BR112013030362B1 - Composto derivado de dolastatina, método para derivatizar o mesmo e composição farmacêutica que compreende o dito composto - Google Patents

Composto derivado de dolastatina, método para derivatizar o mesmo e composição farmacêutica que compreende o dito composto Download PDF

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Lillian Skidmore
Kyle C. Atkinson
Sandra Biroc
Timothy Buss
Melissa Cook
Robin Marsden
Ying Sun
Agnieszka Szydlik
Ianina Valenta
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Abstract

COMPOSIÇÕES CONTENDO, MÉTODOS ENVOLVENDO, E USOS DE DERIVADOS DE DOLASTATINA LIGADOS A AMINOÁCIDO NÃO-NATURAL. Descrito aqui são aminoácidos não naturais e análogos de dolastatina que inclui pelo menos um aminoácido não natural e métodos para preparar tais aminoácidos não naturais e polipeptídeos. Os análogos de dolastatina podem incluir uma ampla faixa de possíveis funcionalidades, porém tipicamente tem pelo menos uma oxima, carbonila, dicarbonila e/ou grupo hidroxilamina. Da mesma forma descrito aqui são análogos de dolastatina de aminoácido não natural que são também modificados pós-translacionalmente, métodos para efetuar tais modificações e métodos para purificar tais análogos de dolastatina. Tipicamente, os análogos de dolastatina modificados incluem pelo menos uma oxima, carbonila, dicarbonila e/ou grupo hidroxilamina. Também descrito são métodos para usar tais análogos de dolasta- tina de aminoácido não natural e análogos de dolastatina de aminoácido não natural modificado, incluindo usos terapêuticos, diagnósticos e outra biotecnologia.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Este pedido reivindica prioridade para Pedido Provisório U.S. No. 61/491,076, intitulado, "Composições Contendo, Métodos Envolvendo, e Usos de Derivados de Dolastatina Ligados a Aminoácido Não-natural," depositado em 27 de maio de 2011, os teores dos quais estão incorporados por referência em sua totali-dade.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[002] A capacidade para incorporar aminoácidos não geneticamente codifi-cados (isto é, "aminoácidos não-naturais") em proteínas permite a introdução de grupos funcionais químicos que poderiam fornecer valiosas alternativas aos grupos funcionais de ocorrência não natural, tal como o épsilon -NH2 de lisina, a sulfidrila - SH de cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Certos grupos funcionais químicos são conhecidos por ser inertes aos grupos funcionais encontrados nos 20 aminoáci-dos comuns, geneticamente-codificados porém reagem completamente e eficazmen-te para formar ligações estáveis com grupos funcionais que podem ser incorporados em aminoácidos não-naturais.
[003] Métodos estão agora disponíveis para seletivamente introduzir grupos funcionais químicos que não são encontrados em proteínas, que são quimicamente inertes em todos os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns, geneticamente codificados e que podem ser usados para reagir eficazmente e sele-tivamente com reagentes compreendendo certos grupos funcionais para formar liga-ções covalentes estáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] Descrito aqui são porções tóxicas com um ou mais ligante(es), grupos tóxicos ligados a aminoácidos não naturais, e métodos para preparar tais aminoáci- dos não naturais e polipeptídeos.
[005] Algumas modalidades da presente invenção descrevem um composto, ou sal do mesmo, compreendendo Fórmula (I):
Figure img0001
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0002
R5 é H, COR8, C1-C6alquila, ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; Y é selecionado a partir do grupo consistindo em uma hidroxilamina, metila, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hi- drazina, amidina, imina, diamina, azida, ceto-amina, ceto-alquina, alquina, cicloal- quina, e eno-diona; L é -alquileno- ou -(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um.
[006] Em algumas modalidades, R5 é tiazol. Em outras modalidades, R6 é H. Em certas modalidades, Ar é fenila. Em outras modalidades ou adicionais, R7 é meti-la. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 0 a 20, 0 a 10 ou 0 a 5.
[007] Em algumas modalidades um composto é descrito compreendendo Fórmula (II):
Figure img0003
[008] Em certas modalidades, L é -(alquileno-O)n-alquileno-. Em modalida-des específicas, cada alquileno é -CH2CH2-, n é igual a 3, e R7 é metila. Em outras modalidades, L é -alquileno-. Em modalidades específicas, cada alquileno é - CH2CH2- e R7 é metila ou hidrogênio.
[009] Em algumas modalidades, Y é azida. Em outras modalidades, Y é ci- clooctina. Em modalidades específicas, a ciclooctina tem uma estrutura de:
Figure img0004
cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, éster, éter, tioéter, aminoalquila, halogênio, éster alquílico, éster arílico, amida, arila amida, haleto de alquila, alquil amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, éster sulfonílico, halossulfonila, nitrila, alquil nitrila, e nitro; e q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.
[010] Certas modalidades da presente invenção descrevem um compostos da Fórmula (VIII):
Figure img0005
A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substi- tuído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído inferior, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1,2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquile-no substituído)-, -N(R')-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou al-quileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, - S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo de proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R3 e R4 são cada qual independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; Z tem a estrutura de:
Figure img0006
R5 ; R5 é H, CO2H, Ci-C6alquila, ou tiazol; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é Ci-C6alquila ou hidrogênio; e L é -alquileno- ou -(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; ou um metabólito ativo, ou um profármaco ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[011] Em algumas modalidades, RI é um polipeptídeo. Em modalidades es-pecíficas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anti-corpo é herceptina. Em outras modalidades, R2 é um polipeptídeo. Em modalidades específicas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é herceptina.
[012] Em algumas modalidades, fornecido aqui é um método pra derivatizar um análogo de dolastatina compreendendo Fórmula (I), o método compreendendo contatar o análogo de dolastatina com um reagente da Fórmula (XXXVII), em que Fórmula (I) corresponde a:
Figure img0007
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0008
R5 R5 é H, COR8, Ci-C6alquila, ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6 alquila ou hidrogênio; Y é NH2-O- ou metila; L é -alquileno- ou -(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; em que Fórmula (XXXVII) corresponde a:
Figure img0009
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, - C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída;
Figure img0010
R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo de proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, ou polinucleotídeo; e R3 e R4 são cada qual independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila.
[013] Em algumas modalidades, o análogo de dolastatina derivatizado com-preende pelo menos uma oxima contendo aminoácido tendo a estrutura da Fórmula (VIII):
Figure img0011
[014] Em modalidades específicas, o análogo de dolastatina é contatado com o reagente da Fórmula (XXXVII) em solução aquosa sob condições ligeiramen- te ácidas.
[015] Certas modalidades da presente compreendendo Fórmula (XXV):
Figure img0012
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0013
R5 ; R5 é H, CO2H, C1-C6alquila, ou tiazol; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R1 é H, um grupo de proteção amino, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R4 é H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; L é -alquileno- ou -(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; cada R16 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio, alquila, NO2, CN, e alquila substituída.
[016] Em algumas modalidades, R1 é um polipeptídeo. Em modalidades es-pecíficas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anti-corpo é herceptina. Em outras modalidades, R2 é um polipeptídeo. Em modalidades específicas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é herceptina.
[017] Algumas modalidades da presente invenção descrevem um composto compreendendo Fórmula (XXXI):
Figure img0014
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0015
R5 é H, CO2H, C1-C6alquila, ou tiazol; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; RI é H, um grupo de proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R4 é H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; L é -alquileno- ou -(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; D tem a estrutura de:
Figure img0016
cada Ri? é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, - (alquileno ou alquileno substituído)-ON(R")2,-(alquileno ou alquileno substituído)- C(O)SR", -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituída), - C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, em que cada R" é independentemente hidrogê-nio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alcóxi, alcóxi substi-tuído, arila, arila substituída, heteroarila, alcarila, alcarila substituída, aralquila, ou aralquila substituída; cada Zi é uma ligação, CR17R17, O, S, NR’, CR17R17-CR17R17, CR17R17-O, O- CR17R17, CR17R17-S, S- CR17R17, CR17R17-NR’, ou NR’-CR17R17; cada R' é H, alquila, ou alquila substituída; cada Z2 is selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação, -C(O)-, -C(S)-, C1-C3 alquileno opcionalmente substituído, C1-C3 alquenileno opcionalmente substituído, e heteroalquila opcionalmente substituída; cada Z3 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação, C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alquenileno opci onalmente substituído, heteroalquila opcionalmente substituída, -O-, -S-, -C(O)-, - C(S)-, e -N(R')-; cada T3 é uma ligação, C(R")(R"), O, ou S; com a condição que quando T3 for O ou S, R" não pode ser halogênio; cada R'' é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalqui- la substituída; m e p são 0, 1, 2, ou 3, contanto que pelo menos um de m ou p não seja 0;
Figure img0017
onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo heterociclo;
Figure img0018
onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo heterociclo;
Figure img0019
onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo heterociclo; cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, éster, éter, tioéter, aminoalquila, halogênio, ster alquílico, éster arílico, amida, aril amida, haleto de alquila, alquil amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, ster sulfonílico, halossulfonila, nitrila, alquil nitrila, e nitro; q é 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 ; e cada R16 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio, alquila, NO2, CN, e alquila substituída. Em algumas modalidades, RI é um polipeptídeo. Em modalidades específi-cas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anticorpo é herceptina. Em outras modalidades, R2 é um polipeptídeo. Em modalidades espe-cíficas, o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades específicas, o anti-corpo é herceptina.
[018] Em algumas modalidades, um composto é descrito compreendendo Fórmula (XXXI-A):
Figure img0020
[019] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida compreendendo quaisquer dos compostos descritos e um veículo farmaceuticamen- te aceitável, excipiente, ou aglutinante.
[020] Em outras modalidades ou alternativas são métodos para detectar a presença de um polipeptídeo em um paciente, o método compreendendo administrar um polipeptídeo compreendendo pelo menos um heterociclo contendo aminoácido não natural e o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo heterociclo resul-tante modula a imunogenicidade do polipeptídeo relativo ao polipeptídeo de aminoá-cido de ocorrência natural homólogo.
[021] Será entendido que os métodos e composições descritas aqui não são limitados à metodologia particular, protocolos, linhagens celulares, construtores, e reagentes descritos aqui e como tal podem variar. Será da mesma forma entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particu-lares apenas, e não são pretendidos limitar o escopo dos métodos e composições descritas aqui que, que serão limitados apenas pelas reivindicações anexas.
[022] Quando aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um," "uma," e "o" inclui referência plural a menos que o contexto claramente indique de outra maneira.
[023] A menos que de outra maneira definido, todos termos técnicos e cientí-ficos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendido por alguém de experiência ordinária na técnica para a qual as invenções descritas aqui perten-cem. Embora quaisquer métodos, dispositivos, e materiais similares ou equivalentes aqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste das invenções descri-tas aqui, os métodos preferidos, dispositivos e materiais são agora descritos.
[024] Todas as publicações e patentes mencionadas aqui estão aqui incor-poradas por referência em sua totalidade para o propósito de relatar e descrever, por exemplo, os construtores e metodologias que são descritas nas publicações, que poderiam ser usadas com relação às invenções presentemente descritas. As publi-cações discutidas aqui são fornecidas somente para suaa descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada será interpretado aqui como uma admissão que os inventores descritos aqui não são intitulados para pré-datar tal descrição em virtude da invenção anterior ou por qualquer outra razão.
[025] Os termos "ligação com base em aldol" ou "ligação com base em aldol misturado" refere-se à condensação catalizada por ácido ou base de um composto de carbonila com o enolato/enol de outro composto de carbonila, que pode ou não pode ser o mesmo, para gerar um compostos de β-hidroxi carbonila - um aldol.
[026] O termo "rótulo de afinidade," quando aqui usado, refere-se a um rótulo que reversivelmente ou irreversivelmente liga-se a outra molécula, para modificar, destruir, ou formar um composto com isto. Por meio de exemplo, rótulos de afinidade incluem enzimas e seus substratos, ou anticorpos e seus antígenos.
[027] Os termos "alcóxi," "alquilaamino" e "alquilatio" (ou tioalcóxi) são usa-dos em seu sentido convencional, e refere-se aqueles grupos alquila ligados a molé-culas por meio de um átomo de oxigênio, um grupo amino, ou um átomo de enxofre, respectivamente.
[028] O termo "alquila," por si próprio ou como parte de outra molécula signi-fica, a menos que de outra maneira declarado, uma cadeia linear ou ramificada, ou o radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinação do mesmo, que pode ser comple-tamente saturada mono- ou poliinsaturada e pode incluir radicais di- e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono alvo (isto é C1-C10 significa um a dez carbo-nos). Exemplos de radicais de hidrocarboneto saturados incluem, porém não são limitados a, grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, cicloexila, (cicloexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isôme- ros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila, e similar. Um grupo alquila insaturado é um tendo uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas. Exemplos de grupos alquila insaturados incluem, porém não são limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), etinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e os homólogos superiores e isômeros. O termo "alquila," a menos que de outra maneira notado, é da mesma forma significado incluir aqueles derivados de alquila definidos aqui em mais detalhes, tal como "heteroalquila", "ha- loalquila" e "homoalquila".
[029] O termo "alquileno" por si só ou como parte de outra molécula significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, por (-CH2-)n, em que n pode ser 1 a cerca de 24. Por meio de exemplo apenas, tais grupos incluem, porém não são limitados a, grupos tendo 10 ou menos átomos de carbono tal como as estruturas -CH2CH2- e -CH2CH2CH2CH2-. Uma "alquila inferior" ou "alquileno infe- rior" é um alquila de cadeia mais curta ou grupo alquileno, geralmente tendo oito ou menos átomos de carbono. O termo "alquileno," a menos que de outra maneira no-tado, é da mesma forma significado incluir aqueles grupos descritos aqui como "he- teroalquileno".
[030] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e não natural, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoá-cidos naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina) e pirolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, por meio de exemplo apenas, um α-carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R. Tais análogos podem ter grupos R modificados (por meio de exemplo, norleucina) ou pode ter cadeias principais de peptídeo modificadas enquanto ainda retendo a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Exemplos não limitantes de análogos de aminoácido incluem homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfônio de metionina.
[031] Aminoácidos podem ser referidos aqui por seu nome, seus três símbo-los de letra geralmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Adicionalmente, nucleotí- deos, podem se referir a seus códigos de única letra geralmente aceitos.
[032] Um "grupo de modificação de terminal amino" refere-se a qualquer mo-lécula que pode ser ligada a um grupo amina terminal. Por meio de exemplo, tais grupos amina terminais podem estar na extremidade das moléculas poliméricas, em que tais moléculas poliméricas incluem, porém não são limitadas a, polipeptídeos, polinucleotídeos, e polissacarídeos. Grupos de modificação terminais incluem porém não são limitados a, vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas. Por meio de exemplo apenas, grupos de modificação de terminais incluem polietileno glicol ou albumina de soro. Grupos de modificação terminais podem ser usados para modificar características terapêuticas da molécula polimérica, incluindo porém não limitado a aumentar a meia-vida de soro de peptídeos.
[033] Por “fragmento de anticorpo” é significado qualquer forma de um anti-corpo diferente da forma de tamanho natural. Fragmentos de anticorpo aqui incluem anticorpos que são componentes menores que existem dentro de anticorpos de ta-manho natural, e anticorpos que foram criados. Fragmentos de anticorpo incluem porém não são limitados a Fv, Fc, Fab, e (Fab’)2, única cadeia Fv (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, com-binações de CDR, regiões variáveis, regiões de estrutura, regiões constantes, ca-deias pesadas, cadeias leves, e regiões variáveis, e moléculas de não anticorpo de sustentação alternativa, anticorpos biespecíficos, e similar (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). Outra sub-estrutura funcional é um Fv de única cadeia (scFv), compre-endeu as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de imunoglobulina, covalente- mente conectado por um ligante de peptídeo (S-z Hu e outro, 1996, Cancer Rese-arch, 56, 3055-3061). Estas proteínas pequenas (Mr 25,000) geralmente retêm es-pecificidade e afinidade por antígeno em um único polipeptídeo e podem fornecer um bloco de construção conveniente para moléculas maiores, específicas de antíge-no. A menos que especificamente notado de outra maneira, declarações e reivindi-cações que usam o termo "anticorpo" ou "anticorpos" especificamente incluem “fra-gmento de anticorpo” e "fragmento de anticorpo”.
[034] Por “conjugado de anticorpo-fármaco, ou “ADC”, quando aqui usado, refere-se a uma molécula de anticorpo, ou fragmento dos mesmos, que é covalen- temente ligado a uma ou mais molécula(s) biologicamente ativa (s). A molécula bio-logicamente ativa pode ser conjugada ao anticorpo através de um ligante, polímero, ou outra ligação covalente.
[035] O termo "aromático" ou "arila", quando aqui usado, refere-se a uma es-trutura de anel fechada que tem pelo menos um anel tendo um sistema de pi elétron conjugado e inclui igualmente grupos arila carbocíclica e arila heterocíclica (ou "hete- roarila" ou "heteroaromáticos"). O grupo aromático carbocíclico ou heterocíclico pode conter de 5 a 20 átomos de anel. O termo inclui grupos de anéis monocíclicos cova- lentemente ligados ou anéis policíclios fundidos (isto é, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos de carbono). Um grupo aromático pode ser não substituído ou substituído. Exemplos não limitantes de grupos "aromáticos" ou "arils", incluem fenila, 1- naftila, 2- naftila, 4-bifenila, antracenila, e fenantracenila. Substituintes para cada um dos sistemas de anel de arila ou heteroarila notado acima são selecionados a partir do grupo de substituintes aceitáveis descritos aqui.
[036] Para brevidade, o termo "aromático" ou "arila" quando usado em com-binação com outros termos (incluindo porém não limitado a, arilóxi, ariltióxi, aralquila) inclui igualmente arila e heteroarila como definido acima. Desse modo, o termo "aralquila" ou "alcarila" é significado incluir aqueles radicais nos quais um grupo arila é ligado a um grupo alquila (incluindo porém não limitado a, benzila, fenetila, piridil- metila e similar) incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbono (incluindo porém não limitado a, um grupo metileno) foi substituído por um heteroáto- mo, por meio de exemplo apenas, por um átomo de oxigênio. Exemplos de tais grupos arila incluem, porém não são limitados a, fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1- naftilóxi)propila, e similar.
[037] O termo "arileno", quando aqui usado, se refere a um radical de arila divalente. Exemplos não limitantres de "arileno" incluem fenileno, piridinileno, pirimi- dinileno e tiofenileno. Substituintes para grupos arileno são selecionados a partir do grupo de substituintes aceitáveis descritos aqui.
[038] Um “polímero bifuncional”, da mesma forma referido como um “ligante bifuncional”, refere-se a um polímero compreendendo dois grupos funcionais que são capazes de especificamente reagir com outras porções para formar ligações covalentes ou não covalentes. Tais porções podem incluir, porém não são limitadas a, os grupos laterais em aminoácidos naturais ou não naturais ou peptídeos que contêm tais aminoácidos naturais ou não naturais. As outras porções que podem ser ligadas ao ligante bifuncional ou polímero bifuncional podem ser as mesmas ou diferentes porções. Por meio de exemplo apenas, um ligante bifuncional pode ter um grupo funcional reativo com um grupo em um primeiro peptídeo, e outro grupo funci-onal que é reativo com um grupo em um segundo peptídeo, pelo qual a formação de um conjugado que inclui o primeiro peptídeo, o ligante bifuncional e o segundo pep-tídeo. Muitos procedimentos e moléculas de ligante para ligação de vários compostos para peptídeos são conhecidos. Veja, por exemplo, Pedido de Patente Europeu No. 188,256; Patente U.S. Nos 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; e 4,569,789 que estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Um "polímero multi-funcional" da mesma forma referido como um "ligante multi-funcional", refere-se a um polímero compreendendo dois ou mais grupos funcionais que são capazes de reagir com outras porções. Tal porções podem incluir, porém não são limitadas aos, grupos laterais em aminoácidos naturais ou não naturais ou peptídeos que contêm tais aminoácidos naturais ou não naturais, (incluindo porém não limitados a, grupos laterais de aminoácido) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bi-funcional ou polímero multi-funcional pode ser qual-quer comprimento ou peso molecular desejado, e pode ser selecionado para forne-cer um espaçamento particular desejado ou conformação entre uma ou mais molé-culas ligadas a um composto e moléculas liga-se ao composto.
[039] O termo "biodisponibilidade," quando aqui usado, refere-se à taxa e ex tensão para qual uma substância ou sua porção ativa é liberada de uma forma de dosagem farmacêutica e torna-se disponível no sítio de ação ou no círculo geral. Aumentos em biodisponibilidade referem-se a aumentar a taxa e extensão uma substância ou sua porção ativa é liberada de uma forma de dosagem farmacêutica e torna-se disponível no sítio de ação ou no círculo geral. Por meio de exemplo, um aumento em biodisponibilidade pode ser indicado quando um aumento em concen-tração da substância ou sua porção ativa no sangue quando comparado a outras substâncias ou porções ativas. Um exemplo não limitando de um método para avali-ar aumentos em biodisponibilidade é determinado nos exemplos 21-25. Este método pode ser usado para avaliar a biodisponibilidade de qualquer polipeptídeo.
[040] O termo "molécula biologicamente ativa", "porção biologicamente ativa" ou "agente biologicamente ativo" quando usado aqui significa qualquer substância que pode afetar qualquer propriedade física ou bioquímica de um sistema biológico, série de reação, molécula, ou interação relativo a um organismo, enquanto incluindo porém não limitado a, vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, príon, insetos, fun-gos, plantas, animais, e humanos. Em particular, quando aqui usadas, moléculas biologicamente ativas incluem porém não são limitadas a qualquer substância pre-tendida para diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doença em humanos ou outros animais, ou para de outra maneira realçar bem-estar físico ou mental de humanos ou animais. Exemplos de moléculas biologicamente ativas in-cluem, porém não são limitados a, peptídeos, proteínas, enzimas, fármacos de mo-lécula pequena, fármaco duros, fármaco macios, profármacos, carboidratos, átomos inorgânicos ou moléculas, tinturas, lipídios, nucleosídeos, radionuclídeos, oligonu- cleotídeos, toxinas, células, vírus, lipossomas, micropartículas e micelas. Classes de agentes biologicamente ativos que são adequadas para uso com os métodos e composições descritas aqui incluem, porém não são limitadas a, fármacos, profár-macos, radionuclídeos, agentes de imageamento, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-tumor, agentes cardio-vasculares, agentes anti-ansiedade, hormônios, fatores de crescimento, agentes és- teróides, toxinas microbiologicamente derivada, e similar.
[041] Por "atividade biológica de modulação" é significado aumentar ou diminuir a reatividade de um polipeptídeo, alterando a seletividade do polipeptídeo, aumentando ou diminuindo a seletividade de substrato do polipeptídeo. Análise de atividade biológica modificada pode ser realizada comparando-se a atividade biológica do polipeptídeo não natural aquele do polipeptídeo natural.
[042] O termo "biomaterial," quando aqui usado, refere-se a um material bio-logicamente derivado, incluindo porém não limitado a material obtido de biorreatores e/ou de métodos recombinantes e técnicas.
[043] O termo "sonda biofísica," quando aqui usado, refere-se a sondas que podem detectar ou monitorar mudanças estruturais em moléculas. Tais moléculas incluem, porém não são limitadas a, proteínas e a "sonda biofísica" podem ser usa-das para detectar ou monitorar interação de proteínas com outras macromoléculas. Exemplos de sondas biofísicas incluem, porém não são limitados a, rótulos de centri-fugação, um fluoróforo, e grupos fotoativáveis.
[044] O termo "biossinteticamente," quando aqui usado, refere-se a qualquer método utilizando um sistema de tradução (celular ou não celular), incluindo uso de pelo menos um dos seguintes componentes: um polinucleotídeo, um códon, um tRNA, e um ribossoma. Por meio de exemplo, aminoácidos não naturais podem ser "biossinteticamente incorporados" em polipeptídeos de aminoácido não natural usando os métodos e técnicas descritas aqui, "Geração in vivo de polipeptídeos compreendendo aminoácidos não naturais", e no exemplo limitante 20. Adicional-mente, os métodos para a seleção de aminoácidos não naturais úteis que podem ser "biossinteticamente incorporados" em polipeptídeos de aminoácido não natural são descritos no exemplo não limitante 20.
[045] O termo "análogo de biotina," ou da mesma forma referido como "mí-mico de biotina", quando aqui usado, é qualquer molécula, diferente de biotina, que liga-se com alta afinidade para avidina e/ou estreptavidina.
[046] O termo "carbonila" quando aqui usado refere-se a um grupo contendo uma porção selecionando a partir do grupo consistindo em -C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-, e -C(S)-, incluindo, porém não limitado a, grupos contendo pelo menos menos um grupo cetona, e/ou pelo menos um grupo aldeído, e/ou pelo menos um grupo éster, e/ou pelo menos um grupo ácido carboxílico, e/ou pelo menos um grupo tioéster. Tais grupos carbonila incluem cetonas, aldeídos, ácidos carboxílicos, ésteres, e tioésters. Além disso, tais grupos podem ser parte de moléculas lineares, ramifica-das, ou cíclicas.
[047] O termo "grupo de modificação de terminal carbóxi" refere-se a qual-quer molécula que pode ser ligada a um grupo de terminal carbóxi. Por meio de exemplo, tais grupos de terminal carbóxi podem estar na extremidade de moléculas poliméricas, em que tais moléculas poliméricas incluem, porém não são limitadas a, polipeptídeos, polinucleotídeos, e polissacarídeos. Grupos de modificação terminais incluem porém não são limitados a, vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas. Por meio de exemplo apenas, grupos de modificação terminais incluem polietileno glicol ou albumina de soro. Grupos de modificação terminais podem ser usados para modificar características terapêuticas da molécula polimérica, incluindo porém não limitado a aumentar a meia-vida de soro de peptídeos.
[048] O termo "grupo quimicamente clivável," da mesma forma referido como "quimicamente lábil", quando aqui usado, refere-se a um grupo que quebra ou cliva em exposição a ácido, base, agentes de oxidação, agentes de redução, iniciadores químicos, ou iniciadores de radical.
[049] O termo "grupo quimioluminescente," quando aqui usado, refere-se a um grupo que emite luz como um resultado de uma reação química sem a adição de calor. Por meio de exemplo apenas, luminol (5-amino-2,3-diidro-1,4-ftalazinadiona) reage com oxidantes como peróxido de hidrogênio (H2O2) na presença de uma base e um catalisador de metal para produzir um produto de estado aceso (3- aminoftalato, 3-APA).
[050] O termo "cromóforo," quando aqui usado, refere-se a uma molécula que absorve luz de comprimentos de onda visíveis, comprimentos de onda UV ou comprimentos de onda IR.
[051] O termo "co-fator," quando aqui usado, refere-se a um átomo ou molé-cula essencial para a ação de uma molécula grande. Co-fatores incluem, porém não são limitados a, íons inorgânicos, coenzimas, proteínas, ou algum outro fator neces-sário para a atividade de enzimas. Exemplos incluem heme em hemoglobina, mag-nésio em clorofila, e íons de metal para proteínas.
[052] "Coduplicação," quando aqui usada, refere-se a processos de redupli- cação, reações, ou métodos que empregam pelo menos duas moléculas que intera-gem entre si e resultam na transformação de moléculas não duplicadas ou impropri-amente duplicadas para moléculas corretamente duplicadas. Por meio de exemplo apenas, "coduplicação," emprega pelo menos dois polipeptídeos que interagem en-tre si e resultam na transformação de polipeptídeos não duplicados ou impropria-mente duplicados para nativos, polipeptídeos corretamente duplicados. Tal polipep-tídeos podem conter aminoácidos naturais e/ou pelo menos um aminoácido não na-tural.
[053] Uma "janela de comparação," quando aqui usado, refere-se um seg-mento de qualquer um de posições contíguas usadas para comparar uma sequência a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências estiverem otimamente alinhadas. Tais posições contíguas incluem, porém não são limitadas a um grupo consistindo de cerca de 20 a cerca de 600 unidades sequenciais, incluindo cerca de 50 a cerca de 200 unidades sequenciais, e cerca de 100 a cerca de 150 unidades sequenciais. Por meio de exemplo apenas, tais sequências incluem polipeptídeos e polipeptídeos contendo aminoácidos não naturais, com as unidades sequenciais incluem, porém não são limitados a aminoá-cidos naturais e não naturais. Além disso, por meio de exemplo apenas, tais se-quências incluem, polinucleotídeos com nucleotídeos sendo as unidades sequen-ciais correspondentes. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, incluindo porém não limitado a, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de ali-nhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela procura para método de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e ins-peção visual (veja, por exemplo, Ausubel e outro, Current Protocols in Molecular Bio-logy (1995 suplemento)).
[054] Por meio de exemplo, um algoritmo que pode ser usado para determi-nar identidade de sequência percentual e similaridade de sequência são os algoriti- mos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outro (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul e outro (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectiva-mente. Software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível atra-vés de National Center for Biotechnology Information. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa quando falta um compri-mento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma compara-ção de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa quando falta um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a ma- triz de marcação BLOSUM62 (veja Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo de BLAST é tipicamente realizado com o filtro de "baixa complexidade" desligado.
[055] O algoritmo de BLAST da mesma forma realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma combinação entre dois nucleotídeo ou se-quência de aminoácido ocorreria por casualidade. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de soma me-nor em uma comparação do ácido nucléico de teste para o ácido nucléico de refe-rência for menos do que cerca de 0,2, ou menos do que cerca de 0,01, ou menos do que cerca de 0,001.
[056] O termo "variantes conservadoramente modificadas" aplica-se igual-mente a aminoácido natural e não natural e sequências de ácido nucléico naturais e não naturais, e combinações dos mesmos. Com respeito a sequência de ácido nu-cléico particulares, "variantes conservadoramente modificadas" refere-se a esses ácidos nucléicos naturais e não naturais que codificam sequência de aminoácido naturais e não naturais idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nu-cléico natural e não natural não codifica uma sequência de aminoácido natural e não natural, para sequência essencialmente idêntica. Por meio de exemplo, por causa da degeneração do código genético, um número grande de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer determinada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam a alanina de aminoácido. Desse modo, em toda posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em quaisquer do códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucléico são "variações silenciosas," que são uma espécie de variações conservadoras modificadas. Desse modo por meio de exemplo toda sequência de ácido nucléico natural ou não natural aqui que codifica um polipeptídeo natural ou não natural descreve toda possível variação silenciosa do ácido nucléico natural ou não natural. Alguém experiência ordinária na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico natural ou não natural (menos AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Desta maneira, cada variação silenciosa de um ácido nucléico natural e não natural que codifica um polipeptídeo natural e não natural está implícita em cada sequência descrita.
[057] Como em sequência de aminoácido, substituições individuais, dele- ções ou adições a um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de prote-ína que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido natural e não natural ou uma porcentagem pequena de aminoácidos naturais e não naturais na sequência codificada é uma "variante conservadora modificada" onde a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido, ou substituição de um aminoácido natural e não natural com um aminoácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservadoras fornecendo aminoácidos naturais funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservadoras modificadas são além de e não excluem variantes polimórficas, homólogos de interespécies, e alelos dos métodos e composições descritas aqui.
[058] Tabelas de substituição conservadoras fornecendo aminoácidos funci-onalmente similares são conhecidas aqueles de experiência ordinária na técnica. Os seguintes oito grupos cada qual contendo aminoácidos que são substituições conservadoras para um outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja, por exemplo, Creighton, Pro- tein:Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2a edição (dezembro de 1993)
[059] Os termos "cicloalquila" e "heterocicloalquila", por eles ou em combi-nação com outros termos, representa, a menos que de outra maneira declarado, versões cíclicas de "alquila" e "heteroalquila", respectivamente. Desse modo, uma cicloalquila ou heterocicloalquila incluem ligações de anel saturadas, parcialmente insaturadas e completamente insaturadas. Adicionalmente, para uma heterocicloal-quila, um heteroátomo pode ocupar a posição em que o heterociclo é ligado ao resto da molécula. O heteroátomo podem incluir, porém não é limitado a, oxigênio, nitro-gênio ou enxofre. Exemplos de cicloalquila incluem, porém não são limitados a, ci- clopentila, cicloexila, 1- cicloexenila, 3-cicloexenila, cicloeptila, e similar. Exemplos de heterocicloalquila incluem, porém não são limitados a, 1-(1,2,5,6-tetraidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetraidrofuran- 2-ila, tetraidrofuran-3-ila, tetraidrotien-2-ila, tetraidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2- piperazinila, e similar. Adicionalmente, o termo abrange estruturas multicíclicas, in-cluindo porém não limitadas a, estruturas de anel bicíclicas e tricíclicas. Similarmen-te, o termo "heterocicloalquileno" por si só ou como parte de outra molécula significa um radical divalente derivado de heterocicloalquila, e o termo "cicloalquileno" por si só ou como parte de outra molécula significa um radical divalente derivado de ciclo-alquila.
[060] O termo "ciclodextrina," quando aqui usado, refere-se a carboidratos cíclicos consistindo em pelo menos seis a oito moléculas de glicose em uma forma-ção de anel. A parte exterior do anel contém grupos solúveis em água; no centro do anel é um cavidade não relativamente polar capaz de acomodar moléculas peque-nas.
[061] O termo "citotóxico," quando aqui usado, refere-se a um composto que prejudica células.
