BR112013029212B1 - anticorpos para o tratamento de câncer expressando claudina-6 - Google Patents

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Korden Walter
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Maria Kreuzberg
Michael Erdeljan
Michael Weichel
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Abstract

resumo da patente de invenção para: “anticorpos para o tratamento de cãncer expressando claidin 6”. a presente invenção fornece anticorpos úteis como agentes terapêuticos para o tratamento e / ou prevenção de doenças associadas com células que expressam cldn6, incluindo doenças relacionadas ao tumor, tais como o câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, melanoma malignos, cãncer de cabeça e pescoço, sarcoma, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, câncer de rim, câncer de cólon, coriocarcinoma placentário, câncer de colo do útero, câncer testicular e câncer uterino

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: “ANTICORPOS PARA TRATAMENTO DO CÂNCER EXPRESSANDO CLAUDINA 6.
Antecedentes da Invenção
[001] Os anticorpos foram introduzidos com sucesso na clínica para utilização em terapia do câncer e têm emergido como a terapêutica mais promissoras em oncologia, durante a última década. As terapias à base de anticorpos para o câncer têm o potencial de uma maior especificidade e menor perfil de efeitos secundários, em comparação com drogas convencionais. A razão é uma distinção precisa entre células normais e neoplásicas, através de anticorpos e o fato de o seu mecanismo de ação se baseia em mecanismos antitumorais imunológicos menos tóxicos, tais como a ativação do complemento e recrutamento de células imunológicas citotóxicas.
[002] Claudinas são proteínas de membrana integrais localizadas dentro das junções apertadas de epitélio e endotélio. Claudinas está previstas para ter quatro segmentos transmembranares com dois laços extracelulares, e terminais N e C localizado no citoplasma. A claudina (CLDN) da família de proteínas transmembranares desempenha um papel crítico na manutenção das alterações epiteliais e endoteliais nas junções apertadas e pode também desempenhar um papel na manutenção do citoesqueleto e na sinalização celular. A expressão diferencial destas proteínas entre células tumorais
2/237 e normais, além da sua localização na membrana, torna-as alvos atrativos para a imunoterapia do câncer e o uso de terapias à base de anticorpos para alvejar CLDNs na terapia do câncer prometendo um elevado nível de especificidade terapêutica.
[003] No entanto, a aplicação clínica terapêutica CLDN-alvo enfrenta vários obstáculos. A expressão ubíqua de CLDNs no corpo e o papel crítico da CLDNs na manutenção de junções apertadas exige especificidade alvo da terapêutica CLDN-alvo, a fim de maximizar a especificidade do tratamento e minimizar a toxicidade sistêmica.
[004] O documento WO 2009/087978 refere-se a anticorpos anti-CLDN6 e à sua utilização como agentes anticâncer. Em particular, os anticorpos monoclonais designados AB3-1, AE1-16, AE49-11, e AE3-20 são descritos. No entanto, nenhum destes anticorpos foi específico para CLDN6 como mostrado por análise de FACS no Exemplo 5. O anticorpo reagiu com AE3-20 CLDN9, enquanto os anticorpos AE1-16 e AE49-11 mostrou reatividade com CLDN9 considerável e também reagiu com CLDN4. A ligação do anticorpo AB3-1 para CLDN6 era tão forte como a sua ligação ao CLDN9. É descrito no Exemplo 7 que o anticorpo AE49-11 quando administrado a um modelo de rato tumoral tende a inibir o crescimento do tumor e teve um efeito de prolongamento da vida. No entanto, dada a não especificidade do anticorpo utilizado, não fica claro se os
3/237 efeitos descritos são devidos à ligação do anticorpo a CLDN6.
[005] Assim, até agora, nenhum anticorpo específico para CLDN6 foi descrito que se liga seletivamente à superfície de células que expressam CLDN6. No entanto, tal anticorpo específico poderia ser necessário para as abordagens terapêuticas baseadas em anticorpos, utilizando CLDN6 como um alvo.
[006] O alinhamento da sequência de CLDN3, CLDN4, CLDN6 e CLDN9 mostrado na Fig. 1 ilustra que existe um elevado grau de conservação de CLDN6 a outras proteínas claudina. Esta alta homologia de CLDN6 com outras proteínas Claudina, em particular, CLDN9 e CLDN4, e o fato de que WO 2009/087978 não conseguiu apresentar anticorpos específicos para CLDN6 sugerem que ele pode não ser possível para a produção de anticorpos que se liga especificamente a CLDN6. Sumário da Invenção
[007] Os resultados experimentais aqui descritos confirmar que CLDN6 é expressa em diferentes células cancerígenas humanas, enquanto que a expressão em tecidos normais é limitada a placenta.
[008] Além disso, a presente invenção pela primeira vez descreve a produção bem sucedida de anticorpos específicos de CLDN6 capazes de se ligarem à superfície de células intactas que expressam CLDN6. Análises FACS de células intactas que expressam CLDN6 mostrou ligação de
4/237 anticorpos anti-CLDN6, enquanto não foi observada ligação para as células que expressam outras proteínas claudina, em particular, CLDN3, CLDN4 e CLDN9, ou células que não expressam qualquer destas proteínas específicas do CLDN. Assim, a presente invenção demonstra inesperadamente que um anticorpo pode ser produzido realizando especificamente uma reação antígeno-anticorpo com CLDN6 na superfície de células que expressam CLDN6, mas não se realiza substancialmente a reação antígeno-anticorpo com outras claudinas altamente homólogas.
[009] A presente invenção proporciona anticorpos geralmente úteis como agentes terapêuticos para o tratamento e / ou prevenção de doenças associadas com células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células, incluindo as doenças relacionadas com tumores, em particular, o câncer, como o câncer do ovário, em especial, adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (SCLC), em especial, o carcinoma pulmonar de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer de pele, em particular, o carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça pescoço, em particular, adenoma
5/237 pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinosarcoma, câncer do duto biliar, o câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular, carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma papilar renal, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinal e adenocarcinoma do íleo, carcinoma ao desenvolvimento embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, seminoma testicular, em particular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumor de células germinativas, tais como um ou mais carcinoma teratocarcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes.
[0010] Em um aspecto, a invenção se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a CLDN6 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN6. De preferência, o anticorpo não é capaz de se ligar substancialmente a CLDN9 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN9. De preferência, o anticorpo não é capaz de se ligar substancialmente a CLDN4 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN4 e / ou não é substancialmente capaz de se ligar a CLDN3 associada com a superfície de uma célula
6/237 que expressa CLDN3. Mais preferencialmente, o anticorpo não é substancialmente capaz de se ligar a uma proteína CLDN diferente de CLDN6 associada com a superfície de uma célula que expressa a referida proteína CLDN e é específico para CLDN6. De preferência, a referida célula que expressa à referida proteína CLDN é uma célula intacta, em particular, uma célula não-permeabilizadas, e a referida proteína CLDN associada com a superfície de uma célula tem uma conformação nativa, ou seja, não desnaturada. De preferência, o anticorpo é capaz de se ligar a um ou mais epítopos de CLDN6 na sua conformação nativa.
[0011] Em uma concretização, o anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo localizado dentro de uma porção extracelular de CLDN6, em que a referida porção extracelular do CLDN6, preferencialmente, compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferência, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. De preferência, o anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo localizado dentro da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferência, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.
[0012]
Em uma concretização, o anticorpo é capaz de
7/237
se ligar a CLDN6 interagindo com pelo menos uma, de
preferência, mais de um, tal como 2, 3, 4 ou 5, de
preferência, todos os aminoácidos selecionados a partir do
grupo que consiste em Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 , Ile40 e
Leul51, de preferência, através da interação com pelo menos um, de preferência, mais de um, de preferência, todos os aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 e Ile40, mais de preferência, através da interação com pelo menos um, de preferência, mais do que um, de preferência todos os aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em Phe35, Gly37, Ser39 e DE40 ou consistindo de Thr33, Phe35, Gly37 e Ser39, e, em particular, através da interação com pelo menos um, de preferência, mais de um, de preferência, todos aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em Phe35, Gly37 e Ser39. De preferência, o anticorpo não interage com um ou mais, de preferência todos os aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de Glul54, Alal55, Argl58 e Glyl61, e de preferência, não interage com um ou mais, de preferência, todos os aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de Argl58 e Glyl61.
[0013] A interação entre um anticorpo e CLDN6, em particular, na sua conformação nativa pode ser analisada por uma mutagénese de varrimento de alanina de aminoácidos. CLDN6 mutante pode ser avaliada para a sua capacidade de ser ligada
8/237 por anticorpos monoclonais específicos. Ligação prejudicada de um anticorpo monoclonal específico para um mutante CLDN6 sugerem que o aminoácido mutado é um resíduo de contato importante. A ligação pode ser analisada, por exemplo, por citometria de fluxo.
[0014] Em uma concretização, o anticorpo pode ser obtido por um método compreendendo a etapa de imunização de um animal com um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferência, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7 ou um peptídeo imunologicamente equivalente, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira que expressa o referido peptídeo.
[0015] Em diferentes concretizações, a CLDN6 para o qual o anticorpo é capaz de se ligar tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. É particularmente preferido que o anticorpo seja capaz de se ligar a CLDN6 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e seja capaz de se ligar a CLDN6 possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
[0016] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo, pelo menos um, preferencialmente, dois, mais preferencialmente todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia pesada de anticorpo selecionado a partir da SEQ ID NOs: 34,
9/237
36, 38 e 40, ou uma sua variante. As sequências CDR estão marcadas por uma caixa nas sequências de cadeia pesada do anticorpo mencionado acima, indicadas na figura 25.
[0017] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de CDR3 Xaal Gli Val Xaa2 Xaa3, em que Xaal é qualquer aminoácido, de preferência, um aminoácido aromático, mais preferivelmente, Phe ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr, Xaa2 é qualquer de aminoácido, de preferência, um aminoácido aromático, mais preferivelmente, Phe ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr, e Xaa3 é qualquer aminoácido, de preferência, Leu ou Phe, mais de preferência, Leu. Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de CDR3 Xaal Asp Gli Val Xaa2 Xaa3 ou Xaal Gly Xaa 2 Xaa 3 Asp Val, em que Xaal, Xaa e Xaa3 são como definidos acima. Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de CDR3 Xaal Asp Gly Xaa 2 Xaa 3 Asp Val, em que Xaal, Xaa2 e Xaa3 são como definidos acima. Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de CDR3 Ala Arg Asp Xaal Gly Xaa 2 Xaa 3 Asp Tyr Val, em que Xaal, Xaa2 e Xaa3 são como definidos acima. Em uma concretização, um anticorpo de acordo com as concretizações anteriores compreende uma cadeia pesada
10/237 de anticorpo compreendendo a sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 47 ou uma sua variante e / ou CDR2 a sequência de acordo com SEQ ID NO: 48 ou uma sua variante.
[0018] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada de anticorpo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 34, 36, 38 e 40 ou uma sua variante.
[0019] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia leve de anticorpo que compreende pelo menos um, preferencialmente dois, mais preferencialmente todas as três sequências de CDR de uma sequência da cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 35, 37, 39 e 41, ou uma sua variante. As sequências de CDR estão marcadas por uma caixa nas sequências de cadeia leve do anticorpo acima mencionado indicadas na figura 26.
[0020] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de CDR3 Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro, em que Xaal é qualquer aminoácido, de preferência, Ser ou Asn, mais preferivelmente, Ser, Xaa2 é qualquer aminoácido, de preferência, Tyr, Ser, He, Asn ou Thr, mais preferivelmente, Tyr, Ser ou Asn, mais preferivelmente, Asn e Xaa3 é qualquer aminoácido, de preferência, Ser ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr. Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a
11/237 sequência de CDR3 Gin Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro Pro, em que Xaal, Xaa2 e Xaa3 são como definidos acima. Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de CDR3 Gin Gin Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, em que Xaal, Xaa2 e Xaa3 são como definidos acima. Em uma concretização, um anticorpo de acordo com as concretizações anteriores compreende uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 52 ou uma sua variante e / ou CDR2 a sequência de acordo com SEQ ID NO: 53 ou uma sua variante.
[0021] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de cadeia leve de anticorpo selecionado de entre SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 54 e 55 ou uma sua variante.
[0022] Em várias concretizações, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo, como discutido acima e uma cadeia leve de anticorpo, como discutido acima também.
[0023] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(I) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo, pelo menos um, preferencialmente, dois, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia pesada do anticorpo da SEQ ID NO: x, ou sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende pelo
12/237 menos um, preferencialmente, dois, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de anticorpo de cadeia leve da SEQ ID NO: x + 1 ou sua variante;
em que x é selecionado a partir de 34, 36, 38 e 40.
[0024] As sequências de CDR estão marcadas por uma caixa em que as sequências de cadeia pesada do anticorpo e as sequências da cadeia leve do anticorpo mencionado acima, respectivamente, são apresentadas na Figura 25 e Figura 26, respectivamente.
[0025] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
[0026] (i) uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma sequência de CDR3 selecionado a partir do grupo que consiste em Xaal Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaal Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaal Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaal Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, e Ala Arg Asp Xaal Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, em que Xaa1 é qualquer aminoácido, de preferência, um aminoácido aromático, mais preferivelmente, Phe ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr, Xaa2 é qualquer aminoácido, preferencialmente, um aminoácido aromático, mais preferivelmente, Phe ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr, e Xaa3 é qualquer aminoácido, preferivelmente Leu ou Phe, mais de preferência Leu, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de CDR3 selecionado a partir do grupo que consiste
13/237 em Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro, Gin Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gin Gin Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, em que Xaal é qualquer aminoácido, de preferência, Ser ou Asn, mais preferivelmente, Ser, Xaa2 é qualquer aminoácido, de preferência Tyr, Ser, He, Asn ou Thr, mais preferivelmente Tyr, Ser ou Asn, mais preferivelmente, Asn, e Xaa3 é qualquer aminoácido, de preferência, Ser ou Tyr, mais preferivelmente, Tyr .
[0027] Em uma concretização, um anticorpo de acordo com as concretizações anteriores compreende (i) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 47 ou uma sua variante e / ou a sequência CDR2 de acordo com SEQ ID NO: 48 ou uma sua variante (ii) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 52 ou uma variante e / ou a sequência CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 53 ou sua variante.
[0028] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(i) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 34, 36, 38 e 40 ou uma sua variante, de preferência, a SEQ ID NO: 36 ou uma sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de cadeia leve de anticorpo selecionado de entre SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 54 e 55 ou sua variante, de
14/237 preferência, a SEQ ID NO: 35 ou uma sua variante.
[0029] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(I) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: 36 ou uma sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de cadeia leve de anticorpo selecionado de entre SEQ ID NOs: 35, 54 e 55 ou uma sua variante.
[0030] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(I) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: 36 ou uma sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de cadeia leve de anticorpo selecionado de entre SEQ ID NOs: 54 e 55 ou uma sua variante.
[0031] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(I) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: 36 ou uma sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de anticorpo de cadeia leve de SEQ ID NO: 35 ou sua variante.
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[0032] Em uma concretização, um anticorpo da invenção compreende:
(i) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: X ou uma sua variante, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência de anticorpo de cadeia leve de SEQ ID NO: x + 1 ou uma sua variante;
em que X é selecionado a partir de 34, 36, 38 e 40.
[0033] Em concretizações preferidas, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma cadeia pesada da região constante gama-1, de preferência, uma gama-1 humano de cadeia pesada da região constante tal como uma sequência como apresentado na SEQ ID NO: 25 e / ou compreende uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma região constante de cadeia leve capa, preferencialmente uma cadeia leve da região constante kapa humana, tais como uma sequência de apresentada em SEQ ID NO: 27.
[0034] Em concretizações preferidas, o anticorpo tem uma ou mais das seguintes atividades: (i) morte de uma célula que expressa CLDN6, (ii) a inibição da proliferação de uma célula que expressa CLDN6, (iii) inibição da formação de colônias de uma célula que expressa CLDN6, (iv) mediando a remissão, ou seja, redução de tamanho, de preferência, a
16/237 remissão completa, isto é, desaparecimento completo, de tumores estabelecidos, (v) a prevenção da formação ou reformação de tumores, e (vi) a inibição de metástases de uma célula que expressa CLDN6. Assim, o anticorpo pode ser utilizado para um ou mais dos anteriores, em particular quando administrada a um paciente. Essa destruição das células e / ou inibição de uma ou mais atividades de células podem ser utilizados terapeuticamente, tal como aqui descrito. Em particular, a morte de células, inibição da proliferação de células e / ou inibição da formação de colônias de células podem ser utilizadas para tratar ou prevenir câncer, incluindo metástases de câncer. A inibição da proliferação, a formação de colônias e / ou metástase de células pode ser utilizada, em particular, para o tratamento ou prevenção de metástases de câncer e a metástase de células de câncer. De preferência, o anticorpo da invenção medeia a morte de células através da indução de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) lise mediada, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por lise, a apoptose, a adesão homotípica, e / ou fagocitose, de preferência, através da indução de lise mediada CDC e / ou ADCC mediada lise. No entanto, a presente invenção também inclui concretizações, em que o anticorpo exerce a sua actividade, tal como descrito aqui, tal como a morte de células e / ou inibição de uma ou mais atividades de células,
17/237 por exemplo, a proliferação celular e / ou a formação de colônias, sem induzir lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC), lise mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), a apoptose, a adesão homotípica, e / ou fagocitose. Por exemplo, o anticorpo da presente invenção pode também exercer um efeito simplesmente pela ligação a CLDN6 na superfície da célula, assim, por exemplo, impedindo a proliferação das células. Em uma concretização, o anticorpo da invenção não induz CDC lise mediada por células.
[0035] De preferência, lise mediada por ADCC de células tem lugar na presença de células efetoras, em concretizações particulares, que são selecionadas de entre o grupo consistindo de monócitos, células mononucleares, células NK e PMN e fagocitose por macrófagos.
[0036] A atividade de inibir ou reduzir a proliferação de células que expressam CLDN6, de preferência, células cancerígenas pode ser medida in vitro por determinação da proliferação de células cancerosas que expressam CLDN6 em um ensaio utilizando bromodesoxiuridina (desoxiuridina 5-bromo-2-, BrdU). BrdU é um nucleosídeo sintético que é um análogo da timidina e pode ser incorporado novamente dento de DNA sintetizado de células replicantes (durante a fase S do ciclo celular), substituindo por timidina durante a replicação do DNA. Detectando a química
18/237 incorporada utilizando, por exemplo, anticorpos específicos para BrdU indica as células que foram ativamente replicantes em seu DNA.
[0037] A atividade de inibir ou reduzir a formação de colônias de células que expressam CLDN6, de preferência, células cancerígenas, pode ser medida in vitro em um ensaio clonogênico. Um ensaio clonogênico é uma técnica de microbiologia para estudar a eficácia de agentes específicos sobre a sobrevivência e proliferação das células. É frequentemente usado em laboratórios de pesquisa do câncer para determinar o efeito de drogas ou radiação na proliferação de células tumorais. A experiência envolve três etapas principais: (i) aplicação de um tratamento de uma amostra de células, nomeadamente, em células cancerosas, (ii) plaqueamento das células em um vaso de cultura de tecidos e (iii) permitir que as células cresçam. As colônias produzidas são fixadas, coradas e contadas. A formação de colônias é de importância no que diz respeito à formação de metástases de células tumorais individuais colonizando órgãos. A atividade inibidora dos anticorpos indica o seu potencial na supressão da formação de metástases. Os anticorpos que têm a atividade de inibir ou reduzir a formação de colônias em um ensaio clonogênico são particularmente úteis para tratar ou prevenir a metástase e a disseminação metastática de células de câncer, em particular, dos tipos de câncer aqui mencionados.
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[0038] Em concretizações preferidas, o anticorpo exibe um ou mais funções efetoras imunológicas contra uma célula possuindo CLDN6 na sua conformação nativa, em que as funções de um ou mais imunes efetoras são preferivelmente selecionados a partir do grupo consistindo de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), celular dependente de anticorpo citotoxicidade mediada (ADCC), indução de apoptose e inibição da proliferação, de preferência, as funções efetoras são ADCC e / ou CDC.
[0039] Preferivelmente, a referida uma ou mais atividades ou uma ou mais funções efetoras imunes exibidas pelo referido anticorpo são induzidas pela ligação do referido anticorpo à CLDN6, de preferência, a um epítopo localizado dentro de uma porção extracelular de CLDN6, em que a referida porção extracelular do CLDN6 compreende, de preferência, a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferência, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, mais preferivelmente a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0040] De acordo com a invenção, uma célula que expressa CLDN6 é, de preferência, caracterizada por associação de CLDN6 com a sua superfície celular. Uma célula que expressa CLDN6 ou uma célula possuindo CLDN6 na sua conformação nativa é, de preferência, uma célula tumoral, tal
20/237 como uma célula de câncer, de preferência, uma célula de câncer a partir de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e de teratocarcinoma de ovário, câncer de pulmão incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em especial, o carcinoma pulmonar de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, em particular, carcinoma de células basais e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular, ademona maligno pleomórfico, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinosarcoma, câncer do duto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular, carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma de células renais papilífero, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinal e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, seminoma testicular, em particular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumor de células germinativas, tais como um ou um teratocarcinoma carcinoma embrionário, em
21/237 particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes.
[0041] O anticorpo da invenção pode ser ligado a uma ou mais porções efetoras terapêuticas, por exemplo, radiomarcadores, citotoxinas, enzimas, agentes terapêuticos que induzem a apoptose, e semelhantes, a fim de proporcionar a citotoxicidade alvo, ou seja, morte de células tumorais.
[0042] Em uma concretização, o anticorpo da presente invenção (i) liga-se a células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação a CLDN6 com sua superfície celular, e (ii) não se ligam a células que não expressam CLDN6 e não sendo caracterizado por associação com a sua CLDN6 de superfície celular. O anticorpo da invenção, de preferência, (i) medeia matar e / ou inibe a proliferação de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular, e (ii) não medeia matam e / ou não inibem a proliferação de células não CLDN6 expressando e não sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
[0043] Em concretizações preferidas particulares, o anticorpo da invenção liga-se a epítopos nativos da CLDN6 presentes na superfície de células vivas, tais como os da SEQ ID NO: 6 ou 7. Em outras concretizações preferidas, o anticorpo da invenção é específico para CLDN6- expressando as células cancerosas e não se liga às células cancerosas que
22/237 não expressam CLDN6.
[0044] Os anticorpos da invenção podem ser derivados de espécies diferentes, incluindo, mas não limitado a camundongo, rato, coelho, cobaia e humano. Os anticorpos da invenção também incluem moléculas quiméricas, nas quais uma região constante de anticorpo derivados a partir de uma espécie humana, de preferência, é combinado com o local de ligação do antígeno derivada de uma outra espécie. Além disso, os anticorpos da invenção incluem moléculas humanizadas, em que os locais de um anticorpo deriva de uma espécie não humana de ligação ao antígeno são combinadas com as regiões constantes e de estrutura de origem humana.
[0045] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais e incluiem anticorpos IgG2a (por exemplo, IgG2a, κ, λ), IgG2b (por exemplo, IgG2b, κ, λ), IgG3 (por exemplo, IgG3, κ, λ) e IgM. No entanto, outros isotipos de anticorpos também estão englobados pela invenção, incluindo IgGl, iGal, IgA2, IgA secretório, IgD, e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos completos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, incluindo, por exemplo, Fab, F (ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadeia única ou anticorpos biespecíficos. Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno incluem proteínas de fusão de imunoglobulina que se liga ao domínio compreendendo (i) um domínio de ligação polipeptídicos (tais como, uma região
23/237 variável da cadeia pesada ou de uma região variável da cadeia leve) que está fundido com um polipeptídeo da região de charneira de imunoglobulina, (ii) uma imunoglobulina pesada CH2 da região constante da cadeia fundida com a região charneira, e (iii) uma cadeia pesada de imunoglobulina CH3 da região constante fundido com a região constante do CH2. Tais proteínas de fusão de imunoglobulina do domínio binding- são ainda descritas em US2003/0118592 e US 2003/0133939.
[0046] O anticorpo da presente invenção é, de preferência, um anticorpo monoclonal, quimérico, anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo. Os anticorpos da invenção incluem anticorpos completamente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos em um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico capaz de produzir vários isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLDN6 por sofrer recombinação VDJ e troca de isotipo. Tal animal transgênico pode também ser um coelho transgênico para a produção de anticorpos policlonais, tais como divulgado no documento US 2003/0017534.
[0047] Os anticorpos da presente invenção, de preferência, dissociam-se da CLDN6 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 1-100 nM ou menos. De um modo preferido, os anticorpos da invenção não reagem de forma cruzada com antígenos da superfície celular disponíveis e, portanto, não inibem a sua função.
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[0048] Em concretizações preferidas, os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades:
a) especificidade para CLDN6;
b) uma afinidade de ligação para CLDN6 de cerca de 100 nM ou menos, de preferência, de cerca de 5 - 10 nM ou menos e, mais preferivelmente, cerca de 1 - 3 nM ou menos,
c) capacidade para induzir a CDC de células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
d) capacidade de inibir o crescimento de células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
e) capacidade de induzir apoptose de células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
f) capacidade para induzir a adesão homotípica das células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
g) capacidade para induzir ADCC das células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células na presença de células efetoras;
h) capacidade de prolongar a sobrevivência de um sujeito com células tumorais que expressam CLDN6 e são caracterizados
25/237 pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
i) a capacidade de destruir as células que expressam CLDN6 e são caracterizados pela associação de CLDN6 com sua superfície celular;
h) capacidade de agregar CLDN6 na superfície de células vivas.
[0049] Um anticorpo preferido aqui descrito é um anticorpo produzido por ou obtenível a partir de uma célula de hibridoma depositadas no DSMZ (Inhoffenstr 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha) E ter uma das seguintes denominações e números de acesso:
1. GT512muMAB 59A, No de Acesso. DSM ACC3067,
depositado em 21 de junho de 2010;
2. GT512muMAB 60A, No de Acesso. DSM ACC3068,
depositado em 21 de junho de 2010;
3. GT512muMAB 6ID, No de Acesso DSM ACC3069,
depositado em 21 de junho de 2010;
4. GT512muMAB 64A, No de Acesso DSM ACC3070,
depositado em 21 de junho de 2010;
5. GT512muMAB 65A, No de Acesso DSM ACC3071,
depositado em 21 de junho de 2010;
6. GT512muMAB 66B, No de Acesso DSM ACC3072,
depositado em 21 de junho de 2010;
7. GT512muMAB 67 A, No de Acesso DSM ACC3073.
depositada em 21 de junho de 2010;
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8. GT512muMAB 55A, No de Acesso DSM ACC3089, depositado em 31 de agosto de 2010; ou
9. GT512muMAB 89A, No de Acesso DSM ACC3090, depositado em 31 de Agosto, 2010.
[0050] Os anticorpos da invenção são aqui designados por referindo-se a designação de anticorpo e / ou por referência com o clone que produz o anticorpo, por exemplo, muMAb 59A.
[0051] Outros anticorpos preferidos são aqueles que possuem a especificidade dos anticorpos produzidos pelos e que podem ser obtidos a partir dos hibridomas acima descritos e, em, em particular, os que compreendem um antígeno ou porção de ligação de antígenos de ligação, em particular, uma região variável, idêntica ou altamente homóloga à dos anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos. É contemplado que os anticorpos preferidos são aqueles que possuem regiões de CDR ou idênticas ou altamente homólogas com as regiões de anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos. Por altamente homólogos é contemplado que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas em cada uma das regiões CDR. Os anticorpos, particularmente, preferidos são as formas quimerizada e humanizadas dos anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos.
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[0052] Assim, um anticorpo da invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de (i) um anticorpo produzido por ou obtenível a partir de um clone depositado sob o n° de acesso a. DSM ACC3067 (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A), ou DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), (ii) um anticorpo que é uma forma humanizada quimerizada ou do anticorpo em (i), (iii) um anticorpo que tem a especificidade do anticorpo sob (i) e (iv) um anticorpo que compreende a porção de ligação ao antígeno ou local de ligação ao antígeno do anticorpo em (i). A porção ou local de ligação ao antígeno do anticorpo de ligação em (i) antígeno pode compreender a região variável do anticorpo em (i).
[0053] A presente invenção também se refere a uma célula, tal como uma célula de hibridoma que produz um anticorpo como aqui descrito.
[0054] As células de hibridoma são preferidas aqueles depositados na DSMZ (Inhoffenstr 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha), e ter uma das seguintes denominações e números de acesso:
1. GT512muMAB 59A, No de Acesso. DSM ACC3067, depositado em 21 de junho de 2010;
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2. GT512muMAB 60A, No de Acesso DSM ACC3068, depositado
em 21 de junho de 2010;
3. GT512muMAB 61D, No de Acesso. DSM ACC3069, depositado
em 21 de junho de 2010;
4. GT512muMAB 64A, No de Acesso. DSM ACC3070, depositado
em 21 de junho de 2010;
5. GT512muMAB 65 A , No de Ace sso. DSM ACC3071,
depositado em 21 de junho de 2010;
6. GT512muMAB 66B, No de Acesso DSM ACC3072, depositado
em 21 de junho de 2010;
7. GT512muMAB 67A, No de Acesso DSM ACC3073. depositado
em 21 de junho de 2010;
8. GT512muMAB 55A, No de Acesso DSM ACC3089, depositado
em 31 de agosto de 2010 ; ou
9. GT512muMAB 8 9A, No de Acesso DSM ACC3090,
depositado em 31 de Agosto, 2010.
[0055] Os anticorpos anti-CLDN6 da presente invenção podem ser derivatizados, ou ligados a co-expressão de outras especificidades de ligação. Em uma concretização particular, a invenção proporciona um ou molécula biespecífica e multiespecífico que compreende pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLDN6 (por exemplo, um anticorpo anti-CLDN6 ou mimético), e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efetora, tal como uma especificidade de ligação para um receptor de Fc (por
29/237 exemplo, um receptor Fc-gama, tais como Fc RI-gama, ou qualquer outro receptor de Fc) ou um receptor de células T, por exemplo, CD3.
[0056] Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficos que se ligam a ambos CLDN6 e a um receptor Fc ou um receptor de células T, por exemplo, CD3. Exemplos de receptores de Fe de IgG são de receptor, receptor de Fc-gama (FcyR), tais como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16). Outros recetores Fc, tais como receptores de IgA (por exemplo, Fc RI), também pode ser alvejado. O receptor Fc é, de preferência, localizado na superfície de uma célula efectora, por exemplo, um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear activado. Em uma concretização preferida, a moléculas biespecíficas e multiespecíficos se ligar a um receptor Fc em um local que é diferente da Fc de imunoglobulina (por exemplo, IgG ou IgA), local de ligação do receptor. Por conseguinte, a ligação das moléculas biespecíficas e multiespecíficos não é bloqueada por níveis fisiológicos de imunoglobulinas.
[0057] Em ainda outro aspecto, os anticorpos antiCLDN6 da invenção são derivados, ligados ou co-expressados com outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab'). Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação
30/237 não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico), uma citotoxina, ligante celular ou antígeno (por exemplo, para produzir um imunoconjugado, tal como uma imunotoxina). Um anticorpo da presente invenção pode estar ligado a outras porções terapêuticas, por exemplo, um radioisótopo, um pequeno fármaco de molecula anti-câncer, uma citocina ou quimiocina recombinante. Por conseguinte, a presente invenção abrange uma grande variedade de conjugados de anticorpo biespecífico e multiespecíficos, moléculas e proteínas de fusão, os quais se ligam a células que expressam CLDN6 e / ou para as células sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular e que podem ser utilizados para outras moléculas alvo para tais células.
[0058] De um modo geral, para os fins da presente invenção, todos os derivados de anticorpos, tais como conjugados de anticorpos, moléculas biespecífica e multiespecífica, e proteínas de fusão descritas aqui são englobadas pelo termo anticorpo.
[0059] Em um outro aspecto, a invenção também prevê proteínas de ligação CLDN6 derivados de domínios nãoimunoglobulina, em especial, proteínas de cadeia simples. Tais proteínas e métodos para a sua produção de ligação encontram-se descritos, por exemplo, em Binz et al. (2005)
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Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, aqui incorporada por referência. É para ser entendido que os ensinamentos aqui dados com respeito a imunoglobulina ou moléculas de ligação de imunoglobulina derivada correspondentemente também se aplica a moléculas de ligação derivados de domínios não imunoglobulina. Em particular, o uso de tais moléculas de ligação derivados de domínios não imunoglobulina é possível bloquear CLDN6 de células que expressam o referido alvo e sendo caracterizado por associação do referido alvo com a sua superfície celular e, portanto, para produzir efeitos terapêuticos, como aqui revelados para anticorpos da invenção, em particular, a inibição de uma ou mais atividades de células tumorais como descrito aqui, tal como a proliferação. Embora não seja obrigatório, é possível conferir funções efetoras dos anticorpos para moléculas de ligação como não imunoglobulina, por exemplo, por fusão com a região Fc do anticorpo.
