TW201319058A - 新穎化合物 - Google Patents

Abstract

本發明係提供式(I)化合物，其為p38分裂原活化蛋白激酶酵素家族之抑制劑，及其於治療的用途，包括用於醫藥組合，特別是用於治療發炎疾病，包括肺之發炎疾病，例如氣喘和COPD。

Description

新穎化合物

本發明係關於為p38分裂原(mitogen)活化蛋白激酶酵素家族之抑制劑(文中係指p38 MAP激酶抑制劑)之化合物，例如其α和γ激酶亞型，和Syk激酶和酪胺酸激酶之Src家族，及其於治療上的用途，包括用於醫藥組合，特別是用於治療發炎疾病，特別是肺之發炎疾病，例如氣喘和COPD，以及該等胃腸道之發炎疾病，例如潰瘍性結腸炎和克隆氏症和眼睛之發炎疾病，例如葡萄膜炎。

已辨識出四種p38 MAPK異構型(分別為α、β、γ和δ)各在人類中展現不同的組織表現模式。p38 MAPK α和β異構型在人體中無處不在，存在於許多不同的細胞類型中。α異構型就其在發炎中的角色已被充分定性。雖然在使用化學基因法之研究中顯示，p38 MAPKβ異構型並未參與發炎(O’Keefe,S.J.等人，J.Biol.Chem.,2007,282(48)：34663-71.)，但是其經由調節COX2表現涉及疼痛機制(Fitzsimmons,B.L.等人，Neuroreport,2010,21(4)：313-7)。這些異構型受許多先前描述的小分子量化合物所抑制。早期的抑制劑種類，由於這些異構型廣泛的組織分布，產生化合物之多重偏離標的效應，而具高度毒性。再者，實質上許多抑制劑之開發由於臨床研究上不可接受的安全性而中斷(Pettus,L.H.and Wurz,R.P.,Curr.Top.Med.Chem.,2008,8(16)：1452-67.)。因這些有害效應隨化學形態而不同，且該等化合物具有不同激酶 選擇性模式，所觀察到的毒性可能與結構相關，而非以p38機制為主。

有關p38 MAPKγ和δ異構型所知甚少，其不像α和β異構型係表現在特定的組織和細胞。p38 MAPK-δ異構型在胰臟、睪丸、肺、小腸和腎臟較高度表現。其在巨噬細胞中很豐富並可在嗜中性粒細胞、CD4+T細胞和在內皮細胞中偵測到(Shmueli,O.等人，Comptes Rendus Biologies,2003,326(10-11)：1067-1072；Smith,S.J.Br.J.Pharmacol.,2006,149：393-404；Hale,K.K.,J.Immunol.,1999,162(7)：4246-52；Wang,X.S.等人，J.Biol.Chem.,1997,272(38)：23668-23674.)。有關p38 MAPKγ之分布所知甚少，雖然其在腦、骨骼肌和心臟，以及淋巴細胞和巨噬細胞中較高度表現(Shmueli,O.等人，Comptes Rendus Biologies,2003,326(10-11)：1067-1072；Hale,K.K.,J.Immunol.,1999,162(7)：4246-52；Court,N.W.等人，J.Mol.Cell.Cardiol.,2002,34(4)：413-26；Mertens,S.等人，FEBS Lett.,1996,383(3)：273-6.)。

雖然先前揭示的化合物BIRB 796已知具有泛-異構型抑制活性，但目前並無p38 MAPKγ和p38 MAPKδ之選擇性小分子抑制劑。可觀察到抑制p38 MAPKγ和δ異構型比抑制p38 MAPKα和p38γ需要更高濃度的化合物(Kuma,Y.,J.Biol.Chem.,2005,280：19472-19479.)。此外BIRB 796亦藉由上游激酶MKK6或MKK4削弱p38 MAPK或JNK之磷酸化作用。Kuma討論了由抑制劑與MAPK蛋白結合所造成的構形改 變，可能影響其磷酸化位置和對上游活化子之接合位置二者之結構，藉此削弱p38 MAPK或JNK之磷酸化的可能性。

p38 MAP激酶咸信在許多涉及啟動和維持人類疾病，例如嚴重氣喘和COPD中之慢性、持續性發炎的訊號傳遞路徑中扮演著關鍵角色(Chung,F.,Chest,2011,139(6)：1470-1479.)。目前有很多的文獻顯示，p38 MAP激酶係藉由一系列的前發炎(pro-imflammatory)細胞激素所活化且其活化導致額外的前發炎細胞激素之招募和釋放。實際上，一些臨床研究上的數據證明以p38 MAP激酶抑制治療期間，病患中疾病活性之有利的改變。例如Smith描述了p38 MAP抑制劑對TNFα(但非IL-8)從人類PBMC釋放之抑制效應。

亦已建議使用p38 MAP激酶抑制劑來治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)。以p38 MAPKα/β為目標之小分子抑制劑，已證明在降低各種得自一般對皮質類固醇不敏感的COPD病患的細胞和組織發炎中之參數(Smith,S.J.,Br.J.Pharmacol.,2006,149：393-404.)以及在各種活體內動物模型中為有效的(Underwood,D.C.等人，Am.J.Physiol.,2000,279：L895-902；Nath,P.等人，Eur.J.Pharmacol.,2006,544：160-167.)。Irusen和同僚亦提出經由降低細胞核中糖皮質類固醇受體(GR)之結合親和力，p38 MAPK α/β可能涉入皮質類固醇不敏感性(Irusen,E.等人，J.Allergy Clin.Immunol.,2002,109：649-657.)。以一系列的p38 MAP激酶抑制劑，包括AMG548、BIRB 796、VX702、SCIO469和SCIO323之臨床實驗已有描 述(Lee,M.R.和Dominguez,C.,Current Med.Chem.,2005,12：2979-2994.)。

COPD為一種其中所經歷的發炎根據報告係實質上對吸入的皮質類固之抗發炎效應具阻抗性之症狀。因此，較佳的治療COPD之策略應為開發具有固有的抗發炎效應和增加COPD病患肺組織對吸入的皮質類固醇之敏感性能力二者之療育。Mercado之新近的發表刊物(Mercado,N.，等人，Mol.Pharmacol.,2011,80(6)：1128-1135.)驗證了靜默p38 MAPK γ具有恢復對皮質類固醇敏感性之潛在性。因此對於使用p38 MAP抑制劑治療COPD和嚴重氣喘之病患可能具有雙重利益。然而，阻礙利用p38 MAP激酶抑制劑治療人類慢性發炎疾病之主要障礙為在病患中所觀察到的嚴重毒性，導致許多化合物在退出於臨床發展，包括所有該等上文所特別提起的化合物。

許多診斷出患有氣喘或COPD的病患持續承受不受控制的癥候和其醫療症狀的惡化，而可能導致住院。僅管使用最先進、新近可取得的治療療法，包括吸入性皮質類固醇和長效β-促效劑之組合產品，此狀況仍發生。在過去10年間所累積的資料顯示，無法有效管理肺部疾病之其下的發炎部分為惡化發生之最可能的因素。給予皮質類固醇作為抗發炎劑所建立的效用，特言之，治療氣喘之吸入式皮質類固醇，這些發現已激起密集的研究。研究結果已鑑別出某些環境危害引起病患肺部之皮質類固醇-不敏感性發炎改變。一實例為由病毒媒介的上呼吸道感染(URTI)所引起的反應，其在增加與 氣喘和COPD有關的發病率中特別顯著。

流行病學的調查已顯示上呼吸道之病毒感染和已診斷患有慢性呼吸道疾病之病患實質惡化的百分比之間有強烈的相關性。就此，某些最令人信服的數據係衍生自患有氣喘之孩童的縱貫性研究(Papadopoulos,N.G.,Papi,A.,Psarras,S.and Johnston,S.L.,Paediatr.Respir.Rev,.2004,5(3)：255-260.)。各種額外的研究支持此項病毒感染可能促成惡化並增加疾病嚴重性之結論。例如，鼻病毒之實驗臨床感染根據報告，對於皮質類固醇治療無反應之氣喘者造成對組織胺之支氣管過度敏感反應(Grunberg,K.,Sharon,R.F.，等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.,2001,164(10)：1816-1822.)。進一步的證據係來自觀察到病患之疾病惡化與囊狀纖維化和HRV感染間之關聯(Wat,D.,Gelder,C.，等人，J.Cyst.Fibros,.2008,7：320-328.)。呼吸道病毒感染，包括鼻病毒，係代表與小兒科肺移植接受者之12個月存活率負相關的獨立風險因子之發現，亦與此數據體相符(Liu,M.,Worley,S.，等人，Transpl.Infect.Dis,.2009,11(4)：304-312.)。

臨床的研究顯示，病毒載量係與所觀察到的癥狀和併發症成比例，且意味著，與發炎的嚴重性成比例。例如，在實驗性鼻病毒感染後，下呼吸道癥狀和支氣管過度敏感與病毒載量顯著相關(Message,S.D.,Laza-Stanca,V.，等人，PNAS,2008；105(36)：13562-13567.)。同樣地，在無其他病毒劑下，當有免疫力的小兒科病患中病毒載量高時，鼻病毒感染通常係與下呼吸道感染和哮喘有關 (Gerna,G.,Piralla,A.，等人，J.Med.Virol,.2009,81(8)：1498-1507.)。

有趣地，最近已有報告提出，預先暴露於鼻病毒降低了人類肺泡巨噬細胞中由細菌產物所誘發的細胞介素反應(Oliver,B.G.,Lim,S.，等人，Thorax,2008,63：519-525.)。此外，已記載以鼻病毒感染鼻上皮細胞促進細菌的黏附，包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)和流感嗜血桿菌(H.influenzae)(Wang,J.H.,Kwon,H.J.and Yong,J.J.,The Laryngoscope,2009,119(7)：1406-1411.)。此等細胞效應可能造成病患在上呼吸道感染後，罹患下呼吸道感染之可能性。因此，治療上適切地係集中在於各種活體外系統中降低病毒載量之新穎的療育能力，作為其在臨床設定上有利的代理預測劑。

對於上呼吸道之鼻病毒感染可能導致嚴重次要併發症之高風險族群，並不限於患有慢性呼吸疾病之病患。其包括，例如易發生下呼吸道感染之免疫功能低下者，以及，面對急性、生命威脅發燒之進行化療病患。研究上亦顯示，其他慢性疾病，例如糖尿病，係與免疫-防禦反應低下有關。此病症增加了得到呼吸道感染和結果住院治療二者之可能性(Peleg,A.Y.,Weerarathna,T.，等人，Diabetes Metab.Res.Rev.,2007,23(1)：3-13；Kornum,J.B.,Reimar,W.，等人，Diabetes Care,2008,31(8)：1541-1545.)。