[062] "Agente de desnaturação" ou "desnaturante," quando aqui usado, refere-se a qualquer composto ou material que causarão uma não duplicação reversível de um polímero. Por meio de exemplo apenas, "agente de desnaturação" ou "desna- turantes," pode causar uma não duplicação reversível de uma proteína. A resistência de um agente de desnaturação ou desnaturante será determinado igualmente pelas propriedades e a concentração do agente de desnaturação particular ou desnaturante. Por meio de exemplo, agentes de desnaturação ou desnaturantes incluem, porém não são limitados a, caótropos, detergentes, orgânico, solventes miscíveis em água, fosfolipídeos, ou uma combinação dos mesmos. Exemplos não limitantes de caótropos incluem, porém não são limitados a, uréia, guanidina, e tiocianato de sódio. Exemplos não limitantes de detergentes podem incluir, porém não são limitados a, detergentes fortes tal como dodecil sulfato de sódio, ou éteres de polioxietileno (por exemplo detergentes de Tween ou Triton), Sarkosila, detergentes não iônicos moderados (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos moderados tal como N- >2,3-(Dioleióxi)-propil-N,N,N-trimetilamônio, detergentes iônicos moderados (por exemplo colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes híbridos incluindo, porém não limitados a, sulfobetaínas (Zwittergent), sulfato de 3-(3- clolamidopro- pil)dimetilamônio-1-propano (CHAPS), e sulfonate de 3-(3- clolamidopro- pil)dimetilamônio-2-hidróxi-1-propano (CHAPS). Exemplos não limitantes de orgânico, solventes miscíveis em água incluem, porém não são limitados a, acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente C2-C4 alcanóis tal como etanol ou isopropanol), ou alcandióis inferiores (C2-C4 alcandióis tal como etileno-glicol) pode ser usado como desnaturantes. Exemplos não limitantes de fosfolipídeos incluem, porém não são limitados a, fosfolipídeos de ocorrência natural tal como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, e fosfatidilinositol ou derivados de fosfolipídeo sintéticos ou variantes tais como diexanoilfosfatidilcolina ou dieptanoilfosfatidilcolina.
[063] O termo "funcionalmente desejado" quando aqui usado refere-se a qualquer grupo selecionado a partir de um rótulo; uma tintura; um polímero; um po-límero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; um fotoreticulador; um composto citotóxico; um fármaco; um rótulo de afinidade; um rótulo de fotoafinidade; um composto reativo; uma resina; uma Segunda proteína ou polipeptídeo ou análo-go de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; um quelador de metal; um co-fator; um ácido graxo; um carboidrato; um polinucleotídeo; um DNA; um RNA; um polinucleotídeo antissentido; um sacarídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um biomaterial; uma nanopartícula; um rótulo de centrifugação; um fluoróforo; uma porção contendo metal; uma porção radioativa; um novo grupo funcional; um grupo que covalentemente ou não covalentemente interage com ou-tras moléculas; uma porção photocaged; uma porção excitável de radiação actínica; um ligante; uma porção fotoisomerizável; biotina; um análogo de biotina; uma porção incorporando um átomo pesado; um grupo quimicamente clivável; um grupo fotocli- vável; uma cadeia lateral alongada; um açúcar ligado a carbono; um agente redox- ativo; um amino tioácido; uma porção tóxica; uma porção isotopicamente rotulada; uma sonda biofísica; um grupo fosforescente; um grupo quimiluminescente; um gru-po denso de elétron; um grupo magnético; um grupo de intercalação; um cromóforo; um agente de transferência de energia; um agente biologicamente ativo (caso no qual, o agente biologicamente ativo pode incluir um agente com atividade terapêuti-ca e o polipeptídeo de aminoácido não natural ou aminoácido não natural pode ser vir como um agente co-terapêutico com o agente terapêutico ligado ou como meios para liberar o agente terapêutico em um sítio desejado dentro de um organismo); um rótulo detectável; uma molécula pequena; um ácido ribonucléico inibitório; um radio- nucleotídeo; um agente de captura neutro; um derivado de biotina; ponto(s) quânti- co(s); um nanotransmissor; um radiotransmissor; uma abzima, um ativador de com-plexo ativado, um vírus, um adjuvante, um aglicano, um alergan, uma angiostatina, um antiormônio, um antioxidante, um aptâmero, um RNA guia, uma saponina, um vetror de transporte, uma macromolécula, um mimótopo, um receptor, uma miscela reversa, e qualquer combinação dos mesmos.
[064] O termo "diamina," quando aqui usado, refere-se a grupos/moléculas compreendendo pelo menos dois grupos funcionais amina, incluindo, porém não li-mitado a, um grupo hidrazina, um grupo amidina, um grupo imina, um grupo 1,1- diamina, um grupo 1,2-diamina, um grupo 1,3-diamina, e um grupo 1,4-diamina. Além disso, tais grupos podem ser parte de moléculas lineares, ramificadas, ou cíclicas.
[065] O termo "rótulop detectável," quando aqui usado, refere-se a um rótulo que pode ser observável usando técnicas analíticas incluindo, porém não limitadas a, fluorescência, quimoluminescencia, ressonância de giro de elétron, espectrosco- pia de absorvência ultravioleta/visível, espectrometria de massa, ressonância mag-nética nuclear, ressonância magnética, e métodos eletroquímicos.
[066] O termo "dicarbonila" quando aqui usado refere-se a um grupo conten-do pelo menos duas porções selecionadas a partir do grupo consistindo em -C(O)-, - S(O)-, -S(O)2-, e -C(S)-, incluindo, porém não limitado a, grupos 1,2-dicarbonila, grupos 1,3-dicarbonila, e grupos 1,4-dicarbonila, e grupos contendo pelo menos um grupo cetona, e/ou pelo menos um grupo aldeído, e/ou pelo menos um grupo éster, e/ou pelo menos um grupo ácido carboxílico, e/ou pelo menos um grupo tioéster. Tais grupos dicarbonila incluem dicetonas, cetoaldeídos, cetoácidos, cetoésteres, e cetotioésteres. Além disso, tais grupos podem ser parte de moléculas lineares, rami-ficadas, ou cíclicas. As duas porções no grupo de dicarbonila podem ser as mesmas ou diferentes, e podem incluir substituintes que produziria, por meio de exemplo apenas, um éster, uma cetona, um aldeído, um tioéster, ou um amida, em qualquer uma das duas porções.
[067] O termo "fármaco," quando aqui usado, refere-se a qualquer substân-cia usada na prevenção, diagnóstico, alívio, tratamento, ou cura de uma doença ou condição.
[068] O termo "tintura," quando aqui usado, se refere uma substância solú-vel, de coloração que contém um cromóforo.
[069] O termo "quantidade eficaz," quando aqui usado, refere-se a uma quantidade suficiente de agente ou um composto sendo administrado que aliviará um até certo ponto ou mais dos sintomas da doença ou condição a ser tratada. O resultado pode ser redução e/ou alívio dos sinais, sintomas, ou causas de uma do-ença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por meio de exemplo, um agente ou um composto sendo administrado inclui, porém não é limita-do a, um polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natu-ral, polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou polipeptídeo de não aminoá-cido modificado. Composições contendo tais polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modi-ficado, ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificados podem ser adminis-trados para tratamentos profiláctico, de realce e/ou terapêuticos. Uma quantidade eficaz "apropriada" em qualquer caso individual pode ser determinada usando técni-cas, tais como um estudo de escalação de dose.
[070] O termo "grupo denso de elétron," quando aqui usado, refere-se a um grupo que dispersa elétrons quando irradiado com um feixe de elétron. Tais grupos incluem, porém não são limitados a, molibdato de amônio, iodeto de cádmio de sub- nitrato de bismuto, 99%, carboidrazida, hexaidrato de cloreto férrico, tetramina de hexametileno, 98,5%, de tricloreto de índio anidroso, nitrato de lantânio, tridridrato de acetato de chumbo, tridridrato de citrato de chumbo, nitrato de chumbo, ácido perió-dico, ácido fosfomolíbdico, ácido fosfotúngstico, ferricianeto de potássio, ferrocianeto de potássio, rutênio vermelho, nitrato de prata, proteinato de prata (Ag Ensaio: 8,0-8,5%)) tetrafenilporfina de prata “Forte”, (S-TPPS), cloroaurato de sódio, tungstato de sódio, nitrato de tálio, tiosemicarbazida (TSC), acetato de uranila, nitrato de urani- la, e sulfato de vanadila.
[071] O termo "agente de transferência de energia," quando aqui usado, re-fere-se a uma molécula que ou pode doar ou aceitar energia de outra molécula. Por meio de exemplo apenas, transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) é um processo de acoplamento de dipólo-dipólo pelo qual a energia em es-tado excitado de uma molécula de doador de fluorescência não é radiativamente transferida em uma molécula aceptora não excitada que em seguida fluorescente-mente emite a energia doada em um comprimento de onda mais longo.
[072] Os termos "realçam" ou "realçando" significa aumentar ou prolongar em potência ou duração um efeito desejado. Por meio de exemplo, "realçando" o efeito de agentes terapêuticos reere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, em potência ou duração, o efeito de agentes terapêuticos durante tratamento de uma doença, distúrbio ou condição. Um "quantidade eficaz de realce," quando aqui usa-da, refere-se a uma quantidade adequada para realçar o efeito de um agente tera-pêutico no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição. Quando usado em um paciente, quantidades eficazes para este uso dependerá da severidade e curso da doença, distúrbio ou condição, terapia prévia, o estado de saúde do paciente e res-posta aos fármacos, e o julgamento do médico do tratamento.
[073] Quando aqui usado, o termo "eucarioto" refere-se a organismos que pertencem ao domínio filogenético Eucarya, incluindo porém não limitado a animais (incluindo porém não limitado a, mamíferos, insetos, répteis, pássaros, etc.), ciliados, plantas (incluindo porém não limitadas a, monocotiledôneas, dicotiledôneas, e al-gas), fungos, leveduras, flagelados, microsporidia, e protistas.
[074] O termo "ácido graxo," quando aqui usado, refere-se a ácidos carboxí- licos com cerca de C6 ou cadeia lateral de hidrocarboneto mais longa.
[075] O termo "fluoróforo," quando aqui usado, refere-se a uma molécula que sob excitação emite fótons e é desse modo fluorescente.
[076] Os termos "grupo funcional", "porção ativa", "grupo de ativação", "gru-po de saída", “sítio reativo”, "grupos quimicamente reativo" e "porção quimicamente reativa," quando aqui usados, referem-se a porções ou unidades de uma molécula em que reações químicas ocorrem. Os termos são um pouco sinônimos nas técnicas químicas e são usados aqui para indicar as porções de moléculas que realizam al-guma função ou atividade e são reativas com outras moléculas.
[077] O termo "halogênio" inclui flúor, cloro, iodo, e bromo.
[078] O termo "haloacila," quando aqui usado, refere-se a grupos acila con-tendo porções de halogênio, incluindo, porém não limitado a, -C(O)CH3, -C(O)CF3, - C(O)CH2OCH3, e similar.
[079] O termo "haloalquila," quando aqui usado, refere-se a grupos alquila contendo porções de halogênio, incluindo, porém não limitadas a, -CF3 e -CH2CF3 e similar.
[080] O termo "heteroalquila," quando aqui usado, refere-se a cadeia linear ou ramificada, ou os radicais de hidrocarboneto cíclicos, ou combinações dos mes-mos, consistindo em um grupo alquila e pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo consistindo em O, N, Si e S, e em que o nitrogênio e átomos de en-xofre podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode opcio-nalmente ser quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interior do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila é ligado ao resto da molécula. Exemplos incluem, porém não são limitados a, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3,- Si(CH3)3, -CH2- CH=N-OCH3, e -CH=CH-N(CH3)-CH3. Além disso, até dois heteroátomos podem ser sucessivos, tal como, por meio de exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O- Si(CH3)3.
[081] Os termos "ligação com base heterocíclica" ou “ligação de heterociclo” refere-se a um porção formada a partir da reação de um grupo dicarbonila com um grupo diamina. O produto de reação resultante é um heterociclo, incluindo um grupo heteroarila ou um grupo heterocicloalquila. O grupo heterociclo resultante serve co-mo uma ligação química entre um aminoácido não natural ou polipeptídeo de ami-noácido não natural e outro grupo funcional. Em uma modalidade, a ligação de heterociclo inclui uma ligação de heterociclo contendo nitrogênio, incluindo por meio de exemplo apenas uma ligação de pirazol, uma ligação de pirrol, uma ligação de indol, uma ligação de benzodiazepina, e uma ligação de pirazalona.
[082] Similarmente, o termo "heteroalquileno" refere-se a um radical divalen-te derivado de heteroalquila, como exemplificado, porém não limitado por, -CH2- CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, os mesmos ou diferentes heteroátomos podem ocupar qualquer um ou ambos terminais de cadeia (incluindo porém não limitado a, alquilenoóxi, alquilenodióxi, alquilenoami- no, alquilenodiamino, aminooxialquileno, e similar). Ainda também, para grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação é incluída pela direção em que a fórmula do grupo de ligação é escrita. Por meio de exemplo, a fórmula -C(O)2R- representa igaulmente -C(O)2R- e -R'C(O)2-.
[083] O termo "heteroarila" ou "heteroaromático," quando aqui usado, refere- se a grupos arila contendo pelo menos um heteroátomo selecionado a partir de N, O, e S; em que o nitrogênio e átomos de enxofre podem ser opcionalmente oxida- dos, e o(s) átomo(s) de nitrogênio pode(m) ser opcionalmente quaternizado(s). Gru-pos heteroarila podem ser substituídos ou não substituídos. Um grupo heteroarila pode ser ligado ao resto da molécula através de um heteroátomo. Exemplos não limitantes de grupos heteroarila incluem 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3- pirazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5- oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3- tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4- pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2- benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5- isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila, e 6-quinolila.
[084] O termo "homoalquila," quando aqui usado refere-se a grupos alquila que são grupos hidrocarbonetos.
[085] O termo "idêntico," quando aqui usado, refere-se a duas ou mais se-quências ou subsequências que são as mesmas. Além disso, o termo "substancial-mente idêntico," quando aqui usado, refere-se a duas ou mais sequências que têm uma porcentagem de unidades sequenciais que são as mesmas quando comparado e alinhado para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou regi-ão designada quando medida usando algoritmos de comparação ou por alinhamento manual e inspeção visual. Por meio de exemplo apenas, duas ou mais sequências podem ser "substancialmente idênticas" se as unidades sequenciais são cerca de 60% idênticas, cerca de 65% idênticas, cerca de 70% idênticas, cerca de 75% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 85% idênticas, cerca de 90% idênticas, ou cerca de 95% idênticas em uma região especificada. Tais porcentagens para descrever a “identidade percentual” de duas ou mais sequências. A identidade de uma sequência pode existir em uma região que é pelo menos cerca de 75-100 unidades sequenciais em comprimento, em uma região que é cerca de 50 unidades sequenciais em comprimento, ou, onde não especificado, através da sequência inteira. Esta definição da mesma forma refere-se ao complemento de uma sequência teste. Por meio de exemplo apenas, duas ou mais sequências de polipeptídeo são idênticas quando os resíduos de aminoácido são os mesmos, enquanto duas ou mais se-quências de polipeptídeo são "substancialmente idênticas" se os resíduos de amino-ácido são cerca de 60% idênticos, cerca de 65% idênticos, cerca de 70% idênticos, cerca de 75% idênticos, cerca de 80% idênticos, cerca de 85% idênticos, cerca de 90% idênticos, ou cerca de 95% idênticos em uma região especificada. A identidade pode existir em uma região que é pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 aminoáci-dos em comprimento, em uma região que é cerca de 50 aminoácidos em compri-mento, ou, onde não especificado, pela sequência inteira de um sequência de poli-peptídeo. Além disso, por meio de exemplo apenas duas ou mais sequências de po-linucleotídeo são idênticas quando os resíduos de ácido nucléico são os mesmos, enquanto duas ou mais sequências de polinucleotídeo são "substancialmente idênticas" se os resíduos de ácido nucléico são cerca de 60% idênticos, cerca de 65% idênticos, cerca de 70% idênticos, cerca de 75% idênticos, cerca de 80% idênticos, cerca de 85% idênticos, cerca de 90% idênticos, ou cerca de 95% idênticos em uma região especificada. A identidade pode existir em uma região que é pelo menos cerca de 75 a cerca de 100 ácidos nucléicos em comprimento, em uma região que é cerca de 50 ácidos nucléico em comprimento, ou, onde não especificado, pelo sequência inteira de uma sequência de polinucleotídeo.
[086] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência em que sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e referência são entradas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetrosde programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos po-dem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência em seguida calcula as identidades de sequência percentuais para as sequências de teste relativo à se quência de referência, com base nos parâmetros de programa.
[087] O termo "imunogenicidade," quando aqui usado, refere-se a uma res-posta de anticorpo a administração de um fármaco terapêutico. A imunogenicidade para polipeptídeos de aminoácido não naturais terapêuticos pode ser obtida usando ensaios quantitativos e qualitativos para detecção de anticorpos de polipeptídeos de aminoácido anti-não naturais em fluidos biológicos. Tais ensaios incluem, porém não são limitados a, Radioimunoensaio (RIA), ensaio imunosorvente ligado a Enzima (ELISA), imunoensaio luminescente (LIA), e imunoensaio fluorescente (FIA). Análise de imunogenicidade para polipeptídeos de aminoácido não naturais terapêuticos envolve comparar a resposta de anticorpo em administração de polipeptídeos de aminoácido não natural terapêutico para a resposta de anticorpo em administração de polipeptídeos de aminoácido natural terapêutico.
[088] O termo "agente de intercalamento," da mesma forma referido como "grupo de intercalamento," quando aqui usado, refere-se a uma substância química que pode inserir no espaço intramolecular de uma molécula ou o espaço intermole- cular entre moléculas. Por meio de exemplo apenas um agente de intercalamento ou grupo pode ser uma molécula que insere nas bases empilhadas da hélice de DNA duplo.
[089] O termo "isolado," quando aqui usado, refere-se a separar e remover um componente de interesse a partir de componentes sem interesse. Substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo porém não limitado a uma solução aquosa. O componente isolado pode estar em um estado homogêneo ou o componente isolado pode ser uma parte de uma composi-ção farmacêutica que compreende veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. Pureza e homogeneidade podem ser determinadas usando técnicas químicas analíticas incluindo, porém não limitadas a, eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Além disso, quando um componente de interesse está isolado e é a espécie predominante presente em uma preparação, o componente é descrito aqui como substancialmente purificado. O ter-mo "purificado," quando aqui usado, pode se referir a um componente de interesse que é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo me-nos 99% ou mais puro. Por meio de exemplo apenas, ácidos nucléicos ou proteínas são "isolados" quando tais ácidos nucléicos ou proteínas estiverem livre de pelo me-nos alguns dos componentes celulares com que está associado no estado natural, ou que o ácido nucléico ou proteína foi concentrado em um nível maior do que a concentração de sua produção in vivo ou in vitro. Da mesma forma, por meio de exemplo, um gene é isolado quando separado de estruturas de leitura abertas que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse.
[090] O termo "rótulo," quando aqui usado, refere-se a uma substância que está incorporada em um composto e é facilmente detectada, pelo qual sua distribui-ção física pode ser detectada e/ou monitorada.
[091] O termo "ligação," quando usado aqui para se referir a ligações ou por-ção química formada de uma reação química entre o grupo funcional de um ligante e outra molécula. Tais ligações podem incluir, porém não são limitadas a, ligações covalentes e ligações não covalentes, enquanto tais porções químicas podem incluir, porém não são limitadas a, ésteres, carbonatos, ésteres de fosfato de iminas, hidra- zonas, acetais, ortoésteres, ligações de peptídeo, e ligações de oligonucleotídeo. Ligações hidroliticamente estáveis significa que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo porém não limitados a, sob condições fisiológicas durante um período estendido de tempo, talvez ainda indefinidamente. Ligações hidroliticamente instáveis ou ligações degradáveis significam que ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por um ou mais enzimas. Por meio de exemplo apenas, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na cadeia principal de polímero ou no grupo ligante entre a cadeia principal de polí-mero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polímero. Tais ligações degradáveis incluem, porém não são limitadas a ligações de éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo, em que tais grupos éster ge-ralmente hidrolizam sob condições fisiológicas para liberar o agente biologicamente ativo. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem porém não são limitados a ligações de carbonato; ligações de imina resultaram na reação de uma amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formados reagindo-se um álcool com um grupo fosfato; ligações de hidrazona que são produto de reação de um hidrazida e um al-deído; ligações de acetal que são o produto de reação de um aldeído e um álcool; ligações de ortoéster que são o produto de reação de um formato e um álcool; liga-ções de peptídeo formadas por um grupo amina, incluindo porém não limitado a, em um extremidade de um polímero tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptí-deo; e ligações de oligonucleotídeo formadas por um grupo fosforamidita, incluindo porém não limitadas à, extremidade de um polímero, e um grupo 5' hidroxila de um oligonucleotídeo.
[092] Os termos "meio" ou "meios," quando aqui usados, referem-se a qual-quer meio de cultura usado para cultivar e colher células e/ou produtos expressados e/ou segregados por tais células. Tal "meio" ou "meios" incluem, porém não são limi-tados a, solução, sólido, semi-sólido, ou suportes rígidos que podem suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo, por meio de exemplo, células hospe-deiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras de planta, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamífero, células de CHO, células hospedeiras procarióticas, E., coli, ou células hospedeiras de Pseudomonas, e teores de célula. Tal "meio" ou "meios" incluem, porém não são limitados a, meio ou meios em que a célula hospedeira foi cultivada em que um polipeptídeo foi segregado, incluindo meio antes ou depois de uma etapa de proliferação. Tal "meio" ou "meios" da mesma forma incluem, porém não são limitados a, tampões ou reagentes que contêm lisados de célula hospedeira, por meio de exemplo um polipeptídeo produzido intracelularmente e as células hospedeiras são lisadas ou rompidas para liberar o polipeptídeo.
[093] O termo "metabólito," quando aqui usado, refere-se a um derivado de um composto, por meio de exemplo polipeptídeo de aminoácido natural, um polipep-tídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado que é formado quando o composto, por meio de exemplo polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou polipep-tídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado. O termo "metabólito farmaceuticamente ativo" ou "metabólito ativo" refere-se a um derivado biologica-mente ativo de um composto, por meio de exemplo polipeptídeo de aminoácido na-tural, um polipeptídeo de aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural modificado, ou um polipeptídeo de aminoácido não natural modificado que são formados quando tal um composto, por meio de exemplo um polipeptídeo de aminoácido natural, polipeptídeo de aminoácido não natural, polipeptídeo de amino-ácido natural modificado, ou polipeptídeo de aminoácido não natural modificado, é metabolizado.
[094] O termo "metabolizado," quando aqui usado, refere-se à soma dos processos pelos quais uma substância particular é mudada por um organismo. Tais processos incluem, porém não são limitados a, reações de hidrólise e reações cata-lisadas por enzimas. Outras informações sobre metabolismo podem ser obtidas a partir de The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Edição, McGraw-Hill (1996). Por meio de exemplo apenas, metabólitos de polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modi-ficado, ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificado podem ser identifica-dos por administração do polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificado, ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificado em um hospedeiro e análise de amostras de tecido do hospedeiro, ou por incubação de polipeptídeos de aminoácido natural, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido natural modificado, ou polipeptídeos de aminoácido não natural modificado com células hepáticas in vitro e análise dos compostos resultantes.
[095] O termo "quelador de metal," quando aqui usado, refere-se a uma mo-lécula que forma um complexo de metal com íons de metal. Por meio de exemplo, tais moléculas podem formar duas ou mais ligações de coordenação com um íon de metal central e pode formar estruturas de anel.
[096] O termo "porção contendo metal," quando aqui usado, refere-se a um grupo que contém um íon de metal, átomo ou partícula. Tais porções incluem, porém não são limitadas a, cisplatina, íons de metais quelados (tais como níquel, ferro, e platina), e nanopartículas de metal (tal como níquel, ferro, e platina).
[097] O termo "porção incorporando um átomo pesado," quando aqui usado, refere-se a um grupo incorporando um íon de átomo que é normalmente mais pesa-do do que carbono. Tais íons ou átomos incluem, porém não são limitados a, silico-ne, tungstênio, ouro, chumbo, e urânio.
[098] O termo "modificado," quando aqui usado refere-se à presença de uma mudança a um aminoácido natural, um aminoácido não natural, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural. Tais mudanças, ou modificações, podem ser obtidas por modificações pós síntese de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido natural ou polipep-tídeos de aminoácido não natural, ou por modificação co-translacional, ou por pós- translacional de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeos de aminoácido não natural. A forma "modificada ou não modificada" significa que o aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural sendo discutida é opcionalmente modificada, isto é, o aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural em discussão pode ser modificado ou não modificado.
[099] Quando aqui usado, o termo “meia-vida de soro modulado” refere-se a mudanças positivas ou negativas na meia-vida de circulação de uma molécula biolo-gicamente ativa modificada relativa a sua forma não modificada. Por meio de exem-plo, as moléculas biologicamente ativas modificadas incluem, porém não são limita-das a, aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural. Por meio de exemplo, meia-vida de soro é medida tirando-se amostras de sangue em vários pontos de tempo depois da administração da molécula biologicamente ativa ou molécula biologicamente ativa modificada, e determinando a concentração daquela molécula em cada amostra. Correlação da concentração de soro com tempo permite cálculo da meia-vida de soro. Por meio de exemplo, meia-vida de soro modulada pode ser um aumento em meia-vida de soro, que pode permitir regimes de dosagem melhorados ou evitar efeitos tóxicos. Tais aumentos em soro pode ser pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de dez vezes. Um exemplo não limitante de um método para avaliar aumentos em meia-vida de soro é determinado no exemplo 33. Este método pode ser usado para avaliar a meia-vida de soro de qualquer polipeptídeo.
[0100] O termo "meia-vida terapêutica modulada," quando aqui usado, refe-re-se a mudança positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula biologicamente ativa modificada, relativo a sua forma não modificada. Por meio de exemplo, as moléculas biologicamente ativas modificadas incluem, porém não são limitadas a, aminoácido natural, aminoácido não natural, polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural. Por meio de exemplo, meia-vida terapêutica é medida medindo-se propriedades farma- cocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários pontos de tempo depois da administração. Meia-vida terapêutica aumentada pode permitir um regime de do-sagem benéfico particular, uma dose total benéfica particular, ou evitar um efeito indesejado. Por meio de exemplo, a meia-vida terapêutica aumentada pode ser o resultado de potência aumentada, ligação aumentada ou diminuída da molécula mo-dificada em seu alvo, um aumento ou diminuição em outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada, ou uma ruptura aumentada ou diminuída das moléculas por enzimas tal como, por meio de exemplo apenas, protease. Um exem-plo não limitando de um método para avaliar aumenta em meio vida terapêutica é determinado no exemplo 33. Este método pode ser usado para avaliar a meia-vida terapêutica de qualquer polipeptídeo.
[0101] O termo "nanopartícula," quando aqui usado, refere-se a uma partícu-la que tem um tamanho de partícula entre cerca de 500 nm a cerca de 1 nm.
[0102] O termo "próximo-estequiométrico," quando aqui usado, refere-se à relação dos mols de compostos participando em uma reação química sendo cerca de 0,75 a cerca de 1,5.
[0103] Quando aqui usado, o termo "não eucarioto" refere-se a organismos não eucarióticos. Por meio de exemplo, um organismo de não eucariótico pode per-tencer ao Eubacteria, (que inclui porém não é limitado, Escherichia coli, Thermus thermophilus, ou Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudo-monas aeruginosa, Pseudomonas putida), domínio filogenético, ou o Archaea, que inclui porém não é limitado a, Metanococcus jannaschii, Metanobacterium thermoau- totrophicum, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, ou Halobacterium tal como Haloferax volcanii e Halobacterium volcanii NRC-1, ou domínio filogenético.
[0104] Um "aminoácido não natural" refere-se a um aminoácido que não é nenhum dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados sinonimamente com o termo "aminoácido não natural" é ami-noácido não naturalmente codificado," "aminoácido não natural," "aminoácido de ocorrência não natural," e variadamente versões hifenizadas e não hifenizadas dos mesmos. O termo "aminoácido não natural" inclui, porém não é limitado a, aminoáci-dos que ocorrem naturalmente por modificação de um aminoácido naturalmente co-dificado (incluindo porém não limitado aos, 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína) porém não são eles mesmos incorporados em uma cadeia de poli-peptídeo de crescimento pelo complexo de translação. Exemplos de aminoácidos de ocorrência natural que não são naturalmente codificados incluem, porém não são limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, e O- fosfo- tirosina. Adicionalmente, o termo "aminoácido não natural" inclui, porém não é limitado a, aminoácidos que não ocorre naturalmente e podem ser obtidos sinteticamente ou podem ser obtido por modificação de aminoácidos não naturais.
[0105] O termo" ácido nucléico," quando aqui usado, refere-se a deoxiribo- nucleotídeos, deoxiribonucleosídeos, ribonucleosídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de filamento único ou duplo. Por meio de exemplo apenas, tais ácidos nucléicos e polímeros de ácido nucléico incluem, porém não são limitados a, (i) análogos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares como um ácido nucléico de referência e são metabolizados similar de uma maneira similar a nucleotídeos de ocorrência natural; (ii) análogos oligonucleotídeo incluindo, porém não são limitados a, PNA (ácido peptidonucléico), análogos de DNA usados em tecnologia antissentido (fosforotioatos, fosforoamidatos, e similar); (iii) variantes conservadoras modificadas do mesmo (incluindo porém não limitado a, substituições de códon degeneradas) e sequências complementares e sequência explicitamente indicada. Por meio de exemplo, substituições de códon degeneradas podem ser obtidas gerando-se sequência em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mistura e/ou resíduos de deoxiinosina (Batzer e outro, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka e outro, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini e outro, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0106] O termo "agente de oxidação," quando aqui usado, refere-se a um composto ou material que é capaz de remover um elétron a partir de um composto sendo oxidado. Por meio de exemplo agentes de oxidação incluem, porém não são limitados a, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxida-do, e oxigênio. Uma ampla variedade de agentes de oxidação é adequada para uso nos métodos e composições descritas aqui.
[0107] O termo "farmaceuticamente aceitável", quando aqui usado, refere-se a um material, incluindo porém não limitado, a um sal, veículo ou diluente que não anulam a atividade biológica ou propriedades do composto e são relativamente não tóxicas, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira danosa com quaisquer dos componentes da composição que está contido.
[0108] O termo "rótulo de fotoafinidade," quando aqui usado, refere-se a um rótulo com um grupo que, em exposição a luz, forma uma ligação com uma molécula para a qual o rótulo tem uma afinidade. Por meio de exemplo apenas, uma tal liga-ção pode ser covalente ou não covalente.
[0109] O termo "porção de photocaged," quando aqui usado, refere-se a um grupo que, sob iluminação em certos comprimentos de onda, covalentemente ou não covalentemente liga outros íons ou moléculas.
[0110] O termo "grupo fotoclivável," quando aqui usado, refere-se a um gru- po que quebra em exposição a luz.
[0111] O termo "fotorreticulador," quando aqui usado, refere-se a um com-posto compreendendo dois ou grupos mais funcionais que, em exposição a luz, são reativos e forma uma ligação covalente ou não covalente com duas ou mais molécu-las monoméricas ou poliméricas.
[0112] O termo "porção fotoisomerizável," quando aqui usado, refere-se a um grupo em que sob iluminação com luz muda de uma forma isomérica para outra.
