BR112014002618B1 - Anticorpo, composição farmacêutica, dna, uso de um anticorpo e uso de uma composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA, DNA, USO DE UM ANTICORPO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DE UMA COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA. Um objetivo da presente invenção é preparar um anticorpo que atinge CAPRIN-1, expressa especificamente na superfície de células cancerosas e é superior na atividade antitumoral, e fornecer o uso do anticorpo como um agente terapêutico e/ou preventivo para câncer. A presente invenção fornece o uso de um anticorpo direcionado a uma proteína antigênica de câncer identificada, expressa especificamente na superfície de células cancerosas como um agente terapêutico e/ou preventivo para câncer, especificamente, uma composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende como um ingrediente ativo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, cujo anticorpo ou o fragmento o do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende sequê ncias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 9, 10 e 11.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao novo uso de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um fragmento do mesmo em uma droga, como um agente terapêutico e/ou agente preventivo para câncer.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] O câncer é a principal causa de morte. Essa doença é atualmente tratada principalmente por terapia cirúrgica, em combinação com radioterapia e/ou quimioterapia. Apesar do recente desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas ou descoberta de novos agentes anticâncer, o tratamento existente de câncer tem um resultado melhorado de maneira insuficiente, com exceção de alguns tipos de câncer. Com os recentes avanços da biologia molecular ou imunologia do câncer, os anticorpos que reagem especificamente com câncer, antígenos de câncer que são reconhecidos por células T citotóxicas, genes que codificam esses antígenos de câncer, e outros foram identificados, elevando as expectativas sobre terapia de câncer direcionada aos antígenos de câncer (Literatura Não Patente 1).
[003] Para reduzir o efeito colateral da terapia de câncer, é desejável que os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas reconhecidas como antígenos do câncer devem existir raramente nas células normais e existem especificamente nas células cancerosas. Em 1991, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) isolaram um antígeno de melanoma humano MAGE1 reconhecido por células T CD8 positivas por um método de clonagem de expressão de cDNA com o uso de linhagens celulares de câncer autólogas e células T reativas de câncer (Literatura Não Patente 2). Então, um método SEREX (identificação sorológica de antígenos por clonagem de expressão recombinante) foi relatado, o qual adota uma abordagem de clonagem de expressão de genes para identificar antígenos tumorais reconhecidos pelos anticorpos produzidos em resposta ao câncer autólogo in vivo em um paciente com câncer (Literatura de Patente 3 e Literatura de Patente 1). De acordo com esse método, alguns antígenos de câncer que raramente são expressos em células normais e são especificamente expressos no câncer foram isolados (Literaturas Não Patentes 4 a 9). Além disso, a terapia celular com o uso de imunócitos que reagem especificamente com antígenos de câncer ou imunoterapia específica para o câncer com o uso de vacinas ou os similares que compreendem antígenos de câncer estão em estudo clínico direcionando alguns dos antígenos de câncer isolados.
[004] Nos últimos anos, várias drogas de anticorpos para o tratamento do câncer que direcionam proteínas antigênicas em células de câncer surgiram no mundo. Essas drogas têm recebido atenção por causa de sua certa eficácia como agentes terapêuticos específicos de câncer. Uma grande maioria de proteínas antigênicas direcionadas pelas drogas, no entanto, também são expressas em células normais. Como resultado da administração dos anticorpos, as células normais que expressam os antígenos, bem como as células cancerosas são danificadas, resultando de maneira desvantajosa em efeitos colaterais. Dessa forma, se os antígenos de câncer especificamente expressos na superfície de células cancerosas pode ser identificado e anticorpos direcionados contra os antígenos podem ser usados como drogas, espera-se que essas drogas de anticorpos possa alcançar um tratamento com menos efeitos colaterais.
[005] A proteína 1 associada à ativação citoplasmática e proliferação (CAPRIN-1) tem sido conhecida como uma proteína intracelular que é expressa após a ativação ou divisão celular das células normais em repouso e forma grânulos de estresse citoplasmático com RNAs intracelulares para participar na regulação do transporte e tradução de mRNAs. Descobriu-se que essa proteína é especificamente expressa na superfície de células cancerosas e, portanto, mediante estudo como um alvo de anticorpos de drogas para o tratamento do câncer (Literatura de Patente 2). LISTA DE CITAÇÕES LITERATURA DE PATENTE Literatura de Patente 1: patente US 5698396 Literatura de Patente 2: documento WO 2010/016526 LITERATURA NÃO PATENTE Literatura Não Patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, “Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy”, 1997, Vol. 24, p. 511-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan) Literatura Não Patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991) Literatura Não Patente 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995) Literatura Não Patente 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997) Literatura Não Patente 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Literatura Não Patente 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Literatura Não Patente 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999) Literatura Não Patente 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Literatura Não Patente 9: Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[006] Um objetivo da presente invenção é produzir um anticorpo que atinge CAPRIN-1, expressa especificamente na superfície de células cancerosas e tem atividade antitumoral maior do que os anticorpos convencionais, e fornecer o uso do anticorpo como um agente terapêutico e/ou preventivo para câncer.
SOLUÇÃO DO PROBLEMA
[007] A presente invenção tem os seguintes aspectos:
[008] A presente invenção fornece um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, cujo anticorpo ou o fragmento do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NOs: 9, 10 e 11.
[009] Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo biespecífico.
[010] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo ou o fragmento do mesmo, como um ingrediente ativo.
[011] Em uma realização da presente invenção, o câncer é câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de intestino grosso, câncer de pulmão, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
[012] O presente relatório descritivo engloba os conteúdos divulgados no pedido de patente japonesa 2011-171379 com base no qual é reivindicada a prioridade do presente pedido.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[013] O anticorpo contra CAPRIN-1 usado na presente invenção danifica as células cancerosas. Dessa forma, o anticorpo contra CAPRIN-1 é útil no tratamento e/ou prevenção de câncer.
DESCRIÇÃO DAS REALIZAÇÕES
[014] O anticorpo contra um polipeptídeo CAPRIN-1, usado na presente invenção, pode ser examinado para sua atividade antitumoral, conforme descrito posteriormente, ao examinar in vivo a inibição da proliferação do tumor em um animal portador de câncer ou por exame ex vivo da presença ou da ausência de atividade citotóxica mediada por imunócito ou complemento exibida por um anticorpo contra as células tumorais que expressam o polipeptídeo.
[015] O anticorpo contra CAPRIN-1 usado na presente invenção é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à proteína CAPRIN-1. Como um anticorpo monoclonal pode ser qualquer tipo de anticorpo que exerça atividade antitumoral e inclui, por exemplo, anticorpos animais não humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo, rato, coelho e galinha), anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de cadeia única (scFv)), anticorpos humanos e seus fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab’)2 e Fv). Esses anticorpos e fragmentos do mesmo podem ser preparados por métodos geralmente conhecidos pelos técnicos no assunto. No caso de um sujeito de teste humano, é desejável um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado para evitar ou suprimir a rejeição.
[016] O anticorpo é qualquer classe de molécula de imunoglobulina, por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD ou IgY, ou qualquer subclasse, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ou IgA2.
[017] O anticorpo pode ser ainda modificado por acetilação, formilação, amidação, fosforilação, peguilação, ou similares, além de glicosilação.
[018] Neste contexto, a frase “que se liga especificamente à proteína CAPRIN-1” significa que o anticorpo se liga especificamente à proteína CAPRIN-1 sem se ligar substancialmente a outras proteínas.
[019] O sujeito de teste para receber o tratamento e/ou prevenção do câncer de acordo com a presente invenção é um mamífero, como um humano, um animal de estimação, gado ou um animal de competição, preferencialmente um humano.
[020] Desse ponto em diante, a preparação do antígeno, a preparação do anticorpo e uma composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção, serão descritas.
PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO PARA A PREPARAÇÃO DO ANTICORPO
[021] As proteínas ou os fragmentos das mesmas usadas como antígenos sensibilizantes para a obtenção do anticorpo contra CAPRIN-1, usado na presente invenção, não são limitados pelos tipos de animais que servem como suas origens, incluindo humanos, cães, bovinos, cavalos, camundongos, ratos e galinhas. As proteínas ou os fragmentos das mesmas, entretanto, são preferencialmente selecionados de acordo com a compatibilidade com as células parentais para uso na fusão celular. Em geral, as proteínas derivadas de mamíferos são preferenciais. Particularmente, as proteínas derivadas de humanos são preferenciais. Por exemplo, quando CAPRIN-1 é CAPRIN-1 humana, as proteínas CAPRIN-1 humanas, e parte dos peptídeos das mesmas, ou células que expressam CAPRIN-1 humana podem ser usadas como antígenos sensibilizantes.
[022] As sequências de nucleotídeos e as sequências de aminoácidos de CAPRIN-1 humano e os homólogos da mesma podem ser obtidas, por exemplo, pelo acesso ao GenBank (NCBI, EUA) e uso do algoritmo BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). 5873-5877, 1993; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).
[023] Na presente invenção, com referência à sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1 ou 3) ou sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 ou 4) de CAPRIN-1 humana, os alvos são os ácidos nucleicos ou as proteínas que consistem nas sequências que têm 70% a 100%, preferencialmente 80% a 100%, mais preferencialmente 90% a 100%, ainda mais preferencialmente 95% a 100%, por exemplo, 97% a 100%, 98% a 100%, 99% a 100% ou 99,5% a 100% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos ou com a sequência de aminoácidos do ORF ou da porção madura da referência. Neste contexto, o termo “% de identidade de sequência” significa a porcentagem (%) do número de aminoácidos idênticos (ou bases) em relação ao número total de aminoácidos (ou bases) quando duas sequências são alinhadas, de modo que o grau máximo de similaridade ou identidade possa ser atingido com ou sem gaps introduzidos.
[024] Os fragmentos de cada proteína CAPRIN-1 têm comprimentos que variam do comprimento do aminoácido de um epítopo (ou um determinante antigênico), que é a menor unidade reconhecida do anticorpo, até menos que o comprimento total da proteína. O epítopo refere-se a um fragmento de polipeptídeo que tem antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferencialmente em humanos. Sua menor unidade consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos.
[025] Os polipeptídeos que compreendem as proteínas CAPRIN-1 humanas acima e os peptídeos parciais das mesmas podem ser sintetizados de acordo com os métodos de síntese química, por exemplo, os métodos Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonila) e tBoc (t-butiloxicarbonila) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japão), 1981). Além disso, esses polipeptídeos podem ser sintetizados por métodos de rotina com o uso de vários sintetizadores de peptídeo disponíveis comercialmente. De maneira alternativa, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos podem ser preparados com o uso de abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edição, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.) e incorporados nos vetores de expressão, os quais são então introduzidos nas células hospedeiras de modo que as células hospedeiras produzam os polipeptídeos. Desta forma, os polipeptídeos de interesse podem ser obtidos.
