BR112013020684B1

BR112013020684B1 - composição de aditivo de ração e seu método de prepa-ração, ração e seu método de preparação, e pré-mistura

Info

Publication number: BR112013020684B1
Application number: BR112013020684-5A
Authority: BR
Inventors: Luis Fernando Romero Millán
Original assignee: Dupont Nutrition Biosciences Aps
Priority date: 2011-02-18
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2020-11-10
Also published as: BR112013020684A2; CN103533843A; US20190076488A1; EP2675286A2; ZA201305269B; AU2012216898A1; DK2675286T3; GB201102857D0; WO2012110778A2; EP2675286B1; CA2825618C; CA2825618A1; AU2016201761A1; AR084893A1; US10695384B2; WO2012110778A3; ES2621137T3; AU2016201761B2; US20140234279A1; TW201234977A

Abstract

COMPOSIÇÃO DE ADITIVO DE RAÇÃO, MICRORGANISMO DE ALIMENTAÇÃO DIRETA EM COMBINAÇÃO COM UMA PROTEASE, UMA XILANASE, UMA AMILASE E UMA FITASE, KIT, MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE ADITIVO DE RAÇÃO, RAÇÃO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA REFERIDA RAÇÃO E PRÉ-MISTURA. A presente invenção refere-se a uma composição de aditivo de ração que compreende um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase, e um método para melhorar o desempenho de um indivíduo ou para melhorar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar a retenção de nitrogênio, ou para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica ou para melhorar a razão de conversão alimentar (FCR) ou para melhorar o ganho de peso em um indivíduo ou para melhorar a eficiência alimentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo ou para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, sendo que o método compreende administrar a um indivíduo um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a métodos para melhorar composições de ração usando um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma combinação específica de enzimas, e a uma composição de aditivo de ração que compreende um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma combinação específica de enzimas. A presente invenção refere-se, adicionalmente, a usos e kits.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Enzimas suplementares são usadas como aditivos para ração animal, particularmente, rações para aves domésticas e suínos, como um meio de aprimorar as características de utilização de nutrientes e desempenho da produção. Misturas de enzimas estão disponíveis para aprimorar o valor nutricional de dietas contendo farelo de feijão soja, farelos de proteína animal ou subprodutos alimentares com alto teor de fibras.

[0003] O conceito de microrganismos de alimentação direta (DFM) envolve a alimentação de micróbios benéficos a animais, como gado leiteiro, quando eles estão sob períodos de estresse (doença, alterações na ração, desafios ambientais ou de produção). Probióticos é um outro termo para esta categoria de aditivos de ração. Foi mostrado que os probióticos ou DFM aprimoram o desempenho do animal em estudos controlados. Os DFM incluem produtos à base de bactérias ou leveduras de alimentação direta.

[0004] Embora combinações de DFMs com algumas enzimas tenham sido contempladas, a interação entre DFMs e enzimas nunca foi completamente compreendida. A presente invenção se refere a com-binações específicas inovadoras que surpreendentemente melhoram significativamente as características de desempenho de produção de animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] Um achado seminal da presente invenção é que um DFM em combinação com uma protease, xilanase, amilase e fitase tem efeitos benéficos significativos sobre o desempenho de um animal.

[0006] Em particular, um achado seminal da presente invenção é que um DFM em combinação com uma protease, xilanase, amilase e fitase tem efeitos benéficos significativos sobre o desempenho de um animal, incluindo a melhoria de um ou mais dos seguintes: razão de conversão alimentar (FCR), capacidade de digerir uma matéria-prima (por exemplo, digestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), retenção de nitrogênio, índice de sobrevivência, rendimento da carcaça, taxa de crescimento, ganho de peso, eficiência alimentar, resistência dos animais à enterite necrótica, a resposta imune do indivíduo, ou o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo.

[0007] Outro efeito surpreendente da presente invenção é que ela pode reduzir a excreção de nutrientes no conteúdo de esterco (por exemplo, reduzir o nitrogênio e o fósforo) do esterco de um indivíduo.

[0008] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase.

[0009] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para melhorar o desempenho de um indivíduo ou para melhorar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, di- gestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar a retenção de nitrogênio, ou para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica ou para melhorar a razão de conversão alimentar (FCR) ou para melhorar o ganho de peso em um indivíduo ou para melhorar a eficiência alimentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo, ou para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir a excreção de nutrientes no esterco, sendo que o método compreende administrar a um indivíduo um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase.

[00010] Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase para melhorar o desempenho de um indivíduo ou para melhorar a digestibilidade de uma matéria-prima em uma ração (por exemplo, digestibilidade de nutrientes, como digestibilidade de aminoácidos), ou para melhorar a retenção de nitrogênio, ou para evitar os efeitos negativos da enterite necrótica ou para melhorar a razão de conversão alimentar (FCR) ou para melhorar o ganho de peso em um indivíduo ou para melhorar a eficiência alimentar em um indivíduo ou para modular (por exemplo, melhorar) a resposta imune do indivíduo, ou para promover o crescimento de bactérias benéficas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo, ou para reduzir a excreção de nutrientes no esterco.

[00011] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um kit que compreende um microrganismo de alimentação direta, uma protease, uma xilanase, uma amilase, uma fitase (e, opcionalmente, pelo menos uma vitamina e/ou opcionalmente, pelo menos um mineral) e instruções para administração.

[00012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar uma composição de aditivo de ração, que compreende misturar um microrganismo de alimentação direta com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase e (opcionalmente) embalar.

[00013] Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma ração ou alimento para animais que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase.

[00014] Uma pré-mistura compreende uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase, e pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina.

[00015] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar um alimento para animais que compreende misturar um componente de ração com uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma protease, uma xilanase, uma amilase e uma fitase.

[00016] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição de aditivo de ração para a prevenção e/ou tratamento de coccidiose e/ou enterite necrótica em um indivíduo.

[00017] A presente invenção ainda fornece um método para prevenir e/ou tratar enterite necrótica e/ou coccidiose sendo que uma quantidade eficaz de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção é administrada a um indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00018] A Figura 1 mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro® disponível junto à Danisco A/S) com uma combinação de uma xilanase (por exemplo, uma endo-xilanase de xilanase de Trichoder- ma), uma amilase (por exemplo, uma alfa-amilase de Bacillus licheni- formis), uma protease (por exemplo, protease de Bacillus subtilis) e uma fitase (por exemplo, 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coli) disponível junto à Danisco A/S) melhorou significativamente (reduziu) as classificações de lesão de enterite necrótica no trato gastrointestinal dos animais em comparação ao controle estimulado. Em algumas modalidades, a xilanase, amilase e protease podem ser formuladas juntas em AxtraXAP® [contendo 2.000 Xll/kg de ração de xilanase; 200 All/kg de ração de amilase e 4.000 Pll/kg de ração de protease] também disponível junto à Danisco A/S).

[00019] A Figura 2 mostra que uma combinação de (Enviva Pro® disponível junto à Danisco A/S) com uma combinação de uma xilanase (por exemplo, uma endo-xilanase de xilanase de Trichoderma), uma amilase (por exemplo, uma alfa-amilase de Bacillus licheniformis), uma protease (por exemplo, protease de Bacillus subtilis) e uma fitase (por exemplo, 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coli) disponível junto à Danisco A/S) melhorou significativamente o ganho de peso corporal (ganho de PC) em frangos de corte estimulados com Clostridium perfringens em comparação ao controle estimulado - mesmo que resultando em um ganho de PC aprimorado em relação a um controle negativo (isto é, um controle não estimulado). Isto foi significativamente melhor que qualquer outra combinação de enzimas, como amilase e fitase ou protease e fitase, e significativamente melhor que o DFM aplicado ao controle estimulado. Em algumas modalidades, a xilanase, amilase e protease podem ser formuladas juntas em AxtraXAP® [contendo 2.000 XU/kg de ração de xilanase; 200 AU/kg de ração de amilase e 4.000 PU/kg de ração de protease] também disponível junto à Danisco A/S). Desvio-padrão da média (SEM) agrupado = 28,6

[00020] A Figura 3 mostra que uma combinação de (Enviva Pro® disponível junto à Danisco A/S) com uma combinação de uma xilanase (por exemplo, uma endo-xilanase de xilanase de Trichoderma), uma amilase (por exemplo, uma alfa-amilase de Bacillus licheniformis), uma protease (por exemplo, protease de Bacillus subtil is) e uma fitase (por exemplo, 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coll) disponível junto à Danisco A/S) melhorou significativamente a razão de conversão alimentar (FCR) (g de ingesta de ração/g de ganho de PC) em frangos de corte estimulados com Clostridium perfringens até o nível das aves não estimuladas. Isto foi significativamente melhor que outras combinações de enzimas com o DFM como amilase e fitase ou protease e fitase. Em algumas modalidades, a xilanase, amilase e protease podem ser formuladas juntas em AxtraXAP® [contendo 2.000 Xll/kg de ração de xilanase; 200 AU/kg de ração de amilase e 4.000 Pll/kg de ração de protease] também disponível junto à Danisco A/S).

[00021] A Figura 4 mostra a expressão de mRNA relativa de IFN-g usado como marcador de inflamação no intestino, e mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma combinação de xilanase, amilase, protease e fitase (Avizyme 1502® disponível junto à Danisco A/S + 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coll) aumentou a expressão de IFN-g em 11 dias e reduziu esta expressão em 20 dias.

[00022] A Figura 5 mostra a energia digestível do íleo aparente (mCal/kg) e mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma xilanase, amilase, protease e fitase (duas misturas de enzimas diferentes foram usadas, a primeira foi Avizyme 1502® disponível junto à Danisco A/S + 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coll)', e a segunda foi AxtraXAP [contendo 2.000 XU/kg de ração de xilanase; 200 AU/kg de ração de amilase e 4.000 PU/kg de ração de protease] também disponível junto à Danisco A/S + 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coli) melhorou significativamente os efeitos da digestibilidade de energia.

[00023] A Figura 6 mostra que a digestibilidade de aminoácidos melhorou significativamente com uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma xilanase, amilase, protease e fitase. O aprimoramento da digestibilidade das frações de aminoácido não digeridas no nível do íleo com uma combinação de DMF com xilanase, amilase, protease e fitase foi mais que o aprimoramento do DFM sozinho ou da combinação de xilanase, amilase, protease e fitase sem DFM.

[00024] A Figura 7 mostra a digestibilidade de energia aprimorada com uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma xilanase, amilase, protease e fitase.

[00025] A Figura 8 mostra a energia metabolizável aparente corrigida para o nitrogênio AMEn de tratamentos dietéticos dados a frangos de corte com 17 a 21 dias de idade.