[0113] O termo "polialquileno glicol," quando aqui usado, refere-se a polióis de poliéter poliméricos lineares ou ramificados. Tais polialquileno glicóis, incluindo, porém não são limitados a, polietileno glicol, polipropileno glicol, polibutileno glicol, e derivados dos mesmos. Outras modalidades exemplares são listadas, por exemplo em catálogos de fornecedor comerciais, tais como o catálogo de Shearwater Corpo-rations “Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001). Por meio de exemplo apenas, tais polióis de poliéter poliméricos têm pesos moleculares comuns entre cerca de 0,1 kDa a cerca de 100 kDa. Por meio de exemplo, tal polióis de poliéter poliméricos incluem, porém não são limitados a, entre cerca de 100 Da e cerca de 100,000 Da ou mais. O peso molecular do polímero pode estar entre cerca de 100 Da e cerca de 100,000 Da, incluindo porém pode não limitado a, cerca de 100,000 Da, cerca de 95,000 Da, cerca de 90,000 Da, cerca de 85,000 Da, cerca de 80,000 Da, cerca de 75,000 Da, cerca de 70,000 Da, cerca de 65,000 Da, cerca de 60,000 Da, cerca de 55,000 Da, cerca de 50,000 Da, cerca de 45,000 Da, cerca de 40,000 Da, cerca de 35,000 Da, cerca de 30,000 Da, cerca de 25,000 Da, cerca de 20,000 Da, cerca de 15,000 Da, cerca de 10,000 Da, cerca de 9,000 Da, cerca de 8,000 Da, cerca de 7,000 Da, cerca de 6,000 Da, cerca de 5,000 Da, cerca de 4,000 Da, cerca de 3,000 Da, cerca de 2,000 Da, cerca de 1,000 Da, cerca de 900 Da, cerca de 800 Da, cerca de 700 Da, cerca de 600 Da, cerca de 500 Da, 400 Da, cerca de 300 Da, cerca de 200 Da, e cerca de 100 Da. Em algumas modalidades peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 50,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 100 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 1,000 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 2,000 a cerca de 50,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 5,000 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero está entre cerca de 10,000 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etileno glicol) é um polímero ramificado. O peso molecular do PEG de cadeia ramificada pode estar entre cerca de 1,000 Da e cerca de 100,000 Da, incluindo po rém não limitado a, cerca de 100,000 Da, cerca de 95,000 Da, cerca de 90,000 Da, cerca de 85,000 Da, cerca de 80,000 Da, cerca de 75,000 Da, cerca de 70,000 Da, cerca de 65,000 Da, cerca de 60,000 Da, cerca de 55,000 Da, cerca de 50,000 Da, cerca de 45,000 Da, cerca de 40,000 Da, cerca de 35,000 Da, cerca de 30,000 Da, cerca de 25,000 Da, cerca de 20,000 Da, cerca de 15,000 Da, cerca de 10,000 Da, cerca de 9,000 Da, cerca de 8,000 Da, cerca de 7,000 Da, cerca de 6,000 Da, cerca de 5,000 Da, cerca de 4,000 Da, cerca de 3,000 Da, cerca de 2,000 Da, e cerca de 1,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1,000 Da e cerca de 50,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 1,000 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia rami-ficada está entre cerca de 5,000 Da e cerca de 40,000 Da. Em algumas modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 5,000 Da e cerca de 20,000 Da. Em outras modalidades, o peso molecular do PEG de cadeia ramificada está entre cerca de 2,000 a cerca de 50,000 Da.
[0114] O termo "polímero," quando aqui usado, refere-se a uma molécula composta de subunidades repetidas. Tais moléculas incluem, porém não são limita- das a, polipeptídeos, polinucleotídeos, ou polissacarídeos ou polialquileno glicóis.
[0115] Os termos "polipeptídeo," "peptídeo" e "proteína" são usados alterna-damente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Isto é, uma descrição dirigida a um polipeptídeo aplica-se igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína, e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido de ocorrência natural bem como polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido não natural. Adicio-nalmente, tais "polipeptídeos," "peptídeos" e "proteínas" incluem cadeias de aminoá-cido de qualquer comprimento, incluindo proteínas de tamanho natural, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações de peptídeo covalentes.
[0116] O termo "pós-translacionalmente modificado" refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre depois de que um tal aminoácido foi translacionalmente incorporado em uma cadeia de polipeptídeo. Tais modificações incluem, porém não são limitadas a, modificações co- translacionais in vivo, co- translacionais in vitro (tal como em um sistema de transla-ção livre de célula), modificações pós translacionais in vivo, e modificações pós translacionais.
[0117] Os termos "profármaco" ou "profármaco farmaceuticamente aceitá-vel," quando aqui usado, refere-se a um agente que é convertido no fármaco origem in vivo ou in vitro, em que que não anula a atividade biológica ou propriedades do fármaco, e é relativamente não tóxico, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira danosa com quaisquer dos componentes da composição em que é contido. Profár- macos são geralmente precursores de fármaco que, seguindo administração a um indivíduo e absorção subsequente, são convertidos em espécies ativas, ou mais ati-vas por meio de algum processo, tal como conversão por uma série de reação me-tabólica. Alguns profármacos têm um grupo químico presente no profármaco que torna isto menos ativo e/ou confere solubilidade ou alguma outra propriedade ao fármaco. Uma vez que o grupo químico foi clivado e/ou modificado a partir do pro- fármaco o fármaco ativo é gerado. Profármacos são convertidos em fármaco ativo dentro do corpo através de reações enzimáticas ou não enzimáticas. Profármacos podem fornecer propriedades físico-químicas melhoradas tal como melhor solubili-dade, características de liberação aumentadas, tal como especificamente alvejando uma célula particular, tecido, órgão ou ligante, e valor terapêutico melhorado do fár-maco. Os benefícios de tais profármacos incluem, porém não são limitados a, (i) faci-lidade de administração comparada com o fármaco origem; (ii) o profármaco podem estar biodisponível por administração oral visto que a origem não é; e (iii) o profár-maco podem da mesma forma ter solubilidade melhorada em composições farma-cêuticas comparadas com o fármaco origem. Um pró-fármaco inclui um derivado farmacologicamente inativo, ou de atividade reduzida, de um fármaco ativo. Profár-macos podem ser designados para modular a quantidade de um fármaco ou molécu-la biologicamente ativa que alcançam um sítio desejado de ação através da manipu-lação das propriedades de um fármaco, tal como propriedades físico-químicas, bio- farmacêuticas, ou farmacocinéticas. Um exemplo, sem limitação, de um profármaco seria um polipeptídeo de aminoácido não natural que é administrado como um éster (o "profármaco") para facilitar transmissão através de uma membrana celular onde solubilidade em água é prejudicial a mobilidade porém que em seguida é metaboli- camente hidrolizada ao ácido carboxílico, a entidade ativa, uma vez dentro da célula onde solubilidade em água é benéfica. Profármacos podem ser designados como derivados de fármaco reversíveis, para uso como modificadores para realçar trans-porte de fármaco para tecidos sítio específicos.
[0118] O termo "quantidade profilaticamente eficaz," quando aqui usado, re- fere-e aquela quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natu- ral profilaticamente aplicado a um paciente que aliviará um até certo ponto um ou mais dos sintomas de uma doença, condição ou distúrbio sendo tratados. Em tais aplicações profilácticas, tais quantidades podem depender do estado do paciente de saúde, peso, e similar. É considerado bem dentro da experiência da técnica para alguém determinar tais quantidades profilaticamente eficazes por experimentação rotineira, incluindo, porém não limitadas a, uma tentativa clínica de escalação.
[0119] O termo "protegido," quando aqui usado, refere-se à presença de um "grupo de proteção" ou porção que previne reação do grupo funcional quimicamente reativo sob certas condições de reação. O grupo de proteção variará, dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo a ser protegido. Por meio de exemplo apenas, (i) se o grupo quimicamente reativo é um amina ou um hidrazida, o grupo de proteção pode ser selecionado a partir de terc-butiloxicarbonila (t-Boc) e 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc); (ii) se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo de proteção pode ser ortopiridildissulfeto; e (iii) se o grupo quimicamente rea-tivo é um ácido carboxílico, tal como ácido butanóico ou propiônico, ou um grupo hidroxila, o grupo de proteção pode ser benzila ou um grupo alquila tal como metila, etila, ou terc-butila.
[0120] Por meio de exemplo apenas, grupos de bloqueio/proteção podem ser selecionados a partir de:
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[0121] Adicionalmente, grupos de proteção incluem, porém não são limitados a, incluindo grupos fotolábeis tal como Nvoc e MeNvoc e outros grupos de proteção conhecidos na técnica. Outros grupos de proteção são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3° Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que estão incorporados aqui por referência em sua totalidade.
[0122] O termo "porção radioativa," quando aqui usado, refere-se a um grupo cujos núcleos espontaneamente produzem radiação nuclear, tal como partículas alfa, beta, ou gama; em que, partículas alfas são núcleos de hélio, partículas betas são elétrons, e partículas gama são fótons de alta energia.
[0123] O termo "composto reativo," quando aqui usado, refere-se a um com-posto que sob condições apropriadas é reativa para outro átomo, molécula ou com-posto.
[0124] O termo "célula hospedeira recombinante," da mesma forma referido como "célula hospedeira," refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exó-geno, em que os métodos usados para inserir o polinucleotídeo exógeno em uma célula incluem, porém não são limitados a, captação direta, transdução, f- acoplamento, ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedei-ras recombinantes. Por meio de exemplo apenas, tal polinucleotídeo exógeno pode ser um vetor não integrado, incluindo porém pode não limitado a um plasmídeo, ou pode ser integrado no genoma hospedeiro.
[0125] O termo "agente redox-ativo," quando aqui usado, refere-se a uma molécula que oxida ou reduz outra molécula, por meio de que o agente redox ativo torna-se reduzido ou oxidado. Exemplos de agente redox ativo incluem, porém não são limitados a, ferroceno, quinonas, complexos de Ru2+/3+, complexos de Co2+/3+, e complexos de Os2+/3+.
[0126] O termo "agente de redução," quando aqui usado, refere-se a um composto ou material que é capaz de adicionar um elétron a um composto sendo reduzido. Por meio de exemplo agentes de redução incluem, porém não são limita-dos a, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2- aminoetanotiol), e glutationa reduzida. Tais agentes de redução podem ser usados, por meio de exemplo apenas, manter grupos sulfidrila no estado e para reduzir e ligações de dissulfeto intra- ou intermoleculares.
[0127] "Reduplicação," quando aqui usado descreve qualquer processo, reação ou método que transforma um estado impropriamente duplicado ou não duplicado em uma conformação nativa ou corretamente duplicada. Por meio de exemplo apenas, reduplicação transforma ligação de dissulfeto contendo polipeptídeos de um estado impropriamente duplicado ou não duplicado em uma conformação nativa ou corretamente duplicada com respeito a ligações de dissulfeto. Tal ligação de dissulfeto contendo polipeptídeos pode ser polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeos de aminoácido não natural.
[0128] O termo "resina," quando aqui usado, refere-se a peso molecular alto, contas de polímero insolúveis. Por meio de exemplo apenas, tais contas podem ser usadas como suportes para síntese de peptídeo de fase sólida, ou sítios para liga- ção de moléculas antes da purificação.
[0129] O termo "sacarídeo," quando aqui usado, refere-se a uma série de carboidratos incluindo porém não limitado a açúcares, monossacarídeos, oligossaca- rídeos, e polissacarídeos.
[0130] O termo "segurança" ou "perfil de segurança," quando aqui usado, refere-se a efeitos colaterais que poderiam estar relacionados a administração de um fármaco relativo ao número de tempos que o fármaco foi administrado. Por meio de exemplo, um fármaco que foi administrado muitas vezes e produziu nenhum ou mo-derado efeito colateral é referido ter um perfil de segurança excelente. Um exemplo não limitante de um método para avaliar o perfil de segurança é determinado no exemplo 26. Este método pode ser usado para avaliar o perfil de segurança de qual-quer polipeptídeo.
[0131] A frase "seletivamente hibridiza" ou "especificamente hibridiza," quando aqui usado, refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula em uma sequência de nucleotídeo particular sob condições de hibridização rígidas quando aquela sequência está presente em uma mistura complexa incluindo porém não limitado a, DNA ou RNA celular total ou biblioteca.
[0132] O termo "rótulo de rotação," quando aqui usado, refere-se a molécu-las que contêm um átomo ou um grupo átomos exibindo uma rotação de elétron não pareada (isto é um grupo paramagnético estável) que pode ser detectado por espec- troscopia de ressonância de rotação de elétron e pode ser ligado a outra molécula. Tais moléculas de rótulo de rotação incluem, porém não são limitados aos, radicais de nitrila e nitróxidos, e pode ser rótulos de únicos rótulos de rotação ou duplos.
[0133] O termo "estequiométrico," quando aqui usado, refere-se à relação dos mols de compostos participando em uma reação química sendo cerca de 0,9 a cerca de 1,1.
[0134] O termo "semelhante a estequiométrico," quando aqui usado, refere- se a uma reação química que torna-se estequiométrica ou próxima a estequiométri- ca sob mudanças em condições de reação ou na presença de aditivos. Tais mudan-ças em condições de reação incluem, porém não são limitadas a, um aumento em temperatura ou muda em pH. Tais aditivos incluem, porém não são limitados a, aceleradores.
[0135] A frase "condições de hibridação rígidas" referem-se a hibridação de sequências de DNA, ARN, PNA ou outros mímicos de ácido nucléico, ou combina-ções dos mesmos, sob condições de baixa resistência iônica e alta temperatura. Por meio de exemplo, sob condições rígidas uma sonda hibridizará a sua subsequência alvo em uma mistura complexa de ácido nucléico, (incluindo porém não limitado a, DNA ou ARN celular total ou biblioteca) porém não hibridiza em outras sequências na mistura complexa. Condições rígidas são dependentes de sequência e serão di-ferentes em circunstâncias diferentes. Por meio de exemplo, sequências mais lon-gas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Condições de hibrida-ção rígidas incluem, porém não são limitadas a, (i) cerca de 5-10°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específico em uma resistência iônica definida e pH; (ii) a concentração de sal é cerca de 0,01 M a cerca de 1,0 M a cerca de pH 7,0 a cerca de pH 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (incluindo porém não limitado a, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotí- deos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (incluindo porém não limitado a, maior do que 50 nucleotídeos); (iii) a adição de agentes de desestabilização incluindo, porém não limitado a, formamida, (iv) 50% de formamida, 5X SSC, e 1% de SDS, incubando a 42°C, ou 5X SSC, cerca de 1% de SDS, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2X SSC, e cerca de 0,1% de SDS a 65°C durante entre cerca de 5 minutos a cerca de 120 minutos. Por meio de exemplo apenas, detecção de hibridi- zação seletiva ou específica, inclui, porém não é limitada a, um sinal positivo pelo menos duas vezes. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléico é en- contrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993).
[0136] O termo "indivíduo" quando aqui usado, refere-se a um animal que é o objetivo de tratamento, observação ou experiência. Por meio de exemplo apenas, um indivíduo pode ser, porém não é limitado a, um mamífero incluindo, porém não limitado a, um humano.
[0137] O termo "substancialmente purificado," quando aqui usado, refere-se a um componente de interesse que pode estar substancialmente ou essencialmente livre de outros componentes que normalmente acompanham ou interagem com o componente de interesse antes da purificação. Por meio de exemplo apenas, um componente de interesse pode ser “substancialmente purificado” quando a prepara-ção do componente de interesse contiver menos do que cerca de 30% >, menos do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, me-nos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1% (em peso seco) de componentes de contaminação. Desse modo, um "compo-nente substancialmente purificado" de interesse pode ter um nível de pureza de cer-ca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou maior. Por meio de exemplo apenas, um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser purificado a partir de uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de polipeptídeos de aminoácido natural recombinantemente produzidos ou polipeptídeos de aminoácido não natural. Por meio de exemplo uma preparação de um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de amino-ácido não natural pode ser “substancialmente purificada” quando a preparação con-tiver menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 25%, menos do que cer ca de 20%), menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10% >, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%), menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1% (em peso seco) de material de contaminação. Por meio de exemplo quando um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido por células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de ami-noácido não natural pode estar presente a cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1% ou menos do peso seco das células. Por meio de exemplo quando um polipeptídeo de aminoácido natural ou um polipeptídeo de aminoácido não natural é recombinantemente produzido por células hospedeiras, o polipeptídeo de aminoácido natural ou polipeptídeo de aminoácido não natural pode estar presente no meio de cultura a cerca de 5g/L, cerca de 4g/L, cerca de 3g/L, cerca de 2g/L, cerca de lg/L, cerca de 750mg/L, cerca de 500mg/L, cerca de 250mg/L, cerca de 100 mg/L, cerca de 50mg/L, cerca de 10 mg/L, ou cerca de 1 mg/L ou menos do peso seco das células. Por meio de exemplo, polipeptídeos de aminoácido natural "subs-tancialmente purificados" ou polipeptídeos de aminoácido não natural podem ter um nível de pureza de cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%), cerca de 99% ou maior como determinado por métodos apropriados, incluindo, porém não limitados a, análi-se de SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar.
[0138] O termo "substituintes" da mesma forma referido como "substituintes sem interferência" "refere-se a grupos que podem ser usados para substituir outro grupo em uma molécula. Tais grupos incluem, porém não são limitados a, halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquinila, C1-C10 alcóxi, C5-C12 aralquila, C3-C12 cicloalquila, C4-C12 cicloalquenila, fenila, fenila substituída, toluolila, xilenila, bifenila, C2-C12 alcoxialquila, C5-C12 alcoxiarila, C5-C12 ariloxialquila, C7-C12 oxi- arila, C1-C6 alquilsulfinila, C1-C10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-C10 alquila) em que m é de 1 a 8, arila, arila substituída, alcóxi substituído, fluoroalquila, radical hete- rocíclico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-C10 alquila), -C(O)-(C1-C10 alquila), C2-C10 alqutioalquila, -C(O)O-(C1-C10 alquila), - OH, -SO2, =S, -COOH, -NR2, carbonila, -C(O)-(C1-C10 alquila)-CF3, -C(O)-CF3, - C(O)NR2, -(C1-C10 aril)-S-(C6-C10 arila), -C(O)-(C6-C10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m- O-(C1-C10 alquila) em que cada m é de 1 a 8, -C(O)NR2, -C(S)NR2, -SO2NR2, - NRC(O)NR2, -NRC(S)NR2, sais dos mesmos, e similar. Cada grupo R na lista ante-rior inclui, porém não é limitado a, H, alquila ou alquila substituída, arila ou arila substituída, ou alcarila. Onde grupos substituintes são especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para direita, eles igualmente abrangem os substituintes quimicamente idênticos que seriam o resultado de escre-ver a estrutura da direita para esquerda; por exemplo, -CH2O- é equivalente a - OCH2-.
[0139] Por meio de exemplo apenas, substituintes para radicais de alquila e heteroalquila (incluindo aqueles grupos referidos como alquileno, alquenila, hetero- alquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila, e heterocicloalquenila) incluem, porém não são limitados a: -OR, =O, =NR, =N-OR, - NR2, -SR, -halogênio, -SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, - NRC(O)R, -NRC(O)NR2, -NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN e -NO2. Cada grupo R na lista anterior inclui, porém não é limitado a, hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, incluindo porém não limitado a, arila substituída com 1-3 halogê- nios, alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou grupos aralquila. Quando dois grupos R são ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5-, 6-, ou 7 membros. Por exemplo, -NR2 é significado incluir, porém não é limitado a, 1- pirrolidinila e 4-morfolinila.
[0140] Por meio de exemplo, substituintes para grupos arila e heteroarila in-cluem, porém não são limitados a, -OR, =O, =NR, =N-OR, -NR2, -SR, -halogênio, - SiR3, -OC(O)R, -C(O)R, -CO2R, -CONR2, -OC(O)NR2, -NRC(O)R, -NRC(O)NR2, - NR(O)2R, -NR-C(NR2)=NR, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -NRSO2R, -CN, -NO2, - R, -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1-C4)alcóxi, e fluoro(C1-C4)alquila, em um número variando de zero ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e onde cada grupo R na lista anterior incluem, porém não é limitado a, hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila.
[0141] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz," quando aqui usado, refere-se à quantidade de uma composição contendo pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não natural e/ou pelo menos um polipeptídeo de aminoácido não na-tural modificado administrado a um paciente que já sofre de uma doença, condição ou distúrbio, suficiente para curar ou pelo menos parcialmente controlar, ou aliviar um até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença, distúrbio ou condição que são tratados. A eficácia de tais composições depende de condições incluindo, porém não limitadas a, severidade e curso da doença, distúrbio ou condição, terapia prévia, o estado de saúde do paciente e resposta aos fármacos, e o julgamento do médico do tratamento. Por meio de exemplo apenas, quantidades terapeuticamente eficazes podem ser determinadas por experimentação rotineira, incluindo porém não limitado a uma experiência clínica de escalação de dose.
[0142] O termo "tioalcóxi," quando aqui usado, refere-se a grupos alquila contendo enxofre ligados a moléculas por meio de um átomo de oxigênio.
[0143] O termo "ponto de fusão térmico" ou Tm é a temperatura (sob resis-tência iônica definida, pH, e concentração nucléica) em que 50% de sondas com-plementares a um alvo hibridizam à sequência alvo em equilíbrio.
[0144] O termo "porção tóxica" ou "grupo tóxico" quando aqui usado, refere- se a um composto que pode causar dano, distúrbios, ou morte. Porções tóxicas in-cluem, porém não são limitadas a, auristatina, agente de ligação de sulco menor de DNA, agente de alquilação de sulco menor de DNA, enediina, lexitropsina, duocar- micina, taxano, puromicina, dolastatina, maitansinóide, alcalóide de vinca, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB, auristatina E, paclitaxel, docetaxel, CC-1065, SN-38, topotecano, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina, dolastati- na-10, equinomicina, combretatstatina, caliqueamicina, maitansina, DM-1, netropsi- na, podofilotoxina (por exemplo etoposídeo, teniposídeo, etc.), bacatina e seus deri-vados, agentes anti-tubulina, criptofisina, combretastatina, auristatina E, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorelbina, VP- 16, camptotecina, epotilona A, epotilona B, nocodazol, colchicinas, colcimida, estramustina, cemadotina, discodermolida, mai-tansina, eleuterobina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, carmustina, lomus- tina, semustina, estreptozocina, clorozotocina, mostarda de uracila, clormetina, ifos- famida, clorambucila, pipobroman, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamina, bus- sulfano, dacarbazina, e temozolomida, itarabina, citosina arabinosídeo, fluorouracila, floxuridina, 6-tioguanina, 6- mercaptopurina, pentostatina, 5-fluorouracila, metotrexa- to, 10-propargil-5,8-dideazafolato, ácido 5,8-dideazatetraidrofólico, leucovorina, fos-fato de fludarabina, pentostatina, gemcitabina, Ara-C, paclitaxel, docetaxel, deoxico- formicina, mitomicina-C, L-asparaginase, azatioprina, brequinar, antibióticos (por exemplo, antraciclina, gentamicina, cefalotina, vancomicina, telavancina, daptomici- na, azitromicina, eritromicina, rocitromicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, flucloxacilina, meticilina, penicilina, ciprofloxacina, moxifloxacina, ofloxacina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, estreptomicina, rifabutin, etambutol, rifaximina, etc.), fármacos antivirais (por exemplo, abacavir, aciclovir, ampligen, cidofovir, delavirdina, didanosina, efavirenz, entecavir, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, inosina, lopinavir, metisazona, nexavir, nevira- pina, oseltamivir, penciclovir, estavudina, trifluridina, truvada, valaciclovir, zanamivir, etc.), cloridrato de daunorubicina, daunomicina, rubidomicina, cerubidina, idarubici- na, doxorubicina, epirubicina e derivados de morfolino, bisciclopeptídeos de fenoxi- zona (por exemplo, dactinomicina), glicopeptídeos básicos (por exemplo, bleomici- na), glicosídeos de antraquinona (por exemplo, plicamicina, mitramicina), antraceno- dionas (por exemplo, mitoxantrona), indoledionas de azirinopirrolo (por exemplo, mi- tomicina), imunossupressores macrocíclicos (por exemplo, ciclosporina, FK-506, ta-crolimus, prograf, rapamicina etc.), navelbeno, CPT-11, anastrazol, letrazol, capeci- tabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida, droloxafina, alocolchicina, Halichondrina B, colchicina, derivados de colchicina, maitansina, rizoxina, paclitaxel, derivados de paclitaxel, docetaxel, tiocolchicina, tritil cisterina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, cisplatina, carboplatina, hidroxiuréia, N-metilaidrazina, epidofilotoxina, procarbazina, mitoxantrona, leucovorina, e tegafur. "Taxanos" incluem paclitaxel, bem como qualquer derivado de taxano ativo ou a profármaco.
[0145] Os termos "tratar," "tratando" ou "tratamento", quando aqui usados, incluem aliviar, enfraquecer ou melhorar uma doença ou sintomas de condição, pre-venindo sintomas adicionais, melhorando ou prevenindo as causas metabólicas subjacentes de sintomas, inibindo a doença ou condição, por exemplo, interrompendo o desenvolvimento da doença ou condição, aliviando a doença ou condição, causando regressão da doença ou condição, aliviando uma condição causada pela doença ou condição, ou parando os sintomas da doença ou condição. Os termos "tratar," "tratando" ou "tratamento", incluem, porém não são limitados a, tratamentos profiláctico e/ou terapêuticos.
[0146] Quando aqui usado, o termo "polímero solúvel em água" refere-se a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. Tais polímeros solúveis em água incluem, porém não são limitados a, polietileno glicol, propionaldeído de polieti- leno glicol, mono C1-C10 alcóxi ou derivados de arilóxi do mesmo (descrito em Pa- tente US No. 5,252,714, que está incorporado aqui por referência), monometóxi- polietileno glicol, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, ácidos de poliamino, anidrido maléico de diviniléter, N-(2-Hidroxipropil)- metacrilamida, dextrana, derivados de dextrana incluindo sulfato de dextrana, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polissacarídeos, oligosacarídeos, glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo porém não limitado a metilcellulose e carboximetil celulose, albumina de soro, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquileno glicol e derivados dos mesmos, copolímeros de polialquileno glicóis e derivados dos mesmos, éteres polivinil etílicos, e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e similar, ou misturas dos mesmos. Por meio de exemplo apenas, acoplamento de tais polímeros solúveis em água a polipeptídeos de aminoácido natural ou polipeptídeos não natural podem resultar em mudanças incluindo, porém não limitadas a, solubilidade de água aumentada, meia-vida de soro aumentada ou modulada, meia-vida terapêutica aumentada ou moduada relativo à forma não modificada, biodisponibilidade aumentada, atividade biológica modulada, tempo de circulação estendido, imunogenicidade modulada, características de associação física modulado incluindo, porém não limitado a, agregação e formação de multímero, ligação de receptor alterado, ligação alterada a um ou mais padrões de ligação, e dimerização de receptor alterada ou multimerização. Além disso, tais polímeros solúveis em água podem ou podem não ter sua própria atividade biológica.
[0147] A menos que de outra maneira indicado, métodos convencionais de espectroscopia de massa, NMR, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de DNA recombinantes e farmacologia, dentro da experiência da técnica estão em-pregadas.
[0148] Compostos, (incluindo, porém não limitados a aminoácidos não natu-rais, polipeptídeos de aminoácido não natural, polipeptídeos de aminoácido não na- tural modificado, e reagentes para produzir os compostos mencionados acima) apresentados aqui incluem compostos isotopicamente rotulados, que são idêntico aqueles recitados nas várias fórmulas e estruturas apresentadas aqui, porém para o fato que um ou mais átomos são substituídos por um átomo tendo uma massa atô-mica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa nor-malmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorpora-dos nos compostos presentes incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tal como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 35S, 18F, 36Cl, respectivamente. Certos compostos isotopicamente rotulados descritos aqui, por exemplo aqueles em que isótopos radioativos tal como 3H e 14C estão incorporados, são úteis em ensaio de distribuição de tecido de fármaco e/ou substrato. Além disso, substituição com isótopos tal como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultando em maior estabilidade metabólica, por exemplo meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzidas.
[0149] Alguns dos compostos aqui (incluindo, porém não limitado a aminoá-cidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de ami-noácido não natural modificado, e reagentes para produzir os compostos menciona-dos acima) tem átomos de carbono assimétricos e pode portanto existir como enan- tiômeros ou diastereômeros. Misturas diasteroméricas podem ser separadas em seus diastereômeros individuais na base de suas diferenças físicas químicas por métodos conhecidos, por exemplo, por cromatografia e/ou cristalização fracionária. Enantiômeros podem ser separados convertendo-se a mistura enantiomérica em uma mistura diastereomérica por reação com um composto oticamente ativo apro-priado (por exemplo, álcool), separando os diastereômeros e convertendo (por exemplo, hirolizando) os diastereômeros individuais aos enantiômeros puros corres-pondentes. Todos os tais isômeros, incluindo diastereômeros, enantiômeros, e mis-turas dos mesmos são considerados como parte das composições descritas aqui.
[0150] Em modalidades adicionais ou outras, os compostos descritos aqui (incluindo, porém não limitado a aminoácidos não naturais, polipeptídeos de amino-ácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado, e reagentes para produzir os compostos mencionado acima) são usados na forma de profármacos. Em modalidades adicionais ou outras, os compostos descritos aqui ((incluindo, porém não limitado a aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado, e reagentes para produzir os compostos mencionados acima) são metabolizados em administração a um organismo em necessidade para produzir um metabólito que é em seguida usado para produzir um efeito desejado, incluindo um efeito terapêutico desejado. Em outras ou adicionais modalidades são metabólitos ativo de aminoácidos não naturais e polipeptídeos de aminoácido não natural "modificado ou não modificado".
[0151] Os métodos e formulações descritas aqui incluem o uso de N-óxidos, formas cristalinas (da mesma forma conhecidas como polimorfos), ou aceitáveis farmaceuticamente de aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado. Em certas modalida-des, aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipep-tídeos de aminoácido não natural modificado podem existir como tautômeros. Todos os tautômeros estão incluídos dentro do escopo dos aminoácidos não naturais, poli-peptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados apresentados aqui. Além disso, os aminoácidos não naturais, polipeptí-deos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modifi-cados descritos aqui podem existir em forma não solvatada bem como solvatada com solventes farmaceuticamente aceitáveis tal como água, etanol, e similar. As formas solvatadas dos aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificados apresentadas aqui são da mesma forma consideradas ser descritas aqui.
[0152] Alguns dos compostos aqui (incluindo, porém não limitado a aminoá-cidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de ami-noácido não natural modificado e reagentes para produzir os compostos menciona-dos acima) podem existir em várias formas tautoméricas. Todas as tais formas tau- toméricas são consideradas como parte das composições descrita aqui. Da mesma forma, por exemplo todas as formas de enol-ceto de qualquer composto (incluindo, porém não limitado a aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado e reagentes para pro-duzir os compostos mencionado acima) aqui é considerado como parte das compo-sições descritas aqui.
[0153] Alguns dos compostos aqui (incluindo, porém não limitado a aminoá-cidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de ami-noácido não natural modificado e reagentes para produzir qualquer um dos compos-tos mencionados acima) são ácidos e podem formar um sal com um cátion farma- ceuticamente aceitável. Alguns dos compostos aqui (incluindo, porém não limitado a aminoácidos não naturais, polipeptídeos de aminoácido não natural e polipeptídeos de aminoácido não natural modificado e reagentes para produzir os compostos mencionados acima) podem ser básicos e desta maneira, pode formar um sal com um ânion farmaceuticamente aceitável. Todos os tais sais, incluindo di-sais estão dentro do escopo das composições descritas aqui e eles podem ser preparados por métodos convencionais. Por exemplo, sais podem ser preparados contatando-se as entidades ácidas e básicas, em um meio aquoso, não aquoso ou parcialmente aquoso. Os sais são recuperados usando-se pelo menos uma das seguintes técni-cas: filtração, precipitação com um não solvente seguido por filtração, evaporação do solvente, ou, no caso de soluções aquosas, liofilização.
[0154] Sais farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos de aminoácido não natural descritos aqui podem ser formados quando um próton ácido presente nos polipeptídeos de aminoácido não natural origem é substituído por um íon de me-tal, por meio de exemplo um íon de metal de álcali, um íon alcalino terroso, ou um íon de alumínio; ou coordena com uma base orgânica. Além disso, as formas de sal dos polipeptídeos de aminoácido não natural descritas aqui podem ser preparadas usando sais dos materiais de partida ou intermediários. Os polipeptídeos de aminoá-cido não natural descritos aqui podem ser preparados como um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável (que é um tipo de um sal farmaceuticamente aceitável) reagindo-se a forma de base livre de polipeptídeos de aminoácido não natural descritos aqui com um ácido inorgânico ou orgânico farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, os polipeptídeos de aminoácido não natural descritos aqui podem ser preparados como sais de adição de base farmaceuticamente aceitável (que são um tipo de um sal farmaceuticamente aceitável) reagindo-se a forma de ácida livre de polipeptídeos de aminoácido não natural descrita aqui com uma base inorgânica ou orgânica farmaceuticamente aceitável.
[0155] O tipo de sais farmacêuticos aceitáveis, incluem, porém não são limi-tados a: (1) sais de adição de ácido, formados com ácidos inorgânicos tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e similar; ou formados com ácidos orgânicos tal como ácido acético, ácido propiônico, ácido hexanóico, ácido ciclopentanepropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malônico, ácido sucínico, ácido málico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, áci-do cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 1,2-etanodissulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido benzenossulfônico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 4-metilabiciclo-[2.2.2]oct-2-eno-1-carboxílico, ácido glucoeptônico, ácido 4,4'-metilenobis-(3-hidróxi-2-eno-1-carboxílico), ácido 3- fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido lauril sulfúrico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteá- rico, ácido mucônico, e similar; (2) sais formados quando um próton ácido presente no composto origem é substituído por um íon de metal, por exemplo, um íon de metal de álcali, um íon alcalino terroso, ou um íon de alumínio; ou coordena com uma base orgânica. Bases orgânicas aceitáveis incluem etanolamina, dietanolamina, trie- tanolamina, trometamina, N- metilaglucamina, e similar. Bases inorgânicas aceitá-veis incluem hidróxido de alumínio, hidróxido de cálcio, hidróxido de potássio, carbo-nato de sódio, hidróxido de sódio, e similar.
[0156] Os contraíons correspondentes dos sais farmacêuticos aceitáveis de polipeptídeo de aminoácido não natural podem ser analisados e identificados usan-do vário métodos incluindo, porém não limitados a, cromatografia de troca iônica, cromatografia de íon, eletroforese capilar, plasma indutivamente acoplado, espec- troscopia de absorção atômica, espectrometria de massa, ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, a atividade terapêutica de tal sais farmacêuticos aceitáveis de polipeptídeo de aminoácido não natural pode ser testada usando as técnicas e métodos descritos nos exemplos 87-91.