[026] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos podem ser prontamente preparados por abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica ou por métodos de rotina com o uso de sintetizadores de ácido nucleico disponíveis comercialmente. Por exemplo, um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de um gene de CAPRIN-1 humana pode ser preparado por PCR com o uso de uma biblioteca de DNA cromossômico ou cDNA humanos como um molde e um par de primers projetados de modo que sejam capazes de amplificar a sequência de nucleotídeos descritas na SEQ ID NO: 1. As condições de reação para esse PCR podem ser determinadas de maneira apropriada. Os exemplos das condições podem incluir, mas não se limitam a, 30 ciclos de cada envolvendo as etapas de reação que consiste em 94°C durante 30 segundos (desnaturação), 55°C durante 30 segundos a 1 minuto (anelamento) e 72°C durante 2 minutos (alongamento) com o uso de DNA polimerase com tolerância térmica (por exemplo, Taq polimerase, Pfu polimerase) e um tampão de PCR contendo Mg2+, seguido pela reação em 72°C durante 7 minutos. A abordagem de PCR, as condições, etc. estão descritas, por exemplo em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (particularmente, Capítulo 15).
[027] Além disso, sondas apropriadas ou primers podem ser preparados com base nas informações sobre as sequências de nucleotídeos do gene da CAPRIN-1 e das sequências de aminoácidos das proteínas CAPRIN-1 e usadas na triagem, por exemplo, da biblioteca de cDNA humano, para isolar o DNA desejado. Preferencialmente, uma biblioteca de cDNA é produzida a partir de células, órgãos ou tecidos que expressem as proteínas CAPRIN-1. Exemplos dessas células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados dos testículos, de cânceres ou de tumores como leucemia, câncer de mama, linfoma, tumor cerebral, câncer pulmonar, câncer pancreático e câncer do intestino delgado. Essas operações, incluindo a preparação de sondas e primers, a construção de uma biblioteca de cDNA, a triagem da biblioteca de cDNA e a clonagem do gene de interesse, são conhecidos pelos técnicos no assunto e podem ser realizadas de acordo com os métodos descritos em, por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), e Ausubel et al. (ibid.). Os DNAs que codificam as proteínas CAPRIN-1 humanas e os peptídeos parciais das mesmas podem ser obtidos a partir do DNA obtido dessa forma.
[028] As células hospedeiras podem ser quaisquer células capazes de expressar os polipeptídeos acima. Exemplos de células procariontes incluem, mas não se limitam a E. coli. Exemplos de células eucariontes incluem, mas não se limitam a: células de mamífero, como células de rim de macaco COS1 e células de ovário de hamster chinês CHO; uma linhagem celular de rim embrionário humano HEK293; linhagem celular de pele embrionária de camundongo NIH3T3; células de levedura como levedura de brotamento e células de levedura de fissão; células de bicho da seda; e células de ovo de Xenopus.
[029] No caso do uso de células procariontes, como células hospedeiras, os vetores de expressão usados devem ter uma origem que permita a replicação nas células procariontes, um promotor, um sítio de ligação ribossômico, um sítio de multiclonagem, um terminador, um gene de resistência à droga, um gene complementar auxotrófico, etc. Exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir séries pUC, pBluescriptII, sistemas de expressão pET e sistemas de expressão pGEX. Os DNAs que codificam os polipeptídeos podem ser incorporados nos vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras procariontes são então transformadas, seguido pela cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipeptídeos codificados pelos DNAs sejam expressos nas células hospedeiras procariontes. A esse respeito, os polipeptídeos podem ser expressos como proteínas de fusão com outras proteínas.
[030] No caso do uso de células eucariontes como células hospedeiras, vetores de expressão para células eucariontes que têm um promotor, uma região de splicing, um sítio de adição de poli(A), etc., são usados como vetores de expressão. Exemplos desses vetores de expressão podem incluir vetores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK- RSV, EBV, pRS, pcDNA3 e pYES2 . Da mesma forma que acima, os DNAs que codificam os polipeptídeos acima podem ser incorporados nos vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras eucariontes são então transformadas, seguido pela cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipeptídeos codificados pelos DNAs sejam expressos nas células hospedeiras eucariontes. No caso dos vetores de expressão como pIND/V5- His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 ou pEGFP-C1, os polipeptídeos podem ser expressos como várias proteínas de fusão marcadas com a tag His (por exemplo, (His)6 - (His)10), tag FLAG, tag myc, tag HA, GFP ou similares.
[031] Os vetores podem ser introduzidos nas células hospedeiras com o uso de métodos bem conhecidos, como eletroporação, um método de fosfato de cálcio, um método de lipossomo, um método de dextrano DEAE, microinjeção, infecção viral, lipofecção e ligação com peptídeos de penetração celular.
[032] O polipeptídeo de interesse pode ser isolado e purificado a partir de células hospedeiras por uma combinação de operações de separação conhecidas na técnica. Exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, tratamento com desnaturante (por exemplo, ureia) ou um detergente, ultrassonicação, digestão enzimática, dessalinização, fracionamento com solvente e precipitação, diálise, centrifugação, ultrafiltração, filtração em gel, SDS-PAGE, eletroforese com foco isoelétrico, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.
ESTRUTURA DO ANTICORPO
[033] Os anticorpos são geralmente glicoproteínas heteromultiméricas que compreendem pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As imunoglobulinas, exceto IgM, são glicoproteínas heterotetraméricas, de aproximadamente 150 kDa cada, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ponte bissulfeto covalente única, embora o número de pontes bissulfeto entre as cadeias pesadas varie entre os diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada uma das cadeias leve e pesada também tem uma ponte bissulfeto entre as cadeias. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) em uma extremidade, seguido por uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região VL) em uma extremidade e tem uma única região constante na outra extremidade. A região constante da cadeia leve é alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada, enquanto o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. As regiões particulares denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis de anticorpo exibem a variabilidade específica e comprometem a especificidade de ligação ao anticorpo. As porções relativamente conservadas nas regiões variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis completos das cadeias pesadas e leves compreendem quatro FRs conectados através de três CDRs. Essas três CDRs são chamadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3 nesta ordem a partir da terminação N da cadeia pesada. Do mesmo modo, as CDRs são chamadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3 na cadeia leve. CDRH3 é mais importante para a especificidade de ligação do anticorpo para seu antígeno. Além disso, as CDRs em cada cadeia são mantidas juntas entre si pelas regiões FR e contribuem para a formação de um sítio de ligação de antígeno no anticorpo, juntamente com as CDRs em outra cadeia. As regiões constantes não contribuem diretamente para a ligação anticorpo-antígeno, mas exibem várias funções efetoras, por exemplo, envolvimento na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose mediada pela ligação a um receptor de Fcy, meia-vida/taxa de depuração mediada por um receptor Fc neonatal (FcRn) e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um componente C1q na cascata do complemento.
PREPARAÇÃO DO ANTICORPO
[034] O anticorpo anti-CAPRIN-1, de acordo com a presente invenção, significa um anticorpo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 inteira ou com um fragmento da mesma.
[035] Neste contexto, a “reatividade imunológica” significa a propriedade do anticorpo se ligar ao antígeno CAPRIN-1 in vivo. Através dessa ligação, o anticorpo exerce a função de danificar o tumor (por exemplo, morte, supressão ou regressão). Especificamente, o anticorpo usado na presente invenção não é limitado por seu tipo desde que o anticorpo possa danificar os tumores, como câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer do intestino grosso, câncer de pulmão, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer do colo do útero, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma, como um resultado da ligação à proteína CAPRIN-1.
[036] Desse ponto em diante, os exemplos de preparação de vários anticorpos monoclonais serão mostrados.
[037] Por exemplo, linhagens celulares de câncer de mama SK- BR-3 que expressam CAPRIN-1 são administradas para imunização. O baço é extraído deste camundongo. Após a separação das células de baço, as células são fundidas com as células de mieloma de camundongo. Os clones que produzem anticorpos que têm efeito antiproliferativo em uma célula cancerosa são selecionados entre as células de fusão obtidas (hibridomas). Os hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais que têm o efeito antiproliferativo de uma célula de câncer são isolados e cultivados. O anticorpo pode ser preparado por purificação do sobrenadante da cultura de acordo com um método de purificação de afinidade geral.
[038] Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal podem ser preparados, por exemplo, como a seguir: primeiro, os animais são imunizados com os antígenos sensibilizantes de acordo com um método conhecido na técnica. Esse método de imunização geralmente envolve injeção intraperitoneal ou subcutânea de antígenos sensibilizantes ao mamíferos.Especificamente, os antígenos sensibilizantes são diluídos ou suspensos em PBS (solução salina tamponada por fosfato), solução salina fisiológica, ou similares, em uma quantidade apropriada e, então, misturados, se desejável, com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional, por exemplo, um adjuvante completo de Freund. Depois da emulsificação, a emulsão resultante é administrada a cada mamífero várias vezes a cada 4 a 21 dias. De maneira alternativa, um carreador apropriado pode ser usado para a imunização com os antígenos sensibilizantes.
[039] Após a confirmação de um aumento no nível do anticorpo desejado no soro de mamífero imunizados dessa forma, os imunócitos são coletados do mamífero e submetidos à fusão celular. Os exemplos preferenciais dos imunócitos incluem particularmente as células de baço.
[040] As células de mieloma de mamífero são usadas como as células parentais do parceiro a serem fundidas com os imunócitos. Para as células de mieloma, as várias linhagens celulares conhecidos na técnica, por exemplo, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), são preferencialmente usadas.
[041] A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser formada basicamente de acordo com o método conhecido na técnica, por exemplo, o método de Kohler e Milsten (Kohler, G. e Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
[042] Mais especificamente, a fusão celular é realizada, por exemplo, na presença de um promotor de fusão celular em um meio de nutriente convencional. Por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou o vírus de hemaglutinação do Japão (HVJ) é usado como o promotor da fusão. Se desejável, um auxiliar, como sulfóxido de dimetila, pode ser adicionado para aumentar a eficiência da fusão.