[00026] A Figura 9 mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma xilanase, amilase, protease e fitase (duas misturas diferentes de enzimas foram usadas, a primeira foi Avizyme 1502® disponível junto à Danisco A/S + 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coli)', e a segunda foi AxtraXAP também disponível junto à Danisco A/S+ 500 FTU/kg de Phyzyme XP (uma fitase de E. coli) aprimorou significativamente a retenção de nitrogênio.

[00027] A Figura 10 mostra que uma combinação de DFM (Enviva Pro®) com uma xilanase, amilase, protease e fitase (Avizyme 1502® disponível junto à Danisco A/S + Phyzyme XP (uma fitase de E. coli)) reduz significativamente a abundância de mRNA de MUC-2 nas ras- pagens de mucosa do íleo no dia 14 tratadas com uma vacina coccidi- ana dada em alta dose, na choca, em comparação aos tratamentos de controle estimulado e não estimulado.

[00028] A Figura 11 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO. 1) de uma alfa amilase resistente à pepsina de Bacillus licheniformis.

[00029] A Figura 12 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 2) de uma alfa amilase resistente à pepsina de Bacillus licheniformis.

[00030] A Figura 13 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO. 3) de uma alfa amilase resistente à pepsina de Trichoderma ree- sei.

[00031] A Figura 14 mostra a sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO. 4) de uma alfa amilase resistente à pepsina de Trichoderma ree- sei.

[00032] A Figura 15 mostra a razão de conversão alimentar de frangos de corte no dia 48 de idade.

[00033] A Figura 16 mostra um mapa de calor dos perfis de expressão dos genes de interesse para todos os tratamentos para o jeju- no aos 23 dias de idade. Controle não estimulado= Controle não estimulado + fitase CC = Controle estimulado + fitase CC+ Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase CC+ XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase + Enviva Pro CC+ EP + XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease + Enviva Pro.

[00034] A Figura 17 mostra um mapa de calor do perfil de expressão de alfa amilase de galinha para todos os tratamentos no pâncreas em 23 dias de idade. Controle não estimulado= Controle não estimulado + fitase CC = Controle estimulado + fitase CC+ Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase CC+ XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase + Enviva Pro CC+ EP + XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease + Enviva Pro.

[00035] A Figura 18 mostra a energia metabolizável aparente corrigida pela retenção de nitrogênio (AMEn) de frangos de corte com 21 dias de idade. Efeito do DFM; P<0,001; Efeito da enzima; P<0,001; Efeito de DFM x Enzima; P=0,27; Desvio-padrão da média (SEM) agrupado =32 kcal.

[00036] A Figura 19 mostra a razão de conversão alimentar (FCR) de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica (SEM agrupado: 0,015).

[00037] A Figura 20 mostra a proporção relativa de Lactobacillus spp. em 21 dias no jejuno em frangos de corte, ChSq <0,0001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00038] De preferência, a(s) enzima(s) usada(s) na presente invenção é/são exógena(s) ao DFM. Em outras palavras, a(s) enzima(s) é/são, de preferência, adicionada(s) ou misturada(s) com o DFM.

[00039] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado conforme compreendido pelo versado na técnica à qual esta descrição pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley e Sons, New York, EUA (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY, EUA (1991) fornecem a urn ver- sado na técnica um dicionário geral de muitos termos usados na descrição.

[00040] Esta descrição não se limita aos métodos e materiais exemplificadores aqui apresentados, e quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos podem ser usados na prática ou teste das modalidades desta descrição. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Exceto onde indicado em contrário, quaisquer sequências de ácidos nucleicos são escritas da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.

[00041] Os títulos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades desta descrição, que podem ser admitidos por referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo como um todo.

[00042] Os aminoácidos são designados aqui usando o nome do aminoácido, a abreviação de três letras ou a abreviação de uma letra.

[00043] O termo "proteína", para uso na presente invenção, inclui proteínas, polipeptídeos, e peptídeos.

[00044] Para uso na presente invenção, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo de "polipeptídeo" e/ou do termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídeo"; em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "enzima".

[00045] Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável na presente invenção. Na presente descrição e nas rei-vindicações, os códigos convencionais de uma letra e três letras para os resíduos de aminoácido podem ser usados. O código de 3 letras para os aminoácidos, como definido em conformidade com a Comis são Conjunta sobre Nomenclatura Bioquímica (JCBN) da IUPACIUB. Também deve ser compreendido que um polipeptideo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético.

[00046] Outras definições de termos podem aparecer por toda o relatório descritivo. Antes de as modalidades exemplificadoras serem descritas em detalhes, deve-se compreender que esta descrição não se limita às modalidades particulares descritas, uma vez que isto pode, logicamente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito apenas de descrever as modalidades particulares, e não se destina a ser limitante, já que o escopo da presente descrição será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[00047] Quando uma faixa de valores for fornecida, entende-se que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto determine claramente de outro modo, entre os limites superior e inferior daquela faixa também foi apresentado especificamente. Cada faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor interveniente em uma faixa declarada e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente em que a faixa estabelecida está abrangida dentro desta descrição. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos na faixa e cada faixa onde qualquer um, nenhum, ou ambos os limites estão incluídos nas faixas menores também está incluída nesta descrição, sujeitos a qualquer limite excluído especificamente da faixa estabelecida. Quando a faixa estabelecida incluir um ou ambos os limites, as faixas que excluem um ou ambos estes limites incluídos também estão inclu-ídas nesta descrição.

[00048] Deve ser observado que, como usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "o", "a", "um", "uma" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Desta forma, por exemplo, referência a "uma enzima" inclui uma pluralidade destes agentes candidatos, e referência a "a ração" inclui referência a uma ou mais rações e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica, e assim em diante.

[00049] As publicações discutidas aqui são fornecidas apenas para descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada nelas deve ser considerado uma admissão de que tais publicações constituem técnica anterior às reivindicações em anexo.

[00050] As enzimas para uso na presente invenção podem ser produzidas por cultura sólida ou submersa, inclusive em processos de batelada, de batelada alimentada e de fluxo contínuo. A cultura é feita em um meio de crescimento que compreende um meio aquoso com sais minerais, fatores de crescimento orgânicos, o material fonte de carbono e energia, oxigênio molecular, e, logicamente, um inoculo inicial de uma ou mais espécies de microrganismos específicas que serão empregadas. Microrganismo de alimentação direta (DFM)

[00051] O termo "microbiano" da presente invenção é usado de forma intercambiável com "microrganismo".

[00052] De preferência, o DFM compreende um microrganismo viável. De preferência, o DFM compreende uma bactéria viável ou uma levedura viável ou fungos viáveis.

[00053] Em uma modalidade preferencial, o DFM compreende uma bactéria viável.

[00054] O termo "microrganismo viável" significa um microrganismo que é metabolicamente ativo ou capaz de se diferenciar.

[00055] Em uma modalidade, o DFM pode ser uma bactéria formadora de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido de ou pode conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Portanto, em uma modalidade, o termo "microrganismo viável" para uso na presente invenção pode incluir esporos microbianos, como endósporos ou conídios.

[00056] Em outra modalidade, o DFM na composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não é compreendido de ou não contém esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídios.

[00057] O microrganismo pode ser um microrganismo de ocorrência natural ou ele pode ser um microrganismo transformado. O microrganismo pode, também, ser uma combinação de microrganismos adequados.

[00058] Em alguns aspectos, o DFM de acordo com a presente invenção pode ser um ou mais dos seguintes: uma bactéria, uma levedura, um fungo.

[00059] De preferência, o DFM de acordo com a presente invenção é um microrganismo probiótico.

[00060] Na presente invenção, o termo microrganismo de alimentação direta (DFM) abrange bactérias de alimentação direta, leveduras de alimentação direta, fungos de alimentação direta e combinações dos mesmos.

[00061] De preferência, o DFM é uma bactéria de alimentação direta.

[00062] De preferência, o DFM é uma combinação que compreende duas ou mais bactérias, por exemplo, três ou mais ou quatro ou mais; ou o DFM é uma combinação que compreende duas ou mais cepas bacterianas, por exemplo, três ou mais ou quatro ou mais.

[00063] De preferência, a bactéria ou bactérias é ou são isolada(s).

[00064] Adequadamente, o DFM pode compreender um bactéria de um ou mais dos seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Car- nobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium e Me- gasphaera e combinações dos mesmos.

[00065] Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dentre os seguintes Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis e Bacillus amyloliquefaciens.

[00066] Em uma modalidade, o DFM pode ser uma combinação que compreende duas ou mais cepas de Bacillus.

[00067] Em uma modalidade, o DFM pode ser uma combinação de duas ou mais das cepas de Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506); 15A- P4 (PTA-6507); 22C-P1 (PTA-6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-50105); BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-50634).

[00068] As cepas 3A-P4 (PTA-6506), 15A-P4 (PTA-6507) e 22C-P1 (PTA-6508) estão disponíveis ao público junto à American Type Culture Collection (ATCC).

[00069] As cepas 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B- 50104); BS27 (NRRL B-50105) estão disponíveis ao público junto à Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL). A cepa de Bacillus subtilis LSSA01 é algumas vezes chamada de B. subtilis 8.

[00070] Estas cepas são ensinadas na US 7.754.469 B2.

[00071] Os Bacillus subtilis BS 18 e Bacillus subtilis BS 278 foram depositadas por Andy Madisen de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, Wl 53186, EUA ou Danisco USA Inc. de W227 N752 West- mound Dr. Waukesha, Wl 53186, EUA de acordo com o Budapest Treaty (Tratado de Budapeste) no Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) em 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos da América, sob os números de depósito NRRL B-50633 e NRRL B-50634, respectivamente, em 9 de janeiro de 2012.

[00072] Andy Madisen de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, Wl 53186, EUA e Danisco USA Inc. de W227 N752 Westmound Dr. Waukesha, Wl 53186, EUA autorizam a Danisco A/S de Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001, Copenhagen K, Dinamarca a se referir a estes materiais biológicos depositados neste pedido de patente e deram consentimento não reservado e irrevogável ao material depositado sendo disponibilizado para o público.

[00073] Em algumas modalidades, o DFM pode ser uma combinação que compreende as cepas de Bacillus subtilis, conforme detalhado na tabela abaixo:

[00074] Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado a partir dos seguintes Lactococcus spp: Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis e combinações dos mesmos.

[00075] Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dos seguintes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus cur- vatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lac-tobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii, e combinações de quaisquer dos mesmos.

[00076] Em uma modalidade, o DFM pode ser selecionado dos seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifi- dium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum, e combinações de quaisquer dos mesmos.

[00077] Adequadamente, o DFM pode compreender uma bactéria de uma ou mais das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus li- cheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus, Enterococcus spp, e Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e combinações dos mesmos.