當上呼吸道病毒感染為患有潛在疾病或帶有其他風險因子之病患的重大罹病和死亡原因時；其亦代表一般民眾之重大健康照護負擔且為學校缺席和損失工時 之主要原因(Rollinger,J.M.and Schmidtke,M.,Med.Res.Rev.,2010,Doi 10.1002/med.20176.)。這些考量更顯出具有優於目前治療之改良效用的新穎藥物為預防和治療鼻病毒媒介的上呼吸道感染之迫切所需。一般而言，為了開發改良性抗病毒劑之策略已以病毒產生的各種蛋白為目標，作為治療介入點。然而，廣大範圍的鼻病毒血清型使得此策略在實行上特別具挑戰性，並可說明為何目前用於預防和治療鼻病毒感染之藥物尚未被任何主管當局核准。

病毒進入宿主細胞係與許多胞內訊號傳遞路徑之活化有關，其咸信在啟動發炎過程(參見Ludwig,S,2007；Signal Transduction,7：81-88.)及病毒增殖和後續釋放上扮演著重要角色。一已測定出其在活體外流感病毒增殖中所扮演的角色之此機制，為活化磷酸肌醇3-激酶/Akt路徑。已有報告提出此訊號傳遞路徑係由病毒的NS1蛋白所活化(Shin,Y.K.,Liu,Q.等人，J.Gen.Virol.,2007,88：13-18.)且其抑制降低了子代病毒之效價(Ehrhardt,C.,Marjuki,H.等人，Cell Microbiol.,2006,8：1336-1348.)。

再者，已記載MEK抑制劑U0126在無引發病毒抗藥性變體出現下，抑制了病毒增殖(Ludwig,S.,Wolff,T.等人，FEBS Lett.,2004,561(1-3)：37-43.)。最近，以抑制Syk激酶為目標的研究已驗證酵素在媒介鼻病毒進入細胞及病毒引起的發炎反應，包括ICAM-1上調，扮演著重要角色(Sanderson,M.P.,Lau,C.W.等人，Inflamm.Allergy Drug Targets,2009,8：87-95.)。Syk活性根據報 告係由c-Src所控制，作為HRV感染的上游激酶(Lau,C.等人，J.Immunol.,2008,180(2)：870-880.)。有少數的研究顯示，細胞Src(Src1或p60-Src)或Src家族激酶之活化與病毒感染相關聯。這些包括腺病毒經由c-Src依賴機制，引起PI3激酶媒介的Akt活化之報告。其亦顯示，在上皮細胞中鼻病毒-39依賴Src激酶活化而引發IL-8產生(Bentley,J.K.,Newcomb,D.C.,J.Virol.,2007,81：1186-1194.)。最後，提出了Src激酶之活化係涉及上皮細胞和黏膜下層腺體中誘發鼻病毒-14產生黏蛋白(Inoue,D.and Yamaya,M.,Respir.Physiol.Neurobiol.,2006,154(3)：484-499.)。

先前已揭示，抑制c-Src和Syk激酶二者活性之化合物為有效抗鼻病毒複製之藥劑(Charron,C.E.等人，WO 2011/158042.)及抑制p59-HCK之化合物可有效抗流感病毒複製(Charron,C.E.等人，WO 2011/070369.)。基於上文總述之理由，設計用於治療慢性呼吸疾病之化合物，結合這些固有的抑制p38 MAPK之性質，預期為特別有效用。

特定的p38 MAPK抑制劑亦已描述作為抑制呼吸道融合病毒複製之抑制劑(Cass,L.等人，WO 2011/158039.)。

再者，值得注意的是，在治療一星期後，未持續四星期的治療期間，已發現p38 MAPK抑制劑對於患有IBD病患為有利的(Schreiber,S.等人，Clin.Gastro.Hepatology,2006,4：325-334.)。

除了在控制前發炎路徑之活性的細胞訊號傳遞事件中扮演關鍵角色之外，激酶酵素目前已被認為可調節一系列細胞功能之活性。就其中最近已討論的有維持DNA完整(Shilo,Y.Nature Reviews Cancer,2003,3：155-168.)和協調複雜的細胞分裂過程。一篇新近發現之說明為一描述一組依照所謂的「Olaharsky激酶」來作用之抑制劑，在活體外對微核形成之頻率的影響之刊物(Olaharsky,A.J.等人，PLoS Comput.Biol.,2009,5(7)：e1000446.)。微核形成係牽涉或與有絲分裂過程之破壞有關，而因此為不欲的潛在毒性表現。已發現，抑制肝醣合成酶激酶3α(GSK3α)為增加激酶抑制劑提高微核形成可能性之特別顯著的因素。最近，根據報告以RNAi抑制激酶GSK3β亦提高微核形成(Tighe,A.等人，BMC Cell Biology,2007,8：34.)。

由藥物與Olaharsky激酶，例如GSK3α之交互作用所引起的有害效應，可能藉由將劑量最適化及/或藉由改變給藥路徑而減輕。然而，鑑別出對這些非目標酵素具有低的或偵測不到的活性，而因此(如有絲分裂分析所測)引起極少或不會破壞有絲分裂過程之治療上有效的分子，應為更有利。

從上文所引述的文獻考量證明，就鑑別和開發出具有優於目前可取得治療之改良的治療潛力之新的p38 MAP激酶抑制劑仍有需求。所欲的化合物為該等藉由施予適切的治療劑量，至少一種與先前藥劑同等效用，但在一或多方面，較低毒性，展現優越的治療指數之化合物。因此本發明之目標係提供此等抑制p38 MAP激 酶，例如帶有特定亞型特性與Syk激酶和Src家族中之酪胺酸激酶(特別是c-Src)之酵素活性的新穎化合物，因此具有良好抗發炎性並適合用於治療。

在文中所揭示的一或多個本發明之實施例中，相較於其他先前所揭示的異位p38 MAP激酶抑制劑，例如BIRB 796(Pargellis,C.等人，Nature Struct.Biol.,2002,9(4)：268-272.)，化合物(I)展現較長的作用效期及/或作用持續性。另外的實施例係提供此等具有高化學和物理穩定性，適合調配成吸入式醫藥品之一或多種固體晶體形式的新穎化合物。

因此，在本發明一方面係提供式(I)化合物：

或其醫藥上可接受鹽或溶劑化物，包括其所有的立體異構物和互變異構物。

「式(I)化合物」本文中亦可稱為「化合物(I)」。

在本發明另一方面係提供如上所定義之式(I)化合物游離鹼。

在本發明另一方面係提供如上所定義之化合物(I)無水游離鹼。

在本發明另一方面係提供如上所定義之化合物(I)固體晶體形式之無水游離鹼。

在本發明另一方面係提供如上所定義之化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼。

在本發明另一方面係提供如上所定義之化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼。

本發明之詳細說明

文中所揭示的式(I)化合物為：1-(3-第三丁基-1-對甲苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(4-(2-(苯胺基)嘧啶-4-基氧基)萘-1-基)脲。化合物(I)之鹽類的實例包括所有醫藥上可接受鹽類，例如(不限於)強無機酸之酸加成鹽，例如HCl和HBr鹽類，和強有機酸例如甲磺酸之加成鹽。

如下文中所用，除非文中有特別指出，否則式(I)化合物希望包括該化合物的鹽類、溶劑化物和所有互變異構物。溶劑化物之實例包括水合物。

文中所提供的本發明延伸至式(I)化合物之前藥，亦即在活體內經分解及/或代謝而提供式(I)活性化合物之化合物。前藥之一般實例包括單酯類和其他酯類列如混合的碳酸酯、胺甲酸酯、糖苷、醚、縮醛和縮酮。

本發明涵蓋所有化合物(I)之同位素衍生物。因此本發明涵蓋化合物(I)其具有一或多個原子已被具有與自然界最常見的原子量或質量數不同之原子量或質量數的原子所取代之化合物，或其中具有自然界中較不常見的原子量或質量數之原子的比例增加(後者之觀念稱為「同位素富集」)。因此，本揭示文之化合物包括該等其中所指原子為自然界生成或非自然界生成的同位素之化合物。在一實施例中，此同位素為安定的同位素。因此，在本發明一實施例中，化合物(I)就一或多個氫原 子係含有富集量之氘(例如，對一所給予的氫原子，氘同位素的量在數目上超過20%、50%、75%、90%、95%或99%)。可併入化合物(I)或富集於化合物(I)之其他同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、氟、碘和氯之同位素，例如³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、¹²³I或¹²⁵I，其可為自然界生成或非自然界生成的同位素。

在本發明另一方面係提供一或多種式(I)化合物之代謝物，特別是保留一或多種式(I)化合物之治療活性的代謝物。如文中所用，代謝物為活體中由式(I)化合物代謝所產生的化合物，例如(不限於)氧化代謝物及/或(例如)由O-去烷化所產生的代謝物。

此揭示文亦延伸至文中所定義的化合物之所有多形物形式。

適合製備式(I)化合物之路徑係如下所示(流程1)。

流程1

在上述一或多個反應期間可能需要保護基用以保護化學上敏感的基團，以確定此方法可進行及/或為有效的。因此，若希望或需要，中間化合物可使用習用的保護基加以保護。保護基和其移除方法係描述於“Protective Groups in Organic Synthesis”,by Theodora W.Greene and Peter G.M.Wuts,published by John Wiley & Sons Inc；4th Rev Ed.,2006,ISBN-10：0471697540中。

詳細的化合物(I)之製備係提供於實例1中。

如文中所述的新穎中間物為本發明一態樣。

在本發明另一方面係提供化合物(I)固體晶體形式之無水游離鹼。在本發明另一方面係提供化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼，其可(例如)藉由將化合物(I)從乙酸異丙酯結晶來製得。在本發明一特定方面係 提供化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼，其可(例如)藉由將化合物(I)從丙酮和水結晶來製得。適合用於此法之典型的丙酮和水比例係介於5：1至200：1間，例如約10：1。另一種選擇，B型可藉由將化合物(I)單獨從丙酮結晶來製得。詳細的化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離鹼的製備係分別提供於實驗部份之實例1和3中。

在本發明另一方面，化合物(I)之固態性質可藉由進一步形成漿液或再結晶步驟來改良，例如帶有改良的形態學及/或含較低量殘餘溶劑之物質。例如，可藉由將化合物(I)多形物B型於水中形成漿液，或另外藉由以丙酮再結晶，將殘餘的溶劑從化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼中移除。示例的形成漿液過程之詳細說明係提供於實驗部分的實例3a中。