[0060] A presente invenção abrange de uma forma geral o tratamento e / ou diagnóstico de doenças, em particular, doenças tumorais, por direcionamento a CLDN6 expressado pelas células e que está sendo associado com a superfície das células. Estes métodos proporcionam para a detecção seletiva e / ou erradicação de tais células, minimizando, assim, os efeitos adversos para as células normais que não expressam CLDN6 e não sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a
32/237 sua superfície celular. Doenças preferidas para uma terapia ou diagnóstico são aquelas em que as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular estão envolvidos, tais como doenças tumorais, em particular, doenças cancerígenas, tais como aqueles aqui descritos.
[0061] Em um aspecto, a invenção proporciona composições, por exemplo, composições farmacêuticas e kits de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou uma combinação de anticorpos da presente invenção. Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um transportador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, pode compreender um ou mais adjuvantes, estabilizadores, etc. Em uma concretização particular, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epítopos diferentes ou que possuem características funcionais distintas, tais como indução de CDC e / ou ADCC e indução de apoptose. Nesta concretização da invenção, os anticorpos podem ser usados em combinação, por exemplo, como uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos monoclonais anti-CLDN6. Por exemplo, os anticorpos anti-CLDN6 possuindo atividades diferentes, mas complementares podem ser combinados em uma única terapia para alcançar um efeito terapêutico desejado. Em uma concretização preferida, a composição inclui um anticorpo anti-CLDN6 que medeia CDC combinado com outro
33/237 anticorpo anti-CLDN6 que induz a apoptose. Em uma outra concretização, a composição inclui um anticorpo anti-CLDN6 que medeia a morte altamente eficaz de células alvo na presença de células efetoras, combinada com outro anticorpo anti-CLDN6 que inibe o crescimento das células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular.
[0062] A presente invenção também inclui a administração simultânea ou sequencial de dois ou mais anticorpos anti-CLDN6 da invenção, em que, preferivelmente, pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo antiCLDN6 quimérico e pelo menos um outro anticorpo é um anticorpo anti-humano CLDN6, os anticorpos de ligação para os mesmos ou diferentes epítopos de CLDN6. De um modo preferido, um anticorpo quimérico CLDN6 da invenção é administrado primeiro seguido pela administração de um anticorpo antihumano CLDN6 da invenção, em que o anticorpo anti-humano CLDN6 é administrado de preferência por um período de tempo prolongado, isto é, como terapia de manutenção.
[0063] Anticorpos, conjugados, moléculas biespecífico / multiespecíficos e composições da presente invenção pode ser usada em uma variedade de métodos para inibir o crescimento de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular e / ou matar seletivamente as células que expressam
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CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular através do contato das células com uma quantidade eficaz do anticorpo, conjugado, moléculas biespecíficas / ou multiespecífico, composição, de tal modo que o crescimento da célula é inibida e / ou a célula é morta. Em uma concretização, o método inclui a morte de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células, opcionalmente na presença de células efetoras, por exemplo, por CDC, apoptose, ADCC, a fagocitose, ou por uma combinação de dois ou mais destes mecanismos. As células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície celular que podem ser inibidos ou mortos utilizando os anticorpos da presente invenção incluem células cancerosas.
[0064] Anticorpos, conjugados, moléculas biespecíficas / multiespecíficas e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar e / ou prevenir uma variedade de doenças que envolvem as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular por administração dos anticorpos para os pacientes que sofrem a partir de tais doenças. Exemplos de doenças que podem ser tratadas (por exemplo, melhoradas) ou prevenidas, incluem, mas não estão limitadas a, doenças tumorais. Exemplos de doenças tumorais, que podem ser
35/237 tratadas e / ou prevenidas, incluem doenças cancerosas, tais como o câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e de teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular carcinoma epidermóide de pulmão de células e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em especial, carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer renal, em particular, carcinoma de células renais incluindo carcinoma das células renais claras e carcinoma de célula renal papilar, câncer do cólon, o câncer do intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, o câncer cervical, câncer testicular, em particular, seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, um tumor de células germinativas, tais como um ou um teratocarcinoma carcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas
36/237 metastáticas destes.
[0065] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou desordem envolvendo células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células, compreendendo a administração a um sujeito o anticorpo, conjugado, moléculas biespecíficas / multiespecíficas ou composição da invenção. De preferência, a doença ou desordem é uma doença relacionada com tumor e em concretizações particulares é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e de teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), em particular, carcinoma de pulmão de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em especial, carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, do sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do ducto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma da célula de transição e carcinoma papilar, câncer renal, em particular carcinoma de célula renal, incluindo células de carcinoma de células renais claras e célula renal papilar carcinoma, câncer de
37/237 cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequeno adenocarcinoma intestinal e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, o câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário , câncer uterino, tumor de células germinativas, tais como um ou um teratocarcinoma carcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes. CLDN6 é de preferência expressa na superfície das referidas células.
[0066] A invenção pode envolver a utilização dos agentes e composições aqui descritas para o tratamento profilático e / ou terapêutico de doenças tumorais, isto é, para o tratamento de um paciente possuindo uma doença tumoral ou estando em risco de desenvolver uma doença tumoral. Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para inibir o crescimento de tumores compreendendo a administração de um ou mais dos agentes e composições aqui descritos.
[0067] De preferência, os agentes e as composições aqui descritos são administrados de uma forma, tal que a substância terapeuticamente ativa é entregue ou substancialmente não entregue a um tecido ou órgão, em que as células, quando o tecido ou órgão seja livre de tumores expressando CLDN6 e caracterizam-se por associação de CLDN6
38/237 com a sua superfície celular, tais como o tecido da placenta ou placenta. Para este fim, os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados localmente.
[0068] Em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo, tal como aqui descrita para utilização nos métodos de tratamento aqui descritos. Em uma concretização, a invenção proporciona uma composição farmacêutica, tal como aqui descrita para utilização nos métodos de tratamento aqui descritos.
[0069] Em uma concretização particular da invenção, o sujeito sendo administrado com o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente quimioterapêutico, radiação, ou um agente que modula, por exemplo, melhora ou inibe, a expressão ou a atividade de um receptor de Fc, por exemplo, um receptor Fc-gama, tal como uma citocina. Citocinas típicas para administração durante o tratamento incluem o fator de estimulação de colônias de granulócitos-(G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ), e fator de necrose tumoral (TNF) . Agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluorouracilo, metotrexato, ciclofosfamida e gemzitabin.
[0070] Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma estratégia de vacinação para imunização de animais não
39/237 humanos, tais como camundongos com CLDN6 humano ou um seu fragmento de peptídeo para se obter anticorpos. Os peptídeos preferidos para a imunização são aqueles selecionados de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, e os peptídeos imunologicamente equivalentes.
[0071] Animais transgênicos não humanos bem como de tipo selvagem podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno CLDN6 ou um seu fragmento de peptídeo e / ou ácidos e / ou células expressando CLDN6 nucleico ou um seu fragmento de peptídeo.
[0072] De preferência, o animal não humano transgênico é capaz de produzir vários isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLDN6 (por exemplo, IgG, IgA e / ou IgM), passando por recombinação VDJ e troca de isotipo. Comutação de isotipo pode ocorrer, por exemplo, clássica ou comutação isótipo não-clássica.
[0073] Assim, em ainda outro aspecto, a invenção proporciona células B isoladas de um animal não-humano, como descrito acima. As células B isoladas podem ser imortalizadas por fusão de uma célula imortalizada para proporcionar uma fonte (por exemplo, um hibridoma) de anticorpos da invenção. Tais hibridomas (isto é, que produzem os anticorpos da invenção) também estão incluídos dentro do escopo da invenção.
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[0074] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a métodos para diagnóstico, detecção ou monitoração de uma doença tumoral, compreendendo a detecção e / ou determinação da quantidade de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular em uma amostra biológica isolada a partir de um paciente, utilizando um anticorpo da invenção. A amostra biológica pode ser isolada a partir de um doente com uma doença neoplásica, suspeito de ter ou de adoecer com uma doença tumoral ou ter um potencial para uma doença tumoral.
[0075] Em uma concretização do método para o diagnóstico, monitoração ou detecção de uma doença de tumor de acordo com a invenção, uma amostra biológica e / ou uma amostra de controle / referência é de um tecido ou órgão correspondente ao tecido ou órgão que está a ser diagnosticado, detectado ou monitorizados em relação ao afecto por uma doença tumoral, por exemplo, a doença de tumor que está a ser diagnosticado, detectado ou é monitorizada câncer do ovário e a amostra biológica e / ou amostra de controle e/ou amostra de referência é o tecido do ovário. Tais tecidos e órgãos são aqui descritos, por exemplo, em ligação com as doenças tumorais e diferentes tipos de câncer.
[0076] Em uma concretização dos métodos para diagnóstico, detecção ou monitoração de uma doença tumoral a amostra biológica é de um tecido ou órgão, em que as células,
41/237 quando o tecido ou órgão seja livre de tumores não expressam substancialmente CLDN6 e não são caracterizados pela associação de substancial CLDN6 com a sua superfície celular. Preferivelmente, o dito tecido é um tecido que não seja de tecido de placenta.
[0077] Tipicamente, o nível de uma molécula de alvo em uma amostra biológica é comparado com um nível de referência, em que um desvio a partir do referido nível de referência é indicativo da presença e / ou da fase de uma doença tumoral em um sujeito. O nível de referência pode ser um nível tal como determinado em uma amostra de controle (por exemplo, a partir de um tecido saudável ou sujeiro) ou um nível médio de indivíduos saudáveis. Um desvio a partir do referido nível de referência designa qualquer alteração significativa, tal como um aumento ou diminuição de pelo menos 10%, 20%, ou 30%, preferivelmente, em pelo menos 40% ou 50%, ou mesmo mais. De preferência, a presença de células que expressam ou CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula em que a referida amostra biológica ou uma quantidade de células que expressam ou CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula em que a amostra biológica é aumentada em comparação com um nível de referência indica a presença de uma doença tumoral.
[0078]
Tipicamente, a detecção e / ou determinação da
42/237 quantidade nos métodos da invenção envolve o uso de anticorpos marcados que se ligam especificamente a uma molécula alvo.
[0079] Em um aspecto particular, a invenção refere-se a um método para detecção, ou seja, a determinação da posição ou sítio, de uma doença tumoral, por exemplo, um tecido ou órgão particular, o qual compreende a administração de um anticorpo do presente invenção, o qual é acoplado a um marcador detectável para um paciente. Rotulagem de um tecido ou órgão no referido paciente pode indicar a presença ou o risco de uma doença de tumor, em que o referido tecido ou órgão.
[0080] Como aqui exemplificado, os anticorpos da invenção podem ser obtidos diretamente a partir de hibridomas que expressam o anticorpo, ou podem ser clonadas e expressas de forma recombinante em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO ou uma célula linfocítica). Outros exemplos de células hospedeiras são microrganismos, tais como E. coli, e os fungos, tais como leveduras. Alternativamente, eles podem ser produzidos de forma recombinante em um animal ou vegetal não-humano transgênico. No entanto, a presente invenção prevê também a concretizações em que os anticorpos são produzidos por imunização ou vacinação utilizando estratégias de imunização, tal como aqui divulgado in situ em um paciente.
[0081]
A presente invenção também se refere a ácidos
43/237 nucleicos que compreendem os genes ou sequências de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, ou partes destes, por exemplo, uma cadeia de anticorpo, como aqui descrito. Os ácidos nucleicos podem ser incluídos em um vector, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago ou outro vector utilizado, por exemplo, convencionalmente, em engenharia genética. O vector pode compreender outros genes, tais como genes marcadores que permitem a selecção do vector em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vector pode compreender elementos de controle da expressão que permitem a expressão correcta das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controle são conhecidos do perito e podem incluir um promotor, um cassete de splice, e um códon de iniciação da tradução.
[0082] De preferência, o ácido nucleico da invenção está operacionalmente ligado às sequências de controle de expressão acima, permitindo a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Os elementos de controle que asseguram a expressão em células eucariotas ou procariotas são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto.
[0083] Os métodos para a construção de moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, para a construção de vetores que compreendem as moléculas de ácido nucleico acima, para a introdução dos vetores em células
44/237 hospedeiras apropriadamente escolhidas, para causar ou alcançar a expressão são bem conhecidos no estado da técnica.
[0084] Um outro aspecto da presente invenção referese a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou vetor, tal como aqui divulgado.
[0085] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0086] A Fig. 1 é o alinhamento da Sequência CLDN3, CLDN4, CLDN6 e CLDN9.
[0087] A Fig. 2 mostra a análise por imunofluorescência de soros obtidos de camundongos imunizados para produzir anticorpos específicos de CLDN6.
(A) Células não fixadas CHO-K1 co-transfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN6 humano e GFP, respectivamente, foram sondados com um anticorpo monoclonal anti- CLDN6 de camundongo (R & D Systems, MAB3656). CLDN6 está localizada na membrana plasmática das células transfectadas e podem ser direcionados em células vivas por meio de anticorpos específicos.
(B) O soro de um rato com base no qual o hibridoma F36C3-H8 foi produzido continham anticorpos que se ligam a CLDN6 na superfície de células CHO não fixada Kl cotransfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN6 humano
45/237 e GFP.
[0088] A Fig. 3. Mostra a análise de Western blot para ensaiar a expressão endógena de proteínas claudina em células HEK293T.
[0089] Os lisados de proteína das células HEK293T transfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN3, CLDN4, CLDN6, e CLDN9, respectivamente, ou falsamente transfectadas foram testados por Western blot utilizando anti-CLDN3 disponível comercialmente (A) (Invitrogen, Cat No. 34-1700), anti-CLDN4 (A) (Zymed, 32-9400), anti-CLDN6 (A) (ARP, 01-8865) e anticorpos (Santa Cruz, sc-17672) anti-CLDN9 (A). O anticorpo detectou a expressão dos seus alvos correspondentes apenas nos respectivos transfectantes HEK293T. Nenhuma expressão endógena de qualquer destas claudinas foi observada em células não-transfectadas HEK293T.
[0090] A Fig. 4 mostra a citometria de fluxo para análise de ensaiar a especificidade dos anticorpos anti-CLDN disponíveis comercialmente.
[0091] A ligação de anticorpos anti-CLDN disponíveis comercialmente para HEK293T células transfectadas com ácidos nucleicos que codifica CLDN3, CLDN4, CLDN6, e CLDN9, respectivamente, ou não transfectadas foi determinada por citometria de fluxo. Apenas o anticorpo anti-CLDN3 disponível comercialmente é específico para o seu alvo.
[0092] A Figo. 5 mostra a análise de citometria de
46/237 fluxo para ensaio da especificidade dos anticorpos anti-CLDN preparados de acordo com a invenção.
[0093] A ligação de anticorpos em sobrenadantes de hibridoma a partir dos subclones monoclonais para células HEK293T co-trans tadas com um vector que codifica CLDN6, CLDN3, CLDN4 ou CLDN9 e um vector que codifica um marcador de fluorescência foi determinada por citometria de fluxo.
(A) Os anticorpos no sobrenadante do hibridoma monoclonal F3- subclone 6C3-H8 ligam-se especificamente a células transfectadas CLDN6 mas não para células transfectadas com CLDN3, CLDN4 e CLDN9, respectivamente. Em contraste, os anticorpos no sobrenadante do hibridoma monoclonal subclone F4-4F7-F2 ligam-se a células transfectadas com CLDN6 ou CLDN9. Os anticorpos presentes no sobrenadante do hibridoma monoclonal subclone F3-6C3-H8 também se ligam a células transfectadas com o (I143V) -SNP variante de CLDN6.
(B) Os anticorpos presentes no sobrenadante do hibridoma monoclonal subclone F3- 7B3 B4-se ligam a células transfectadas com CLDN6, CLDN3 ou CLDN9. Os anticorpos presentes no sobrenadante do hibridoma se ligam monoclonal subclone F3-3F7-A5 a células transfectadas com CLDN6, CLDN4 ou CLDN9.
[0094] A Fig. 6 mostra a especificidade de ligação de anticorpos monoclonal anti-CLDN6 de murino muMAb 59A, 60A,
47/237
61D, 64A, 65A, 66B e 67A.
[0095] A ligação dos anticorpos anti-CLDN6 para CLDN6 humano, 3, 4, 9 e o CLDN6 SNP (polimorfismo de nucleótido único) 43V variante II foi analisada por citometria de fluxo utilizando células que expressam transitoriamente o HEK293T claudina humano correspondente. HEK293T foram cotransfectadas com um marcador de fluorescência para distinguir entre as células não transfectadas (população Ql e Q3) e transfectadas (população Q2 e Q4). A concentração do anticorpo utilizado foi o de que a concentração de ligação para CLDN6 saturado (25 ug / ml) . A expressão de CLDN6 humano, 3, 4, 9 e CLDN6-SNP (I143V) foi confirmada com anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente contra Claudina-6 humano (R & D Systems, MAB3656), humano Claudina-3 (R & D Systems, MAB4620) e Claudina humano -4 (R & D Systems, MAB 4219).
[0096] A Fig. 7 mostra afinidades relativas de antiCLDN6 murino de anticorpos monoclonais muMAb 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B e 67 A.
[0097] Para determinar as afinidades relativas da ligação de anticorpos anti-CLDN6 para CLDN6 humano estavelmente expressos na superfície de células HEK293 que foram analisadas por citometria de fluxo. Na experiência de ligação de saturação a concentração dos anticorpos foi representada graficamente contra os sinais de FACS (mediana
48/237 da intensidade de fluorescência) . O EC50 (concentração de anticorpo que se liga a metade dos sítios de ligação no equilíbrio) foi calculada por regressão não linear. Os anticorpos específicos para CLDN6 muMAb 59 A, 60 A, 6 de identificação, 64 A, 65 A, 66B e 67 A não apresentaram valores muito baixos de CE50 (EC50 200-500 ng / ml) e saturação da ligação foi conseguida a baixas concentrações.
[0098] A Fig. 8 mostra a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de atividade do anticorpo monoclonal antiCLDN6 murino muMAb 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B e 67A.
[0099] A atividade CDC de anticorpos anti-CLDN6 foi analisada usando um ensaio dependente de luciferase- para detectar ATP endógeno de células não lisadas. Portanto, as células CHO-K1 que expressam estavelmente CLDN6 humano foram tratadas com diferentes concentrações de muMAc 59A, 60A, ID 6, 64A, 65 A, 66B e 67 A. muMAb 59 A, 60 A, 6 ID, 64 A, 65 A, 66B e 67A exibiram atividade de CDC dependente da dose e CDC induzida em concentrações baixas.
[00100] A Fig. 9 mostra a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de anticorpos monoclonais de murino anti-CLDN6 muMAb 65A e 66B em endogenamente CLDN6 expressar NEC8 e NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 knock-down) células.
[00101] Os anticorpos anti-CLDN6 muMAb 65A e 66B CDC induzida em células NEC8 de uma forma dependente da dose. Especificidade alvo de muMAb 65A e 66B foi provado usando
49/237
NEC8 LVTS2 54 células (CLDN6 knock-down).
[00102] A Fig. 10 mostra o efeito terapêutico de muMAb 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B e 67A em um modelo de xenotransplante início de tratamento utilizando camundongos enxertados com o NEC8 linha de células tumorais.
[00103] O modelo utilizado endogenamente CLDN6 expressar xenografts NEC8 em atímica Nude-Foxnl ratos. Em comparação com o grupo controle salina muMAb 59A, 60A, 6 ID, 64 A, 65 A, 66B e 67A mostraram inibição do crescimento do tumor em camundongos enxertados com NEC 8 células.
[00104] A Fig. 11 mostra a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos Chimab anti-CLDN6 61D, 64A, 67A e 89A.
[00105] A ligação dos anticorpos anti-CLDN6 para CLDN6 humano, 3, 4 e 9, respectivamente, foram analisadas por citometria de fluxo utilizando células HEK293 que expressam estavelmente o claudina humano correspondente. A concentração do anticorpo utilizado foi o de que a concentração saturada de ligação (25 pl). A expressão de CLDN3 humana, 4, 6 e 9 foi confirmada com anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente contra Claudina-3 humano (R & D Systems, MAB4620) e Claudina-4 humana (R & amp; D Systems, MAB 4219), e o CLDN6 / 9 reactivo murino anticorpo monoclonal muMAb 5F2D2, respectivamente. O controle negativo foi realizado sob condições idênticas sem anticorpo primário.
50/237
[00106] A Fig. 12 mostra as afinidades relativas de anticorpos anti-CLDN6 quimérico a anticorpos monoclonais CHIMAB 61D, 64A, 67A e 89A para células HEK293-CLDN6.
[00107] Para determinar as afinidades relativas da ligação de anticorpos anti-CLDN6 para CLDN6 humano estavelmente expressos na superfície de células HEK293 que foram analisadas por citometria de fluxo. Na experiência de ligação de saturação a concentração dos anticorpos foi representada graficamente contra os sinais de FACS (mediana da intensidade de fluorescência). A EC50 (concentração de anticorpo que se liga a metade dos sítios de ligação no equilíbrio) foi calculada por regressão não linear. Os anticorpos específicos de CLDN6 CHIMAB 64A e 89A muito baixas exibiram valores de EC50 (EC50 de 450-600 ng / ml) e a saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações. Chimab 67A e 61 D apresentaram baixos (EC50 1000 ng / ml) e médio (EC50 2300 ng / ml) valores de EC50, respectivamente.
[00108] A Fig. 13 mostra as afinidades relativas de anticorpos anti-CLDN6 quimérico a anticorpos monoclonais CHIMAB 61D, 64A, 67A e 89A para células NEC8.
[00109] Para determinar as afinidades de ligação dos anticorpos anti-CLDN6 a células tumorais que expressam endogenamente ligação à linhagem de células do câncer testicular NEC8 foi analisada por citometria de fluxo CLDN6 humano. Os anticorpos específicos de CLDN6 CHIMAB 64 A e 89 A
51/237 exibiram valores muito baixos de EC50 (EC50 de 600-650 ng / ml) e a saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações, ao etapa que CHIMAB 61D e 67 mostraram uma média (EC50 1700 ng / ml) e alta (EC50 6100 ng / ml) Os valores de EC50, respectivamente.
[00110] A Fig. 14 mostra as afinidades relativas de anticorpos monoclonais quiméricos Chimab anti-CLDN6 61D, 64A, 67A e 89A para células OV90.
[00111] Para determinar as afinidades de ligação dos anticorpos anti-CLDN6 a células tumorais que expressam endogenamente ligação à linhagem celular do câncer do ovário OV90 foi analisada por citometria de fluxo CLDN6 humano. Os anticorpos específicos de CLDN6 CHIMAB 64A e 89A muito baixas exibiram valores de EC50 (EC50 550-600 ng / ml) e a saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações. CHIMAB 61D e 67A mostraram valores de EC50 média (CE50 1,500 ng / ml e 2300 EC50 ng / ml, respectivamente).
[00112] A Fig. 15 mostra a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de anticorpos monoclonais Chimab quiméricos anti-CLDN6 61D, 64A, 67A e 89A em células NEC8 e NEC8 tipo selvagem knock-down.
[00113] A atividade CDC de anticorpos anti-CLDN6 foi analisada usando um ensaio dependente de luciferase- para detectar ATP endógeno de células não lisadas. Portanto, as células de tipo selvagem NEC8 (NEC8 LVTS2 77) ectopicamente
52/237 expressando luciferase foram tratados com diferentes concentrações de Chimab 6 ID, 64 A, 67 A e 89 A. Em NEC-8 células Chimab 6 ID, 64A, 67 e 89A. A atividade exibiu CDC de uma forma dependente da dose, enquanto que em células NEC-8 CLDN6 knock-down (NEC8 LVTS2 54) nenhum destes anticorpos capazes de induzir lise de células inespecíficas. Este resultado indicou que as funções efetoras alvo específicas de CHIMAB 61D, 64A, 67A e 89A.
[00114] A Fig. 16 mostra a atividade citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 61D, 64A, 67A e 89A em células selvagens NEC8 e células knock-down NEC8.
[00115] A atividade de CCDA de anticorpos anti-CLDN6 foi analisado utilizando um ensaio de luciferase dependente de ATP endógeno para detectar dentro das células não lisadas. Portanto, células de tipo selvagem NEC-8 (NEC 8 LVTS2 77) foram tratados com diferentes concentrações de Chimab 61D, 64A, 67A e 89A. Chimab 61D, 64A, 67A e 89A apresentaram atividade ADCC dose-dependente e ADCC induzida mesmo em baixas concentrações de anticorpos. Para demonstrar células knock-down NEC8 especificidade alvo com um CLDN6 estável (NEC 8 LVTS2 54) foram utilizados.
[00116] A Fig. 17 mostra o efeito terapêutico de longa duração de anticorpos monoclonais anti-CLDN6 de murino muMAb 61D, 64A e 67A em um modelo de xenoenxerto de início de
53/237 tratamento utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular de tumor NEC8.
[00117] O modelo utilizado expressando endogenamente CLDN6 xenoenxertos NEC8 em atímicos ~ nu-FoxnJ u camundongos. Os camundongos foram tratados durante 46 dias com anticorpos específicos CLDN6. Após tratamento, o crescimento do tumor foi monitorizado durante 60 dias. Mesmo depois de parar os camundongos tratados com imunoterapia murino anticorpos monoclonais muMAb ID 6, 64A e 67 A não mostrou qualquer crescimento do tumor.
[00118] A Fig. 18 mostra efeito terapêutico do anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 89A em um modelo de xenoenxerto de início de tratamento utilizando camundongos enxertados com o NEC8 linha de células de tumor.
[00119] O modelo utilizado endogenamente CLDN6 expressar xenografts NEC8 em oxny Nude- atímica ratos. Scatter blots representam volumes de tumores enxertados em diferentes pontos de tempo durante o tratamento inicial de xenoenxertos NEC8 em atímicos nu-Foxnl camundongos. Em comparação com o grupo controle de solução salina muMAb 89A mostraram inibição do crescimento do tumor em camundongos enxertados com células NEC8 (A). Os ratos foram tratados durante 47 dias com PBS como um controle e o anticorpo específico CLDN6, respectivamente. O crescimento do tumor foi monitorado durante mais 51 dias. Em comparação com o controle
54/237 de PBS não foram detectáveis tumores em camundongos tratados com muMAB89A no final do estudo (B).
[00120] A Fig. 19 mostra o efeito terapêutico do anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 64A em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com o NEC8 linhagem de células de tumor.
[00121] Scatter blot representam volumes de tumores enxertados em momentos diferentes durante o tratamento de xenografts NEC8 avançados em atímicas Nude- oxn / ratos. A imunoterapia com o anticorpo anti-CLDN6 anticorpo monoclonal muMAb 64A mostraram uma inibição do crescimento do tumor de xenoenxertos NEC8 sólidos em comparação com ambos os grupos de anticorpos de controle e solução salina.
[00122] A Figo. 20 mostra o efeito de longo prazo dos níveis terapêuticos do anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 64A em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem de células NEC8 de tumor.
[00123] 15 dias após o enxerto, os camundongos foram tratados durante 45 dias com o anticorpo específico CLDN6 muMAb 64A. O crescimento do tumor foi monitorado durante mais 49 dias (A). O grupo de sobrevivência mostrou sobrevivência prolongada de camundongos tratados com o anticorpo específico CLDN6 muMAb 64 A (B).
[00124] A Fig. 21 mostra o efeito terapêutico de
55/237 anticorpos monoclonais murinos anti-CLDN6 muMAb 61D, 67A e 89A, em um modelo de tratamento avançado xenotransplante utilizando camundongos enxertados com a linhagem de células NEC8 tumorais.
[00125] Scatter blots representam volumes de tumores NEC8 enxertados em diferentes pontos de tempo durante o tratamento de xenoenxertos NEC8 avançada. Comparado com os grupos de controle de solução salina e de anticorpos a inibição do crescimento do tumor foi realizada com os anticorpos monoclonais de murino anti-CLDN6 muMAb 61D, 67A e 89A.
[00126] A Fig. 22 mostra o efeito terapêutico de longa duração de anticorpos monoclonais de murino anti-CLDN6 muMAb 61D, 67A e 89A em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 de tumor.
[00127] 17 dias após o enxerto, os ratos foram tratados durante 42 dias com os anticorpos específicos CLDN6 muMAb 61D, 67A e 89A. O crescimento do tumor foi monitorizado durante mais 49 dias (A). O grupo de sobrevivência mostrou sobrevivência prolongada de camundongos tratados com os anticorpos específicos CLDN6 muMAb 61D e 67A (B) .
[00128] A Figo. 23 mostra o efeito terapêutico de anticorpos monoclonais de murino anti-CLDN6 muMAb 64A e 89A, em um modelo de tratamento avançado com xenotransplante
56/237 utilizando camundongos enxertados com células tipo selvagem NEC8 e células knockdown NEC8 com um CLDN6 estável.
[00129] MuMAb 64A e 89A mostram apenas efeito terapêutico em camundongos enxertados com o tipo selvagem NEC8, mas não em camundongos enxertados com células NEC8 CLDN6 knock-alvo, demonstrando a especificidade dos anticorpos in vivo.
[00130] A Figo. 24 mostra a alta resolução de mapeamento epítopo Chimab 61D, 64A, 67A e 89A.
[00131] Os mutantes de alanina são denominados como tipo selvagem número resíduo de alanina ou de tipo selvagem como o resíduo número de glicina' no caso de tipo selvagem-alanina, onde os aminoácidos são apresentados no código de letra única. Os aminoácidos F35, G37, S39 e T33, possivelmente, do primeiro domínio extracelular do CLDN6 são importantes para a interação com as CLDN6 anticorpos quiméricos específicos CHIMAB D 61, 64A, 67 A e 89A. Resíduo 140 é essencial para a ligação de Chimab 89A e contribui para a ligação de Chimab 61D e 67A. Além disso, LI 51 do segundo domínio extracelular de CLDN6 contribui para a interação com Chimab 67A. Embora experimentos de imunofluorescência confirmou a expressão de CLDN6 mutantes P28A, W30A, G49A, L50A, W51A, C54A e C64A eles não mostraram coloração membraneous. Por esta razão, não podemos excluir a interação dos nossos anticorpos com estes aminoácidos. No total, o
57/237 epítopo identificado como aqui é consistente com a nossa estratégia de imunização usando DNA e peptídeos do domínio de ECL CLDN6.
[00132] A Figo. 25 mostra o alinhamento de sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de CLDN6 anticorpos específicos da presente invenção.
[00133] As sequências de CDR (HCDR1, HCDR2, e HCDR3) são delineadas por uma caixa.
[00134] A Fig. 26 mostra o alinhamento de sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve de CLDN6 anticorpos específicos da presente invenção.
[00135] As sequências de CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3) e são descritos por uma caixa.
[00136] A Fig. 27 mostra a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS.
[00137] A especificidade de ligação de anticorpos anti-CLDN6 foi analisada por citometria de fluxo utilizando células HEK293T transientemente transfectadas com CLDN6 humano, 3, 4 e 9, respectivamente. Para discriminar entre populações de células transfectadas e não transfectadas, as células foram co-transfectadas com um marcador de fluorescência como um repórter. A concentração do anticorpo utilizado foi o de que a concentração saturada de ligação (100 g / ml). A expressão de CLDN3 humana, 4, 6 e 9 foi
58/237 confirmada com anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente contra Claudina-3 humano (R & D Sistemas, MAB4620) e Claudina-4 humana (R & amp; D Systems, MAB4219), e o anticorpo monoclonal murino CLDN6 / 9 reactivo muMAb 5F2D2, respectivamente. Os anticorpos monoclonais quiméricos Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS mostrou ligação a CLDN6 sem interagir com CLDN3, 4 e 9, respectivamente.
[00138] A Fig. 28 mostra afinidades de ligação relativa de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUB para células HE K293-CLD1S6.