[00078] A bactéria de alimentação direta usada na presente invenção pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[00079] Adequadamente, o DFM de acordo com a presente invenção pode ser um ou mais dos produtos ou os microrganismos contidos nestes produtos, conforme a tabela abaixo:

[00080] Em uma modalidade, adequadamente, o DFM pode ser Enviva Pro®. Enviva Pro® está disponível comercialmente junto à Danisco A/S e é uma combinação da cepa de Bacillus 2084, n° de acesso NRRI B-50013, da cepa de Bacillus LSSAO1, n° de acesso NRRL B- 50104 e da cepa de Bacillus 15A-P4 ATCC, n° de acesso PTA-6507 (conforme apresentado em US 7.754.469 B - aqui incorporado, a título de referência).

[00081] Adequadamente, o DFM pode compreender uma levedura do gênero: Saccharomyces spp.

[00082] De preferência, o DFM que será usado de acordo com a presente invenção é um microrganismo que é geralmente reconhecido como seguro e que é, de preferência, aprovado pelo GRAS.

[00083] Um versado na técnica terá facilmente conhecimento de espécies e/ou cepas de microrganismos dos gêneros aqui descritos que são usadas nos alimentos e/ou indústrias agrícolas e que são ge-ralmente considerados adequados para o consumo animal.

[00084] De preferência, o DFM usados de acordo com a presente invenção é adequado para consumo animal.

[00085] Vantajosamente, quando o produto é uma ração ou composição de aditivo de ração, o DFM viável deve permanecer eficaz até a data de "validade" ou "vencimento" normal do produto durante o qual a ração ou composição de aditivo de ração é oferecida para venda pelo distribuidor. Os períodos de tempo desejados e a vida útil normal variarão de ração para ração e os elementos versados na técnica irão reconhecer que os tempos de vida útil irão variar dependendo do tipo de ração, do tamanho da ração, das temperaturas de armazenamento, condições de processamento, material para embalagem e equipamento de embalagem.

[00086] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Este é particularmente o caso no qual a ração é peletizada. Portanto, em uma modalidade, o DFM pode ser um microrganismo termotolerante, como uma bactéria termotolerante, incluindo, por exemplo Bacillus spp.

[00087] Em algumas modalidades, pode ser preferencial que o DFM seja uma bactérias formadora de poros, como Bacilli, por exemplo, Bacillus spp. Os bacilos são capazes de formar endósporos estáveis quando as condições para o crescimento forem desfavoráveis e são muito resistentes ao calor, pH, umidade e desinfetantes.

[00088] Em uma modalidade, adequadamente, o DFM pode reduzir ou evitar o estabelecimento intestinal de microrganismos patogênicos (como Clostridium perfringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.).

[00089] O DFM de acordo com a presente invenção pode ser qualquer DFM adequado. Em uma modalidade, o seguinte ensaio "ensaio DFM" pode ser usado para determinar a adequação de um microrganismo para ser um DFM. A título de esclarecimento, em uma modalidade, um DFM selecionado como a cepa inibitória (ou um DFM antipa- tógeno) de acordo com o "ensaio DFM" ensinado aqui é um DFM adequado para uso de acordo com a presente invenção, isto é, na composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção.

Ensaio DFM:

[00090] Cada tubo foi semeado com um patógeno representativo de um agrupamento representativo.

[00091] O sobrenadante de um DFM potencial cultivado aerobica- mente ou anaerobicamente foi adicionado aos tubos semeados e incubado.

[00092] Após a incubação, a densidade óptica (OD) dos tubos de controle e com sobrenadante tratado foi medida para cada patógeno.

[00093] Colônias de cepas (DFM em potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação ao controle foram classificadas como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatógeno).

[00094] O ensaio DFM, como usado aqui, é explicado em mais detalhes em US2009/0280090 - aqui incorporado, a título de referência.

[00095] De preferência, o patógeno representativo usado no ensaio é um (ou mais) dos seguintes: Clostridium, como Clostridium perfrin- gens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade preferencial, o ensaio é con-duzido com um ou mais de Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile e/ou E. coli, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clos-tridium difficile, com mais preferência, Clostridium perfringens.

[00096] Em uma modalidade, o DFM da presente invenção é, de preferência, um antipatógeno.

[00097] O termo "antipatógeno", como usado aqui, significa que o DFM se opõe a um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[00098] Em uma modalidade, para determinar se um DFM é um DFM antipatogênico, o ensaio de DFM mencionado acima pode ser usado. Um DFM é considerado um antipatógeno ou um DFM antipatogênico, se ele for classificado como uma cepa inibitória no "ensaio de DFM" acima mencionado, por exemplo, quando o patógeno é Clostridium perfringens.

[00099] Em uma modalidade, o DFM antipatógeno pode ser uma ou mais das seguintes bactérias: Cepa de Bacillus subtilis 2084 n° de acesso NRRI B-50013, Cepa de Bacillus subtilis LSSAO1, n° de acesso NRRL B- 50104, Cepa de Bacillus subtilis 15A-P4 n° de acesso ATCC PTA- 6507, Cepa de Bacillus subtilis 3A-P4, n° de acesso ATCC PTA- 6506, e Cepa de Bacillus subtilis BS27, n° de acesso ATCC NRRL B-50105.

[000100] A título de esclarecimento, estas cepas estão disponíveis e são referidas no documento US 7.754.459 B.

[000101] Em uma modalidade, o DFM usado de acordo com a presente invenção não é a cepa de Lactobacillus gasseri BNR 17, n° de acesso KCTC 10902BP, conforme apresentado no W02008/016214.

[000102] De preferência, o DFM não é um microrganismo inativado.

[000103] Em uma modalidade, o DFM, como usado aqui, é uma composição que compreende um ou mais microrganismos de DFM, conforme descrito aqui. A composição pode compreender, adicional-mente, as enzimas da presente invenção. A composição pode ser ali-mentada a um animal como um microrganismo de alimentação direta (DFM). Um ou mais veículos ou outros ingredientes podem ser adicio-nados ao DFM. O DFM pode ser apresentado sob várias formas físicas, por exemplo, como uma cobertura, como um concentrado solúvel em água para uso como uma calda líquida ou para ser adicionado a um substituto de leite, cápsula de gelatina, ou géis. Em uma modalidade da forma de cobertura, o produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veículo, como soro de leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco, e/ou silico aluminato de sódio. Em uma modalidade do concentrado solúvel em água para uma calda líquida ou suplemento substituto de leite, produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veículo solúvel em água, como soro de leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, amido seco, silico aluminato de sódio, e um líquido é adicionado para formar a calda ou o suplemento é adicionado a leite ou um substituto de leite. Em uma modalidade da forma de cápsula de gelatina, o produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veículo, como soro de leite, maltodextrina, açúcar, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco e/ou silico aluminato de sódio. Em uma modalidade, as bactérias e o veículo são colocados em uma cápsula de gelatina degradável. Em uma modalidade da forma de géis, o produto de fermentação seco por congelamento é adicionado a um veículo, como óleo vegetal, sacarose, dióxido de silício, polissorbato 80, propileno glicol, hidróxi anisol butilado, ácido cítrico, etoxiquina, e/ou colorido artificial para formar o gel.

[000104] O(s) DFM(s) pode(m), opcionalmente, ser misturado(s) com uma formulação seca de aditivos incluindo, mas não se limitando a, substratos de crescimento, enzimas, açúcares, carboidratos, extratos e microingredientes promotores de crescimento. Os açúcares poderiam incluir os seguintes: lactose; maltose; dextrose; malto-dextrina; glicose; frutose; manose; tagatose; sorbose; rafinose; e galactose. Os açúcares variam de 50 a 95%, individualmente ou em combinação. Os extratos poderiam incluir solúveis da fermentação de levedura ou levedura secana faixa de 5 a 50%. Os substratos de crescimento poderiam incluir: tripticase, na faixa de 5 a 25%; lactato de sódio, na faixa de 5 a 30%; e, Tween 80, na faixa de 1 a 5%. Os carboidratos poderiam inclui manitol, sorbitol, adonitol e arabitol. Os carboidratos poderiam estar na faixa de 5 a 50% individualmente ou em combinação. Os microingredientes poderiam incluir os seguintes: carbonato de cálcio, na fai- xa de 0,5 a 5,0%; cloreto de cálcio, na faixa de 0,5 a 5,0%; fosfato di- potássico, na faixa de 0,5 a 5,0%; fosfato de cálcio, na faixa de 0,5 a 5,0%; proteinato de manganês, na faixa de 0,25 a 1,00%; e, manganês, na faixa de 0,25 a 1,0%.

[000105] Para preparar os DFMs aqui descritos, a(s) cultura(s) e o(s) veículo(s) (quando usado(s)) podem ser adicionados a um misturador de fitas ou de pás e misturados durante cerca de 15 minutos, embora a temporização possa ser aumentada ou reduzida. Os componentes são misturados de modo que resulte em uma mistura uniforme das culturas e veículos. O produto final é, de preferência, um pó fluxível seco. O(s) DFM(s) ou a composição compreendendo o mesmo pode ser adicionada a uma ração animal ou uma pré-mistura de ração, adicionada à água de um animal, ou administrada de outras formas conhecidas na técnica (de preferência, simultaneamente com as enzimas da presente invenção). Uma ração para um animal pode ser suplementada com um ou mais DFM(s) aqui descritos ou com uma composição aqui descrita.

[000106] Por "uma mistura de pelo menos duas cepas," entende-se uma mistura de duas, três, quatro, cinco, seis ou mesmo mais cepas. Em algumas modalidades de uma mistura de cepas, as proporções podem variar de 1% a 99%. Outras modalidades de uma mistura de cepas são de 25% a 75%. Modalidades adicionais de uma mistura de cepas são aproximadamente 50% para cada cepa. Quando uma mistura compreender mais de duas cepas, as cepas podem estar presentes em proporções substancialmente iguais ou em proporções diferentes na mistura.

[000107] O DFM pode ser administrado adequadamente.

[000108] Adequadamente, as dosagens de DFM na ração podem estar entre cerca de 1x103 UFC/g de ração a cerca de 1x109 UFC/g de ração, adequadamente, entre cerca de 1x104 UFC/g de ração a cerca de 1x108 UFC/g de ração, adequadamente, entre cerca de 7,5x104 UFC/g de ração a cerca de 1x107 UFC/g de ração.

[000109] Em uma modalidade, o DFM é administrado na ração a mais que cerca de 1x103 UFC/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 1x104 UFC/g de ração, adequadamente, mais que cerca de 7,5x104 UFC/g de ração.

[000110] Adequadamente, dosagens de DFM na composição de aditivo de ração podem ser entre cerca de 1x105 UFC/g de composição a cerca de 1x1013 UFC/g de composição, adequadamente, entre cerca de 1x106 UFC/g de composição a cerca de 1x1012 UFC/g de composição, adequadamente, entre cerca de 3,75x107 UFC/g de composição a cerca de 1x1011 UFC/g de composição.