在一實施例中，係提供化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼，其具有實質上如圖1所示之XRPD圖。得到XRPD數據之方法係描述於分析方法和實例5所論述的數據中。

因此，係提供化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼，其具有含至少一個(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或十六個)波峰在7.8、8.7、10.3、11.2、12.4、15.2、16.2、17.5、19.7、20.8、22.6、23.1、24.6、25.5、26.7、27.4(±0.2度，2-θ值)之XRPD圖，這些波峰為固體晶體多形物A型之特徵波峰。於10.3、15.2、17.5、23.1、24.6、26.7和27.4之波峰為固體晶體多形物A型之特 定特徵波峰，且因此其較佳的在XRPD圖中可觀察到至少一個(例如一、二、三、四、五、六或全部七個)這些波峰。

在另外的實施例中，係提供化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼(微米化)，其具有實質上如圖2所示之XRPD圖。微米化之方法係描述於實例4中而得到XRPD數據之方法係描述於分析方法和實例5所論述的數據中。

因此，係提供化合物(I)固體晶體多形物B型(微米化)之無水游離鹼，其具有含至少一個(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五或十六個)波峰在3.9、6.1、7.7、8.6、10.9、11.8、12.7、14.3、15.9、16.7、18.3、18.7、19.9、20.9、22.0、22.6、25.2、28.9(±0.2度，2-θ值)之XRPD圖，這些波峰為固體晶體多形物B型之特徵波峰。於3.9、6.1、11.8、14.3、16.7、18.3、18.7和28.9之波峰為固體晶體多形物B型之特定特徵波峰，且因此其較佳的在XRPD圖中可觀察到至少一個(例如一、二、三、四、五、六或全部七個)這些波峰。

化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離鹼的熔點係使用示差掃描量熱儀如實例6所示來測定。發現化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼具有191.6℃之熔點，及發現化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼具有214℃之熔點。亦發現多形物B型比多形物A型具有更高的熔解熱。如實例6所說明，這些結果顯示多形物B型比多形物A型在熱力學上更穩定。

就化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼的物理和化學穩定性進行研究，其結果係揭示於本文中。

為了評估物理穩定性，係將化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼依照實例4所述微米化，並將所生成的物質之樣本儲存於開放的容器中並置於不同的環境溫度和相對濕度。樣本的物理性質和穩定性係使用TGA、DSC、DVS、IR光譜和XRPD分析來探討。完整的實驗程序係提供於通用製程部份且結果係總述於實例7(表7)中。如實例7所論述，發現化合物(I)固體晶體多形物B型(微米化)之無水游離鹼具有良好的物理穩定性。亦使用化合物(I)固體晶體多形物B型(非微米化形式)之無水游離鹼進行相同的實驗程序，並發現結果實質上係與微米化物質類似，亦即發現化合物(I)固體晶體多形物B型無水游離鹼之微米化或未微米化形式二者皆具有良好的物理穩定性。

為了評估化學穩定性，係將化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼依照實例4所述微米化。將微米化樣本儲存於開放的容器中並置於不同的環境溫度和相對濕度。樣本的化學穩定性係以HPLC來分析。結果係總述於實例8(表8)中，其中顯示，雖然偵測到對光有些敏感性，但發現微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼為化學上穩定的。

由於文中所揭示的固態研究，其結論出化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼可經微米化且其生成的物質具有良好的物理和化學穩定性。

式(I)化合物為p38 MAP激酶抑制劑(特別是α亞型) 且在一方面此化合物可用於治療發炎疾病，例如COPD及/或氣喘。

令人驚訝地，相較於其他先前所揭示的p38 MAP激酶抑制劑，例如BIRB 796，此化合物展現長的作用效期及/或作用持久性。

作用持久性如文中所用係與目標(例如受體)化合物之溶解速率或溶解常數有關。低的溶解速率可造成持久性。

低溶解速率與高結合率之組合易於提供有效的治療實體。

預期式(I)化合物在活體內為有效的。

典型地，目前所開發的先前技術化合物希望係用於口服。此策略涉及將化合物最適化，藉由適當的藥物動力學性質達到其作用效期，藉此確保在給劑之間建立和維持夠高的藥物濃度而提供臨床利益。此方式之必然結果為所有的身體組織，特別是肝和腸道，係暴露於超-治療活性濃度之藥物中，無論其是否有受所欲治療之疾病有害影響。

另一種選擇策略係設計治療範例，其中該藥物係直接給劑於發炎器官(局部治療)。在此方法不適合用於治療所有慢性發炎疾病之同時，而已廣泛地被用於肺疾病(氣喘、COPD)、皮膚症狀(異位性皮膚炎和乾癬)、鼻病(過敏性鼻炎)和胃腸道(潰瘍性結腸炎)。

局部治療，可藉由確保此藥物具有持續的作用效期並保留在相關器官中以便將全身毒性之風險減至最低，或藉由製造一產生活性藥物「儲庫」之調配物可用 於維持其所欲效用，來達到功效。第一種方法係以抗膽鹼藥物噻托銨(tiotropium)(Spiriva)作為示例。此化合物係以局部投予肺中供治療COPD，且對於其目標受體具有異常高的親和力，導致非常緩慢的速率及後續持續的作用效期。

在本揭示文之一方面，式(I)化合物特別適合用於局部遞送，例如局部遞送至肺，特別是用於治療呼吸疾病，例如慢性呼吸疾病如COPD及/或氣喘。

在一實施例中，式(I)化合物係適合敏感化以皮質類固醇治療但對此治療療法已難以治療的病患。

式(I)化合物亦可用於治療類風濕性關節炎。

式(I)化合物可具有抗病毒性質，例如防止小核糖核酸病毒，特別是鼻病毒、流感或呼吸融合病毒感染細胞(例如呼吸道上皮細胞)之能力。

因此，此化合物被視為抗病毒劑，特別適合用於預防、治療或改善小核糖核酸病毒感染，例如鼻病毒感染、流感或呼吸融合病毒。

在一實施例中式(I)化合物能降低由病毒感染例如鼻病毒感染所引起的發炎，及特別是造成細胞激素例如IL-8釋放(特別是在活體內)之病毒感染。此活性可例如於活體外應用如文中實例中所述之鼻病毒引起的IL-8分析來試驗。

在一實施例中式(I)化合物能在活體內降低由鼻病毒引起的ICAM1表現。ICAM1為被所謂的主要溝槽鼻病毒血清型用來感染細胞之受體機制。此活性可例如藉由實例中所述的方法來測量。

預期上述特性使式(I)化合物特別適用於患有一或多種下列慢性症狀，例如鬱血性心衰竭、COPD、氣喘、糖尿病、癌症之病患及/或免疫抑制病患，例如器官移植後，治療及/或預防發炎疾病之惡化，特別是病毒性惡化。

特言之，式(I)化合物可用於治療一或多種呼吸病症，包括COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、氣喘、小兒氣喘、囊狀纖維化、類肉瘤、特發性肺纖維化、過敏性鼻炎、鼻炎、鼻竇炎，特別是氣喘和COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)。

式(I)化合物亦可用於治療一或多種可以局部療法治療之症狀，包括過敏性結膜炎、結膜炎、過敏性皮膚炎、接觸性皮膚炎、乾癬、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎或骨關節炎之續發關節發炎。

亦預期式(I)化合物可用於治療特定的其他症狀，包括類風濕性關節炎、胰臟炎、惡質病、抑制腫瘤生長和轉移，包括非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、大腸直腸癌和惡性黑色素瘤。

當病患症狀對皮質類固醇變得難以治療時，式(I)化合物亦可再敏感化病患症狀以皮質類固醇治療。

再者，本發明係提供包括本揭示文之化合物，視需要與一或多種醫藥上可接受稀釋劑或載劑組合之醫藥組成物。

本發明亦提供製備此醫藥組成物之方法，其包括將成份混合。

稀釋劑和載劑可包括該等適合非經腸、口服、局 部、黏膜和直腸給藥者。

如上述，此等組成物可製備例如供非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內或關節周圍給藥，特別是液體溶液或懸浮液之形式；就口服給藥，特別是以錠劑或膠囊之形式；就局部，例如肺部或鼻內給藥，特別是以散劑、鼻內滴劑或氣霧之形式和經皮給藥；就黏膜給藥，例如頰內、舌下或陰道黏膜，及就直腸給藥，例如以栓劑之形式。

組成物可方便地以單位劑型給藥並可以任何醫藥技術中熟知的方法來製備，例如，如Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA.,(1985)中所述。非經腸給藥之調配物可含有作為賦形劑之無菌水或食鹽水，烷二醇例如丙二醇、聚烷二醇例如聚乙二醇、蔬菜油類、氫化萘及其類似物。鼻內給藥之調配物可為固體並可含有賦形劑，例如乳糖或葡聚醣，或可為水性或油性溶液以鼻滴劑或計量噴霧之形式來使用。就頰內給藥，典型的賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預明膠化澱粉及其類似物。

適合口服給藥之組成物可包括一或多種生理上相容的載劑及/或賦形劑並可為固體或液體形式。錠劑和膠囊可以結著劑，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠或聚乙烯吡咯酮；填充劑，例如乳糖、蔗糖、玉米澱粉、磷酸鈣、山梨醇或甘油；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或矽氧；及介面活性劑，例如月桂基硫酸鈉來製備。液體組成物可含有習用的添加劑例如 懸浮劑，如山梨醇糖漿、甲基纖維素、糖漿、明膠、羧甲基纖維素或食用油脂；乳化劑，例如卵磷脂或阿拉伯膠；蔬菜油，例如杏仁油、椰子油、鱈魚肝油或花生油；防腐劑，例如丁羥基茴香醚(BHA)和丁羥基甲苯(BHT)。液體組成物可包膠於例如明膠中，以提供單位劑型。

固體口服劑型包括錠劑、二片式硬殼膠囊和軟式彈性明膠(SEG)膠囊。

乾殼調配物典型地係包括約40%至60%重量/重量濃度之明膠，20%至30%濃度之增塑劑(例如甘油、山梨醇或丙二醇)及約30%至40%濃度之水。亦可存有其他的物質例如防腐劑、染劑、乳白劑和風味劑。液體填充物質包括已溶化、溶解或分散(以懸浮劑，例如蜂蠟、氫化蓖麻油或聚乙二醇400)之固體藥物，或於媒劑或媒劑組合物，例如礦物油、蔬菜油、三酸甘油酯、甘油和介面活性劑中之液體藥物。