[043] A razão entre os imunócitos e as células de mieloma usadas pode ser configurada arbitrariamente. Por exemplo, a quantidade dos imunócitos é preferencialmente configurada para 1 a 10 vezes a quantidade das células de mieloma. Os exemplos do meio que podem ser usados na fusão celular incluem meio RPMI1640 e MEM adequado para o crescimento das linhagens celulares de mieloma, bem como o meio convencional para uso nesse tipo de cultura celular. Além disso, um suplemento sérico, como soro fetal bovino (FCS) pode ser usado em combinação com esses meios.
[044] Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturados em uma quantidade predeterminada de meio. Uma solução de PEG (peso molecular médio: por exemplo, aproximadamente 1000 a 6000) pré-aquecido a aproximadamente 37°C é geralmente adicionado à mistura em uma concentração de 30 a 60% (p/v) e misturado com isso para formar hibridomas de interesse. Subsequentemente, procedimentos da adição sequencial de um meio apropriado e remoção do sobrenadante por centrifugação são repetidos para remover os agentes de fusão celular ou os semelhantes desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas.
[045] Os hibridomas assim obtidos são cultivados em um meio seletivo convencional, por exemplo, um meio HAT (meio que contém hipoxantina, aminopterina ou timidina) para seleção. A cultura no meio HAT é continuada por um período (geralmente, vários dias a várias semanas) suficiente para a morte das células, exceto os hibridomas de interesse (células não fundidas). Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são triados e clonados como clones únicos por um método de diluição limitante convencional.
[046] Em adição a essa obtenção dos hibridomas pela imunização dos animais não humanos com antígenos, hibridomas que produzem anticorpos humanos que têm atividade desejada (por exemplo, atividade antiproliferativa celular) podem ser obtidos pelos linfócitos humanos sensibilizantes, por exemplo, linfócitos humanos infectados por vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas ou lisados das mesmas in vitro e fusão dos linfócitos sensibilizados com as células de mieloma derivados de humano capazes de se dividir permanentemente, por exemplo U266 (Acesso no TIB196).
[047] Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal preparados dessa forma podem ser cultivados em um meio convencional e também podem ser armazenados por um longo período em nitrogênio liquido.
[048] Especificamente, os antígenos desejados ou células que expressam os antígenos desejados são usados como antígenos sensibilizantes na imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos são fundidos com as células parentais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. As células que produzem anticorpo monoclonal (hibridomas) podem ser triadas por um método convencional de triagem para preparar o anticorpo.
[049] Nesse contexto, por exemplo, os camundongos KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) e os camundongos Xero (Amgen Inc.) são conhecidos como camundongos que produzem anticorpo humano (por exemplo, publicação internacional documentos WO 02/43478 e WO 02/092812). Os anticorpos policlonais humanos completos podem ser obtidos a partir do sangue desses camundongos imunizados com as proteínas CAPRIN-1 ou com os fragmentos da mesma. De maneira alternativa, as células do baço podem ser isoladas dos camundongos assim imunizados e fundidas com as células de mieloma. Dessa maneira, os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos.
[050] Os antígenos podem ser preparados de acordo com, por exemplo, um método com o uso de células animais (publicação de patente japonesa (Kohyo) 2007-530068) ou um método com o uso de baculovírus (por exemplo, publicação internacional documento WO98/46777). Os antígenos que têm baixa imunogenicidade podem ser ligados às macromoléculas imunogênicas, como a albumina, para imunogenização.
[051] De maneira alternativa, anticorpos recombinantes podem ser usados, os quais são produzidos com o uso de uma técnica de recombinação genética que envolve: clonagem dos genes do anticorpo a partir dos hibridomas; incorporação dos genes do anticorpo em vetores apropriados; e introdução dos vetores nos hospedeiros (consulte, por exemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, Publicado no Reino Unido por Macmillan Publishers Ltd, 1990). Especificamente, os cDNAs da região variável do anticorpo (região V) são sintetizados a partir de mRNAs dos hibridomas com o uso de transcriptase reversa. Após a obtenção dos DNAs que codificam as regiões V do anticorpo de interesse, os DNAs são ligados com os DNAs que codificam as regiões constantes do anticorpo desejado (regiões C). Os produtos de ligação resultantes são então incorporados nos vetores de expressão. De maneira alternativa, os DNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser incorporados nos vetores de expressão que contêm os DNAs da região C do anticorpo. Esses DNAs são incorporados nos vetores de expressão de forma que sejam expressos sob o controle das regiões de controle de expressão, por exemplo, um enhancer e um promotor. Depois, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e podem expressar os anticorpos.
[052] Conforme descrito acima, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é qualquer um dos vários anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais de animais não humanos, anticorpos monoclonais humanos e anticorpos recombinantes.
[053] Esses anticorpos monoclonais animais não humanos ou os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados pela cultura de hibridomas obtidos pela fusão entre as células de baço de animais não humanos (por exemplo, camundongos, camundongos que produzem anticorpo humano, galinha ou coelhos) imunizados com as proteínas CAPRIN-1 e células de mieloma.
[054] O anticorpo recombinante inclui, conforme descrito acima, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, anticorpos multiespecíficos e similares.
[055] O anticorpo quimérico pode ser preparado por: ligação dos DNAs que codificam as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou galinha) com os DNAs que codificam as regiões constantes da cadeia leve e pesada obtidos a partir de anticorpo humano; incorporação dos genes de fusão resultantes nos vetores de expressão; e introdução dos vetores nos hospedeiros de modo que os anticorpos sejam produzidos.
[056] Especificamente, o anticorpo quimérico é, por exemplo, um anticorpo composto de regiões variáveis das cadeias leves e pesadas do anticorpo de camundongo e de região constante da cadeia leve e pesada de anticorpos humanos. O anticorpo quimérico pode ser preparado com o uso de um método conhecidos na técnica que envolva, por exemplo, ligação dos DNAs que codifiquem as regiões V do anticorpo de camundongo com os DNAs que codifiquem as regiões C do anticorpo humano; incorporação dos produtos resultantes da ligação nos vetores de expressão; e introdução dos vetores nos hospedeiros de modo que os anticorpos sejam produzidos. Nos Exemplos descritos posteriormente, os anticorpos quiméricos de humano- camundongo foram preparados e confirmados como tendo um efeito antitumoral. Esses anticorpos monoclonais compreendem uma região variável da cadeia pesada (VH) que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve (VL) que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, em que a região VH compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e a região VL compreende CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[057] O anticorpo humanizado, também chamado de anticorpo humano reformulado, é um anticorpo elaborado geneticamente. O anticorpo humanizado é construído pelo enxerto de CDRs de anticorpo humano com CDRs que correspondem ao anticorpo derivado de um animal imunizado. Especialmente, os DNAs em que as sequências codificadoras de CDR nos DNAs que codificam uma região variável da cadeia leve ou pesada derivada de anticorpo humano são substituídas pelas sequências codificadoras de CDR correspondentes de anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou galinha) são preparados e ligados com os DNAs que codificam as regiões constantes da cadeia leve ou pesada derivadas do anticorpo humano. Os genes de fusão resultantes podem ser incorporados nos vetores de expressão, que são então introduzidos nos hospedeiros para a produção de anticorpo para preparar o anticorpo humanizado de interesse.
[058] Especificamente, por exemplo, as sequências de DNA projetadas para se ligarem às CDRs de anticorpos de camundongo e de galinha e as regiões de estrutura (FRs) de anticorpo humano são sintetizadas por PCR com o uso de vários oligonucleotídeos preparados que têm as porções terminais sobrepostas entre si. Os DNAs obtidos são ligados com os DNAs que codificam as regiões constantes de anticorpo humano. Subsequentemente, os produtos de ligação resultantes são incorporados nos vetores de expressão, que são então introduzidos nos hospedeiros para a produção de anticorpo para obter o anticorpo de interesse (consulte publicação de pedido de patente europeia EP239400 e publicação internacional documento WO 96/02576). As FRs do anticorpo humano conectadas através de CDRs são selecionadas de modo que as CDRs formem um sítio de ligação favorável ao antígeno. Se necessário, os aminoácidos nas regiões de estrutura das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídos de modo que as CDRs do anticorpo humano reformulado resultante formem um sítio de ligação de antígeno apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Além disso, essas regiões de estrutura podem ser substituídas pelas regiões de estrutura obtidas a partir de vários anticorpos humanos (consulte publicação internacional documento WO 99/51743).
[059] As regiões de estrutura do anticorpo humano conectadas através de CDRs são selecionadas de modo que as CDRs formem um sítio de ligação favorável. Se necessário, os aminoácidos nas regiões de estrutura das regiões variáveis do anticorpo podem ser substituídas de modo que as CDRs do anticorpo humano reformulado resultante formem um sítio de ligação de antígeno apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).
[060] O anticorpo de cadeia única refere-se a um anticorpo ou ao fragmento deste que compreende as regiões variáveis das cadeias leve e pesada ligadas entre si através de um ligante. Um DNA que codifica o anticorpo de cadeia única pode ser preparado por ligação de um DNA que codifica a região variável da cadeia pesada, um DNA que codifica o ligante e um DNA que codifica a região variável da cadeia leve. Nesse contexto, as regiões variáveis das cadeias pesadas e leve são derivadas de um anticorpo humano ou derivadas de um anticorpo humano que tem as CDRs substituídas apenas pelas CDRs de um anticorpo derivado de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou galinha). O ligante consiste em 12 a 19 aminoácidos. Exemplos destes incluem (G4S)3 que consiste em 15 aminoácidos (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).
[061] O anticorpo multiespecífico refere-se a um anticorpo capaz de se ligar especificamente a uma pluralidade de epítopos diferentes. Por exemplo, o anticorpo biespecífico (diacorpo) é capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes. Um DNA que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado por ligação, por exemplo, de um DNA que codifica uma região A variável da cadeia pesada, um DNA que codifica uma região B variável da cadeia leve, um DNA que codifica uma região B variável da cadeia pesada e um DNA que codifica uma região A variável da cadeia leve nesta ordem (desde que o DNA que codifica uma região B variável da cadeia leve e o DNA que codifica uma região B variável da cadeia pesada sejam ligados através de um DNA que codifica um ligante, conforme descrito acima). Nesse contexto, ambas as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são todas derivadas de um anticorpo humano ou obtidas a partir de um anticorpo humano que tem as CDRs substituídas apenas pelas CDRs de um anticorpo obtido de um animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho ou galinha).
[062] Os aminoácidos nas regiões variáveis (por exemplo, FRs) ou as regiões constantes do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado preparados dessa forma podem ser substituídos por outros aminoácidos.