[000111] Em uma modalidade, o DFM é administrado na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 1x105 UFC/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 1x106 UFC/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 3,75x107 UFC/g de composição.

[000112] Em uma modalidade, o DFM é administrado na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 2x105 UFC/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 2x106 ufc/g de composição, ade-quadamente, mais que cerca de 3,75x107 UFC/g de composição.

[000113] Para uso na presente invenção, o termo "UFC" significa unidades de formação de colônia e é uma medida das células viáveis na qual uma colônia representa um agregado de células derivado de uma única célula progenitora.

Xilanase

[000114] Xilanase é o nome dado a uma classe de enzimas que de-gradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose degradando, assim, a hemicelulose, um dos componentes principais das paredes celulares vegetais.

[000115] A xilanase para uso na presente invenção pode ser qualquer xilanase disponível para comercialização.

[000116] Adequadamente, a xilanase pode ser uma endo-1,4-β-d- xilanase (classificada como E.C. 3.2.1.8) ou uma 1,4 β-xilosidase (classificada como E.C. 3.2.1.37).

[000117] Em uma modalidade, de preferência, a xilanase em uma endoxilanase, por exemplo, uma endo-1,4-β-d-xilanase. A classificação para uma endo-1,4-β-d-xilanase é E.C. 3.2.1.8.

[000118] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um DFM em combinação com uma endoxilanase, por exemplo, uma endo- 1,4-β-d-xilanase, e outra enzima.

[000119] Todas as classificações de enzima E.C. aqui mencionadas se referem às classificações fornecidas no documento Enzyme No-menclature - Recommendations (1992) do comitê de nomenclaturas da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular - ISBN 0- 12-226164-3.

[000120] Adequadamente, a xilanase para uso na presente invenção pode ser uma xilanase de Bacillus, Trichoderma, Thermomyces, Aspergillus e Penicillium.

[000121] Em uma modalidade, a xilanase pode ser a xilanase em Axtra XAP® ou Avizyme 1502®, ambos produtos disponíveis comercialmente junto à Danisco A/S.

[000122] Em uma modalidade preferencial, a xilanase para uso na presente invenção pode ser uma ou mais das xilanases em um ou mais dos produtos comerciais abaixo:

[000123] De preferência, a xilanase está presente na ração em uma faixa de cerca de 500 XU/kg a cerca de 16.000 XU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 750 XU/kg de ração a cerca de 8.000 XU/kg de ração, e com mais preferência ainda cerca de 1.000 XU/kg de ração a cerca de 4.000 XU/kg de ração.

[000124] Em uma modalidade, a xilanase está presente na ração a mais que cerca de 500 XU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 600 XU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 700 XU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 800 XU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 900 XU/kg de ração, ade-quadamente, mais que cerca de 1.000 XU/kg de ração.

[000125] Em uma modalidade, a xilanase está presente na ração a menos que cerca de 16.000 XU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 8.000 XU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 7.000 XU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 6.000 XU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 5.000 XU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 4.000 XU/kg de ração.

[000126] De preferência, a xilanase está presente na composição de aditivo de ração em uma faixa de cerca de 100 XU/g a cerca de 320.000 XU/g de composição, com mais preferência, cerca de 300 XU/g de composição a cerca de 160.000 XU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 500 XU/g de composição a cerca de 50.000 XU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 500 XU/g de composição a cerca de 40.000 XU/g de composição.

[000127] Em uma modalidade, a xilanase está presente na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 100 XU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 200 XU/g de composição, ade- quadamente, mais que cerca de 300 XU/g de composição, adequada-mente, mais que cerca de 400 XU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 500 XU/g de composição.

[000128] Em uma modalidade, a xilanase está presente na composição de aditivo de ração a menos que cerca de 320.000 XU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 160.000 XU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 50.000 XU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 40.000 XU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 30.000 XU/g de com posição.

[000129] Será compreendido que uma unidade de xilanase (XU) é a quantidade de enzima que libera 0,5 pmol de equivalentes de açúcar redutor (como xilose pelo teste de ácido dinitrossalicílico (DNS) - método do açúcar redutor) a partir de um substrato de aveia-trigo espelta- xilano por minuto em pH 5,3 e 50°C. (Bailey, M.J. Biely, P. e Poutanen, K., Journal of Biotechnology, Volume 23, (3), maio de 1992, 257-270).

[000130] Em uma modalidade, adequadamente, a enzima é classificada usando a classificação EC acima, e a classificação EC designa uma enzima que tem esta atividade quando testada no ensaio ensinado aqui para determinar 1 XU.

Amilase

[000131] Amilase é o nome dado a uma classe de enzimas capazes de hidrolisante amido em oligossacarídeos de cadeia mais curta como maltose. A porção glicose pode ser então mais facilmente transferida da maltose para um monoglicerídeo ou glicosil monoglicerídeo do que da molécula de amido original.

[000132] O termo amilase inclui a-amilases (E.C. 3.2.1.1), amilases formadoras de G4 (E.C. 3.2.1.60), β-amilases (E.C. 3.2.1.2) e y- amilases (E.C. 3.2.1.3).

[000133] Em uma modalidade, de preferência, a amilase é uma a- amilase. As α-amilases são classificadas como (E.C. 3.2.1.1).

[000134] Elas podem incluir amilases de origem bacteriana ou fúngica, e mutantes quimicamente modificados ou obtidos mediante engenharia de proteínas estão incluídos.

[000135] Em uma modalidade, de preferência, a amilase pode ser uma amilase, por exemplo, uma a-amilase de Bacillus licheniformis e/ou uma amilase, por exemplo, uma α-amilase de Bacillus amylolique- faciens.

[000136] Em uma modalidade, a a-amilase pode ser a a-amilase em Axtra XAP® ou Avizyme 1502®, ambos produtos disponíveis comercialmente junto à Danisco A/S.

[000137] Em outra modalidade, a amilase pode ser uma a-amilase resistente à pepsina, como uma alfa amilase de Trichoderma (como Trichoderma reesei) resistente à pepsina. Uma a-amilase adequada-mente resistente à pepsina é ensinada no pedido UK número 1011513.7 (que está aqui incorporado, por referência) e PCT/IB2011/053018 (que está aqui incorporado, por referência).

[000138] Em uma modalidade, a amilase pode ser uma a-amilase resistente à pepsina que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos: i) apresentada na SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3; ii) apresentada na SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3 exceto por uma ou várias adições/inserções, deleções ou substituições de aminoácidos; iii) que tem pelo menos 85% (de preferência, pelo menos 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID NO. 1 ou ao menos 70% (de preferência, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID NO. 3; iv) que é produzida pela expressão de uma sequência de nucleotideos que compreende a sequência da SEQ ID NO. 2 ou da SEQ ID NO. 4; v) que é produzida pela expressão de uma sequência de nucleotídeos que difere da SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4 devido à degeneração do código genético; vi) que é produzida pela expressão de uma sequência de nucleotídeos que difere da SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4 por uma ou várias adições/inserções, deleções ou substituições de nucleotídeos; ou vii) que é produzida pela expressão de uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% (de preferência, pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%) de identidade com a SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4.

[000139] A alfa amilase resistente à pepsina pode, também, ser codi-ficada por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4 sob condições estringentes ou altamente es- tringentes.

[000140] Em uma modalidade preferencial, a amilase para uso na presente invenção pode ser uma ou mais das amilases em um ou mais dos produtos comerciais abaixo: Produto comercial® Empresa Tipo de amilase Fonte de amilase

[000141] Em uma modalidade, a amilase pode ser uma alfa-amilase maltogênica de Bacillus (consulte EP 120 693). Esta amilase está dis-ponível para comercialização sob o nome comercial de Novamyl™ (Novo Nordisk A/S, Dinamarca). Novamyl é descrito em detalhes na publicação de patente internacional WO 91/104669.

[000142] De preferência, a amilase está presente na ração em uma faixa de cerca de 50 All/kg a cerca de 10.000 AU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 70 AU/kg de ração a cerca de 7.500 AU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 70 AU/kg de ração a cerca de 5.000 AU/kg de ração e com mais preferência ainda cerca de 100 AU/kg de ração a cerca de 2.000 AU/kg de ração.

[000143] Em uma modalidade, a amilase está presente na ração a mais que cerca de 50 AU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 60 AU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 70 AU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 80 AU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 90 AU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 100 AU/kg de ração.

[000144] Em uma modalidade, a amilase está presente na ração a menos que cerca de 10.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 8.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 7.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 5.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 4.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 3.000 AU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 2.000 AU/kg de ração.

[000145] De preferência, a amilase está presente na composição de aditivo de ração em uma faixa de cerca de 10 AU/kg a cerca de 200.000 AU/g de composição, com mais preferência, cerca de 30 AU/g de composição a cerca de 100.000 AU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 40 AU/g de composição a cerca de 50.000 AU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 50 AU/g de composição a cerca de 20.000 AU/g de composição.

[000146] Em uma modalidade, a amilase está presente na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 10 AU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 20 AU/g de composição, adequa-damente, mais que cerca de 30 AU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 40 AU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 50 AU/g de composição.

[000147] Em uma modalidade, a amilase está presente na composição de aditivo de ração a menos que cerca de 200.000 AU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 100.000 AU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 50.000 AU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 40.000 AU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 30.000 AU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 20.000 AU/g de com posição.

[000148] Será entendido que uma unidade de amilase (AU) é a quantidade de enzima que libera 1 mmol de ligações glicosídicas de um substrato polimérico de amido reticulado insolúvel em água por minuto em pH 6,5 e 37°C (isto pode ser chamado aqui como o ensaio para determinar 1 AU).

[000149] 1 TAU (atividade de α-amilase) é a quantidade de enzima necessária para liberar (na presença de α-glicosidase em excesso) 0,20 pmol de ligações glicosídicas (expressa como equivalentes de p- nitrofenol) de um substrato de malto heptaosídeo por minuto em pH 8,0 e 40 °C. Isto pode ser chamado aqui de o ensaio para determinar 1 unidade TAU.

[000150] Em uma modalidade, adequadamente, a enzima é classificada usando a classificação EC acima, e a classificação EC designa uma enzima que tem esta atividade quando testada no ensaio ensinado aqui para determinar 1 AU.

Protease

[000151] O termo protease, como usado aqui, é sinônimo de peptidase ou proteinase.

[000152] A protease para uso na presente invenção pode ser uma subtilisina (E.C. 3.4.21.62) ou uma bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) ou uma protease de serina alcalina (E.C. 3.4.21.x) ou uma queratinase (E.C. 3.4.X.X).

[000153] De preferência, a protease de acordo com a presente invenção é uma subtilisina.