適合地，式(I)化合物係以局部投予肺中。因此，根據本發明，吾等係提供包括本揭示文之化合物(I)，視需要與一或多種局部可接受的稀釋劑或載劑組合之醫藥組成物。局部投予肺中可藉由使用氣霧調配物來進行。氣霧調配物典型地係包括懸浮於或溶解於適合的氣霧推進劑，例如氯氟碳化物(CFC)或氫氟碳化物(HFC)中之活性成份。適合的CFC推進劑包括三氯一氟甲烷(推進劑11)、二氯四氟乙烷(推進劑114)和二氯二氟甲烷(推進劑12)。適合的HFC推進劑包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。推進劑典型地係包括以吸入組 成物之總重量計40%至99.5%，例如40%至90%。調配物可包括賦形劑，包括共溶劑(例如乙醇)和介面活性劑(例如卵磷脂、山梨醇酐三油酸酯及其類似物)。氣霧調配物係包裝於容器中並藉由計量閥(例如由Bespak、Valois或3M公司所供應的)遞送適合的劑量。

局部投予肺部亦可藉由使用非加壓式調配物例如水溶液或懸浮液來進行。此可藉由霧化器來投予。霧化器可為攜帶式或非攜帶式。局部投予肺部可藉由使用乾粉調配物來進行。乾粉調配物應含有細粉形式之本揭示文化合物，典型地帶有1-10 μm之質量平均空氣動力直徑(MMAD)。調配物典型地係含有局部可接受的稀釋劑例如乳糖，通常粒徑較大，例如50 μm或更高之MMAD，如100 μm或更高。另一種局部可接受的稀釋劑為甘露醇。乾粉遞送系統之實例包括SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS和CLICKHALER。另外的乾粉吸入器系統之實例包括ECLIPSE、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、TURBUHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、SKYEHALER、ORIEL乾粉吸入器、MICRODOSE、ACCUHALER、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。

本發明一方面係關於吸入用之乾粉醫藥調配物，其包括：(i)式(I)化合物 其為1-(3-第三丁基-1-對甲苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(4-(2-(苯胺基)嘧啶-4-基氧基)萘-1-基)脲或其醫藥上可接鹽類，包括其所有立體異構物和互變異構物，以顆粒形式(例如固體晶體B型)作為活性成份；(ii)顆粒乳糖作為載劑；及(iii)顆粒的硬脂酸金屬鹽，例如硬脂酸鎂。

本發明亦提供包括一或多個劑量之該調配物的吸入裝置。

式(I)化合物具有治療活性。在另一方面，本發明係提供本揭示文之化合物用作為醫藥品。因此，在另一方面本發明係提供如文中所述之化合物供用於治療一或多種上述症狀。

在另一方面，本發明係提供如文中所述之化合物(I)，用於製造醫藥品供治療一或多種上述症狀。

在另一方面，本發明係提供治療一或多種上述症狀之方法，其包括將一有效量之本揭示文化合物(I)，或包含該化合物之醫藥組成物投予一對象。

術語「治療」希望涵蓋治療以及治療性處理。

本發明之化合物(I)亦可與一或多種其他活性成份，例如適合治療上述症狀之活性成份組合給藥。例如治療呼吸病症之可能的組合包括與類固醇(例如布地奈德(budesonide)、倍氯米松二丙酸鹽(beclomethasone dipropionate)、氟替卡松丙酸鹽(fluticasone propionate)、莫美他松糠酸鹽(mometasone furoate)、氟替卡松糠酸鹽(fluticasone furoate))、β促效劑(例如特布他林(terbutaline)、沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特羅(salmeterol)、福莫特羅(formoterol))及/或黃嘌呤類(例如茶鹼)之組合。其他適合的活性劑包括抗膽鹼劑，例如噻托銨和抗病毒劑，例如(但不限於)紮那米韋(zanamivir)或奧司他韋(oseltamivir)例如為磷酸鹽。其他的抗病毒劑包括帕那米韋(peramivir)和那尼納米韋(laninamivir)。用於治療呼吸病症之另外可能的組合包括與膽固醇例如氟尼縮松(flunisolide)、環索奈德(ciclesonid)e和曲安奈德(triamcinolone)；β促效劑例如班布特羅(bambuterol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、克侖特羅(clenbuterol)、非諾特羅(fenoterol)、布澤特羅(broxaterol)、茚達特羅(indacaterol)、瑞普特羅(reproterol)、丙卡特羅(procaterol)和維蘭特羅(vilanterol)；蕈毒鹼拮抗劑(例如異丙托品(ipratropium)、噻托銨(tiotropium)、氧托銨(oxitropium)、格隆銨(glycopyrronium)、葡萄糖吡咯(glycopyrrolate)、阿地溴銨(aclidinium)、曲司銨(trospium))和白三烯拮抗劑(例如紮魯司特(zafirlukast)、潘卡司特(pranlukast)、齊留通(zileuton)、孟魯司特(montelukast))之組合。應了 解，任何前述之活性成份可以醫藥上可接受鹽之形式來使用。

在一實施例中，式(I)化合物和其他活性成份可共同調配於相同的醫藥調配物中。在另外的實施例中其他的活性成份係以一或多個分開的醫藥調配物來給藥。

因此，本發明另外方面係提供一組合的產品，其包括：(A)本發明化合物(亦即如上所定義之式(I)化合物或其醫藥上可接受鹽)；及(B)另外的治療劑，其中各組份(A)和(B)係與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合加以調配。

在本發明之此方面，組合產品可為單一(組合)醫藥調配物或部件之套組。

因此，本發明之此方面係涵蓋包括本發明化合物和另外治療劑，與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合之醫藥調配物(此調配物以下稱為「組合製備物」)。

其亦涵蓋部件之套組，該套組包括：(i)包括本發明化合物與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合之醫藥調配物；及(ii)包括另外治療劑與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合之醫藥調配物，此組份(i)和(ii)係各自以適合彼此共同給藥之形式來提供。

因此部件套組之組份(i)為上述組份(A)與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合。同樣地，組份(ii)為上述組份(B) 與醫藥上可接受稀釋劑或載劑混合。

其他的治療劑(亦即上述組份(B))可為，例如任何與治療呼吸病症有關的上述活性成份。

下文所提出有關式(I)化合物之抗病毒特性的數據係提供其他抗病毒治療與式(I)化合物組合能有效用於治療或預防患有呼吸道疾病例如COPD及/或氣喘及/或一或多種上列適應症之病患中病毒引發的惡化(例如呼吸道病毒感染)之證據。因此，在一方面係提供化合物(I)與抗病毒治療，例如(但不限於)紮那米韋或奧司他韋(例如奧司他韋磷酸鹽)組合用於治療或預防患有呼吸道疾病例如COPD及/或氣喘之病患中呼吸道病毒感染之用途。

本發明者亦相信其他的抗病毒治療與化合物(I)之組合應可有效用於治療或預防患有呼吸道疾病以外的慢性症狀，鬱血性心衰竭、糖尿病、癌症之病患，或患有免疫抑制例如器官移植後之病患中病毒引發的惡化(例如呼吸道病毒感染)。因此，在另一方面係提供本發明化合物與抗病毒治療，例如(但不限於)紮那米韋或奧司他韋(例如奧司他韋磷酸鹽)之組合用於治療或預防患有慢性症狀，例如鬱血性心衰竭、糖尿病、癌症之病患，或患有免疫抑制例如器官移植後之病患中呼吸道病毒感染之用途。

實驗部分

文中所用的縮寫係如下定義(表1)。任何未定義的縮寫希望係以一般所接受的意義表達。

通用製程

所有的起始物和溶劑係從市面上購得或根據文獻 引文的方法來製備。除非另有說明，否則所有的反應皆經攪拌。有機溶液例行上係以無水硫酸鎂乾燥。氫化係於泰勒斯H-立方流動反應器(Thales H-cube flow reactor)上於所述的條件下進行。管柱層析係於預充填矽膠(230-400個網孔，40-63 μm)濾心上使用所述的量來進行。SCX係購自Supelco公司並在使用前以1M鹽酸處理。除非另有說明，否則所欲純化的反應混合物係先以MeOH稀釋及以幾滴AcOH酸化。將此溶液直接載入SCX並以MeOH沖洗。然後以1% NH₃之MeOH溶液沖洗將所欲的物質溶離。

製備式逆相高效液相層析：Agilent Scalar管柱C18,5 μm(21.2 x 50 mm)，流速28 mL min^-1以含0.1%體積/體積甲酸之H₂O-MeCN梯度於10 min內溶離，使用UV於215和254 nm偵測。梯度資料：0.0-0.5 min；95% H₂O-5% MeCN；0.5-7.0 min；梯度從95% H₂O-5% MeCN至5% H₂O-95% MeCN；7.0-7.9 min；保持在5% H₂O-95% MeCN；7.9-8.0 min；轉變為95% H₂O-5% MeCN；8.0-10.0 min；保持在95% H₂O-5% MeCN。

分析方法

逆相高效液相層析：(方法1)：Agilent Scalar管柱C18,5 μm(4.6 x 50 mm)或Waters XBridgeC18,5 μm(4.6 x 50 mm)流速2.5 mL min^-1以含0.1%體積/體積甲酸(方法1酸性)或NH₃(方法1鹼性)之H₂O-MeCN梯度於7 min內溶離，使用UV於215和254 nm偵測。梯度資料：0.0-0.1 min，95% H₂O-5% MeCN；0.1-5.0 min，梯度從95% H₂O-5% MeCN至5% H₂O-95% MeCN；5.0-5.5 min，保持在5% H₂O-95% MeCN；5.5-5.6 min，保持在5% H₂O-95% MeCN，流速增加至3.5 mL min^-1；5.6-6.6 min，保持在5% H₂O-95% MeCN，流速3.5 mL min^-1；6.6-6.75 min，轉變為95% H₂O-5% MeCN，流速3.5 mL min^-1；6.75-6.9 min，保持在95% H₂O-5% MeCN，流速3.5 mL.min^-1；6.9-7.0 min，保持在95% H₂O-5% MeCN，流速降至2.5 mL min^-1。

逆相高效液相層析：(方法2)：Agilent Extend C18管柱，1.8 μm(4.6 x 30 mm)於40℃；流速2.5-4.5 mL min^-1以含0.1%體積/體積甲酸之H₂O-MeCN梯度於4 min內溶離，使用UV以254 nm偵測。梯度資料：0-3.00 min，梯度從95% H₂O-5% MeCN至5% H₂O-95% MeCN；3.00-3.01 min，保持在5% H₂O-95% MeCN，流速增加至4.5 mL min^-1；3.01 3.50 min，保持在5% H₂O-95% MeCN；3.50-3.60 min，轉變為95% H₂O-5% MeCN，流速降至3.50 mL min^-1；3.60-3.90 min，保持在95% H₂O-5% MeCN；3.90-4.00 min，保持在95% H₂O-5% MeCN，流速降至2.5 mL min^-1。