[00139] Para determinar as afinidades relativas da ligação de anticorpos anti-CLDN6 para CLDN6 humano estavelmente expressos na superfície de células HEK293 que foram analisadas por citometria de fluxo. Na experiência de ligação de saturação a concentração dos anticorpos foi representada graficamente contra os sinais de FACS (mediana da intensidade de fluorescência). A EC50 (concentração de anticorpo que se liga a metade dos sítios de ligação no equilíbrio) foi calculada por regressão não linear. Os anticorpos específicos de CLDN6 exibiram valores semelhantes de EC50 de baixo e de saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações.
[00140] A Fig. 29 mostra afinidades de ligação relativa de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6
59/237
Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUB para células NEC8 .
[00141] Para determinar as afinidades de ligação dos anticorpos anti-CLDN6 a células tumorais que expressam endogenamente ligação à linhagem de células do câncer testicular NEC8 foi analisada por citometria de fluxo CLDN6 humano. Em comparação com os anticorpos específicos para CLDN6 Chimab 64A, mAb206-subg e mAb206-SUBS a variante combinação de cadeia leve mAb206-LCC mostrou afinidade de ligação a tríplice forte para células NEC8. Em todos os casos, a ligação de saturação foi atingida em baixas concentrações.
[00142] A Fig. 30 mostra afinidades de ligação relativa de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUB para células OV9 0.
[00143] As afinidades de ligação dos anticorpos antiCLDN6 para a linhagem celular de câncer do ovário humano OV90 foi analisada por citometria de fluxo. Os anticorpos específicos para CLDN6 exibiram baixos valores de EC50 semelhantes. A variante combinação de cadeia leve mAb206-LCC mostrou a ligação mais forte a células OV90.
[00144] A Fig. 31A mostra a atividade de Citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC e
60/237 mAb206-subg sobre células NEC8 tipo selvagem e células NEC8 knock-down.
[00145] A atividade CDC de anticorpos anti-CLDN6 foi analisada usando um ensaio dependente de luciferase- para detectar ATP endógeno de células não lisadas. Portanto, as células de tipo selvagem NEC8 ectopicamente expressam luciferase foram tratados com diferentes concentrações de Chimab 64A, mAb206-LCC e mAb206-subg. Por células NEC-8, os anticorpos exibiram uma atividade CDC de uma forma dependente da dose, enquanto que as células em NEC-8 CLDN6 knock-down nenhum destes anticorpos foram capaz de induzir lise de células inespecíficas. Este resultado demonstrou funções efetoras alvo-específica Chimab 64A, mAb206-LCC e mAb206subg.
[00146] A Fig. 31b mostra a atividade de Citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUB em células NEC8.
[00147] Os anticorpos exibiram atividade de CDC de uma forma dependente da dose. Em comparação com Chimab 64A a substituição de aminoácidos variantes mAb206-subg e mAb206SUBS apresentaram atividades CDC semelhantes em células NEC8.
[00148] A Fig. 32a mostra a atividade de citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpos do anticorpo monoclonal quimérico anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb20661/237
LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS sobre NEC8 e células OV90.
[00149] A atividade de CCDA de anticorpos anti-CLDN6 foi analisado utilizando um ensaio de luciferase dependente de ATP endógeno para detectar dentro das células não lisadas. Portanto, as células NEC-8 e OV90 foram tratadas com diferentes concentrações de anticorpos quiméricos contra CLDN6. Todos os anticorpos apresentaram dependente da dose a actividade de ADCC e ADCC induzida, mesmo a baixas concentrações de anticorpos em ambas as linhagens celulares tumorais.
[00150] A Fig. 32b mostra a atividade de Citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpos do anticorpo monoclonal quimérico anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206LCC e mAb206-subg sobre células tipo selvagem NEC8 e células NEC8 knock-down.
[00151] Para demonstrar a especificidade alvo de células NEC8 knock-down foram usadas CLDN6 estável.
[00152] A Fig. 33 mostra o efeito terapêutico dos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com o linhagrm de células NEC8 de tumor.
[00153] O modelo utilizado nos xenoenxertos NEC8 atímicos nu-FoxnJ u camundongos. 17 dias após o enxerto, camundongos foram tratados com os anticorpos específicos
62/237
CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS e o crescimento do tumor foi monitorado. Marcas de dispersão representam volumes de tumores enxertada em diferentes momentos durante um tratamento avançado de enxerto NEC8 em camundongos. Em comparação com o grupo controle de anticorpos, o anticorpo monoclonal quimérico anti-CLDN6 mAb206-LCC, mAb206- subg e mAb206-SUB mostraram inibição do crescimento do tumor.
[00154] A Fig. 34 mostra o efeito terapêutico dos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com o linhagem de células tumorais NEC8.
[00155] Em comparação com a Figura 33 as curvas de crescimento são mostrando com mais detalhes que os anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 foram capazes de inibir o crescimento do tumor (A). O grupo de sobrevivência mostraram sobrevivência prolongada de camundongos tratados com anticorpos específicos CLDN6 (B).
[00156] A Fig. 35 mostra a alta resolução do mapeamento de epítopo de Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS.
[00157] Os mutantes de alanina são denominados como tipo selvagem número resíduo alanina, onde os aminoácidos são apresentados no código de letra única. Os aminoácidos F35, S39 e G37 e potencialmente T33 do primeiro domínio
63/237 extracelular do CLDN6 são importantes para a interação com os anticorpos quiméricos específicos CLDN6. Chimab 64A, mAb206LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS mostraram marcações idênticas.
[00158] A Fig. 36 mostra o efeito terapêutico do anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 64A em um modelo de metástases de xenoenxerto utilizando camundongos enxertados com a linhagem de células tumorais NEC8.
[00159] No modelo de metástase, células NEC8 foram injetadas no vão da cauda de camundongos atímicos ~ nu-Foxnl nu camundongos. 3 dias após o enxerto, camundongos foram tratados com o anticorpo específico CLDN6 muMAb 64A. Após oito semanas os pulmões foram preparados e a carga tumoral foi analisada por PCR. Em comparação com o grupo controle de PBS a anticorpo monoclonal anti-CLDN6 muMAb 64A de murinho mostraram claramente a inibição do crescimento do tumor.
[00160] A Fig. 37 mostra uma coloração Imunohistoquímica do câncer humano e tecidos normais,
utilizando anticorpos monoclonais muMAb 64A, mAb206-LCC e
mAb206-subg.
[00161] Em contraste com os tecidos normais, de
coloração forte homogênea e foi observado em secções de
tecido a partir de cânceres do ovário e de testículo. Uma coloração membranosa muito forte das populações de células epiteliais malignas foi detectada, enquanto estroma adjacente e células epiteliais não malignas não foram coradas. Estes
64/237 resultados mostram claramente que os anticorpos específicos de CLDN6 se ligar especificamente a células malignas derivadas de pacientes tumorais. (Explicação: Número de tecidos que foram marcadas pelo anticorpo / número de tecidos analisados)
DEFINIÇÃO DOS TERMOS
[00162] A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendido, certos termos são definidos em primeiro lugar. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.
[00163] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra compreender, e variações tais como compreende e compreendendo, será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas. Os termos um e uma e o e de referência semelhante ao utilizado no contexto da descrição da invenção (especialmente, no contexto das reivindicações) devem ser entendidos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. Recitação de faixas de valores aqui destina-se apenas a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que
65/237 cai dentro da faixa. A menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui descrito individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, tal como), aqui fornecido destina-se apenas a ilustrar melhor a invenção e não constitui uma limitação do escopo da invenção reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.
[00164] Claudinas são uma família de proteínas que são os componentes mais importantes de junções apertadas, onde estabelecem a barreira paracelular que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre as células do epitélio. Claudinas são proteínas transmembranares que abrangem a membrana 4 vezes com a extremidade N-terminal e a extremidade C- terminal, ambos localizados no citoplasma. O primeiro laço extracelular consiste, em média, de 53 aminoácidos e a segunda de cerca de 24 aminoácidos. CLDN6 e CLDN9 são os membros mais semelhantes da família CLDN.
[00165] O termo CLDN, tal como aqui utilizado, significa e inclui claudina CLDN6, CLDN9, CLDN4 e CLDN3. De
66/237 um modo preferido, uma CLDN é uma CLDN humana.
[00166] O termo CLDN6 refere-se a CLDN6, preferencialmente, humano, e, em particular, para (i) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ED NO: 2 ou que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, tal como um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ou (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. O primeiro laço extracelular CLDN6, preferencialmente, compreende os aminoácidos 28 e 80, mais preferencialmente, os aminoácidos 28-76 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, tais como a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7. O segundo laço extracelular de CLDN6, preferencialmente, compreende os aminoácidos 138 a 160, de preferência, os aminoácidos 141-159, mais preferivelmente, os aminoácidos 145-157 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8, tal como a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6. O referido primeiro e segundo laço extracelular, preferencialmente, formam a porção extracelular de CLDN6.
[00167] O termo CLDN9 refere-se a CLDN9 preferencialmente, humano, e, em particular, para (i) um
67/237 ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. O primeiro laço extracelular de CLDN9, preferencialmente, compreende os aminoácidos 28-76 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9. O segundo laço extracelular de CLDN9, preferencialmente, compreende os aminoácidos 141-159 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9. Os referidos primeiro e segundo laços extracelulares, preferencialmente, formam a porção extracelular de CLDN9.
[00168] O termo CLDN4 refere-se a CLDN4 preferencialmente, humano, e, em particular, para (i) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. O primeiro laço extracelular de CLDN4 preferencialmente compreende os aminoácidos 28-76 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10. A segunda ansa extracelular de CLDN4 preferencialmente compreende os aminoácidos 141-159 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Os referidos primeiro e segundo laços extracelulares, preferencialmente, formam a porção extracelular de CLDN4.
[00169] O termo CLDN3 refere-se a CLDN3
68/237 preferencialmente, humano, e, em particular, para (i) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. O primeiro laço extracelular de CLDN3 preferencialmente compreende os aminoácidos 27-75 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 11. A segunda ansa extracelular de CLDN3 preferencialmente compreende os aminoácidos 140-158 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11. Os referidos primeiro e segundo laços extracelulares extracelulares, preferencialmente, formam a porção extracelular de CLDN3.
[00170] As sequências CLDN acima descritos incluem as variantes das ditas sequências, em mutantes particulares, variantes de processamento, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e espécies homólogas, em especial, aquelas que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. Sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Uma espécia homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido com uma espécie diferente de origem a partir de que uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos. O termo CLDN deve abranger (i)
69/237 variantes CLDN plice (ii) CLDN-pós-traducionalmente modificados, particularmente, incluindo variantes com glicosilação diferente, como o estado N-glicosilação, (iii) variantes CLDN conformação, (iv) o câncer CLDN relacionados e CLDN variantes relacionadas não-cancerosas. De um modo preferido, um CLDN está presente na sua conformação nativa.
[00171] CLDN6 foi encontrado para ser expressa, por exemplo, no câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, melanoma, câncer do pescoço, sarcomas, câncer do ducto biliar, câncer de células renais, e câncer de bexiga urinária. CLDN6 é um alvo particularmente preferido para a prevenção e / ou tratamento de câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e de teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular, carcinoma escamoso do pulmão e o adenocarcinoma, o câncer gástrico, o câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, em particular, carcinoma de célula basal e carcimona de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular sarcoma sinovial e carcinosarcoma, câncer do ducto biliar, o câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células transicionais e
70/237 carcinoma papilar, câncer de rim, em particular, carcinoma de células renal, incluindo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma papilar renal, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinal e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, o câncer de colo do útero, o câncer de testículo, em particular, seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumor de células germinativas, tais como um teratocarcinoma carcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes. Em uma concretização, a doença do câncer associado com a expressão CLDN6 é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer metastático do ovário e câncer metastático do pulmão. De preferência, o câncer do ovário é um carcinoma ou um adenocarcinoma. De preferência, o câncer do pulmão é um carcinoma ou um adenocarcinoma, e, de preferência, é o câncer brônquico, tais como carcinoma bronquiolar ou adenocarcinoma bronquiolar. Em uma concretização, a célula tumoral associado com expressão CLDN6 é uma célula de tal câncer.
[00172] O termo porção refere-se a uma fração. Com respeito a uma estrutura particular, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteínas, o termo porção do mesmo pode
71/237 designar uma fração contínua ou descontínua da referida estrutura. De preferência, uma porção de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, de preferência pelo menos 40%, de preferência pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80%, e mais preferencialmente pelo menos 90% dos aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. De preferência, se a parte é uma fração descontínua a dita fração descontínua é composta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais partes de uma estrutura, cada parte de ser um elemento permanente da estrutura. Por exemplo, uma fração descontínua de uma sequência de aminoácidos pode ser composta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais, de preferência, não mais do que 4 partes de a referida sequência de aminoácidos, em que cada parte compreende, de preferência, pelo pelo menos 5 aminoácidos contínuas, pelo menos 10 aminoácidos contínuos, de preferência, de pelo menos 20 aminoácidos contínuos, de preferência, pelo menos 30 aminoácidos contínuos da sequência de aminoácidos.
[00173] Os termos parte e fragmento são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um elemento contínuo. Por exemplo, uma parte de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína refere-se a um elemento contínuo da referida estrutura. Uma porção, uma
72/237 parte ou um fragmento de uma estrutura, de preferência, compreende uma ou mais propriedades funcionais da referida estrutura. Por exemplo, uma porção, uma parte ou um fragmento de um epítopo ou peptídeo é, de preferência, imunologicamente equivalente ao epítopo ou peptídeo que é derivado.
[00174] O termo uma porção extracelular de uma CLDN no contexto da presente invenção refere-se a uma parte de um CLDN de frente para o espaço extracelular de uma célula, e, de preferência, ser acessível a partir do exterior da referida célula, por exemplo, por meio de anticorpos localizados fora da célula. Preferencialmente, o termo refere-se a uma ou mais voltas extracelulares ou uma parte da mesma ou qualquer outra parte extracelular de uma CLDN que é preferivelmente específica para o referido CLDN. De preferência, a dita parte compreende pelo menos 5, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos, 50 aminoácidos ou mais.
[00175] O termo CLDN associada com a superfície de uma célula é para ser entendida para se relacionar com CLDN nativa, ou seja, CLDN no seu estado não desnaturado, de preferência, dobrada naturalmente. De preferência, o termo CLDN associada com a superfície de uma célula significa que o CLDN está associado com e localizada na membrana plasmática da referida célula, em que pelo menos uma parte do CLDN, de preferência, a porção extracelular, está virada para o espaço
73/237 extracelular da referida célula e é acessível a partir do exterior da referida célula, por exemplo, por meio de anticorpos localizados no exterior da célula. A associação pode ser direta ou indireta. Por exemplo, a associação pode ser feita por um ou mais domínios de transmembrana, uma ou mais âncoras de lipídeos, e / ou por interação com qualquer outra proteína, lipídeo, sacarídeo, ou outra estrutura que pode ser encontrada na estrutura exterior da membrana plasmática de uma célula. Por exemplo, uma CLDN associada com a superfície de uma célula pode ser uma proteína transmembranar, ou seja, uma proteína de membrana integral, que tem uma porção extracelular, ou pode ser uma proteína associada com a superfície de uma célula através da interação com uma outra proteína que é uma proteína transmembranar.
[00176] CLDN6 está associada com a superfície de uma célula se ela estiver localizada na superfície da referida célula e é acessível para ligação de anticorpos específicos CLDN6-adicionados à célula. Em concretizações preferidas, uma célula que está sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície da célula é uma célula que expressa CLDN6. É para ser entendido que, no caso em que CLDN6 é expressa pelas células, a CLDN6 associada com a superfície das referidas células pode ser apenas uma porção da CLDN6 expressa.
[00177] O termo uma célula transportando uma CLDN,
74/237 preferencialmente, significa que a referida célula carrega uma CLDN na sua superfície, ou seja, que a CLDN está associada com a superfície da referida célula.
[00178] Superfície celular ou superfície de uma célula são usadas de acordo com o seu significado normal no estado da técnica, e inclui, assim, a parte externa da célula que é acessível para ligação de proteínas e outras moléculas.
[00179] A expressão CLDN expressa na superfície de uma célula significa que a CLDN expressa por uma célula se encontra em associação com a superfície da referida célula.
[00180] De acordo com a invenção CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula e não é substancialmente associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação é inferior em comparação com a expressão e de associação em células da placenta ou tecido de placenta. De preferência, o nível de expressão e de associação é inferior a 10%, de preferênciaa menos do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressão e de associação em células da placenta ou do tecido da placenta nem mais baixo. De preferência, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula e não é substancialmente associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação excede o nível de expressão e de associação em tecido nãotumorigênico, não-canceroso do que o tecido de placenta outro por não mais do que 2 vezes, preferencialmente, 1,5 vezes, e
75/237 de preferência, não exceda o nível de expressão e de associação em que o referido tecido não tumorigênico, nãocanceroso. De preferência, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula e não é substancialmente associada com uma superfície celular se o nível de expressão ou associação está abaixo do limite de detecção e / ou se o nível de expressão ou associação é demasiadamente baixo para permitir a ligação por CLDN6 a anticorpos específicos adicionados às células.
[00181] De acordo com a invenção CLDN6 é expressa em uma célula e está associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação excede o nível de expressão e de associação em tecido não-tumorigênico, nãocanceroso outro do que o tecido da placenta, de preferência, por mais do que duas vezes, de preferência, de 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De preferência, CLDN6 é expresso em uma célula e está associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação está acima do limite de detecção e / ou se o nível de expressão e de associação seja suficientemente elevada para permitir a ligação de anticorpos específicos CLDN6-adicionados às células. De preferência, CLDN6 expressa em uma célula é expressa ou exposta na superfície da referida célula.
[00182] A expressão grande quantidade refere-se aos microdomínios da membrana rico em colesterol e
76/237 esfingolipídeos situados na área folicular exterior da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de certas proteínas para associar dentro de tais domínios e suas habilidades de formação de agregados ou agregados focais pode afetar a função da proteína. Por exemplo, a translocação de moléculas CLDN6 em tais estruturas, depois de ser ligada por anticorpos da presente invenção, cria uma alta densidade de complexos CLDN6 antígeno-anticorpo nas membranas plasmáticas. Esta elevada densidade de complexos CLDN6 antígeno-anticorpo pode permitir a ativação eficiente do sistema complemento durante CDC.
[00183] De acordo com a invenção, o termo doença refere-se a qualquer estado patológico, incluindo o câncer, em particular, as formas de câncer aqui descrita.
[00184] Doenças que envolvem as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular significa, acordo com a invenção que expressão e a associação em células de um tecido ou órgão doente é, preferencialmente, aumentado em comparação com o estado em um tecido saudável ou órgão. Um aumento refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1,000%, pelo menos, 10000%) ou ainda mais. Em uma concretização, a expressão e associação com a superfície da célula é apenas encontrada em um tecido doente,
77/237 enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, as doenças associadas com células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células tumorais, incluem doenças, tais como as doenças de câncer. Além disso, de acordo com a invenção, doenças tumorais, tais como as doenças de câncer, de preferência, são aqueles em que as células de tumor ou células de câncer expressam CLDN6 e são caracterizadas pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
[00185] Tal como aqui utilizado, uma doença tumoral, doença relacionada com tumor ou doença tumorigênica inclui uma doença caracterizada por um crescimento celular regular aberrante, proliferação, diferenciação, adesão e / ou migração, o que pode resultar na produção de ou tendência para produzir tumores e / ou metástase tumorais. Por células de tumor entende-se uma célula anormal que cresce rapidamente, proliferação celular descontrolada e continua a crescimento após os estímulos que iniciou a nova parada do crescimento.
[00186] Por tumor entende-se um grupo anormal de células ou de um tecido por um rápido crescimento, proliferação celular descontrolada e continua a crescer após os estímulos que iniciaram a nova parada do crescimento. Tumores mostram falta parcial ou completa de organização
78/237 estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e geralmente formam uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.
[00187] De um modo preferido, uma doença tumoral, doença relacionada com tumor ou doença tumorigênico, de acordo com a invenção é de uma doença cancerosa, ou seja, uma doença maligna e uma célula de tumor é uma célula de câncer. De um modo preferido, uma doença tumoral, doença relacionada com tumor ou doença tumorigénico é caracterizada por células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula e uma célula tumoral expressa CLDN6 e caracterizase por associação de CLDN6 com sua superfície celular.
[00188] Uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula é, de preferência, uma célula de câncer ou célula de tumor, de preferência, de tumores e cânceres aqui descritos. De preferência, tal célula é uma célula que não seja uma célula de placenta.
[00189] Doenças de câncer ou cânceres preferidos, de acordo com a invenção são selecionados a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e de teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas
79/237 (NSCLC), em especial, carcinoma epidermóide de células do pulmão e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em especial, carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em nomeadamente, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer renal, em particular, carcinoma de células renais incluindo carcinoma de células renais claras e carcinoma de célula renal papilar, câncer do cólon, câncer do intestino delgado, incluindo câncer de íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinais e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, o câncer cervical, câncer testicular, em particular, seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, uma célula germinal, tal como um tumor ou um teratocarcinoma carcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes.
[00190] Os principais tipos de câncer de pulmão são o carcinoma do pulmão de pequenas células (CPPC) e carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Existem três principais sub-tipos de carcinomas do pulmão de células não
80/237 pequenas: carcinoma do pulmão de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma do pulmão de células grandes. Os adenocarcinomas são responsáveis por aproximadamente 10% dos cânceres do pulmão. Esse tipo de câncer geralmente é visto perifericamente nos pulmões, ao contrário de câncer de pulmão de pequenas células e câncer de pulmão de células escamosas, que ambos tendem a ser mais central.
[00191] O câncer de pele é um crescimento maligno na pele. Os cânceres de pele mais comuns são câncer basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma. O melanoma maligno é um tipo grave de câncer de pele. Isso é devido ao crescimento descontrolado de células de pigmento, chamadas melanócitos.
[00192] De acordo com a invenção, um carcinoma é um câncer que começa na camada de revestimento (células epiteliais) dos órgãos.
[00193] Carcinoma bronquiolar é um carcinoma do pulmão, que se pensa ser derivado do epitélio dos bronquíolos terminais, em que o tecido neoplásico estende-se ao longo das paredes alveolares e cresce em pequenas quantidades dentro dos alvéolos. A mucina pode ser demonstrada em algumas das células e no material nos alvéolos, que também inclui as células desmatadas.
[00194] Adenocarcinoma é um câncer que se origina no tecido glandular. Este tecido é também parte de uma categoria de tecido maior conhecida como tecido epitelial. O tecido
81/237 epitelial da pele inclui, glândulas e uma variedade de outros tecidos que revestem as cavidades e órgãos do corpo. Epitélio é derivada embriologicamente do ectoderma, endoderma e mesoderme. Para ser classificado como adenocarcinoma, as células não têm necessariamente de ser parte de uma glândula, contanto que elas tenham propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo seres humanos. adenocarcinomas bem diferenciados tendem a se parecer com o tecido glandular que são derivados de, ao mesmo tempo pouco diferenciado não pode. Por coloração das células a partir de uma biópsia, um patologista irá determinar se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer. Os adenocarcinomas pode surgir em muitos tecidos do corpo, devido à natureza ubíqua das glândulas dentro do corpo. Enquanto cada glândula não pode ser a mesma substância que secreta, enquanto há uma função exócrina para a célula, é considerado glandular maligno e a sua forma é, portanto, chamado adenocarcinoma. Adenocarcinomas maligno invade outros tecidos e muitas vezes metástase, dado ao tempo suficiente para fazê-lo. Adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de câncer de ovário. Ele inclui os adenocarcinomas seroso e mucinoso, o adenocarcinoma de células claras e o adenocarcinoma endometrioide.
[00195] Cistadenocarcinoma é uma forma maligna de um tumor epitelial, superfície estromal, um tipo de câncer do
82/237 ovário .
[00196] Tumores epiteliais da superfície do estroma são uma classe de neoplasmas do ovário que se pensa serem derivados a partir do epitélio da superfície do ovário (peritoneu modificada) ou a partir do endométrio ectópico ou trompa de Falópio tecido (trompas). Este grupo de tumores contribui para a maioria de todos os tumores do ovário.
[00197] Teratocarcinoma refere-se a um tumor de células germinativas, que é uma mistura de teratoma com carcinoma embrionário, ou com coriocarcinoma, ou com ambos. Coriocarcinoma é um câncer maligno, trofoblastico e agressivo, geralmente da placenta. É caracterizado por disseminação hematogênica precoce para os pulmões.
[00198] Um sarcoma é um câncer do tecido conjuntivo (osso, cartilagem, gordura) resultando na proliferação de mesoderme. Isto está em contraste com os carcinomas, que são de origem epitelial. A sarcoma sinovial é uma forma rara de câncer que geralmente ocorre perto das articulações do braço ou perna. É um dos sarcomas de tecidos moles.
[00199] Carcinoma de células renais, também conhecido como câncer de células renais ou adenocarcinoma de células renais é um câncer do rim que se origina no revestimento do tubo contornado proximal, os muito pequenos tubos no rim que filtram o sangue e remover os resíduos. Carcinoma de células renais é, de longe, o tipo mais comum de câncer de rim em
83/237 adultos e o mais letal de todos os tumores genitorurinario. Subtipos distintos de carcinoma de células renais são células claras carcinoma de células renais e carcinoma papilar renal. Carcinoma das células renais claras, é a forma mais comum de carcinoma de células renais. Quando visto sob um microscópio, as células que formam células claras carcinoma de células renais aparecer muito pálido ou claro. Carcinoma de células renais papilífero é o segundo subtipo mais comum. Estes cânceres formam pequenas projeções digitiformes (chamadas papilas) em alguns, se não a maioria, dos tumores.
[00200] Um tumor de células germinativas é uma neoplasia derivada de células germinativas. Tumores de células germinativas pode ser tumores cancerosos ou nãocancerosos. Células germinativas ocorrem normalmente dentro das gônadas (ovários e testículos). Tumores de células germinativas que se originam fora das gônadas (por exemplo, cabeça, dentro da boca, pescoço, pelve; em fetos, bebês e crianças pequenas na maioria das vezes encontrado na linha média do corpo, principalmente, na ponta do cóccix) pode ser defeitos congênitos resultantes de erros durante o desenvolvimento do embrião.
[00201] As duas principais classes de tumores de células germinativas são os seminomas e não-seminomas, em que os não-seminomas incluem: teratocarcinoma, carcinoma embrionário, os tumores do saco vitelino, coriocarcinoma e
84/237 teratoma diferenciado. A maioria das linhagens celulares de não seminomas são equivalentes para os carcinomas embrionários, isto é, eles são quase inteiramente compostos de células troncos que não diferenciam em condições basais, embora alguns possam responder aos indutores da diferenciação, tais como o ácido retinóico.
[00202] Por metástases significa-se a propagação de células de câncer do seu sítio original para outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende de desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, a penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade do corpo e vasos, e em seguida, depois de ser transportado pelo sangue, a infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogênese. Metástase de tumor muitas vezes ocorre mesmo após a remoção do tumor primário porque as células tumorais ou componentes podem permanecer e desenvolver o potencial metastático. Em uma concretização, o termo metástases de acordo com a invenção refere-se a metástase distante referindo-se a uma metástase remota que é a partir do tumor primário e o sistema de linfonodo regional.
[00203] As células de um tumor secundário ou metastático são aqueles em o tumor original. Isto significa, por exemplo, que, no caso do câncer do ovário forma
85/237 metástases para o fígado, o tumor secundário é constituído por células de ovário anormais, não das células hepáticas anormais. O tumor no fígado é então chamado de câncer metastático do ovário, não câncer de fígado.
[00204] Por tratar entende-se a administrar um composto ou uma composição como aqui descrita a um sujeito, a fim de evitar ou eliminar uma doença, incluindo a redução do tamanho de um tumor ou no número de tumores em um sujeito; deter ou desacelerar de uma doença em um sujeito; inibir ou retardar o desenvolvimento de uma nova doença em um sujeito; diminuir a frequência e severidade dos sintomas e / ou recorrências em um sujeito que tem atualmente ou que já teve uma doença; e / ou prolongar, ou seja, aumentar a vida útil do sujeito.
[00205] O termo tratamento de uma doença inclui cura, encurtamento a duração, melhorar, prevenir, retardar ou inibir a progressão ou agravamento de, ou prevenir ou retardar o aparecimento de uma doença ou dos seus sintomas.
[00206] Por em risco entende-se um sujeito, ou seja um paciente, que é identificado como tendo uma probabilidade maior do que o normal de desenvolver uma doença, em particular, câncer, em comparação com a população em geral. Além disso, um indivíduo que teve, ou que tem atualmente, uma doença, em particular, câncer é um sujeito que tem um risco aumentado para o desenvolvimento de uma doença, como tal, um
86/237 sujeito pode continuar a desenvolver uma doença. Os indivíduos que têm atualmente, ou que tiveram um câncer também têm um risco aumentado de metástases do câncer.
[00207] O termo imunoterapia relaciona-se com um tratamento que envolva uma reação imunológica específica. No contexto da presente invenção, os termos como proteger, prevenir, profilática, prevenção ou protetor referemse à prevenção ou tratamento ou ambos da ocorrência e / ou a propagação de um tumor em um indivíduo. O termo imunoterapia no contexto da presente invenção refere-se preferencialmente a imunização ativa ou vacinação tumoral do tumor. A administração profilática de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração profilática da composição da invenção, de preferência, protege o receptor do desenvolvimento do crescimento do tumor. A administração terapêutica de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração terapêutica da composição da invenção, pode levar à inibição do progresso / crescimento do tumor. Este compreende a desaceleração da evolução / crescimento de rumor, em particular uma interrupção da progressão do tumor, que de preferência conduz a eliminação do tumor. A administração terapêutica de uma imunoterapia pode proteger o indivíduo, por exemplo, a partir da divulgação ou metástase de tumores existentes.
[00208]
O termo imunização ou vacinação descreve o
87/237 processo de administração do antígeno a um sujeito com a finalidade de induzir uma resposta imune por motivos terapêuticos ou profiláticos.
[00209] Os termos sujeito, indivíduo, organismo, ou paciente são utilizadas indiferentemente e referem-se a vertebrados, de preferência mamíferos. Por exemplo, mamíferos, no contexto da presente invenção são os seres humanos, primatas não humanos, animais domésticos, tais como cães, gatos, ovelhas, gado, cabras, porcos, cavalos, etc., animais de laboratório tais como camundongos, ratos, coelhos, guiné porcos, etc., bem como os animais em cativeiro como animais de zoológicos. O termo animal, tal como aqui utilizado também inclui seres humanos. O termo indivíduo pode também incluir um paciente, isto é, um animal, de preferência um ser humano com uma doença, preferivelmente, uma doença associada com a expressão de CLDN6, de preferência uma doença tumorigénico tal como um câncer.
[00210] O termo adjuvante refere-se a compostos que prolonga ou melhora ou acelera uma resposta imune. A composição da presente invenção, de preferência, exerce o seu efeito sem a adição de adjuvantes. Ainda assim, a composição do presente pedido de patente podem conter qualquer adjuvante conhecido. Os adjuvantes compreendem um grupo heterogéneo de compostos, tais como emulsões de óleo (por exemplo, adjuvantes de Freund), compostos minerais (tal como, alúmen),
88/237 produtos bacterianos (tais como toxina de Bordetella pertussis), lipossomas e complexos imuno-estimulantes. Exemplos de adjuvantes são o monofosforil-Iipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponinas, tais como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham, WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, e QS-L1 (. Assim, et al., 1997, Mol Cells 7: 178-186), adjuvante de Freund incompleto adjuvantes, adjuvantes de Freund completos, vitamina E, montanid, alúmen, oligonucleotídeos CpG (Krieg et ai, 1995, Nature 374: 546549.), e várias emulsões água-em-óleo, que são preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis, tais como esqualeno e / ou tocoferol.
[00211] De acordo com a invenção, uma amostra pode ser qualquer amostra útil, de acordo com a presente invenção, em especial, uma amostra biológica como uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e / ou uma amostra celular e pode ser obtido da forma convencional, tal como por tecidos biópsia, incluindo biópsia, e tomando sangue, aspirado brônquico, escarro, urina, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo amostra biológica inclui também fracções de amostras biológicas.