[000154] As proteases adequadas incluem aquelas de origem animal, vegetal ou microbiana. Mutantes obtidos mediante engenharia de proteínas ou quimicamente modificados também são adequados. A protease pode ser uma protease de serina ou uma metaloprotease, por exemplo, uma protease microbiana alcalina ou protease semelhante a tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são as subtilisinas, es-pecialmente aquelas derivadas de Bacillus sp., por exemplo, a subtilisina Novo, a subtilisina Carlsberg, a subtilisina 309 (consulte, por exemplo, a patente US n° 6.287.841), a subtilisina 147, e a subtilisina 168 (consulte, por exemplo, WO 89/06279). Exemplos de proteases semelhantes a tripsina são tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina), e Fusarium proteases (consulte, por exemplo, WO 89/06270 e WO 94/25583). Exemplos de proteases úteis incluem, mas não se limi-tam a, as variantes descritas nos WO 92/19729 e WO 98/20115.

[000155] Em uma modalidade preferencial, a protease para uso na presente invenção pode ser uma ou mais das proteases em um ou mais dos produtos comerciais abaixo:

[000156] Em uma modalidade, a protease pode ser uma protease de B. subtilis.

[000157] Em uma modalidade, a protease pode ser uma Nocardio- psis protease disponível junto à Novozymes A/S.

[000158] De preferência, a protease está presente na ração em uma faixa de cerca de 1.000 U/kg a cerca de 20.000 Pll/kg de ração, com mais preferência, cerca de 1.500 PU/kg de ração a cerca de 10.000 PU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 2.000 PU/kg de ração a cerca de 6.000 PU/kg de ração.

[000159] Em uma modalidade, a protease está presente na ração a mais que cerca de 1.000 PU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 1.500 PU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 2.000 PU/kg de ração.

[000160] Em uma modalidade, a protease está presente na ração a menos que cerca de 20.000 PU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 10.000 PU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 7.000 PU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 6.000 PU/kg de ração.

[000161] De preferência, a protease está presente na composição de aditivo de ração em uma faixa de cerca de 200 PU/g a cerca de 400.000 PU/g de composição, com mais preferência, cerca de 300 PU/g de composição a cerca de 200.000 PU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 5.000 PU/g de composição a cerca de 100.000 PU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 700PU/g de composição a cerca de 70.000 PU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 1.000 PU/g de composição a cerca de 60.000 PU/g de composição.

[000162] Em uma modalidade, a protease está presente na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 200 PU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 300 PU/g de composição, ade-quadamente, mais que cerca de 400 PU/g de composição, adequada-mente, mais que cerca de 500 PU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 750 PU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 1.000 PU/g de composição.

[000163] Em uma modalidade, a protease está presente na composição de aditivo de ração a menos que cerca de 400.000 PU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 200.000 PU/g de composição, adequadamente, menos que cerca de 100.000 PU/g de com- posição, adequadamente, menos que cerca de 80.000 PU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 70.000 PU/g de com-posição, adequadamente, menos que cerca de 60.000PU/g de compo-sição.

[000164] Será entendido que uma unidade de protease (PU) é a quantidade de enzima que libera do substrato (solução de caseína a 0,6%) um micrograma de composto fenólico (expresso como equiva-lentes de tirosina) em um minuto em pH 7,5 (tampão de Na2PO4 40mM/ácido lático) e 40°C. Isto pode ser chamado de ensaio para de-terminar 1 PU.

[000165] Em uma modalidade, adequadamente, a enzima é classificada usando a classificação EC acima, e a classificação EC designa uma enzima que tem esta atividade quando testada no ensaio ensinado aqui para determinar 1 PU.

Fitase

[000166] A fitase para uso na presente invenção pode ser classificada como uma 6-fitase (classificada como 3.1.3.26) ou uma 3-fitase (classificada como E.C. 3.1.3.8).

[000167] Em uma modalidade, a fitase pode ser uma 6-fitase (E.C. 3.1.3.26).

[000168] Em uma modalidade preferencial, a fitase para uso na presente invenção pode ser uma ou mais das fitases em um ou mais dos produtos comerciais abaixo:

[000169] O termo gene consenso, como usado aqui, significa que o vetor de DNA usado para transformar o organismo contém um gene de fitase sintético com base em uma sequência consenso, um gene URA da levedura não patogênica Saccharomyces cerevisiae e a origem de replicação do plasmídio pBR322 de Escherichia coli.

[000170] Em uma modalidade, a fitase é uma fitase de Citrobacter derivada, por exemplo, de Citrobacter freundii, de preferência, C. freundii NCIMB 41247 e suas variantes, por exemplo, conforme apresentado nos W02006/038062 (aqui incorporado, a título de referência) e W02006/038128 (aqui incorporado, a título de referência), Citrobacter braakii YH-15 conforme apresentado no WO 2004/085638, Citrobacter braakii ATCC 51113 conforme apresentado no W02006/037328 (aqui incorporado, a título de referência), assim como suas variantes, por exemplo, conforme apresentado nos W02007/112739 (aqui incorporado, a título de referência) e WO2011/117396 (aqui incorporado, a título de referência), Citrobacter amalonaticus, de preferência, Citrobacter amalonaticus ATCC 25405 ou Citrobacter amalonaticus ATCC 25407 conforme apresentado em W02006037327 (aqui incorporado, a título de referência), Citrobacter gillenii, de preferência, Citrobacter gillenii DSM 13694 conforme apresentado em W02006037327 (aqui incorporado, a título de referência), ou polipeptídeos das espécies Citrobacter intermedius, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedla- kii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae, Citrobacter ou suas variantes.

[000171] Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Citrobacter, por exemplo, de Citrobacter freundii, como a(s) enzima(s) fitase ensinada(s) no W02006/038128, cuja referência está aqui incorporada, a título de referência.

[000172] Em modalidades preferenciais, a fitase é, de preferência, a fitase de E. coli comercializada sob o nome Phyzyme XP™ pela Danisco A/S.

[000173] Alternativamente, a fitase pode ser uma fitase de Buttiau- xella, por exemplo, uma fitase de Buttiauxella agrestis, por exemplo, as enzimas fitase ensinadas nos WO 2006/043178, WO 2008/097619, W02009/129489, W02008/092901, PCT/US2009/41011 ou PCT/IB2010/051804, todos os quais estão aqui incorporados a título de referência.

[000174] Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Hafnia, por exemplo, de Hafnia alvei, como a(s) enzima(s) fitase ensinada^) na US2008263688, cuja referência está aqui incorporada, a título de referência.

[000175] Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de As- pergillus, por exemplo, de Apergillus orzyae.

[000176] Em uma modalidade, a fitase pode ser uma fitase de Peni- cillium, por exemplo, de Penicillium funiculosum.

[000177] De preferência, a fitase está presente na ração em uma faixa de cerca de 200 FTU/kg a cerca de 1.000 FTU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 300 FTU/kg de ração a cerca de 750 FTU/kg de ração, com mais preferência, cerca de 400 FTU/kg de ração a cerca de 500 FTU/kg de ração.

[000178] Em uma modalidade, a fitase está presente na ração a mais que cerca de 200 FTU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 300 FTU/kg de ração, adequadamente, mais que cerca de 400 FTU/kg de ração.

[000179] Em uma modalidade, a fitase está presente na ração a menos que cerca de 1.000 FTU/kg de ração, adequadamente, menos que cerca de 750 FTU/kg de ração.

[000180] De preferência, a fitase está presente na composição de aditivo de ração em uma faixa de cerca de 40 FTU/g a cerca de 40.000 FTU/g de composição, com mais preferência, cerca de 80 FTU/g de composição a cerca de 20.000 FTU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 100 FTU/g de composição a cerca de 10.000 FTU/g de composição, e com mais preferência ainda cerca de 200 FTU/g de composição a cerca de 10.000 FTU/g de composição.

[000181] Em uma modalidade, a fitase está presente na composição de aditivo de ração a mais que cerca de 40 FTU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 60 FTU/g de composição, ade-quadamente, mais que cerca de 100 FTU/g de composição, adequa-damente, mais que cerca de 150 FTU/g de composição, adequadamente, mais que cerca de 200 FTU/g de composição.

[000182] Em uma modalidade, a fitase está presente na composição de aditivo de ração a menos que cerca de 40.000 FTU/g de composi- ção, adequadamente, menos que cerca de 20.000 FTU/g de composi-ção, adequadamente, menos que cerca de 15.000 FTU/g de composi-ção, adequadamente, menos que cerca de 10.000 FTU/g de composi ção.

[000183] Será compreendido que, para uso na presente invenção, 1 FTU (unidade de fitase) é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 pmol de ortofosfato inorgânico a partir de um substrato em um minuto sob as condições de reação definidas no ensaio de fitase ISO 2009 - Um ensaio padrão para determinar a atividade de fitase e 1 FTU pode ser encontrado em International Standard ISO/DIS 30024:1-17, 2009.

[000184] Em uma modalidade, adequadamente, a enzima é classificada usando a classificação EC acima, e a classificação EC designa uma enzima que tem esta atividade quando testada no ensaio ensinado aqui para determinar 1 FTU.

Vantagens

[000185] A interação entre os DFMs e as enzimas é complicada e sem se ater à teoria, é muito surpreendente que possamos ver um aprimoramento na resistência do indivíduo à enterite necrótica, por exemplo, que nós vejamos uma redução nos escores da lesão, por exemplo. Antes da presente invenção, a combinação entre DFMs e enzimas (por exemplo, conforme ensinado aqui) não havia sido ensinada para este propósito específico.

[000186] Uma vantagem da presente invenção é que a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode evitar os efeitos negativos da enterite necrótica ou pode ser usada para melhorar a resistência do indivíduo à enterite necrótica.

[000187] Sem se ater à teoria, a fitase catalisa a hidrólise sequencial de fitato, a principal forma de armazenamento de fósforo nos cereais e legumes, para derivados de mio-inositol menos fosforilados com a libe- ração concomitante de fosfato inorgânico. A hidrólise do fitato causa uma redução das perdas endógenas de aminoácidos para o lúmen intestinal. Uma redução das perdas de aminoácidos endógenos no intestino reduz a disponibilidade de nitrogênio para a multiplicação de bactérias, o que ajuda a atividade dos DFMs na inibição de C. perfringens e outras bactérias patogênicas.

[000188] Sem se ater à teoria, as proteases causam hidrólise ines- pecífica da proteína da dieta, gerando uma variedade de polipeptídeos no lúmen intestinal. Os animais finalizam a hidrólise das proteínas e absorvem os aminoácidos. Entretanto, no caso de desafios patogênicos entéricos, bactérias patogênicas podem tirar vantagem da maior disponibilidade de peptídeos no lúmen do jejuno e íleo. Os DFMs inibem o crescimento de enteropatógenos, por exemplo, por competir por fontes de N, assim como por inibição direta.