¹ H NMR光譜：光譜係於Bruker Avance III光譜儀於400 MHz使用殘餘未氘化溶劑作為參照所獲得

動態水份吸附：圖表係使用表面測量系統動態水份吸附模型DVS-1使用約10 mg的樣本所得來。重量變化係相對於大氣濕度於25℃所記錄並使用下列參數來測定：乾燥：60 min於無水氮氣下；平衡：60 min/步；數據間隔：0.05%或2.0 min。相對濕度[RH%]測量點係如下：

第一次設定：5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5。

第二次設定：10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、0。

X-光粉末繞射：圖形係於配置有Cu LFF X-光管(45 kV；40 mA；Bragg-Brentano；旋轉台)之PANalytical(Philips)X’PertPRO MPD繞射儀並使用Cu Kα放射線於下列測量條件下所得來：掃描模式：連續；掃描範圍：3至50° 2θ；步距：0.02°/步；計算時間：30秒/步；旋轉器旋轉時間：1秒；入射光路徑：依程式。發散狹縫：15 mm；蘇萊爾狹縫：0.04 rad；光罩：15 mm；反散射狹縫：1°；光束刀：+；繞射光路徑：長的反散射屏：+；蘇萊爾狹縫：0.04 rad；Ni過濾器：+；偵測器：X’Celerator。樣本係藉由散布於零背景樣本架上所製備。

紅外線光譜：使用微區衰減全反射(microATR)並使用適合的microATR配件及下列測量條件分析樣本：裝置：Thermo Nexus 670 FTIR光譜儀；掃描次數：32；解析：1 cm^-1；波長範圍：4000至400 cm^-1；偵測器：DTGS含KBr窗口；分束器：Ge於KBr上；micro ATR配件：Harrick Split Pea含Si晶體。

示差掃描量熱法：數據係以配置有RCS冷卻元件之TA-Instruments Q1000 MTDSC來收集。典型地各3 mg的化合物，於標準的鋁TA-Instrument樣本盤中，以10℃/min從25 C加熱至300℃。於樣本上保持以50 mL/min通入氮氣。

熱重分析：數據係於TA-Instruments Q500熱重分析儀上收集。除非另有說明，否則典型地係將各10 mg的樣本轉置於預先稱重的鋁盤上並以20℃/min從環境溫度加熱至300℃或<80[(重量/重量)%]。

HPLC之化學穩定性：分析係於Waters Xbridge C₁₈管柱(3.0 x 150 mm；3.5 μm)使用下列操作條件來進行：管柱溫度：40℃；樣本溫度：5℃；流速：0.45 mL/min；注射量：7 μL；UV偵測於260 nm；移動相組成物係包括A相：10 mM乙酸銨+0.1%,v/v三氟乙酸之水溶液及B相：乙腈，使用下列參數所定義之梯度(表2)。

生物試驗之實驗方法 酵素抑制分析

文中所揭示之化合物的激酶酵素結合活性係使用測量與固定配體之活性位置-導向競爭結合的專有分析來測定(Fabian,M.A.等人，Nature Biotechnol.,2005,23：329-336)。這些分析係以DiscoverX(以前為Ambit；San Diego,CA)來進行。Kd值(解離常數值)係以化合物對各激酶之親和力指數來計算。

酵素抑制分析

文中所揭示之化合物的酵素抑制活性係以FRET使用經供體和受體螢光團(Z-LYTE,Invitrogen Ltd.,Paisley,UK)標定的合成胜肽來測定。

p38 MAPKα酵素抑制作用

試驗化合物對p38 MAPKα異構型(MAPK14：Invitrogen)之抑制活性，係間接藉由測定下游分子MAPKAP-K2之活化/磷酸化之量來評估。將p38 MAPKα蛋白(80 ng/mL,2.5 μL)與試驗化合物(2.5 μL之4 μg/mL、0.4 μg/mL、0.04 μg/mL或0.004 μg/mL)於RT混合2 hr。然後加入p38α不活化目標MAPKAP-K2(Invitrogen,600 ng/mL)和FRET胜肽(8 μM；MAPKAP-K2之磷酸化目標)之混合物溶液(2.5 μL)並加入ATP(40 μM,2.5μL)啟動激酶反應。將混合物於RT培養1 hr。在以螢光微量盤判讀儀(Varioskan® Flash,ThermoFisher Scientific)偵測前1 hr加入展開劑(蛋白酶，5 μL)。

p38 MAPKγ酵素抑制

本發明化合物對p38MAPKγ(MAPK12：Invitrogen)之抑制活性，係以類似上述方法來評估。將酵素(800 ng/mL,2.5 μL)以試驗化合物(2.5μL以4 μg/mL、0.4 μg/mL、0.04 μg/mL或0.004 μg/mL)於RT培養2 hr。然後將FRET胜肽(8 μM,2.5 μL)和適當的ATP溶液(2.5 μL,400 μM)加入酵素/化合物混合物中並培養1 hr。在以螢光微量盤判讀儀(Varioskan® Flash,Thermo Scientific)偵測前1 hr加入展開劑(蛋白酶，5 μL)。

c-Src和Syk酵素抑制作用

本發明化合物對c-Src和Syk酵素(Invitrogen)之抑制活性，係以類似上述方法來評估。將相關酵素(分別3000 ng/mL或2000 ng/mL，2.5 μL)以試驗化合物(4 μg/mL、0.4 μg/mL、0.04 μg/mL或0.004 μg/mL，各2.5μL)於RT培養2 hr。然後將FRET胜肽(8 μM,2.5 μL)和適當的ATP溶液(2.5 μL,c-Src為800 μM，而Syk為60 μM ATP)加入酵素/化合物混合物中並培養1 hr。在以螢光微量盤判讀儀(Varioskan® Flash,ThermoFisher Scientific)偵測前1 hr加入展開劑(蛋白酶，5 μL)。

GSK 3α酵素抑制作用

試驗化合物對GSK 3α酵素異構型(Invitrogen)之抑制活性，係藉由測定目標胜肽之活化/磷酸化之量來評估。將GSK3-α蛋白(500 ng/mL,2.5 μL)與試驗化合物(2.5 μL以4 μg/mL,0.4 μg/mL,0.04 μg/mL或0.004 μg/mL)於RT混合2 hr。然後將FRET胜肽(8 μM,2.5 μL)(其為GSK3α之磷酸化目標)和ATP(40 μM,2.5 μL)加到酵素/化合物混合物中並將生成的混合物培養1 hr。在以螢光微量盤判讀儀(Varioskan® Flash,ThermoFisher Scientific)偵測前1 hr加入展開劑(蛋白酶，5 μL)。

在所有的案例中，位置專一性的蛋白酶僅裂解非磷酸化胜肽並消除FRET訊號。各反應之磷酸化程度係使用香豆素放射(供體)對螢光素放射(受體)之比例來計算，就其低的比例係顯示高磷酸化而高比例則顯示低磷酸化程度。各反應之抑制百分比係以相對於非抑制對照組所計算，及然後從濃度反應曲線計算50%抑制濃度 (IC₅₀值)。

細胞分析 d-U937細胞中LPS-引發的TNFα/IL-8釋放

將U937細胞，一種人類單核細胞株，藉由以PMA(100 ng/mL)培養48至72 hr分化成巨噬細胞型之細胞。將細胞以試驗化合物之最終濃度預培養2 hr及然後以LPS(0.1 μg/mL；來自大腸桿菌：O111：B4,Sigma)刺激4 hr。收集上清液藉由三明治ELISA(Duo-set,R&D systems)測定TNFα和IL-8濃度。抑制TNFα產生係以相較於媒劑對照組，由10 μg/mL的BIRB796於各試驗化合物濃度所達到的百分比來計算。相對的50%有效濃度(REC₅₀)係由所生成的濃度-反應曲線來測定。抑制IL-8產生係於各試驗化合物濃度，相較於媒劑對照組來計算。相對的50%抑制濃度(IC₅₀)係由所生成的濃度-反應曲線來測定。

THP-1細胞中LPS-引發的TNFα釋放

將THP-1細胞，一種人類單核細胞株，以3 μg/mL的LPS(來自大腸桿菌：O111：B4,Sigma)刺激4 hr並收集上清液藉由三明治ELISA(Duo-set,R&D systems)測定TNFα濃度。抑制TNFα產生係於各試驗化合物濃度，相較於媒劑對照組來計算。50%抑制濃度(IC₅₀)係由所生成的濃度-反應曲線來測定。

BEAS2B細胞中Poly I：C-引發的ICAM-1表現

於這些研究中Poly I：C係用作為簡單的RNA病毒模擬物。將Poly I：C-Oligofectamine混合物(1 μg/mL Poly I：C,±2% Oligofectamine,25 μL；分別為加州聖地牙哥Invivogen公司和加州卡爾斯巴Invitrogen公司)轉染至BEAS2B細胞(人類支氣管上皮細胞，ATCC)。將細胞以試驗化合物之最終濃度預培養2 hr並以細胞為基礎的ELISA測定ICAM-1在細胞表面的表現量。於poly I：C轉染後18 hr的時間點，將細胞以4%甲醛之PBS(100 μL)溶液固定及然後加入含0.1%疊氮鈉和1%過氧化氫之清洗緩衝液(100 μL,0.05% Tween in PBS：PBS-Tween)使內生性過氧化酶驟冷。以清洗緩衝液(3 x 200 μL)清洗細胞及以5%牛乳之PBS-Tween溶液(100 μL)封閉孔槽1 hr後，將細胞以抗人類ICAM-1抗體(50 μL；Cell Signaling Technology,Danvers,MA)之1% BSA PBS溶液於4℃培養至隔夜。

將細胞以PBS-Tween(3 x 200 μL)清洗並以第二抗體(100 μL；HRP-接合抗-兔IgG,Dako Ltd.,Glostrup,Denmark)培養。然將細胞以基質(50 μL)培養2-20min，接著加入停止溶液(50 μL,1N H₂SO₄)。使用光譜儀以讀數及讀取於450 nm對參照波長655 nm之吸收度偵測ICAM-1訊號。然後以PBS-Tween(3 x 200 μL)清洗細胞並於結晶紫染色(50 μL之2%的PBS溶液)和以1% SDS之蒸餾水溶液(100 μL)沖洗後於595 nm讀取吸收度來測定各孔槽的總細胞數。將測量的OD 450-655讀數除以各孔槽的OD595讀數來校正細胞數。抑制ICAM-1表現係於各試驗化合物之濃度，相較於媒劑對照組來計 算。50%抑制濃度(IC₅₀)係從所生成的濃度反應曲線來測定。