[00212] O termo anticorpo refere-se a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) inter-cadeias ligadas por pontes dissufeto, e inclui qualquer molécula que compreende uma
89/237 porção de ligação ao antigeno dos mesmos. O termo anticorpo inclui anticorpos monoclonais e seus fragmentos ou derivados, incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, anticorpos de cadeia simples, por exemplo, scFv e fragmentos de anticorpos de ligação ao antigeno, tais como fragmentos Fab e Fab' e também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos expressos em procariotas, os anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos de anticorpo de ligação ao antigeno e seus derivados como aqui descrito. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabil idade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas por regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para terminal carboxil na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um dominio de ligação que interajem com um antigeno. As regiões constantes dos anticorpos podem
90/237 mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, culas efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema clássico de complemento.
[00213] De acordo com a invenção, o termo pelo menos uma das sequências de CDR de preferência significa pelo menos a sequência de CDR3. O termo sequências de CDR de uma cadeia de anticorpo refere-se, preferencialmente, a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo.
[00214] De acordo com a invenção, uma referência a uma cadeia de anticorpo compreendendo uma sequência CDR particular, tal como uma sequência de CDR3 particular, significa que a referida sequência de CDR particular, quer forma a região CDR, tal como a região CDR3 da referida cadeia do anticorpo, isto é, a região CDR consiste do referido nomeadamente sequência CDR, ou forma uma parte da região CDR, tal como a região CDR3 da referida cadeia do anticorpo, isto é, a região CDR compreende a referida sequência CDR especial.
[00215] Se de acordo com a invenção é feita referência a um anticorpo que compreende uma cadeia pesada de anticorpo em particular e / ou uma cadeia leve de anticorpo específico, tal como uma cadeia que compreende sequências de CDR particulares, é preferível que ambas as cadeias pesada e / ou ambas as cadeias leves da anticorpo sejam compostos, cada um de cadeia pesada de anticorpo em particular e / ou da cadeia
91/237 leve do anticorpo específico.
[00216] O termo anticorpo humanizado refere-se a uma molécula contendo um local de ligação ao antígeno que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não-humana, em que a estrutura da imunoglobulina restantes da molécula é baseada na estrutura e / ou a sequência de uma imunoglobulina humana . O local de ligação ao antígeno pode incluir quer os domínios variáveis completos fundidos para os domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais adequados nos domínios variáveis. Locais de ligação ao antígeno podem ser de tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificada para se assemelhar mais de perto imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservar todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo humanizado do rato que contém todas as seis CDR a partir do anticorpo de camundongo). Outras formas têm uma ou mais CDRs que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original.
[00217] O termo anticorpo quimérico refere-se a esses anticorpos, em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas é homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma
92/237 determinada classe correspondente, enquanto que o restante segmento da cadeia é homóloga às sequências correspondentes em um outro correspondente. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada, para mimetizar as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto que as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivados de uma outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que a região variável pode convenientemente ser derivada de fontes presentemente conhecidas usando células B ou hibridomas prontamente disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Enquanto a região variável tem a vantagem da facilidade de preparação e a especificidade não é afectado pela fonte, a região constante sendo humana, é menos provável que provoquem uma resposta imunológica de um indivíduo humano quando os anticorpos são injectados do que a região constante a partir de uma fonte não humana. Todavia, a definição não está limitada a este exemplo particular.
[00218] O termo porção de ligação ao antígeno de um anticorpo (ou simplesmente porção de ligação), tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Tem sido demonstrado que a função de ligação
93/237 ao antigeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo anticorpo de uma porção de ligação ao antigeno incluem (i) os fragmentos
Fab, fragmentos monovalentes que consistem de domínios VL,
VK, CL e CH; (ii) F(ab') 2, fragmentos bivalentes que
compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte
dissulfureto na região dobradiça; (iii) fragmentos Fd
consistindo dos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv
consistindo nos domínios VL e VH de um ún ico braço de um
anticorpo, (v) Fragmentos de dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:. 544-546), que consiste de um domínio VH; (vi) as regiões de determinação de complementaridade isolada (CDR), e (vii) combinações de dois ou mais CDR isoladas que podem, opcionalmente, ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitas como uma cadeia de proteína única, em que o VL e regiões VH emparelham para formar moléculas mono valentes (conhecido como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242:.. 423-426; e Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci. EUA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser englobadas no termo porção de ligação ao
94/237 antígeno de um anticorpo. Um outro exemplo é as proteínas de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação compreendendo (i) um domínio de ligação ao polipeptídeo que está fundido com um região de charneira de imunoglobulina polipeptídeo, (ii) uma cadeia pesada de imunoglobulina CH2 da região constante fundido com a região de charneira, e (iii) uma cadeia pesada de imunoglobulina CH3 da região constante fundido com a região constante do CH2. O polipeptídeo do domínio de ligação pode ser uma região variável da cadeia pesada ou de uma região variável da cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina que se liga ao domínio estão ainda descritas nos documentos US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas por técnicos versados no assunto, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o são os anticorpos intactos.
[00219] O termo epítopo refere-se a um determinante antigênico em uma molécula, isto é, para a parte de uma molécula que é reconhecida pelo sistema imunológico, por exemplo, que é reconhecido por um anticorpo. Por exemplo, os epítopos são os locais discretos, tridimensionais em um antígeno, que são reconhecidos pelo sistema imunológico. No contexto da presente invenção, o epítopo é preferivelmente derivado a partir de uma proteína CLDN. Os epítopos consistem normalmente em grupamentos de superfície quimicamente ativos
95/237 de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidas pelo fato de a ligação para o primeiro, mas não o último é perdida na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo de uma proteína, tal como um CLDN de preferência compreende uma porção contínua ou descontínua da referida proteína e é de preferência entre 5 e 100, de preferência entre 5 e 50, mais preferencialmente entre 8 e 30, mais preferencialmente entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ser, de preferência 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos de comprimento.
[00220] O termo epítopo descontínuo, tal como aqui utilizado, significa um epítopo conformacional em um antígeno de proteína que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína.
[00221] O termo molécula biespecífica destina-se a incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, um peptídeo ou uma proteína ou peptídeo complexo, o qual possui duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula se pode ligar a, ou interagir com (a) um antígeno da superfície celular, e (b) um receptor Fc na superfície de uma célula efectora. O termo molécula multiespecífica ou
96/237 molécula heteroespecífico destina-se a incluir qualquer agente, por exemplo, um complexo de proteína, peptídeo ou proteína ou peptídeo, que tem mais de duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula se pode ligar a, ou interagir com (a) um antígeno da superfície celular, (b) um receptor Fc na superfície de uma célula efectora, e (c) pelo menos um outro componente. Por conseguinte, a invenção inclui, mas não está limitado a, biespecíficos triespecica, tetraspecific, e outras moléculas multiespecíficos que são dirigidos para CLDN6, e para outros objectivos, tais como receptores de Fe em células efetoras. O termo anticorpos biespecíficos também inclui diacorpos. Os diacorpos s anticorpos bivalentes, biespecicos em que os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com o domínio complementar de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et ai (1993) Proc Natl Acad Sci EUA 90:6444-6448; Poljak, RJ, et al (1994) Estrutura 2: 1 121-1 123).
[00222] Tal como aqui utilizado, o termo heteroanticorpos refere-se a dois ou mais anticorpos, seus derivados, ou as regiões de ligação ao antígeno ligados entre si, pelo menos dois dos quais têm diferentes especificidades.
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Estas especificidades diferentes incluem uma especificidade de ligação para um receptor Fc em uma célula efectora, e uma especificidade de ligação para um antígeno ou epítopo em uma célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral.
[00223] Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos humanos. O termo anticorpo humano, tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linhagem germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese ao acaso, ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo) .
[00224] O termo anticorpo monoclonal, tal como aqui utilizado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpos da composição molecular único. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epítopo. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano, por exemplo, rato, fundido com uma célula imortalizada.
[00225] O termo anticorpo recombinante, como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais
98/237 como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossómico com respeito aos genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir dele, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de um recombinante, biblioteca de anticorpos combinatória, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing das sequências de genes de imunoglobulina de outras sequências de DNA.
[00226] O termo transfectoma, tal como aqui utilizado, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, tais como células CHO, células NS / 0, células HEK293, células HEK293T, células de plantas ou fungos, incluindo células de levedura.
[00227] Tal como aqui utilizado, um anticorpo heterólogo é definido em relação a um organismo transgênico produzindo tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico de codificação correspondente ao encontrado em um organismo que não seja constituída, o organismo transgênico, e sendo geralmente derivadas de uma excepção, aespécie de organismo transgênico.
[00228] Tal como aqui utilizado, um heteroanticorpo
99/237 refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas de diferentes origens dos organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murino é um heteroanticorpo.
[00229] A invenção inclui todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tal como aqui descrito, que para os fins da presente invenção são englobados pelo termo anticorpo. O termo derivados de anticorpos refere-se a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjugado de anticorpo e o outro agente ou anticorpo, ou um fragmento de anticorpo.
[00230] Os anticorpos aqui descritos são, de preferência isolado. Um anticorpo isolado, tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que possuem diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CLDN6 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos de CLDN6). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante do CLDN6 humano pode, no entanto, ter reactividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécies CLDN6). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e / ou
100/237 produtos químicos. Em uma concretização da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais isolado refere-se a anticorpos que possuem diferentes especificidades e sendo combinadas em uma composição bem definida.
[00231] De acordo com a presente invenção, um anticorpo é capaz de se ligar a um alvo pré-determinado, se ele tem uma afinidade significativa para o referido alvo prédeterminado e se liga ao referido alvo pré-determinado em ensaios convencionais, tais como os ensaios aqui descritos. De um modo preferido, um anticorpo é capaz de se ligar a um alvo que se liga de forma detectável para o referido alvo, em uma análise de citometria de fluxo (análise FACS) em que a ligação do referido anticorpo ao referido alvo expresso na superfície de células intactas é determinada. De preferência, o anticorpo liga-se de forma detectável para o referido alvo se estiver presente em uma concentração de 10 pg / ml ou inferior, 5 μ R / ml ou inferior ou 2 g / mL ou inferior. De preferência, o anticorpo liga-se de forma detectável para o referido alvo se estiver presente em uma concentração de 50 nM ou inferior, de 30 nM ou inferior, ou 15 nM ou inferior. afinidade ou afinidade de ligação é muitas vezes medido pelo constante de equilíbrio de dissociação (KD). De preferência, o termo afinidade significativa refere-se à ligação a um alvo predeterminado com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 M ou inferior, 10-6 M ou inferior, 10101/237 7 M ou inferior, 10-8 M ou inferior, 10-9 M ou inferior, 10-10 M ou inferior, 10-11 M ou inferior, ou 10-12 M ou inferior. Os anticorpos da presente invenção têm de preferência valores de EC50 para a ligação a CLDN6 de 6500 ng / ml ou inferior, 3000
ng / ml ou inferi or, 2500 ng / ml ou inferior, 2000 ng / ml
ou inferior, 150 0 ng / ml ou inferior, 1000 ng / ml ou
inferior, de 500 ng / ml ou inferior, de 400 ng / ml ou
inferior, de 300 ng / ml ou inferior, de 200 ng / ml ou
inferior, ou 100 ng / ml ou inferior.
[00232] Um anticorpo não é (substancialmente) capaz de
se ligar a um alvo que não tenha qualquer afinidade significativa para o dito alvo e não se liga significativamente ao referido alvo em ensaios convencionais. De um modo preferido, um anticorpo não é (substancialmente) capaz de se ligar a um alvo se faz ligação não detectável ao referido alvo em uma análise de citometria de fluxo (análise FACS) em que a ligação do referido anticorpo ao referido alvo expresso na superfície de células intactas é determinada. De preferência, o anticorpo não se liga de forma detectável para o referido alvo se estiver presente em uma concentração de até 2 mg / ml, de preferência até 5 ug / ml, de preferência até 10 ug / ml, de preferência até 20 ug / ml, mais preferivelmente até 50 ug / ml, em especial até 100 g / ml, ou até 150 g / ml, até 200 ug / ml ou superior. De preferência, o anticorpo não se ligar de forma detectável
102/237 para o referido alvo se estiver presente em uma concentração de até 15 nM, de preferência até 30 nM, de preferência, até 50 nM, de preferência, até 100 nM, de preferência, até 150 nM, ou até 170 nM, até 300 mM, até 600 nM, até 1000 nM, até 1300 nM ou superior. De preferência, o anticorpo não se liga de forma detectável para o referido alvo se estiver presente em uma concentração que satura a ligação ao alvo ao qual o anticorpo se liga, ou seja, CLDN6. De um modo preferido, um anticorpo tem nenhuma afinidade significativa para um alvo que se liga ao referido alvo com um K D que é, pelo menos, 10 vezes, 100 vezes, 10 3 vezes, 10 4 vezes, 10 5 vezes, ou 10 6 vezes mais elevada do que a KD para a ligação ao alvo predeterminado para o qual o anticorpo é capaz de se ligar. Por exemplo, se a KD para a ligação de um anticorpo para o alvo para o qual o anticorpo é capaz de se ligar é de 10 -7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual o anticorpo não tem qualquer afinidade significativa seria de pelo menos 10 -6 M, 10 -5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, ou 10-1 M.
[00233] Um anticorpo é específico para um alvo prédeterminado, se for capaz de se ligar ao referido alvo prédeterminado, embora não seja capaz de se ligar a outros alvos, ou seja, não tem qualquer afinidade significativa para os outros objectivos e não se liga de forma significativa a outros alvos em ensaios convencionais. De acordo com a invenção, um anticorpo é específico para CLDN6 se for capaz
103/237 de se ligar a CLDN6 mas não é capaz de se ligar a outros alvos, em especial proteínas claudina excepto CLDN6 como CLDN9, CLDN4, CLDN3 e CLDN1. De um modo preferido, um anticorpo é específico para CLDN6 se a afinidade para e a ligação a uma proteína diferente de claudina CLDN6 tais como CLDN9, CLDN4, CLDN3 e CLDN1 não exceda significativamente a afinidade para ligação a proteínas ou claudina-relacionado, tais como albumina de soro bovino (BSA), caseína, albumina do soro humano (HSA) ou proteínas transmembranares não claudina, tais como moléculas de MHC ou receptor de transferrina ou qualquer outro polipeptídeo especificado. De um modo preferido, um anticorpo é específico para um alvo prédeterminado, se liga ao referido alvo com um KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 10 3 vezes, 10 4 vezes, 10 5 vezes, ou 10 6 - vezes mais baixa do que a KD para a ligação a um alvo para os quais não é específica. Por exemplo, se a KD para a ligação de um anticorpo para o alvo para o qual é específico é de 10-7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual não é específico seria, pelo menos, 10-6 M, 10-5 M, 10-4M, 10-3 M, 10-2 M, ou 10-1 M.
[00234] A ligação de um anticorpo para um alvo pode ser determinada experimentalmente utilizando qualquer modo adequado; ver, por exemplo, Berzofsky et al., antígenoanticorpo Interactions Em Immunology Fundamental, Paul, WE, Ed., Raven Press New York, NY (1 84), Kuby, Janis Immunology,
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WH Freeman and Company de Nova Iorque, Nova Iorque (1992), e os métodos aqui descritos. Afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise de equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimentos gerais definidos pelo fabricante; por radioimunoensaio utilizando o antígeno alvo radiomarcado; ou por qualquer outro método conhecido de um técnico versado no assunto. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann NY Acad. Sci, 51: 660 (1949) . A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno particular pode variar se for medido sob diferentes condições, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno, por exemplo, KD, IC50, são de preferência feitos com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno, e um tampão normalizado.
[00235] Uma característica única do anticorpo da presente invenção é a capacidade de se ligar claudina 6 a superfície celular. Isto é demonstrado por análise de citometria de fluxo de células que expressam claudina 6.
[00236] Para testar a ligação de anticorpos monoclonais a células que expressam claudinas vivo, citometria de fluxo pode ser usado. Resumidamente, as linhagens celulares que expressam claudinas associada à membrana (cultivadas sob condições de crescimento padrão) são
105/237 misturados com várias concentrações de anticorpos em PBS contendo FCS a 2% inactivado calor e 0,1% de NaN3 a 4 ° C durante 30 min. Após lavagem, as células são feitas reagir com um anticorpo secundário marcado por fluorescência sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por FACS utilizando luz e propriedades de dispersão lateral de porta em células individuais e de ligação dos anticorpos marcados é determinada.
[00237] O termo ligação, de acordo com a invenção, de preferência refere-se a uma ligação específica, tal como aqui definida.
[00238] Tal como aqui utilizado, isotipo refere-se a classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes das regiões constantes da cadeia pesada.
[00239] Tal como aqui utilizado, comutação de isotipo refere-se o fenómeno pelo qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma das outras classes Ig.
[00240] O termo de ocorrência natural tal como é aqui utilizado, tal como aplicado a um objeto refere-se ao fato de um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência polinucleotídica que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi
106/237 intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
[00241] O termo rearranjada como aqui utilizado refere-se a uma configuração de uma cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que o locus de um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento J DJ ou de uma codificação conformação essencialmente um domio VH ou VL completo, respectivamente. Um locus de imunoglobulina rearranjados (anticorpo) de genes podem ser identificados por comparação com o DNA da linha germinal; um locus rearranjado terá pelo menos um recombinados heptâmero / elemento homologia nonâmero.
[00242] O termo configuração da linhagem germinativa ou não rearranjado, tal como aqui utilizado em referência a um segmento V refere-se à configuração em que o segmento V, não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
[00243] O termo molécula de ácido nucleico, tal como aqui utilizado, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é DNA de cadeia dupla. Uma molécula de ácido nucleico pode ser utilizada para efeitos de introdução, isto é, a transfecção de, células, por exemplo, na forma de RNA que podem ser preparada por transcrição in vitro a partir de um molde de
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DNA. O RNA pode aliás ser modificado antes da aplicação através da estabilização sequências, tampando e poliadenilação.
[00244] Os ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção de preferência têm sido isolados. O termo ácido nucleico isolado significa de acordo com a invenção que o ácido nucleico era (i) amplificada in vitro, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido recombinantemente através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo pela clivagem e fraccionamento electroforético-gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está
disponível para a manipulação por meio de técnicas de DNA
recombinante.
[00245] Os ácidos nucleicos podem, de acordo com a
invenção, estar presente sozinho ou em combinação com outros
ácidos nucleicos, que pode ser homóloga ou heteróloga. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligada a sequências de controle da expressão que pode ser homóloga ou heteróloga em relação ao referido ácido nucleico, sendo que o termo homólogo significa que o ácido nucleico também é funcionalmente ligado à sequência de controle da expressão e, naturalmente, o termo heterólogo significa que o ácido nucleico não está funcionalmente ligado à sequência de controle da expressão naturalmente.
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[00246] Um ácido nucleico, tal como um ácido nucleico que expressa o RNA e / ou proteína ou peptídeo, e uma sequência de controle de expressão estão funcionalmente ligados uns aos outros, se eles estão covalentemente ligados um ao outro de tal modo que a expressão ou transcrição da referida ácido nucleico está sob o controle ou sob a influência da referida sequência de controle da expressão. Se o ácido nucleico é para ser traduzido em uma proteína funcional, em seguida, com uma sequência de controle da expressão funcionalmente ligado a uma sequência de codificação, a indução do referido resultados de sequências de controle de expressão na transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou a referida sequência de codificação de não ser capaz de ser traduzido para a proteína ou peptídeo desejado.
[00247] O termo sequência de controle de expressão inclui os promotores de acordo com a invenção, ao ribossoma, locais potenciadores e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou de tradução de um ARNm de ligação. Em concretizações particulares da invenção, as sequências de controle de expressão podem ser regulada. A estrutura exacta das sequências de controle de expressão podem variar em função da espécie ou tipo de célula, mas geralmente compreende 5'-transcrita e 5'- e sequências 3 'não
109/237 traduzidas que são envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como caixa TATÁ, sequência de cobertura, sequência CAAT, e semelhantes. Mais especificamente, as sequências de controle de expressão não transcrita 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controle da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligadas. As sequências de controle de expressão pode também compreender sequências potenciadoras ou sequências ativadoras a montante.
[00248] De acordo com a invenção, o termo promotor ou região de promotor refere-se a uma sequência de ácido nucleico, que está localizado a montante (5') com a sequência de ácido nucleico a ser expressa e controla a expressão da sequência de reconhecimento e proporcionando um sítio de ligação para o RNA -polimerase. A região de promotor pode ainda incluir reconhecimento e sítios de ligação para outros fatores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser indutível e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser constitutivo se a transcrição não é controlada por um agente indutor. Um gene que está sob o controle de um promotor induzível não é expresso ou expresso apenas em pequena medida, se um agente indutor está ausente. Na presença do agente de indução do gene é ligado ou
110/237 o nível de transcrição é aumentada. Este é mediada, em geral, por meio da ligação de um fator de transcrição específico.
[00249] Os promotores que são preferidos, de acordo com a invenção incluem os promotores para SP6, T3 e T7 polimerase, promotor U6 ARN humano, o promotor de CMV, e promotores híbridos artificiais dos mesmos (por exemplo, CMV), onde uma ou mais partes são fundidas com uma parte ou partes de promotores de os genes de outras proteínas celulares, tais como por exemplo, de GAPDH humano (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase), e incluindo ou não (um) íntron (ões) adicional.
[00250] De acordo com a invenção, o termo expressão é utilizado no seu significado mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína / peptídeo. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser realizada de forma estável ou transiente. De acordo com a invenção, o termo expressão também inclui uma expressão aberrante ou expressão anormal.
[00251] Expressão aberrante ou expressão anormal significa de acordo com a invenção que a expressão seja alterada, de preferência, aumentada, em comparação com uma referência, de preferência, em comparação com o estado de uma célula normal, não tumorigénico ou um indivíduo saudável. Um aumento da expressão refere-se a um aumento de pelo menos
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10%, em particular, pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Em uma concretização, a expressão é apenas encontrada em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida.
[00252] Em uma concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico é de acordo com a invenção presente em um vetor, quando apropriado, com um promotor que controla a expressão do ácido nucleico. O termo vetor é aqui utilizado no seu significado mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que permite que o referido ácido nucleico, por exemplo, para ser introduzida na procariotas e / ou células eucarióticas e, se for caso disso, ser integradas um genoma. Vetores desse tipo são preferencialmente replicadas e / ou expresso nas células. Os vectores compreendem plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos ou genomas virais. O termo plasmídeo, tal como aqui utilizada geralmente refere-se a uma construção de material genético extracromossómico, geralmente um duplex de DNA circular, que pode replicar-se independentemente do DNA cromossómico.
[00253] Como vetor para a expressão de um anticorpo, ou de um tipo de vector, em que o anticorpo de cadeia pesada e de cadeia leve estão presentes em diferentes vetores ou um tipo de vector, em que a cadeia pesada e de cadeia leve estão presentes no mesmo vector pode ser utilizado.
[00254] O ensinamento aqui dado com respeito a
112/237 sequências específicas de ácido nucleico e de aminoácidos, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequências, é para ser interpretado de modo a também se relacionam com alterações, isto é, variantes, das referidas sequências específicas que resultam em sequências que sejam funcionalmente equivalentes aos as referidas sequências específicas, por exemplo, as sequências de aminoácidos que exibem propriedades idênticas ou semelhantes às das sequências específicas de aminoácidos e sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos que exibem propriedades idênticas ou similares às das sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácido nucleico específicas. Uma propriedade importante é a de reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou para manter as funções efetoras de um anticorpo, tais como CDC e / ou ADCC. De preferência, uma sequência modificada em relação a uma sequência específica, quando se substitui a sequência
específica de um anticorpo retém a ligação dos ditos
anticorpos ao alvo e de preferência funções do referido
anticorpo, tal como aqui descrito.
[00255] Do mesmo modo, os ensinamentos aqui dado com respeito a anticorpos ou hibridomas que produzem anticorpos específicos específicas, deve ser interpretado de forma a também se relacionam com os anticorpos caracterizados por uma sequência de aminoácidos e / ou sequência de ácido nucleico
113/237 que é modificada em comparação com a sequência de aminoácidos e / ou sequência de ácido nucleico de anticorpos específicos, mas sendo funcionalmente equivalente. Uma propriedade importante é a de reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo ou para manter as funções efetoras de um anticorpo. De preferência, uma sequência modificada em relação a uma
sequência específica, quando se substitui a sequência
específica de um anticorpo retém a ligação dos ditos
anticorpos ao alvo e de preferência funções do referido
anticorpo, tal como aqui descrito, por exemplo, lise mediada
CDC ou lise mediada ADCC.
[00256] Será apreciado pelos técnico versado no assunto que, em particular, as sequências das CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de se ligar a um alvo. Por exemplo, regiões CDR será idêntica ou altamente homóloga às regiões de anticorpos aqui especificados. Por altamente homólogos é contemplado que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2 podem ser feitas substituições nas CDR. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis pode ser modificado de modo que eles apresentam homologia significativa com as regiões de anticorpos especificamente aqui descritos.
[00257] É para ser entendido que os ácidos nucleicos específicos aqui descritas também incluem ácidos nucleicos modificados por uma questão de otimizar a utilização de
114/237 codões em uma célula hospedeira ou organismo em particular. As diferenças na utilização de codões entre os organismos pode levar a uma variedade de problemas relacionados com a expressão do gene heterólogo. Otimização de códon mudando um ou mais nucleotídeos da sequência original pode resultar em uma otimização da expressão de um ácido nucleico, em particular, na otimização da eficácia de tradução, em um hospedeiro homólogo ou heterólogo, em que o referido ácido nucleico é expresso.
[00258] De acordo com a invenção, uma variante, forma derivada, modificado ou um fragmento de uma sequência de ácido nucleico, a sequência de aminoácidos, ou peptídeo tem de preferência uma propriedade funcional da sequência de ácido nucleico, sequência de aminoácidos, ou peptídeo, respectivamente, a partir da qual ele tem foram derivadas. Tais propriedades funcionais compreendem a interação com ou de ligação a outras moléculas. Em uma concretização, uma variante, forma derivada, modificado ou fragmento de uma sequência de ácido nucleico, sequência de aminoácidos, ou peptídeo é imunologicamente equivalente à sequência de ácido nucleico, sequência de aminoácidos, ou peptídeo, respectivamente, a partir do qual ela foi derivada.
[00259] Preferencialmente o grau de identidade entre uma sequência de ácido nucleico específica e uma sequência de ácido nucleico que é modificada em relação à ou que é uma
115/237 variante da referida sequência de ácido nucleico específica será de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou mais de preferência, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Relativamente variantes de ácidos nucleicos CLDN6, o grau de identidade é de preferência determinado por uma região de pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 550, pelo menos cerca de 600 ou, pelo menos, cerca de 630 nucleotídeos. Em concretizações preferidas, o grau da identidade é determinada para todo o comprimento da sequência de ácido nucleico de referência, tal como as sequências de ácidos nucleicos apresentadas na listagem de sequências. De preferência, as duas sequências são capazes de hibridar e formar um duplex estável umas com as outras, com hibridização de preferência ser levada a cabo sob condições que permitam a hibridação específica entre os polinucleotídeos (condições rigorosas). As condições rigorosas são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, J. Sambrook et ai, Editors, segunda edição, prima Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque e referem-se, por exemplo, a hibridização a 65 ° C em tampão de hibridação (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll,
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0,02% polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino , 2,5 mM de NaH 2 P0 4 (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M / citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após a hibridação, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 * SSC à temperatura ambiente e, em seguida, em 0,1-0,5 * SSC / 0,1 x SDS a temperaturas de até 68 ° C.
[00260] O termo variante de acordo com a invenção também inclui mutantes, variantes de splicing, isoformas, conformações, variantes alélicas, variantes de espécie e homólogos de espécies, em particular aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. Sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Uma espécia homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou amino ácido com uma espécie diferente de origem a partir de que uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos.
[00261] Para os fins da presente invenção, variantes de uma sequência de aminoácidos amino compreendem variantes de inserção, variantes de adição de ácido de aminoácidos, variantes de deleção de amino ácidos e / ou variantes de substituição de aminoácidos. Amino ácido variantes de deleção que abrangem a deleção na extremidade N-terminal e / ou na
117/237 extremidade C-terminal da proteína também são denominadas variantes de truncamento C-terminal e / ou N- terminal.
[00262] Variantes de aminoácido variantes de inserção compreendem inserções simples ou de dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos em um sítio particular em uma sequência de aminoácidos, embora com a inserção aleatória o rastreio adequado do produto resultante também é possível.
[00263] Variantes de adição de aminoácidos compreendem
fusões amino e / ou carboxi-terminal de um ou mais
aminoácidos, tais como 1 , 2, 3, 5, 10, 20 , 30, 50, ou mais
aminoácidos.
[00264] Variantes de aminoácido de deleção são
caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tais como por remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ou mais aminoácidos. As deleções podem estar em qualquer posição da proteína.
[00265] As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência a ser removido e outro resíduo de ser inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações estar em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas ou peptídeos homólogos e / ou a substituição de
118/237 aminoácidos com outros que têm propriedades semelhantes. De preferência, alterações de aminoácidos nas variantes proteicas são as alterações de aminoácidos conservativas, isto é, substituições de aminoácidos semelhante carregadas ou não carregadas. Uma mudança de aminoácidos conservativa envolve a substituição de uma de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Aminoácidos que ocorrem naturalmente são geralmente divididos em quatro famílias: ácido (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não-polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), e não carregados polar (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina) aminoácidos. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são por vezes classificadas em conjunto como aminoácidos aromáticos.
[00266] No que diz respeito à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 37, o termo variante refere-se, em particular, a uma sequência em que a cisteína na posição 46 é substituído por um outro aminoácido diferente de cisteína tal como um aminoácido, como mencionado acima, de preferência, glicina, alanina, serina, treonina, valina ou leucina.
[00267] De preferência, o grau de semelhança, preferivelmente identidade entre uma sequência específica de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é modificada em relação a, ou que é uma variante da referida sequência de
119/237 aminoácidos específica, tal como entre as sequências de aminoácidos que mostram homologia substancial será de pelo menos 70 %, de preferência pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou mais de preferência, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de semelhança ou de identidade é dada preferência para uma região de aminoácidos que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a sequência de aminoácidos de referência é constituído por 200 aminoácidos, o grau de similaridade ou de identidade é dada preferência durante pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180, ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência os aminoácidos contínuos. Relativamente variantes polipeptídicas CLDN6, o grau de similaridade ou de identidade é dada preferência para uma região de pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180, pelo menos cerca de 200, ou pelo menos cerca de 210 aminoácidos. Em concretizações preferidas, o grau de similaridade ou de
120/237 identidade é determinada para a totalidade do comprimento da sequência de aminoácidos de referência, tais como as sequências de aminoácidos apresentadas na listagem de sequências. O alinhamento para determinar a similaridade de sequência, de preferência de identidade de sequência pode ser realizada com as ferramentas da arte conhecida, utilizando de preferência o melhor alinhamento de sequências, por exemplo, utilizando Align, utilizando definições normalizadas, de preferência EMBOSS: needle, Matriz: Blosum62, Gap Abrir 10,0, Gap Estender 0,5.
[00268] Similaridade de sequência indica a percentagem de aminoácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. Identidade de sequência entre dois polipeptídeo ou sequências de ácidos nucleicos que indica a percentagem de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos entre as sequências.
[00269] A percentagem de identidade é obtido depois de o melhor alinhamento, sendo esta percentagem puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências a serem distribuídos aleatoriamente e ao longo de todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos são convencionalmente realizada por comparação destas sequências, depois de ter alinhado-los de forma óptima, referida
121/237 comparação ser efetuada pelo segmento ou janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento óptimo das sequências para comparação pode ser produzido, além manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, App anúncios. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EUA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, N e BLAST TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Ciência Drive, Madison, Wisconsin).
[00270] A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências a serem comparadas, dividindo este valor pelo número de posições de comparação e multiplicando o resultado obtido por 100, de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.
[00271] Substituições conservativas, pode ser feita, por exemplo, com base em semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e / ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo: (a) não polares (hidrofóbicos) incluem os aminoácidos alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina,
122/237 triptofano, e metionina; (B) os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, e glutamina; (C) carregados positivamente (básicos) incluem os aminoácidos arginina, lisina e histidina; e (d) ácidos carregados negativamente (ácidos) incluem amino ácido aspártico e ácido glutâmico. As substituições podem ser feitas tipicamente dentro dos grupos (a) - (d). Além disso, glicina e prolina pode ser substituída por uma outra com base na sua capacidade para perturbar cchélices. Algumas substituições preferidas podem ser feita entre os seguintes grupos: (i) S e T; (Ii) P e G; e (iii) A, V, G e I. Dado o código genético conhecido, e técnicas de DNA recombinante e sintéticas, o cientista especialista pode prontamente construir DNAs que codificam as variantes de aminoácidos conservativas.