[0157] Deveria ser entendido que uma referência para um sal inclui as for-mas de adição de solvente ou formas cristalinas do mesmo, particularmente solvatos ou polimorfos. Solvatos contêm quantidades estequiométricas ou não estequiométri- cas de um solvente, e são frequentemente formados durante o processo de cristali-zação com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, etanol, e similar. Hidratos são formados quando o solvente é água, ou alcoolatos são formados quan-do o solvente for álcool. Polimorfos incluem as disposições de empacotamento cris-talinas diferentes da mesma composição elementar de um composto. Polimorfos normalmente têm padrões de difração de Raios X diferentes, espectros infraverme-lhos, pontos de fusão, densidade, dureza, forma cristalina, propriedades ópticas e elétricas, estabilidade, e solubilidade. Vários fatores tal como o solvente de recrista- lização, taxa de cristalização, e temperatura de armazenamento pode causar uma única forma cristalina dominar.
[0158] A avaliação e caracterização de polipeptídeo de polimorfos de sais farmacêuticos aceitáveis de polipeptídeo de aminoácido não natural e/ou solvatos podem ser realizados usando uma variedade de técnicas incluindo, porém não limi-tado a, análise térmica, difração de Raios X, espectroscopia, sorpção de vapor, e microscopia. Métodos de análise térmicos trata degradação termo química ou pro-cessos termo físicos incluindo, porém não limitados a, transições polimórficas, e tais métodos são usados para analisar as relações entre formas polimórficas, determi-nam perda de peso, encontrar a temperatura de transição de vidro, ou para estudos de compatibilidade excipiente. Tais métodos incluem, porém não são limitados a, calorimetria de varreduira diferencial (DSC), Calorimetria de Varredura Diferencial Modulada (MDCS), análise Termogravimétrica (TGA), e análise Termogravi-métrica e Infravermelha (TG/IR). Métodos de difração de Raios X incluem, porém não são limitados a, únicos difractômetros de cristal e pó e fontes de síncrotron. As várias técnicas espectroscópicas usadas incluem, porém não são limitadas a, Raman, FTIR, UVIS, e NMR (estado líquido e sólido). As várias técnicas de microscopia in-cluem, porém não são limitadas a, microscopia de luz polarizada, Microscopia de Elétron de Varredura (SEM) com Análise de Raios X Dispersiva de Energia (EDX), Microscopia de Elétron de Varredura Ambiental com EDX (em atmosfera de vapor de gás ou água), microscopia de IR, e microscopia de Raman.
[0159] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0160] As novas características da invenção são mencionadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das características e vantagens da presente invenção será obtido por referência à seguinte descrição detalhada que menciona modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos acompanhantes dos quais:
[0161] Figura 1 apresenta uma ilustração gráfica de ligação Her-Tox ao re- ceptor de Her2.
[0162] Figura 2 apresenta uma ilustração gráfica da expressão de variantes Anti-Her2 determinadas por análise de ELISA.
[0163] Figura 3 apresenta uma ilustração gráfica da expressão de variantes Anti-Her2 determinada por análise de ELISA.
[0164] Figura 4 apresenta uma ilustração gráfica do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer de mama HCC 1954 e derivados de ligan- te de dolastatina.
[0165] Figura 5 apresenta uma ilustração gráfica da análise do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer de mama HCC 1954 e conju-gados de trastuzumabe-tox.
[0166] Figura 6 apresenta uma ilustração gráfica da análise do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer ovariano SKOV-3 e derivados de ligante de dolastatina.
[0167] Figura 7 apresenta uma ilustração gráfica da análise do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer ovariano SKOV-3 e conjuga-dos de trastuzumabe-tox.
[0168] Figura 8 apresenta uma ilustração gráfica da análise do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer de mama MDA- MB-468 e derivados de ligante de dolastatina.
[0169] Figura 9 apresenta uma ilustração gráfica da análise do ensaio de proliferação de célula com linhagem celular de câncer de mama MDA- MB-468 e conjugados de trastuzumabe-tox.
[0170] Figura 10 apresenta uma ilustração gráfica de medida de volume de tumor (mm3) depois que uma única dose IC (3,3 mg/kg, 10 mg/kg, 20mg/kg) de deri-vados de dolastatina ligados a trastuzumabe.
[0171] Figura 11 apresenta formatos de ensaio usados para medir concen- tração de derivados de dolastatina ligada a trastuzumabe em soro de rato SD
[0172] Figura 12 apresenta ilustrações gráficas de concentrações de soro (ng/mL) de derivados de dolastatina ligados a trastuzumabe depois de única inje-ções IV.
[0173] Figura 13 apresenta uma ilustração gráfica de concentrações de soro (ng/mL) de derivados de dolastatina ligados a trastuzumabe depois de única inje-ções de IV. Este ensaio descreve ligação de anticorpo ao receptor ErbB2.
[0174] Figura 14 apresenta uma ilustração gráfica de de concentrações de soro (ng/mL) de derivados de dolastatina ligados a trastuzumabe depois da injeção IV. O em medidas de estabilidade in vivo detecta pelo menos dois derivados de do-lastatina ligados a rastuzumabe.
[0175] Figura 15 apresenta ilustrações gráficas da mudança em peso corpo-ral de rato e volume de tumor depois de tratamento com derivados de dolastatina ligados a trastuzumabe.
[0176] Figura 16 apresenta ilustrações gráficas de eficácia anti-tumor de trastuzumabe, Her2-HS122-NCD1 e Her2-HS122/LK145-HCDl contra tumores esta-belecidos de HCC1954 em camundongos SCID-bg. Camundongos foram adminis-trados uma única injeção IV no dia 1 (seta). Pontos de dados representam grupo volume de tumor médio e barras de erro representam erro padrão da média (SEM).
[0177] Figura 17 apresenta ilustrações gráficas de eficácia anti-tumor de de-rivados de ligante de dolastatina no modelo de Xenoenxerto MDA361DYT2 Breast (2+).
[0178] Figura 18 apresenta ilustrações gráficas de eficácia anti-tumor de de-rivados de ligante de dolastatina no modelo de Xenoenxerto MDA361DYT2 Breast (2+).
[0179] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0180] Enquanto modalidades preferidas da presente invenção foram mos- tradas e descritas aqui, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais moda-lidades são fornecidas por meio de exemplo apenas. Numerosas variações, mudan-ças, e substituições agora ocorrerão para aqueles versados na técnica sem partir da invenção. Deveria ser entendido que várias alternativas para as modalidades da in-venção descritas aqui podem ser empregadas na prática da invenção. É pretendido que as seguintes reivindicações definem o escopo da invenção e que métodos e es-truturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes ser revestidos desse modo.
[0181] I. Introdução
[0182] Recentemente, um tecnologia completamente nova nas ciências de proteína foi relatada, que promete superar muitas das limitações associadas com modificações sítio-específicas de proteínas. Especificamente, novos componentes foram adicionados à maquinaria biossintética de proteína do procarioto Escherichia coli (E. coli) (por exemplo, L. Wang, e outro, (2001), Science 292:498-500) e o euca- rioto Sacchromyces cerevisiae (S. cerevisiae) (por exemplo, J. Chin., Science 301 :964-7 (2003)), que permitiu a incorporação de aminoácidos não naturais a proteínas in vivo. Vários novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou bio-lógicas, incluindo rótulos de fotoafinidade e aminoácidos fotoisomerizáveis, ceto aminoácidos, e aminoácidos glicosilados foram incorporados eficazmente e com al-ta-fidelidade em proteínas em E. coli e em levedura com respeito ao códon ambari- no, TAG, usando esta metodologia. Estudos demonstraram que é possível seletiva-mente e habitualmente introduzir grupos funcionais químicos que não são encontra-dos em proteínas, que são quimicamente inertes em todos os grupos funcionais en-contrados nos 20 aminoácidos comuns, geneticamente-codificados e que podem ser usados para reagir eficazmente e seletivamente formar ligações covalentes estáveis.
[0183] II. Vista geral
[0184] Em um nível, descrito aqui são as ferramentas (métodos, composi-ções, técnicas) para criar e usar derivados de ligante de dolastatina ou análogos compreendendo pelo menos uma carbonila, dicarbonila, oxima, hidroxilamina, aldeí-do, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazi- na, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, alquina, cicloalquina, ou eno-diona. Em outro nível, descrito aqui são as ferramentas (métodos, composi-ções, técnicas) para criar e usar derivados de ligante de dolastatina ou análogos compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com uma oxima, amina aromática, heterociclo (por exemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).
[0185] Tais derivados de ligante de dolastatina compreendendo aminoácidos não naturais podem conter outra funcionalidade, incluindo porém não limitado a, um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; uma se-gunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou frag-mento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos. Nota-se que as várias funcionalidades mencionadas acima não são pretendidas insinuar que os membros de uma funcionalidade não pode ser classificado como membros de outra funciona-lidade. Realmente, haverá sobreposição dependendo das circunstâncias particula-res. Por meio de exemplo apenas, um polímero solúvel em água sobrepõe em esco-po com um derivado de polietileno glicol, entretanto a sobreposição não está com-pleto e desse modo ambas as funcionalidades são citadas acima.
[0186] Fornecido aqui em algumas modalidades, é um derivado de ligante de grupo tóxico compreendendo uma carbonila, dicarbonila, oxima, hidroxilamina, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazi- na, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, alquina, cicloalquina, ou eno-diona. Em algumas modalidades, o derivado de grupo tóxico compreende quaisquer dos ligantees descritos aqui. Em outras modalidades, descritas aqui são as ferramentas (métodos, composições, técnicas) para criar e usar derivados de grupo tóxicos ou análogos compreendendo um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado pelo menos com uma oxima, amina aromática, heterociclo (por exemplo, indol, quinoxalina, fenazina, pirazol, triazol, etc.).
[0187] Em algumas modalidades, tais derivado tóxicos compreendendo ami-noácidos não naturais podem conter outra funcionalidade, incluindo porém não limi-tado a, um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades es-pecíficas, o grupo tóxico é dolastatina ou auristatina. Em certas modalidades especí-ficas, o grupo tóxico é dolastatina-10. Nota-se que as várias funcionalidades menci-onadas acima não são significadas insinuar que os membros de uma funcionalidade não podem ser classificado como membros de outra funcionalidade. Realmente, haverá sobreposição dependendo das circunstâncias particulares. Por meio de exemplo apenas, um polímero solúvel em água sobrepõe em escopo com um derivado de polietileno glicol, entretanto a sobreposição não está completa e desse modo ambas as funcionalidades são citadas acima.
[0188] Certas modalidades da presente invenção descrevem preparações de certas porções tóxicas com ligantees que reduz a toxicidade da porção in vivo en-quanto a porção tóxica retém atividade farmacológica. Em algumas modalidades, a toxicidade do grupo tóxico ligado, quando administrado a um animal ou humano, é reduzida ou eliminada comparado ao grupo tóxico livre ou derivados de grupo tóxico compreendendo ligações lábeis, enquanto retendo atividade farmacológica. Em al-gumas modalidades, doses aumentadas do grupo tóxico ligado (por exemplo, deri-vados de ligante de dolastatina, derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural) podem ser administradas a animais ou humanos com maior segurança. Em certas modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a um por- ção tóxica (por exemplo, derivados de dolastatina) fornece estabilidade in vitro e in vivo. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de aminoácido não natural ligados a um porção tóxica (por exemplo, derivados de dolastatina-10) são eficazes e menos tóxicos comparado à porção tóxica livre (por exemplo, dolastatina- 10).
[0189] III. Derivados de Ligante de Dolastatina
[0190] Em um nível, descrito aqui são as ferramentas (métodos, composi-ções, técnicas) para criar e usar derivados de ligante de dolastatina ou análogos compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, oxima ou hidroxilamina. Tais deri-vado de ligante de dolastatina compreendendo aminoácidos não naturais podem conter outra funcionalidade, incluindo porém não limitado a, um polímero; um polí-mero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos. Nota-se que as várias funcionalidades mencio-nadas acima não são significadas insinuar que os membros de uma funcionalidade não podem ser classificados como membros de outra funcionalidade. Realmente, haverá sobreposição dependendo das circunstâncias particulares. Por meio de exemplo apenas, um polímero solúvel em água sobrepõe em escopo com um deri-vado de polietileno glicol, entretanto a sobreposição não está completa e desse mo-do ambas as funcionalidades são citadas acima.
[0191] Em um aspecto são métodos para selecionar e designar um derivado de ligante de dolastatina a ser modificado usando os métodos, composições e técni-cas descritas aqui. O novo derivado de ligante de dolastatina pode ser designado novamente, incluindo por meio de exemplo apenas, como parte de processo de ava-liação de alto-processamento (caso no qual numerosos polipeptídeos podem ser designados, sintetizados, caracterizado e/ou testado) ou com base nos interesses do pesquisador. O novo derivado de ligante de dolastatina pode da mesma forma ser designado com base na estrutura de um polipeptídeo conhecido ou parcialmente caracterizado. Por meio de exemplo apenas, dolastatina foi o paciente de estudo intenso pela comunidade científica; um novo composto pode ser designado com ba-se na estrutura de dolastatina. Os princípios para selecionar aminoácido(s) para substituir e/ou modifcar são descritos aqui separadamente. A escolha da qual modi-ficação para empregar é da mesma forma descrita aqui, e pode ser usada para sa-tisfazer a necessidade do experimentador ou usuário final. Tais necessidades po-dem incluir, porém não são limitadas a, manipular a eficácia terapêutica do polipep-tídeo, melhorar o perfil de segurança do polipeptídeo, ajustando as farmacocinética, farmacológicos e/ou farmacodinâmicas do polipeptídeo, tal como, por meio de exemplo apenas, solubilidade de água crescente, biodisponibilidade, meia-vida de soro crescente, meia-vida terapêutica aumentada, modular imunogenicidade, modu-lar atividade biológica, ou estender o tempo de circulação,. Além disso, tais modifi-cações incluem, por meio de exemplo apenas, fornecendo funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporando um anticorpo, e qualquer combinação das modifica-ções mencionadas acima.
[0192] Da mesma forma descrito aqui são derivados de ligante de dolastatina que têm ou podem ser modificados para conter um grupo oxima, carbonila, dicar-bonila, ou hidroxilamina. Incluído com este aspecto são métodos para produzir, puri-ficar, caracterizar e usar tais derivados de ligante de dolastatina
[0193] O derivado de ligante de dolastatina pode conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou dez ou mais de um grupo carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, grupo hidroxilamina, ou formas protegi-das dos mesmos. O derivado de ligante de dolastatina pode ser o mesmo ou diferen-te, por exemplo, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou sítios mais diferentes no derivado que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais grupos reativos diferentes.
[0194] A. Estrutura e Síntese de Derivados de Ligante de Dolastatina: Gru-pos Electrofílicos e Nucleofílicos
[0195] Derivados de dolastatina com ligantees contendo um grupo hidroxila- mina (da mesma forma chamado um aminoóxi) permite a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo porém não limitado a, com PEG ou outros polímeros solúveis em água). Como hidrazinas, hidrazidas e semi- carbazidas, a nucleofilicidade aumentada do grupo aminoóxi permite reagir eficaz-mente e seletivamente com uma variedade de moléculas que contêm grupos carbo-nila ou dicarbonila, incluindo porém não limitado a, cetonas, aldeídos ou outros gru-pos funcionais com reatividade química similar. Visto que o resultado de reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, entretanto, uma oxima resulta geralmente da reação de um grupo aminoóxi com um grupo contendo carbonila ou dicarbonila tal como, por meio de exemplo, grupos cetonas, aldeídos ou outros fun-cionais com reatividade química similar. Em algumas modalidades, derivados de do-lastatina com ligantees compreendendo uma azida, alquina ou cicloalquina permite ligação de moléculas por meio de reações de cicloadição (por exemplo, cicloadições 1,3-dipolares, cicloadição de Huisgen azida-alquina, etc.)
[0196] Desse modo, em certas modalidades descritas aqui são derivados de dolastatina com ligantees compreendendo uma hidroxilamina, aldeído, aldeído pro-tegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, amidina, imi- na, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, e grupo hidroxilamina de eno-diona, um grupo semelhante a hidroxilamina (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina e é estruturalmente similar a um grupo hidroxilamina), um grupo hidroxilamina mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo hidroxilamina), ou um grupo de proteção de hidroxilamina (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina em desproteção). Em algumas modalidades, os derivados de dolastatina com ligan- tees compreendem azidas, alquinas ou cicloalquinas. Tais derivado de ligante de dolastatina incluem compostos tendo a estrutura da Fórmula I):
Figure img0022
em que: Z tem estrutura de:
Figure img0023
R5 é H, COR8, C1-C6alquila, ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; Y é hidroxilamina, metila, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegi-da, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, azida, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, alquina, cicloalquina, ou eno-diona; L é -alquileno- ou-(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um.
[0197] Tais derivado de ligante de dolastatina podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, po-límero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0198] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R5 é tiazol ou ácido carboxílico. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R5 é hidro-gênio. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R5 é metila, etila, propi-la, iso-propila, butila, iso-butila, sec-butila, terc-butila, pentila, ou hexila.
[0199] Em algumas modalidades, Y é azida. Em outras modalidades, Y é ci-cloalquina. Em modalidades específicas, a ciclooctina tem uma estrutura tem de:
Figure img0024
cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, éster, éter, tioéter, aminoalquila, halogênio, éster alquílico, éster arílico, amida, aril amida, haleto de alquila, alquil amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, éster sulfonílico, halossulfonila, nitrila, alquil nitrila, e nitro; e q é 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11.
[0200] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R6 é H. Em al-gumas modalidades de compostos da Fórmula (I), R6 é hidroxi.
[0201] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), Ar é fenila.
[0202] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R7 é metila, eti- la, propila, iso-propila, butila, sec-butila, iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R7 é hidrogênio.
[0203] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), Y é hidroxilami-na, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, amidina, imina, diamina, ceto-amina, ceto-alquina, ou eno-diona.
[0204] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), cada alquileno é independentemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de com-postos da Fórmula (I), n é 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0205] B. Estrutura e Síntese de Derivados de Ligante de Dolastatina: Gru-pos Hidroxilamina
[0206] Desse modo, em certas modalidades descritas aqui são derivados de dolastatina com ligantees compreendendo um grupo hidroxilamina, um grupo seme-lhante a hidroxilamina (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina e é es-truturalmente similar a um grupo hidroxilamina), um grupo hidroxilamina mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo hidroxilamina), ou um grupo de proteção de hidroxilamina (que tem reatividade similar a um grupo hidroxilamina em desproteção). Tais derivado de ligante de dolastatina incluem compostos tendo a estrutura da Fórmula (I):
Figure img0025
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0026
R5 é H, COR8, C1-C6alquila, ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-Cealquila ou hidrogênio; Y é NH2-O- ou metila; L é -alquileno- ou-(alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um.
[0207] Tais derivados de ligante de dolastatina podem estar na forma de um sal, ou pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural, políme-ro, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0208] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R5 é tiazol. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R5 é hidrogênio. Em certas moda-lidades de compostos da Fórmula (I), R5 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, iso-butila, sec-butila, terc-butila, pentila, ou hexila.
[0209] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R6 é H. Em al-gumas modalidades de compostos da Fórmula (I), R6 é hidróxi.
[0210] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), Ar é fenila.
[0211] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R7 é metila, eti-la, propila, iso-propila, butila, sec-butil iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), R7 é hidrogênio.
[0212] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), Y é hidroxilami- na, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonila, hidrazina, amidina, imina, diamina, ceto- amina, ceto-alquina, ou eno-diona.
[0213] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (I), alquileno é - CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de com-postos da Fórmula (I), n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0214] Em certas modalidades, derivados de ligante de dolastatina incluem compostos tendo a estrutura da Fórmula (II):
Figure img0027
[0215] Em algumas modalidades de compostos da Fórmula (II), Lé- (alquileno-O)n-alquileno-. Em algumas modalidades, cada alquileno é -CH2CH2-, n é igual a 3, e R7 é metila. Em algumas modalidades, L é -alquileno-. Em algumas modalidades de compostos da Fórmula (II), cada alquileno é -CH2CH2- e R7 é metila ou hidrogênio. Tais derivados de ligante de dolastatina podem estar na forma de um sal, ou pode ser incorporado em um polipeptídeo de aminoácido não natural, po-límero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0216] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (II), R7 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, sec-butil iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (II), R7 é hidrogênio.
[0217] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (II), alquileno é - CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de com-postos da Fórmula (II), n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0218] Em certas modalidades, compostos da Fórmula (I) são estáveis em solução aquosa durante pelo menos 1 mês sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostos da Fórmula (I) são estáveis durante pelo menos 2 semanas sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostoss da Fórmula (I) são estáveis durante pelo menos 5 dias sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[0219] Os métodos e composições fornecidos e descritos aqui incluem poli-peptídeos compreendendo derivado de ligante de dolastatina contendo pelo menos um grupo um carbonila ou dicarbonila, grupo oxima, grupo hidroxilamina, ou formas protegidas ou mascaradas dos mesmos. Introdução de pelo menos um grupo reativo em um derivado de ligante de dolastatina pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas, incluindo, porém não limi-tado a, com um ou mais derivado(s) de ligante de dolastatina enquanto não reagindo com os aminoácidos de ocorrência comum. Uma vez incorporado, as cadeias laterais de derivado de ligante de dolastatina podem da mesma forma ser modificadas utilizando-se metodologias de química descritas aqui ou adequadas para os grupos funcionais particulares ou substituintes presentes no derivado de ligante de dolasta-tina.
[0220] Os métodos de derivado de ligante de dolastatina e composições descritas aqui fornecem conjugados de substâncias tendo uma ampla variedade de grupos funcionais, substituintes ou porções, com outras substâncias incluindo porém não limitadas a um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos.
[0221] Em certas modalidades, os derivados de ligante de dolastatina, ligan- tees e reagentes descritos aqui, incluindo compostos das Fórmulas (I) são estáveis em solução aquosa sob condições ligeiramente ácidas (incluindo porém não limitado a pH 2 a 8). Em outras modalidades, tais compostos são estáveis durante pelo menos um mês sob condições ligeiramente ácidas. Em outras modalidades, tais compostos são estáveis durante pelo menos 2 semanas sob condições ligeiramente ácidas. Em outras modalidades, tais compostos são estáveis durante pelo menos 5 dias sob condições ligeiramente ácidas.
[0222] Em outro aspecto das composições, métodos, técnicas e estratégias descritas aqui são métodos para estudar ou usar quaisquer dos derivados de ligante de dolastatina de aminoácido não natural “modificado” ou “não modificado”. "Incluído dentro deste aspecto, por meio de exemplo apenas, são terapêutico, diagnóstico, com base em ensaio, industrial, cosmético, biologia de planta, ambiental, produção de energia, produtos de consumo, e/ou usos militares que beneficiariam de um derivado de ligante de dolastatina compreendendo um polipeptídeo ou proteína de aminoácido não natural “modificado ou não modificado”.
[0223] Exemplos não limitantes de derivados de ligante de dolastatina inclu-em:
Figure img0028
[0224] IV. Derivados de Aminoácido Não Natural
[0225] Os aminoácidos não naturais usados nos métodos e composições descritas aqui têm pelo menos uma das seguintes quatro propriedades: (1) pelo me-nos um grupo funcional na cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma carac-terística e/ou atividade e/ou reatividade ortogonal à reatividade química dos 20 ami-noácidos comuns, geneticamente codificados (isto é, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina), ou pelo menos ortogonal à reatividade química dos aminoácidos de ocorrên-cia natural presentes no polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural; (2) os aminoácidos não naturais introduzidos são substancialmente quimicamente inertes aos 20 aminoácidos comuns, geneticamente codificados; (3) o aminoácido não natu-ral pode ser estavelmente incorporado em um polipeptídeo, preferivelmente com a estabilidade comensurável com os aminoácidos de ocorrência natural ou sob condi-ções fisiológicas típicas, e também preferivelmente tal incorporação pode ocorrer por meio de um sistema in vivo; e (4) o aminoácido não natural inclui um grupo funcional oxima ou um grupo funcional que pode ser transformado em um grupo oxima reagindo-se com um reagente, preferivelmente sob condições que não destroem as propriedades biológicas do polipeptídeo que inclui o aminoácido não natural (a menos claro uma tal destruição de propriedades biológicas é o propósito da modifica- ção/transformação), ou onde a transformação pode ocorrer sob condições aquosas em um pH entre cerca de 4 e cerca de 8, ou onde o sítio de reativo no aminoácido não natural é um sítio eletrofílico. Qualquer número de aminoácidos não naturais pode ser introduzido no polipeptídeo. Aminoácidos não naturais podem da mesma forma incluir oximas protegidas ou mascaradas ou grupos protegidos ou mascarados que podem ser transformados em um grupo oxima depois da desproteção do grupo protegido ou não mascaramento do grupo mascarado. Aminoácidos não naturais podem da mesma forma incluir grupos carbonila ou dicarbonila protegidos ou mas-carados, que pode ser transformado em um grupo carbonila ou dicarbonila depois da desproteção do grupo protegido ou desmascaramento do grupo mascarado e desse modo estão disponíveis para reagir com hidroxilaminas ou oximas para formar gru-pos oxima.
[0226] Aminoácidos não naturais que podem ser usados nos métodos e composições descritos aqui incluem, porém não são limitados a, aminoácidos com-preendendo aminoácidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que covalen-temente ou não covalentemente interagem com outras moléculas, aminoácidos gli- cosilados tal como uma serina substituída por açúcar, outros aminoácidos modifica-dos por carboidrato, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos contendo aldeído, aminoácidos compreendendo polietileno glicol ou outro poliéters, aminoácidos subs-tituídos por átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, aminoácidos com cadeias laterais alongadas quando comparado a aminoácidos na-turais, incluindo porém não limitado a, poliéters ou hidrocarboneto de cadeia longa, incluindo porém não limitado a, maior do que cerca de 5 ou maior do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos contendo açúcar ligados a carbono, aminoácidos redox- ativos, aminoácidos contendo amino tioácido, e aminoácidos compreendendo uma ou mais porção tóxica.
[0227] Em algumas modalidades, aminoácidos não naturais compreendem uma porção de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L- glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N-acetil-L-glucosaminil-L- treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-mannosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos da mesma forma incluem exemplos onde a ligação de N- ou Ode ocorrência natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituído por uma ligação covalente não geralmente encontrada na natureza incluindo porém não limitado a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similar. Exemplos de tais amino- ácidos da mesma forma incluem sacarídeos que não são geralmente geralmente encontrados em proteínas de ocorrência natural tal como 2-desóxi-glicose, 2- desoxigalactose e similar.
[0228] As porções químicas incorporadas em polipeptídeos por meio de in-corporação de aminoácidos não naturais em tal polipeptídeos oferecem uma varie-dade de vantagens e manipulações de polipeptídeos. Por exemplo, a reatividade única de um grupo funcional carbonila ou dicarbonila (incluindo um grupo funcional ceto ou aldeído) permite modificação seletiva de proteínas com qualquer de vários reagentes contendo hidrazina ou hidroxilamina in vivo e in vitro. Um aminoácido não natural de átomo pesado pode ser útil para planejamento em fases de dados de estrutura de Raios X. A introdução sítio-específica de átomos pesados usando aminoácidos não naturais da mesma forma fornece seletividade e flexibilidade escolhendo- se posições para átomos pesados. Aminoácidos não naturais fotorreativos (incluindo porém não limitado a, aminoácidos com benzofenona e arilazidas (incluindo porém não limitado a, fenilazida) cadeias laterais), por exemplo, permite fotoreticulação in vivo e in vitro eficiente de polipeptídeos. Exemplos de aminoácidos não naturais fotorreativos incluem, porém não limitado a, p-azido-fenilalanina e p-benzoil- fenilalanina. O polipeptídeo com os aminoácidos não naturais fotorreativos podem em seguida ser reticulados por excitação do controle temporal de fornecimento de grupo fotorreativo. Em um exemplo não limitante, o grupo metila de um amino não natural pode ser substituído com um isotopicamente rotulado, incluindo porém não limitado a, com um grupo metila, como uma sonda de estrutura local e dinâmicas, incluindo porém não limitado a, com o uso de ressonância magnética nuclear e es- pectroscopia vibracional.
[0229] A. Estrutura e Síntese de Derivados de Aminoácido Não-natural: Gru-pos Carbonila, semelhante a Carbonila, Carbonila Mascarado, e Carbonila Protegida
[0230] Aminoácidos com um grupo reativo eletrofílico permite uma variedade de reações em moléculas de ligação por meio de várias reações químicas, incluindo, porém não limitado a, reações de adição nucleofílicas. Tais grupos reativos eletrofíli- cos incluem um grupo carbonila ou dicarbonila (incluindo um grupo ceto ou aldeído), um grupo semelhante a carbonila ou dicarbonila (que tem reatividade similar a um grupo carbonila ou dicarbonila e é estruturalmente similar a um grupo carbonila ou dicarbonila), um grupo carbonila mascarado ou dicarbonila mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo carbonila ou dicarbonila), ou um grupo carbonila protegido ou dicarbonila protegido (que tem reatividade similar a um grupo carbonila ou dicarbonila em desproteção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVII):
Figure img0029
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído inferior, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituí- do)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R>N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila
Figure img0030
R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; cada R" é independentemente H, alquila, alquila substituída, ou um grupo de proteção, ou quando mais do que um grupo R" está presente, dois R" opcionalmente formam uma heterocicloalquila; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegi-do, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; ou os grupo -K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterocicloalquila mo- nocíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, incluindo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegi-do, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; com a condição que quando A for fenileno e cada R3 é H, B está presente; e que quando A for -(CH2)4 e cada R3 é H, B não seja -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes e cada R3 é H, R não é metila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0231] Em certas modalidades, compostos da Fórmula (XXXVII) são estáveis em solução aquosa durante pelo menos 1 mês sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostos da Fórmula (XXXVII) são estável durante pelo menos 2 semanas sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, com-postos da Fórmula (XXXVII) são estáveis durante pelo menos 5 dias sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8.
[0232] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), B é al-quileno inferior, alquileno inferior substituído, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(R’)=N-N(R’)-, -N(R’)CO-, -C(O)-, -C(R’)=N-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, ou-S(O)2(alquileno ou alquileno substituído)-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), B é - O(CH2)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH2-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH2)-, -CONH- (CH2)-, -SCH2-, -S(=O)CH2-, ou -S(O)2CH2-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), R é C1-6 alquila ou cicloalquila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII) R é -CH3, -CH(CH3)2, ou ciclopropila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), RI é H, terc-butiloxicarbonila (Boc), 9-Fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), N-acetila, tetrafluoroacetila (TFA), ou benziloxicarbonila (Cbz). Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), RI é uma resina, aminoácido, polipeptídeo, anticorpo, ou polinucleotídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), R2 é OH, O- metila, O-etila, ou O-i- butila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), R2 é uma resina, aminoácido, polipeptídeo, anticorpo, ou polinucleotídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), R2 é um polinucleotídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII), R2 é ácido ribonucléico (RNA).
[0233] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVII),
Figure img0031
, é selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) A é alquileno inferior substituído, C4-arileno, arileno substituído, heteroari-leno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante divalente selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -OCO)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R')-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, - S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; (ii) A é opcional, e quando presente é alquileno inferior substituído, C4- arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é um ligante divalente selecionado a partir do grupo consistindo em alqui-leno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, - NS(O)2-,-OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), - S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, - N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; (iii) A é alquileno inferior; B é opcional, e quando presente é um ligante divalente selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, - N(R')-, -C(O)N(R')-, -CSN(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, - N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2- N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-; e (iv) A é fenileno; B é um ligante divalente selecionado a partir do grupo consistindo em alqui-leno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, - NS(O)2-,-OS(O)2-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), - S(O)2N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)2N(R')-, - N(R')-N=, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-;
Figure img0032
cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; RI é opcional, e quando presente, é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é opcional, e quando presente, é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e cada R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVIII) são incluí-dos:
Figure img0033
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substtituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcari- leno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído inferior, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1,2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituí-do)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, - CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno subs- tituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, - N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; com a condição que quando A for fenileno, B está presente; e que quando A for -(CH2X B não seja -NHC(O)(CH2CH2)-; e que quando A e B estão ausentes, R não seja metila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados. Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXIX) são incluí-dos:
Figure img0034
em que: B é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou al- quileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, - C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno subs tituído)-, -N(R’)-, -NR’- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, - S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, - C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR', e-S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou po-dem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, po- lissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modifi-cados.
[0234] Além disso, os seguintes aminoácidos são incluídos:
Figure img0035
[0235] Tais aminoácidos não naturais podem ser opcionalmente grupo pro tegido amino, carboxila protegida e/ou na forma de um sal, ou podem ser incorpora- dos em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0236] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXX) são incluídos:
Figure img0036
em que -NS(O)2-, -OS(O)2-, opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alque- nileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquile- no inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, - CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR', e-S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; e n é 0 a 8; com uma condição que quando A for -(CH2)4-, B não seja - NHC(O)(CH2CH2)-. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0237] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
Figure img0037
em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida, ou um sal dos mesmos, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0238] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXI) são incluídos:
Figure img0038
em que A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, - CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou po-dem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, po- lissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modifi-cados.