細胞有絲分裂分析

將來自健康受試者之周圍血液單核細胞(PBMC)使用密度梯度(Histopaque^®-1077,Sigma-Aldrich,Poole,UK)自全血中分離出(Quintiles,London,UK)。隨後將PBMC(每各樣本3百萬個細胞)以2% PHA(Sigma-Aldrich,Poole,UK)處理48 hr，接著暴露於各種濃度的試驗化合物20 hr。在收集前2 hr，以秋水仙胺(demecolcine)(0.1 μg/mL；Invitrogen,Paisley,UK，)處理PBMC將細胞阻滯在細胞分裂中期。為了觀察有絲分裂的細胞，係將PBMC透性化並加入Intraprep(50 μL；Beckman Coulter,France)固定，及以抗-磷酸-組蛋白3(0.26 ng/L；#9701；Cell Signalling,Danvers,MA)和碘化丙錠(1 mg/mL；Sigma-Aldrich,Poole,UK，)如先前所述染色(Muehlbauer P.A.和Schuler M.J.,Mutation Research,2003,537：117-130)。使用ATTUNE流式細胞儀(Invitrogen,Paisley,UK)觀察螢光，選通淋巴細胞。有絲分裂之抑制百分比係就各處理相對於媒劑處理(0.5% DMSO)所計算。

鼻病毒引發的IL-8釋放和ICAM-1表現

人類鼻病毒RV16係得自美國典型菌種保存中心(Manassas,VA)。以HRV感染海樂細胞(Hela cell)產生病毒儲株，直到80%的細胞具細胞病變。

將BEAS2B細胞以5 MOI之HRV感染並於33℃緩和震盪下培養2 hr以促進吸收。然後將細胞以PBS清洗，加入新鮮培養基並將細胞另再培養72 hr。收集上清液使用Duoset ELISA展開套組(R&D systems,Minneapolis,MN)進行IL-8濃度分析。

細胞表面之ICAM-1表現量係以細胞為基礎的ELISA來測定。感染72 hr後，將細胞以4%甲醛之PBS溶液固定。加入0.1%疊氮鈉和1%過氧化氫使內生性過氧化酶驟冷後，以清洗緩衝液(0.05% Tween溶於PBS：PBS-Tween)清洗孔槽。以5%牛乳之PBS-Tween溶液封閉1 hr後，將細胞以抗人類ICAM-1抗體之5% BSA PBS-Tween(1：500)溶液培養至隔夜。將細胞以PBS-Tween清洗並以第二抗體(HRP-接合抗-兔IgG,Dako Ltd.)培養。然後加入基質(50 μL)並使用光譜儀讀取於450 nm參照655 nm波長之吸收度來偵測ICAM-1訊號。然後以PBS-Tween清洗細胞並於結晶紫染色和以1% SDS溶液沖洗後於595 nm讀取吸收度來測定各孔槽的總細胞數。將測量的OD_450-655讀數除以各孔槽的OD₅₉₅讀數來校正細胞數。於HRV感染前2 hr加入化合物，及當未感染的HRV被洗出時則於感染後2小時加入。

評估MRC5細胞中HRV16引發的CPE

將MRC-5細胞於含5% FCS和1.5 mM MgCl₂之DMEM中以1 MOI之HRV16感染，接著於33℃培養1 hr以促進吸收。將上清液吸出，及然後加入新鮮培養基 ，接著培養4天。若適當，以化合物或DMSO預培養2 hr，並於洗出病毒後再次加入化合物和DMSO。

將上清液吸出並以伸甲基藍溶液(100 μL,2%甲醛，10%甲醇和0.175%伸甲基藍)於RT培養2 hr。清洗後，於各孔槽加入1% SDS之蒸餾水溶液(100 μL)，並將測定盤輕微震盪1-2 hr，之後讀取660 nm之讀數。計算各孔槽之抑制百分比。從試驗化合物之連續稀釋液所產生成的濃度反應曲線計算IC₅₀值。

活體外RSV病毒載入初代支氣管上皮細胞

於LHC8培養基：RPMI-1640(50：50)含15 mM氯化鎂，將生長於96孔盤之正常的人類支氣管上皮細胞以0.001 MOI之RSV A2(A2株，HPA,Salisbury,UK)感染並於37℃培養1 hr供吸收。然後以PBS(3 x 200 μL)清洗細胞，加入新鮮培養基(200 μL)並持續培養4天。若適當，將細胞以化合物或DMSO預培養2 hr，並於洗出病毒後再次加入化合物或DMSO。

將細胞以4%甲醛之PBS溶液(50 μL)固定20 min，以清洗緩衝液(3 x 200 μL；PBS包括0.5% BSA和0.05% Tween-20)清洗並以封閉溶液(5%煉乳溶於PBS)培養1 hr。然後將細胞以清洗緩衝液清洗(3 x 200 μL)並以抗-RSV(2F7)F-融合蛋白抗體(40 μL；小鼠單株抗體，批號798760，型號ab43812,Abcam)溶於5% BSA之PBS-tween溶液)於RT培養1 hr。清洗後，將細胞以HRP-接合第二抗體(50 μL)溶於5% BSA之PBS-Tween中之溶液(批號00053170，型號P0447,Dako)培養，及 然後加入TMB基質(50 μL；基質試劑包，批號269472，型號DY999,R&D Systems,Inc.)。加入2N H₂SO₄(50 μL)使反應停止並以比色法(OD：450 nm對參照波長655 nm)於微量盤判讀儀(Varioskan® Flash,ThermoFisher Scientific)中測定所產生的訊號。

然後清洗細胞並加入2.5%結晶紫溶液(50 μL；批號8656，型號PL7000,Pro-Lab Diagnostics)歷時30 min。以清洗緩衝液清洗後，於各孔槽加入1% SDS的蒸餾水溶液(100 μL)並將測定盤輕微震盪1 hr，之後讀取595 nm之吸收度。將測量的OD_450-655讀數除以OD₅₉₅讀數來校正細胞數。計算各孔槽之抑制百分比並從化合物之連續稀釋液所產生成的濃度反應曲線計算IC₅₀值。

試驗化合物對細胞存活率之效應：MTT分析

將分化的U937細胞以各試驗化合物(最終濃度1 μg/mL或10 μg/mL於下列所指的200 μL培養基中)於二個方法下預培養：首先於5% FCS RPMI1640培養基中培養4 hr及第二次於10% FCS RPMI1640培養基中培養24 h。以新的培養基置換(200 μL)上清液並於各孔中加入MTT儲存溶液(10 μL,5 mg/mL)。培養1 hr後將培養基移除，於各孔加入DMSO(200 μL)並將測定盤輕微震盪1 hr，之後讀取550 nm之吸收度。相對於媒劑處理(0.5% DMSO)計算各孔槽細胞存活率之喪失百分比。結果，相對於媒劑，藥物處理之細胞存活力明顯增加係為負百分比。

來自COPD之痰巨噬细胞中細胞介素產生

患有COPD之病患使用超音波霧化器(Devilbiss,Carthage,MO)以潮氣呼吸5 min吸入3%(w/v)高張食鹽水。重覆此過程最多三次直到得到足夠的痰量。將痰液樣本使用試管震盪器劇烈均質化並與in 0.02%體積/體積二硫蘇糖醇(DTT)溶液混合。將樣本再懸浮於PBS(40 mL)中，接著以1500 rpm於4℃離心10 min，得到痰細胞團。將此團以PBS(40mL)清洗二次。然後將痰細胞再懸浮於含20 U/mL盤尼西林、0.02 mg/mL鏈黴素和5 μg/mL兩性黴素B之巨噬細胞無血清培養基中(巨噬細胞-SFM,Life technologies,Paisley,UK；使24孔盤達到2x10⁶/孔)並植入高圓96-孔盤中，接著於37℃和5% CO₂下培養2 hr，使巨噬細胞黏附在盤底。以新鮮的巨噬細胞-SFM(200 μL/孔)清洗盤中細胞以移除嗜中性粒細胞和其他污染細胞。使用黏附在盤上的細胞(主要為痰巨噬細胞)用作進一步分析。痰引出和分離係於蓋伊醫院(Guys Hospital)之昆泰藥物研究單位(Quintiles Drug Research Unit)進行，且倫理核可和所寫的知情同意書係由昆泰取得。

若適當，將1 μL含所述濃度之試驗化合物或參照物或之溶液或另外1 μL的DMSO作為媒劑對照組，加到各孔槽中(200 μL溶於培養基)並將細胞培養2 hr。以LPS溶液(50 μL，最終濃度：1 μg/mL)刺激細胞並於37℃和5% CO₂下培養4 hr。然後收集上清液並保持在-80℃。使用Millipore’s luminex套組測量此四個分析。在上清液融化後，將抗體磁珠多組化並於96-孔盤中以標準背景溶液或適量樣本於震盪下以4℃培養至隔 夜。使用磁性盤清洗器將每孔以200 μL套組提供的清洗緩衝液清洗二次後，將微珠以25 μL由套組提供的生物素接合抗體溶液於震盪下在RT培養1 hr。於RT、震盪下加入鏈黴親和素歷時30 min。每孔以200uL清洗緩衝液清洗後，將微珠再懸浮於鞘液中(150 μL)並立即分析。上清液中各分析物之量係使用Xcel擬合軟體以4或5-參數方程式使用各標準曲線來計算。抑制各細胞激素產生，係於各濃度相較於媒劑對照組所計算。使用XL-Fit(idbs,Guildford,UK)從濃度-抑制曲線測定IC₅₀值。

COPD之初代支氣管上皮細胞中細胞介素產生

來自COPD病患之初代氣管上皮細胞係購自Asterand公司(Royston,UK)，並於支氣管上皮細胞生長培養基中培養，該培養基係藉由將LHC8(Invitrogen)(500 mL)與LHC9(Invitrogen)(500 mL)共同和3 μL的視網酸溶液(5 mg/mL溶於純DMSO)混合所製備。將培養基吸出並於各孔中加入新鮮的BEGM(200 μL)。若適當，加入1 μL所述濃度之試驗化合物或1 μL的DMSO作為媒劑對照組，並將細胞培養2 hr。以TNFα(50 μL；最終濃度50 ng/mL)刺激細胞及然後於37℃和5% CO₂培養4 hr。然後收集上清液並存放於-20℃。