[000189] Além disso, a xilanase degrada o polissacarídeo linear be- ta-1,4-xilano em xilose. Sem se ater à teoria, os inventores da presente invenção mostraram que o aumento da digestibilidade de energia com a combinação de DFMs e enzimas não é explicada pelo amido, gordura ou proteína, portanto, deve ser explicada por polissacarídeos não amido.

[000190] A atividade da amilase hidrolisa ligações alfa de polissacarídeos alfa-ligados grandes, como amido, gerando dextrinas e oligos- sacarídeos, que são absorvidos principalmente no intestino delgado após hidrólise em maltose e glicose na parede do trato gastrointestinal. Surpreendentemente, a rápida hidrólise do amido no trato digestivo superior e a maior absorção de glicose no duodeno depriva as bactérias patogênicas de uma importante fonte de energia (glicose) no jejuno e no íleo, o que melhora a atividade do DFM por causa de uma vantagem competitiva contra patógenos que não podem usar pentoses tão eficazmente.

[000191] Em combinação, as quatro enzimas e DFMs fornecem sur-preendentemente um aprimoramento significativo sobre a redução de patógenos e/ou resistência à enterite necrótica em comparação a outro DFM e combinações de enzimas e/ou DFMs sozinhos e/ou enzima(s) sozinha(s).

[000192] A combinação específica de DFMs e enzimas aqui ensinada pode levar, vantajosamente, a uma redução na secreção de muci- na. Sem se ater à teoria, esta secreção de mucina reduzida pode resultar em uma redução das perdas de aminoácidos endógenos e/ou pode ser responsável por um desempenho aprimorado. A combinação específica de DFMs e enzimas aqui ensinada pode reduzir vantajosamente a inflamação no íleo. Isto pode ser visto pela regulação negativa da expressão de IFR-g no íleo. Os inventores mostraram que a modulação da resposta imune pode otimizar o desempenho.

Formulação do DFM com as enzimas

[000193] O DFM e as enzimas podem ser formulados de qualquer forma adequada para garantir que a formulação compreenda DFMs viáveis e enzimas ativas.

[000194] Em uma modalidade, o DFM e as enzimas podem ser for-mulados como um líquido, um pó seco ou um grânulo.

[000195] O pó seco ou grânulos podem ser preparados através de meios conhecidos pelos versados na técnica, como em um dispositivo de aplicação de revestimento de leito fluidizado de pulverização superior, em um Wurster de pulverização inferior por granulação de tambor (por exemplo, granulação de alto cisalhamento), extrusão, revestimento em tambor ou em um misturador de microingredientes.

[000196] Para algumas modalidades, o DFM e/ou a(s) enzima(s) podem ser revestidos, por exemplo, encapsulados. Adequadamente, o DFM e enzimas podem ser formulados dentro do mesmo revestimento ou podem ser encapsulados dentro da mesma cápsula. Alternativamente, uma ou duas ou três ou quatro das enzimas podem ser formuladas dentro do mesmo revestimento ou podem ser encapsuladas dentro da mesma cápsula e o DFM poderia ser formulado em um revestimento separado da uma ou mais ou todas as enzimas. Em algumas modalidades, tal como quando o DFM é capaz de produzir endóspo- ros, o DFM pode ser fornecido sem nenhum revestimento. Em tais circunstâncias, os endósporos do DFM podem ser simplesmente misturados com uma ou duas ou três ou quatro enzimas. No último caso, as enzimas podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas, por exemplo, uma ou mais ou todas as enzimas podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas. As enzimas podem ser encapsuladas como misturas (isto é, compreendendo uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou todas) das enzimas ou elas podem ser encapsuladas separadamente, por exemplo, como enzimas individuais. Em uma modalidade preferencial, todas as quatro enzimas podem ser revestidas, por exemplo, encapsuladas, juntas.

[000197] Em uma modalidade, o revestimento protege as enzimas do calor e pode ser considerado um protetor térmico.

[000198] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração é formulada para um pó seco ou grânulos, conforme descrito no W02007/044968 (chamada de grânulos TPT) ou WO1997/016076 ou WO1992/012645 (cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência).

[000199] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada como um grânulo para composições de ração que compreendem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revesti-mento, o agente ativo do grânulo retendo pelo menos 50% de atividade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após condições selecionadas a partir de uma ou mais de a) um processo de peletização de ração, b) um processo de pré-tratamento da ração aquecida com vapor d'água, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada, e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura-base de ração ou uma pré-mistura de ração que compreende pelo menos um composto selecionado a partir de minerais traço, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina, e compostos que resultam em uma mistura-base de ração ou pré- mistura de ração ácida ou básica.

[000200] Com relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material de hidratação por umidade que constitui pelo menos 55% p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento pode compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento de hidratação com umidade e um revestimento de barreira à umidade. Em algumas modalidades, o revestimento de hidratação com umidade pode representar entre 25% e 60% p/p do grânulo e o revestimento de barreira à umidade pode representar entre 2% e 15% p/p do grânulo. O revestimento de hidratação com umidade pode ser selecionado a partir de sais inorgânicos, sacarose, amido, e maltodextrina e o revestimento de barreira à umidade pode ser seleci-onado a partir de polímeros, gomas, soro de leite e amido.

[000201] O grânulo pode ser produzido usando um processo de pele-tização de ração e o processo de pré-tratamento da ração pode ser conduzido entre 70°C e 95°C por até vários minutos, como entre 85°C e 95°C.

[000202] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada em um grânulo para ração animal que compreende: um núcleo; um agente ativo, o agente ativo do grânulo retendo pelo menos 80% de atividade após armazenamento e após um processo de peletização aquecido com vapor d'água onde o grânulo é um ingredi ente; um revestimento de barreira à umidade; e um revestimento de hidratação com umidade que representa pelo menos 25% p/p do grânulo, o grânulo tendo uma atividade de água menor que 0,5 antes do processo de peletização aquecido com vapor d'água.

[000203] O grânulo pode ter um revestimento de barreira à umidade selecionado a partir de polímeros e gomas e o material de hidratação por umidade pode ser um sal inorgânico. O revestimento de hidratação com umidade pode representar entre 25% e 45% p/p do grânulo e o revestimento de barreira à umidade pode representar entre 2% e 10% p/p do grânulo.

[000204] O grânulo pode ser produzido usando um processo de pele-tização aquecido com vapor d água que pode ser conduzido entre 85°C e 95°C por até vários minutos.

[000205] Em algumas modalidades, o DFM (por exemplo, endóspo- ros de DFM) pode ser diluído usando um diluente, como pó de amido, calcário ou similares.

[000206] Em uma modalidade, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, de preferência, tal líquido para consumo contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[000207] Em outra modalidade, a composição de aditivo de ração pode ser formulada pela aplicação, por exemplo, aspersão, da(s) en- zima(s) sobre um substrato carreador, como trigo triturado, por exemplo.

[000208] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser formulada como uma pré- mistura. Apenas a título de exemplo, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[000209] Em uma modalidade, o DFM e/ou as enzimas para uso na presente invenção são formulados com pelo menos um veículo fisiolo- gicamente aceitável selecionado a partir de ao menos um dentre mal-todextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarose, propileno glicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, nitrato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formiato e misturas dos mesmos.

Embalagem

[000210] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais de acordo com a presente invenção é embalada.

[000211] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais é embalada em um saco, como um saco de papel.

[000212] Em uma modalidade alternativa, a composição de aditivo de ração e/ou pré-mistura e/ou ração ou comida para animais pode ser lacrada em um recipiente. Qualquer recipiente adequado pode ser usado.

Ração

[000213] A composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada como - ou na preparação de - uma ração.

[000214] O termo "ração" é usado como sinônimo de "comida para animais".

[000215] A ração pode estar sob a forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou modo de aplicação e/ou modo de administração.

[000216] Quando usada como - ou na preparação de - uma ração - como uma ração funcional - a composição da presente invenção pode ser usada em conjunto com um ou mais de: um veículo nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nutricionalmente ativo.

[000217] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com um componente de ração para formar uma ração.

[000218] O termo "componente de ração" para uso na presente invenção, significa a totalidade ou parte da ração. Parte da ração pode significar um constituinte da ração ou mais do que um constituinte da ração, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma modalidade, o termo "componente de ração" abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré- mistura.

[000219] De preferência, a alimentação pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma ração composta, ou uma pré-mistura da mesma. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma ração composta, um componente de alimentação composto ou a uma pré- mistura de uma ração composta ou a uma forragem, componente de forragem, ou uma pré-mistura de uma forragem.

[000220] O termo forragem, para uso na presente invenção, significa qualquer alimento que seja fornecida a um animal (ao invés de o animal ter que buscar a comida sozinho). A forragem abrange plantas que foram cortadas.

[000221] O termo forragem inclui feno, palha, silagem, rações com-pactadas e peletizadas, óleos e rações misturadas e também grãos germinados e legumes.

[000222] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas a partir de: alfalfa (luzerna), cevada, comichão, brassicas, Chau moellier, couve, colza (canola), rutabaga (couve nabo da suécia), nabo, trevo, trevo híbrido, cravo vermelho, trevo subterrâneo, trevo branco, grama, balanquinho, festuca, gramíneas do grupo Bermuda, brome, grama comum, gramas de campinas (de relvados de pastos naturalmente misturados, capim dos pomares, grama de centeio, grama Timothy, milho (mais), painço, aveias, sorgo, feijões soja, árvores (brotos de árvore de poda para feno), trigo, e legumes.

[000223] O termo "ração composta" significa uma ração comercial sob a forma de uma farinha, um pélete, anéis, bolo ou um farelo. As rações compostas podem ser misturadas a partir de várias matérias primas e aditivos. Estas misturas são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.

[000224] As rações compostas podem ser rações completas que for-necem todos os nutrientes necessários diariamente, concentrados que fornecem uma parte da porção (proteína, energia) ou suplementos que fornecem apenas micronutrientes adicionais, como minerais e vitaminas.

[000225] Os ingredientes principais usados na ração composta são os grãos de ração, que incluem milho, feijões soja, sorgo, aveia e cevada.

[000226] Adequadamente, uma pré-mistura, conforme chamado aqui, pode ser uma composição composta por microingredientes como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermentação, e outros ingredientes essenciais. As pré-misturas são, geralmente, composições adequadas para misturar em rações comer-ciais.

[000227] Qualquer ração da presente invenção pode compreender um ou mais materiais de ração selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes, como milho ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de glúten de milho, solúveis de grão seco de destilaria (DDGS), fibra de trigo, farelo de trigo, cortes de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma, e polpa de frutas cítricas; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, favas, algodão, canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[000228] Uma ração da presente invenção pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou ao menos 60%, em peso de milho e farelo de feijão soja ou milho e soja integral, ou farelo de trigo ou farelo de girassol.