[00272] A presente invenção compreende anticorpos em que foram feitas alterações na região Fc, de modo a alterar as propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Tais alterações podem resultar em uma diminuição ou aumento de ligação Clq e vinculativa CDC ou de FcyR e ADCC. As substituições podem, por exemplo, ser feita em um ou mais dos resíduos de aminoácidos da região constante da cadeia pesada, causando assim uma alteração em uma função efectora, mantendo a capacidade de se ligar ao antígeno, em comparação com o anticorpo modificado, por exemplo, US
123/237
5,624,821 e US 5,648,260.
[00273] A meia-vida in vivo de anticorpos pode ser melhorada através da modificação do epítopo de receptor de salvamento do domínio constante de Ig ou um domínio constante de tipo Ig tal que a molécula não contém um domínio CH2 intacta ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6,121,022 e US 6,194,551. A meia-vida in vivo podem, além disso, ser aumentada, fazendo mutações na região Fe, por exemplo, substituindo a treonina para a leucina na posição 252, substituindo a treonina por serina na posição 254, ou por substituição de treonina por fenilalanina na posição 256, cf. US 6,277,375.
[00274] Além disso, o padrão de glicosilação de anticorpos podem ser modificados de modo a alterar a função efectora dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos em um transfectoma que não adicionar a fucose a unidade normalmente ligado a Asn na posição 297 da região Fc de modo a aumentar a afinidade da regi Fc para Fc-receptores que, por sua vez, resultará em um aumento da ADCC dos anticorpos na presença de células NK, cf. Proteger et al. (2002) JBC, 277:26733. Para além disso, a modificação de galactose pode ser feita de modo a modificar CDC.
[00275] Alternativamente, em uma outra concretização, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de um anticorpo anti-CLDN6 sequência de
124/237 codificação, tal como por mutagénese de saturação, e os anticorpos resultantes anti-CLDN6 modificados podem ser rastreados para a atividade de ligação.
[00276] De acordo com a invenção, o termo célula ou célula hospedeira refere-se preferencialmente a uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não liberte os seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelos, ou material genético. Uma célula intacta é de preferência uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de levar a cabo as suas funções metabólicas normais. Preferencialmente, o referido termo refere-se de acordo com a invenção, para qualquer célula que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. O termo célula inclui de acordo com a invenção as células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células eucarióticas (por exemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HeLa, células de levedura, e células de insecto). O ácido nucleico exógeno pode ser encontrado no interior da célula (i) livremente dispersas, tais como, (ii) incorporados em um vector recombinante, ou (iii) integrado no genoma da célula hospedeira ou do DNA mitocondrial. As células de mamífero são particularmente preferidos, tais como as células de seres humanos, ratos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas a partir de um grande número de
125/237 tipos de tecidos e incluem células primárias e linhagens célulares. Exemplos específicos incluem os queratinócitos, leucócitos do sangue periférico, células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias. Em outras concretizações, a célula é uma célula apresentadora de antígeno, em especial células dendríticas, um monócito, ou macrófago. O termo célula hospedeira, tal como aqui utilizado, de preferência, destina-se a referir-se a uma célula na qual um vector de expressão recombinante tenha sido introduzido.
[00277] Uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico de preferência expressar o peptídeo ou a proteína codificada pelo ácido nucleico.
[00278] O termo animal transgênico refere-se a um animal com um genoma que compreende um ou mais transgenes, de preferência, transgenes de cadeia pesadas e / ou leves, ou transcromossomas (ou integrados ou não integrados no DNA genômico natural dos animais) e que é, de preferência, capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve humana e um transgene humano, quer de cadeia pesada humana ou transcromossoma de cadeia pesada, de tal modo que o rato produza anticorpos anti-CLDN6 humanos quando imunizados com antígeno e / ou células que expressam CLDN6 CLDN6. O transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA
126/237 cromossômico do rato, como é o caso dos ratos transgênicos, por exemplo, camundongos HuMAb, tais como ratos HCo7 ou HCol2, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para camundongos transcromossômico (por exemplo, KM), tal como descrito no documento WO 02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômico podem ser capazes de produzir vários isotipos de anticorpos monoclonais humanos
para CLDN6 (por exemplo, IgG, IgA e / ou IgE) por sofrer
recombinação VDJ e troca de isotipo.
[00279] Redução ou inibir, como aqui utilizado,
significa a capacidade para causar uma diminuição global, de
preferência, de 5% ou superior, 10% ou mais, 20% ou mais, mais preferivelmente, de 50% ou maior, e mais preferivelmente, de 75% ou superior, no nível, por exemplo, no nível de proliferação de células. O termo inibição ou frases semelhantes inclui uma inibição completa ou essencialmente completa, isto é, uma redução a zero ou essencialmente zero.
[00280] Termos tais como aumentar ou melhorar referem-se de preferência um aumento ou melhoria de pelo menos cerca de 10%, de preferência, pelo menos 20%, de preferência, pelo menos 30%, mais preferencialmente, pelo menos 40%, mais preferencialmente, pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 80%, e mais preferivelmente,
127/237 pelo menos 100%. Estes termos podem também se referir a circunstâncias, em que, no tempo zero, há nenhum sinal detectável para um determinado composto ou condição e um ponto no tempo determinado depois do que o tempo zero, há um sinal detectável para um determinado composto ou condição.
[00281] O termo imunologicamente equivalente significa que a molécula imunologicamente equivalente, tal como a sequência de aminoácidos imunologicamente equivalente exibe a mesma ou essencialmente a mesma propriedades imunológicas e / ou exerce a mesma ou essencialmente os mesmos efeitos imunológicos, por exemplo, no que diz respeito ao tipo de o efeito imunológico, tais como a indução de uma resposta humoral e / ou resposta imune celular, a resistência e / ou a duração da reação imune induzida, ou a especificidade da reação imunológica induzida. No contexto da presente invenção, o termo imunologicamente equivalente é usado, de preferência, em relação aos efeitos imunológicos ou propriedades de um peptídeo ou variante de peptídeo utilizado para a imunização. Uma propriedade imunológica específica é a capacidade de se ligar a anticorpos e, se for caso disso, geram uma resposta imunológica, de preferência, estimulando a geração de anticorpos. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é imunologicamente equivalente a uma sequência de aminoácidos de referência, se a referida sequência de aminoácidos quando expostos ao sistema imunológico de um
128/237 indivíduo induz uma reação imunológica, de um modo preferido anticorpos, tendo especificidade de reagir com a sequência de aminoácidos de referência, tal como a sequência de aminoácidos de referência que faz parte de CLDN6.
[00282] A expressão funções imunológicas efetoras, no contexto da presente invenção inclui quaisquer funções mediadas por componentes do sistema imunológico que resultam na inibição do crescimento do tumor e / ou inibição de desenvolvimento de tumor, incluindo a inibição da disseminação de tumores e metástases. Preferencialmente, as funções efetoras imunes resultam na morte de células tumorais. Preferencialmente, as funções efetoras imunológicas, no contexto da presente invenção são as funções efetoras mediadas por anticorpos. Tais funções compreendem citotoxicidade dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), indução de apoptose nas células que transportam o antígeno associado a um tumor, por exemplo, por ligação do anticorpo a um antígeno de superfície, e / ou inibição da proliferação das células que transportam o antígeno associado a um tumor, de preferência de ADCC e / ou CDC. Assim, os anticorpos que são capazes de mediar uma ou mais funções efetoras imunes são de preferência capazes de mediar a morte de células através da indução de lise mediada por ADCC ou lise mediada por CDC, a apoptose, a adesão homotípica, e / ou
129/237 fagocitose, de preferência, através da indução de lise e / ou a lise mediada por ADCC CDC-mediada. Os anticorpos também podem exercer um efeito simplesmente pela ligação a antígenos associados a tumores na superfície de uma célula tumoral. Por exemplo, os anticorpos podem bloquear a função do antígeno associado a um tumor ou induzir a apoptose ligando-se apenas para o antígeno associado a um tumor na superfície de uma célula tumoral.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Mecanismos de ação mAb
[00283] Embora o seguinte forneçã considerações sobre o mecanismo subjacente a eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção, não é para ser considerado como limitando de qualquer forma a invenção.
[00284] Os anticorpos aqui descritos podem interagir com componentes do sistema imunológico, de preferência, através de ADCC ou CDC. Os anticorpos da invenção também podem ser utilizados para direcionar cargas (por exemplo, radioisótopos, fármacos ou toxinas) para matar células tumorais diretamente ou podem ser utilizados em sinergia com agentes quimioterapêuticos tradicionais, atacar os tumores por meio de mecanismos de ação complementares, que podem incluir as respostas imunológicas anti-tumorais que pode ter sido comprometida devido a efeitos colaterais citotóxicos dos quimioterapêuticos sobre os linfócitos T. No entanto, os
130/237 anticorpos da invenção podem também exercer um efeito simplesmente pela ligação a CLDN6 na superfície da célula, assim, por exemplo, bloquear a proliferação das células.
Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos
[00285] ADCC descreve a capacidade de matar células de células efetoras, tal como aqui descrito, particularmente linfócitos, que requer um modo preferido a célula alvo a ser marcado por um anticorpo.
[00286] ADCC, preferencialmente, ocorre quando os anticorpos se ligam aos antígenos sobre as células tumorais e os domínios de anticorpo Fc envolvem receptores Fc (FcR) na superfície de células efetoras imunológicas. Várias famílias de receptores de Fc foram identificadas, e as populações de células específicas caracteristicamente expressa definindo receptores Fc. ADCC pode ser visto como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição do tumor imediato que conduz a apresentação de antígeno e a indução de respostas de células T dirigida ao tumor. De um modo preferido, in vivo, a indução de ADCC conduzirá a tumorrespostas de células T dirigidas e as respostas de anticorpos derivados do hospedeiro.
Citotoxicidade dependente de complemento
[00287] CDC é outro método de matar células que pode ser dirigida por anticorpos. Isotipo IgM é o mais eficaz para a activação do complemento. IgGl e IgG3 também são muito
131/237 eficazes em dirigir CDC através da via do complemento, activação clássica. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos antígeno-anticorpo resulta na desvelamento de locais de ligação de Clq em múltiplos proximidade nos domínios CH2 de participar moléculas de anticorpos, tais como moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl). De preferência, estes locais de ligação de Clq desencobertos converter a interação Clq-IgG anteriormente baixa afinidade para um de avidez elevada, o que desencadeia uma cascata de acontecimentos que envolvem uma série de outras proteínas do complemento e leva à libertação proteolítica dos quimiotácticos de célula efectora / agentes de activação C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque à membrana, o que cria poros na membrana da célula que facilitam a passagem livre de água e de solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos
[00288] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica de hibridização de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975) . Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridização de células somáticas, em princípio, podem ser utilizadas outras técnicas para a
132/237 produção de anticorpos monoclonais, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de exibição em fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos.
[00289] O sistema de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema murino. Produção de Hibridoma no rato é um procedimento muito bem estabelecida. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenitos imunizados para a fusão são conhecidos no estado da técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
[00290] Outros sistemas de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o rato e o sistema do coelho (por exemplo, descrito em Spieker-POLET et ai, Proc Natl Acad Sci EUA 92:9348 (1995), ver também Rossi et al, Am. J. Clin Pathol 124:295 (2005)).
[00291] Em ainda outra concretização preferida, os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CLDN6 pode ser gerado utilizando camundongos transgênicos que transportam transcromossômico ou partes do sistema imunológico humano em vez do sistema do rato. Estes camundongos transgênicos e transcromossómicos incluem camundongos, conhecidos como camundongos e ratos HuMAb KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como
133/237 camundongos transgênicos. A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos pode ser realizada como descrito em detalhes para CD20 no documento WO 2004035607.
[00292] Ainda uma outra estratégia para a geração de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes que codificam anticorpos de linfócitos que produzem anticorpos da estratégia definida por exemplo, ver Babcock et al., 1996; Uma estratégia inovadora para a produção de anticorpos monoclonais de linfócitos individuais isolados, que produzem anticorpos da estratégia definida. Para obter detalhes de engenharia anticorpo recombinante ver também Welschof e Kraus, antibodes recombinantes para terapia do câncer ISBN-089603-918-8 e Benny KC Lo Antibody Engenharia ISBN 1-58829092-1.
Imunizações
[00293] Para gerar anticorpos para CLDN6, os ratos podem ser imunizados com os peptídeos conjugados com transportadores derivados da sequência CLDN6, uma preparação enriquecida de forma recombinante expressa antígeno CLDN6 ou seus fragmentos e / ou células que expressam CLDN6 ou seus fragmentos, como descrito. Alternativamente, os ratos podem ser imunizados com DNA que codifica comprimento completo CLDN6 humana ou seus fragmentos. No caso em que as imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno CLDN6 não resultarem em anticorpos,
134/237 os ratos podem ser imunizados com células que expressam CLDN6, por exemplo, uma linha de células, para promover respostas imunes.
[00294] A resposta imune pode ser monitorada ao longo do protocolo de imunização com amostras de plasma e de soro a ser obtido pela veia da cauda ou hemorragias retro-orbital. Os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-CLDN6 pode ser utilizado para fusões. Ratos pode ser potenciado por via intraperitoneal ou por via intravenosa com células CLDN6 que expressam 3-5 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas secretores de anticorpos específicos.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais
[00295] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais para CLDN6, células de nódulos linfáticos ou do baço obtidas a partir de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem celular imortalizada adequada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem então ser rastreados para a produção de anticorpos específicos para o antígeno. Os poços individuais podem então ser rastreados por ELISA para anticorpos que segregam hibridomas. Por imunofluorescência e análise de FACS utilizando células que expressam CLDN6, anticorpos com especificidade para CLDN6 pode ser identificado. O anticorpo pode ser hibridomas
135/237 secretores replatados, peneirados novamente e se ainda positivo para anticorpos monoclonais anti-CLDN6 podem ser subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivadas in vitro para gerar o anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização. Geração de transfectomas para Produzir Anticorpos Monoclonais
[00296] Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes, como são bem conhecidos no estado da técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
[00297] Por exemplo, em uma concretização, o gene (s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpos, pode ser ligado em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica, tal como utilizado pelo sistema de expressão do gene de GS revelados nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos no estado da técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, as células NS / 0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas, como as células derivadas de plantas, fúngica ou de leveduras. O método utilizado para introduzir estes genes podem ser os
136/237 métodos descritos no estado da técnica, tais como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes de anticorpo nas células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados para o seu nível de expressão e upscaled para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e / ou das células.
[00298] Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expresso em outros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais não humanos transgênicos, tais como em leite de ovelhas e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgênicas; por exemplo, ver Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Utilização de sequências parciais de anticorpos para expressar anticorpos intactos (isto é humanização e quimerização).
Quimerização
[00299] Os anticorpos monoclonais de murídeo podem ser utilizadas como anticorpos terapêuticos em seres humanos
137/237 quando marcados com toxinas ou isótopos radioativos. Anticorpos de murino não marcado são altamente imunogênicos no homem quando aplicada repetidamente conduzindo à redução do efeito terapêutico. A principal imunogenicidade é mediada pelas regiões constantes de cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos de murídeo em seres humanos pode ser reduzida ou completamente evitada se os respectivos anticorpos são quimerizado ou humanizado. Os anticorpos quiméricos são anticorpos, as diferentes porções das quais são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles que possuem uma região variável derivada de um anticorpo murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Quimerização de anticorpos é conseguido pela união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos de murino com a região constante da cadeia pesada e leve humana (por exemplo, tal como descrito por Kraus et al., Em Methods in Molecular Biology, séries de anticorpos recombinantes para câncer ISBN 0-89603-918-8-terapia). Em uma concretização preferida os anticorpos quiméricos são produzidos unindo-kappa humano de cadeia leve da região constante de região variável de cadeia leve de murino. Em uma concretização anticorpos quiméricos também preferidos podem ser gerados por se juntar humano cadeia lambda-leve da região constante de região variável de cadeia leve de murino. As regiões constantes da cadeia pesada preferidas para a geração de anticorpos quiméricos são IgGl,
138/237
IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes de cadeia pesada preferidas para a geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM.
Humanização
[00300] Anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados na complementaridade de seis cadeia pesada e leve a regiões determinação (CDRs) . Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora dos CDRs. Porque as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo que ocorre naturalmente enxertado específicas em sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al (1998) Nature 332:: 323-327; Jones, P. et al (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci EUA 86: 10029-10033). Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicas que incluem sequências de genes de anticorpos da linhagem germinativa. Estas sequências da linhagem germinativa irão variar a partir de sequências de genes de
139/237 anticorpos maduros porque eles não incluem genes variáveis completamente montados, que são formados por V (D) J durante a maturação de células B aderindo a sequências de genes da linhagem germinal, também será diferente a partir das sequências de um anticorpo de elevada afinidade reportório secundário no indivíduo uniformemente em toda a região variável. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção amino-terminal da região de estrutura 1 e da porção carboxi-terminal da região de estrutura 4. Por outro lado, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário para se obter a sequência de DNA inteira de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver documento WO 99/45962). Sequências parciais de cadeia leve e pesada que abrangem as regiões CDR são tipicamente suficientes para este fim. A sequência parcial é utilizada para determinar qual variável e segmentos do gene da linha germinal que unem contribuiu para os genes variáveis de anticorpo recombinado. A sequência da linhagem germinativa é então utilizada para preencher as porções das regiões variáveis em falta. Sequências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar
140/237 sequências faltantes, sequências de DNAc clonadas podem ser combinadas com os oligonucleotídeos sintéticos de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de curtas, que se sobrepõem, a oligonucleotídeos e combinado através de amplificação por PCR para criar um clone da região variável totalmente sintético. Este processo tem certas vantagens, tais como a eliminação ou inclusão ou determinados locais de restrição, ou otimização de codões específicos.
[00301] As sequências de nucleotídeos dos transcritos da cadeia pesada e leve a partir de hibridomas são utilizados para conceber um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar sequências V sintéticas com aminoácidos idênticos de codificação capacidades como as sequências naturais. As sequências das cadeias pesada e kappa sintéticos podem diferir das sequências naturais de três formas: cadeias de bases de nucleotídeos repetidos são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e amplificação por PCR; locais de iniciação da tradução ideal são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol Chem 266:19.86719.870); e locais HindIII são manipulados a montante dos locais de iniciação da tradução.
[00302] Para ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, a codificação correspondente optimizado e não
141/237 de codificação, sequências de cadeia são divididos em 30-50 nucleotídeos, aproximadamente, no ponto central do oligonucleotídeo não codificante correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em conjuntos duplos sobrepostos de cadeia que abrangem segmentos de 150-400 nucleotídeos. As piscinas são então utilizados como moldes para produzir produtos de amplificação de PCR de 150- 400 nucleotídeos. Normalmente, um único conjunto de região de oligonucleotídeo variável será dividido em dois grupos que são amplificados em separado para gerar dois sobrepostos produtos de PCR. Estes produtos sobrepostos são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Também pode ser desejável incluir um fragmento de sobreposição da cadeia pesada ou leve constante na região de amplificação por PCR para gerar fragmentos que podem ser facilmente clonados nas construções de vectores de expressão.
[00303] As regiões variáveis da cadeia pesada e leve reconstruída quimerizada ou humanizadas são, então, combinados com o promotor clonado, líder, a iniciação da tradução, a região constante 3' não traduzida, de poliadenilação, e sequências de terminação de transcrição para formar construções de vector de expressão. As construções de expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinadas em um único vector, co-transfectadas, serialmente
142/237 transfectadas, ou separadamente transfectadas em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias. Os plasmídeos para a utilização na construção de vetores de expressão para IgGK humano são descritos. Os plasmídeos podem ser construídos, de modo a que o PCR amplificado V kappa pesada V e sequências de DNAc da cadeia leve podem ser utilizadas para reconstruir minigenes completos de cadeia pesada e leve. Estes plasmídeos podem ser usados para expressar completamente anticorpos humano, ou quimérico IgGl, IgG4 ou Kappa, semelhante a Kappa.
[00304] Os plasmídeos podem ser construídos para a expressão de outros isotipos da cadeia pesada, ou para a expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves lambda.
[00305] Assim, em um outro aspecto da invenção, as características estruturais dos anticorpos anti-CLDN6 da invenção, são utilizadas para criar anticorpos humanizados anti-estruturalmente relacionados CLDN6 que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tais como ligação para CLDN6. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de anticorpos monoclonais de camundongo podem ser combinados de forma recombinante conhecidas com regiões estruturais humanas e CDRs para criar os anticorpos humanizados adicional recombinantemente concebidos, antiCLDN6 da invenção.
Ligação às células expressando antígeno
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[00306] A capacidade do anticorpo para se ligar CLDN6 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação convencionais, tais como os apresentados nos exemplos (por exemplo, ELISA, Western Blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo).
Isolamento e caracterização de anticorpos
[00307] Para purificar anticorpos anti-CLDN6, os hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos de dois litros giratórios para a purificação de anticorpo monoclonal. Alternativamente, os anticorpos anti-CLDN6 podem ser produzidos com base em biorreatores de diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrado antes da cromatografia de afinidade com proteína G-Sepharose ou proteína A-Sepharose. A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -80° C.
[00308] Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-CLDN6 selecionados se ligam a epítopos únicos, mutagênese dirigida ao local ou múltiplos locais dirigidos podem ser utilizados.
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Determinação do Isotipo
[00309] Para determinar o isotipo de anticorpos
purificados, ELISAs isotípicos com vários kits comerciais
(por exemplo, Zymed, Roche Diagnostics) pode ser realizada.
Os poços das placas de microtitulação podem ser revestidos
com anti-Ig de camundongo. Após o bloqueio, as placas reagem com anticorpos monoclonais ou controles de isotipo purificado, à temperatura ambiente durante duas horas. As cavidades podem em seguida ser reagir com qualquer um IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3, IgA ou IgM de camundongo específico de sondas conjugados com peroxidase. Após lavagem, as placas podem ser desenvolvidas com substrato ABTS (1 mg / ml) e analisadas a OD de 405-650. Alternativamente, o Kit IsoStrip de isotipagem anticorpo monoclonal de rato (Roche, Cat. No. 1493027) pode ser utilizado tal como descrito pelo fabricante.
Análise por citometria de fluxo
[00310] A fim de demonstrar a presença de anticorpos anti-CLDN6 em soros de camundongos imunizados ou de ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLDN6, a citometria de fluxo pode ser usada. As linhagens celulares que expressam naturalmente ou após transfecção CLDN6 e controles negativos sem expressão CLDN6 (cultivadas sob condições de crescimento normais) pode ser misturado com várias concentrações de anticorpos monoclonais em
145/237 sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo 1% de FBS, e pode ser incubado a 4 ° C durante 30 min. Após a lavagem, o anticorpo IgG anti-Alexa647 ou APC- marcado pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado CLDN6 sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando luz e propriedades de dispersão lateral, a porta em células vivas individuais. De modo a distinguir os anticorpos monoclonais específicos para CLDN6 de ligantes não específicos de uma única medição, o método de co-transfecção pode ser empregue. As células transfectadas transientemente com plasmidos que codificam CLDN6 e um marcador fluorescente podem ser coradas, como descrito acima. As células transfectadas pode ser detectada em um canal de fluorescência diferente do que as células marcadas com o anticorpo. Como a maioria das células transfectadas expressam ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais específicos para CLDN6 ligam-se preferencialmente a células que expressam o marcador de fluorescência, enquanto que os anticorpos não específicos se ligam em uma proporção comparável de células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado para além ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exactamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.
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Microscopia de imunofluorescência
[00311] A fim de demonstrar a presença de anticorpos anti-CLDN6 em soros de camundongos imunizados ou de ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLDN6, análise de microscopia de imunofluorescência podem ser utilizados. Por exemplo, linhagens celulares que expressam quer os controles espontaneamente ou após a transfecção CLDN6 e negativo a que falta expressão CLDN6 são cultivadas em lâminas de câmaras de crescimento, sob condições padrão em meio DMEM / F12, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. As células podem ser então fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixada sem tratamento. As células podem então reagir com os anticorpos monoclonais contra CLDN6 durante 30 min. a 25 ° C. Após lavagem, as células podem reagir com um anticorpo anti- IgG de rato marcado com Alexa555 secundário (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem então ser examinadas por microscopia de fluorescência.
[00312] Os níveis totais de CLDN6 em células pode ser observado quando as células são fixadas metanol ou paraformaldeído fixadas e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e não-permeabilizadas, células fixadas paraformaldeído superfície localização de CLDN6 pode ser examinado. Além disso direcionamento de CLDN6 para junções
147/237 apertadas podem ser analisados por co-coloração com marcadores de junção apertados tais como ZO-1. Além disso, os efeitos do anticorpo de ligação e localização CLDN6 dentro da membrana da célula pode ser examinado.
Western Blot
[00313] IgG anti-CLDN6 pode ser adicionalmente testada quanto à reatividade com o antígeno CLDN6 por Western Blotting. Resumidamente, os extratos celulares a partir de células que expressam CLDN6 e controles negativos apropriados podem ser preparados e submetidos a dodecil sulfato de sódio (SDS) electroforese em gel de poliacrilamida. Após a electroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. IgG de ligação pode ser detectada usando peroxidase anti-IgG de camundongo e reveladas com substrato ECL.
Imuno-histoquímica
[00314] IgG Anti-CLDN6 de rato pode ser adicionalmente testada quanto à reatividade com o antígeno CLDN6 por imunohistoquímica de um modo bem conhecido para o técnico versado no assunto, por exemplo, utilizando acetona ou paraformaldeído fixo em criossecções ou secções de tecido embebidas em parafina fixadas com paraformaldeído a partir de tecido não-câncer ou amostras de tecido de câncer obtidos a partir de pacientes durante os procedimentos cirúrgicos de
148/237 rotina ou de camundongos portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de células que expressam espontaneamente ou após a transfecção CLDN6. Para a imunocoloração, anticorpos reativos para CLDN6 pode ser incubada seguido de peroxidase de rábano de cabra anti-rato conjugado ou anticorpos anti-coelho de cabra (DAKO) de acordo com as instruções do fabricante.
Atividades Fagocíticas e morte celular de anticorpos in vitro
[00315] Além de se ligar especificamente a CLDN6, anticorpos anti-CLDN6 podem ser testados quanto à sua capacidade para mediar a fagocitose e morte de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular. O ensaio de actividade de anticorpo monoclonal in vitro irão proporcionar uma triagem inicial antes do ensaio em modelos in vivo.
Citotoxicidade mediada por células dependentes de Anticorpo (ADCC):
[00316] Resumidamente, as células polimorfonucleares (PMNs), células NK, monócitos, células mononucleares ou outras células efetoras, a partir de doadores saudáveis podem ser purificadas por centrifugação por densidade Ficoll Hypaque, seguido de lise de eritrócitos contaminantes. Células efetoras lavadas podem ser suspensas em RP I suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inativado pelo calor ou, em alternativa, com 5% de soro humano inativado
149/237 pelo calor e misturado com 51Cr marcadas células alvo que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua célula superfície, em várias proporções de células efetoras para células alvo. Alternativamente, as células alvo podem ser marcadas com um ligante de reforço fluorescente (BATDA). Um quelato de európio altamente fluorescente com o ligando de reforço que é libertado a partir de células mortas pode ser medido por um fluorômetro. Outra técnica alternativa pode utilizar a transfecção de células alvo com a luciferase. Adicionado amarelo lucifer pode, então, ser oxidado por apenas as células viáveis. IgG anti-CLDN6 purificada pode então ser adicionada em várias concentrações. IgG humana irrelevante pode ser usada como controle negativo. Os ensaios podem ser realizados durante 4 a 20 horas a 37° C, dependendo do tipo de célula efetora utilizado. As amostras podem ser ensaiadas para a citólise por medição de liberação de 5lCr ou a presença do quelato EuTDA no sobrenadante da cultura. Alternativamente, a luminescência resultante da oxidação de Amarelo Lúcifer pode ser uma medida de células viáveis.
[00317] Os anticorpos monoclonais anti-CLDN6 também podem ser testados em várias combinações para determinar se a citólise é melhorada com vários anticorpos monoclonais. Citotoxicidade dependente do complemento (CDC):
[00318] Os anticorpos monoclonais anti-CLDN6 podem ser
150/237 testados quanto à sua capacidade para mediar CDC, usando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, para o complemento de soro podem ser obtidos a partir do sangue de uma maneira conhecida por um técnico versado no assunto. Para determinar a atividade CDC de mAb, pode ser utilizado métodos diferentes. 51Cr pode ser liberado, por exemplo, sendo medido ou elevada permeabilidade da membrana pode ser avaliada utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propídio (PI). Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e 5 x 105 / mL pode ser incubado com várias concentrações de mAb para 1030 min. à temperatura ambiente ou a 37° C. O soro ou plasma pode ser, em seguida, adicionado a uma concentração final de 20% (v / v) e as células incubadas a 37° C durante 20-30 min. Todas as células a partir de cada amostra podem ser adicionadas à solução de PI para um tubo de FACS. A mistura pode então ser analisadas imediatamente por análise de citometria de fluxo utilizando FACSArray.
[00319] Em um ensaio alternativo, a indução da CDC pode ser determinada em células aderentes. Em uma concretização deste ensaio, as células são semeadas 24 horas antes do ensaio com uma densidade de placas de microtitulação de plano de fundo de 3 x 10 / cavidade de cultura de tecidos. O meio de crescimento do próxima dia é removido e as células são incubadas em triplicado com os anticorpos. As células de controle são incubadas com meio de crescimento ou em meio de
151/237 crescimento contendo 0,2% de saponina para a determinação da lise mínima e lise máxima, respectivamente. Após incubação durante 20 min. à temperatura ambiente, o sobrenadante é removido e 20% (v / v) de plasma ou soro humano em DMEM (préaquecido a 37 ° C) é adicionado às células e incubado durante mais 20 min. a 37 ° C. Todas as células a partir de cada amostra são adicionadas a solução de iodeto de propídio (10 ug / ml). Em seguida, os sobrenadantes são substituídos por ml de PBS contendo brometo de emissão de fluorescência e de 2,5 ug / etídio após excitação a 520 nm é medida a 600 nm usando um Tecan Safire. A percentagem de lise específica é calculada da seguinte forma: % de lise específica = (fluorescência da amostra-fluorescência de fundo) / (fluorescência de lise máxima por fluorescência de fundo) x 100.
Inibição da proliferação de células por anticorpos monoclonais:
[00320] Para testar a capacidade de iniciar a apoptose, os anticorpos monoclonais anti-CLDN6 pode, por exemplo, ser incubados com as células tumorais positivas para CLDN6 ou CLDN6 transfectadas células tumorais a 37 ° C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação anexina-V (BD biosciences) e incubadas com anexina V conjugada com (BD biosciences) ou APC FITC durante 15 min. no escuro. Todas as células a partir de
152/237 cada amostra podem ser adicionada à solução de PI (10 g / ml em PBS) em um tubo de FACS e avaliados imediatamente por citometria de fluxo (como acima). Alternativamente, uma inibição geral da proliferação celular por meio de anticorpos monoclonais pode ser detectada com kits disponíveis comercialmente. O Kit DELFIA de Proliferação Celular (PerkinElmer, Cat. N ° AD0200) é um imunoensaio não isotópico com base na medição de 5- bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a incorporação durante a síntese de DNA de células proliferativas em microplacas. BrdU incorporada é detectada através de anticorpo monoclonal marcado com európio. Para permitir a detecção de anticorpos, as células são fixas e DNA desnaturado usando solução Fix. O anticorpo não ligado é removido por lavagem DELFIA e indutor seja adicionado ao dissociar íons európio do anticorpo marcado em solução, onde formam quelatos altamente fluorescentes com componentes do DELFIA indutor. A fluorescência medida - utilizando fluorometria resolvida no tempo na detecção - é proporcional à síntese de DNA na célula de cada poço.
Estudos pré-clínicos
[00321] Os anticorpos monoclonais que se ligam a CLDN6 também podem ser testados em um modelo in vivo (por exemplo, em camundongos imunodeficientes portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhagens de células expressando CLDN6, possivelmente após a transfecção) para
153/237 determinar a sua eficácia no controle do crescimento de células tumorais expressando CLDN6.