[0239] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXII) são incluídos:
Figure img0039
em que, B é opcional, e quando presente é que um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno substituído inferior, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR- (alquileno ou alquile- no substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N- N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, al-quila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, po-límero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0240] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
Figure img0040
em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida, ou um sal dos mesmos, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados. Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXIV) estão incluídos:
Figure img0041
B é opcional, e quando presente é que um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno substituído inferior, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, - NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’- (alquileno ou alqui- leno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N- N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, al-quila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou al-quila substituída; e n é 0 a 8. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0241] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
Figure img0042
em que tais compostos são opcionalmente amino protegido, opcionalmente carboxila protegida, opcionalmente amino protegido e carboxila protegida, ou um sal dos mesmos, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0242] Além das estruturas de monocarbonila, os aminoácidos não naturais descritos aqui podem incluir grupos tais como dicarbonila, semelhante a dicarbonila, dicarbonila mascarada e grupos dicarbonila protegidos. Por exemplo, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXV) estão incluídos:
Figure img0043
em que, A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno substituído inferior, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1,2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -NS(O)2-,-OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, - CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli-nucleotídeo. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou po-dem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, po-lissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modifi-cados.
[0243] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXVI) estão incluídos:
Figure img0044
em que, B é opcional, e quando presente é que um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno substituído inferior, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquile- no substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N- N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, al-quila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, po-límero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0244] Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
Figure img0045
em que tais compostos são opcionalmente amino protegido e carboxila pro-tegida, ou um sal dos mesmos. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natu-ral, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0245] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXVII) estão incluídos:
Figure img0046
em que, B é opcional, e quando presente é que um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno substituído inferior, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -NS(O)2-, -OS(O)2-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(alquileno ou alquile- no substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R’)-, -CSN(R’)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’) CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, - N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N- N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, al-quila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR’ onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alqui-la substituída; e n é 0 a 8. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados. Além disso, os seguintes aminoácidos estão incluídos:
Figure img0047
em que tais compostos são opcionalmente amino protegido e carboxi- la protegida, ou um sal dos mesmos, ou podem ser incorporados em um polipeptí- deo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0246] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXVIll) estão incluídos:
Figure img0048
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; X1 é C, S, ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, po-límero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0247] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula
Figure img0049
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída.
[0248] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0249] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXX) estão incluídos:
Figure img0050
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser in-corporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0250] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXl) estão incluídos:
Figure img0051
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; X1 é C, S, ou S(O); e n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, alcóxi, alquilamina, halogênio, alquila, arila, ou qualquer R8 e R9 podem juntos formar =O ou uma cicloalquila, ou quaisquer grupos R8 adjacentes podem juntos formar uma ciclo- alquila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissa- carídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0251] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXII) estão incluídos:
Figure img0052
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli-nucleotídeo; n é 0, 1,2, 3, 4, ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é indepen-dentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, alcóxi, alquilamina, ha-logênio, alquila, arila, ou qualquer R8 e R9 podem juntos formar =O ou uma cicloal-quila, ou quaisquer grupos R8 adjacentes podem juntos formar uma cicloalquila. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarí- deo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificadoa.
[0252] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXIII) estão incluídos:
Figure img0053
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5; e cada R8 e R9 em cada grupo CR8R9 é indepen-dentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, alcóxi, alquilamina, ha- logênio, alquila, arila, ou qualquer R8 e R9 pode juntos formar =O ou uma cicloalquila, ou quaisquer grupos R8 adjacentes podem juntos formar uma cicloalquila. Tais ami- noácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um po- linucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0253] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXIV) estão incluídos:
Figure img0054
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; X1 é C, S, ou S(O); e L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída.
[0254] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0255] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXV) estão incluídos:
Figure img0055
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída.
[0256] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0257] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXVl) estão incluídos:
Figure img0056
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; L é alquileno, alquileno substituído, N(R’)(alquileno) ou N(R’)(alquileno substituído), onde R’ é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída.
[0258] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0259] Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXVII) estão incluídos:
Figure img0057
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído;
Figure img0058
ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são inde-pendentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquila, alquila substituída, ciclo- alquila, ou cicloalquila substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; T3 é uma ligação, C(R)(R), O, ou S, e R é H, halogênio, alquila, alquila subs-tituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo.
[0260] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0261] Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXVIII) estão incluídos:
Figure img0059
onde (a) indica ligação ao grupo A e (b) indica ligação aos respectivos grupos carbonila, R3 e R4 são independentemente escolhidos a partir de H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 ou dois grupos R4 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; T3 é uma ligação, C(R)(R), O, ou S, e R é H, halogênio, alquila, alquila subs- tituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli- nucleotídeo; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’, onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou al-quila substituída.
[0262] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0263] Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXIX) es-tão incluídos:
Figure img0060
em que: R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; e T3 é O, ou S.
[0264] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0265] Além disso, aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXX) es-tão incluídos:
Figure img0061
em que: R é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída.
[0266] Além disso, os seguintes aminoácidos tendo estruturas da Fórmula (XXXXXX) estão incluídos:
Figure img0062
[0267] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0268] A funcionalidade de carbonila ou dicarbonila pode ser reagida seleti-vamente com um reagente contendo hidroxilamina sob condições moderadas em solução aquosa para formar a ligação de oxima correspondente que é estável sob condições fisiológicas. Veja, por exemplo, Jencks, W., P., J. Am. Chem Soc. 81,475-481 (1959); Shao, J., e Tam, J., P., J. Am. Chem. Soc. 117(14):3893-3899 (1995). Além disso, a única reatividade do grupo carbonila ou dicarbonila permite modifica-ção seletiva na presença das outras cadeias laterais de aminoácido. Veja, por exemplo, Cornish, V., W., e outro, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geog- hegan, K., F. & Stroh, J., G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L., K., e outro, Science 276:1125-1128 (1997).
[0269] A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)-fenilalanina é descrita em Zhang, Z., e outro, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), incorporado por referência. Outros aminoácidos contendo carbonila ou dicarbonila podem ser simi-larmente preparados.
[0270] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo um ami-noácido não natural é quimicamente modificado para gerar uma carbonila reativa ou grupo funcional dicarbonila. Por exemplo, uma funcionalidade de aldeído útil para reações de conjugação pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxila adjacentes. Onde a molécula biologicamente ativa é um polipeptí-deo, por exemplo, uma serina ou treonina N-terminal (que normalmente pode estar presente ou pode ser exposta por meio de digestão química ou enzimática) pode ser usada para gerar uma funcionalidade de aldeído sob condições de clivagem oxidati- va moderadas usando periodato. Veja, por exemplo, Gaertner, e outro, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K., & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner e outro, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Entretanto, métodos conhecidos na técnica são restringidos ao aminoácido no terminal N do peptídeo ou proteína.
[0271] Adicionalmente, por meio de exemplo um aminoácido não natural su-portando hidroxila adjacente e grupos aminos podem ser incorporados em um poli-peptídeo como uma "funcionalidade de aldeído mascarada." Por exemplo, 5- hidroxilisina suportando um grupo hidroxila adjacente à épsilon amina. Condições de reação para gerar o aldeído tipicamente envolve adição de excesso molar de meta- periodato de sódio sob condições moderadas para evitar oxidação em outros sítios dentro do polipeptídeo. O pH da reação de oxidação é tipicamente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de cerca de 1,5 molar em excesso de meta pe- riodato de sódio em uma solução tamponada do polipeptídeo, seguido por incubação durante cerca de 10 minutos no escuro. Veja, por exemplo Patente U.S. No. 6,423,685.
[0272] B. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não-Naturais: Grupos Di-carbonila, semelhantes a Dicarbonila-like, Dicarbonila Mascarados, e Dicarbonila Protegidos
[0273] Aminoácidos com um grupo reativo eletrofílico permita uma variedade de reações a moléculas de ligação por meio de reações de adição nucleofílicas entre outros. Tais grupos reativos eletrofílicos incluem um grupo dicarbonila (incluindo um grupo dicetona, um grupo cetoaldeído, um grupo cetoácido, um grupo cetoéster, e um grupo cetotioéster), um grupo semelhante a dicarbonila (que tem reatividade similar a um grupo dicarbonila e é estruturalmente similar a um grupo dicarbonila), um grupo dicarbonila mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo dicarbonila), ou um grupo dicarbonila protegido (que tem reatividade similar a um grupo dicarbonila em desproteção). Tais aminoácidos incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVII):
Figure img0063
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante ligado a uma extremidade a uma porção contendo diamina, o ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído inferior, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)R"-, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, onde k é 1, 2, ou 3, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituí- do)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -NR"-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, e -N(R")CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, onde cada R" é independentemente H, alquila, ou alquila substituída;
Figure img0064
ou onde, TI é uma ligação, C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alqueni-leno opcionalmente substituído, ou heteroalquila opcionalmente substituída; em que cada substituintes opcionais é independentemente selecionado a partir de alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, ciclo-alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; T2, é selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquile-no inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroal-quileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR’- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO- (alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, - N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=-C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N- N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, al
Figure img0065
da é XI é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em-O-, -S-, - N(H)-, -N(R’)-, -N(Ac)-, e -N(OMe)-; X2 é -OR, -OAc, -SR, -N(R’)2, -N(R’)(Ac), - N(R’)(OMe), ou N3, e onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila subs-tituída; RéH, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli-nucleotídeo; ou os grupos -A-B-K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterociclo- alquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo carbonila, inclu-indo um grupo dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegido, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado; ou o grupo -K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterocicloalquila mono- cíclica ou bicíclica compreendeno pelo menos um grupo carbonila, incluindo um gru-po dicarbonila, grupo carbonila protegido, incluindo um grupo dicarbonila protegido, ou grupo carbonila mascarado, incluindo um grupo dicarbonila mascarado.
[0274] Exemplo não limitante de aminoácidos de dicarbonila tendo a estrutu ra da Fórmula (XXXVII) incluem:
Figure img0066
[0275] Os seguintes aminoácidos tendo estruturas da Fórmula (XXXVIl) são da mesma forma incluídos:
Figure img0067
[0276] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente mo-dificados.
[0277] C. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não-naturais: Grupos Cetoal- quina, semelhantes a Cetoalquina, Cetoalquina Mascarados, Cetoalquina Protegidos, Alcino, e Cicloalquina
[0278] Aminoácidos contendo grupos reativos com reatividade semelhante a dicarbonila permitem a ligação de moléculas por meio de reações de adição nucleo- fílicas. Tais grupos reativos eletrofílicos incluem um grupo cetoalquina, um grupo semelhante a cetoalquina (que tem reatividade similar a um grupo cetoalquina e é estruturalmente similar a um grupo cetoalquina), um grupo cetoalquina mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo cetoalquina), ou um grupo cetoal-quina protegido (que tem reatividade similar a um grupo cetoalquina em desprote-ção). Em algumas modalidades, aminoácidos contendo grupos reativos com uma alquina terminal, alquina interna ou cicloalquina permitem ligação de moléculas por meio de reações de cicloadição (por exemplo, cicloadições 1,3-dipolar, cicloadição azida-alquina Huisgen, etc.) Tais aminoácidos incluem aminoácidos tendo a estrutu-ra da Fórmula (XXXXXXI-A) ou (XXXXXXI-B)
Figure img0068
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante ligado a uma extremidade a uma porção contendo diamina, o ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)R"-, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, onde ké1, 2, ou 3, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - NR"-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, e -N(R")CO-(alquileno ou alqui leno substituído)-, onde cada R" é independentemente H, alquila, ou alquila substitu- ída;
Figure img0069
G é opcional, e quando presente é
Figure img0070
T4 é um grupo de proteção carbonila, porém não limitado a,
Figure img0071
, onde cada X1 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em -O-, -S-, -N(H)-, - N(R’)-, -N(Ac)-, e -N(OMe)-; X2 é -OR, -OAc, -SR, -N(R’)2, -N(R’)(Ac), -N(R’)(OMe), ou N3, e onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; RéH, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, éster, éter, tioéter, aminoalquila, halogênio, éster alquílico, éster arílico, amida, aril amida, haleto de alquila, alquil amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, éster sulfonílico, halossulfonila, nitrila, alquil nitrila, e nitro; e q é 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. D. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não-naturais: Grupos Cetoamina, Semelhantes a Cetoamina, Cetoamina Mascarados, e Cetoamina Protegidos Aminoácidos contendo grupos reativos com reatividade semelhante a dicar-bonila permitem a ligação de moléculas por meio de reações de adição nuclefílicas. Tais grupos reativos incluem um grupo cetoamina, um grupo semelhante a cetoami-na (que tem reatividade similar para um grupo cetoamina e é estruturalmente similar a um grupo cetoamina), um grupo cetoamina mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo cetoamina), ou um grupo cetoamina protegido (que tem reatividade similar a um grupo cetoamina em desproteção). Tais aminoácidos include aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXXII):
Figure img0072
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante ligado a uma extremidade a uma porção contendo diamina, o ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)R"-, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, onde ké1, 2, ou 3, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, - NR"-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, e -N(R")CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, onde cada R" é independentemente H, alquila, ou alquila substitu
Figure img0073
TI é um C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, um C1-C4 alquenileno opcionalmente substituído, ou uma heteroalquila opcionalmente substituída; T4 é um grupo de proteção carbonila, porém não limitado a,
Figure img0074
independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em -O-, -S-, -N(H)-, - N(R')-, -N(Ac)-, e -N(OMe)-; X2 é -OR, -OAc, -SR', -N(R')2, -N(R')(Ac), -N(R')(OMe), ou N3, e onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; RéH, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila.
[0279] Aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXXII) incluem ami- noácidos tendo a estrutura (XXXXXXIV)
Figure img0075
em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consis-tindo em H, halogênio, alquila, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR onde k é 1, 2, ou 3, -C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR’ onde cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída.
[0280] E. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não-naturais: Diamina, Seme-lhante a Diamina, Diamina Mascarada, Aminas Protegidas e Azidas
[0281] Aminoácidos com um grupo reativo nucleofílico permite uma varieda-de de reações a moléculas de ligação por reações de adição eletrofílicas entre ou-tros. Tais grupos reativos nucleofílicos incluem um grupo diamina (incluindo um gru-po hidrazina, um grupo amidina, um grupo imina, um grupo 1,1-diamina, um grupo 1,2-diamina, um grupo 1,3-diamina, e um grupo 1,4-diamina), um grupo semelhante a diamina (que tem reatividade similar a um grupo diamina e é estruturalmete similar a um grupo diamina), um grupo diamina mascarado (que pode ser facilmente con-vertido em um grupo diamina), ou um grupo diamina protegido (que tem reatividade similar para um grupo diamina em desproteção). Em algumas modalidades, aminoá-cidos contendo grupos reativos com azidas permitem ligaçao de moléculas por meio de reações de cicloadição (por exemplo, cicloadições 1,3-dipolar, cicloadição azida- alquina Huisgen, etc.).
[0282] Em outro aspecto são métodos para a síntese química de moléculas substituídas por hidrazina para a derivatização de derivados de dolastatina substituí-dos por carbonila. Em uma modalidade, a molécula substituída por hidrazina pode ser derivados ligados a dolastatina. Em uma modalidade são métodos para a prepa-ração de moléculas substituídas por hidrazina adequadas para a derivatização de polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila, incluindo por meio de exemplo apenas, polipeptídeos de aminoácido não natural contendo cetona, ou aldeído. Em uma outra modalidade ou adicional, os aminoácidos não naturais são incorporados sítio-especificamente durante a translação in vivo de proteínas. Em uma outra modalidade ou adicional, os derivado de dolastatina substituídos por hidrazina permitem a derivatização sítio-específico de aminoácidos não naturais contendo carbonila por meio de ataque nucleofílico de cada grupo carbonila para formar um polipeptídeo derivatizado heterociclo, incluindo um polipeptídeo derivatizado heterociclo contendo nitrogênio de uma maneira sítio-específica. Em uma outra modalidade ou adicional, o método para a preparação de derivados de dolastatina substituídos por hidrazina fornece acesso a uma ampla variedade polipeptídeos sítio- especificamente derivatizados. Em uma outra modalidade ou adicional são métodos para sintetizar derivados de dolastatina ligados a polietilenoglicol funcionalizado por hidrazina (PEG).
[0283] Tais aminoácidos incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVII-A) ou (XXXVIl-B):
Figure img0076
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante ligado a uma extremidade a uma porção contendo diamina, o ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)R"-, -C(O)R"- , -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, onde k é 1, 2, ou 3, - C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -NR"-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, e -N(R")CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, onde cada R" é independentemente H, alquila, ou alquila substituída;
Figure img0077
; onde: R8 e R9 são independentemente selecionados a partir de H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, cicloalquila substituída, ou aminum grupo de proteção; Ti é uma ligação, C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alqueni-leno opcionalmente substituído, ou heteroalquila opcionalmente substituída; T2 é C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alquenileno opcional-mente substituído, heteroalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída; em que cada substituinte opcional é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, alquila inferior substituída, cicloalquila inferior, cicloalquila inferior substituída, alquenila inferior, alquenila inferior substituída, alquinila, heteroalquila inferior, heteroalquila substituída, heterocicloalquila inferior, heterocicloalquila inferior substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcarila substituída, aralquila, ou aralquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; Ri é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou os grupos -A-B-K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo menos um grupo diamina, grupo diamina protegido ou grupo diamina mascarado; ou os grupos -B-K-R juntos formam uma cicloalquila ou cicloarila bicíclica ou heterocicloalquila tricíclica ou compreendendo pelo menos um grupo diamina, grupo diamina protegido ou grupo diamina mascarado; ou o grupo -K-R juntos formam uma cicloalquila ou heterocicloalquila mono- cíclica ou bicíclica compreendendo pelo menos um grupo diamina, grupo diamina protegido ou grupo diamina mascarado; em que pelo menos um grupo amina em -A-B-K-R é opcionalmente uma amina protegida.
[0284] Em um aspecto são compostos compreendendo as estruturas 1 ou 2:
Figure img0078
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante ligado a uma extremidade em uma porção contendo diamina, o ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O- (alquileno ou alquileno substituído)-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)R"-, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, onde k é1, 2, ou 3, -C(O)- (alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -NR"- (alquileno ou alquileno substituído)-, -CON(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, - CSN(R")-(alquileno ou alquileno substituído)-, e -N(R")CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, onde cada R" é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; TI é uma ligação ou CH2; e T2 é CH; em que cada substituinte opcional é independentemente selecionado a partir de alquila inferior, alquila inferior substituída, cicloalquila inferior, cicloalquila inferior substituída, alquenila inferior, alquenila inferior substituída, alquinila, heteroalquila inferior, heteroalquila substituída, heterocicloalquila inferior, heterocicloalquila inferior substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcari- la substituída, aralquila, ou aralquila substituída; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou as porções contendo -A-B-diamina juntas formam uma cicloalquila ou he-terocicloalquila bicíclica compreendendo pelo menos um grupo diamina, grupo dia-mina protegido ou grupo diamina mascarado; ou os grupos de porções contendo -B-diamina juntos formam uma cicloalqui-la ou cicloarila ou heterocicloalquila bicíclica ou tricíclica compreendendo pelo me-nos um grupo diamina, grupo diamina protegido ou grupo diamina mascarado; em que pelo menos um grupo amina em porção contendo -A-B-diamina é opcionalmente uma amina protegida; ou um metabólito ativo, sal, ou um profármaco ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0285] Os seguintes exemplos não limitantes de aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVIl) estão incluídos:
Figure img0079
[0286] Tais aminoácidos não naturais podem da mesma forma estar na for- ma de um sal ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e/ou opcionalmente pós- translacionalmente modificados.
[0287] Em certas modalidades, compostos da Fórmula (XXXVIl) são estáveis em solução aquosa durante pelo menos 1 mês sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostos da Fórmula (XXXVIl) são estáveis durante pelo menos 2 semanas sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, com-postos da Fórmula (XXXVIl) são estáveis durante pelo menos 5 dias sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, tais condições ácidas são pH cerca de 2 a cerca de 8.
[0288] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), B é alqui-leno inferior, alquileno inferior substituído, O-(alquileno ou alquileno substituído)-, C(R’)=N (R’)-, -N(R’)CO-, C(O)-, -C(R’)=N-, C(O)-(alquileno ou alquileno substituído), CON(R’)(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(alquileno ou alquileno substituído), -S(O)(alquileno ou alquileno substituído)-, ou -S(O)2(alquileno ou alquileno substitu-ído)-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), B é -O(CH2)-, - CH=N-, CH=NH-, -NHCH2-, -NHCO-, C(O)-, C(O)(CH2)-, CONH(CH2)-, -SCH2-, - S(=O)CH2-, ou -S(O)2CH2-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), R é C1-6 alquila ou cicloalquila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl) R é -CH3, -CH(CH3)2, ou ciclopropila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), RI é H, terc-butiloxicarbonila (Boc), 9- Fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), N-acetila, tetrafluoroacetila (TFA), ou benziloxicar-bonila (Cbz). Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), RI é uma resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), RI é um anticorpo, fragmento de anticorpo ou anti-corpo monoclonal. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), R2 é OH, O-metila, O-etila, ou O-t-butila. Em certas modalidades de compostos da Fórmu- la (XXXVIl), R2 é uma resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinu-cleotídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXVIl), R2 é um anti-corpo, fragmento de anticorpo ou anticorpo monoclonal.
[0289] Os seguintes exemplos não limitantes de aminoácidos tendo a estru tura da Fórmula (XXXVIl) estão da mesma forma incluídos:
Figure img0080
[0290] Exemplos não limitantes de aminoácidos protegidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXVIl) incluem:
Figure img0081
[0291] F. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Não-naturais: Aminas Aromá-ticas
[0292] Aminoácidos não naturais com grupos reativos nucleofílicos, tal como, por meio de exemplo apenas, um grupo amina aromática (incluindo grupo amina secundária e terciária), um grupo amina aromática mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo amina aromática), ou um grupo amina aromática protegido (que tem reatividade similar a um grupo amina aromática em desproteção) permite uma variedade de reações a moléculas de ligação por meio de várias reações, incluindo porém não limitado a, reações de alquilação redutivas com derivados de ligante de dolastatina contendo aldeído. Tais aminas aromáticas contendo aminoácidos não naturais incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXXV):
Figure img0082
em que: , é selecionado a partir do grupo consistindo em um anel de arila monocíclico, um anel de arila bicíclico, um anel de arila multicíclico, a anel de heteroarila monocíclico, um anel de heteroarila bicíclico, e um anel de heteroarila multicíclico; A é independentemente CRa, ou N; B é independentemente CRa, N, O, ou S; cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em H, halogênio, alquila, -NO2, -CN, alquila substituída, -N(R')2, -C(O)kR', -C(O)N(R')2,- OR', e -S(O)kR', onde k é 1,2, ou 3; e n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; e R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; cada um de R3 e R4 é independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; M é H ou -CH2R5; ou a porção M-N-C(R5) pode formar uma estrutura de anel de 4 a 7 membros; R5 é alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, al- quinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R")2,-(alquileno ou alquileno substituído)- N(R")2,-(alquenileno ou alquenileno substituído)-N(R")2,-(alquileno ou alquileno subs- tituído)-(arila ou arila substituída),-(alquenileno ou alquenileno substituído)-(arila ou arila substituída),-(alquileno ou alquileno substituído)-ON(R")2,-(alquileno ou alquileno substituído)-C(O)SR", -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituída), em que cada R" é independentemente hidrogênio, alquila, alquila subs- tituída, alquenila, alquenila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituí-da, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, ou -C(O)OR'; ou dois grupos R5 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; ou R5 e qualquer Ra opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma hetero-cicloalquila; e cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída.
[0293] Tais aminoácidos não naturais podem da mesma forma estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente redutiva- mente alquilado. M I
[0294] A estrutura
Figure img0083
(como apresenteado em todos os exemplos aqui) não apresenta as orientações relativas de "A," "B," "NH-M" e "Ra"; de preferência estas quatro características desta estrutura podem ser orientadas de qualquer maneira de quimicamente-som (juntamente com outras características desta estrutura), como ilustrado por exemplo aqui.
[0295] Aminoácidos não naturais contendo uma porção de amina aromática tendo a estrutura da Fórmula (A) incluem, aminoácidos não naturais tendo as estru-turas
Figure img0084
Figure img0085
: em que, cada A’ é independentemente selecionado a partir de
Figure img0086
e até dois A’ podem ser
Figure img0087
com o A’ restante selecionado a partir de CRa ou N.
[0296] Tais aminoácidos não naturais podem da mesma forma estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente redutiva- mente alquilado.
[0297] Exemplos não limitantes de aminoácidos não naturais contendo uma porção de amina aromática tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXXV) incluem ami noácidos não naturais tendo a estrutura da Fórmula (XXXXXXVI), e Fórmula
Figure img0088
D:\Altius Project\Rework Batches\Bennington_VT\11.10.2022
Figure img0089
[0298] Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo e opcionalmente redutivamente alquilados.
[0299] Aminoácidos não naturais contendo uma porção de amina aromática têm as seguintes estruturas:
Figure img0090
em que cada Ra é independentemente selecionado a partir do grupo consis-tindo em H, halogênio, alquila, -NO2, -CN, alquila substituída, -N(R’)2, -C(O)kR, - C(O)N(R’)2, -OR', e -S(O)kR onde k é 1, 2, ou 3; M é H ou -CH2R5; ou a porção M-N-C(R5) podem formar uma estrutura de anel de 4 a 7 membros; RI é H, um grupo de proteção amino, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, aminoácido, polipeptídeo, ou poli-nucleotídeo; R5 é alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, al- quinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, cicloalquila, cicloalquila substituída, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, -C(O)R", -C(O)OR", -C(O)N(R")2, -C(O)NHCH(R" )2, -(alquileno ou alquileno substituído)- N(R")2, -(alquenileno ou substituiu alquenileno)-N(R")2, -(alquileno ou alquileno subs- tituído)-(arila ou arila substituída), -(alquenileno ou alquenileno substituído)-(arila ou arila substituída), -(alquileno ou alquileno substituído)-ON(R")2, -(alquileno ou alqui-leno substituído)-C(O)SR", -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituída), em que cada R" é independentemente hidrogênio, alquila, alquila subs-tituída, alquenila, alquenila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituí-da, heteroarila, heteroarila substituída, heterociclo, heterociclo substituído, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, ou -C(O)OR'; ou R5 e qualquer Ra opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma hetero-cicloalquila; e cada R’ é independentemente H, alquila, ou alquila substituída. Tais aminoácidos não naturais podem da mesma forma estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinucleotídeo.
[0300] Tais aminoácidos não naturais da Fórmula (XXXXXXV) podem ser formados por redução de porções de amina protegidas ou mascaradas na porção aromática de um aminoácido não natural. Tais porções de amina protegidas ou mascaradas incluem, porém não são limitadas a, iminas, hidrazinas, nitro, ou substi-tuintes de azida. Os agentes de redução usados para reduzir tais porções de amina protegidas ou mascaradas incluem, porém não são limitados a, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, NaBH4 ou NaBCNH3.
[0301] V. Derivados de Dolastatina Ligados a Aminoácido Não-natural
[0302] Em outro aspecto descrito aqui são métodos, estratégias e técnicas para incorporar pelo menos tais derivados de ligante de dolastatina em um aminoá-cido não natural. Da mesma forma incluído com este aspecto são métodos para pro-duzir, purificar, caracterizar e usar tais derivados de ligante de dolastatina contendo pelo menos um tal aminoácido não natural. Da mesma forma incluído com este as-pecto são composições de e métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar oligonucleotídeos (incluindo DNA e RNA) que pode ser usado para produzir, pelo menos em parte, um derivado de ligante de dolastatina contendo pelo menos um aminoácido não natural. Da mesma forma incluído com este aspecto são composi-ções de e métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar células que podem expressar tais oligonucleotídeos que podem ser usados para produzir, pelo menos em parte, um derivado de ligante de dolastatina contendo pelo menos um aminoáci-do não natural.
[0303] Desse modo, derivados de ligante de dolastatina compreendendo pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um carbonila, dicarbonila, alquina, cicloalquina, azida, oxima ou grupo hidroxilamina são fornecidos e descritos aqui. Em certas modalidades, derivados de ligante de dolastatina com pelo menos um aminoácido não natural ou aminoácido não natural modificado com um grupo carbonila, dicarbonila, alquina, cicloalquina, azida, oxima ou hidroxilamina incluem pelo menos uma modificação pós-translacional em alguma posição no polipeptídeo. Em algumas modalidades a modificação co-translacional ou pós-translacional ocorre pela maquinaria celular (por exemplo, glicosilação, acetila- ção, acilação, modificação de lipídio, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, e similar), em muitos exemplos, tais modifica-ções co-translacionais ou pós-translacionais com base em maquinaria celular ocor-rem nos sítios de aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo, entretanto, em certas modalidades, as modificações co-translacionais ou pós-translacionais com base em maquinaria celular ocorrem no(s) síto(s) de aminoácido não natural(is) no polipeptídeo.
[0304] Em outras modalidades, a modificação pós-translacional não utiliza a maquinaria celular, porém a funcionalidade é ao invés fornecida por ligação de uma molécula (um polímero; um polímero solúvel em água; um derivado de polietileno glicol; uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anti-corpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos) compreen- dendo um segundo grupo reativo ao pelo menos um aminoácido não natural com-preendendo um primeiro grupo reativo (incluindo porém não limitado a, aminoácido não natural contendo um grupo funcional cetona, aldeído, acetal, hemiacetal, alqui-na, cicloalquina, azida, oxima, ou hidroxilamina) utilizando metodologia de química descrita aqui, ou outros adequados para os grupos reativos particulares. Em certas modalidades, a modificação co-translacional ou pós-translacional é feita in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não eucariótica. Em certas modalidades, a modificação pós-translacional é feita in vitro não utilizando a maquinaria celular. Da mesma forma incluído com este aspecto são métodos para produzir, purificar, carac-terizar e usar tais derivados de ligante de dolastatina contendo pelo menos um tal aminoácido não natural co-translacionalmente ou pós-translacionalmente modifica-dos.
[0305] Da mesma forma incluído dentro do escopo dos métodos, composi-ções, estratégias e técnicas descritas aqui são reagentes capazes de reagir com um derivado de ligante de dolastatina (contendo um grupo carbonila ou dicarbonila, gru-po oxima, alquina, cicloalquina, azida, grupo hidroxilamina, ou formas mascaradas ou protegidas dos mesmos) que é parte de um polipeptídeo para produzir quaisquer das modificações pós-translacionais mencionadas acima. Em certas modalidades, o derivado de ligante de dolastatina pós-translacionalmente modificado conterá pelo menos um grupo oxima; os derivados de ligante de dolastatina contendo oxima mo-dificados resultantes pode sofrer reações de modificação subsequentes. Da mesma forma incluído com este aspecto são métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar tais reagentes que são capazes de quaisquer tais modificações pós- translacionais de tal(is) derivado(s) de ligante de dolastatina.
[0306] Em certas modalidades, o derivado de dolastatina ligados a polipeptí-deo ou aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação co-translacional ou pós-translacional que é feita in vivo por uma célula hospedeira, onde a modifica ção pós-translacional não é normalmente feita por outro tipo de célula hospedeira. Em certas modalidades, o polipeptídeo inclui pelo menos uma modificação co- translacional ou pós-translacional que é feita in vivo por uma célula eucariótica, onde a modificação co-translacional ou pós-translacional não é normalmente feita por uma célula não eucariótica. Exemplos de tais modificações co-translacionais ou pós- translacionais incluem, porém não são limitados a, glicosilação, acetilação, acilação, modificação de lipídio, palmitoilação, adição de palmitato, fosforilação, modificação de ligação de glicolipídeo, e similar. Em uma modalidade, a modificação co- translacional ou pós-translacional compreende ligação de um oligosacarídeo a uma asparagina por uma ligação de GlcNAc-asparagina (incluindo porém não limitado a, onde o oligosacarídeo compreende (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc, e similar). Em outra modalidade, a modificação co-translacional ou pós-translacional compreende ligação de um oligosacarídeo (incluindo porém não limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, etc.) a uma serina ou treonina por uma ligação de GalNAc-serina, uma GalNAc-treonina, uma GlcNAc-serina, ou uma GlcNAc-treonina. Em certas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo podem compreender uma secreção ou sequência de localização, uma etiqueta de epítopo, uma etiqueta de FLAG, uma etiqueta de poliistidina, uma fusão de GST, e similar. Da mesma forma incluído com este aspecto são métodos para produzir, purificar, caracterizar e usar tais polipeptídeos contendo pelo menos uma tal modificação co-translacional ou pós- translacional. Em outras modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural gli- cosilado é produzido em uma forma não glicosilada. Uma tal forma não glicosilada de um aminoácido não natural glicosilado pode ser produzido por métodos que incluem remoção química ou enzimática de grupos oligosacarídeo de um polipeptídeo de aminoácido não natural glicosilado isolado ou substancialmente purificado ou não purificado; produção do aminoácido não natural em um hospedeiro que não glicosila um tal polipeptídeo de aminoácido não natural (um tal hospedeiro incluindo, proca- riotos ou eucariotos criados ou mutados para não glicosilar um tal polipeptídeo), a introdução de um inibidor de glicosilação no meio de cultura de célula em que um tal polipeptídeo de aminoácido não natural está sendo produzido por um eucarioto que normalmente glicosilaria um tal polipeptídeo, ou uma combinação de qualquer tais métodos. Da mesma forma descrito aqui são tais formas não glicosiladas de polipep-tídeos de aminoácido não natural normalmente glicosilados (por normalmente glico- silado é significado um polipeptídeo que seria glicosilado quando produzido sob condições em que polipeptídeos de ocorrência natural são glicosilados). Claro que, tais formas não glicosiladas de polipeptídeos de aminoácido não natural normalmen-te glicosilados (ou realmente qualquer polipeptídeo descritos aqui) pode estar em uma forma não purificada, uma forma substancialmente purificada, ou em uma forma isolada.