[063] A substituição do aminoácido é a substituição de, por exemplo, menos que 15, menos que 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos aminoácidos, preferencialmente 1 a 15 aminoácidos, mais preferencialmente 1 ou 2 aminoácidos. O anticorpo substituído deve ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. É desejável que a substituição seja uma substituição conservativa de aminoácido, que é a substituição entre aminoácidos similares nas propriedades, como carga, tamanhos da cadeia, polaridade e aromaticidade. Os aminoácidos podem ser classificados em termos de propriedades similares, por exemplo: aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoácidos acídicos (ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoácidos polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina); aminoácidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); e aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).
[064] Os exemplos de anticorpos modificados podem incluir os anticorpos ligados com várias moléculas como polietilenoglicol (PEG). No anticorpo modificado na presente invenção, a substância que deve ser ligada não é limitada. Para obter um anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser quimicamente modificado. Um método, portanto, já foi estabelecido na técnica.
[065] Neste contexto, a frase “funcionalmente equivalente” significa que um anticorpo referente tem atividade biológica ou bioquímica similar àquela do anticorpo da presente invenção, especificamente, o anticorpo referente tem a função de danificar o tumor e não provocar essencialmente nenhuma rejeição quando aplicado em humanos, por exemplo. Exemplos dessas atividades podem incluir atividade antiproliferativa e atividade de ligação.
[066] Um método para o preparo de um polipeptídeo funcionalmente equivalente a certo polipeptídeo, que envolve a introdução de uma mutação em um polipeptídeo, é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os técnicos no assunto podem introduzir de maneira apropriada uma mutação no anticorpo da presente invenção com o uso de mutagênese sítio-dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152: 271275; Zoller, MJ., e Smith, M. (1983) Methods Enzymol., 100: 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res., 12: 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol., 154: 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 488-492; e Kunkel (1988) Methods Enzymol., 85: 2763-2766) ou similares, através disso preparar um anticorpo funcionalmente equivalente ao anticorpo da presente invenção.
[067] Um anticorpo que reconhece um epítopo de uma proteína CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 descrito acima pode ser obtido por um método geralmente conhecido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, o anticorpo pode ser obtido por um método que envolve a determinação do epítopo da proteína CAPRIN-1 reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 por um método convencional (por exemplo, mapeamento de epítopo) e preparação de um anticorpo com o uso de um polipeptídeo que tenha uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como um imunógeno, ou um método que envolve a determinação de um epítopo para um anticorpo preparado por um método convencional que reconhece o mesmo epítopo como aquele para o anticorpo anti-CAPRIN-1.
[068] O anticorpo da presente invenção tem uma constante de afinidade Ka (kon/koff) de preferencialmente pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 x 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 x 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 x 1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 x 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1 ou pelo menos 1013 M-1.
[069] O anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A conjugação do anticorpo com o agente antitumoral pode ser realizada através de um espaçador que tem um grupo (por exemplo, grupo succinimidil, um grupo formil, um grupo 2-piridiltio, um grupo maleimidil, um grupo alcoxicarbonil ou um grupo hidróxi) reativo com um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo hidróxi, um grupo tiol ou similares.
[070] Exemplos de agente antitumoral incluem os seguintes agentes antitumorais publicamente conhecidos na literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracila, tiotepa, bussulfano, improssulfano, pipossulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, brioestatina, calistatina, criptoficina 1, croptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, andrógenos (por exemplo, calusterona, proprionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosida, ácido aminolevulínico, eniluracila, ansacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglucida, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamete, pirarrubicina, iosoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilidrazida, procarbazina, razoxana, rizoxina, schizofilano, spirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, mannomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucila, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronata, irinotecana, inibidores de topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e os sais farmacologicamente aceitáveis e derivados dos mesmos.
[071] De maneira alternativa, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumoral para produzir um efeito terapêutico maior. Essa abordagem é adaptável a um paciente com câncer que expressa CAPRIN-1 antes ou depois da operação cirúrgica. Essa abordagem pode ser aplicada, especialmente depois da cirurgia, para câncer que expressa CAPRIN-1, que foi tratado da maneira convencional com um agente antitumoral sozinho, para produzir uma maior prevenção da recidiva de câncer ou prolongamento do tempo de sobrevida.
[072] Exemplos do agente antitumoral usado na administração combinada com o anticorpo da presente invenção incluem os seguintes agentes antitumorais publicamente conhecidos na literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracila, tiotepa, bussulfano, improssulfano, pipossulfano, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, camptotecina, brioestatina, calistatina, criptoficina 1, croptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina,tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, proprionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosida, ácido aminolevulínico, eniluracila, ansacrina, bestrabucila, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglucida, lentinan, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamete, pirarrubicina, iosoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilidrazida, procarbazina, razoxana, rizoxina, schizofilano, spirogermânio, ácido tenuazônico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, mannomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacitosina, docetaxel, clorambucila, gencitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina,oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etoposida, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, Xeloda, ibandronata, irinotecana, inibidores de topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e sais farmaceuticamente aceitáveis (conhecidos na técnica) e derivados dos mesmos (conhecidos na técnica). Desses agentes antitumorais, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel ou vinorelbina são particularmente usados preferencialmente.
[073] De maneira alternativa, o anticorpo da presente invenção pode ser ligado a um radioisótopo publicamente conhecido nas literaturas, etc., como 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu ou 176Lu. É desejável que seja usado um radioisótopo efetivo para o tratamento ou diagnóstico do tumor.
[074] O anticorpo da presente invenção é um anticorpo que tem reatividade imunológica com CAPRIN-1, um anticorpo que especificamente reconhece CAPRIN-1, ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1 e exibe atividade citotóxica ou efeito antiproliferativo no câncer. O anticorpo deve ter uma estrutura que provoque pouca ou nenhuma rejeição nos animais receptores. Exemplos desses anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos quiméricos humano de camundongo), anticorpos de cadeia única e anticorpos biespecíficos, quando os animais receptores são humanos. Esses anticorpos (1) têm regiões variáveis das cadeias leves e pesadas derivadas de um anticorpo humano, (2) têm regiões variáveis com CDRs (CDR1, CDR2 e CDR3) das cadeias leves e pesadas derivadas de um anticorpo animal não humano e regiões de estrutura derivadas de um anticorpo humano, ou (3) esses anticorpos são anticorpos recombinantes que têm regiões variáveis das cadeias leves e pesadas derivadas de um anticorpos animal não humano e regiões constantes da cadeia leve e pesada derivadas de um anticorpo humano. O anticorpo da presente invenção é preferencialmente o anticorpo (1) ou (2).
[075] Esses anticorpos recombinantes podem ser preparados como a seguir: os DNAs que codificam os anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, de camundongo, rato, coelho e galinha) contra CAPRIN-1 humana são clonados a partir de células que produzem anticorpos, como hibridomas e usados como moldes em RT-PCR ou similar para preparar DNAs que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas nos anticorpos. As respectivas sequências das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves e as respectivas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada região são determinadas com base no sistema de numeração EU de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[076] Esse DNA que codifica cada região variável ou um DNA que codifica cada CDR é preparado com o uso de uma técnica de recombinação genética (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de DNA. Nesse contexto, os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal humano podem ser preparados pela imunização de animais que produzem anticorpo monoclonal humano (por exemplo, camundongos) com CAPRIN-1 humana e, então, por fusão com as células de baço extraídas dos animais imunizados com as células de mieloma. A parte disso, os DNAs que codificam as regiões variáveis e constantes da cadeia leve e pesada derivados do anticorpo humano são preparados, se necessário, com o uso de uma técnica de recombinação genética ou um sintetizador de DNA.
[077] Os DNAs recombinantes preparados podem ser incorporados em um ou mais vetores apropriados, que são então introduzidos nas células hospedeiras (por exemplo, células de mamíferos, células de levedura e células de inseto) para que os DNAs sejam coexpressos para produzir anticorpos recombinantes (P.J. Delves., Antibody Production Essential Techniques., 1997 WILEY, P. Shepherd e C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 Oxford University Press; e J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice., 1993 Academic Press).
[078] Exemplos do anticorpo da presente invenção preparados por qualquer um dos métodos descritos acima incluem o seguinte anticorpo (a) obtido nos Exemplos descritos posteriormente:(a) um anticorpo ou o fragmento do mesmo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 (por exemplo, um anticorpo composto de uma região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 e um domínio variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12).
[079] Neste contexto, a sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 correspondem às CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo de camundongo. A sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 correspondem às CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, de uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo de camundongo.
[080] Exemplos do anticorpo humanizado, do anticorpo quimérico, do anticorpo de cadeia única ou do anticorpo multiespecífico da presente invenção incluem os seguintes anticorpos (i), (ii) e (iii): (i) um anticorpo ou o fragmento do mesmo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura derivadas do anticorpo humano e uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 e as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura derivadas do anticorpo humano; (ii) um anticorpo ou o fragmento do mesmo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura derivadas do anticorpo humano, uma região constante da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada do anticorpo humano, uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 e as sequências de aminoácidos das regiões de estrutura derivadas do anticorpo humano, e uma região constante da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada do anticorpo humano; e: (iii) um anticorpo ou o fragmento do mesmo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de aminoácidos representadas pela SEQ ID NO: 8, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada do anticorpo humano, uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 12, e uma região constante da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano.
[081] As sequências das regiões constantes e variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo humano estão disponíveis a partir de, por exemplo, NCBI (EUA; GenBank, UniGene, etc.). Por exemplo, as seguintes sequências podem ser citadas como: Acesso no J00228 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG1 humana; Acesso no J00230 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG2 humana; Acesso no X03604 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG3 humana; Acesso no K01316 para uma região constante de uma cadeia pesada de IgG4 humana; Acesso nos V00557, X64135 e X64133 para uma região constante de uma cadeia leve K humana; acessos nos X64132 e X64134 para uma região constante de uma cadeia leve X humana.
[082] Preferencialmente, esses anticorpos têm atividade citotóxica e podem, através disso, exercer um efeito antitumoral.
[083] As sequências particulares citadas acima das regiões variáveis e CDRs das cadeias leves e pesadas em cada anticorpo são fornecidas meramente para propósitos ilustrativos. É óbvio que o anticorpo da presente invenção não é limitado pelas sequências particulares. Os hibridomas capazes de produzir anticorpos humanos anti-CAPRIN-1 humana ou anticorpos de animais não humanos (por exemplo, anticorpos de camundongo), diferente dos descritos acima, são preparados e os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas são recuperados e avaliados como sendo (ou não sendo) os anticorpos de interesse com a atividade de ligação imunológica contra CAPRIN-1 humana e a atividade citotóxica como indicador. Os hibridomas que produzem anticorpo monoclonal de interesse são, portanto, identificados. Assim, os DNAs que codificam as cadeias leves e pesadas de regiões variáveis dos anticorpos de interesse são produzidos a partir de hibridomas e sequenciados, conforme descrito acima. Os DNAs são usados para a preparação dos diferentes anticorpos.