[00322] Em estudos in vivo, após xenoenxerto de células tumorais expressando CLDN6 em camundongos imunocomprometidos ou em outros animais pode ser realizada utilizando os anticorpos da invenção. Os anticorpos podem ser administrados a camundongos sem tumor, seguido de injeção das células tumorais para medir os efeitos dos anticorpos para evitar a formação de tumores ou sintomas relacionados com o tumor. Os anticorpos podem ser administrados a camundongos portadores de tumor para determinar a eficácia terapêutica dos anticorpos respectivos para reduzir o crescimento de tumores, metástases de tumores ou sintomas relacionados. Aplicação de anticorpo pode ser combinado com a aplicação de outras substâncias como medicamentos cistostáticos, inibidores do fator de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores da angiogênese ou outros anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e a toxicidade potencial de combinações. Para analisar os efeitos secundários tóxicos mediados por anticorpos, dos animais da invenção podem ser inoculados com anticorpos ou reagentes de controle e exaustivamente investigados quanto a sintomas, possivelmente relacionadas com o tratamento anticorpo CLDN6. Os possíveis efeitos secundários de aplicação in vivo de anticorpos CLDN6 incluem particularmente toxicidade em CLDN6 expressa em
154/237 tecidos incluindo placenta. Os anticorpos que reconhecem CLDN6 em humano e em outras espécies, por exemplo, camundongos, são particularmente úteis para prever os efeitos colaterais potenciais mediados por aplicação de anticorpos monoclonais CLDN6 em seres humanos.
Mapeamento de epítopos
[00323] Mapeamento de epítopos reconhecidos por anticorpos de invenção pode ser realizada como descrito em detalhe em epítopo Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em Mapeamento de Epítopos: A Practical Approach Practical Approach Série, 248 por Olwyn MR Westwood, Frank C. Hay
I - Moléculas biespecíficas / multiespecíficas que se ligam a CLDN6
[00324] Em ainda outra concretização da invenção, os anticorpos para CLDN6 pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga aos locais múltiplos ou ligação alvo epítopos. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não cova lente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação.
155/237
[00325] Por conseguinte, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficos que compreendem pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CLDN6 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Em uma concretização particular da invenção, o segundo epítopo alvo é um receptor de Fc, por exemplo, Fc humano-gammaRI (CD64) ou um receptor Fc-alfa humano (CD89), ou um receptor de células T, por exemplo, CD3. Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficos capazes de se ligar tanto a células efetoras expressando FcgamaR, Fc-alphaR ou Fc-epsilonR (por exemplo, monócitos, células polimorfonucleares macrofágicas (PMNs)), e para as células alvo que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície celular. Estas moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem ter como alvo as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular para células efetoras e podem desencadear as atividades de células efetoras Fc mediada por receptores, tais como fagocitose de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com sua superfície celular, a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), libertação de citocinas, ou a geração de ânion superóxido.
[00326] Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção pode ainda incluir uma terceira especificidade de
156/237 ligação, para além de um anti-Fc e uma especificidade de ligação a especificidade de ligação anti-CLDN6. Em uma concretização, a terceira especificidade de ligação é um fator da porção anti-reforço (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida na atividade citotóxica e, deste modo, aumenta a resposta imunológica contra a célula alvo. A porção anti-fator de reforço pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que se liga a uma determinada molécula, por exemplo, um antígeno ou a um receptor, e deste modo resulta em um aumento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc de antígeno ou célula alvo. A porção anti-fator de reforço pode ligar a um receptor Fc ou um antígeno de células alvo. Alternativamente, a porção antifator de reforço pode ligar-se a uma entidade que diferente da entidade qual a primeira e segunda especificidades de ligao se ligam. Por exemplo, a porção anti-fator de reforço pode ligar-se uma célula T citotóxica (por exemplo, através do CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta em um aumento da resposta imunológica contra a célula alvo).
[00327] Em uma concretização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação, pelo menos, um anticorpo, incluindo, por exemplo, um fragmento Fab, Fab', F (ab')2, Fv,
157/237 ou um Fv de cadeia simples. O anticorpo pode também ser uma cadeia leve ou pesada de cadeia dímera, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, tal como um Fv ou uma única construção de cadeia como descrito em LDNAer et al., US 4,946,778. O anticorpo pode também ser uma ligação-domínio da proteína de fusão de imunoglobulina, tal como descrito no documento US 2003/0118592 e US 2003/0133939.
[00328] Em uma concretização moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção compreendem uma especificidade de ligação para um Fc-gamaR ou um Fc-alphaR presente na superfície de uma célula efetora, e uma segunda especificidade de ligação para um antígeno de células alvo, por exemplo, CLDN6.
[00329] Em uma concretização, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecido por um anticorpo monoclonal, a ligação que não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Tal como aqui utilizado, o termo receptor de IgG refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia gama localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de transmembrana ou receptor solúvel, que são agrupados em três classes de receptores Fc-gama: Fc gammaRI (CD64), Fc-gammaRII (CD32), e Fc-gammaRIII (CD 16). Em uma concretização preferida, o receptor de Fc-gama é um Fc-gammaRI humano de elevada afinidade.
[00330] Em ainda outras concretizações preferenciais,
158/237 a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecido por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, por exemplo, um receptor Fc-alfa (Fc-alphaRI (CD89)), cuja ligação é de preferência não bloqueados por imunoglobulina humana (IgA). O termo receptor de IgA destina-se a incluir o produto do gene de um gene de alfa-(Fc-alphaRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido para codificar as várias isoformas de transmembrana de splicing alternativo de 55-110 kDa. Fc-alphaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos / macrófagos, granulócitos neutrófilos e eosinófilos, mas não em populações de células não-efetoras. Fc-alphaRI tem afinidade tanto para a forma iGal e IgA 2, o qual é aumentado após a exposição a citoquinas tais como GCSF ou GM-CSF (Morton, HC et al (1996) Critical Reviews in Immunology 16:. 423-440). Quatro anticorpos Fc-alphaRIespecíficos monoclonais, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a Fc-alphaRI fora do domínio de ligação ao ligando IgA, foram descritos (Monteiro, RC et al (1992) J. Immunol. 148:. 1764).
[00331] Em uma outra concretização, a molécula biespecífica é composta de dois anticorpos monoclonais de acordo com a invenção, que possuem atividades funcionais complementares, tais como um anticorpo de trabalho predominantemente através da indução de CDC e o outro anticorpo predominantemente trabalhando através da indução de
159/237 apoptose.
[00332] Um anticorpo específico de células efetoras, tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que se liga ao receptor Fc das culas efetoras. Os anticorpos preferidos para utilização na presente invenção ligam o receptor de Fe de células efetoras em um local que não é ligado por imunoglobulina endógena.
[00333] Tal como aqui utilizado, o termo célula efetora refere-se a uma célula imunológica que está envolvido na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imunológica. Células imunológicas exemplificativas incluem células de origem linfóide ou mielóide, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células B e células T, incluindo as células T citolíticas (CTLs), células Killer, as células Killer naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células, granulócitos polimorfonucleares, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos e executam funções específicas do sistema imunológico. Em concretizações preferidas, uma célula efetora é capaz de induzir anticorpo-dependente da citotoxicidade celular (ADCC), por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam o FcR estão envolvidos na morte especifica de células alvo e apresentando antígenos para os outros
160/237 componentes do sistema imune, ou a ligação a células que apresentam antígenos. Em outras concretizações, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo, célula alvo, ou microrganismo. A expressão de um FcR particular, em uma célula efetora pode ser regulada por fatores humorais, tais como citocinas. Por exemplo, a expressão de Fc gammaRI foi encontrada para ser regulada para cima por interferon gama (IFN-γ). Esta expressão aumentada aumenta a atividade citotóxica das células Fc-gammaRI-rolamento contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antígeno alvo ou uma célula-alvo.
[00334] Célula alvo significa qualquer célula indesejável em um sujeito (por exemplo, um ser humano ou animal) que pode ser alvo de um anticorpo da invenção. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou super-expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular. As células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular incluem, tipicamente, as células tumorais.
II. Imunoconjugados
[00335] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-CLDN6 conjugado com uma porção terapêutica ou agente, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Tais
161/237 conjugados, são aqui referidos como imunoconjugadosOs imunoconjugados que incluem um ou mais citotoxinas são referidos como imunotoxinas. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para e, em particular, mata as células. Os exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1desidrotestosterona, os glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos destes.
[00336] Os agentes terapêuticos adequados para a formação de imunoconjugados da invenção incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p.ex., metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabin, 5fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cisdiclorodiamina-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC), e agentes anti-mitótico (por exemplo,
162/237 vincristina e vinblastina). Em uma concretização preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Em uma outra concretização, o agente terapêutico é um imunossupressor. Em ainda outra concretização, o agente terapêutico é GM-CSF. Em uma concretização preferida, o agente terapêutico é a doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou a ricina A.
[00337] Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados com um radioisótopo, por exemplo, iodo131, ítrio-90 ou índio-I ll, para gerar radiofármacos citotóxicos para o tratamento de uma desordem relacionada com o CLDN6, tal como um câncer. Os conjugados de anticorpos da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, a parte do fármaco e não é para ser interpretado como limitado a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma actividade biológica desejada. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou seu fragmento ativo, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral ou o interferão-γ; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator
163/237 estimulante de colônias de macrófagos de granulócitos (GMCSF), fator estimulador de colônias de granulócitos (GCSF), ou outros fatores de crescimento.
[00338] As técnicas para conjugação de tais porção terapêutica de anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., Monoclonal Antibodies Para Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Eds.), 243-56 (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp.; Hellstrom et al., Anticorpos para entrega de drogas, em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (Eds.), 623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987) pp.; Thorpe, Antibody Portadores de agentes citotóxicos na terapia do câncer: uma revisão, em anticorpos monoclonais '84: Aplicações clínicas e biológicas, Pincheraet al. (Eds.), Pp 475-506 (1985).; A análise, resultados e perspectivas futuras do uso terapêutico de Radiolabeled Antibody na terapia do câncer, em anticorpos monoclonais na detecção de câncer e terapia, Baldwin et al. (Eds.), Pp. 30316 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., A preparação e propriedades citotóxicas de conjugados anticorpo-Toxin, Immunol. Rev., 62: 1 19-58 (1982).
[00339] Em uma outra concretização, os anticorpos de acordo com a invenção são ligados a um ligante quelante, por exemplo, tiuxetano, o que permite que o anticorpo possa ser conjugado com um radioisótopo.
164/237
III. Composições Farmacêuticas
[00340] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo uma ou mais combinação de anticorpos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com as técnicas convencionais, tais como as descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed, Mack Publishing. Co., Easton, PA, 1995. Em uma concretização, as composições incluem uma combinação de múltiplos anticorpos isolados (por exemplo, dois ou mais) da presente invenção que atuam por mecanismos diferentes, por exemplo, um anticorpo que atua predominantemente através da indução de CDC em combinação com um outro anticorpo que atua predominantemente através da indução de apoptose.
[00341] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente anti-inflamatório ou, pelo menos, um agente imunossupressor. Em uma concretização de tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes antiinflamatórios, tais como um fármaco esteroidal ou um NSAID
165/237 (drogas anti-inflamatórias não esteróides). Os agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores COX-2, tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), NSAEDs tais como o ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozina (Daypro) e indometacina (Indocin).
[00342] Em uma outra concretização, tais agentes terapêuticos incluem agentes que conduzem à perda ou inactivação funcional das células T reguladoras, como a dose baixa ciclofosfamida, anticorpos anti-CTLA4, anti-IL2 ou anticorpos anti-IL2-receptor.
[00343] Em ainda outra concretização, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes quimioterapêuticos, tais como os derivados de taxol, taxotere, gemcitabin, 5fluorouracilo, doxorubicina (adriamicina), cisplatina (Platinol), ciclofosfamida (Cytoxan, Procytox, Neosar). Em uma outra concretização, os anticorpos da presente invenção podem ser administrados em combinação com agentes quimioterapêuticos, que mostram um modo preferido eficácia terapêutica em pacientes que sofrem de câncer, por exemplo, tipos de câncer, tal como aqui descrito.
[00344] Em ainda outra concretização, os anticorpos da
166/237 invenção podem ser administrados em conjunto com a radioterapia e / ou células troncos da medula óssea ou transplante autólogo periférico.
[00345] Tal como aqui utilizado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores da absorção, e semelhantes, que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, administração espinal ou epidérmico (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, por exemplo, anticorpo, molécula biespecífica e multiespecífico, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[00346] Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver, por exemplo, Berge, SM, et ai (1977) J. Pharm Sci 66: 1-19).
[00347] Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos não tóxicos, como o clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico,
167/237 bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e outros semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N, N'dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaa, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
[00348] Uma composição da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica. Como será apreciado pelos técnicos versados no assunto, a via e / ou modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais
168/237 formulações são geralmente conhecidos dos técnicos versados no assunto. Veja-se, por exemplo, sustentada e controlada lançamento Drug Delivery Systems, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[00349] Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito em um transportador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. Os lipossomas incluem emulsões água-em-óleo-emágua CGF bem como lipossomas convencionais (. Strejan et ai (1984) J. Neuroimmunol 7:27).
[00350] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na arte. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas da presente invenção está contemplada. Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.
[00351]
As composições terapêuticas devem ser
169/237 tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de droga elevada. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e afins), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00352] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto activo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes eem umerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração.
[00353] Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes
170/237 necessários a partir daqueles eem umerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem por vácuo e secagem por congelação (liofilização), que produzem um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.
[00354] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta óptima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido.
[00355] Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em (1) água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de
171/237 sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido tetraacético enediamine acetato (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e outros semelhantes.
[00356] Para as composições terapêuticas, as formulações da presente invenção incluem as adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e / ou parentérica. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na arte de farmácia. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do indivíduo a ser tratado e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade da composição que produz um efeito terapêutico.
[00357] As formulações da presente invenção que são adequadas para administração vaginal incluem também pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou
172/237 formulações para pulverização contendo os veículos que são conhecidos na arte como sendo apropriados. As formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições deste invenção incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, geles, soluções, emplastros e inalantes. O composto activo pode ser misturado sob condições estéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões ou propulsores que possam ser requeridos.
[00358] As frases administração parentérica e administrado parentericamente, tal como aqui utilizado, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica , intraperitoneal, transtracheal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraspinal, injeção e infusão epidural e intrasternal.
[00359] Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tal como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis,
173/237 tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de surfactantes.
[00360] Estas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. Prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto pelos procedimentos de esterilização, e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros semelhantes nas composições. Além disso, absorção prolongada da forma
farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de
agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de
alumínio e gelatina.
[00361] Independentemente da via de administração
selecionada, os compostos da presente invenção podem ser utilizados em uma forma hidratada adequada, e / ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos técnicos versados no assunto.
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[00362] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem sendo tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a actividade farmacocinética das composições particulares da presente invenção utilizado, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e / ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.
[00363] Um médico ou veterinário com conhecimentos correntes na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido em ordem a alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, uma dose diária adequada de uma
175/237 composição da invenção será a quantidade do composto que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. É preferível que a administração seja por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea, de preferência proximal administrado no local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição terapêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente, em formas de dosagem unitárias. Embora seja possível para um composto da presente invenção ser administrado sozinho, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição).
[00364] Em uma concretização, os anticorpos da invenção podem ser administrados por infusão, a infusão contínua de preferência lenta durante um longo período, tal como mais de 24 horas, a fim de reduzir os efeitos secundários tóxicos. A administração também pode ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de entre 2 a 12 horas. Tais regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, depois de 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ser ajustada através da medição da quantidade circulante de anticorpos anti-monoclonais CLDN6 após administração em
176/237 uma amostra biológica usando anticorpos anti-idiotípicos que se dirigem os anticorpos anti-CLDN6.
[00365] Em ainda outra concretização, os anticorpos são administrados por terapia de manutenção, tais como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[00366] Em ainda outra concretização, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados por um regime incluindo uma perfusão de um anticorpo contra CLDN6 seguido de uma infusão de um anticorpo contra CLDN6 conjugado com um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, de 7 a 9 dias depois.
[00367] Em uma concretização da invenção, os compostos terapêuticos da invenção são formulados em lipossomas. Em uma concretização mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de direccionamento. Em uma concretização mais preferida, os compostos terapêuticos em lipossomas são entregues por injeção em bolus a um sítio proximal para a área desejada, por exemplo, o local de um tumor. A composição deve ser fluida até ao ponto que exista seringabilidade fácil. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos.
[00368] Em uma outra concretização, os anticorpos da
177/237 invenção podem ser formulados para evitar ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito por métodos conhecidos no estado da técnica, por exemplo, por PEGilação dos anticorpos ou pela utilização de F (ab) '2 fragmentos. As referências podem ser feitas a CunninghamRundles C, Zhuo Z, B Griffith, Keenan J. (1992), As atividades biológicas dos conjugados de imunoglobulina de polietileno-glicol de resistência à degradação enzimática J. Immunol Methods, 152:... 177- 190; e Landor M. (1995) transferência materno-fetal de imunoglobulinas, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.
[00369] Uma dose terapeuticamente eficaz para a terapia de tumores pode ser medida pelas respostas tumorais objetivas que pode ser completa ou parcial. Uma resposta completa (CR) é definida como ausência de evidência clínica, radiológica ou de outra doença. Uma resposta parcial (PR) resulta de uma redução do tamanho do tumor total superior a 50%. O tempo mediano até à progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta objectiva do tumor.
[00370] Uma dose terapeuticamente eficaz para a terapia de tumores, também pode ser medida pela sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir o câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma
178/237 composio pode ser avaliada examinando a capacidade do composto para inibir o crescimento celular ou a apoptose por meio de ensaios in vitro conhecidos dos técnicos versados no assunto. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outra forma melhorar os sintomas em um sujeito. Um técnico versado no assunto seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do sujeito, e da composição particular ou via de administração seleccionada.
[00371] A composição deve ser estéril e fluida ao ponto de que a composição possa ser entregue por meio de seringa. Além da água, o transportador pode ser uma solução isotónica salina tamponada, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e afins), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. Absorção de longo prazo das composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
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[00372] Quando o composto ativo é adequadamente protegido, como descrito acima, o composto pode ser administrado por via oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável.
V. Usos e Métodos da Invenção
[00373] Os anticorpos (incluindo imunoconjugados, biespecíficos / multiespecíficos, composições e outros derivados aqui descritas) da presente invenção tem numerosas utilidades terapêuticas que envolvem o tratamento de distúrbios que envolvem as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície celular. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados a células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou a seres humanos, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, tais como aqueles aqui descritos. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos com doenças que podem ser corrigidos ou melhorados por matar células doentes, em particular, células caracterizadas por um padrão alterado de expressão CLDN6 e / ou um padrão alterado de associação de CLDN6 com a sua superfície de células em comparação com as células normais.
[00374] Em uma concretização, por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um sujeito com uma desordem tumorigênica, por exemplo, uma doença caracterizada pela presença de células de tumor
180/237 que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície celular. Exemplos de doenças tumorigênicas que podem ser tratadas e / ou prevenidas abranger todos os cânceres e entidades tumorais que expressam CLDN6, incluindo aqueles aqui descritos.
[00375] As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descrito de acordo com a invenção também podem ser usados para a imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.
[00376] Em uma outra concretização, os anticorpos da invenção podem ser utilizado para detectar níveis de CLDN6 ou formas particulares de CLDN6, ou níveis de células que contêm CLDN6 na sua superfície da membrana, que os níveis podem então ser ligados a determinadas doenças ou sintomas de doença tais como acima descrito. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com sua superfície celular, implicando, assim, estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser conseguido por contacto de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-CLDN6 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CLDN6. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CLDN6 são detectadas e comparadas na amostra, e uma amostra de controle, ou seja, uma amostra de referência.
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[00377] Os anticorpos da invenção podem ser testados inicialmente pela sua atividade de ligação associado com as utilizações terapêuticas ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados usando ensaios de citometria de fluxo, tal como aqui descrito.
[00378] Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para induzir in vivo ou in vitro, uma ou mais das seguintes atividades biológicas: para inibir o crescimento e / ou diferenciação de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular; para matar uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular; para mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula na presença de células efetoras; para mediar CDC de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície da célula na presença de complemento; para mediar a apoptose de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular; para induzir a adesão homotípica; e / ou para induzir a translocação lipídica sobre ligação CLDN6.
[00379] Em uma concretização particular, os anticorpos são utilizados in vivo ou in vitro, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com o
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CLDN6. Exemplos de doenças relacionadas CLDN6- incluem, entre outras, câncers, tais como os aqui descritos.
[00380] Como descrito acima, os anticorpos anti-CLDN6 do invenção podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radiotóxico, antiangiogeneic ou agente e o agente imunossupressor para reduzir a indução de respostas imunes contra os anticorpos de invenção. O anticorpo pode ser ligado ao agente (tal como, um imunocomplexo) ou pode ser administrado em separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser coadministrada com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anti-câncer, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti-neoplásicos, tais como listados acima. A co-administração de anticorpos anti-CLDN6 da presente invenção com agentes quimioterapêuticos fornece dois agentes anti-câncer que operam via diferentes mecanismos que produzam um efeito citotóxico para células tumorais.
[00381] Tal co-administração pode resolver problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma alteração da antigenicidade das células tumorais, o que tornaria eles não reativos com o anticorpo.
[00382] As composições (por exemplo, anticorpos,
183/237 moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados do invenção) que têm sítios de ligação complementar, tais como porções de IgGl, -2, ou -3 ou IgM que se ligam complemento também pode ser usado na presença de complemento. Em uma concretização, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo as células alvo com um agente de ligação da invenção e as células efetoras apropriadas podem ser completadas pela adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser melhorada através da ligação de proteínas do complemento. Em uma outra concretização as células alvo revestidas com as composições da invenção também podem ser submetidas a lise por complemento. Em ainda outra concretização, as composições da invenção não activa o complemento.
[00383] As composições da invenção também podem ser administrados em conjunto com o complemento. Por conseguinte, dentro do escopo da invenção são composições que compreendem anticorpos, moléculas ou multiespecíficos biespecíficos e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas na medida em que o complemento está localizado em estreita proximidade com a anticorpos, ou moléculas biespecíficas multiespecífico.
[00384] Alternativamente, a anticorpos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento
184/237 de soro podem ser administrados separadamente. A ligação das composições da presente invenção para as células alvo podem provocar translocação do complexo antígeno-anticorpo CLDN6 em jangadas lipídicas da membrana celular. Tal translocação cria uma alta densidade de complexos antígeno-anticorpo, que pode eficientemente ativar e / ou melhorar a CDC.
[00385] Também dentro do escopo da presente invenção estão kits que compreendem as composições de anticorpos da invenção (por exemplo, anticorpos e imunoconjugados) e instruções para utilização. O kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressores, um agente citotóxico, ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo possuindo uma atividade complementar).
[00386] Consequentemente, os doentes tratados com as composições de anticorpos da invenção podem ser administrados adicionalmente (antes de, em simultâneo com, ou após a administração de um anticorpo da presente invenção) com um outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, o que melhora ou aumenta a terapêutica efeito dos anticorpos da invenção.
[00387] Em outras concretizações, o sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que modula, por exemplo, aumenta ou inibe a expressão ou atividade de Fc-gama ou
185/237 receptores Fc-alfa, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citoquina. Citocinas preferidas incluem o fator de estimulação de colônias de granulócitos-(G-CSF), fator de estimulação de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ), e fator de necrose tumoral (TNF). Outros agentes importantes para aumentar a eficácia terapêutica dos anticorpos e composições farmacêuticas aqui descritas são β-glucanos que são homopolissacarídeos de resíduos de glicose ramificadas e são produzidas por uma variedade de plantas e microrganismos, por exemplo, bactérias, algas, fungos, leveduras e grãos. Podem também ser utilizados fragmentos de ser β-glucanos produzidos por organismos. De preferência, o β-glucano é um polímero de β (1,3) glicose, em que pelo menos algumas das unidades de glicose da espinha dorsal, por exemplo, 3-6% das unidades de glicose da espinha dorsal, possuem ramos tais como β (1, 6) ramos.
[00388] Em uma concretização particular, a invenção
proporciona métodos para detectar a presença de antígeno
CLDN6 em uma amostra , ou medindo a quantidade de antígeno
CLDN6, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo que se liga especificamente a
CLDN6, sob condições que permitir a formação de um complexo entre o anticorpo ou sua parte e CLDN6. A formação de um complexo é então detectada, em que a formação de complexo
186/237 diferença entre a amostra comparada com a amostra de controle, é indicativo da presença de antígeno na amostra CLDN6.
[00389] Em ainda outra concretização, a invenção proporciona um método para detectar a presença ou quantificar a quantidade de células que expressam CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície de células in vivo ou in vitro. O método compreende (i) a administração a um sujeito de uma composição da presente invenção conjugado com um marcador detectável; e (ii) expor o sujeito a um meio para detectar o referido marcador detectável para identificar as áreas que contêm células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
[00390] Métodos como descrito acima são úteis, em especial, para o diagnóstico de doenças relacionadas com o CLDN6 e / ou a localização de doenças relacionadas com o CLDN6 tais como doenças cancerosas. Preferivelmente, uma quantidade de CLDN6 de uma amostra que é mais elevada do que a quantidade de CLDN6 em uma amostra de controle é indicativo da presença de uma doença relacionada com CLDN6 em um sujeito, em particular um humano, a partir do qual a amostra é derivada.
[00391] Quando utilizada em métodos conforme acima descrito, um anticorpo aqui descrito pode ser fornecido com
187/237 uma marcação que funciona para: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável proporcionada pela primeira ou segunda etiqueta, por exemplo, TERF (transferência de energia de fluorescência de ressonância); (iii) afectar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética, por carga, hidrofobicidade, forma, ou outros parâmetros físicos, ou (iv) proporcionar uma fração de captura, por exemplo, afinidade, anticorpo / antígeno, ou complexação iónica. Estruturas de marcação apropriadas como marcador são estruturas, tais como marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores de cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, marcadores isotópicas de preferência estáveis, marcadores isobáricas, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, em especial, os marcadores de partículas de metal, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas de polímero, moléculas orgânicas pequenas, tais como biotina, ligantes de receptores ou moléculas de ligação, tais como as proteínas de adesão celular ou lectinas, sequências marcadoras que compreendem os ácidos nucleicos e / ou os resíduos de aminoácidos que podem ser detectados por uso de agentes de ligação, etc. Os marcadores compreendem, em uma forma não limitativa, sulfato de bário, ácido iocetamic, ácido iopanóico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina,
188/237 metrizamida, tiropanoato de sódio e de rádiodiagnóstico, incluindo emissores de positrons, tais como emissores gama, tais como iodo-123 flúor-18 e carbono-11, tecnécio-99m, iodo131 e índio-I ll, nuclídeos de ressonância magnética nuclear, como flúor e gadolínio.
[00392] Ainda em outra concretização imunoconjugados da invenção podem ser utilizados para direcionar os compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) para as células que têm CLDN6 associado com a sua superfície pela ligação de tais compostos para o anticorpo. Assim, a invenção também proporciona métodos para localizar ex vivo ou in vitro em células que expressam CLDN6 e sendo caracterizado por associação de CLDN6 com a sua superfície de células, tais como células tumorais circulantes.
[00393] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos seguintes que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.
EXEMPLOS
[00394] As técnicas e métodos aqui utilizados são aqui descritos ou efetuados de um modo conhecido per se e como descrito, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Clonagem: Um Manual de Laboratório, 2a Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque Todos os métodos, incluindo a utilização de kits e
189/237 reagentes são realizadas de acordo com informações do fabricante, salvo se especificamente indicado.
Exemplo 1: Quantificação de expressão CLDN6 em tecidos normais, tecidos cancerosos e linhagens celulares utilizando RT-PCR tempo real
[00395] RNA celular total foi extraído a partir de amostras congeladas de tecidos e linhagens celulares de câncer utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen), vacinados com uma oligonucleotídeo dT8 e transcrição reversa com Superscript II (Gibco / Lifetech) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do DNAc obtido foi testada por amplificação de transcritos de p53 em 30 ciclos de PCR. Após a normalização de expressão HPRT de CLDN6 foi quantificada utilizando cálculo AACT.
[00396] Os tecidos de três indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. Apenas quantidades vestigiais de transcritos CLDN6 podia ser detectada em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR. O único tecido normal ligeiramente superior a expressão de corte foi de placenta.
[00397] Em contraste com os tecidos normais, encontramos alta expressão de CLDN6 em amostras de câncer de ovário (adenocarcinomas), o câncer de pulmão (NSCLC, com os mais altos níveis de frequência e expressão em adenocarcinomas), câncer gástrico, câncer de mama, câncer
190/237 hepático, câncer pancreático, câncer de pele (carcinoma basocelular e carcinoma de células escamosas), maligno melanoma, câncer de cabeça e pescoço (adenoma pleomórfico maligno), sarcoma (sarcoma sinovial e carcinosarcoma), o câncer do ducto biliar, câncer de células renais (carcinoma de células claras e carcinoma papilar), câncer de útero e linhagens celulares de câncer A2780 (câncer de ovário), NIHOVCAR3 (câncer de ovário), HCT-116 (câncer do cólon), EFO-27 (câncer de ovário), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (câncer gástrico), KATOIII (câncer gástrico), YAPC (câncer no pâncreas), AGS (câncer gástrico), FU97 (câncer gástrico), MKN7 (câncer gástrico).
Exemplo 2: Quantificação da expressão CLDN6 em tecidos normais, tecidos cancerosos e linhagens celulares utilizando análise de Western blot
[00398] Para a análise de Western blot 20 pg de proteína total extraído a partir de células lisadas com tampão Laemmli-lise foi utilizado. Os extratos foram diluídos em tampão de amostra redutora (Roth), sujeitas a SDS-PAGE e eletrotransferidas subsequentemente para uma membrana de PVDF (Pall). A imunocoloração foi realizada com anticorpos policlonais reativos a CLDN6 (ARP), e beta-actina (través) seguido por detecção de anticorpos primários com peroxidase de rábano de cabra anti-rato conjugada e anticorpos secundários anti-coelho de cabra (Dako) .
191/237
[00399] Os lisados de tecidos de até cinco indivíduos foram testados para cada tipo de tecido normal. Nenhuma expressão de proteína CLDN6 foi detectada em nenhum dos tecidos normais analisados. Em contraste com os tecidos normais, a expressão elevada de proteína CLDN6 foi detectada em amostras de câncer do ovário e câncer do pulmão. Expressão CLDN6 foi detectado em NIH-OVCAR3 (câncer de ovário), MKN7 (câncer gástrico), AGS (câncer gástrico), CPC-N (SCLC), HCT116 (câncer do cólon), FU97 (câncer gástrico), NEC8 (embrionário testicular carcinoma), JAR (coriocarcinoma placentária), JEG3 (placentária coriocarcinoma), BEWO (coriocarcinoma da placenta) e PA-1 (teratocarcinoma ovário).
Exemplo 3: Análise de Imunohistoquímica (IHQ) da expressão CLDN6 em tecidos normais e cancerosos.
[00400] Seções de tecido embebidas em parafina (4 pm) foram incubadas durante 1 hora a 58° C sobre uma placa de aquecimento (HI 1220, Leica). A parafina foi removida das seções através da incubação das lâminas em Roti claro (Roth) durante 2 x 10 min em temperatura ambiente. Em seguida, as seções foram re-hidratadas em álcool graduado (99%, 2 x 96%, 80% e 70%, 5 min cada). A recuperação de antígenos foi realizada por lâminas em ebulição a 120 ° C (15 psi) durante 15 min em 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) + 0,05% de Tween-20. Após as lâminas tenham sido diretamente incubadas a ebulição em PBS durante 5 min. A atividade da peroxidase
192/237 endógena foi bloqueada com 0,3% de peróxido de hidrogênio em MeOH durante 15 min à TA. Para evitar a ligação não específica, as lâminas foram bloqueadas com 10% de soro de cabra em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal específico de CLDN6 (1 pg / ml) (ARP) durante a noite a 4° C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS à temperatura ambiente (3 x 5 min) e incubadas com 100 pl dos anticorpos secundários (poli Powervision HRP -Anti-IgG de coelho pronto-para-uso (imunológica)) durante uma hora à TA. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS à temperatura ambiente (3 x 5 min). Coloração final foi realizada utilizando-se o vetor NovaRED Substrato Kit SK-4800 de Vector Laboratories (Burlingame) . As seções foram contrastadas com hematoxilina durante 90 segundos à temperatura ambiente. Após desidratação com álcool graduado (70%, 80%, 2x 96% e 99%, 5 min cada) e 10 min de incubação em xilol lâminas foram montadas com Kit X-tra (Medite Histotechnic).