IL-6和IL-8的量係以ELISA使用R&D系統之人類IL-6和IL-8 Duoset® Elisa套組來測定。抑制IL-6和IL-8產生係於各濃度相較於媒劑對照組相來計算。50%抑制濃度係使用XL-Fit(idbs,Guildford,UK)從所生成 的濃度-抑制曲線來測定。

活體內篩選：藥效動力學和抗發炎活性 小鼠中LPS-引發的嗜中性粒細胞堆積

非禁食Balb/c小鼠於所指的時間(在2-8 hr的範圍內)以氣管內路徑給劑媒劑或試驗物質，之後施予LPS刺激發炎反應。於T=0時，將小鼠放入暴露箱中，暴露於LPS(7.0 mL,0.5 mg/mL之PBS溶液)歷時30 min。另再8 hr後，將小鼠麻醉，將其插管並以灌注萃取BALF，及然後從其肺中經由氣管導管抽取1.0 mL的PBS。使用Neubaur血球計測量BALF樣本中全部和分化的白血球數。BALF樣本之細胞離心塗片係於RT以200 rpm離心5 min並使用DiffQuik染色系統(Dade Behring)染色所製備。使用油浸顯微鏡計算細胞數。BAL中之嗜中性粒細胞數目的數據係以平均值±S.E.M.(平均值標準差)來表示。嗜中性粒細胞堆積之抑制百分比係相對於媒劑治療就各治療所計算。

香菸煙霧模型

使用小型動物之香菸煙霧吸入實驗系統(Model SIS-CS；Sibata Scientific Technology,Tokyo,Japan)，將A/J小鼠(雄性，5星期大)暴露於香菸煙霧中(4%菸煙，經空氣稀釋)歷時30 min/天共計11天。在最終的香菸煙霧暴露後，以鼻內每天1次給予試驗物質(35 μL於50% DMSO/PBS中之溶液)共計3天。在最後給劑後12 hr，將各動物麻醉，插管並收集肺泡灌洗液(BALF)。肺泡巨 噬細胞和嗜中性粒細胞之數目係以FACS分析(EPICS^® ALTRA II,Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,CA,USA)使用抗-小鼠MOMA2抗體(巨噬細胞)或抗小鼠7/4抗體(嗜中性粒細胞)來測定。將BALF離心並收集上清液。使用Quentikine^®小鼠KC ELISA套組(R&D systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)計量BALF中角質細胞化學吸引因子(KC；CXCL1)。

實例1-製備化合物(I)

下列用於製備本發明化合物(I)之中間物先前已有描述且係使用下列所引述的參考文獻所涵蓋的製程來製備(表3)。

中間物C：4-((4-胺基萘-1-基)氧基)-N-苯基嘧啶-2-胺

於通入氮氣之中間物B(50.0 g,184 mmol)和苯胺(42.0 mL,460 mmol)於THF(200 mL)混合物中之溶液一次加入pTSA(17.5 g,92.0 mmol)。將反應混合物加熱至70℃歷時1.5 hr，在此期間有沉澱形成。將混合物冷卻至RT並以THF(200 mL)稀釋。以過濾收集沉澱，以THF(2 x 100mL)清洗及然後懸浮於DCM(600 mL)和aq.NaOH(2M,200 mL)之非均相混合物並劇烈攪拌1 hr，於此期間懸浮的固體溶解。進行分層並以DCM(200 mL)萃取水層。將DCM萃取液組合，乾燥及真空蒸發。將殘餘物以乙醚(150 mL)濕磨並將生成的固體以乙醚(2 x 50 mL)清洗，得到中間物C為灰白色固體(26 g,43%)；R^t 1.95 min(方法2)；m/z 329(M+H)⁺(ES⁺)。

化合物(I)：1-(3-(第三丁基)-1-(對甲苯基)-1H-吡唑-5-機)-3-(4-((2-(苯基胺基)嘧啶-4-基)氧基)萘-1-基)脲

將Na₂CO₃(3.84 g,36 mmol)之水(42 mL)溶液和中間物A(10.5 g,45.7 mmol)於乙酸異丙酯(130 mL,1.082 mol)中之非均相混合物於RT劇烈攪拌5 min及然後以氯甲酸苯酯(5.77 mL,45.7 mmol)處理。將混合物另再持續攪拌4 hr，之後進行分層。將有機層加入中間物C(10.0 g,30.5 mmol)和三乙胺(423 μL,3.05 mmol)之乙酸異丙酯(60 mL,511 mmol)溶液。將反應混合物升溫至48℃歷時1 hr，然後以乙酸異丙酯(190 mL)稀釋並冷卻至RT另再歷時18 hr，於此期間有沉澱形成。以過濾分離沉澱，以乙酸異丙酯清洗及然後於40℃真空乾燥，得到標題化合物，化合物(1)為白色固體(無水游離鹼，多形物A型)(16.5 g,92%)；R^t 2.74 min(方法2)；m/z 584(M+H)⁺(ES⁺)；¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆)δ：1.30(9H,s),2.41(3H,s),6.43(1H,s),6.58(1H,d),6.78(1H,t),6.97(2H,t),7.28(2H,br m),7.39(2H,d),7.40(1H,d),7.49(2H,d),7.56(1H,m),7.63(1H,m),7.82(1H,dd),7.95(1H,d),8.10(1H,d),8.40(1H,d),8.77(1H,s),9.16(1H,br s),9.50(1H,br s).

實例2-活體外和活體內篩選結果之總述

相較於結構上相關的參照化合物 N-(4-(4-(3-(3-第三丁基-1-對甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)萘-1-基氧基)吡 啶-2-基)-2-甲氧基乙醯胺，其已於先前描述為具有抗病毒活性之有效的抗發炎劑(Ito,K.等人，WO 2010/112936,PCT/GB2010/050575,7 Oct 2010 and Ito,K.等人，WO 2010/067130,PCT/GB2009/051702,17 Jun 2010)，文中所揭示之化合物(I)的活體外特性，如使用上述方法所測，係如下所示(表3a-c)。

在激酶酵素分析之範圍分析中，除了化合物(I)對酵素GSK3α之抑制活性明顯例外，其比參照化合物弱很多(表4a)之外，本發明化合物展現與參照化合物非常類似的抑制特性。

本發明化合物(I)之激酶結合特性亦與參照化合物對p38 MAPK、HCK、cSrc、Syk和GSK3α/β作比較。化合物(I)展現非常不同的表型，其顯示對p38MAPK、HCK、cSrc和Syk激酶完全的結合抑制作用，對GSK3α無明顯效應(表4b)。

在細胞分析中，本發明化合物展現與參照化合物非常類似的抑制特性，其顯示抗內毒素媒介的TNFα和IL-8釋放之抗發炎特性(表4c)。在測量其對呼吸病毒複製之效應(HRV引發的ICAM1和CPE表現及F-蛋白之RSV刺激的表現)以及病毒引發的發炎作用(HRV誘發IL-8釋放；表4d)之細胞系統中，化合物之特性亦相類似。

本發明化合物在得自對氟替卡松丙酸鹽(一種皮質類固醇)非常不敏感之COPD病患的痰巨噬細胞和支氣管上皮細胞之前發炎細胞激素產生中，展現較高的效力(表4e)。

1. E-max值(最大抑制)係以於0.1 μg/mL得到的抑制%所計算

然而，有利地，化合物(I)在測量其對細胞存活力和細胞分裂(有絲分裂)之影響的分析中顯現明顯較低的活性，其表示化合物可能具有優於參照化合物之卓越的治療指數(表4f)。

1.細胞存活率篩選：-ve和+ve分別表示該值係低於或高於，無顯著效應閥值定義為在所指的時間點於1 μg/mL時30%之抑制。

發現以化合物(I)治療小鼠對LPS-引發的嗜中性粒細胞堆積產生劑量相關(dose dependent)的抑制作用，及時間時程實驗顯示藥物具有長時間作用效期(表5)。

1. N=每組8隻

探討小鼠香菸煙霧模型中以化合物(I)治療對BALF中巨噬細胞和嗜中性粒細胞堆積之結果(表6a)。用於此研究之香菸煙霧模型根據報告為皮質類固醇難治療系統(Medicherla S.等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,2008,324(3)：921-9.)，並確認以1.75 μg/小鼠(35 μL,bid,i.n.)之氟替卡松丙酸鹽無法抑制嗜中性粒細胞或巨噬細胞堆積在氣管中，相同的劑量對LPS-引發的嗜中性粒細胞堆積產生>80%抑制。

發現以化合物(I)治療小鼠對於香菸煙霧引發的BALF之巨噬細胞和嗜中性粒細胞堆積，產生劑量相關的抑制作用。

細胞數之數據係以平均值±SEM來表示，N=5

以化合物(I)治療小鼠亦以劑量相關的方式抑制BALF中香菸煙霧引發的CXCL1(KC)產生(表6b)。

CXCL量之數據係以平均值±SEM來表示，N=5

總言之，這些結果顯示化合物(I)具有與上文所揭示的參照化合物類似的抗發炎特性，且有利地，係與優越的治療指數有關。

實例3：製備化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼

將化合物(I)(398 g，多形物A型)置於丙酮(3.98 L)中並將此溶液加熱至50℃。然後加入NORIT A SUPRA(19.9 g，一種活性碳)和鍛燒矽藻土(3.98 g；一種過濾劑)並將混合物加熱(56℃)回流15 min。將混合物過濾並將生成的固體以丙酮(100 mL)清洗。將組合的濾液和清洗丙酮升溫回流(56℃)，及經由於56℃大氣壓下蒸餾，移除900 mL的溶劑。將混合物冷卻至50℃及然後於1 hr時間內加入水(398 mL)，同時將溫度維持在50℃。於50℃另經歷30 min後，將非均相混合物於6 h內冷卻至20℃及然後於20℃攪拌10 hr。將生成的產物過濾並以丙酮(318 mL)清洗濾餅。將產物於45℃真空乾燥20 hr，得到化合物(I)為固體晶體多形物B型之無水游離鹼(240.9 g；60.5%產率)。

上述方法可視需要做調整以便於引晶促進結晶。

實例3a：製備含低量殘餘溶劑之化合物(I)固體晶體多形物B型的無水游離鹼

視需要，根據上述製程(實例3)或類似方法所製備的化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼，可如下以水再形成漿液以便降低殘餘的溶劑：將化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼(230 g，如實例3所製備)懸浮於去離子水(2.30 L)中並於20℃攪拌4 hr。將混合物過濾並以去離子水(2 x 115 mL)清洗產物，及然後於45℃真空乾燥，得到含低量殘餘溶劑之化合物(I)固體晶體多形物B型的無水游離鹼(227 g,98.7%)。