[000229] Além disso ou alternativamente, uma ração da presente in-venção pode compreender pelo menos um material de ração com alto teor de fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de ração com alto teor de fibras para fornecer uma ração com alto teor de fibras. Exemplos de materiais de ração com alto teor de fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, como farinha de glúten de milho, solúveis de grão seco de destilaria (DDGS), fibra de trigo, farelo de trigo, cortes de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, caroço de palma, e polpa de frutas cítricas. Algumas fontes de proteína podem, também, ser consideradas como tendo alto teor de fibras: proteína obtida a partir de fontes como girassol, tremoço, favas e algodão.

[000230] Na presente invenção, a ração pode ser uma ou mais das seguintes: uma ração composta e pré-mistura, incluindo péletes, anéis ou bolo (bovino); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, feijões soja, sorgo, aveia, cevada, forragem de milho, copra, palha, moinha, desejo de beterraba açucareira; farinha de peixe; grama cortada fresca e outras plantas de forragem; farinha de carne e ossos; melado; resíduo sólido de oleaginosas e torta prensada; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas: feno e silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[000231] O termo ração na presente invenção também abrange, em algumas modalidades, alimento para animais de estimação. Um alimento para animais de estimação é um material vegetal ou animal destinado ao consumo por animais de estimação, como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento para animais de estimação, como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, tal como em pedaços para cães, ou sob uma forma úmida em lata. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[000232] O termo ração na presente invenção também abrange, em algumas modalidades, alimento para peixes. Um alimento para peixes contém, normalmente, os macronutrientes, elementos traço e vitaminas necessárias para manter os peixes em cativeiro em boa saúde. O alimento para peixes pode estar sob a forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais afundam rapi-damente, são frequentemente usadas para peixes maiores ou espécie com alimentação de fundo. Alguns alimentos para peixe também contêm aditivos, como beta caroteno ou hormônios sexuais, para melhorar artificialmente a cor do peixe ornamental.

[000233] O termo ração na presente invenção também abrange, em algumas modalidades, alimento para pássaros. O alimento para pássaros inclui o alimento que é usado em alimentadores para pássaros e para alimentar aves de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compreende uma variedade de sementes, mas podem, também, abranger sebo (gordura de carne bovina ou de carneiro).

[000234] Para uso na presente invenção, o termo "colocar em contato" se refere à aplicação indireta ou direta da composição da presente invenção ao produto (por exemplo, a ração). Exemplos dos métodos de aplicação que podem ser usados, incluem, mas não se limitam a, o tratamento do produto em um material que compreende a composição de aditivo de ração, a aplicação direta por mistura da composição de aditivo de ração com o produto, aspersão da composição de aditivo de ração sobre a superfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de aditivo de ração.

[000235] Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração da presente invenção é, de preferência, misturada com o produto (por exemplo, ração). Alternativamente, a composição de aditivo de ração pode estar incluída na emulsão ou ingredientes em bruto de uma ração.

[000236] Para algumas aplicações, é importante que a composição seja disponibilizada sobre ou na superfície de um produto a ser afeta- do/tratada. Isto permite que a composição confira uma ou mais das seguintes características favoráveis: benefícios de desempenho.

[000237] As composições de aditivo de ração da presente invenção podem ser aplicadas para entremear, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, ração ou ingredientes em bruto de uma ração) com uma quantidade controlada de DFM e enzimas.

[000238] O DFM e as enzimas podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando eles estão em mistura juntos ou até mesmo quando eles são liberados por diferentes vias) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser liberados por diferentes vias). Em uma modalidade, de preferência, o DFM e as enzimas são aplicados simultaneamente. De preferência, o DFM e as enzimas são misturados antes de serem liberados a uma ração ou a um ingrediente em bruto de uma ração.

[000239] O DFM nas composições de aditivo de ração de acordo com a presente invenção - pode ser adicionado em concentrações adequadas - como, por exemplo, em concentrações no produto de ração final que oferecem uma dose diária entre cerca de 2x105 UFC a cerca de 2x1011 UFC, adequadamente, entre cerca de 2x106 a cerca de 1x1010, adequadamente, entre cerca de 3.75x107 UFC a cerca de 1x1O10 UFC.

[000240] De preferência, a composição de aditivo de ração da presente invenção será termicamente estável ao tratamento com calor até cerca de 70 °C; até cerca de 85°C; ou até cerca de 95°C. O tratamento com calor pode ser feito por até cerca de 1 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minutos. O termo termicamente estável significa que ao menos cerca de 75% dos componentes enzimáticos e/ou DFM que estavam pre- sentes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura es-pecificada ainda estão presentes/ativos após ele resfriar para a tempe-ratura ambiente. De preferência, ao menos cerca de 80% dos compo-nentes enzimáticos e/ou DFM que estavam presentes e ativos no aditivo antes do aquecer até a temperatura especificada ainda estão presentes e ativos após ele resfriar para a temperatura ambiente.

[000241] Em uma modalidade particularmente preferencial, a composição de aditivo de ração é homogeneizada para produzir um pó.

[000242] Em uma modalidade preferencial alternativa, a composição de aditivo de ração é formulada como grânulos, conforme descrito no W02007/044968 (chamados de grânulos de TPT) aqui incorporado, a título de referência.

[000243] Em uma outra modalidade preferencial, quando a composição de aditivo de ração é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado aplicado como revestimento sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento salino é a tolerância térmica aprimorada, estabilidade em armazenamento aprimorada e proteção contra outros aditivos de ração que possuem de outro modo efeitos adversos sobre a enzima e/ou DFM.

[000244] De preferência, o sal usado para o revestimento salino tem uma atividade de água maior que 0,25 ou umidade constante maior que 60 % a 20 °C.

[000245] De preferência, o revestimento salino compreende Na2SO4.

[000246] O método para preparar uma composição de aditivo de ração pode compreender também a etapa adicional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultante são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.

[000247] Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tra-tamento com vapor d'água, ou uma estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura compreendendo o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de vapor d'água. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especificada, tal como a partir de 60 a 100°C, as temperaturas típicas seriam de 70°C, 80°C, 85°C, 90°C ou 95°C. O tempo de permanência pode ser variável de segundos a minutos e até mesmo horas. Como, por exemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora.

[000248] Será compreendido que a composição de aditivo de ração da presente invenção é adequada para adição a qualquer material de ração adequado.

[000249] Como usado aqui, o termo material de ração se refere ao material básico da ração que será consumido por um animal. Será ainda compreendido que ele pode compreender, por exemplo, pelo menos um ou mais grãos não processados, e/ou material vegetal e/ou animal processado, como farelo de feijão soja ou farinha de ossos.

[000250] Como usado aqui, o termo "ração" se refere a um material de ração ao qual uma ou mais composições de aditivo de ração foram adicionadas.

[000251] Será compreendido pelo versado na técnica que diferentes animais exigem diferente rações, e até o mesmo animal pode exigir rações diferente, dependendo do propósito para o qual o animal é criado.

[000252] De preferência, a ração pode compreender materiais de ração que compreendem milho ou milho, trigo, cevada, triticale, centeio, arroz, tapioca, sorgo, e/ou quaisquer dos subprodutos, assim como componentes ricos em proteínas como farelo de feijão soja, farelo de semente de colza, farelo de canola, farelo de caroço de algodão, farelo de semente de girassol, farelos de subprodutos animais e misturas dos mesmos. Com mais preferência, a ração pode compreender gorduras animais e/ou óleos vegetais.

[000253] Opcionalmente, a ração pode conter, também, minerais adicionais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais.

[000254] De preferência, a ração é uma mistura de farelo de feijão soja e milho.

[000255] Em uma modalidade, de preferência, a ração não é alimento para animais de estimação.

[000256] Em outro aspecto, é apresentado um método para produzir uma ração. A ração é produzida, tipicamente, em moinhos para ração nos quais as matérias primas são primeiro trituradas até um tamanho de partícula adequado e, então, são misturadas com aditivos adequados. A ração pode, então, ser produzida como uma massa ou como péletes; este último envolve, tipicamente, um método pelo qual a temperatura é aumentada para um nível alvo e, então, a ração é passada através de uma matriz para produzir péletes de um tamanho particular. Os péletes são resfriados naturalmente. Subsequentemente, aditivos líquidos como gordura e enzima podem ser adicionados. A produção de ração pode, também, envolver uma etapa adicional que inclui ex- trusão ou expansão antes da peletização - em particular, por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor d'água.

[000257] A ração pode ser uma ração para um animal monogástrico, como aves domésticas (por exemplo, frango para alimentação, poedeira, melhoristas de frangos, peru, pato, ganso, aves aquáticas), suínos (todas as categorias de idade), um animal de estimação (por exemplo, cães, gatos) ou peixe, de preferência, a ração é para aves domésticas.

[000258] Em uma modalidade, a ração não é para uma poedeira.

[000259] Apenas a título de exemplo, uma ração para galinhas, por exemplo, galinhas destinadas à alimentação, pode compreender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo:

[000260] Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para galinhas, como galinhas destinadas a alimentação pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:

[000261] Apenas a título de exemplo, uma ração para galinhas poe- deiras pode compreender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo:

[000262] Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para galinhas poedeiras pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:

[000263] Apenas a título de exemplo, uma ração para perus pode compreender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo:

[000264] Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para perus pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:

[000265] Apenas a título de exemp o, uma ração para leitões pode compreender um ou mais dos ingredientes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo:

[000266] Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para leitões pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:

[000267] Apenas a título de exemplo, uma ração para suínos em crescimento/terminação pode compreender um ou mais dos ingredien- tes mencionados na tabela abaixo, por exemplo, nas porcentagens dadas na tabela abaixo:

[000268] Apenas a título de exemplo, a especificação da dieta para suínos em crescimento/terminação pode ser conforme estipulado na tabela abaixo:

[000269] A composição de aditivo de ração da presente invenção e outros componentes e/ou a ração compreendendo a mesma podem ser usados sob qualquer forma adequada.

[000270] A composição de aditivo de ração da presente invenção pode ser usada sob a forma de preparações sólidas ou líquidas ou alternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pílulas grandes, cápsulas, péletes, comprimidos, poeiras, e grânulos que podem ser molháveis, secados por atomização ou secados por congelamento. Exemplos de preparações líquidas incluem, mas não se limitam a, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquoso-orgânicas.

[000271] Em algumas aplicações, o DFM ou as composições de aditivo de ração da presente invenção podem ser misturados com ração ou administrados na água potável. Em uma modalidade, a faixa de dosagem para inclusão na água é cerca de 1x103 UFC/animal/dia a cerca de 1x101° UFC/animal/dia, e com mais preferência, cerca de 1x107 UFC/animal/dia.

[000272] Exemplos adequados de formas incluem um ou mais de: pós, pastas, pílulas grandes, péletes, comprimidos, pílulas, cápsulas, óvulos, soluções ou suspensões, que podem conter agentes flavori- zantes ou corantes, para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada.