[0307] Em certas modalidades, o polipeptídeo de aminoácido não natural in-clui pelo menos uma modificação pós-translacional que é feita na presença de um acelerador, em que a modificação pós-translacional é estequiométrica, semelhante a estequiométrica, ou próximo a estequiométrica. Em outras modalidades o polipeptí-deo é contatado com um reagente da Fórmula (XIX) na presença de um acelerador. Em outra modalidade o acelerador é selecionado a partir do grupo consistindo em:
Figure img0091
[0308] A. Síntese Química de Derivados de Dolastatina Ligados a Aminoáci-do Não-Natural: Derivados de Dolastatina Ligados a Oxima
[0309] Derivados ligados a dolastatina de aminoácido não-natural contendo um grupo oxima permitem reação com uma variedade de reagentes que contêm cer-tos grupos carbonila ou dicarbonila reativos (incluindo porém não limitado a, ceto-nas, aldeídos, ou outros grupos com reatividade similar) para formar novos aminoá- cidos não naturais compreendendo um novo grupo oxima. Uma tal reação de troca de oxima permite a outra funcionalização de derivados ligados a dolastatina. Além disso, o derivado ligado a dolastatina original contendo um grupo oxima pode ser útil em seu próprio direito contanto que a ligação de oxima seja estável sob condições necessárias para incorporar o aminoácido em um polipeptídeo (por exemplo, in vivo, in vitro e métodos sintéticos químicos descritos aqui).
[0310] Desse modo, em certas modalidades descritas aqui são derivados li-gados a dolastatina de aminoácido não natural com cadeias laterais compreendendo um grupo oxima, um grupo semelhante a oxima (que tem reatividade similar a um grupo oxima e é estruturalmente similar a um grupo oxima), um grupo oxima masca-rado (que pode ser facilmente convertido em um grupo oxima), ou um grupo oxima protegido (que tem reatividade similar a um grupo oxima em desproteção).
[0311] Tais derivados ligados a dolastatina de aminoácido não natural inclu-em derivados ligados a dolastatina tendo a estrutura da Fórmula (VIII):
Figure img0092
em que: A é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, ari- leno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarile- no substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-, -O-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S-, -S-(alquileno ou alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1,2, ou 3, -S(O)k(alquileno ou alquileno substituído)-, - C(O)-, -C(O)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')-, -NR’-(alquileno ou alquileno substituído)-, -C(O)N(R')-, - CON(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')CO-(alquileno ou alquileno substituído)-, -N(R')C(O)O-, - S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, - C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, e -C(R')2-N(R')-N(R')-, onde cada R' é independentemente H, alquila, ou alquila substituída; R é H, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída; RI é H, um grupo proteção de amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo proteção de éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R3 e R4 são cada qual independentemente H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 opcionalmente formam uma cicloalquila ou uma heterocicloalquila; Z tem a estrutura de:
Figure img0093
R5 ; R5 é H, COR8, C1-C6alquila, ou tiazol; R8 é OH R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; L é um ligante selecionado a partir do grupo consistindo em -alquileno-, - (alquileno-O)n-alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; ou um metabólito ativo, ou um profármaco ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0312] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R5 é tiazol. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R6 é H. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), Ar é fenila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R7 é metila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), n é um número inteiro de 0 a 20. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), n é um número inteiro de 0 a 10. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), n é um número inteiro de 0 a 5.
[0313] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R5 é tiazol. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R5 é hidrogênio. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R5 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, iso-butila, sec-butila, terc-butila, pentila, ou hexila.
[0314] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R6 é H.
[0315] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), Ar é fenila.
[0316] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R7 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, sec-butila, iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII) e (IX), R7 é hidrogênio.
[0317] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), cada alquile-no independentemente é -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de com- postos da Fórmula (VIII), alquileno é metileno, etileno, propileno, butilenos, pentile- no, hexileno, ou heptileno.
[0318] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), cada n inde-pendentemente é 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0319] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), RI é um po-lipeptídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), R2 é um polipep-tídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (VIII), o anticorpo é herceptina.
[0320] Em certas modalidades, compostos da Fórmula (VIII) são estáveis em solução aquosa durante pelo menos 1 mês sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostos da Fórmula (VIII) são estáveis durante pelo menos 2 semanas sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, compostos da Fórmula (VIII) são estáveis durante pelo menos 5 dias sob condições ligeiramente ácidas. Em certas modalidades, tais condições ácidas são pH 2 a 8. Tais aminoácidos não naturais podem estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um polinu-cleotídeo e opcionalmente pós-translacionalmente modificados.
[0321] Aminoácidos não naturais com base em oxima podem ser sintetizados por métodos já descritos na técnica, ou por métodos descritos aqui, incluindo: (a) reação de um aminoácido não natural contendo hidroxilamina com um reagente contendo carbonila ou dicarbonila; (b) reação de um aminoácido não natural conten-do carbonila ou dicarbonila com um reagente contendo hidroxilamina; ou (c) reação de uma oxima- contendo aminoácido não natural com certos reagentes contendo carbonila ou dicarbonila.
[0322] B. Estrutura Química e Síntese de Derivados de Dolastatina Ligados a Aminoácido Não-natural: Derivados de Dolastatina Ligados a Amina Aromática Alquilada
[0323] Em um aspecto são derivados de ligante de dolastatina para a deriva-tização química de aminoácidos não naturais com base na reatividade de um grupo amina aromática. Em outras modalidades ou adicionais, pelo menos um dos amino-ácidos não naturais mencionados acima está incorporado em um derivados de ligan-te de dolastatina, isto é, tais modalidades são derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural. Em outras modalidades ou adicionais, os derivados de li-gante de dolastatina são funcionalizados em suas cadeias laterais tal sua reação com um aminoácido não natural de derivatização gera uma ligação de amina. Em outras modalidades ou adicionais, os derivados de ligante de dolastatina são seleci-onados a partir de derivados de ligante de dolastatina tendo cadeias laterais de ami-na aromática. Em outras modalidades ou adicionais, os derivados de ligante de do-lastatina compreendem uma cadeia lateral mascarada, incluindo um grupo amina aromática mascarado. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são selecionados a partir de aminoácidos tendo cadeias laterais de amina aromática. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais com-preendem uma cadeia lateral mascarada, incluindo um grupo amina aromática mas-carado.
[0324] Em outro aspecto são derivados de ligante de dolastatina substituídos por carbonila tal como, por meio de exemplo, aldeídos, e cetonas, para a produção de polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados com base em uma ligação de amina. Em uma outra modalidade são derivados de ligante de dolastatina substi-tuídos por aldeído usados para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo amina aromática pela formação de uma ligação de amina entre o ligante de dolastatina de derivatização e a amina aromática contendo polipeptídeo de ami-noácido não natural.
[0325] Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais compreendem cadeias laterais de amina aromática onde o amina aromática é sele-cionada a partir de uma aril amina ou uma heteroaril amina. Em uma outra modali-dade ou adicional, os aminoácidos não naturais se assemelham a um aminoácido natural em estrutura porém contêm grupos amina aromáticas. Em outra modalidade ou adicional os aminoácidos não naturais se assemelham a fenilalanina ou tirosina (aminoácidos aromáticos). Em uma modalidade, os aminoácidos não naturais têm propriedades que são distintas a partir daqueles dos aminoácidos naturais. Em uma modalidade, tais propriedades distintas são a reatividade química da cadeia lateral; em uma outra modalidade esta reatividade química distinta permite a cadeia lateral do aminoácido não natural sofrer uma reação enquanto sendo uma unidade de um polipeptídeo embora as cadeias laterais das unidades de aminoácido de ocorrência natural no mesmo polipeptídeo não sofrem a reação mencionada acima. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma química orto-gonal aquelas dos aminoácidos de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma porção contendo nucleó- filo; em uma outra modalidade, a porção contendo nucleófilo na cadeia lateral do aminoácido não natural podem sofrer uma reação para gerar uma dolastatina deriva- tizada ligada a amina. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma porção contendo eletrófilo; em uma outra modalidade, a porção contendo eletrófilo na cadeia lateral do aminoácido não natural pode sofrer ataque nucleofílico para gerar uma dolastatina derivatizada ligada a amina. Em quaisquer das modalidades mencionadas acima neste parágrafo, o aminoácido não natural pode existir como uma molécula separada ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de qualquer comprimento; se o último, em seguida o polipeptídeo pode também incorporar aminoácidos de ocorrência natural ou não natural.
[0326] Modificação de aminoácidos não naturais descrita aqui usando alqui- lação redutiva ou reações de aminação redutivas tem qualquer ou todas as seguin-tes vantagens. Primeiro, aminas aromáticas podem ser redutivamente alquiladas com compostos contendo carbonila, incluindo aldeídos, e cetonas, em uma faixa de pH de cerca de 4 a cerca de 10 (e em certas modalidades em uma faixa de pH de cerca de 4 a cerca de 7) para gerar amina substituída, incluindo ligações de amina secundárias e terciárias. Segundo, sob estas condições de reação a química é sele-tiva para aminoácidos não naturais como as cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural são não reativos. Isto permite derivatização sítio específica de polipeptídeos que incorporaram aminoácidos não naturais contendo porções de amina aromáticas ou porções aldeído protegidas, incluindo, por meio de exemplo, proteínas recombinantes. Tais polipeptídeos derivatizados e proteínas podem desse modo ser preparados como produtos homogêneos definidos. Terceiro, as condições moderadas necessárias para efetuar a reação de uma porção de amina aromática em um aminoácido, que foi incorporado em um polipeptídeo com um reagente contendo aldeído não irreversivelmente destroem a estrutura terciária do polipeptídeo (excluindo, claro que, onde o propósito da reação é destruir tal estrutura terciária). Similarmente, as condições moderadas necessárias para efetuar a reação de uma porção de aldeído em um aminoácido, que foi incorporado em um polipeptídeo e desprotegido com um reagente contendo amina aromática geralmente não irreversi-velmente destroem a estrutura terciária do polipeptídeo (excluindo, claro que, onde o propósito da reação é destruir tal estrutura terciária). Quarto, a reação ocorre rapi-damente em temperatura ambiente, que permite o uso de muitos tipos de polipeptí-deos ou reagentes que seriam de outra maneira instáveis em temperaturas mais al-tas. Quinto, a reação ocorre facilmente é condições aquosas, novamente permitindo uso de polipeptídeos e reagentes incompatíveis (em qualquer extensão) com soluções não aquosas. Seis, a reação ocorre facilmente ainda quando a relação de polipeptídeo ou aminoácido para reagente é estequiométrica, semelhante a estequiométrica, ou próxima a estequiométrica, de forma que é desnecessário adicionar reagente em excesso ou polipeptídeo para obter uma quantidade útil de produto de reação. Sétimo, a amina resultante pode ser produzida regiosseletivamente e/ou regioespecificamente, dependendo do desígnio das porções de amina e carbonila dos reagentes. Finalmente, a al- quilação redutiva de aminas aromáticas com reagentes contendo aldeído, e a aminação redutiva de aldeídos com reagentes contendo amina aromática, gera amina, incluindo amina secundária e terciária, ligações que são estáveis sob condições biológicas.
[0327] Aminoácidos não-naturais com grupos reativos nucleofílicos, tal como, por meio de exemplo apenas, um grupo amina aromática (incluindo grupos amina secundária e terciária), um grupo amina aromática mascarado (que pode ser facilmente convertido em um grupo amina aromática), ou um grupo amina aromática protegido (que tem reatividade similar a um grupo amina aromática em desproteção) permita uma variedade de reações a moléculas de ligação por meio de várias reações, incluindo porém não limitado a, reações de alquilação redutivas com derivados ligados a dolastatina contendo aldeído. Tais derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural alquilados incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXV):
Figure img0094
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0095
R5 é H, CO2H, Ci-C6alquila, ou tiazol; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; Ri é H, um grupo de proteção amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, pelo menos um aminoácido, poli-peptídeo, ou polinucleotídeo; R4 é H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída; R7 é Ci-C6alquila ou hidrogênio; L é -alquileno- ou-(alquileno-O)n-alquileno-; n é um número inteiro maior do que ou igual a um; e cada R16 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio, alquila, NO2, CN, e alquila substituída.
[0328] Tais derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural alqui-lados podem da mesma forma estar na forma de um sal, ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de aminoácido não natural, polímero, polissacarídeo, ou um po-linucleotídeo e opcionalmente redutivamente alquilados.
[0329] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R5 é tiazol ou ácido carboxílico. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R6 é H. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), Ar é fenila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R7 é metila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), n é um número inteiro de 0 a 20. Em certas moda-lidades de compostos da Fórmula (XXV), n é um número inteiro de 0 a 10. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), n é um número inteiro de 0 a 5.
[0330] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R5 é tiazol ou ácido carboxílico. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R5 é hidrogênio. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R5 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, iso-butila, sec-butila, terc- butila, pentila, ou hexila.
[0331] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R6 é H. Em algumas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R6 é hidróxi.
[0332] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), Ar é fenila.
[0333] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R7 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, sec-butila, iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R7 é hidrogênio.
[0334] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), cada alquileno é independentemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), alquileno é metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexi- leno, ou heptileno.
[0335] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0336] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R1 é um po-lipeptídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), R2 é um poli-peptídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXV), o anticorpo é herceptina.
[0337] Compostos da Fórmula (XXV) são formados pela alquilação redutiva de compostos de amina aromáticas com carbonila contendo reagentes tais como, por meio de exemplo, cetonas, ésteres, tioésteres, e aldeídos.
[0338] Em algumas modalidades, as porções de amina mascaradas de ami-noácidos não naturais contidos em polipeptídeos são inicialmente reduzidos para produzir aminoácidos não naturais contendo porções de amina aromática incorpora-das em polipeptídeos de aminoácido não natural. Tais porções de amina aromática são em seguida alquiladas redutivas com reagentes contendo carbonila descritos acima para produzir polipeptídeos contendo aminoácidos não naturais da Fórmula (XXV). Tais reações podem da mesma forma ser aplicadas a aminoácidos não natu-rais incorporados em polímeros sintéticos, polissacarídeos, ou polinucleotídeos. Adi-cionalmente, tais reações podem ser aplicadas a aminoácidos não naturais não in-corporados. Por meio de exemplo o agente de redução usado para reduzir porções de amina mascaradas incluem, porém não são limitadas a, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlH4, B2H6, e NaBH4. Por meio de exemplo apenas, alquilação redutiva pode ocor-rer em tampões aquosos com um pH de cerca de 4 a cerca de 7 e usando um agente de redução moderado, tal como, por meio de exemplo apenas, cianoboroidreto de sódio (NaBCNH3). Além disso, outros agentes de redução podem ser usados para alquilação redutiva incluindo, porém não limitado a, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlFL, B2H6, e NaBFL.
[0339] Uma síntese exemplar não limitante de polipeptídeos de aminoácido não natural contendo aminoácidos da Fórmula (XXV) por alquilação redutiva de por-ções de amina aromática secundária, contida em aminoácidos não naturais, com reagentes contendo carbonila descritos acima. Tais alquilações redutivas produzem polipeptídeos contendo aminoácidos não naturais com porções de amina aromática terciária. Tais reações podem da mesma forma ser aplicadas a aminoácidos não naturais incorporados em polímeros sintéticos, polissacarídeos, ou polinucleotídeos. Adicionalmente, tais reações podem ser aplicadas a aminoácidos não naturais não incorporados. Por meio de exemplo apenas, alquilação redutiva podem ocorrer em tampões aquosos com um pH de cerca de 4 a cerca de 7 e usando um agente de redução moderado, tal como, por meio de exemplo apenas, cianoboroidreto de sódio (NaBCNH3). Além disso, outros agentes de redução podem ser usados por alquila-ção redutiva incluindo, porém não limitado a, TCEP, Na2S, Na2S2O4, LiAlFL, B2H6, e NaBFL.
[0340] C. Síntese Química de Derivados de Dolastatina Ligados a Ami-noácido Não-Natural: Heteroarila Contendo Derivados de Dolastatina
[0341] Em um aspecto são aminoácidos não naturais para a derivatização química de derivados ligados a dolastatina com base na reatividade de um grupo dicarbonila, incluindo um grupo contendo pelo menos um grupo cetona, e/ou pelo menos um grupo aldeído, e/ou pelo menos um grupo éster, e/ou pelo menos um grupo ácido carboxílico, e/ou pelo menos um tioéster, e em que o grupo dicarbonila pode ser um grupo 1,2- dicarbonila, um grupo 1,3-dicarbonila, ou um grupo 1,4- dicarbonila. Em outros aspectos ou adicionais são aminoácidos não naturais para a derivatização química de derivados ligados a dolastatina com base na reatividade de um grupo diamina, incluindo um grupo hidrazina, um grupo amidina, um grupo imina, um grupo 1,1-diamina, um grupo 1,2-diamina, um grupo 1,3-diamina, e um grupo 1,4-diamina. Em outras modalidades ou adicionais, pelo menos um dos aminoácidos não naturais mencionados acima está incorporado em um derivado ligados a dolastatina, isto é, tais modalidades são derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são funcionalizados em suas cadeias laterais tal que sua reação com uma molécula de derivatização gera uma ligação, incluindo uma ligação com base heterocíclica, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, e/ou uma ligação com base em aldol. Em outras modalidades ou adicionais são polipeptídeos de aminoácido não natural que podem reagir com um ligante de dolastatina de derivatização para gerar derivados de dolastatina ligados a aminoácido não natural contendo uma ligação, incluindo uma ligação com base heterocíclica, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, e/ou uma ligação com base em aldol. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são selecionados a partir de aminoácidos tendo cadeias laterais de dicarbonila e/ou diamina. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais compreendem uma cadeia lateral mascarada, incluindo um grupo diamina mascarado e/ou um grupo dicarbonila mascarado. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais compreendem um grupo selecionado a partir de: ceto-amina (isto é, um grupo contendo uma cetona e um amina); ceto-alquina (isto é, um grupo contendo uma cetona e um alquina); e um eno-diona (isto é, um grupo contendo um grupo dicarbonila e um alqueno).
[0342] Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais compreendem cadeias laterais de dicarbonila onde o carbonila é selecionada a partir de uma cetona, um aldeído, um ácido carboxílico, ou um éster, incluindo um tioéster. Em outra modalidade são aminoácidos não naturais contendo um grupo funcional que é capaz de formar um heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, em tratamento com um reagente adequadamente funcionalizado. Em uma outra mo-dalidade ou adicional, os aminoácidos não naturais se assemelham a um aminoáci-do natural em estrutura porém contêm um dos grupos funcionais mencionados aci-ma. Em outra modalidade ou adicional os aminoácidos não naturais se assemelham a fenilalanina ou tirosina (aminoácidos aromáticos); enquanto em uma modalidade separada, os aminoácidos não naturais se assemelham a alanina e leucina (aminoá-cidos hidrofóbicos). Em uma modalidade, os aminoácidos não naturais têm proprie-dades que são distintas a partir daqueles dos aminoácidos naturais. Em uma moda-lidade, tais propriedades distintas são a reatividade química da cadeia lateral, em uma outra modalidade esta reatividade química distinta permite para a cadeia lateral do aminoácido não natural sofrer uma reação enquanto sendo uma unidade de um polipeptídeo embora as cadeias laterais das unidades de aminoácido de ocorrência natural no mesmo polipeptídeo não sofrem a reação mencionada acima. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma química orto-gonal aquelas dos aminoácidos de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma porção contendo eletrófi- lo; em uma outra modalidade, a porção contendo eletrófilo na cadeia lateral do ami-noácido não natural podem sofrer ataque nucleofílico para gerar uma proteína deri- vatizada de heterociclo, incluindo uma proteína derivatizada de heterociclo contendo nitrogênio. Em quaisquer das modalidades mencionadas acima neste parágrafo, o aminoácido não natural pode existir como uma molécula separada ou podem ser incorporados em um polipeptídeo de qualquer comprimento; se o último, em seguida o polipeptídeo pode também incorporar aminoácidos de ocorrência natural ou não natural.
[0343] Em outro aspecto são moléculas substituídas por diamina, em que o grupo diamina é selecionado a partir de um grupo hidrazina, um amidina, um imina, um 1,1- diamina, um 1,2-diamina, um 1,3-diamina e um 1,4-diamina, para a produção de derivado de dolastatina ligados a aminoácido não natural derivatizados com base em um heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligação. Em uma outra modalidade são derivados de dolastatina substituídos por diamina usados para derivati- zar que polipeptídeos de aminoácido não natural contendo dicarbonila pela formação de um heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligação entre a molécula de derivatização e o polipeptídeo de aminoácido não natural contendo dicarbonila. Em outras modalidades os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo dicarbonila mencionados acima são polipeptídeos de aminoácido não natural contendo dicetona. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais contendo dicarbonila compreendem cadeias laterais onde a carbonila é selecionado a partir de uma ceto- na, um aldeído, um ácido carboxílico, ou um éster, incluindo um tioéster. Em outras modalidades ou adicionais, as moléculas substituídas por diamina compreendem um grupo selecionado a partir de uma funcionalidade desejada. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma química ortogonal aquelas do aminoácidos de ocorrência natural que permitem o aminoácido não natural reagir seletivamente com as moléculas substituídas por diamina. Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende uma porção contendo eletrófilo que reage seletivamente com a molécula contendo diamina; em uma outra modalidade, a porção contendo eletrófilo na cadeia lateral do aminoácido não natural pode sofrer ataque nucleofílico para gerar uma proteína derivatizada de heterociclo, incluindo uma proteína derivatizada de heterociclo contendo nitrogênio. Em um outro aspecto relacionado às modalidades descritas neste parágrafo são os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados que resultam na reação da molécula de derivatização com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Outras modalidades incluem qualquer outra modificação dos polipeptídeos de aminoácido não natural já modificados.
[0344] Em outro aspecto são moléculas substituídas por dicarbonila para a produção de polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados com base em um heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligação. Em uma outra modalidade são moléculas substituídas por dicarbonila usadas para derivatizar poli-peptídeos de aminoácido não natural contendo diamina pela formação de um hete-rociclo, incluindo um grupo heterociclo contendo nitrogênio. Em uma outra modali-dade são moléculas substituídas por dicarbonila que podem formar tal heterociclo, incluindo grupos heterociclos contendo nitrogênio com um polipeptídeo de aminoáci-do não natural contendo diamina em uma faixa de pH entre cerca de 4 e cerca de 8. Em uma outra modalidade são moléculas substituídas por dicarbonila usadas para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo diamina pela formação de um heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligação entre a mo lécula de derivatização e os polipeptídeos de aminoácido não natural contendo dia-mina. Em uma outra modalidade as moléculas substituídas por dicarbonila são mo-léculas substituídas por dicetona, em outros aspectos moléculas substituídas por cetoaldeído, em outros aspectos moléculas substituídas por cetoácido, em outros aspectos moléculas substituídas por cetoéster, incluindo moléculas substituídas por cetotioéster. Em outras modalidades, as moléculas substituídas por dicarbonila compreendem um grupo selecionado a partir de uma funcionalidade desejada. Em outras modalidades ou adicionais, as moléculas substituídas por aldeído são molé-culas de polietileno glicol substituídas por aldeído (PEG). Em uma outra modalidade, a cadeia lateral do aminoácido não natural tem uma química ortogonal aquelas dos aminoácidos de ocorrência natural que permitem o aminoácido não natural reagir seletivamente com as moléculas substituídas por carbonila. Em uma outra modali-dade, a cadeia lateral do aminoácido não natural compreende um porção (por exemplo, grupo diamina) que reage seletivamente com a molécula contendo dicar-bonila; em uma outra modalidade, a porção nucleofílica na cadeia lateral do aminoá-cido não natural pode sofrer ataque eletrofílico para gerar uma proteína derivatizada heterocíclica, incluindo uma proteína derivatizada de heterociclo contendo nitrogê-nio. Em um outro aspecto relacionado às modalidades descritas neste parágrafo são os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados que resultam na reação da molécula de derivatização com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Outras modalidades incluem qualquer outra modificação dos polipeptídeos de aminoácido não natural já modificados.
[0345] Em um aspecto são métodos para derivatizar proteínas pela reação de carbonila e reagentes de hidrazina para gerar uma proteína de derivatizada de heterociclo, incluindo uma dolastatina de derivatizada de heterociclo contendo nitro-gênio. Incluído dentro deste aspecto são métodos para a derivatização de derivados de ligante de dolastatina com base na condensação de carbonila e reagentes con- tendo hidrazina para gerar uma dolastatina derivatizada de heterociclo, incluindo um dolastatina derivatizada de heterociclo contendo nitrogênio. Em outras modalidades ou adicionais métodos são para derivatizar derivados de dolastatina contendo cetona ou derivados de dolastatina contendo aldeído com aminoácidos não naturais fun- cionalizados d hidrazina. Em ainda outros aspectos ou adicionais, a molécula substi-tuída por hidrazina pode incluir proteínas, outros polímeros, e moléculas pequenas.
[0346] Em outro aspecto são métodos para a síntese química de moléculas substituídas por hidrazina para a derivatização de derivados de dolastatina substituí-dos por carbonila. Em uma modalidade, a molécula substituída por hidrazina é um derivado ligado a dolastatina adequado para a derivatização de polipeptídeos de aminoácido não natural contendo carbonila, incluindo por meio de exemplo apenas, cetona-, ou aldeído- contendo polipeptídeos de aminoácido não natural.
[0347] Em um aspecto são aminoácidos não naturais para a derivatização química de análogos de dolastatina com base em uma ligação de quinoxalina ou fenazina. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são funcionalizados em suas cadeias laterais tal que sua reação com um ligante de dolastatina de derivatização gera uma ligação de quinoxalina ou fenazina. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são selecionados a partir de aminoácidos tendo cadeias laterais de 1,2-dicarbonila ou 1,2-arildiamina. Em outras modalidades ou adicionais, os aminoácidos não naturais são selecionados a partir de aminoácidos tendo cadeias laterais de 1,2-dicarbonila ou 1,2-arildiamina protegidas ou mascaradas. Também incluído são equivalentes a cadeias laterais de 1,2-dicarbonila, ou equivalentes protegidos ou mascarados a cadeias laterais de 1,2-dicarbonila.
[0348] Em outro aspecto são moléculas de derivatização para a produção de polipeptídeos de aminoácido não natural derivatizados com base em ligações de quinoxalina ou fenazina. Em uma modalidade são derivados de ligante de dolastati-na substituídos por 1,2-dicarbonila usados para derivatizar polipeptídeos de aminoá- cido não natural contendo 1,2-arildiamina para formar ligações de quinoxalina ou fenazina. Em outra modalidade são derivados de ligante de dolastatina substituídos por 1,2-arildiamina usados para derivatizar polipeptídeos de aminoácido não natural contendo 1,2-dicarbonila para formar ligações de quinoxalina ou fenazina. Em um outro aspecto relacionado às modalidades acima são os polipeptídeos de aminoácido não natural modificados que resultam na reação do ligante de dolastatina de deri-vatização com os polipeptídeos de aminoácido não natural. Em uma modalidade são polipeptídeos de aminoácido não natural contendo 1,2-arildiamina derivatizados com derivado de ligante de dolastatina substituído por 1,2-dicarbonila para formar liga-ções de quinoxalina ou fenazina. Em outra modalidade são polipeptídeos de amino-ácido não natural contendo 1,2-dicarbonila derivatizado com derivados de ligante de dolastatina substituídos por 1,2-arildiamina para formar ligações de quinoxalina ou fenazina.
[0349] Fornecido aqui em certas modalidades são moléculas de derivatiza-ção para a produção de compostos tóxicos compreendendo polipeptídeos de amino-ácido não natural com base em ligações de triazol. Em algumas modalidades, a rea-ção entre o primeiro e segundo grupos reativos pode proceder por meio de uma rea-ção de dipolarófilo. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo pode ser uma azida e o segundo grupo reativo pode ser um alquina. Em outras modalidades ou alternativas, o primeiro grupo reativo pode ser uma alquina e o segundo grupo reati-vo pode ser uma azida. Em algumas modalidades, a reação de cicloadição de Huis- gen (veja, por exemplo, Huisgen, em 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176) fornece para a incorporação de aminoácidos não naturalmente codificados suportando cadeias laterais contendo azida e alquina per-mite os polipeptídeos resultantes ser modificados com seletividade extremamente alta. Em certas modalidades, igualmente os grupos funcionais azida e alquina estão inertes para os vinte aminoácidos comuns encontrados em polipeptídeos de ocor rência natural. Quando trouxe em proximidade íntima, entretanto, a natureza "carre-gada elástica" dos grupos azida e alquina é revelada e eles seletivamente reagem e eficazmente por meio de reação de cicloadição de Huisgen [3 2] para gerar o triazol correspondente. Veja, por exemplo, Chin e outro Science 301 :964-7 (2003); Wang e outro, J. Am. Chem. Soc, 125, 3192-3193 (2003); Chin e outro, J. Am. Chem. Soc, 124:9026-9027 (2002). Reação de cicloadição envolvendo polipeptídeos contendo azida ou alquina pode ser realizada em temperatura ambiente sob condições aquo-sas pela adição de Cu(II) (por exemplo, na forma de uma quantidade catalítica de CUSO4) na presença de um agente de redução para reduzir Cu(II) a Cu(I), in situ, em quantidade catalítica. Veja, por exemplo, Wang e outro, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe e outro, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599 (2002). Agentes de redução preferidos incluem ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2, Co2, e um potencial elétrico aplicado.
[0350] Tais derivados de dolastatina ligados a heteroarila de aminoácido não natural incluem aminoácidos tendo a estrutura da Fórmula (XXXI):
Figure img0096
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0097
R5 é H, CO2H, C1-C6alquila, ou tiazol; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo proteção éster, resina, pelo menos um aminoácido, poli- peptídeo, ou polinucleotídeo; R4 é H, halogênio, alquila inferior, ou alquila inferior substituída; R7 é C1-C6alquila ou hidrogênio; L é -alquileno- ou-(alquileno-O)n-alquileno-; n é um número inteiro maior do que ou igual a um; D tem a estrutura de:
Figure img0098
cada Ri7 é independentemente selecionado a partir do g.upo consistindo em H, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alquilalcóxi, alquilalcóxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, - (alquileno ou alquileno substituído)-ON(R")2, -(alquileno ou alquileno substituído)- C(O)SR", -(alquileno ou alquileno substituído)-S-S-(arila ou arila substituída), - C(O)R", -C(O)2R", ou -C(O)N(R")2, em que cada R" é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, arila, arila substituída, heteroarila, alcarila, alcarila substituída, aralquila, ou aralquila substituída; cada ZI é uma ligação, CR17R17, O, S, NR’, CR17R17-CR17R17, CR17R17-O, O- CRl7Rl7, CR17R17-S, S-CR17R17, CR17R17-NR’, ou NR-CR17R17; cada R' é H, alquila, ou alquila substituída; cada Z2 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação, -C(O)-, -C(S)-, C1-C3 alquileno opcionalmente substituído, C1-C3 alquenileno opcionalmente substituído, e heteroalquila opcionalmente substituída; cada Z3 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação, C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alquenileno opcio-nalmente substituído, heteroalquila opcionalmente substituída, -O-, -S-, -C(O)-, - C(S)-, e -N(R')-; cada T3 é uma ligação, C(R")(R"), O, ou S; com a condição que quando T3 for O ou S, R" não pode ser halogênio; cada R” é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila, ou cicloalquila substituída;
Figure img0099
ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo hete
Figure img0100
onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo heterociclo;
Figure img0101
onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação a posições respectivas dentro do grupo heterociclo; cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em C1-C6 alquila, C1-C6 alcóxi, éster, éter, tioéter, aminoalquila, halogênio, éster alquílico, éster arílico, amida, aril amida, haleto de alquila, alquil amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, éster sulfonílico, halossulfonila, nitrila, alquil nitrila, e nitro; q é 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e cada R16 é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, halogênio, alquila, NO2, CN, e alquila substituída.
[0351] Em algumas modalidades, o composto da Fórmula (XXXI) inclui compostos tendo a estrutura da Fórmula (XXXI-A)
Figure img0102
[0352] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R5 é tiazol ou ácido carboxílico. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R6 é H. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), Ar é fenila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R7 é metila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), n é um número inteiro de 0 a 20. Em certas moda-lidades de compostos da Fórmula (XXXI), n é um número inteiro de 0 a 10. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), n é um número inteiro de 0 a 5.
[0353] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R5 é tiazol ou ácido carboxílico. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R5 é hidrogênio. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R5 é metila, etila, propila, iso-propila, butila, iso-butila, sec-butila, terc-butila, pentila, ou hexila.
[0354] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R6 é H. Em algumas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R6 é hidróxi.
[0355] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), Ar é fenila.
[0356] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R7 é metila, etila, propila, iso- propila, butila, sec-butil iso-butila, terc-butila, pentila, ou hexila. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R7 é hidrogênio.