[084] O anticorpo descrito acima pode ser o anticorpo (a) que tem a substituição, a deleção ou a adição de um ou vários aminoácidos, particularmente em uma sequência de uma região de estrutura e/ou uma região constante, contanto que o anticorpo tenha essa especificidade que pode ser reconhecer especificamente a CAPRIN-1. Nesse contexto, o termo “várias” significa preferencialmente 2 a 5, mais preferencialmente 2 ou 3.
[085] A presente invenção ainda fornece um DNA que codifica o anticorpo da presente invenção, um DNA que codifica a cadeia leve ou pesada do anticorpo, ou um DNA que codifica a região variável da cadeia leve ou pesada no anticorpo. Esse DNA inclui, por exemplo, um DNA que codifica uma região variável da cadeia pesada que compreende sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, e um DNA que codifica uma região variável da cadeia leve que compreende sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, no caso do anticorpo (a).
[086] As CDRs codificadas pelo DNA que têm essas sequências servem como regiões que determinam a especificidade do anticorpo. As sequências que codificam as outras regiões (ou seja, as regiões constantes e as regiões de estrutura) do anticorpo podem, portanto, ser as sequências derivadas de outros anticorpos. Nesse contexto, “outros anticorpos” também inclui os anticorpos derivados de organismos não humanos e são preferencialmente aqueles derivados de humanos do ponto de vista da redução dos efeitos colaterais. Especificamente, o DNA da presente invenção preferencialmente compreende as sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos derivadas do anticorpo humano correspondente das regiões que codificam cada região de estrutura e cada região constante nas cadeias pesadas e leves.
[087] Outros exemplos de DNA que codifica o anticorpo da presente invenção incluem um DNA que codifica uma região variável da cadeia pesada, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pelo SEQ ID NO: 8 e um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12. Nesse contexto, a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 13. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12 é, por exemplo, a sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 14. Nesse DNA, a região que codifica cada região constante nas cadeias pesadas e leves devem compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos correspondente derivada do anticorpo humano.
[088] Esses DNAs do anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, pelos métodos descritos acima ou pelo seguinte método: primeiro, os RNAs totais são preparados a partir de hibridomas relacionados ao anticorpo da presente invenção com o uso de um kit de extração de RNA disponível comercialmente e os cDNAs são sintetizados com o uso de transcriptase reversa e primers aleatórios ou similares. Subsequentemente, os cDNAs que codificam o anticorpo são amplificados por PCR com o uso de primers de oligonucleotídeo para as sequências conservadas de cada região variável nos genes de cadeia pesada e leve do anticorpo do camundongo. As sequências que codificam as regiões constantes podem ser obtidas pela amplificação por PCR das sequências conhecidas. A sequência de nucleotídeos do DNA pode ser incorporada em um plasmídeo ou em um fago para o sequenciamento, por exemplo, e determinada de acordo com um método de rotina.
[089] O efeito antitumoral do anticorpo anti-CAPRIN-1 usado na presente invenção nas células de câncer que expressam CAPRIN-1 parece ser provocado pelo efetor de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por célula e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra as células que expressam CAPRIN-1.
[090] O efeito antitumoral com base no mecanismo é conhecido por se correlacionar com o número de moléculas alvo que se ligam ao anticorpo expressas na superfície das células de câncer (Niwa R., Clinical Cancer Research março de 2005; 11 (6): 2327-2336). O número de moléculas alvo expressas na superfície das células de câncer pode ser examinado com o uso de um kit de teste existente capaz de medir o número de moléculas na superfície da célula. Especificamente, o número de moléculas alvo que se ligam ao anticorpo pode ser determinado por: células de câncer que reagem com, por exemplo, anticorpos contra as moléculas alvo, como os anticorpos primários; que reagem com os anticorpos marcados com fluorescência contra os anticorpos primários, juntamente com as microesferas da curva de calibração com o número conhecido anteriormente de moléculas; medição da intensidade média de fluorescência das amostras; e determinação do número de moléculas alvo com base na curva de calibração obtida.
[091] Dessa forma, o anticorpo anti-CAPRIN-1 usado na presente invenção pode ser avaliado em relação à sua atividade pela determinação da atividade ADCC ou da atividade CDCD ex vivo contra as células de câncer que expressam CAPRIN-1 ou por examine do número de moléculas de CAPRIN-1 expressas na superfície das células de câncer no caso do uso do anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção como um anticorpo primário conforme mostrado especificamente abaixo nos Exemplos.
[092] O anticorpo anti-CAPRIN-1 usado na presente invenção se liga às proteínas CAPRIN-1 nas células de câncer e exibe um efeito antitumoral durante toda a atividade. Assim, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é presumivelmente útil no tratamento ou na prevenção de câncer. Especificamente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende o anticorpo anti-CAPRIN-1 como um ingrediente ativo. O anticorpo anti- CAPRIN-1 usado para o propósito de administração aos corpos humanos (terapia com anticorpo) é preferencialmente um anticorpo humano ou humanizado para redução de imunogenicidade.
[093] O anticorpo anti-CAPRIN-1 com afinidade de ligação mais alta para uma proteína CAPRIN-1 na superfície da célula de câncer exerce uma atividade antitumoral mais forte. Dessa forma, um efeito antitumoral mais forte pode ser esperado se o anticorpo anti-CAPRIN-1 que tem uma afinidade de ligação mais alta para a proteína CAPRIN-1 pode ser obtido. Esse anticorpo é adaptável a uma composição farmacêutica destinada ao tratamento e/ou prevenção do câncer. Desejavelmente, essa alta afinidade de ligação seja preferencialmente pelo menos 107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5 x 108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5 x 109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5 x 1O10 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5 x 1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, ou pelo menos 1013 M-1, em termos de uma constante de associação (constante de afinidade) Ka (kon/koff), conforme descrito acima.
[094] A ligação dos anticorpos anti-CAPRIN-1 a um número maior de moléculas CAPRIN-1 na superfície da célula de câncer produz atividade antitumoral mais forte. Desejavelmente, o número de moléculas de CAPRIN-1 às quais os anticorpos se ligam para o efeito antitumoral esperado é 104 ou mais, preferencialmente 105 ou mais moléculas de CAPRIN-1 por célula de câncer, medida com o uso do anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção.
LIGAÇÃO ÀS CÉLULAS QUE EXPRESSAM ANTÍGENO
[095] A capacidade do anticorpo se ligar à CAPRIN-1 pode ser determinada pelo uso do teste de ligação, por exemplo, por ELISA, Western blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo, conforme descrito nos Exemplos.
COLORAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA
[096] O anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado quanto a sua reatividade com CAPRIN-1 por um método de imuno- histoquímica bem conhecido pelos técnicos no assunto com o uso de um corte congelado fixado em paraformaldeído ou acetona ou um corte incorporado em parafina e fixado em paraformaldeído de um tecido obtido de um paciente durante a operação cirúrgica ou de um animal que porte um tecido de xenoenxerto inoculado com uma linhagem celular que expressa CAPRIN-1 espontaneamente ou depois da transfecção.
[097] Para a coloração imuno-histoquímica, o anticorpo que reage com CAPRIN-1 pode ser corado por vários métodos. Por exemplo, o anticorpo pode ser visualizado através da reação com um anticorpo anti- camundongo de cabra conjugado com peroxidase, anticorpo anti-coelho de cabra ou anticorpo anti-galinha de cabra.
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
[098] Um alvo da composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção do câncer da presente invenção não é particularmente limitado, desde que o alvo seja o câncer (células) que expressa um gene de CAPRIN-1.
[099] Os termos “tumor” e “câncer”, usados no presente pedido, significam neoplasma maligno e são usados de forma intercambiável.
[0100] O câncer alvo na presente invenção é o câncer que expressa um gene que codifica a proteína CAPRIN-1 e é preferencialmente câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer no intestino grosso, câncer pulmonar, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer no colo uterino, câncer ovariano, câncer na próstata, câncer na bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
[0101] Os exemplos específicos desses cânceres incluem, mas não se limitam a, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama do tipo complexo, tumor misto maligno de glândula mamária, adenocarcinoma papilar intradutal, adenocarcinoma pulmonar, câncer de célula escamosa, câncer de célula pequena, câncer de célula grande, glioma que seja um tumor do tecido neuroepitelial, ependimoma, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionário, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crônica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma do tipo de célula pequena a média, câncer cecal, câncer no colo ascendente, câncer no colo descendente, câncer de colo transverso, câncer de colo sigmoide, câncer retal, câncer ovariano epitelial, tumor de célula germinativa, tumor de célula do estroma, carcinoma do duto pancreático, carcinoma do duto pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de célula acinar, carcinoma adenoescamoso, tumor de célula gigante, neoplasia papilar mucinoso intradutal, neoplasia cística mucinosa, pancreatoblastoma, cistadenocarcinoma seroso, tumor pseudopapilar sódilo, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla do tipo 1 (síndrome de Wermer), tumor de célula de ilhota não funcional, somatostatinoma e VIPoma.
[0102] O sujeito de teste, como o receptor, é preferencialmente os mamíferos, por exemplo, mamíferos como primatas, animais de estimação, gado e animais de competição e são preferencialmente particularmente humanos, cães e gatos.
[0103] No caso do uso do anticorpo da presente invenção como uma composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada por um método geralmente conhecido pelos técnicos no assunto. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode ser usada sob a forma de uma injeção parenteral de uma solução asséptica, uma suspensão com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada com o anticorpo misturado em uma forma de dosagem unitária exigida pelas práticas farmacêuticas geralmente aceitas, na combinação apropriada com os carreadores farmacologicamente aceitos ou meio, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, um emulsificante, um agente de suspensão, um detergente, um estabilizante, um agente flavorizante, um excipiente, um veículo, um conservante, um ligante. A quantidade do ingrediente ativo em cada preparação é determinada para que uma dose apropriada dentro da variação prescrita seja atingida.
[0104] Uma composição asséptica para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional com o uso de um veículo como água destilada para injeção.
[0105] Os exemplos de soluções aquosas para injeção incluem solução salina fisiológica, soluções isotônicas, que contenham glicose e outros adjuvantes, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Essas soluções podem ser usadas em combinação com um solubilizador apropriado, por exemplo, um álcool (especificamente, etanol) ou um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol e polietilenoglicol) ou um detergente não iônico, por exemplo, polissorbato 80 (TM) ou HCO-60.