[00401] Nenhuma expressão de proteína CLDN6 foi detectável em tecidos normais do pulmão, ovário, estômago, cólon, pâncreas, fígado, rim ou duodeno. Em contraste com os tecidos normais, fortes ou em coloração menos significativa foi observada em seções de tecido de câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de pele, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de bexiga (carcinoma de
193/237 células de transição), o câncer de colo do útero, o câncer de testículo (seminoma) e câncer de útero. A coloração foi claramente mais acentuada na membrana plasmática das populações de células epiteliais malignas, enquanto estroma adjacente e células epiteliais não-malignas foram negativos. Estes resultados indicam que a proteína CLDN6 está localizada na membrana plasmática de células malignas.
Exemplo 4: Geração de anticorpos murinos contra CLDN6
a. Geração de vetores de expressão que codificam CLDN6 de comprimento completo e fragmentos CLDN6
[00402] Uma sequência de DNA com codões optimizados não natural (SEQ ID NO: 3) que codifica CLDN6 de comprimento completo (número de acesso NCBI NP_067018.2, SEQ ID NO: 2) foi preparado por síntese química (GENEART AG, Alemanha) e clonado no vetor pcD A3.1 / myc-His (Invitrogen, EUA) produzindo o vetor p3953. A inserção de um códon de terminação permitiu a expressão da proteína CLDN6 sem ser fundido com o vetor codificado myc-tag VLiS. Expressão de CLDN6 foi testada por Western blot, citometria de fluxo e análises de imunofluorescência utilizando anticorpos antiCLDN6 comercialmente disponíveis (ARP, 01-8865; I & D Systems, MAB3656).
[00403] Além disso, uma sequência de DNA com codões optimizados (SEQ ID NO: 4), que codifica para o domínio extracelular putativo 2 (EC2) fragmento de CLDN6 (SEQ ID NO:
194/237
6) como uma fusão com um N-terminal de líder de Ig kappa derivado peptídeo sinal seguido por 4 aminoácidos adicionais para garantir um local de clivagem correyo de peptidase de sinal (SEQ ID NO: 5) foi preparada e clonada no vetor pcDNA3.1 / myc-His originando o vetor p3974. Antes da imunização, a expressão do fragmento EC2 foi confirmada por microscopia de imunofluorescência em transientemente transfectadas e paraformaldeído (PFA) células fixadas CHO-K1 usando um anticorpo anti-myc (Cell Signaling, MAB 2276) disponível comercialmente.
b. Geração de linhagens celulares que expressam estavelmente CLDN6
[00404] Linhagens celulares HEK293 e P3X63Ag8U1 que expressam estavelmente CLDN6 foram geradas por meio de técnicas convencionais, utilizando o vetor p3953.
c. Imunizações
[00405] Camundongos Balb / c foram imunizados por injeção intraperitoneal com 25 qg de DNA do plasmideo p3974 em conjunto com 4-manose ql PEI (PEI-Man; in vivo jetPEF- M Man de Polyplus Transfecção) (150 mM de PEI-Man em H 2 0 com 5% de glucose) nos dias 0, 16 e 36. Nos dias 48 e 62 os camundongos foram imunizados por injeção intraperitoneal com células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas com vetor p3953 para expressar estavelmente CLDN6. As células administradas no dia 62 foram irradiadas com 3000 rad antes da injeção. A
195/237 presença de anticorpos dirigidos contra CLDN6 em soros de camundongos foi monitorizada por microscopia de imunofluorescência entre os dias 20 e 70 usando as células CHO-K1 co-transfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN6 e GFP. Para este fim, 24 horas após a transfecção, PFAfixo ou células não-fixadas foram incubadas com uma diluição 1:100 dos soros de camundongos imunizados por 45 min à temperatura ambiente (TA). As células foram lavadas, incubadas com um anticorpo anti-rato marcado com Alexa555 Ig (Molecular Probes) e submetidas a microscopia de fluorescência.
[00406] Os anticorpos específicos anti-CLDN6 foram detectadas em amostras de soro obtidas a partir de um rato, com base em que o hibridoma F3-6C3-H8 foi produzido; ver Fig. 2.
[00407] Para a geração de anticorpos monoclonais, os ratos com respostas imunológicas detectáveis anti-CLDN6 foram reforçados quatro dias antes da esplenectomia por injeção intraperitoneal de 2 χ 107 células HEK293 transfectadas de forma estável com o vetor p3953.
d. Geração de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais murinos contra CLDN6
[00408] 6 x 107 esplenócitos isolados a partir de um rato imunizado foram fundidos com 3 X 107 células da linhagem de células de mieloma de camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL
196/237
1580) utilizando PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). As células foram semeadas a aproximadamente 5 x 104 células por poço em placas de microtitulação de fundo plano e cultivadas durante cerca de duas semanas em meio selectivo de RPMI contendo 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 1% de hibridoma de fusão e suplemento de clonagem (HFCS, Roche, 1 CRL 1363735), 10 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 4,5% de glucose, 0,1 mM de 2- mercaptoetanol, 1 x penicilina / estreptomicina e 1 x HAT suplemento (Invitrogen, CRL 21060). Após 10 a 14 dias, os poços individuais foram testados por citometria de fluxo para os anticorpos monoclonais anti-CLDN6. Hibridomas secretores de anticorpos foram subclonados por diluição limitante e novamente testadas para detecção de anticorpos monoclonais anti-CLDN6. Os subclones estáveis foram cultivadas para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização. Pelo menos um clone de cada hibridoma, que manteve a reactividade das células-mãe (testado por citometria de fluxo) foi selecionado. Nove bancos de células frasco foram gerados para cada clone e armazenado em nitrogênio líquido.
Exemplo 5: Características de ligação dos sobrenadantes de hibridomas e anticorpos monoclonais
a. Controle de Qualidade de células HEK293T transientemente transfectadas por (i) Western blot e (ii) análises de
197/237 citometria de fluxo
[00409] (i) Células HEK293T foram transfectadas com ácidos nucleicos que codifica CLDN3, CLDN4, CLDN6, e CLDN9, respectivamente, ou falsamente transfectadas. Expressão de CLDN3, CLDN4, CLDN6 ou CLDN9 em células HEK293T foi determinada por Western blotting. Para este fim, as células foram colhidas 24 horas após a transfecção e submetida a lise. O lisado foi sujeito a SDS-PAGE, transferido para membrana de nitrocelulose e corado com anti-CLDN3 (A) (Invitrogen, 34-1700), anti-CLDN4 (A) (Zymed, 32-9400), antiCDLN6 (A) (ARP, 01-8865) ou anticorpos (Santa Cruz, sc-17672) anti-CLDN9 (A) que se ligam especificamente o terminal C da claudina correspondente sob condições de desnaturação. Após a incubação com um anticorpo secundário marcado com peroxidase e desenvolvimento com o reagente ECL, um gerador de imagens LAS-3000 (Fuji) foi usado para visualização. Bandas da pesos moleculares esperadas das CLDN3, CLDN4, CLDN6 e CLDN9, respectivamente, foram observados apenas nas células transfectadas mas não nas células de controle (Fig. 3) o que demonstra que as células HEK293T não expressam endogenamente qualquer das claudinas investigados e assim, são um ferramenta adequada para determinar a reatividade cruzada de anticorpos CLDN6.
[00410] (ii) As células HEK293T de (i) foram posteriormente analisadas por citometria de fluxo utilizando
198/237 anticorpos anti-CLDN reconhecendo epítopos nativos (rato anti-CLDN3 IgG2a (R & D, MAB4620), rato anti-CLDN4 IgG2a (R & D, MAB4219), anti-rato CLDN6 IgG2b (R & D, MAB3656)). Os anticorpos podem ser obtidos a partir de Sigma sob o M9144 e M8894 números de produtos serviram como controle isótipo. A especificidade destes anticorpos anti-CLDN foi analisada utilizando células HEK293T transientemente transfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN3, CLDN4, CLDN6, e CLDN9, respectivamente. O anticorpo anti-CLDN6 mostra reatividade cruzada com CLDN3, CLDN4 e CLDN9. O anticorpo anti-CLDN4 mostra reatividade cruzada com CLDN3, CLDN6 e CLDN9. O anticorpo anti-CLDN3 se liga especificamente a CLDN3 (Fig. 4).
b. Determinação da especificidade dos anticorpos monoclonais produzidos de acordo com a invenção, utilizando citometria de fluxo
[00411] Células HEK293T foram co-transfectadas com um vetor que codifica diferentes proteínas CLDN e um vetor que codifica um marcador de fluorescência. 24 h após a transfecção as células foram recolhidas utilizando uma solução de tripsina / EDTA a 0,05% e lavou-se com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%). As células foram transferidas para placas de microtitulação de fundo em U a 2 x 105 células por poço e incubadas durante 60 min a 4 ° C com os sobrenadantes dos hibridomas. Após lavagem três
199/237 vezes com tampão de SCAF, as células foram incubadas com uma aloficocianina (APC) conjugado a anti-IgG de camundongo l + 2a + 2b + 3 anticorpo secundário específico (Dianova, 115135-164) . Em seguida, as células foram lavadas duas vezes e a ligação foi avaliada por citometria de fluxo utilizando uma matriz BD FACS (Fig. 5). A expressão do marcador de fluorescência é representada no eixo horizontal contra o anticorpo de ligação no eixo vertical. Uma disponível comercialmente anticorpo de camundongo anti-IgG2b de CLDN6 (R & D, MAB3656) serviu como um controle positivo e o anticorpo obtido a partir de Sigma com o número de produto M8894 serviu como um controle do isotipo.
[00412] Os anticorpos no sobrenadantes do hibridoma monoclonal subclones F3-6C3- H2, F3-6C3-H8, H9-F3-6C3, F36C3-D8 e F3-6C3-G4, todos os derivados de hibridoma F3-6C3, eram específicos para CLDN6 e não se ligaram a CLDN9, CLDN3 e CLDN4. A Fig. 5A mostra exemplarmente os resultados para o subclone hibridoma monoclonal F3-6C3-H8. Os anticorpos presentes no sobrenadante do subclone hibridoma monoclonal F3-6C3-H8 também se ligam a células transfectadas com o (1143V) - variante SNP de CLDN6. Os anticorpos presentes no sobrenadante do subclone hibridoma monoclonal F4-4F7-F2 ligam-se a ambos CLDN6 e CLDN9 (Fig. 5A). Os anticorpos presentes no sobrenadante do subclone hibridoma monoclonal F3-7B3- B4 ligam a CLDN6, CLDN3 e CLDN9 (Fig. 5B). Os
200/237 anticorpos presentes no sobrenadante do subclone hibridoma monoclonal F3-3F7 A5-se ligam a CLDN6, CLDN4 e CLDN9 (Fig. 5B) .
Exemplo 6: Produção e teste de anticorpos monoclonais contra CLDN6
a. Geração de vetores de expressão que codifica o domínio extracelular de uma CLDN6
[00413] Uma sequência de DNA com codões optimizados (SEQ ID NO: 12) que codifica para o domínio extracelular putativo 1 (ECL) fragmento de CLDN6 (SEQ ID NO: 7) como uma fusão com um líder N-terminal de Ig kappa derivado peptídeo de sinal seguido por 4 aminoácidos adicionais para garantir um local de clivagem de peptidase de sinal correcto (SEQ ID NO: 13) foi preparada e clonada no vetor pcDNA3.1 / myc-His originando o vetor p3973. Antes da imunização, a expressão do fragmento de ECL foi confirmada por microscopia de imunofluorescência em transientemente transfectadas e paraformaldeído (PFA) - células fixadas CHO-K1, utilizando um anticorpo anti-myc disponível comercialmente (Cell Sinaling, MAB 22 76) .
b. Imunização
[00414] Camundongos Balb / c foram imunizados com 25 pg de DNA do plasmídeo p3973 em conjunto com 4-manose pl PEI (PEI-Man; in vivo-jetPEI ™ -Man de Polyplus Transfecção)(150 mM de PEI-Man em H20 com glicose a 5%) por injeção
201/237 intraperitoneal nos dias 0 e 14. No dia 28 e 44, os camundongos foram imunizados por via subcutânea com os peptídeos conjugados KLH-SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15 (100 mg cada em PBS, JPT Peptide Technologies GmbH, Alemanha) juntamente purificados por HPLC PTO-CpG-ODN (25 ug em PBS; 5'-TCC ATG ACGTTCCTG ACGTT; Eurofms MWG Operon, Alemanha). Nos dias 64, 77 e 97 os camundongos foram imunizados por injeção intraperitoneal com 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas com vetor p3953 para expressar estavelmente CLDN6. Antes da administração, as células foram tratadas com mitomicina-C (2,5 pg/ml, Sigma-Aldrich, M4287). Nos dias 64 e 97 células foram administradas em conjunto com purificados por HPLC PTO-CpG-ODN (50 ug em PBS), no dia 77, juntamente com adjuvante incompleto de Freund.
[00415] Para a geração de anticorpos monoclonais, os ratos com respostas imunológicas detectáveis anti-CLDN6 foram reforçados quatro dias antes da esplenectomia por injeção intraperitoneal de 2 x 107 células HEK293 transfectadas de forma estável com o vector p3953.
c. Ensaios de anticorpos monoclonais contra CLDN6 Citometria de fluxo
[00416] Para testar a ligação de anticorpos monoclonais para CLDN6 e suas células HEK293T homóloga foram transitoriamente transfectadas com o plasmídeo codificante claudina correspondente e a expressão foi analisada por
202/237 citometria de fluxo. A fim de diferenciar entre células transfectadas e não transfectadas, células HEK293T foram cotransfectadas com um marcador de fluorescência como um repórter. 24 h após a transfecção as células foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%) e novamente suspensas em tampão FACS a uma concentração de 2 x 106 células / ml. 100 pl da suspensão de células foram incubadas com o anticorpo apropriado nas concentrações indicadas durante 30 min a 4° C. Um anticorpo reativo de forma cruzada foi utilizado para detectar a expressão de CLDN6 e CLDN9. Anticorpos anti-Claudin e anti-CLDN3 de ratos disponível comercialmente (R & D, MAB4620) e anti-CLDN4 (P & D, MAB4219) serviu como controle positivo, enquanto IgG2a de rato (Sigma, M9144) e IgG2b (Sigma, M8894), respectivamente, serviram como controle de isotipo. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas com um anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com APC l + 2a + 2b + 3a anticorpo secundário específico (Dianova, 1 15-135-164) durante 30 min a 4 ° C. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A ligação foi analisada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. A expressão do marcador de fluorescência foi traçada no eixo horizontal contra o anticorpo de ligação no eixo vertical.
203/237
CDC
[00417] A citotoxicidade dependente do complemento (CDC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de complemento humano para as células alvo incubadas com anticorpos anti-CLDN6. Como um método analítico muito sensível a reação luminescente de luciferase foi usado para a medição do ATP.
[00418] As células CHO-K1 transfectadas estavelmente com CLDN6 (CHO-K1 -CLDN6) foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas duas vezes com meio X-Vivo 15 (Lonza, BE04- 418Q) e suspensas a uma concentração de 1 x 107 células / ml em meio X-Vivo 15. 250 pl da suspensão de células foram transferidas para uma cuveta de eletroporação 0,4 centímetros e misturada com 7 g de transcrito in vitro, RNA que codifica para a luciferase (luciferase F / T ARN). As células foram eletroporadas a 200 V e 300 μΡ utilizando um Gene Pulser Xcell (Bio Rad). Após a eletroporação, as células foram suspensas em 2,4 ml pré-aquecido D-MEM / F12 (1: 1) com meio de GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093) contendo 10% (v / v) de FCS, 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina e 1,5 mg / ml de G418. 50 pl da suspensão de células por poço, foram semeadas em um branco de 96 poços PP-placa e incubado a 37 ° C e 7,5% de C02 . 24 horas após a eletroporação 50 pl de anticorpos monoclonais murinos anti-CLDN6 em 60% de RPMI (contendo HEPES 20 mM) e 40% de soro humano (mistura de soro
204/237 obtidas a partir de seis doadores saudáveis) foram adicionados às células a concentrações indicadas. 10 pl a 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS por poço foram adicionados aos controles totais de lise, a etapa que 10 pl PBS por poço foram adicionados a max controles de células viáveis e as amostras reais. Após uma incubação de 80 min a 37° C e 7,5% de C02, 50 pl mistura luciferina (3,84 mg / ml de Dluciferina, 0,64 U / ml de ATPase e HEPES 160 mM em dd H20) foram adicionados por cavidade. A placa foi incubada no escuro durante 45 min à temperatura ambiente. A luminescência foi medida utilizando um luminômetro (Infinito M200, TECAN). Os resultados são apresentados como unidades digitais integradas relativas de luz (RLU).
[00419] Células NEC8 foram eletroporadas a 200 V e 400 pP e cultivadas em meio RPMI 1640 com GlutaMAX-I (Invitrogen, 61870) contendo 10% (v / v) de FCS.
[00420] A lise específica é calculada como:
Lise específica [%] = 100 - (amostra) - (lise total) x 100
Cél. Viáveis max - lise total células viáveis max: 10 pl PBS, sem anticorpo lise total: 10 pl 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS, sem anticorpo
Tratamento Precoce
[00421] Para tratamentos com anticorpos precoces 2 x l07 células NEC8 em 200 pl PBS foram inoculadas por via
205/237 subcutânea no flanco de camundongos atímicos. Cada grupo experimental consistiu de dez camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. Três dias após a inoculação de 200 pg de anticorpos monoclonais murinos purificados muMAb 59A, 60A, ID 6, 64 A, 65 A, 66B e 67A foram aplicadas durante 46 dias, por injeções intravenosas e intraperitoneais alternada duas vezes por semana. Os grupos experimentais tratados com PBS serviram como um controle negativo. O volume do tumor (TV = (comprimento x largura) / 2) foi monitorado duas vezes por semana. TV é expresso em mm3, permitindo a construção de curvas de crescimento do tumor ao longo do tempo. Quando o tumor atingiu um volume superior a 1.500 mm3, os ratos foram sacrificados.
d. Resultados
[00422] Anticorpos monoclonais murinos muMAb 59A, 60 A, 6 de identificação, 64A, 65 A, 66B e 67A apresentaram forte ligação com CLDN6 humana e a variante CLDN6 SNP (single nucleotide polymorphism) 1143 V, enquanto nenhuma ligação a CLDN3, 4 e 9 foi observado (Fig. 6).
[00423] MuMAb 59A, 60A, 6ID, 64A, 65 A, 66B e 67A apresentaram valores muito baixos de CE50 (EC50 200 - 500 ng / ml) e saturação da ligação foi alcançada em baixas concentrações (Fig. 7).
[00424] MuMAb 59A, 60A, ID 6, 64A, 65A, 66B e 67A exibiu atividade de CDC dependente da dose e CDC induziu em
206/237 concentrações baixas (Fig. 8). Os anticorpos anti-CLDN6 muMAb 65A e 66B CDC induzida em células NEC8 de uma forma dependente da dose (Fig. 9). Alvo especificidade de muMAb 65A e 66B foi provado usando células NEC 8 LVTS2 54 (CLDN6 knockdown).
[00425] Além disso, muMAb 59 A, 60 A, 6 ID, 64 A, 65 A, 66B e 67 A, apresentaram inibição do crescimento do tumor em camundongos enxertados com células NEC8 (Fig. 10).
Exemplo 7: Produção e teste de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLDN6
a. Geração de anticorpos monoclonais quiméricos rato / humanos
[00426] Para quimerização, a cadeia pesada murina e região variável de cadeia leve incluindo as sequências líder foram amplificados por PCR utilizando os iniciadores listados na tabela abaixo. As cadeias pesadas de murídeo foram fundidas por um sítio de restrição ApaI (5'-GGGCCC-3') para a parte N-terminal da cadeia Fcgammal humano, que tenha sido codificado pelo vetor de expressão. Os domínios variáveis da cadeia kappa de murino incluindo as sequências líder foram clonados em frente da região constante, através de um sítio de restrição BsiWI. A orientação correta da região constante no vetor, isto é, apropriado para o promotor do vetor precedente, foi verificada por sequenciamento. Devido à posição do local de restrição Apal, qualquer amplificação de
207/237 uma região variável incluindo sequência líder para este fim tem de incluir os primeiros 11 nucleotídeos da sequência da região constante humana gama-1 em adição à sequência do sítio Apal. A sequência de nucleotídeos de gama-1 de cadeia pesada de região constante humana está listada como SEQ ID NO: 24, a sequência de aminoácidos da região constante humana gama-1 assim expressa está listada como SEQ ID NO: 25. A sequência de nucleotídeos que codifica a parte constante da cadeia leve capa está listada como SEQ ID NO: 26, a respectiva sequência de aminoácidos está listada como SEQ ID NO: 27.
[00427] Tabela. 1: Mouse linhas celulares de hibridoma de anticorpo utilizados para clonagem
muMAB Isotipo Primer SEQ ID NOs:
Cadeia pesada 64A IgG2a 17, 18
89A IgGJa 17,19
61D IgG2a 17, 20
67A IgG2a 17, 20
Cadeia leve 64A IgK 21,22
89A IgK 21,23
61D IgK 2], 22
67A IgK 21, 22
[00428] Correspondendo aos seus homólogos murino os anticorpos monoclonais quiméricos foram nomeados adicionando o prefixo chim, por exemplo, Chimab 64A.
[00429] A amplificação das regiões variáveis de
208/237 murídeo de cadeias leves e pesadas, incluindo sequências líder foi realizada de acordo com o método step-PCR para fora descrito na Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, N° 6). Para isto, o RNA total foi preparado a partir de linhagens de células de hibridoma monoclonais (ver Tab. 1) por métodos padrão conhecidos dos técnicos versados no assunto, por exemplo, com a utilização de Kit RNeasy Mini (Qiagen). DNAc de cadeia simples foi preparado, de acordo com o método template-switch, também descrito no Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, 27, Vol., N ° 6, de 1558) . Além de uma (dT) 30 oligômero (SEQ ID NO: 28), que inclui um oligômero de DNA / RNA híbridos (SEQ ID NO: 29) que serve como um adaptador 5' para o molde de comutação durante a polimerização da cadeia de cDNA. Neste oligômero adaptador nos últimos três nucleotídeos foram ribo- em vez de desoxirribonucleotídeos. A subsequente PCR-etapa para fora usado um oligómero anti-sentido dirigido para a região constante da cadeia capa de camundongo ou com a região constante da subclasse 2a da cadeia gama (SEQ ID NO: 30 e 31, respectivamente). A subclasse IgG do anticorpo monoclonal murino produzido pelas linhagens de células de hibridoma foi analisada antes imunologicamente com IsoStrip (Roche), e o oligômero anti-sentido apropriado foi escolhido em conformidade (ver Tab. 1). Uma mistura serviu como iniciador do oligómero de sentido no etapa-PCR para fora, que
209/237 compreende os dois oligômeros listados na SEQ ID NO: 32 e 33.
[00430] As regiões variáveis de murino identificadas, incluindo as sequências líder em seguida, foram amplificados por PCR omitindo 'UTR e 3 o' 5 da região constante de rato, adicionando sítios de restrição para as extremidades que permitiram a subclonagem nos vectores de expressão preparados que transportam as regiões constantes humanas. Além disso, os oligómeros de sentido proporcionada uma sequência de Kozak de consenso os oligómeros anti-sentido para as regiões variáveis da cadeia pesada (5'-GCCGCCACC-3') e incluiu os primeiros 1 1 nucleotídeos do gama-1 humano da região constante para além do local de restrição Apal (ver Tab 1, SEQ ID NOs: 17 a 23). As regiões variáveis de cadeia leve kappa, incluindo sequências líder foram clonados utilizando HindIII e BsiWI enzimas de restrição, regiões variáveis gama da cadeia pesada exigiram enzimas de restrição HindIII e Apal.
[00431] As regiões variáveis de murídeo de cadeias leves e pesadas, incluindo sequências líder foram amplificadas e outros anticorpos monoclonais quiméricos contra CLDN6 gerado de acordo com o protocolo descrito acima. b. Produção de anticorpos monoclonais quimérico anti-CLDN6
[00432] Os anticorpos monoclonais quiméricos foram expressos transitoriamente em células HEK293T (ATCC CRL11268) transfectadas com plasmídeo de DNA codificante para as cadeias leves e pesadas do anticorpo correspondente. 24 h
210/237 antes da transfecção de 8 x 107 células foram semeadas em placas de cultura de 145 milímetros de células e cultivada em 25 ml HEK293T-meio (DMEM / F12 + GlutaMAX-I, 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina). 20 pg de DNA plasmídeo foram dissolvidos em 5 ml de meio sem HEK293T-suplementos por placa de cultura de células. Após a adição de 75 pl de polietilenimina linear (PEI) (1 mg / ml) (Polyscience, 23966) a mistura (DNA: PEI) foi incubada 15 min a RT. Depois disso, a mistura de transfecção gota a gota às células. 24 h após a transfecção, o meio foi HEK293T-substituído com Pro293a-forma (Lonza, BE12-764Q) contendo 1% de penicilina / estreptomicina. Para a expressão ótima, as células transfectadas foram cultivadas a 37 ° C e 7,5% C02 durante mais 96 a 120 horas. O sobrenadante foi recolhido e o anticorpo quimérico foi purificado por FPLC, utilizando colunas de proteína A. A concentração do anticorpo foi determinada e a qualidade foi testada por SDS-PAGE.
c. Ensaios de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLDN6 Citometria de fluxo
[00433] Para testar as especificidades e afinidades dos anticorpos monoclonais quiméricos CLDN6-específicos que se ligam a células HEK293 transfectadas de forma estável com CLDN3, 4, 6 ou 9, respectivamente, e as linhagens de células de tumor que expressam endogenamente CLDN6 foram analisadas por citometria de fluxo. Portanto, as células foram
211/237 recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%) e novamente suspensas em tampão FACS a uma concentração de 2 x 106 células / ml. 100 μΐ da suspensão de células foram incubadas com o anticorpo apropriado nas concentrações indicadas durante 60 min a 4 ° C. Um anticorpo quimérico de reação cruzada (CHIMAB 5F2D2) foi utilizado para detectar a expressão de CLDN6 e CLDN9. Anticorpos anti-Claudin e antiCLDN3 disponível comercialmente de rato (R & D, MAB4620) e anti-CLDN4 (P & D, MAB4219) serviram como controle positivo, enquanto IgGl-kapa humano (Sigma, 15154) serviu como um controle negativo. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas durante 30 min a 4° C, com uma atividade de APC-cabra conjugada com anti-IgG humana Fc-gama (Dianova, 109-136-170) ou uma APC conjugada com anti-IgG de camundongo l + 2a + 2b + 3a (Dianova, 115-135-164) anticorpo secundário específico, respectivamente. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A ligação foi analisada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray.
CDC
[00434] A citotoxicidade dependente do complemento (CDC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de complemento humano para as células alvo incubadas com anticorpos anti-CLDN6.
212/237
Como um método analítico muito sensível a reação bioluminescente da luciferase é usado para a medição do ATP.
[00435] Neste ensaio, as células do tipo selvagem NEC8 (CLDN6 positivo) e células NEC 8 CLDN6 knock-down (CLDN6 negativo) foram usadas tanto que foram estavelmente transduzidas com construção de expressão de luciferase. As células foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA e ajustado a uma concentração de 2 x 10 5 células / ml em meio RPMI com meio de GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010) contendo 10% (v / v) de FCS. 1 x 104 células foram semeadas em um branco de 96 poços PP-placa e incubou-se durante 24 h a 37 ° C e 5% de C0 2. Após a incubação, 50 pl de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6, 60% de RPMI (contendo HEPES 20 mM) e 40% de soro humano (mistura de soro obtidas a partir de seis dadores saudáveis) foram adicionados às células a concentrações indicadas. 10 pl 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS por poço foram adicionados aos controles totais de lise, a etapa que 10 pl de PBS por poço foram adicionados a max controles células viáveis e as amostras reais. Após mais uma incubação de 80 min a 37 ° C e 5% de C02 a 50 pl mistura luciferina (3,84 mg / ml de D-luciferina, 0,64 U / ml de ATPase e HEPES 160 mM em ddH 2 0) foi adicionado por poço. A placa foi incubada no escuro à TA durante 45 min. A bioluminescência foi medida utilizando um luminômetro (Infinito M200, TEC AN). Os resultados são apresentados como
213/237 unidades digitais integradas relativas de luz (RLU).
Lise específica [%] = 100 - (amostra) - (lise total) x 100
Cél. Viáveis max - lise total
Células viáveis max: 10 μ de PBS, sem anticorpo lise no total: 10 μΤ 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS, sem anticorpo
ADCC
[00436] A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de PBMC humano para as células alvo incubadas com anticorpos antiCLDN6. Como um método analítico muito sensível a reação bioluminescente da luciferase é usado para a medição do ATP.
[00437] Neste ensaio, as células NEC-8 de tipo selvagem (CLDN6 positivo) e as células NEC-8 células CLDN6 knockdown (CLDN6 negativo) foram usadas tanto que foram estavelmente transduzidas com construção de expressão de luciferase. As células foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA e ajustado a uma concentração de 2 x 10 5 células / ml em meio RPMI com GlutaMax-I médio (Invitrogen, 61870-010) contendo 10% (v / v) de FCS e 20 mM de Hepes. 1 x 104 células foram semeadas em um branco de 96 poços PP-placa e incubou-se 4 h a 37 ° C e 5% de C02.
[00438] As PBMC foram isoladas de amostras de sangue de doadores humanos por centrifugação em gradiente de
214/237 densidade utilizando Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003). O PBMC contendo interfase foi isolado e as células foram lavadas duas vezes com PBS / EDTA (2 mM). 1 x 108 PBMC foram inoculadas em 50 ml de meio X-Vivo 15 (Lonza, BE04418Q) contendo 5% de soro humano (Lonza, US14-402E) e incubou-se durante 2 h a 37 ° C e 5% C02 inativado pelo calor.
[00439] 4 h após a inoculação das células alvo (NEC-8) 25 μΐ anticorpos anti-CLDN6 quiméricos monoclonais em PBS foram adicionados às células a concentrações indicadas. PBMC não aderentes, que se separou no prazo de 2 horas de incubação a partir de monócitos aderentes foram colhidas e ajustado a 8 x 10 6 células / ml em meio X-vivo 15. 25 μl desta suspensão de células foi adicionado às células-alvo e os anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6. As placas foram incubadas durante 24 h a 37° C e 5% de C02.
[00440] Após 24 h de incubação a 10 μl 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS por poço foram adicionados aos controles totais de lise, a etapa que 10 μl de PBS por poço foram adicionados a max controles células viáveis e as amostras reais. 50 μl da mistura com luciferina (3,84 mg / ml de Dluciferina, 0,64 U / ml de ATPase e HEPES 160 mM em ddh0) foi adicionado por poço. A placa foi incubada no escuro à TA durante 30 min. A bioluminescência foi medida usando um luminômetro (Infinito M200, TECAN). Os resultados são
215/237 apresentados como unidades digitais integradas relativas de luz (RLU).
[00441]A lise específica é calculada como:
Lise específica [%] = 100 - (amostra) - (lise total) x 100
Cél. Viáveis max - lise total células max viáveis: 10 pl de PBS, sem anticorpo lise no total: 10 pl de 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS, sem anticorpo d. Resultados
[00442] Anticorpos monoclonais quiméricos Anti-CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A e 89A apresentaram forte ligação ao CLDN6 humano, enquanto nenhuma ligação a CLDN3, 4 e 9 foi observado (Figura 11).
[00443] No que diz respeito à ligação CLDN6 humano estavelmente expressos na superfície de células HEK293, antiCLDN6 anticorpos monoclonais quiméricos chimAB 64A e 89A apresentam valores muito baixos de EC50 (EC50 de 450-600 ng / ml) e a saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações. chimAB 67A e 61D mostraram baixo (EC50 1000 ng / mL) e médio (CE50 2300 ng / ml) valores de EC50, respectivamente (Fig. 12).