[0357] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), cada alquileno é independentemente -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-, ou - CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), alquileno é metileno, etileno, propileno, butilenos, pentileno, hexi- leno, ou heptileno.
[0358] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), n é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100.
[0359] Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), RI é um polipeptídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), R2 é um po-lipeptídeo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), o polipeptídeo é um anticorpo. Em certas modalidades de compostos da Fórmula (XXXI), o anticor po é herceptina.
[0360] A formação de tais derivados de dolastatina ligados a heterociclo de aminoácido não natural tendo a estrutura da Fórmula (XXXI) inclui, porém não é limi-tada a, (i) reações de aminoácidos não naturais contendo diamina com derivados de ligados a dolastatina contendo dicarbonila ou reações de aminoácidos não naturais contendo diamina com derivados ligados a dolastatina contendo cetoalquina, (ii) rea-ções de aminoácidos não naturais contendo dicarbonila com derivados ligados a do-lastatina contendo diamina ou reações de aminoácidos não naturais contendo dicar-bonila com derivados ligados a dolastatina contendo cetoamina, (iii) reações de ami-noácidos não naturais contendo cetoalquina com derivados ligados a dolastatina contendo diamina, ou (iv) reações de aminoácidos não naturais contendo cetoamina com v contendo dicarbonila.
[0361] Modificação de derivados ligados a dolastatina descritos aqui com tais reações têm qualquer ou todas as seguintes vantagens. Primeiro, diaminas sofrem condensação com compostos contendo dicarbonila em uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8 (e em outras modalidades em uma faixa de pH de cerca de 4 a cerca de 10, em outras modalidades em uma faixa de pH de cerca de 3 a cerca de 8, em outras modalidades em uma faixa de pH de cerca de 4 a cerca de 9, e em outras modalidades uma faixa de pH de cerca de 4 a cerca de 9, em outras modalidades um pH de cerca de 4, e em ainda outra modalidade um pH de cerca de 8) para gerar heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligações. Sob estas condições, as cadeias laterais dos aminoácidos de ocorrência natural são não reativas. Segundo, tal química seletiva torna possível a derivatização sítio-específica de proteínas recombinantes: proteínas derivatizadas podem agora ser preparadas como produtos homogêneos definidos. Terceiro, as condições moderadas necessitam efetuar a reação das diaminas descrita aqui com os polipeptídeos contendo dicarbonila descritos aqui geralmente não irreversivel- mete destroem a estrutura terciária do polipeptídeo (excluindo, claro que, onde o propó sito da reação é destruir tal estrutura terciária). Quarto, a reação ocorre rapidamente em temperatura ambiente que permite o uso de muitos tipos de polipeptídeos ou reagentes que seriam instáveis em temperaturas mais altas. Quinto, a reação facilmente ocorre é condições aquosas, permitindo uso de polipeptídeos e reagentes novamente incompatíveis (em qualquer extensão) com soluções não aquosas. Seis, a reação ocorre facilmente ainda quando a relação de polipeptídeo ou aminoácido para reagente for estequiométrica, próxima estequiométrica, ou semelhante a estequiométrica, de forma que é desnecessário adicionar reagente em excesso ou polipeptídeo para obter uma quantidade útil de produto de reação. Sétimo, o heterociclo resultante pode ser produzido re- gioseletivamente e/ou regioespecificamente, dependendo do desígnio das porções de diamina e dicarbonila dos reagentes. Finalmente, a condensação de diaminas com moléculas contendo dicarbonila gera heterociclo, incluindo um heterociclo contendo nitrogênio, ligações que são estáveis sob condições biológicas.
[0362] VI. Local de aminoácidos não naturais em derivados de ligante de do-lastatina
[0363] Os métodos e composições descritas aqui incluem incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais em um derivados de ligante de dolastatina. Um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados a uma ou mais posi-ções particulares que não rompem atividade dos derivados de ligante de dolastatina. Isto pode ser obtido fazendo-se substituições "conservadoras", incluindo porém não limitado a, substituir aminoácidos hidrofóbicos com aminoácidos hidrofóbicos não naturais ou naturais, aminoácidos volumosos com aminoácidos volumosos não naturais ou naturais, aminoácidos hidrofílicos com aminoácidos hidrofílicos não naturais ou naturais) e/ou inserindo o aminoácido não natural em um local que não é requerido para atividade.
[0364] Uma variedade de abordagens bioquímicas e estruturais pode ser empregada para selecionar os sítios desejados para substituição com um aminoáci- do não natural dentro do derivados de ligante de dolastatina. Em algumas modalida-des, o aminoácido não natural é ligado ao terminal C do derivado de dolastatina. Em outras modalidades, o aminoácido não natural é ligado ao terminal N do derivado de dolastatina. Qualquer posição do derivado de ligante de dolastatina é adequada para seleção para incorporar um aminoácido não natural, e seleção pode estar com base em desígnio racional ou por seleção aleatória para qualquer ou nenhum propósito particular desejado. Seleção de sítios desejados pode estar com base em produzir um polipeptídeo de aminoácido não natural (que pode ser também modificado ou permanecer não modificado) tendo qualquer propriedade ou atividade desejada, in-cluindo porém não limitado a um moduladores de ligação de receptor, moduladores de atividade de receptor, moduladores de ligação a padrões de aglutinante, modula-dores de atividade de padrão de ligação, moduladores de conformação de padrão de ligação, formação de dímero ou multímero, nenhuma mudança a atividade ou pro-priedade comparada à molécula nativa, ou manipulando qualquer propriedade física ou química do polipeptídeo tal como solubilidade, agregação, ou estabilidade. Alter-nativamente, os sítios identificados como críticos a atividade biológica podem da mesma forma ser bons candidatos para substituição com um aminoácido não natu-ral, novamente dependendo da atividade desejada buscada para o polipeptídeo. Ou-tra alternativa seria simplesmente fazer substituições seriais em cada posição na cadeia de polipeptídeo com um aminoácido não natural e observar o efeito nas ativi-dades do polipeptídeo. Qualquer meio, técnica, ou método para selecionar uma po-sição para substituição com um aminoácido não natural em qualquer polipeptídeo é adequado para uso nos métodos, técnicas e composições descritas aqui.
[0365] A estrutura e atividade de mutantes de ocorrência natural de um poli-peptídeo que contém deleções podem da mesma forma ser examinada para deter-minar regiões da proteína que são prováveis ser tolerantes de substituição com um aminoácido não natural. Uma vez que resíduos são prováveis ser intolerantes a substituição com aminoácidos não naturais foram eliminados, o impacto de substitui-ções propostas a cada uma das posições restantes pode ser examinado usando mé-todos incluindo, porém não limitados a, a estrutura tridimensional do polipeptídeo relevante, e quaisquer ligantes associados ou proteínas de ligação. Estruturas crista- lográficas de Raios X e de NMR de muitos polipeptídeos estão disponíveis no Banco de Dados de Proteína (PDB, www.rcsb.org), um banco de dados centralizado con-tendo dados estruturais tridimensionais de moléculas grandes de proteínas e ácidos nucléicos, alguém pode ser usado para identificar posições de aminoácido que po-dem ser substituídas com aminoácidos não naturais. Além disso, modelos podem ser feitos investigando a estrutura secundária e terciária de polipeptídeos, se dados estruturais tridimensionais não estão disponíveis. Desse modo, a identidade de posi-ções de aminoácido que podem ser substituídos com aminoácidos não naturais pode ser facilmente obtida.
[0366] Sítios exemplares de incorporação de um aminoácido não natural in-cluem, porém não são limitados, aqueles que são excluídos das regiões de ligação de receptor potencial, ou regiões para ligação a proteínas de ligação ou ligantes po-dem ser completamente ou parcialmente expostos a solvente, tem mínima ou ne-nhuma interações de ligação de hidrogênio com resíduos próximos, pode ser mini-mamente expostos a resíduos reativos próximos, e/ou podem estar em regiões que são altamente flexíveis como predito pela estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo particular com seu receptor associado, ligante ou proteínas de ligação.
[0367] Uma ampla variedade de aminoácidos não naturais pode ser substitu-ída para, ou incorporada em, uma posição determinada em um polipeptídeo. Por meio de exemplo, um aminoácido não natural particular pode ser selecionado para incorporação com base em um exame da estrutura cristalina tridimensional de um polipeptídeo com seu ligante associado, receptor e/ou proteínas de ligação, uma preferência para substituições conservadoras.
[0368] Em uma modalidade, os métodos descritos aqui incluem incorporação no derivado de ligante de dolastatina, onde o derivados de ligante de dolastatina compreende um primeiro grupo reativo; e contatar o derivado de ligante de dolastati-na com uma molécula (incluindo porém não limitado a uma segunda proteína ou po-lipeptídeo ou análogo de polipeptídeo; um anticorpo ou fragmento de anticorpo; e qualquer combinação dos mesmos) que compreende um segundo grupo reativo. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é uma porção de hidroxilamina e o se-gundo grupo reativo é um carbonila ou porção de dicarbonila, por meio de que uma ligação de oxima é formada. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é uma porção de carbonila ou dicarbonila e o segundo grupo reativo é um porção de hidro-xilamina, por meio de que uma ligação de oxima é formado. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é uma porção de carbonila ou dicarbonila e o segundo grupo reativo é um porção de oxima, por meio de que uma reação de troca de oxima ocorre. Em certas modalidades, o primeiro grupo reativo é um porção de oxima e o segundo grupo reativo é porção de carbonila ou dicarbonila, por meio de que uma reação de troca de oxima ocorre.
[0369] Em alguns casos, a(s) incorporação(ões) de derivado de ligante de dolastatina será combinado com outras adições, substituições, ou deleções dentro do polipeptídeo para afetar outras características químicas, físicas, farmacológicas e/ou biológicas. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo porém não limitado a, resistência para de-gradação proteolítica) do polipeptídeo ou aumentar afinidade do polipeptídeo para seu receptor apropriado, ligante e/ou proteínas de ligação. Em alguns casos, as ou-tras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo porém não limitado a, quando expressado em E. coli ou outras células hospedeiras) do polipeptídeo. Em alguns sítios de modalidades são selecionados para substituição com um aminoácido naturalmente codificado ou não natural além de outro sítio para incorporação de um aminoácido não natural para o propósito de aumentar a solubilidade de polipeptídeo seguindo expressão em E. coli. ou outras células hos-pedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os polipeptídeos compreendem outra adição, substituição, ou deleção que modulam afinidade ao ligante associado, proteínas de ligação, e/ou receptor, modulam (incluindo porém não limitado a, au-mentos ou diminuições) dimerização de receptor, estabiliza dímeros de receptor, modulam meia-vida circulante, modula liberação ou biodisponibilidade, facilita purifi-cação, ou melhora ou altera uma rotina particular de administração. Similarmente, o polipeptídeo de aminoácido não natural pode compreender química ou sequência de clivagem de enzima, sequência de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação de anticorpo (incluindo porém não limitado a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências com base em afinidade (incluindo porém não limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas de ligação (incluindo porém não limitado a, biotina) que me-lhora detecção (incluindo porém não limitado a, GFP), purificação, tecidos de thru de transporte ou membranas celulares, liberação ou ativação de profármaco, redução de tamanho, ou outras características do polipeptídeo.
[0370] VII. Gene HER2 como Exemplar
[0371] Os métodos, composições, estratégias e técnicas descritos aqui não são limitados a um tipo particular, classe ou família de polipeptídeos ou proteínas. Realmente, virtualmente quaisquer polipeptídeos podem ser designados ou modifi-cados para incluir pelo menos um aminoácido não natural "modificado ou não modi-ficado" contendo derivados de ligante de dolastatina descritos aqui. Por meio de exemplo apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica se-lecionada a partir do grupo consistindo em: alfa- 1 antitripsina, angiostatina, fator anti-hemolítico, anticorpo, fragmento de anticorpo, anticorpo monoclonal (por exem-plo, bevacizumabe, cetuximabe, panitumabe, infliximabe, adalimumabe, basilixima- be, daclizumabe, omalizumabe, ustekinumabe, etanercept, gemtuzumabe, alem- tuzumabe, rituximabe, trastuzumabe, nimotuzumabe, palivizumabe, e abciximabe), apolipoproteína, apoproteína, factor natriurético atrial, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C-X-C quimiocina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP- 10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, ligante c-kit, citocina, CC quimiocina, monócito quimioatraente proteína-1, monócito quimioatraente proteína-2, mo- nócito quimioatraente proteína-3, monócito inflamatório proteína-1 alfa, monócito inflamatório proteína-i beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 ligante, c-kit ligante, colágeno, fator estimulador de colônias (CSF), fator de complemento 5a, inibidor de complemento, receptor de complemento 1, citocina, peptídeo-78 de ativação de neutrófilo epitelial, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epidérmico (EGF), peptídeo de ativação de neutrófilo epitelial, eritropoietina (EPO), toxina de exfoliação, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteí-na de feixe quatro helicoidal, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidase, gonado- tropina, fator de crescimento, receptor de fator de crescimento, grf, proteína hed-gehog, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio de crescimento humano (hGH), albumina de soro humano, ICAM-1, ICAM-1 receptor, LFA-1, LFA-1 receptor, insulina, fator de crescimento semelhante a insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, interleucina (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de ceratinócito (KGF), lactoferrina, fator inibitório de leucemia, luciferase, neurturi- na, fator inibitório de neutrófilo (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, oncogene produto, paracitonina, hormônio paratiróide, PD-ECSF, PDGF, hormônio de peptídeo, pleiotropina, protein A, proteina G, pth, exotoxina pirogênica A, exotoxina piro- gênica B, exotoxin pirogênica C, pyy, relaxina, renina, SCF, proteína biossintética pequena, receptor de complemento solúvel I, I-CAM 1 solúvel, receptor de interleucina solúvel, receptor de TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptocinase, superantígenos, enterotoxina staphylococcal, SEA, SEB, SECi, SEC2, SEC3, SED, SEE, receptor de hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina de síndrome de choque tóxico, timosina alfa 1 , ativador de plasminogênio de tecido, fator de crescimento de tumor (TGF), fator de necrose de tumor, factor alfa de necrose de tumor, factor beta de necrose de tumor, recptor de fator de necrose de tumor (TNFR), VLA-4 proteína, VCAM-1 proteína, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), urocinase, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, re-ceptor de estrogênio, receptor de progesterona, receptor de testosterona, receptor de aldosterona, receptor de LDL, e corticosterona.
[0372] Em uma modalidade é um método para tratar tumor sólido que supe- rexpressa HER-2 selecionado a partir do grupo consistindo em câncer de mama, carcinoma pulmonar de célula pequena, câncer ovariano, câncer prostático, carci-noma gástrico, câncer cervical, carcinoma esofagiano, e câncer de cólon. Em outra modalidade, o tumor sólido é câncer de mama. Em uma outra modalidade o tumor sólido é cancer ovariano.
[0373] Desse modo, a seguinte descrição de trastuzumabe é fornecida para propósitos ilustrativos e por meio de exemplo apenas, e não como um limite no es-copo dos métodos, composições, estratégias e técnicas descritas aqui. Além disso, referência a trastuzumabe neste pedido é pretendido usar o termo genérico como um exemplo de qualquer anticorpo. Desse modo, é entendido que as modificações e químicas descritas aqui com referência a trastuzumabe pode ser igualmente aplicada a qualquer anticorpo ou anticorpo monoclonal, incluindo aqueles especificamente listados aqui.
[0374] Trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado que liga-se ao domínio IV do segmento extracelular do receptor de HER2/neu. O gene HER2 (da mesma forma conhecido como HER2/neu e gene ErbB2) é ampliado em 20-30% de cânceres de mama de fase precoce, que torna superexpresso. Da mesma forma, em câncer, HER2 pode enviar sinais sem mitógenos chegar e ligar a qualquer receptor, tornando super-ativo.
[0375] HER2 estende-se através da membrana celular, e transporta sinais de fora da célula para o interior. Em pessoas saudáveis, compostos de sinalização chamados mitógenos chegam à membrana celular, e liga-se à parte externa de ou-tros membros da família de HER de receptores. Esses receptores de ligação em se-guida ligam-se (dimeriza) com HER2, ativando isto. HER2 em seguida envia um sinal para o dentro da célula. As passagens de sinal passam através de séries de reação bioquímicas diferentes. Isto inclui a série de reação de PI3K/Akt e a série de reação de MAPK. Estes sinais promovem invasão, sobrevivência e crescimento de vasos sanguíneos (angiogênese) de células.
[0376] Células tratadas com trastuzumabe sofrem controle durante a fase de G1 do ciclo celular desse modo há proliferação reduzida. Foi sugerido que trastuzu-mabe induza algum de seu efeito por sub-regulação de HER2/neu levando a rompi-mento de dimerização de receptor e sinalização através da cascata de PI3K a jusan-te. P27Kip1 é em seguida não fosforilado e pode entrar no núcleo e inibir atividade de cdk2, causando controle de ciclo celular. Da mesma forma, trastuzumabe suprime angiogênese igualmente por indução de fatores antiangiogênicos e repressão de fatores proangiogênicos. Acredita-se que uma contribuição ao crescimento não regu-lado observado em câncer pode ser devido a clivagem proteolítica de HER2/neu que resulta na liberação do domínio extracelular. Trastuzumabe foi mostrada inibir cliva-gem de ectodomaina de HER2/neu em células de câncer de mama.
[0377] VIII. Captação celular de aminoácidos não naturais
[0378] Captação de aminoácido não natural por uma célula eucariótica é um assunto que é tipicamente considerado quando projetando e selecionando aminoá-cidos não naturais, incluindo porém não limitado a, para incorporação em uma prote-ína. Por exemplo, a densidade de carga alta de a-aminoácidos sugere que estes compostos sejam improváveis de ser permeável em célula. Aminoácidos naturais são empregados na célula eucariótica por meio de uma coleção de sistemas de transporte com base em proteína. Uma avaliação rápida pode ser feita que avalia quais aminoácidos não naturais, se qualquer, são empregados por células (exem-plos 15 & 16 ilustram exemplos não limitantes de testes que podem ser feitos em aminoácidos não naturais). Veja, por exemplo, os ensaios de toxicidade em, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2004/198637 entitulada “Protein Arrays", que está incorporada aqui por referência em sua totalidade, e Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of na organism with an expanded genetic code. PNAS Estados Unidos 96:4780-4785. Embora captação seja facilmente anali-sada com vários ensaios, uma alternativa para designar aminoácidos não naturais que são amenos a séries de reação de captação celular é fornecer séries de reação biossintéticas para criar aminoácidos in vivo.
[0379] Tipicamente, o aminoácido não natural produzido por meio de captação celular como descrito aqui é produzido em uma concentração suficiente para biossínte- se de proteína eficiente, incluindo porém não limitado a, uma quantidade celular natural, porém não para um tal grau como para afetar a concentração dos outros aminoácidos ou exaurir recursos celulares. Concentrações típicas produzidas desta maneira são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mM.
[0380] IX. Biossíntese de Aminoácidos Não Naturais
[0381] Muitas séries de reação biossintéticas já existem em células para a produção de aminoácidos e outros compostos. Enquanto um método biossintético para um aminoácido não natural particular pode não existir na natureza, incluindo porém não limitado a, em uma célula, os métodos e composições descritas aqui for-necem tais métodos. Por exemplo, séries de reação biossintéticas para aminoácidos não naturais podem ser gerados em célula hospedeira adicionando novas enzimas ou modificando séries de reação de célula hospedeira existentes. Novas enzimas adicionais incluem enzimas de ocorrência natural ou enzimas artificialmente evoluí-das. Por exemplo, a biossíntese de p - aminofenilalanina (como apresenteado em um exemplo em WO 2002/085923 intitulado "incorporação in vivo de aminoácidos não naturais") confia na adição de uma combinação de enzimas conhecidas a partir de outros organismos. Os genes para estas enzimas podem ser introduzidos em uma célula eucariótica transformando a célula com um plasmídeo compreendendo os ge-nes. Os genes, quando expressos na célula, fornecem uma série de reação enzimá- tica para sintetizar o composto desejado. Exemplos dos tipos de enzimas que são opcionalmente adicionados são fornecidos aqui. Sequências de enzimas adicionais são encontradas por exemplo, em Genbank. Enzimas artificialmente evoluídas po-dem ser adicionadas em uma célula da mesma maneira. Desta maneira, a maquina-ria celular e recursos de uma célula são manipulados para produzir aminoácidos não naturais.
[0382] Uma variedade de métodos está disponível para produzir novas en-zimas para uso em séries de reação biossintéticas ou para evolução de séries de reação existentes. Por exemplo, recombinação recursiva, incluindo porém não limi-tado a, como desenvolvido por Maxygen, Inc., (disponível no web site mundial em www.maxygen.com), pode ser usado para desenvolver novas enzimas e séries de reação. Veja, por exemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; e, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 91 :10747-10751. Similarly DesignPath™, desenvolvida por Genencor (disponível no web site mundial em genencor.com) é opcionalmente usa-do para criar série de reação metabólica, incluindo porém não limitado a, criar uma série de reação para criar um aminoácido não natural em uma célula. Esta tecnologia reconstrói séries de reação existentes em organismos hospedeiros usando uma combinação de novos genes, incluindo porém não limitado aqueles identificados por evolução genômica funcionais, molecular e desígnio. Diversa Corporation (disponível no web site mundial em diversa.com) da mesma forma fornece tecnologia para rapidamente avaliar bibliotecas de genes e séries de reação de gene, incluindo porém não limitado a, criar novas séries de reação para biossinteticamente produzir aminoácidos não naturais.
[0383] Tipicamente, o aminoácido não natural produzido com uma série de reação biossintética criada como descrito aqui é produzido em uma concentração suficiente para biossíntese de proteína eficiente, incluindo porém não limitado a, uma quantidade celular natural, porém não a um tal grau como para afetar a concen-tração dos outros aminoácidos ou recursos celulares exauridos. Concentrações típi-cas produzidas in vivo desta maneira são cerca de 10 mM a cerca de 0,05 mm. Uma vez que uma célula é transformada com um plasmídeo compreendendo os genes usados para produzir enzimas desejadas para uma série de reação específica e um aminoácido não natural é gerado, seleções in vivo são opcionalmente usadas para também aperfeiçoar a produção do aminoácido não natural para síntese de proteína ribossômica e crescimento celular.
[0384] X. Metodologia Sintética Adicional
[0385] Os aminoácidos não naturais descritos aqui podem ser sintetizados usando metodologias descritas na técnica ou usando as técnicas descritas aqui ou por uma combinação das mesmas. Como uma ajuda, a seguinte tabela fornece vário eletrófilos e nucleófilos de partida que podem ser combinados para criar um grupo funcional desejado. A informação fornecida é pretendida ser ilustrativa e não limitan-te às técnicas sintéticas descritas aqui. Tabela 1: Exemplos de Ligações Covalentes e Precursores dos mesmos
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[0386] Em geral, eletrófilos de carbono são suscetíveis ataque por nucleófi- los complementares, incluindo nucleófilos de carbono, em que um nucleófilo de ata-que traz um par de elétron ao eletrófilo de carbono para formar uma nova ligação entre o nucleófilo e o eletrófilo de carbono.
[0387] Exemplos não limitantes de nucleófilos de carbono incluem, porém não são limitados a alquila, alquenila, arila e alquinila Grignard, reagentes de orga- nolítio, organozinco, alquil-, alquenil, aril- e alquinil-estanho (organoestananos), rea-gentes de alquil-, alquenil-, aril- e alquinil-borano (organoboranos e organoborona- tos); estes nucleófilos de carbono têm a vantagem de ser cineticamente estáveis em água ou solventes orgânicos polares. Outros exemplos não limitantes de nucleófilos de carbono incluem ilidos de fósforo, enol e reagentes de enolato; estes nucleófilos de carbono têm a vantagem de ser relativamente fáceis de gerar a partir de precur-sores bem conhecidos aqueles versados na técnica de química orgânica sintética. Nucleófilos de carbono, quando usados juntos com eletrófilos de carbono, geram novas ligações carbono-carbono entre o nucleófilo de carbono e eletrófilo de carbo-no.
[0388] Exemplos não limitantes de nucleófilos de não carbono adequados para acoplamento a eletrófilos de carbono incluem porém não são limitados a aminas primárias e secundárias, tióis, tiolatos, e tioéters, álcoois, alcóxidos, azidas, se- micarbazidas, e similar. Estes nucleófilos de não carbono, quando usados juntamen-te com eletrófilos de carbono, tipicamente geram ligações de heteroátomo (C-X-C), em que X é um hetereoátomo, incluindo, porém não limitado a, oxigênio, enxofre, ou nitrogênio.
[0389] EXEMPLOS
[0390] Exemplo 1: Síntese de Composto 1 Esquema 1
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Composto 1-3: Tetra(etileno glicol) 1-1 (10g, 51,5mmol), N-hidroxiftalimida 1-2 (8,4g, 51,15mmol) e trifenilfosfina (17,6g, 67mmol) foram dissolvidos em 300 mL de te- traidrofurano seguidos por adição de DIAD (12,8 mL, 61,78 mmols) a 0°C. A solução resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, e em seguida concentrada até a secura. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash para produzir 5,47g (31%) de composto 1-3. Composto 1-4: Em uma solução do composto 1-3 (200 mg, 0,59 mmol) em 15mL de diclorometano foi adicionado Dess-Martin Periodinano (300mg, 0.71 mmol). A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A reação foi extinguida com a solução de bissulfito de sódio em 15 mL de bicarbonato de sódio saturado. A mistura foi separada. A camada orgânica foi lavada com bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash para produzir 150mg(75%) de composto 1-4. Composto 1-6: Em uma solução de sal de cloridrato de monometiladolastatina 15 (50mg, 0,062 mmol) em 1mL de DMF foi adicionado composto 1-4 (63 mg, 0,186 mmol) e 70 μL de ácido acético, seguido por adição de 8 mg de cianoboroidreto de sódio. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional foi diluída com água e purificada por HPLC para produzir 60 mg (80%) de composto 1-6. MS (ESI) m/z 547 [M+2H], 1092 [M+H]. 1d. Composto 1: Composto 1-6 (60 mg, 0,05 mmol) foi dissolvido em 1 mL de DMF. 32 μL de hidrazina foi adicionado. A solução resultante foi agitada em tempe-ratura ambiente durante 1 hora. A reação foi extinguida com 1N de solução de clori-drato. A mistura reacional foi purificada por HPLC para produzir 33 mg (55%) de composto 1. MS (ESI) m/z 482 [M+2H], 962 [M+H]. Exemplo 2: Síntese de Composto 2 Esquema 2
Figure img0107
Composto 2 foi sintetizado por meio de uma rotina sintética similar como descrito no Exemplo 1. MS (ESI) m/z 460 [M+2H], 918 [M+H].
[0391] Exemplo 3: Síntese de Composto 3
[0392] Esquema 3
Figure img0108
[0393] Composto 3 foi sintetizado por meio de rotina sintética similar ao Exemplo 1. MS (ESI) m/z 438 [M+2H], 974 [M+H].
[0394] Exemplo 4: Síntese de Composto 4
[0395] Composto 4-2: Em uma solução de Val (OtBu)-OH.HCl 4-1 (1 g, 4,77 mmols) e bromoetanol (304,7 μL, 4,3 mmol) em 10 mL de DMF foi adicionado 1,68 ml de DIEA. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 dias. 4,8 mmol de Boc2O foi adicionado à mistura reacional, seguido por 0,84 mL de DIEA. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 dias. A mistura reacional foi concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila, e lavada com água, salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vacuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash para produzir 0,66 g de composto 4-2.
[0396] Esquema 4
Figure img0109
[0397] Composto 4-3: Em uma solução do composto 4-2 (500 mg, 1,58 mmol), N-hidroxiftalimida (261 mg, 1,6 mmol) e trifenilfosfina (538 mg, 2,05 mmol) em 15 mL de THF foi adicionado DIAD (394 μL, 1,9 mmol) a 0°C. A solução resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite, e em seguida concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna flash para produzir 0,68 g de composto 4-3.
[0398] Composto 4-4: Composto 4-3 foi dissolvido em 15 mL de 4N HCl/Dioxano. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 dias e concentrada em vácuo. O resíduo foi dissolvido em DMF e tratado com Boc2O (230 μL, 1 mmol) e DIEA (352 μL, 2 mmol). A mistura reacional foi agitada em tem-peratura ambiente durante 2 dias. A mistura reacional foi purificada por HPLC para produzir 100 mg de composto 4-4.
[0399] Composto 4-5: Em uma solução de composto Boc-Val-Dil-metilDap-OH em DMF é adicionado phe(OtBu)-OH.HCl, HATU e N-metilamorfolina. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reacional é concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica é combinada e lavou com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vacuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash. O composto resultante é tratado com HCl/EtOAC para produzir composto 4-5.
[0400] Composto 4-6: Em uma solução de composto 4-5 em DMF é adicionado composto 4-4, HATU e DIEA. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reacional é concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica é combinada e lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash para produzir composto 4-6.
[0401] Composto 4-7: Composto 4-6 é dissolvido em 15 mL de 4N HCl/Dioxano. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 2 ho-ras e concentrada em vácuo para produzir composto 4-7.
[0402] Composto 4-8: A uma solução de composto 4-7 em 1 mL de DMF é adicionado formilaldeído e ácido acético, seguido por adição de cianoboroidreto de sódio. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional é diluída com água e purificada por HPLC para produzir composto 4-8.
[0403] Composto 4: Composto 4-8 é dissolvido em 1 mL de DMF. Hidrazina é adicionada. A solução resultante é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação é extinguida com 1N de solução de cloridrato. A mistura reacional é purificada por HPLC para produzir Composto 4.
[0404] Exemplo 5: Síntese de Composto 5
[0405] Composto 4-7 é dissolvido em 1 mL de DMF. Hidrazina é adicionada. A solução resultante é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação é extinguida com 1N de solução de cloridrato. A mistura reacional é purificada por HPLC para produzir Composto 5.
[0406] Exemplo 6: Síntese de Composto 6
[0407] Esquema 6
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[0408] Composto 6-2: Em uma solução do composto 6-1 (500 mg, 0,875 mmol) em 3 mL de DMF foi adicionado 283 mg de cloridrato de fenilalanina, 433mg de HATU e 581 μL de N-metilamorfolina. A mistura reacional foi agitada em tempera-tura ambiente durante 4 horas. A mistura reacional foi concentrada em vácuo e ex-traída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica foi combinada e lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vácuo. O re-síduo foi purificado por cromatografia flash para produzir 560 mg (76%) do composto 6-2.
[0409] Composto 6-3: Composto 6-2 foi dissolvido em 15 mL de 4N HCl/Dioxano. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas e concentrada em vácuo para produzir 511 mg do composto 6-3.
[0410] Composto 6-4: Em iuma solução do composto 6-3 (368 mg, 0,55 mmol) em 3 mL de DMF foi adicionado 255 mg de Boc-N-metil valina, 314mg de HATU e 303 μL de N-metilamorfolina. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reacional foi concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica foi combinada e la-vada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash para produzir 370 mg (79%) de composto 6-4.
[0411] Composto 6-5: Em uma solução do composto 6-4 (170mg) em 10 mL de MeOH foi adicionado 5eq of 1N de LiOH. A mistura reacional foi agitada em tem-peratura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional foi acidificada por 1NHCl e extraída com acetato de etila lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vácuo para produzir 150 mg (90%) de composto 6-5.
[0412] Composto 6-6: Composto 6-5 foi dissolvido em 4N de HCl/Dioxana. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas e concentra-da em vácuo e purificada por HPLC para produzir 150mg de composto 6-6.
[0413] Composto 6-7: Em uma solução do composto 6-6 (50 mg, 0,062 mmol) em 1mL de DMF foi adicionado composto 1-4 (63 mg, 0,186 mmol) e 70 μL de ácido acético, seguido por adição de 8 mg de cianoboroidreto de sódio. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional foi diluída com água e purificada por HPLC para produzir 60 mg (80%) de composto 6-7.
[0414] Composto 6: Composto 6-7 (60 mg, 0,05 mmol) foi dissolvido em 1 mL de DMF. 32 μL de hidrazina foi adicionado. A solução resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação foi extinguida com 1N de solução de cloridrato. A mistura reacional foi purificada por HPLC para produzir 33 mg (55%) do Composto 6.
[0415] Exemplo 7: Síntese de Composto 7
[0416] Esquema 7
Figure img0111
[0417] Composto 7 foi sintetizado por rotina sintética similar ao Composto 1. MS (ESI) m/z 440 [M+2H], 879 [M+H].
[0418] Exemplo 8: Síntese de Composto 8
[0419] Esquema 8
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[0420] Composto 8 foi sintetizado por rotina sintética similar ao Composto 1. MS (ESI) m/z 41 S [M+2H], 835 [M+H].
[0421] Exemplo 9: Síntese do Composto 9
[0422] Esquema 9
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[0423] Composto 9-1: Em uma solução do composto Boc-Val-Dil-metilDap- OH em DMF é adicionado 4-(2-Aminoetil) piridina, HATU e N-metilamorfolina. A mis-tura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reaci-onal é concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica é combinada e lavada com salmoura, secada em sulfato de só-dio e concentrada em vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash. O com-posto resultante é tratado com HCl/EtOAC para produzir composto 9-1.