[0106] Exemplos de soluções oleosas incluem óleo de gergelim e óleo de soja. Essas soluções podem ser usadas em combinação com um solubilizante como benzoato de benzila ou álcool benzílico. As soluções podem ainda ser misturadas com um tampão (por exemplo, uma solução de tampão fosfato e uma solução de tampão acetato de sódio), um agente suavizante (por exemplo, cloridrato de procaína), um estabilizante (por exemplo, álcool benzílico e fenol) e um antioxidante. As soluções de injeção preparadas dessa forma são geralmente carregadas em ampolas apropriadas.
[0107] A composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via oral ou parenteral, preferencialmente parenteral. Exemplos específicos de suas formas de dosagem incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de administração transpulmonar e agentes de administração percutânea. Exemplos das injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea, através das quais a composição farmacêutica pode ser administrada sistemicamente ou localmente.
[0108] Também, o método de administração pode ser selecionado de maneira apropriada dependendo de idade, sexo, sintomas, etc., de um paciente. A dose de uma composição farmacêutica que contém o anticorpo ou um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dose. De maneira alternativa, a dose pode ser selecionada dentro de uma faixa de, por exemplo, 0,001 a 10000 mg/corpo de um paciente, embora a dose não seja necessariamente limitada a esses valores numéricos. Apesar da dose e do método de administração variem dependendo do peso, da idade, do sexo, dos sintomas, etc., de um paciente, para que os técnicos no assunto possam selecionar de maneira apropriada a dose e o método.
[0109] A composição farmacêutica, incluindo o anticorpo ou os fragmentos da presente invenção, pode ser administrada a um sujeito de teste para tratar e/ou prevenir câncer, preferencialmente câncer de mama, câncer renal, câncer pancreático, câncer no intestino grosso, câncer pulmonar, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer no colo uterino, câncer ovariano, câncer na próstata, câncer na bexiga urinária, câncer esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
[0110] A presente invenção ainda engloba um método para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende administrar a composição farmacêutica da presente invenção em combinação com o agente antitumoral, como exemplificado acima, ou uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral para um sujeito de teste. O anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção pode ser administrado simultaneamente, com ou separadamente do agente antitumoral para o sujeito de teste. No caso da administração separada dessas composições farmacêuticas, um pode ser administrado antes do outro. Seus intervalos de dosagem, doses, vias de administração e número de doses podem ser selecionados de maneira apropriada por um especialista. As formas de dosagem das drogas separadas que devem ser administrados simultaneamente também incluem, por exemplo, as composições farmacêuticas formuladas pela mistura do anticorpo, ou do fragmento do mesmo, da presente invenção e o agente antitumoral em um carreador farmaceuticamente aceitável (ou meio). As descrições acima sobre a prescrição, formulação, rotas de administração, doses, câncer, etc., como as composições farmacêuticas e as formas de dosagem que contêm o anticorpo da presente invenção são também aplicáveis a qualquer uma das composições farmacêuticas e as formas de dosagem descritas acima que contêm o agente antitumoral.
[0111] Dessa forma, a presente invenção também fornece a combinação farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção do câncer, que compreende a composição farmacêutica da presente invenção e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral, conforme exemplificado acima. A presente invenção também fornece a combinação farmacêutica para o tratamento e/ou a prevenção do câncer, que compreende o anticorpo, ou o fragmento do mesmo, da presente invenção e o agente antitumoral juntamente com um carreador farmaceuticamente aceitável.
POLIPEPTÍDEO E DNA
[0112] A presente invenção fornece ainda os seguintes polipeptídeos e DNAs relacionados ao anticorpo (a): (iv) um polipeptídeo que compreende as sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 8 e 12, e um DNA que codifica o polipeptídeo, por exemplo, um DNA que compreende as sequências de nucleotídeos representadas pelas SEQ ID NOs: 13 e 14; (v) ) um polipeptídeo de CDR da cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, e um DNA que codifica o polipeptídeo; e (vi) ) um polipeptídeo de CDR da cadeia leve selecionado a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, e um DNA que codifica o polipeptídeo.
[0113] Esses polipeptídeos e os DNAs podem ser preparados com o uso de técnicas de recombinação genética, conforme descrito acima.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA PRESENTE INVENÇÃO
[0114] Os aspectos da presente invenção descritos acima estão resumidos abaixo. (1) Anticorpo, ou um fragmento do mesmo, que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, cujo anticorpo ou o fragmento do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende as CDRs de SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 9, 10 e 11. (2) Anticorpo, ou o fragmento do mesmo, de acordo com (1), em que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo biespecífico. (3) Anticorpo, ou o fragmento do mesmo, de acordo com (1) ou (2), em que anticorpo ou o fragmento do mesmo é conjugado com um agente antitumoral. (4) Composição farmacêutica, para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende um anticorpo ou o fragmento do mesmo como um ingrediente ativo, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende CDRs de SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 e tem reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. (5) Composição farmacêutica, de acordo com (4), em que o câncer é câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de intestino grosso, câncer de pulmão, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma. (6) Combinação farmacêutica, para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende uma composição farmacêutica, de acordo com (4) ou (5), e uma composição farmacêutica que compreende um agente antitumoral. (7) DNA, que codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com (1) ou (2). (8) Método, para tratamento e/ou prevenção de câncer, que compreende administrar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, de acordo com qualquer um de (1) a (3), uma composição farmacêutica de acordo com (4) ou (5), ou uma combinação farmacêutica, de acordo com (6), para um sujeito de teste.
EXEMPLOS
[0115] Desse ponto em diante, a presente invenção será descrita especificamente com referência aos Exemplos. No entanto, o escopo da presente invenção não é destinado a ser limitada por esses exemplos específicos.
EXEMPLO 1 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE CAPRIN-1 EM CADA TECIDO
[0116] A expressão gênica de CAPRIN-1 nos tecidos normais de cães e humanos e várias linhagens celulares foi examinada por RT-PCR de acordo com o Exemplo 1(4) descrito no documento WO 2010/016526. Como resultado, uma forte expressão foi observada no testículo entre os tecidos caninos saudáveis, embora a expressão foi observada em tecidos de câncer de mama e de adenocarcinoma canino. Como resultado da confirmação também da expressão em tecidos humanos, a expressão foi confirmada somente no testículo entre os tecidos normais, como com o gene de CAPRIN- 1 canino. Por outro lado, a expressão foi detectada em muitos tipos de linhagens celulares de câncer, incluindo 8 linhagens celulares de câncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA- MB-231V e MRK-nu-1) e 4 linhagens celulares de câncer pancreático (Capan- 2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPc-3), entre as células cancerosas. Esses resultados demonstraram que CAPRIN-1 é expressa em várias células cancerosas, embora sua expressão não seja observada em tecidos normais, exceto em testículo.
EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DO ANTICORPO MONOCLONAL DE CAMUNDONGO CONTRA CAPRIN-1
[0117] 100 μg de proteínas CAPRIN-1 humana que têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que foram preparadas no Exemplo 3, descrito no documento WO 2010/016526, foi misturada com uma quantidade igual do adjuvante MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). A mistura foi usada como uma solução de antígeno por camundongo. A solução de antígeno foi administrada por via intraperitoneal a cada camundongo Balb/c de 6 semanas de idade (Japan SLC, Inc.). Então, 7 reforços foram realizados a cada semana para completar a imunização. Três dias depois da dose final, o baço de cada camundongo foi removido e fixado entre duas lâminas de vidro esterilizadas. Os procedimentos de lavagem com PBS(-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e a remoção do sobrenadante por centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos foram repetidas três vezes para obter as células de baço. As células de baço obtidas foram misturadas com as células SP2/0 de mieloma de camundongo (adquiridas junto a ATCC) a uma razão de 10:1. 200 μL de um meio RPMI1640, contendo FBS 10% foram aquecidos a 37°C e misturados com 800 μL de PEG1500 (Boehringer Ingelheim GmbH), e a solução de PEG assim preparada foi adicionada à mistura de células, que foi então deixada durante 5 minutos para fusão celular. Após a remoção do sobrenadante por centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 150 mL de um meio RPMI1640, contendo FBS 15% suplementado com 2% equivalente de uma solução HAT (Life Technologies, Inc./Gibco) (meio seletivo HAT). Essa suspensão foi inoculada em quinze placas de 96 poços (Thermo Fisher Scientific Inc./Nunc) a uma concentração de 100 μL/poço. As células de baço e as células de mieloma foram fundidas por cultura a 37°C, durante 7 dias, sob condições de CO2 5% para obter hibridomas.
[0118] Os hibridomas preparados foram selecionados com a afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra as proteínas CAPRIN-1, como um índice. Um μg/mL de solução das proteínas CAPRIN-1 preparadas no Exemplo 3, descrita no documento WO 2010/016526, foi adicionado a uma placa de 96 poços a uma concentração de 100 μL/poço e deixada a 4°C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Então, uma solução de albumina de soro bovino (BSA) 0,5% (Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionada a uma concentração de 400 μL/poço e deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi descartada e cada poço foi lavado três vezes com 400 μL de PBS-T. Então, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionado nesse a uma concentração de 100 μL/poço e deixado à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Então, os anticorpos IgG (H+L) anti-camundongo marcados com HRP (Invitrogen Corp.) foram diluídos 5000 vezes com PBS e foram adicionados nesse uma concentração de 100 μL/poço e deixado à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada a uma concentração de 100 μL/poço e deixada durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Após a revelação da cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico 1 N a uma concentração de 100 μL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm e 595 nm com o uso de um espectrômetro de absorção. Como resultado, foram selecionados vários hibridomas que produzem anticorpos que têm alta absorbância.
[0119] Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços em uma densidade de 0,5 células/poço e cultivados na placa. Uma semana depois, foram observados os hibridomas que formam colônias únicas nos poços. As células nesses poços foram cultivadas e os hibridomas clonados foram selecionados com a afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas contra as proteínas CAPRIN-1, como um índice. Um μg/mL de solução das proteínas CAPRIN-1 preparadas no Exemplo 3, descritas no documento WO 2010/016526, foi adicionado a uma placa de 96 poços a uma concentração de 100 μL/poço e deixada a 4°C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Então, uma solução de BSA 0,5% foi adicionada a uma concentração de 400 μL/po^o e deixada à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi descartada e cada poço foi lavado três vezes com 400 μL de PBS-T. Então, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionado nesse a uma concentração de 100 μL/po^o e deixado à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Então, os anticorpos IgG (H+L) anti-camundongo marcados com HRP (Invitrogen Corp.) foram diluídos 5000 vezes com PBS e foram adicionados nesse uma concentração de 100 μL/poço e deixado à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Em seguida, uma solução de substrato de TMB (Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada a uma concentração de 100 μL/po^o e deixada durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Após a revelação da cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico 1 N a uma concentração de 100 μL/poço. A absorbância foi medida a 450 nm e 595 nm com o uso de um espectrômetro de absorção. Como resultado, foram obtidas 112 linhagens de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais reativos com as proteínas CAPRIN-1.