[00444] No que diz respeito à ligação CLDN6 expresso endogenamente em células NEC8, anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A e 89A exibiram muito baixos valores de EC50 (EC50 de 600-650 ng / ml) e saturação de
216/237 ligação foi alcançada em baixas concentrações, a etapa que
chimAB 61D e 67A mostraram média (CE50 1700 ng / ml) e
elevada (EC50 6100 ng / ml) valores de EC50, respectivamente
(Fig. 13).
[00445] No que diz respeito à ligação expressando
CLDN6 endogenamente em células OV90, anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A e 89A apresentaram valores muito baixos de EC50 (EC50 550-600 ng / ml) e a saturação de ligaçao foi alcançada em baixas concentrações. chimAB 61D e 67A mostraram valores de EC50 média (CE50 1,500 ng / ml e 2300 EC50 ng / mL, respectivamente) (Fig. 14).
[00446] Anticorpos monoclonais quiméricos Anti-CLDN6 chimAB 61D, 64 A, 67 A e 89A exibiram atividade de CDC em uma maneira dependente da dose em células NEC-8 (Fig. 15).
[00447] Anticorpos monoclonais quiméricos Anti-CLDN6 Chimab 61D, 64A, 67A e 89A apresentaram atividade ADCC dosedependente em células NEC-8 e ADCC induzida mesmo em baixas concentrações de anticorpos (16 Fig.).
[00448] Estes resultados mostram claramente a especificidade destes anticorpos monoclonais quiméricos para CLDN6.
Exemplo 8: Tratamento com anticorpos monoclonais contra CLDN6 Tratamento Precoce
[00449] Para tratamentos com anticorpos precoces 2 x 107 células NEC8 em 200 pl de meio RPMI (Gibco) foram
217/237 inoculadas por via subcutânea no flanco de camunmdongos atímicos nu-Foxn7. Cada grupo experimental consistiu de dez camundongos fêmeas de 6 - 8 semanas de idade. Três dias após a inoculação de células de tumor de 200 pg de anticorpo monoclonal de murino muMAb purificada 89A foi aplicada durante sete semanas por injeções intravenosas alternada e intraperitoneais duas vezes por semana. O grupo experimental tratado com PBS serviu como controle negativo. O volume do tumor (TV = (comprimento x largura2) / 2) foi monitorado duas vezes por semana. TV é expresso em mm3, permitindo a construção de curvas de crescimento do tumor ao longo do tempo. Quando os tumores atingiram um volume superior a 1.500 mm3, os ratos foram sacrificados.
Tratamentos avançados
[00450] Para tratamentos com anticorpos de tumores de xenoenxerto avançados 2 x 107 células NEC8 em 200 pl em meio RPMI (Gibco) foram inoculadas por via subcutânea no flanco de camundongos atímicos femeas de 6 - 8 semanas de idade, nuFoxni. O volume do tumor (TV = (comprimento x largura2) / 2) foi monitorado duas vezes por semana. TV é expresso em mm, permitindo a construção de curvas de crescimento do tumor ao longo do tempo. 15 a 17 dias após a inoculação das células de tumor os camundongos foram divididos em grupos de tratamento de oito animais por coorte com tamanhos tumorais homogêneos acima de 80 mm3 . 200 pg de anticorpos monoclonais murinos
218/237 purificados muMAb ID 6, 64 A, 67 A e 89A foram aplicados durante cinco semanas alternadas por injeções intravenosas e intraperitoneais duas vezes por semana. Os grupos experimentais tratados com PBS e um anticorpo não específico serviu de controles negativos. Quando os tumores atingiram um volume maior do que 1500 mm, os camundongos foram sacrificados.
[00451] Em um modelo de xenotransplante de tratamento precoce utilizando camundongos enxertados com o a linhagem celular NEC8 tumorais, os ratos tratados com anticorpos monoclonais de murino muMAb 6 de identificação, 64A e 67A não apresentaram qualquer crescimento tumoral, mesmo após a interrupção da imunoterapia (Fig. 17).
[00452] Em um modelo de xenoenxerto de tratamento precoce usando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 de tumor, muMAb 89A mostraram inibição do crescimento tumoral e tumores não foram detectados em camundongos tratados com muMAB89A no final do estudo (Fig. 18).
[00453] Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 de tumor, muMAb 64A mostraram uma inibição do crescimento do tumor (Fig. 19).
[00454] Em um modelo de xenotransplante tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 tumorais, os ratos tratados com muMAb 64A
219/237 mostraram sobrevida prolongada (Fig. 20).
[00455] Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 tumoral, inibição de crescimento de tumor foi obtida com os anticorpos monoclonais murinos anti-CLDN6 muMAb 61D, 67A e 89A (Fig. 21).
[00456] Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular NEC8 de tumor, os camundongos tratados com o anticorpo específico CLDN6 muMAb 6 ou ID 67A mostraram sobrevivência prolongada (Fig. 22).
[00457] Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando ratos enxertados com células NEC8 de tipo selvagem e células NEC8 CLDN6 knock-down estável, muMAb 64A e 89A mostram apenas um efeito terapêutico em camundongos enxertados com o tipo selvagem NEC8, mas não em camundongos enxertados com células NEC8 CLDN6 knock-down CLDN6 demonstrando a especificidade do anticorpo in vivo (Fig. 23). Exemplo 9: Mapeamento de epítopo de alta resolução de anticorpos monoclonais contra CLDN6
[00458] Os anticorpos monoclonais específicos apenas para CLDN6 mostram muito fraco (se houver) a ligação a peptídeos lineares em estudos ELISA de mapeamento de epítopo, o que implica que os epítopos são conformacional. Para analisar a interação entre os anticorpos aqui descritos e
220/237
CLDN6 na sua conformação de mutagênese sítio-dirigida nativa, cultura de células de mamífero foi usada como uma técnica de mapeamento de epítopo. A mutagênese de varrimento de alanina de aminoácidos 27-81 e 137-161 no primeiro e segundo domínios extracelulares, respectivamente, foi executada. Após a expressão transiente em células HEK293T, CLDN6 mutantes foram avaliados quanto à sua capacidade de ser ligada por anticorpos monoclonais específicos. Ligação prejudicada de um anticorpo monoclonal específico para um mutante CLDN6 sugerem que o aminoácido mutado é um contato importante e / ou resíduo conformacional. A ligação foi analisada por citometria de fluxo. Para discriminar entre populações de células transfectadas e não transfectadas, as células foram co-transfectadas com um marcador de fluorescência.
[00459] Os resíduos de aminoácidos de CLDN6 que são importantes para a interação com anticorpos quiméricos específicos CLDN6 foram sistematicamente identificados por pesquisa com alanina. Mutações de Alanina e glicina foram geradas por mutagênese dirigida ao local (GENEART AG, Alemanha). Para testar a ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos para o tipo selvagem e seus mutantes CLDN6 HEK293T, células foram transitoriamente transfectadas com o plasmídeo codificante claudina correspondente e a expressão foi analisada através de citometria de fluxo. A fim de diferenciar entre células transfectadas e não transfectadas,
221/237 células HEK293T foram co-transfectadas com um marcador de fluorescência como um repórter. Após 24h de transfecção, as células foram colhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%) e novamente suspensas em tampão FACS a uma concentração de 2 x 106 células / ml. 100 pl da suspensão de células foram incubadas com 10 pl de anticorpo durante 45 min a 4° C. O anti-CLDN6 de rato disponível comercialmente (R & D, MAB3656) foi utilizado como um controle para detectar a expressão da superfície celular de mutantes CLDN6. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas com uma APCcabra conjugada com anti-IgG humana Fc-gama (Dianova, 109136-170) ou um anti-IgG de camundongo conjugado com APC l + 2a + 2b + 3a específico anticorpo secundário (Dianova, 1 15135-164) durante 30 min a 4 ° C. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A ligação entre a população de células transfectadas foram analisados por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. Assim, a expressão do marcador de fluorescência foi traçada no eixo horizontal contra o anticorpo de ligação no eixo vertical. A intensidade média do sinal de um anticorpo monoclonal quimérico específico CLDN6 ligado a CLDN6 mutante foi expressa como a percentagem de ligação de tipo selvagem. Os aminoácidos que são essenciais para a ligação não mostraram nenhuma ligação depois de ser mutado, enquanto que os
222/237 aminoácidos que suportam a ligação só mostraram redução da ligação em comparação com o tipo selvagem.
[00460] A alta resolução de mapeamento de epítopodemonstraram que os aminoácidos F35, G37, S39 e T33, possivelmente, do primeiro domínio extracelular do CLDN6 são importantes para a interação com a anticorpos quiméricos específicos CLDN6 chimAB ID 6, 64 A, 67 A e 89A. Resíduo 140 é essencial para a ligação de Chimab 89A e contribui para a ligação de Chimab 61D e 67A. Além disso, LI 51 do segundo domínio extracelular do CLDN6 é importante para a interação com chimAB 67A (Fig. 24).
Exemplo 10: Produção e teste de anticorpos monoclonais melhorados contra CLDN6
[00461] Descobriu-se que o anticorpo 64A apesar de ser excelente em suas propriedades em relação a ligação a CLDN6 e eficácia em relação ao tratamento do tumor tinha um resíduo de cisteína livre na posição 46 da cadeia leve que se verificou potencialmente comprometer suas propriedades em relação a solubilidade, estabilidade e formação de agregados. Tal cisteína livre também pode ser indesejável por outras razões, tais como as disposições regulamentares. Foi tentado, portanto, criar anticorpos com base 64A mantendo as suas propriedades desejadas, evitando um resíduo cisteína livre na posição 46.
[00462] O anticorpo monoclonal quimérico mAb206-LCC
223/237 foi gerado pela combinação da cadeia pesada de chimAB 64A com a cadeia leve de chimAB 61D. MAb206-subg e mAb206-SUBS foram construídas por substituição de aminoácidos. Para este fim, a cisteína na posição 46 na cadeia leve de chimAB 64A foi substituído para glicina e serina, respectivamente.
Produção de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 em HEK293T
[00463] Os anticorpos monoclonais quiméricos foram expressos transitoriamente em células HEK293T (ATCC CRL11268) transfectadas com plasmídeo de DNA codificante para as cadeias leves e pesadas do anticorpo correspondente, tal como descrito no ítem b do Exemplo 7.
Produção de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 em suspensão adaptada as células CHO
[00464] Suspensão adaptado células CHO foram subcultivadas em meio isento de soro, em uma atmosfera umidificada com C02 e agitador. Um dia antes da transfecção, as células foram semeadas em meio isento de soro em frascos de agitação. No dia da transfecção as células foram centrifugadas (5 minutos a 200 xg) e ressuspensas em meio DMEM fresco (Invitrogen, 41965-039) em frascos de agitação. Reagente de transfecção de DNA e foram adicionados às células e misturou-se suavemente por agitação. Após incubação estática em uma incubadora CO2, as células foram diluídas com meio de crescimento isento de soro e depois cultivadas para
224/237 expressão em um agitador de incubação. As células foram alimentadas no dia 0, 2, 4 e 6 com CHO CD EfficientFeed ™ A e B, respectivamente (Invitrogen, A1023401 e A1024001). Os anticorpos quiméricos foram colhidos após a viabilidade das células diminuiu abaixo de 90%. Os anticorpos foram purificados por FPLC, utilizando colunas de proteína A. A concentração de anticorpo foi determinada por absorvância a 280 nm e a pureza foi analisado por SDS-PAGE.
Citometria de fluxo
[00465] A ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos CLDN6-específicos a células que expressam o alvo foi analisada por citometria de fluxo. Portanto, as células foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%) e novamente suspensas em tampão FACS a uma concentração de 2 x 10 6 células / ml. 100 pl da suspensão de células foram incubadas com o anticorpo apropriado nas concentrações indicadas durante 30 min a 4 ° C. Chimab 5F2D2 foi usado para detectar a expressão CLDN6 e CLDN9. Anticorpos anti-Claudin e anti-CLDN3 disponível comercialmente de rato (P & D, MAB4620) e anti-CLDN4 (P & D, MAB4219) serviram como controle positivo, enquanto IgGl-kappa humano (Sigma, 15154) serviu como controle negativo. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas durante 30 min a 4 ° C, com uma atividade de APC-cabra conjugada com anti-IgG humana Fc-gama
225/237 (Dianova, 109-136-170) ou uma APC conjugada com anti-IgG de camundongo l + 2a + 2b + 3a (Dianova, 115-135-164) anticorpo secundário específico, respectivamente. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A ligação foi analisada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray.
CDC
[00466] A citotoxicidade dependente do complemento (CDC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de complemento humano para as células alvo incubadas com anticorpos anti-CLDN6 como descrito na Secção C do Exemplo 7.
ADCC
[00467] A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de PBMC humano para as células alvo incubadas com anticorpos antiCLDN6. Como um método analítico muito sensível a reação bioluminescente da luciferase é usado para a medição do ATP.
[00468] Neste ensaio, as células NEC-8 de tipo selvagem (CLDN6 positivo) e cpelulas NEC-8 CLDN6 knockdown (CLDN6 negativo) foram usadas tanto que foram estavelmente transduzidas com o RNA da luciferase OV90, enquanto que as células foram transfectadas transientemente com IVT-RNA que codifica para a luciferase. As células foram recolhidas com
226/237
0,05% de tripsina / EDTA e ajustado a uma concentração de 2 x 105 células / ml (NEC-8 de tipo selvagem e CLDN6 knock-down) ou 1 x 106 células / ml (OV90) no respectivo meio de crescimento contendo adicionalmente 20 mM de Hepes. 1 x 104 ou 5 x 104 células, respectivamente, foram semeadas em um branco de 96 poços PP-placa e incubado a 37 ° C e 5% de C02.
[00469] As PBMC foram isoladas de amostras de sangue de doadores humanos por centrifugação por gradiente de densidade utilizando Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003). O PBMC contendo interfase foi isolado e as células foram lavadas duas vezes com PBS / EDTA (2 mM). 1 x 108 PBMC foram inoculadas em 50 ml de meio X-Vivo 15 (Lonza, BE04418Q) contendo soro humano a 5% (mistura de soro obtidas a partir de seis dadores saudáveis) e incubou-se durante 2 h a 37 ° C e 5% de C02.
[00470] 4 h após a inoculação das células-alvo 25 pl de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 em PBS foram adicionados às células a concentrações indicadas. PBMC não aderidas, que se separaram no prazo de 2 horas de incubação a partir de monócitos aderentes, foram recolhidas e ajustadas a 1,6 x 107 células / ml para (experimentos NEC-8 de tipo selvagem ou CLDN6 knock-down) ou 4 x 107 células / ml (para experimento OV90) em meio X-vivo 15. 25 pl desta suspensão de células foram adicionadas às células alvo e aos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6. As placas foram incubadas
227/237 durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO2.
[00471] Após 24 h de incubação a 10 μΐ 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS por poço foram adicionados aos controles totais de lise, a etapa de 10 μl PBS por poço foram adicionados a controles max de células viáveis e as amostras reais. 50 μl de mix luciferina (3,84 mg / RNL D-luciferina, 0,64 U / ml ATPase e HEPES 160 mM em DDH20) foram adicionados por poço. A placa foi incubada no escuro à TA durante 30 min. A bioluminescência foi medida utilizando um luminómetro (Infinito M200, TEC AN). Os resultados são apresentados como unidades digitais integradas relativas de luz (RLU).
Lise específica [%] = 100 - (amostra) - (lise total) x 100
Cél. Viáveis max - lise total células max viáveis: 10 μl de PBS, sem anticorpo lise no total: 10 μl de 8% (v / v) de Triton X-100 em PBS, sem anticorpo.
Tratamentos avançados
[00472] Para tratamentos com anticorpos de tumores de xenoenxerto avançados, 2 x 107 células NEC8 em 200 μl de meio RPMI (Gibco) foram inoculadas por via subcutânea no flanco de camundongos fêmeas atímicos de 6 - 8 semanas de idade oxni Nude. O volume do tumor (TV = (comprimento x largura2 / 2) foi monitorado duas vezes por semana. TV é expresso em mm, permitindo a construção de curvas de crescimento do tumor ao longo do tempo. 17 dias após a inoculação das células de
228/237 tumor, os camundongos foram divididos em grupos de tratamento de oito animais por corte com tamanhos tumorais homogêneos acima de 80 mm3. 200 pg de anticorpos monoclonais quiméricos purificados foram aplicados durante cinco semanas alternadas por injeções intravenosas e intraperitoneais duas vezes por semana. O grupo experimental tratado com um anticorpo não específico serviu como um controle negativo. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume maior de 1500 mm3.
Ensaio de Metástase
[00473] Para as células de ensaio de metástases, NEC8 foram recolhidas e filtradas através de um filtro celular de 70 pm para excluir grandes agregados celulares. 4 x 106 células NEC8 foram injetados na veia da cauda de camundongos oxni Nude fémeas atímicos de 6 semanas de idade. 3 dias após a injeção de células 200 pg de anticorpo monoclonal de murino muMAb purificada 64 A em PBS ou PBS sem anticorpo foram aplicados duas vezes por semana, alternando entre injeções intravenosas e intraperitoneais. Após oito semanas, os ratos foram sacrificados, os pulmões foram preparados e congelados em nitrogênio líquido.
[00474] O DNA genômico foi isolado a partir de tecido congelado, de acordo com as instruções do Blood & Cultura celular de DNA Midi Kit (Qiagen, 13343) . Os tecidos do pulmão foram homogeneizados utilizando o Ultra Torax T8.10
229/237 (IKA-Werke). A fim de evitar a contaminação com DNA genômico humano, o PCR quantitativo (qPCR) do DNA genômico de pulmão foi preparado sob condições estéreis. Para avaliar a carga tumoral de células NEC8 humanos em amostras de tecido de pulmão de murino de uma curva padrão foi gerada utilizando uma quantidade definida de DNA genômico humano e NEC8 DNA genômico de pulmão de murino. Portanto, a seguinte série de diluição foi usada (NEC8 DNA / rato DNA do pulmão): 200/0, 40/160, 8/192, 1,6 / 198,4, 0,32 / 199,68, 0064 / 199,94, 0013/200 e 0/200 ng. Para 200 pg de DNA genômico de qPCR, 2 x SYBR Green (Qiagen, 204,145), 16 nmol de iniciador com sentido(GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG, Eurofins) e 16 nmol de iniciador anti-sentido (TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC, Eurofins) em um volume total de 50 pl foram analisados usando o sisteme 7300 de PCR em tempo real de Applied Biosystems. Como um controle negativo, água foi utilizada em vez de DNA. QPCR foi realizada sob as seguintes condições: 15 min a 95° C (1 repetições), 30 segundos a 95° C / 30 s a 62° C / 30 segundos a 72° C (40 repetições), 15 segundos a 95° C / 30 seg a 60° C / 15 segundos a 95° C (1 repetições). Todas as reações de qPCR foram realizadas em triplicata. A carga de tumor de cada amostra de tecido de pulmão foi quantificada em correlação com a curva padrão usando o software System 7300 (Applied Biosystems).
Mapeamento de epítopos de alta resolução
230/237
[00475] Para analisar a interação entre os anticorpos e CLDN6 na sua conformação nativa foi utilizado mutagênese dirigida ao local em cultura de células de mamífero como uma técnica de mapeamento de epítopo. Portanto, foi realizada mutagênese de varrimento de alanina de aminoácido 27-81 e 137-161 no primeiro e segundo domínios extracelulares de CLDN6, respectivamente. Mutações de alanina foram gerados por mutagénese dirigida ao local (GENEART AG, Alemanha). Após a expressão transiente em células HEK293T, CLDN6 mutantes foram avaliados quanto à sua capacidade de ser ligada por anticorpos monoclonais específicos. Prejudicada ligação de um anticorpo monoclonal específico para um mutante CLDN6 sugerem que o aminoácido mutado é um contato importante e / ou resíduo conformacional. A ligação foi analisada por citometria de fluxo. Para discriminar entre populações de células transfectadas e não transfectadas, as células foram co-transfectadas com um marcador de fluorescência como um repórter. 24 h após a transfecção as células foram recolhidas com 0,05% de tripsina / EDTA, lavadas com tampão FACS (PBS contendo FCS a 2% e azida de sódio a 0,1%) e novamente suspensas em tampão FACS a uma concentração de 2 x 106 células / ml. 100 pl da suspensão de células foram incubadas com 10 pg de anticorpo / ml durante 30 min a 4 ° C. O antiCLDN6 de rato disponível comercialmente (R & D, MAB3656) foi utilizado como um controle para detectar a expressão da
231/237 superfície celular de mutante CLDN6. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas com uma APC-cabra conjugada com anti-IgG humana Fc-gama (Dianova, 109-136-170) ou um anti-IgG de camundongo conjugado com APC l + 2a + 2b + 3a específico anticorpo secundário (Dianova, 1 15-135-164) durante 30 min a 4 ° C. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de FACS. A ligação entre a população de células transfectadas foram analisados por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. Assim, a expressão do marcador de fluorescência foi traçada no eixo horizontal contra o anticorpo de ligação no eixo vertical. A intensidade média do sinal de um anticorpo monoclonal quimérico específico CLDN6 ligado a CLDN6 mutante foi expressa como a percentagem de ligação de tipo selvagem. Os aminoácidos que são essenciais para a ligação não mostraram ligação, após ter sido mutado na etapa que os aminoácidos que suportam a ligação definitiva mostraram ligação reduzida em comparação com o tipo selvagem.
[00476] Imunohistoquímica
[00477] Crio seções de tecido (4 pm) foram fixadas diretamente após o corte com acetona durante 10 min a -20° C. Em seguida, as seções foram secas durante 10 min à temperatura ambiente e armazenado a -80 ° C. Antes da utilização, as seções foram Thawn (10 min à temperatura ambiente) e re-hidratadas em PBS durante 5 min. A atividade
232/237 da peroxidase endógena foi bloqueada com 0,3% de peróxido de hidrogênio em PBS durante 15 min à temperatura ambiente. Para evitar a ligação não específica as lâminas foram bloqueadas com 10% de soro de cabra em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o anticorpo monoclonal murino específico de CLDN6 muMAb 64A (0,2 pg / ml diluído em soro de cabra a 10% / PBS) durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBS à temperatura ambiente (3 5 min) e incubadas com 100 pl dos anticorpos secundários (poli Powervision HRP -Anti-IgG de camundongo pronto-para-uso (Immuno lógica)) durante uma hora a RT. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS à temperatura ambiente (3 x 5 min) . Coloração final foi realizada por 1:30 min, utilizando o vetor NovaRED Substrato Kit SK-4800 a partir de Vetor Laboratories (Burlingame).
[00478] As seções foram contrastadas com hematoxilina durante 90 segundos à temperatura ambiente. Após desidratação com álcool graduado (70%, 80%, 2 x 96% e 99%, 5 min cada) e 10 min de incubação em xilol lâminas foram montadas com Kit X-tra (Medite Histotechnic).
[00479] A fim de utilizar os anticorpos monoclonais quimêricos mAb206-LCC e mAb206- subg sobre os tecidos humanos, eles foram marcados com FITC (Squarix GmbH, Alemanha). Seções de crio foram preparadas e tratadas como descrito acima em relação a fixação, o bloqueio da peroxidase
233/237 endógena e bloqueio dos locais de ligação não específicos. Em seguida, as lâminas foram incubadas com os anticorpos mAb206LCC-FITC e mAb206-subg-FITC (1 pm em 10% de soro de cabra / PBS) durante 1 h à temperatura ambiente em uma câmara escura. Em seguida, as lâminas foram lavadas com PBS à temperatura ambiente (3 x 5 min) e incubadas com 200 pl do anticorpo de coelho anti-FITC-HRP (AbD Serotec, dilluted 1: 300 em soro de cabra a 10% / PBS) durante 30 min à TA. A seguir à lavagem com PBS à temperatura ambiente (3 x 5 min), a reação do substrato foi realizada para 2:30 min utilizando o vetor NovaRED Substrato Kit SK-4800 de Vector Laboratories (Burlingame). A contracoloração, desidratação e fixação foram realizadas como descrito acima.
[00480] Análise da especificidade de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 por citometria de fluxo utilizando células HEK293T transientemente transfectadas com CLDN6 humano, 3, 4 e 9, respectivamente, revelou que os anticorpos monoclonais quiméricos chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206- SUBS mostrou ligação a CLDN6 sem interagir com CLDN3, 4 e 9, respectivamente (Fig. 27).
[00481] Em relação à ligação a CLDN6 humano estavelmente expressos na superfície de células HEK293 que os anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS exibiram valores
234/237 semelhantes de EC50 de baixo e de saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações (Fig. 28A).
[00482] As afinidades de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS a células tumorais que expressam endogenamente CLDN6 humano foi avaliada através da análise da ligação à linhagem celular de câncer testicular NEC8 por citometria de fluxo. Em comparação com variantes dos anticorpos específicos CLDN6 Chimab 64A, mAb206-subg e mAb206-SUBS combinação cadeia leve- mAb206-LCC mostrou forte afinidade de ligação a tríplice para células NEC8. Em todos os casos, a ligação de saturação foi atingida em baixas concentrações (Fig. 29).
[00483] Uma análise das afinidades de ligação dos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS para a linhagem celular de câncer do ovário humano OV90 por citometria de fluxo revelou que os anticorpos específicos de CLDN6 exibiram valores de CE50 baixo similares. A variante da combinação de cadeia leve mAb206-LCC mostrou ligação mais forte a células OV90 (Fig. 30).
[00484] Por células NEC-8 anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC e mAb206-subg exibiu atividade de CDC de uma forma dependente da dose, enquanto que em células NEC-8 CLDN6 knock-down nenhum destes
235/237 anticorpos foi capaz de induzir lise de células inespecíficas. Este resultado demonstrou funções efetoras específicas alvo de Chimab 64A, mAb206-LCC e mAb206-subg (Fig. 31a).
[00485] Anticorpos Chimab 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS exibiram atividade CDC em células NEC8 em uma forma dependente da dose. Em comparação com chimAB 64A a substituição de aminoácidos variantes mAb206-subg e mAb206SUBS apresentaram atividades CDC semelhantes em células NEC8 (Fig. 31b).
[00486] Anticorpos monoclonais quiméricos Anti-CLDN6 CHIMAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS mostraram dependente da dose a atividade de ADCC e ADCC induzida, mesmo a baixas concentrações de anticorpos em células de linhagens tumorais NEC8 e OV90 (Fig. 32a).
[00487] A Fig. 32b mostra a atividade de citotoxicidade celular (ADCC) dependente de anticorpos dos anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 Chimab 64A, mAb206-LCC e mAb206-subg em células tipo selvahem NEC8 e NEC 8. Para demonstrar a especificidade alvo de células NEC8 foi usado com um CLDN6 knock-down estável.
[00488] Um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com a linhagem celular de tumor NEC8 mostrou que em comparação com o grupo de controle sem anticorpo os anticorpos específicos CLDN6
236/237 mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-submarinos inibiram o crescimento tumoral (Fig. 33).
[00489] As curvas de crescimento na Fig. 34a demonstram que os anticorpos monoclonais quiméricos antiCLDN6 mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS são capazes de inibir o crescimento do tumor. O grupo de sobrevivência na Fig. 34b mostra a sobrevivência prolongada de ratos tratados com anticorpos específicos CLDN6.
[00490] Mapeamento de epitopo de alta resolução chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-subg e mAb206-SUBS demonstrado que os aminoácidos, F35 e G37 S39 e T33 potencialmente do primeiro domínio extracelular do CLDN6 são importantes para a interação com o anticorpo quimérico CLDN6 quimérico específico. Chimab 64A, mAb206- LCC, mAb206-subg e mAb206SUBS mostraram marcações idênticas (Fig. 35) .
[00491] Para testar o efeito terapêutico do anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 64A em um modelo de xenoenxerto de metástase, células NEC8 foram injetadas no vão da cauda de camundongos NuOe-FoxnJ atímicos. 3 dias após ao enxerto, os camundongos foram tratados com o anticorpo específico CLDN6 muMAb 64A. Após oito semanas, os pulmões foram preparados e a carga tumoral foi analisada por PCR. Em comparação com o grupo de controle, PBS anticorpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAb 64A mostraram claramente a inibição do crescimento do tumor (Fig. 36) .
237/237
[00492] A coloração imunohistoquimica de tecidos normais e cancerosos humanos utilizando anticorpos monoclonais muMAb 64A, mAb206-LCC e mAb206-subg revelou que, em contraste com tecidos normais, coloração forte homogênea foi observado em seções de tecido de câncer do ovário e de testículo. Uma coloração muito forte membranosa das populações de células epiteliais malignas foi detectada, enquanto estroma adjacente e células epiteliais não malignas não foram coradas (Fig. 37). Estes resultados mostram claramente que os anticorpos específicos de CLDN6 se ligam especificamente a células malignas derivadas de pacientes tumorais. (Explicação: número de tecidos que foram corados pelo anticorpo / número de tecidos analisados).

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1..
  2. 2. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende:
    (i) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: 36, e
    (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma sequência da cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 35, 54 e 55.
    2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a CLDN6 associado à superfície de uma célula que expressa CLDN6 e que substancialmente não é capaz de se ligar a CLDN9 associado à superfície de uma célula que expressa CLDN9.
  3. 3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que substancialmente não é capaz de se ligar a CLDN4 associado à superfície de uma célula que expressa CLDN4 e / ou substancialmente não é capaz de se ligar a CLDN3 associado à superfície de uma célula que expressa CLDN3.
  4. 4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é específico para CLDN6.
  5. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190126176, de 02/12/2019, pág. 14/26
    2/6
    reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a um epítopo locado dentro de uma porção extracelular de CLDN6. 6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 , caracterizado pelo fato de que CLDN6 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 2 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. 7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o
    anticorpo tem uma ou mais das seguintes atividades:
    (i) morte de uma célula que expressa CLDN6, (ii) inibição da proliferação de uma célula que expressa CLDN6, (iii) inibição da formação de colônias de uma célula que expressa CLDN6, (iv) mediação da remissão de tumores estabelecidos, (v) prevenção da formação ou re-formação de tumores, e (vi) inibição de metástases de uma célula que expressa CLDN6.
    8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que exibe uma ou mais funções efetoras imunológicas contra uma célula transportando CLDN6 na sua conformação nativa, em que uma ou mais funções efetoras imunológicas são,
    Petição 870190126176, de 02/12/2019, pág. 15/26
    3/6 preferencialmente, selecionadas a partir do grupo consistindo de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células anticorpodependente (ADCC), indução de apoptose e inibição da proliferação, de preferência, as funções efetoras são ADCC e / ou CDC.
    9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula expressando CLDN6 ou a célula transportando CLDN6 na sua conformação nativa é uma célula tumoral ou célula cancerígena.
    10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal ou quimérico ou um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo.
    11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a um ou mais epítopos de CLDN6 na sua conformação nativa.
    12. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 juntamente com um agente terapêutico, preferencialmente, uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
    Petição 870190126176, de 02/12/2019, pág. 16/26
    4/6
    13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreendendo o anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e / ou um conjugado conforme definido pela reivindicação 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    14. Uso de um anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e / ou um conjugado conforme definido pela reivindicação 12 caracterizado pelo fato de que para a preparação de um medicamento para (i) inibição do crescimento de uma célula cancerígena que expressa CLDN6 em que é pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular, (ii) matar uma célula cancerígena que expressa CLDN6 em que é pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular, (iii) inibir propagação metastática de uma célula cancerígena expressando CLDN6, em que é pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
    15. Uso de um anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e / ou um conjugado conforme definido pela reivindicação 12 ou a composição farmacêutica conforme definido pela reivindicação 13 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença ou desordem envolvendo uma célula que expressa CLDN6 em que é pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular em um indivíduo.
    Petição 870190126176, de 02/12/2019, pág. 17/26
    5/6
    16. Uso do anticorpo, de acordo com a reivindicação 14 ou de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tumor ou câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de câncer do ovário, em particular, um adenocarcinoma de ovário e teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em especial, carcinoma pulmonar de células escamosas e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em especial, carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em especial, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer de bexiga, em particular, carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular, carcinoma de células renais incluindo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma papilar renal, câncer de cólon, câncer de intestino delgado incluindo o câncer do íleo, em particular, adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma testicular embrionário, coriocarcinoma placentário, câncer do colo do útero, câncer testicular, seminoma testicular, em particular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino,
    Petição 870190126176, de 02/12/2019, pág. 18/26
  6. 6/6 tumor de células germinativas, tais como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular, um tumor de células germinativas testículares e as formas metastáticas destes, inibindo a propagação de metástase de uma célula que expressa CLDN6 em que é pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
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