實例4：化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼之微米化

微米化之化合物(I)晶體多形物B型的無水游離鹼係使用噴射磨碎微米化裝置(1.5 bar使用手動入料以1.5 bar的注入器壓力)(由Hosokawa Alpine所生產)來製備。顆粒大小分布係使用雷射繞射(Malvern Mastersizer 2000S儀器)來測量。顆粒大小分布可使用D₁₀、D₅₀和D₉₀值來代表。顆粒大小分布之D₅₀中間數值係定義為此分布對半分以微米表示之顆粒大小。由雷射繞射所產生的測量值比用體積分布描述更精確，而因此使用此程序所得到的D₅₀值，更有意義地係稱為Dv₅₀值(體積分布之中位數值)。如文中所用Dv值係指使用使用雷射繞射所測量的顆粒大小分布。同樣地，D₁₀和D₉₀值，用於雷射繞射中，係用來表示Dv₁₀和Dv₉₀值及係分別指10%的分布在D₁₀值以下，及90%的分布係在D₉₀值以下之顆粒大小。化合物(I)之微米化晶體多形物B型的無水游離鹼具有下列顆粒大小分布：0.850 μm之D₁₀；1.941 μm之D₅₀和4.563 μm之D₉₀。

實例5：化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離 鹼的XRPD分析

使用通用製程中所述的方法進行化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離鹼的XRPD分析(多形物B型係依照實例4之製程微米化)。所產生的繞射圖分別係如圖1和2所示。二個XRPD圖顯示繞射波峰無鹵基存在，因此表示二種物質皆為晶體。波峰及其強度係如下所示(表7a和表7b)。

1.其值為±0.2度

1.其值為±0.2度

實例6：測定化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離鹼的熔點

化合物(I)固體晶體多形物A和B型之無水游離鹼(後者經微米化)的熔點是使用示差掃描量熱儀(DSC)，如通用製程所述取得。多形物A型於191.6℃熔化而多形物B型係於214.0℃熔化。從所計算的DSC數據，B型具有高於A型之熔解熱。因為B型亦具有高於A型之熔點，此顯示多形物A和B型為單變性相關，其表示在所有的溫度，較高熔點的多形物B型應比較低熔點的多形物A型更穩定。因此，可預期在熱力學上多形物B型比多形物A型更穩定。

實例7：微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水 游離鹼的熱分析

化合物(I)固體晶體B型之無水游離鹼(微米化)的熱分析係使用TGA、DVS、XRPD分析、IR光譜和DSC如通用製程所述來進行。若適當，將置於周圍溫度和相對濕度之樣本(參照樣本/“0天”)與儲存於各種溫度和相對濕度之樣本(比較樣本)作比較。

熱重分析：將分析前暴露於不同儲存條件之參照樣本(t=0)和比較樣本以20℃/min之速率從RT加熱至300℃。參照樣本(t=0)之TGA曲線係如圖3所示及所有樣本之結果係總述於下(表7)。如從圖3可看到的，在RT至180℃的溫度範圍內可觀察到失重0.6%，其係由於溶劑蒸發。180℃以上的失重係由於產物之蒸發和分解。將此失重之性質與表7中比較樣本之失重性質相比較，並未觀察到顯著的差異。

動態水份吸附：微米化參照樣本之DVS等溫圖係如圖4所示及微米化參照樣本之DVS質量變化圖係如圖5所示。在起初的乾燥步驟期間，無顯示失重且產品顯示無吸濕性。依照大氣濕度，產品吸收至高0.4%水氣。在試驗期間發現產品完全乾燥並保持在相同的晶體固體狀態(B型)，如IR光譜所證明及XRPD圖形在DVS分析前後實質上相同。

XRPD分析和IR光譜：參照樣本(t=0)之XPRD繞射圖係如圖2所示及IR記錄係如圖6所示。將此XPRD繞射圖與IR記錄與比較樣本(暴露於不同的儲存條件) 的XPRD繞射圖與IR記錄作比較，結果係總述於表7中。所有的樣本繞射圖和IR記錄皆相同。

示差掃描量熱法：將先前暴露於不同儲存條之參照樣本(t=0)和比較樣本以10℃/min之速率從25℃加熱至300℃。參照樣本之DSC曲線係如圖7所示而所有樣本之結果係總述於下(表8)。從圖7，證明參照樣本在214.0℃分解熔化。

1. Cryst.：晶體；2.~Ref：圖形與參照樣本相同，3.最高(℃)；NT：此分析中未進行試驗

總言之，證明化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼具有良好的物理穩定性。

實例8：微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼的HPLC分析

微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼的化學穩定性係藉由與放置在環境溫度和相對濕度之樣本(參照樣本)與儲存在各種溫度和上文所述的相對濕度之樣本(比較樣本，表8)作比較來測定。然後將參照樣本和比較樣本以HPLC使用通用製程所述之方法並藉由目視檢驗加以分析。此研究之結果(數據總述於表9中)顯示化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼，雖然觀察到對光有些敏感，但為化學上穩定的。

1.在此分析系統中NT；2.刺激的晝光：燈箱700 W/m²。

實例9-製備醫藥調配物

本發明之示例醫藥調配物應由0.4重量%之化合物(I)(為固體晶體多形物B型之無水游離鹼)、98.6重量%之乳糖單水合物(吸入等級)和1.0重量%硬脂酸鎂所組成，其中所有組份之重量%係以乾燥醫藥調配物之重量為基準。

整個說明書和下列之申請專利範圍，除非文中需要，否則術語「包括(comprise)」及變化例如「包括(comprises和comprising)」應了解係意味包括所述的整體、步驟或整體之群組或步驟之群組，但不排除任何其他整體、步驟或整體之群組或步驟之群組。

文中所指出之所有的專利和專利申請書係以其全文併入作為參考。

圖1係顯示由化合物(I)固體晶體多形物A型之無水游離鹼樣本所得來的X-光粉末繞射(XRPD)圖。

圖2係顯示由微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼樣本所得來的XRPD圖。

圖3係顯示由微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼樣本的熱重分析結果。

圖4係代表衍生自微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼樣本的動態水份吸附(DVS)等溫圖。

圖5係代表於微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼中所進行的磁滯實驗結果，用以測定隨時間對相對濕度變化之水份吸附和解吸的程度和速率。

圖6為得自微米化後化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼樣本的紅外線(IR)光譜。

圖7係顯示化合物(I)固體晶體多形物B型之無水游離鹼樣本(微米化)之示差掃描量熱儀(DSC)的熱分析。

Claims (16)

1. 一種式(I)化合物 或其醫藥上可接受鹽，包括其所有的立體異構物和互變異構物。
2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其為游離鹼。
3. 如申請專利範圍第2項之化合物，其為固體晶體形式之無水游離鹼。
4. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中該式(I)化合物為固體晶體形式之無水游離鹼，其具有實質上如圖1所示之X-光粉末繞射圖(A型)。
5. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中該式(I)化合物為固體晶體形式之無水游離鹼，其具有包含一、二、三、四、五、六或七個選自(±0.2)10.3、15.2、17.5、23.1、24.6、26.7和27.4之2-θ度波峰的X-光粉末繞射圖。
6. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中該式(I)化合物為固體晶體形式之無水游離鹼，其具有實質上如圖2所示之X-光粉末繞射圖(B型)。
7. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中該式(I)化合物為固體晶體形式之無水游離鹼，其具有包含一、 二、三、四、五、六或七個選自(±0.2)3.9、6.1、11.8、14.3、16.7、18.3、18.7和28.9之2-θ度波峰的X-光粉末繞射圖。
8. 一種醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1至7項中任一項之化合物與一或多種醫藥上可接受的稀釋劑或載劑組合。
9. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物，係用作為醫藥品。
10. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，係用於治療或預防病患中慢性呼吸疾病，例如COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、氣喘、小兒氣喘、囊狀纖維化、類肉瘤、特發性肺纖維化之惡化。
11. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，係用於治療或預防由下列選出之症狀：COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、氣喘、小兒氣喘、囊狀纖維化、類肉瘤、特發性肺纖維化、過敏性鼻炎、鼻炎、鼻竇炎、過敏性結膜炎、結膜炎、過敏性皮膚炎、接觸性皮膚炎、乾癬、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎或骨關節炎之續發性關節發炎、類風濕性關節炎、胰臟炎、惡質病、抑制腫瘤生長和轉移，該腫瘤包括非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、大腸直腸癌和惡性黑色素瘤。
12. 一種如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物之用途，係用於製造醫藥品供治療或預防由下列選出之症狀：COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、氣喘、小兒氣喘、囊狀纖維化、類肉瘤、特發性肺纖維化、過敏性鼻炎、鼻炎、鼻竇炎、肺高血壓、過敏性結膜炎、結膜炎、過敏性皮膚炎、接觸性皮膚炎、乾癬、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎或骨關節炎之續發性關節發炎、類風濕性關節炎、胰臟炎、惡質病、抑制腫瘤生長和轉移，該腫瘤包括非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、大腸直腸癌和惡性黑色素瘤。
13. 一種治療由下列選出之症狀之方法：COPD(包括慢性支氣管炎和肺氣腫)、氣喘、小兒氣喘、囊狀纖維化、類肉瘤、特發性肺纖維化、過敏性鼻炎、鼻炎、鼻竇炎、過敏性結膜炎、結膜炎、過敏性皮膚炎、接觸性皮膚炎、乾癬、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎或骨關節炎之續發性關節發炎、類風濕性關節炎、胰臟炎、惡質病、抑制腫瘤生長和轉移，該腫瘤包括非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、大腸直腸癌和惡性黑色素瘤，該方法包括將一治療上有效量之如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物投予一對象。
14. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，係用於治療或預防患有慢性症狀，例如鬱血性心衰竭、糖尿病、癌症之病患或免疫抑制病患(例如器官移植後)之呼吸道病毒感染。
15. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，係與抗病毒治療劑例如紮那米韋(zanamivir)或奧司他韋(oseltamivir)(例如奧司他韋磷酸鹽)組合，用於治療或預防患有慢性症狀，例如鬱血性心衰竭、糖尿病、癌症之病患或免疫抑制病患(例如器官移植後)之呼吸道病毒感染。
16. 一種組合產品，其包括：(A)如申請專利範圍第1至7項中任一項之式(I)化合物；及(B)另外的治療劑；其中各(A)和(B)組份係與醫藥上可接受的稀釋劑或載劑混合調配；其中該組合產品可為單一醫藥調配物或部件之套組。