[0120] Em seguida, esses anticorpos monoclonais foram selecionados para anticorpos reativos com a superfície das células cancerosas de mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 106 células de uma linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231V foram centrifugadas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. 100 μL do sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionado e deixado durante 1 hora em gelo. Após a lavagem com PBS, os anticorpos IgG anti-camundongo de cabra marcados com FITC (Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo FBS 0,1%, foram adicionados e deixados durante 1 hora em gelo. Depois de lavar com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida com o uso de FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação que acima foi realizada com uso de soro de cada camundongo Balb/c de 6 semanas de idade, não tratados, diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridoma, ao invés de anticorpos, para preparar um controle. Como resultado, foi selecionado um anticorpo monoclonal (n° 1) que tem intensidade de fluorescência mais forte que a do controle, isto é, reativo com a superfície de células cancerosas de mama.
EXEMPLO 3 CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL SELECIONADO
[0121] Os anticorpos monoclonais obtidos no Exemplo 2 foram analisados de acordo com um método descrito no Exemplo 5 do documento WO 2010/016526 para suas sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos codificadas através disso. Como resultado, o anticorpo monoclonal n° 1 foi composto de uma região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos representadas pela SEQ ID NO: 8 e uma região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12. A sequência de nucleotídeos resultante que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal n° 1 é mostrada na SEQ ID NO: 13 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 8. A sequência de nucleotídeos que codifica a região variável da cadeia leve da mesma é mostrada na SEQ ID NO: 14 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 12.
[0122] Especificamente, o anticorpo monoclonal n° 1 foi confirmado para consistir na região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 8 e a região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 12, em que a região variável da cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e a região variável da cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 que consiste nas sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, respectivamente.
EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL QUIMÉRICO HUMANO-CAMUNDONGO
[0123] Ambas as extremidades do fragmento de amplificação do gene que compreendem o nucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal de camundongo n°1 obtido no Exemplo 3, que consiste em uma sequência de nucleotídeos representa pela SEQ ID NO: 13 foram tratadas com enzimas de restrição, então, purificadas e inseridas de acordo com o método de rotina em um vetor pcDNA4/myc-His (Invitrogen Corp.), que já tinham insertos de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de camundongo e uma região constante da cadeia H de IgG1 humana, que compreende a SEQ ID NO: 37. Além disso, o fragmento de amplificação de gene que compreende o gene da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal de camundongo n° 1, que consiste em uma sequência de nucleotídeos representada pela SEQ ID NO: 14 foi tratado em ambas as extremidades com enzimas de restrição, então, purificadas e inseridas de acordo com o método de rotina em um vetor pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen Corp.), que já tinham insertos de gene de uma sequência líder derivada de anticorpo de camundongo e uma região constante da cadeia L de IgG1 humana, que compreende a SEQ ID NO: 38.
[0124] Em seguida, o vetor recombinante que tem o inserto na região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 13) do anticorpo monoclonal de camundongo n°1 e o vetor recombinante que tem o inserto da região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 14) do anticorpo monoclonal de camundongo n°1 foram introduzidos nas células CHO-K1 (obtidas junto à Riken Cell Bank). Especificamente, 2 x 105 células de CHO-K1 foram cultivadas em um meio F12 de Ham (Invitrogen Corp.) contendo 1 mL de FBS 10% por poço de uma placa de cultura de 12 poços e lavadas com PBS(-). Então, foi adicionado um meio F12 de Ham fresco contendo 1 mL de FBS 10% por poço. 250 ng de cada um dos vetores lisados em 10 μL de OptiMEM (Invitrogen Corp.) foi misturado com 30 μL de reagente de transfecção Polyfect (Qiagen N.V.) e essa mistura foi adicionada a cada poço. As células de CHO-K1 cotransfectadas com os vetores recombinantes foram cultivadas em um meio F12 de Ham contendo FBS 10% suplementado com 200 μg/mL de Zeocina (Invitrogen Corp.) e 200 μg/mL de Geneticina (Roche Diagnostics K.K.), e então inoculadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 0,5 células/poço para preparar uma linhagem celular que produz com estabilidade um anticorpo monoclonal quimérico humano-camundongo n° 1 (n° 1) que tem as regiões variáveis do anticorpo monoclonal de camundongo n°1.
[0125] Cada linhagem celular preparada foi cultivada durante 5 dias em um frasco de 150 cm2, em uma densidade de 5 x105 células/mL, com o uso de 30 mL de um meio OptiCHO sem soro (Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo o anticorpo monoclonal quimérico humano-camundongo n° 1.
[0126] Além disso, as linhagens celulares que produzem com estabilidade os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos humano- camundongo de 1 a 11 foram preparadas da mesma maneira que a descrita acima com o uso dos seguintes anticorpos monoclonais derivados de camundongo anti-CAPRIN-1, descritos no documento WO 2010/016526, como anticorpos comparativos: um anticorpo comparativo 1 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 15 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 16; um anticorpo comparativo 2 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 17 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 18; um anticorpo comparativo 3 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 19 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 20; um anticorpo comparativo 4 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 21 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 22; um anticorpo comparativo 5 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 24; um anticorpo comparativo 6 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 25 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 26; um anticorpo comparativo 7 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 27 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 28; um anticorpo comparativo 8 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 30; um anticorpo comparativo 9 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 31 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 32; um anticorpo comparativo 10 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 33 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 34; e um anticorpo comparativo 11 que consiste na região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 35 e a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 36. Cada linhagem celular preparada foi cultivada durante 5 dias em um frasco de 150 cm2, em uma densidade de 5 x105 células/mL, com o uso de 30 mL de um meio OptiCHO sem soro (Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo qualquer um dos anticorpos comparativos quiméricos humano-camundongo 1 a 11.
EXEMPLO 5 EXPRESSÃO DE CAPRIN-1 NA SUPERFÍCIE DE VÁRIAS CÉLULAS DE CÂNCER COM O USO DE ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 N° 1
[0127] Em seguida, as linhagens celulares de câncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- 231V e MRK-nu-1), as linhagens celulares de câncer renal (Caki-1, Caki-2, A498 e ACHN), a linhagem celular de câncer na bexiga urinária (T24), a linhagem celular de câncer ovariano (SKOV3), as linhagens celulares de câncer pulmonar (QG56 e A549), as linhagens celulares de câncer pancreático (Capan-2 e MIAPaCa-2), a linhagem celular de câncer na próstata (PC3), a linhagem celular de câncer no colo do útero (SW756), a linhagem celular de fibrossarcoma (HT1080), as linhagens celulares de tumor cerebral (T98G, U87MG, U251, SNB19 e U373), as linhagens celulares de câncer gástrico (MNK28 e MNK45), as linhagens celulares de câncer de intestino grosso (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 e HCT116), a linhagem celular de leucemia (AML5) e a linhagem celular de linfoma (Ramos) confirmadas para ter expressão gênica de CAPRIN-1 foram examinadas quanto a sua expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície celular com o uso dos sobrenadantes de cultura contendo n° 1 obtidos no Exemplo 4. 5 x 105 células de cada linhagem celular foram centrifugadas em cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Cada sobrenadante da cultura (100 μL) contendo o anticorpo n° 1 foi adicionado ao tubo e deixado durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, os anticorpos IgG (H+L) anti-camundongo de cabra marcados com FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), diluídos com PBS contendo FBS 0,1% foram adicionados nesse e deixados a 4°C durante 30 minutos. Depois de lavar com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida com o uso de FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company). O controle negativo usado foi células que reagiram somente com anticorpos secundários. Como resultado, as células suplementadas com o anticorpo n° 1 tinha intensidade fluorescente pelo menos 35% mais forte que as do controle negativo. Isso demonstrou que as proteínas CAPRIN-1 são expressas na superfície da membrana celular das linhagens celulares de câncer humano. A taxa acima de aumento na intensidade de fluorescência foi indicada pela taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) em cada linhagem celular e calculada de acordo com a seguinte expressão:
[0128] Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de aumentar na intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI das células que reagiram com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI de controle) / (MFI de Controle) x 100.