[0424] Composto 9-2: Em uma solução do composto 9-1 em DMF é adicio-nado composto 4-4, HATU e DIEA. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura reacional é concentrada em vácuo e extraída com acetato de etila (100 mLXl, 50 mL X2). A camada orgânica é combinada e lavada com salmoura, secada em sulfato de sódio e concentrada em vacuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash para produzir composto 9-2.
[0425] Composto 9-3: Composto 9-2 é dissolvido em 15 mL de 4N HCl/Dioxana. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 2 ho-ras e concentrada em vácuo para produzir composto 9-3.
[0426] Composto 9-4: Em uma solução do composto 9-3 em 1mL de DMF é adicionado formilaldeído e ácido acético, seguido por adição de cianoboroidreto de sódio. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reacional é diluída com água e purificada por HPLC para produzir composto 9-4.
[0427] Composto 9: Composto 9-4 é dissolvido em 1 mL de DMF. Hidrazina é adicionada. A solução resultante é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação é extinguida com 1N solução de cloridrato. A mistura reacional é purificada por HPLC para produzir composto 9.
[0428] Exemplo 10: Síntese do Composto 10
[0429] Esquema 10
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[0430] Composto 10: Composto 9-3 é dissolvido em 1 mL de DMF. Hidrazina é adicionada. A solução resultante é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação é extinguida com 1N solução de cloridrato. A mistura reacional é puri-ficada por HPLC para produzir Exemplo 10. Tabela 1. Estruturas de Compostos 1-10
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[0431] Exemplo 11: Análise de ligação de HER-tox a receptor de HER2
[0432] Her2-Fc foi imobilizado em fragmento de CM5 em uma densidade de ~ 280 RU. Taxa de fluxo foi ajustada a 50 ul/min com HBS-EP como tampão. Variantes de HerTox foram injetadas durante 3 minutos com 15 fases de dissociação. Pulso de 30sec de 20mM de HCl foi usado para regeneração. O modelo de Analisado Bivalente foi utilizado para ajustar os dados (Figura 1). Análise dos dados indica que HerTox HA121-NC2D: Kd ~ 60 pM (chi2=4) e HerTox HA121-NC1D: Kd ~ 300 pM (chi2=14).
[0433] Exemplo 12: Transfecção Transitória
[0434] Cultura de CHO-S é semeada em 0,75x10A6/mL aproximadamente 16 horas pré-transfecção em meios de FreeStyle Cho. Células estão prontas para transfeccionar o próximo dia quando a contagem de célula alcançou 1,4- 1,6x10A6/mL. Quando células alcançarem contagem alvo, 400 mM de matéria prima de pAF é adicionada a uma concentração de cultura final de 1,4mM. Complexo de PEI/DNA é preparado como descrito: DNA (1,42 ug/1x10A6 células) é dissolvido em RPMI (5% (v/v) de volume de cultura total), mistura de DNA/RPMI é incubada em temperatura ambiente durante 2 minutos, matéria prima de PEI (1 mg/mL) é adicionada a solução de DNA em uma relação de 3:1 (mL PEI/ug DNA), e a mistura é incubada em temperatura ambiente durante 5 minutos. A cultura é suavemente adicionada à mistura e é girada. Os frascos são transferidos a uma incubadora de 32°C. No dia 6 pós-transfecção, uma análise de mancha do oeste é realizada. No dia 7 pós-transfecção, o sobrenadante é colhido.
[0435] Exemplo 13: Teste de expressão variante Anti-Her2
[0436] Culturas de agitação de 30 ml, CHO-S em meio FreeStyle; 56 ug de DNA em reagente de PEI foram usadas. 1,5 mM de pAF foi da mesma forma usado. No dia 6, o sobrenadante foi colhido. Titulação foi determinada por Fc ELISA. (Figuras 2 e 3)
[0437] Exemplo 14: Inibição in vitro de Ensaio de Proliferação
[0438] No dia 1, as células foram semeadas. Os meios foram aspirados e os frascos de cultura T-225 de células foram enxaguados com 30mL de PBS -/. PBS foi aspirado e 6 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados a 37°C, 5% de CO2 durante 2-5 minutos. Células aderentes foram desalojadas por frasco de choque e tripsina foi neutralizada adicionando 14mL de meio de cultura. A suspensão de célula foi misturada e transferida em um tubo cônico de 50 mL. As células foram giradas em 1200 rpm, 5 minutos, temperatura de ambiente. A pelota de célula resultante foi ressuspensa em 12 mL de meio de cultura. As células foram contadas em um hemacitômetro. Células foram semeadas em densidades celulares apropriadas em placas claras de base lisa de 96 cavidades, e incubadas durante a noite a 37°C, 5% de CO2 para permitir células ligar. Volume de plaqueamento foi 80uL/cavidade. 80uL/cavidade de meio de cultura foi utilizado como a célula de "não controle".
[0439] Exemplos de densidade de plaqueamento de célula incluem:
[0440] BT474 (Her2 alto) - 20,000 células/cavidade em F12k/DMEM (50/50), 10% de FBS, P/S
[0441] MDA-MB-468 (Her2 negativo) - 6,000 células/cavidade em F12k/DMEM (50/50), 10% de FBS, P/S
[0442] HCC1954 - 5,000 células/cavidade em RPMI 1640, 10% de FBS, P/S
[0443] SKOV-3 - 6,000 células/cavidade em RPMI 1640, 10% de FBS, P/S
[0444] HT29 - 20.000 células/cavidade em McCoy’s 5A, 10% de FBS, P/S
[0445] No dia 2, as amostras de teste foram adicionadas às células. As amostras de teste foram diluídas meio de cultura em uma concentração de matéria prima de 9x em Coluna 2 de uma placa de 96 cavidades de base redonda. 3x dilui-ções seriais foram feitas a partir da Coluna 2 para Coluna 11 com um pipetor de multi-canal. 10uL/cavidade das amostras acima foi adicionado em duplicata às cavidades apropriadas da placa semeada. O volume total nas cavidades foi cerca de 90uL/cavidade. 10 uL/cavidade de meio de cultura foi adicionado para evitar efeitos de extremidade para cavidades de amostra. Cavidades de meio de controle foram incluídas nas cavidades internas onde nenhuma amostra foi adicionada (apenas 10uL/cavidade de meio de cultura) a ser usado em cálculos de proliferação. As placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 72 horas.
[0446] No dia 5, ocorreu leitura de proliferação. Para detectar proliferação celular, 10 uL/cavidade de reagente de WST-8 foi adicionado (Cell Counting Kit-8, cat# CK04-20, Dojindo Labs) para todas as cavidades. A placa foi incubada durante 4 horas a 37°C, 5% de CO2. As placas estavam medidas para absorvência em OD 450nm. Cálculo de inibição de proliferação de amostras de teste: subtraia o “controle sem célula” valor de OD450 dos valores de OD450 de todas as cavidades; calcular média das cavidades de Controle Médias (não tratado); calcular cada amostra % de valor de Controle Médio valor usando a fórmula: (OD450 amostra/OD450 média de % de Controle médio) *100; calcular a média, desvio-padrão, e % de CV de cada duplicata de amostra % de valores de Controle Médio; plotar cada média de amostras % de valore de Controle Médio contra concentração de amostra; calcular valores de IC50 usando análise de regressão de ajuste logístico de parâmetro para determinar potência de amostras de teste.
[0447] Figura 4 e Figura 5 ilustram resultados a partir do em ensaio de proliferação in vitro com derivados de ligante de dolastatina e linhagem de câncer de mama HCC1954, HER2 +++. Figuras 6 e 7 ilustram resultados do em ensaio de proliferação in vitro com derivados de ligante de dolastatina e linhagem de câncer ovari- ano SKOV-3, HER2 +++. Figuras 8 e 9 ilustram resultados a partir do em ensaio de proliferação in vitro com derivados de ligante de dolastatina e linhagem de câncer de mama MDS-MB-468, HER2 negativo.
[0448] TABELA 2. Sumário de Ensaio de Proliferação de HER-Tox: Valores de IC50 [nM] depois de 72 horas de tratamento de fármaco
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TABELA 3. Dados Celulares In vitro
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[0449] Exemplo 15: Eficácia anti-tumor in vivo de Her2-ADCs em HCC1954 (carcinoma de mama humano) model animal de xenoenxerto
[0450] HCC1954 (carcinoma de mama humano) células foram obtidas a partir de American Type Culture Collections (Manassas, VA) e cultura em RPMI + 10% de FBS, 37°C, 5% de CO2 até 80% confluente. Células foram colhidas por tripsiniza- ção e suspensas em PBS em 1 x 108 células/mL.
[0451] Camundongos fêmeas, SCID-beges, 5-8 semanas de idade, foram obtidos a partir de Charles River Laboratories. Células de HCC1954 (humano, carcinoma de mama, ATCC, #CRL-2338) foram misturados 1:1 com Matrigel (BD Biosciences, Bedford MA) e subcutaneamente injetados nos camundongos. Quando tumores alcançaram um tamanho médio de 100-200 mm3, camundongos foram classificados em grupos de 9 - 10 camundongos cada. Medidas de calibrador foram empregadas duas vezes por semana até o fim do estudo. Para calcular volume de tumor, dois diâmetros ortogonais foram medidos com capilares e os valores entraram na fórmula, (L x W x W)/2=V, (onde W=diâmetro mais curto, L=diâmetro mais longo e V=volume), para obter um volume calculado. O volume de tumor foi convertido em peso de tumor no arquivo de dados de Excel assumindo 1 mm3 = 1 mg. Ponto final estva com base em um desígnio de estudo de inibição de crescimento de tumor (TGI). Quando o volume de tumor médio do grupo controle alcançou aproximada-mente 1.000 mm3 todos os camundongos foram eutanizados ou dia 28, o que viesse primeiro.
[0452] Camundongos foram determinados uma única injeção IV (veia de cauda) no dia 1 de dosagem. Artigo de teste foi dissolvido em 4 mg/mL, 2 mg/mL e 0,66 mg/mL e administrado em um volume de dose de 5 mL/kg para liberar 20, 10 e 3,3 mg/kg. Artigos de teste foram: grau clínico de Herceptin® (Trastuzumabe), Her2- HS122- NCD1 (relação de Ab:Drug = 1:2, ligante não clivável), e Her2- HS122/LK145-HCDl (relação de Ab:Drug = 1:4, ligante clivável) Veja Figura 16.
[0453] Exemplo 16: Estudos In vivo de Derivados ligados a Her2-Dolastatina
[0454] Células HCC1954 foram utilizadas para este estudo com 107 célu- las/camundongo em Matrigel, SC no flanco direito. Camundongos foram fêmeas SCID-bg de 4-8 semanas. Agrupamento foi realizado no dia 5 depois da implantação celular (tumores ~100 mm3): ordenado em 11 grupos de 10 camundongos cada. Uma única dose IV foi dada no dia 1 de dosagem com cada composto em 3 níveis de dose, 20 mg/kg, 10 mg/kg e 3,3 mg/kg. Volume de tumor foi monitorado até que o ponto final foi alcançado (1.000 mm3 ou 60 dias). (Figura 10) Paclitaxel 25 mg/kg, IV, qod x 5 foi empregado como a quimioterapia de controle. O veículo = 50 mM de his- tamina, 0,1 M de NaCl, 5% de trealose, pH 6. Grau clínico de Herceptin® (Trastuzumabe), Her2-HS122-NCDl (ligante não clivável) e Her2-HS122/LK145-HCDl (ligante clivável) foram testados. (Figura 11 e 12) Tabela 4. Cálculo de T/C (Tratado / Controle) para o estudo de HCC1954 estude no dia 28
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[0455] Exemplo 17: Estudos Farmacocinéticos
[0456] Ensaio foi realizado que detectou ligação de anticorpo a receptor de ErbB2. (Figura 13) Ensaio foi realizado que detectou pelo menos duas dolastatinas ligadas a um anticorpo (Figura 14).
[0457] Figura 15.
[0458] Exemplo 18: Tratamento para Câncer de Mama
[0459] Experiência Clínica Humana da Segurança e/ou Eficácia de Deriva- dois de Dolastatina Ligados a Trastuzumabe para Terapia de Câncer de Mama
[0460] Objetivo: Comparar a segurança e farmacocinéticos de composição administrada compreendendo derivado de dolastatina ligados a trastuzumabe.
[0461] Desígnio de Estudo: Este estudo será um estudo de Fase I, único- centro, rótulo aberto, escalação de dose aleatorizado seguido por um estudo de Fase II em pacientes com câncer de mama. Pacientes não deveriam ter sido expostos a derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe antes da entrada do estudo. Pacientes não deveriam ter recebido tratamento para seu câncer dentro de 2 semanas do início da experiência. Tratamentos incluem o uso de quimioterapia, fatores de crescimento hematopoiéticos, e terapia biológica tal como anticorpos monoclonais. Pacientes devem ter recuperado de todas as toxicidades (classificar 0 ou 1) associadas com tratamento prévio. Todos os indivíduos são avaliados quanto a segurança e todas as coleções de sangue para análise farmacocinética são coletados quand marcados. Todos os estudos são realizados com aprovação de comitê de ética institucional e consentimento de paciente.
[0462] Fase I: Pacientes recebem derivdo de dolastatina ligado a trastuzumabe i.v. nos dias 1, 8, e 15 de cada ciclo de 28 dias. Doses de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe podem ser sustentadas ou modificadas quanto a toxici- dade cm base em avaliações como esboçado abaixo. Tratamento repete-se a cada 28 dias na ausência de toxicidade inaceitável. Grupos de 3-6 pacientes recebem doses crescentes de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe até que a dose máxima tolerada (MTD) para derivado de dolastatina ligado a trastuzumab seja determinada. O MTD é definido como a dose anterior na qual 2 de 3 ou 2 de 6 pacientes experimentam toxicidade de limitação de dose. Toxicidades de limitação de dose são determinadas de acordo com as definições e padrões fixos pelo National Cancer Institute (NCI) Common Terminology for Adverse Events (CTCAE) Versão 3.0 (9 de agosto de 2006).
[0463] Fase II: Pacientes recebem derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe como na fase I no MTD detrminado na fase I. Tratamento repete-se a cada 4 semanas durante 2-6 cursos na ausência de progressão de doença ou toxicidade inaceitável. Depois da conclusão de 2 cursos de terapia de estudo, pacientes que alcançam uma resposta completa ou parcial podem receber adicional de 4 cursos. Pacientes que mantêm doença estável durante mais de 2 meses depois da conclusão de 6 cursos de terapia de estudo podem receber um adicional de 6 cursos no momento da progressão da doença, contanto eles conheçam critérios de elegibilidade originais.
[0464] Sangue Serial de Amostragem de Sangue é tirado por punção da veia direta antes e depois da administração de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe. Amostras de sangue venosas (5 mL) para determinação de concentrações de soro são obtidas a cerca de 10 minutos antes da dosagem e em aproximadamente seguindo tempos depois da dosagem: dias 1, 8, e 15. Cada amostra de soro é dividida em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20°C°C. Amostras de soro são transportadas em gelo seco.
[0465] Farmacocinéticos: Pacientes sofrem coleção de amostra de plas- ma/soro para avaliação farmacocinética antes de começar tratamento e nos dias 1, 8, e 15. Parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos independentes modelo em um sistema de computador Digital Equipament Corporation VAX 8600 usando a versão mais recente do software BIOAVL. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos são determinados: concentração de soro de pico (Cmax); tempo para concentração de soro de pico (tmax); área sob a curva de tempo de concentração (AUC) de tempo zero ao último tempo de amostragem de sangue (AUC0-72) calculado com o uso da regra trapezoidal linear; e meia-vida de eliminação terminal (t1/2), computado a partir da taxa de eliminação constante. A constante de taxa de eliminação é calculada por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal da plotagem de tempo de concentração linear de log. A média, desvio padrão (SD), e coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos são calculados para cada tratamento. A relação dos meios de parâmetro (formulação preservada/formulação não preservada) é calculada.
[0466] Resposta de paciente a terapia de combinação: Resposta de paciente é avaliada por meio de imageamento com Raios X, varreduras CT, e MRI, e image- amento é realizado antes de começar o estudo e ao término do primeiro ciclo, com imageamento adicional realiado a cada quatro semanas ou ao término de ciclos subsequentes. Modalidades de imageamento são escolhidas com base no tipo de câncer e viabilidade/disponibilidade, e a mesma modalidade de imageamento é utilizada para tipos de câncer similares bem como ao longo do curso de estudo de cada paciente. Taxas de resposta são determinadas usando os critérios de RECIST. (The- rasse e outro, J., Natl. Cancer Inst. 2000 2 de fevereiro; 92(3):205-16; http://ctep.cancer.gov/forms/TherasseRECISTJNCI.pdf). Pacientes da mesma forma sofrem biópsia de câncer/tumor para avaliar mudanças em fenótipo de célula de câncer progenitor e crescimento clonogênico por citometria de fluxo, mancha do Oeste, e IHC, e para mudanças em citogenética por FISH. Depois da conclusão de tratamento de estudo, pacientes são seguidos periodicamente durante 4 semanas.
[0467] Exemplo 19: Tratamento para Câncer de Mama
[0468] Tentativa Clínica Humana da Segurança e Eficácia de Derivado de Dolastatina Ligado a Trastuzumabe para Terapia de Câncer de Mama
[0469] Objetivo: Comparar a eficácia e toxicidade de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe sozinho seguido em progressão de doença por trastuzumabe de combinação e paclitaxel vs trastuzumab de combinação de primeira linha e paclitaxel em mulheres com câncer de mama metastático super-expressando HER2.
[0470] Desígnio de Eestudo: Este estudo é um estudo aleatorizado, de multicentro. Pacientes são estratificados de acordo com grau de super-expressão de HER2/neu (2+ vs 3+), antes do tratamento adjuvante contendo antraciclina (nenhum tratamento anterior vs tratamento anterior sem radioterapia para parede torácica esquerda vs tratamento anterior com radioterapia para parede torácica esquerda), estado de estrogênio-receptor (positivo vs desconhecido vs negativo), terapia anterior (primeira linha vs segunda/terceira linha), e centro. Pacientes são aleatorizados em um de dois braços de tratamento. Braço I: os Pacientes recebem derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe IV durante 30-90 minutos semanalmente. Em tempo de progressão de doença, pacientes recebem derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe de combinação IV e paclitaxel IV como no braço II. BraçoII: Pacientes recebem derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe IV durante 30-90 minutos semanalmente. Paclitaxel é administrado para IV durante 1 hora semanalmente durante 3 semanas seguido por 1 semana de resto.
[0471] Tratamento continua em ambos os braços na ausência de progressão de doença ou toxicidade inaceitável. Qualidade de vida é avaliada em linha de referência e dia 1 de cursos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, e 12. Pacientes são seguidos em 1, 3, e 6 meses e em seguida a cada 6 meses depois disso.
[0472] Exemplo 20: Tratamento para Câncer de Bexiga
[0473] Experiência Clínica Humana da Segurança e Eficácia de um Derivado de Dolastatina descrito aqui para Terapia de Câncer de Bexiga
[0474] Objetivo: Determinar a toxicidade aguda de paclitaxel e radioterapia com ou sem derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe em pacientes para que sofreram resseção de bexiga transuretral anterior para carcinoma de célula transitivo invasivo muscular da bexiga.
[0475] Características da doença: Histologicamente ou citologicamente é confirmado carcinoma de célula transitivo primário (TCC) da bexiga; evidência histológica de invasão de muscularis propria; conhece 1 dos seguintes critérios de estágio: estágio T2-4a; NX, N0, ou N1; e M0 doença ou estágio clínico T1, doença de grau 3/3 E requer terapia local definitiva; envolvimento de tumor da uretra prostática permitiu contanto os seguintes critérios sejam conhecidos: tumor é visivelmente completamente ressecado; nenhuma evidência de invasão estromal da próstata, nenhuma evidência de metástase distantes por Raios X do tórax ou varredura de CT AND varreguras abdominais/pélvicas CT; sofreu resseção de bexiga transuretral (tão completo quanto é julgado seguramente possível) dentro das últimas 3-8 semanas, incluindo exame bimanual com mapeamento de tumor; tecido de tumor suficiente disponível para análise de HER2/neu; não um candidato para cistectomia radical.
[0476] Desígnio do Estudo: Este estudo é um estudo não aleatorizado, de multicentro. Pacientes são avaliados em 1 de 2 grupos de tratamento de acordo com estado de HER2/neu (HER2/neu 2+ ou 3+ manchamento [grupo 1] vs HER2/neu 0 ou 1+ manchamento [grupo 2]).
[0477] Grupo 1: Pacientes recebem paclitaxel IV durante 1 hora nos dias 1, 8, 15, 22, 29, 36, e 43 e derivado de dolastatina ligado a trastuzumab IV durante 90 minutos no dia 1 e em seguida durante 30 minutos nos dias 8, 15, 22, 29, 36, e 43. Pacientes da mesma forma sofrem radioterapia uma vez por dia nos dias 1-5, 8-12, 15-19, 22-26, 29- 33, 36-40, 43-47, e 50. Tratamento continua na ausência de progressão de doença ou toxicidade inaceitável.
[0478] Grupo 2: Pacientes recebem paclitaxel e sofrem radioterapia como no grupo 1. Depois da conclusão de tratamento de estudo, pacientes são seguidos em 4-5 semanas, a cada 3 meses durante 1 ano, a cada 4 meses durante 1 ano, a cada 6 meses durante 3 anos, e em seguida anualmente depois disso.
[0479] Exemplo 21: Tratamento para Cancer Ovariano
[0480] Experiência Clínica Humana da Segurança e Eficácia de Derivado de Dolastatina Descrito aqui para Terapia de Câncer Ovariano
[0481] Objetivo: Avaliar a segurança e eficácia de uma dosagem de quatro semana uma vez por semana IV de composição compreendendo um derivado de dolastatina descrito aqui em mulheres com câncer ovariano super-expressando HER2.
[0482] Desígnio do Estudo: Este estudo é um estudo não aleatorizado, de rótulo aberto, de 11 semanas, de multicentro. Este estudo avaliará o perfil de segurança de quatro dosagens uma vez por semana IV, MTD, PK e imunogenicidade de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe. Pacientes são avaliados em um único grupo. Pacientes recebem uma dose de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe uma vez por semana durante 4 semanas. Derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe será administrado por infusão IV em Dias de Estudo 1, 8, 15, e 22. Amostras de urina serão empregadas nos dias 1 e 22.
[0483] Sangue serial de amostragem de sangue é tirado por punção venosa direta antes e depois da administração de derivado de dolastatina ligado a trastuzumabe. Amostra de sangue venoso (5 mL) para determinação de concentrações de soro são obtidas a cerca de 10 minutos antes da dosagem e aproxmadamente os seguintes tempos depois da dosagem: dias 1, 2, 4, 5, 8, 15, 22, 36, 43 e 50. Cada amostra de soro é dividida em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20°C. Amostras de soro são transportadas em gelo seco.
[0484] Tratamento continua na ausência de progressão de doença ou toxici- dade inaceitável. Qualidade de vida é avaliada na linha de referência e dia 1 de cursos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, e 12. Pacientes são seguidos nos dias 29. 36, 43, e 50. Pacientes serão perguntados sobre eventos adversos. Pacientes terão uma varredura de imageamento e ECG para avaliar função de siz de tumor e coração (dia 43). Na terminação dos pacientes de estudo terá um exame físico dia 50). Pacientes com evidência de regressão de doença podem receber terapia continuada até que evidência de progressão de doença seja documentada.
[0485] Descrito aqui são aminoácidos não naturais e análogos de dolastatina incluindo pelo menos um aminoácido não natural, e métodos para preparar tais ami-noácidos não naturais e polipeptídeos. Os análogos de dolastatina podem incluir uma ampla faixa de possíveis funcionalidades, porém tipicamente tem pelo menos um grupo oxima, carbonila, dicarbonila, e/ou hidroxilamina. Da mesma forma descrito aqui são análogos de dolastatina de aminoácido não naturais que são também modificados pós-translacionalmente, métodos para realizar tais modificações, e métodos para purificar tais análogos de dolastatina. Tipicamente, os análogos de dolastatina modificados incluem pelo menos um grupo oxima, carbonila, dicarbonila, e/ou hidroxilamina. Além disso descrito são métodos para usar tais análogos de dolastatina de aminoácido não natural e análogos de dolastatina de aminoácido não natural modificados, incluindo usos de biotecnologia terapêutica, diagnósticos, e outros.

Claims (8)

1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a Fórmula
Figure img0124
em que: A é opcional, e quando presente é C1-C8 alquileno, C1-C8 alquileno substituí-do, C1-C8 cicloalquileno, C1-C8 cicloalquileno substituído, C1-C8 alquenileno, C1-C8 alquenileno substituído, C1-C10 alquinileno, C1-C8 heteroalquileno, C1-C10 heteroal- quileno substituído, C1-C8 heterocicloalquileno, C1-C8 heterocicloalquileno substituí-do, arileno contendo de 5 a 20 átomos de anel, arileno substituído contendo de 5 a 20 átomos de anel, heteroarileno contendo de 5 a 20 átomos de anel, heteroarileno substituído contendo de 5 a 20 átomos de anel, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substituído; b é opcional, e quando presente é um ligante selecionado dentre o grupo consistindo em C1-C8 alquileno, C1-C8 alquileno substituído, C1-C8 alquenileno, C1-C8 alquenileno substituído, C1-C8 heteroalquileno, C1-C8 heteroalquileno substituído, -o-, -o-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(o)k- onde k é 1, 2, ou 3, -S(o)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(o)-, -C(o)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(o)N(R’)-, -CoN(R’)-(C1- C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R’)Co-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, - N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, -C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e -C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, C1-C10 alquila, ou C1C10 alquila substituída; R é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, C1-C10 cicloalquila, ou C1C10 cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo ou polinucleotídeo; cada R3 e R4 é independentemente H, halogênio, C1-C8 alquila, ou C1-C8 al-quila substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente uma C1-C10 cicloalquila ou uma C1-C10 heterocicloalquila; Z tem a estrutura de:
Figure img0125
R5 ; R5 é H, COR8, C1-C6 alquila ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6 alquila ou hidrogênio; e L é -C1-C10 alquileno- ou -(C1-C10 alquileno-O)n-C1-C10 alquileno-; e n é um número inteiro maior do que ou igual a um; em que C1-C10 alquila é uma cadeia linear ou ramificada, ou um radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturada mono- ou poliinsaturada e pode incluir radicais di- e multivalentes e tam-bém inclui C1-C10 heteroalquila e C1-C10 haloalquila; em que C1-C10 alquileno inclui C1-C10 heteroalquileno; em que arila contendo de 5 a 20 átomos de anel inclui heteroarila contendo de 5 a 20 átomos de anel; em que cicloalquila e heterocicloalquila, por si ou em combinação com ou-tros termos, representam versões cíclicas de alquila e heteroalquila; em que aralquila ou alcarila é um radical em que um grupo arila contendo de 5 a 20 átomos de anel está ligado a um grupo C1-C10 alquila; e em que substituído significa que um grupo na molécula foi substituído por um halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquinila, C1-C10 alcóxi, C5-C12 aral- quila, C3-C12 cicloalquila, C4-C12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-C12 alcoxialquila, C5-C12 alcoxiarila, C5-C12 ariloxialquila, C7-C12 oxiarila, C1-C6 alqui- lsulfinila, C1-C10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-C10 alquila) em que m é de 1 a 8, arila, radical heterocíclico, -NO2, -CN, -NR’C(O)-(C1-C10 alquila), -C(O)-(C1-C10 alquila), C2-C10 alqutioalquila, -C(O)O-(C1-C10 alquila), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR’2, carbonila, -C(O)-(C1-C10 alquila)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR’2, -(C1-C10 arila)-S-(C6-C10 arila), - C(O)-(C6-C10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10 alquila) em que cada m é de 1 a 8, - C(O)NR’2, -C(S)NR’2, -SO2NR’2, -NRC(O)NR’2, -NRC(S)NR’2, e em que cada R’ é selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos de anel, ou alcarila.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que RI é um polipeptídeo.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é um polipeptídeo.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é um anticorpo.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é herceptina.
6. Método para derivatizar um análogo de dolastatina que compreende a Fórmula (I), o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende colocar em contato o análogo de dolastatina com um reagente da Fórmula (XXXVII), em que a Fórmula (I) corresponde a:
Figure img0126
em que: Z tem a estrutura de:
Figure img0127
R5 é H, COR8, -C1-C6 alquila ou tiazol; R8 é OH; R6 é OH ou H; Ar é fenila ou piridina; R7 é C1-C6 alquila ou hidrogênio; Y é NH2-O-; L é -C1-C10 alquileno- ou -(C1-C10 alquileno-O)n-C1-C10 alquileno-; n é um número inteiro maior do que ou igual a um; em que a Fórmula (XXXVII) corresponde a:
Figure img0128
em que: A é opcional, e quando presente é C1-C8 alquileno, C1-C8 alquileno substituí-do, C1-C8 alquenileno, C1-C8 alquenileno substituído, arileno contendo de 5 a 20 átomos de anel, arileno substituído contendo de 5 a 20 átomos de anel, heteroarile- no contendo de 5 a 20 átomos de anel, heteroarileno substituído contendo de 5 a 20 átomos de anel, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno, ou aralquileno substi- tuído; B é opcional, e quando presente é um ligante selecionado dentre o grupo consistindo em C1-C8 alquileno, C1-C8 alquileno substituído, C1-C8 alquenileno, C1-C8 alquenileno substituído, -O-, -O-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, - S-, -S-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -S(O)k- onde k é 1, 2 ou 3, -S(O)k(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)-, -C(O)-(C1-C10 alqui- leno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(S)-, -C(S)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 al- quileno substituído)-, -N(R’)-, -NR’-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -C(O)N(R’)-, -CON(R’)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -CSN(R’)-, -CSN(R’)-(C1-C10 alquileno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R’)CO-(C1-C10 alqui- leno ou C1-C10 alquileno substituído)-, -N(R’)C(O)O-, -S(O)kN(R’)-, -N(R’)C(O)N(R’)-, -N(R’)C(S)N(R’)-, -N(R’)S(O)kN(R’)-, -N(R’)-N=, -C(R’)=N-, -C(R’)=N-N(R’)-, C(R’)=N-N=, -C(R’)2-N=N-, e C(R’)2-N(R’)-N(R’)-, onde cada R’ é independentemente H, C1-C10 alquila, ou C1-C10 alquila substituída; cada R’ é independentemente H, C1-C10 alquila, ou C1-C10 alquila substituída;
Figure img0129
R é H, C1-C10 alquila, C1-C10 alquila substituída, C1-C10 cicloalquila, ou C1- C10 cicloalquila substituída; R1 é H, um grupo de proteção amino, resina, pelo menos um aminoácido ou polinucleotídeo; R2 é OH, um grupo de proteção éster, resina, pelo menos um aminoácido ou polinucleotídeo; e cada R3 e R4 é independentemente H, halogênio, C1-C8 alquila, ou C1-C8 al-quila substituída, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente uma C1-C10 cicloalquila ou uma C1-C10 heterocicloalquila; em que C1-C10 alquila é uma cadeia linear ou ramificada, ou um radical de hidrocarboneto cíclico, ou combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturada mono- ou poliinsaturada e pode incluir radicais di- e multivalentes e tam-bém inclui C1-C10 heteroalquila e C1-C10 haloalquila; em que C1-C10 alquileno inclui C1-C10 heteroalquileno; em que arila contendo de 5 a 20 átomos de anel inclui heteroarila contendo de 5 a 20 átomos de anel; em que cicloalquila e heterocicloalquila, por si ou em combinação com ou-tros termos, representam versões cíclicas de alquila e heteroalquila; em que aralquila ou alcarila é um radical em que um grupo arila contendo de 5 a 20 átomos de anel está ligado a um grupo C1-C10 alquila; e em que substituído significa que um grupo na molécula foi substituído por um halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquinila, C1-C10 alcóxi, C5-C12 aral- quila, C3-C12 cicloalquila, C4-C12 cicloalquenila, fenila, toluolila, xilenila, bifenila, C2-C12 alcoxialquila, C5-C12 alcoxiarila, C5-C12 ariloxialquila, C7-C12 oxiarila, C1-C6 alqui- lsulfinila, C1-C10 alquilsulfonila, -(CH2)m-O-(C1-C10 alquila) em que m é de 1 a 8, arila, radical heterocíclico, -NO2, -CN, -NR’C(O)-(C1-C10 alquila), -C(O)-(C1-C10 alquila), C2-C10 alqutioalquila, -C(O)O-(C1-C10 alquila), -OH, -SO2, =S, -COOH, -NR’2, carbonila, -C(O)-(C1-C10 alquila)-CF3, -C(O)-CF3, -C(O)NR’2, -(C1-C10 arila)-S-(C6-C10 arila), - C(O)-(C6-C10 arila), -(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10 alquila) em que cada m é de 1 a 8, - C(O)NR’2, -C(S)NR’2, -SO2NR’2, -NRC(O)NR’2, -NRC(S)NR’2, e em que cada R’ é selecionado dentre H, C1-C10 alquila, arila contendo de 5 a 20 átomos de anel, ou alcarila.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o análogo de dolastatina derivatizado compreende pelo menos uma oxima con- tendo aminoácido tendo a estrutura da Fórmula (VIII):
Figure img0130
8. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo, excipiente ou aglutinante farmaceuticamente aceitável.
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