EXEMPLO 6 EFEITO ANTITUMORAL (ATIVIDADE DE ADCC) DE ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 EM CÉLULA DE CÂNCER
[0129] O anticorpo monoclonal quimérico humano-camundongo n° 1 anti-CAPRIN-1, obtido no Exemplo 4, estudado quanto a sua capacidade em danificar as células cancerosas que expressam CAPRIN-1 pelo ensaio de atividade de ADCC. O sobrenadante da cultura das células que produzem n° 1 foi purificado com o uso da Proteína A Sefarose FF Hitrap (GE Healthcare BioSciences Ltd.). Depois da substituição com PBS(-), a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 μm (Millipore Corp.). O anticorpo resultante foi usado para ensaio de atividade. 106 células de cada linhagem celular de câncer de mama humano MCF7, a linhagem celular de câncer de intestino grosso humano HCT-116, a linhagem celular de câncer pancreático MIAPaCa- 2, a linhagem celular de câncer renal humano Caki-2 e a linhagem celular de câncer pulmonar humano QG56, confirmou ter a expressão de CAPRIN-1, foram coletadas em um tubo de centrífuga de 50 mL, para o qual 100 μCi de cromo 51 foi então adicionado, seguido por incubação a 37°C durante 2 horas. Então, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI 1640, contendo FBS 10% e adicionadas em uma densidade de 2 x 103 células/poço para cada placa de fundo em V de 96 poços para preparar células alvo. O anticorpo purificado n° 1 e os anticorpos comparativos quiméricos humano- camundongo 1 a 11 obtidos no Exemplo 4 foram cada um adicionados nesse a uma concentração de 1 μg/poço. Uma população de células contendo células NK humanas separadas com o uso de um método de rotina a partir de linfócitos do sangue periférico humano foi adicionada à placa em uma densidade de 2 x 105 células/poço e cultivadas a 37°C durante 4 horas sob condições de CO2 5%. Depois da cultura, a quantidade de cromo 51 liberada das células tumorais danificadas foi medida no sobrenadante da cultura para calcular a atividade citotóxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerosas. O controle negativo usado foram células suplementadas com anticorpos de controle de isotipo. A população de células contendo as células NK que foram usadas nessa avaliação foi preparada da seguinte forma: células mononucleares do sangue periférico humanas separadas a partir de sangue periférico humano de acordo com um método de rotina com o uso de uma solução de separação de gravidade específica Histopaque para separação de células mononucleares do sangue periférico humanas (Sigma- Aldrich Corp.) foram reagidas com vários anticorpos marcados com FITC (anticorpo CD3 anti-humano, anticorpo CD20 anti-humano, anticorpo CD11c anti-humano e anticorpo anti-HLA-DR (Becton, and Dickinson and Company)) e uma população de células não coradas com os anticorpos foi separada com o uso de um separador de células (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) ou um kit de separação de células NK humanas (Miltenyi Biotec K.K.). Como resultado de avaliação da atividade citotóxica contra as células cancerosas, os anticorpos de controle de isotipo usados e os anticorpos comparativos 1 a 11 usados tinham atividade citotóxica menor que 5% contra todas as linhagens celulares. Por contraste, o anticorpo n° 1 exibiu atividade citotóxica de 20%, 17%, 27%, 21% e 10% contra a linhagem celular de câncer de mama humano MCF7, a linhagem celular de câncer de intestino grosso humano HCT-116, a linhagem celular de câncer pancreático humano MIAPaCa-2, a linhagem celular de câncer renal humano Caki-2 e a linhagem celular de câncer pulmonar humano QG56, respectivamente. Do mesmo modo, os anticorpos de controle de isotipo usados e os anticorpos comparativos 1 a 11 usados tinham atividade citotóxica menor que 4% contra todas as outras células cancerosas, linhagens celulares de câncer de mama ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V e MRK-nu-1, linhagens celulares de glioma T98G e U373, uma linhagem celular de câncer pulmonar A549, linhagens celulares de câncer renal Caki-1 e ACHN, uma linhagem celular de câncer no colo uterino T24, linhagens celulares de câncer gástrico MKN28 e MKN45, uma linhagem celular de câncer de intestino grosso SW480, uma linhagem celular de leucemia AML5 e uma linhagem celular de linfoma Ramos. Em contrapartida, o anticorpo n° 1 confirmou ter 10% ou mais de atividade citotóxica contra essas linhagens celulares. Esses resultados mostraram que o anticorpo monoclonal n° 1 obtido contra CAPRIN-1 danifica as células cancerosas que expressam CAPRIN-1, através de sua atividade ADCC, e demonstrou que o anticorpo n° 1 exibe atividade citotóxica mais forte contra as células cancerosas humanas que a dos anticorpos comparativos 1 a 11.
[0130] Esses resultados sobre a atividade citotóxica foram obtidos por mistura do anticorpo contra CAPRIN-1, usado na presente invenção, células de linfócitos (população contendo células NK) e 2 x 103 células de cada linhagem celular de câncer com cromo 51 incorporado, conforme descrito acima, seguido pela cultura das células durante 4 horas, depois da cultura, medição da quantidade de cromo 51 liberada no meio e cálculo da atividade citotóxica contra cada linhagem celular de câncer de acordo com a seguinte expressão.
[0131] Expressão: Atividade citotóxica (%) = Quantidade de cromo 51 liberada das células alvo suplementadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e células de linfócito (população contendo células NK) / Quantidade de cromo 51 liberado das células alvo suplementadas com 1 N de ácido clorídrico x 100. Em seguida, o anticorpo monoclonal quimérico humano- camundongo n° 1, obtido no Exemplo 4, foi avaliado quanto a seu efeito antitumoral em camundongos portadores de câncer in vivo. O anticorpo usado foi purificado em coluna a partir do sobrenadante da cultura de cada linhagem celular que produz o anticorpo n° 1. De maneira similar, os anticorpos quiméricos humano-camundongo anti-CAPRIN-1 comparados a anticorpos monoclonais 1 a 11 preparados no Exemplo 4, também foram avaliados quanto ao seu efeito antitumoral em camundongos portadores de câncer in vivo.
[0132] O anticorpo n° 1 foi estudado quanto a seu efeito antitumoral com o uso de camundongos portadores de câncer, no qual uma linhagem celular de câncer derivada de humano que expressa CAPRIN-1 foi transplantada. 2 x 106 células Capan-2 da linhagem celular de câncer pancreático humano (adquirido junto à ATCC) por camundongo foram transplantadas por via subcutânea, nas costas de 65 camundongos nude Balb/c (Japan SLC, Inc.) e cultivadas até o tamanho do tumor chegar a aproximadamente 5 mm de diâmetro. O anticorpo n° 1 e os anticorpos comparativos quiméricos humano-camundongo 1 a 11 foram administrados intraperitonialmente em uma dose de 200 μg (200 μL)/camundongo a 5 (por anticorpo) desses camundongos portadores de câncer. Então, cada anticorpo foi administrado intraperitonialmente aos camundongos portadores de câncer na mesma dose que acima, um total de três vezes durante 2 dias. O tamanho do tumor foi medido diariamente e o efeito antitumoral foi observado. Por outro lado, PBS(-) foi administrado ao invés dos anticorpos para os 5 camundongos portadores de câncer remanescentes, que foram sucessivamente usados como um grupo controle. O tamanho do tumor foi calculado em termos de volume de acordo com a expressão 0,5 x (Eixo principal x Eixo secundário x Eixo secundário).
[0133] Como resultado de observação do efeito antitumoral, o tamanho do tumor foi reduzido a aproximadamente 85% nos camundongos que receberam os anticorpos comparativos quiméricos humano-camundongo 1 a 11, enquanto o anticorpo n° 1 exibiu um efeito antitumoral de redução do tamanho do tumor a 80% no grupo de teste que recebeu o anticorpo n° 1 contra CAPRIN-1 no dia 29 após a administração de anticorpos (com o tamanho do tumor no grupo de controle na mesma data definida como 100%). Esses resultados também demonstraram que o anticorpo n° 1 exerce um efeito antitumoral in vivo mais forte que os anticorpos comparativos 1 a 11.
EXEMPLO 7 O NÚMERO DE MOLÉCULAS DE CAPRIN-1 SOBRE A SUPERFÍCIE DE VÁRIAS CÉLULAS CANCEROSAS RECONHECIDAS PELO ANTICORPO ANTI-CAPRIN-1 N° 1
[0134] Linhagens celulares de câncer de mama humano (ZR75- 1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1), linhagens celulares de câncer renal (Caki-1, Caki-2, A498 e ACHN), uma linhagem celular de câncer na bexiga urinária (T24), uma linhagem celular de câncer ovariano (SKOV3), linhagens celulares de câncer pulmonar (QG56 e A549), linhagens celulares de câncer pancreático (MIAPaCa-2 e Capan-2), uma linhagem celular de câncer na próstata (PC3), uma linhagem celular de câncer no colo uterino (SW756), uma linhagem celular de fibrossarcoma (HT1080), linhagens celulares de tumor cerebral (T98G, U87MG, U251, SNB19 e U373), linhagens celulares de câncer gástrico (MNK28 e MNK45), linhagens celulares de câncer de intestino grosso (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 e HCT116), uma linhagem celular de leucemia (AML5) e uma linhagem celular de linfoma (Ramos) foram examinadas com o uso de um kit de ensaio QIFIKIT quanto ao número de moléculas (Dako Japan Inc.), quanto ao número de moléculas de CAPRIN-1 na sua superfície celular reconhecida pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 n° 1. De maneira similar, o número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície dessas várias células cancerosas também foi examinado com o uso dos anticorpos comparativos 1 a 11, que são anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 preparados no Exemplo 4.
[0135] De acordo com o protocolo anexado ao kit, o anticorpo n° 1 e os anticorpos comparativos 1 a 11 foram diluídos em 5 μg/mL (em termos de concentração final) com PBS e essa diluição foi adicionada a cada linhagem celular e reagida durante 30 minutos. Após a lavagem com PBS, os anticorpos IgG anti-camundongo marcados com fluorescência anexados ao kit foram adicionados aos anticorpos secundários, juntamente com microesferas de calibração anexadas ao kit, para cada linhagem celular e deixadas durante 45 minutos em gelo. Cada linhagem celular e as microesferas de calibração foram lavadas com PBS. Em seguida, a intensidade de fluorescência foi medida com o uso de FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company) para obter um valor médio de intensidade de fluorescência (média). Além disso, os anticorpos comparativos são medidos de maneira similar, conforme acima, para obter uma média. O controle negativo usado foi células reagidas com anticorpos de controle de isotipos e uma média também foi obtida. Cada valor médio de intensidade de fluorescência (média) foi usado para calcular o número de moléculas de acordo com o protocolo anexado ao kit. Como resultado, o número de moléculas de CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerosas, reconhecidas pelo anticorpo n° 1, foi de 105 ou mais por célula para todas as linhagens celulares de câncer humano examinadas. Por outro lado, o número de moléculas reconhecidas pelos anticorpos monoclonais comparativos 1 a 11 foi menor que 105 por célula.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[0136] O anticorpo da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção de câncer.
[0137] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citadas no presente pedido são incorporadas ao presente pedido como referência em sua totalidade.

Claims (9)

1. ANTICORPO, ou um fragmento do mesmo, que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento do mesmo compreender uma região variável da cadeia pesada que compreende as regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 5, 6 e 7 e uma região variável da cadeia leve que compreende regiões determinantes de complementaridade de SEQ ID NOs: 9, 10 e 11.
2. ANTICORPO, ou um fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multiespecífico.
3. ANTICORPO, ou um fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo anticorpo ou fragmento do mesmo ser conjugado com um agente antitumoral.
4. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, para tratamento e/ou prevenção de câncer, caracterizada por compreender um anticorpo ou um fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, como um ingrediente ativo.
5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo câncer ser câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de intestino grosso, câncer de pulmão, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
6. DNA, caracterizado por codificar um anticorpo ou um fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 2,em que a sequência nucleotídica que codifica a região variável de cadeia pesada é de SEQ ID NO: 13 e a sequência nucleotídica que codifica a região variável de cadeia leve é de SEQ ID NO:14.
7. USO DE UM ANTICORPO, ou fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de câncer.
8. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de câncer.
9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de intestino grosso, câncer de pulmão, tumor cerebral, câncer gástrico, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer de esôfago, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
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