[000273] A título de exemplo, se a composição da presente invenção for usada em um sólido, por exemplo, forma peletizada, ela também pode conter um ou mais de: excipientes como celulose microcristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina; desintegradores como amido (de preferência, amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose só- dica e certos silicatos complexos; aglutinantes de granulação como polivinil pirrolidona, hidroxipropil metilcelulose (HPMC), hidroxipropil celulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco podem estar incluídos.

[000274] Exemplos de veículos nutricionalmente aceitáveis para uso no preparo das formas incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, gel de petróleo, óleos vegetais, polietileno gli- cóis, propileno glicol, lipossomos, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silícico, parafina vis-cosa, óleo essencial, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo de petroetral, hidróxi-metil-celulose, polivinil pirrolidona, e similares.

[000275] Os excipientes preferenciais para as formas incluem lactose, amido, uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicóis com alto peso molecular.

[000276] Para suspensões aquosas e/ou elixires, a composição da presente invenção pode ser combinada com vários agentes adoçantes ou saborizantes, matéria de tingimento ou corantes, com agentes de emulsificação e/ou suspensão e com diluentes como água, propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[000277] Soro de leite não higroscópico é frequentemente usado como um veículo para DFMs (particularmente, DFMs bacterianos) e é um bom meio para iniciar o crescimento.

[000278] Pastas contendo DFM bacteriano podem ser formuladas com óleo vegetal e ingredientes de gelificação inertes.

[000279] Os produtos fúngicos podem ser formulados com subprodutos de grão como veículos.

[000280] Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não está sob a forma de um sistema de micropartículas, como o sistema de micropartículas ensinado no W02005/123034.

Administração

[000281] O DFM e/ou composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção pode ser projetado para administração única ou pode ser projetado para alimentação diária.

[000282] A quantidade ótima da composição (e de cada componente presente nela) a ser usada na combinação da presente invenção de-penderá do produto a ser tratado e/ou do método de contato do produto com a composição e/ou do uso pretendido para a mesma.

[000283] A quantidade de DFM e das enzimas usadas nas composi- ções deve ser uma quantidade suficiente para ser eficaz e permanecer suficientemente eficaz no aprimoramento do desempenho dos produtos de ração dados ao animal contendo a dita composição. Este período de tempo para eficácia deve se estender até pelo menos o tempo de utilização do produto (por exemplo, composição de aditivo de ração ou ração contendo a mesma).

[000284] A razão entre DFM e cada enzima na ração pode estar nas faixas dadas abaixo:

[000285] DFM: fitase (UFC/FTU): Na faixa de 5,0x102 UFC de DFM: 1FTU de enzima a 5,0x109 UFC: 1FTU de enzima; de preferência, na faixa de 7,5x104UFC de DFM: 1FTU de enzima a 2,5x107 UFC: 1FTU de enzima.

[000286] DFM: xilanase (CFU/XU): Na faixa de 6,25x101 CFU de DFM: 1XU de enzima a 2,0x109 CFU:1XU de enzima; de preferência, na faixa de 1,88x104CFU de DFM: 1XU de enzima a 1,0x107 CFU:1XU de enzima.

[000287] DFM: amilase (CFU/AU): Na faixa de 1,0x102 CFU de DFM: 1AU de enzima a 2,0x101° CFU:1AU de enzima; de preferência, na faixa de 3,7x104CFU de DFM: 1AU de enzima a 1,0x108 CFU:1AU de enzima.

[000288] DFM: protease (CFU/PU): Na faixa de 5,0x101 UFC de DFM: 1PU de enzima a 1,0x109 CFU:1PU de enzima; de preferência, na faixa de 1,25x104 CFU de DFM: 1PU de enzima a 5,0x106 CFU:1PU de enzima.

[000289] Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o seguinte: uma protease a pelo menos 4.000 PU/kg de ração; uma xilanase a pelo menos 1.000 XU/kg a 2.000 XU/kg de ração (por exemplo Avizyme a 1.000 XU/kg de ração ou Axtra XAP a pelo menos 2.000 XU/kg de ração); uma amilase; pelo menos 1.800 AU/kg ou 200 TAU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 1.800 AU/kg ou Axtra XAP a pelo menos 200 TAU/kg de ração); uma fitase a pelo menos 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a pelo menos 75.000 CFU/g a 150.000 CFU/g de ração.

[000290] Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o seguinte: uma protease a 4.000 PU/kg de ração; uma xilanase a 1.000 XU/kg a 2.000 XU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 1.000 XU/kg de ração ou Axtra XAP a 2.000 XU/kg de ração); uma amilase; 1.800 AU/kg ou 200 TAU/kg de ração (por exemplo Avizyme a 1.800 AU/kg ou Axtra XAP a 200 TAU/kg de ração); uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 CFU/g a 150.000 CFU/g de ração.

[000291] Em uma modalidade, de preferência, a ração compreende o seguinte: uma protease a 5.000 PU/kg de ração; uma xilanase a 1.250 XU/kg a 2.500 XU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 1.000 XU/kg de ração ou Axtra XAP a 2.500 XU/kg de ração); uma amilase; 2.250 AU/kg ou 250 TAU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 1.800 AU/kg ou Axtra XAP a 250 TAU/kg de ração); uma fitase a 625 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 CFU/g a 150.000 CFU/g de ração.

[000292] Em outra modalidade, a ração compreende o seguinte: uma protease a 2.000 PU/kg de ração; uma xilanase a 500 XU/kg a 1.000 XU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 500 XU/kg de ração ou Axtra XAP a 1.000 XU/kg de ração); uma amilase; 900 AU/kg ou 100 TAU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 900 AU/kg ou Axtra XAP a 100 TAU/kg de ração); uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 37.500 CFU/g a 75.000 CFU/g de ração.

[000293] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de ração compreende enzima suficiente e DFMs para administrar a ração da seguinte forma: uma protease a 4.000 PU/kg de ração; uma xilanase a 1.000 XU/kg a 2.000 XU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 1.000 XU/kg de ração ou Axtra XAP a 2000 XU/kg de ração); uma amilase; 1.800 AU/kg ou 200 TAU/kg de ração (por exemplo Avizyme a 1.800 AU/kg ou Axtra XAP a 200 TAU/kg de ração); uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 75.000 CFU/g a 150.000 CFU/g de ração.

[000294] Em uma modalidade preferencial, a composição de aditivo de ração compreende enzima suficiente e DFMs para administrar a ração da seguinte forma: uma protease a 2.000 PU/kg de ração; uma xilanase a 500 XU/kg a 1.000 XU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 500 XU/kg de ração ou Axtra XAP a 1.000 XU/kg de ração); uma amilase; 900 AU/kg ou 100 TAU/kg de ração (por exemplo, Avizyme a 900 AU/kg ou Axtra XAP a 100 TAU/kg de ração); uma fitase a 500 FTU/kg de ração; e Envivo Pro (DFM) a 37.500 CFU/g a 75.000 CFU/g de ração.

Combinação com outros componentes

[000295] O DFM e a(s) enzima(s) para uso na presente invenção podem ser usados em combinação com outros componentes. Desta forma, a presente invenção também se refere a combinações. O DFM em combinação com uma protease, xilanase, amilase e fitase pode ser chamado na presente invenção de "a composição de aditivo de ração da presente invenção".

[000296] A combinação da presente invenção compreende a composição de aditivo de ração da presente invenção (ou um ou mais dos seus constituintes) e outro componente que é adequado para consumo animal e é capaz de fornecer um benefício médico ou fisiológico ao consumidor.

[000297] Em uma modalidade, de preferência, o "outro componente" não é uma enzima adicional ou um DFM adicional.

[000298] Os componentes podem ser prebióticos. Os prebióticos são tipicamente carboidrato não digestível (oligo- ou polissacarídeos) ou um álcool de açúcar que não é degradado ou absorvido no trato digestivo superior. Os prebióticos conhecidos usados em produtos comerciais e úteis de acordo com a presente invenção incluem inulina (fruto- oligossacarídeo, ou FOS) e transgalacto-oligossacarídeos (GOS ou TOS). Os prebióticos adequados incluem palatinoseoligossacarídeo, oligossacarídeo de feijão soja, alginato, xantana, pectina, goma de al-farrobeira (LBG), inulina, goma guar, galacto-oligossacarídeo (GOS), fruto-oligossacarídeo (FOS), amido não degradável, lactosacarose, lactulose, lactitol, maltitol, maltodextrina, polidextrose (isto é, Lites- se®), lactitol, lactosacarose, oligossacarídeos de feijão soja, palatino- se, isomaltooligossacarídeos, gluco-oligossacarídeos e xilo- oligossacarídeos, fragmentos de pectina, fibras dietéticas, manana- oligossacarídeos.

[000299] As fibras dietéticas podem incluir polissacarídeos não amido, como arabinoxilanos, celulose e muitos outros componentes vegetais, como dextrinas resistentes, inulina, lignina, ceras, quitinas, pecti- nas, beta-glucanos e oligossacarídeos.

[000300] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se à com-binação da composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção (ou um ou mais dos seus constituintes) com um prebiótico. Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de aditivo de ração que compreende (ou consiste essencialmente em ou consiste em) um DFM em combinação com uma xilanase, uma amilase, uma fitase, uma protease e um prebiótico.

[000301] O prebiótico pode ser administrado simultaneamente com (por exemplo, em mistura junto com ou liberado simultaneamente pela mesma via ou por vias diferentes) ou sequencialmente à (por exemplo, pela mesma via ou vias diferentes) composição de aditivo de ração (ou seus constituintes) de acordo com a presente invenção.

[000302] Outros componentes das combinações da presente invenção incluem polidextrose, como Litesse®, e/ou uma maltodextrina e/ou lactitol. Estes outros componentes podem ser adicionados, opcional-mente, à composição de aditivo de ração para auxiliar o processo de secagem e ajudar a sobrevivência do DFM.

[000303] Exemplos adicionais de outros componentes adequados incluem um ou mais de: espessantes, agentes gelificantes, emulsifi- cantes, aglutinantes, modificadores de cristal, adoçantes (incluindo adoçantes artificiais), modificadores de reologia, estabilizadores, antio- xidantes, corantes, enzimas, carreadores, veículos, excipientes, dilu- entes, agentes lubrificantes, agentes saborizantes, matéria de fingi-mento, agentes de suspensão, desintegradores, aglutinantes de gra-nulação etc. Estes outros componentes podem ser naturais. Estes outros componentes podem ser preparados pelo uso de técnicas químicas e/ou enzimáticas.

[000304] Em uma modalidade, o DFM e/ou as enzimas podem ser encapsulados. Em uma modalidade, a composição de aditivo de ração e/ou DFM e/ou enzimas é/são formulada(s) como um pó seco ou grã- nulo, conforme descrito no W02007/044968 (chamado de grânulos TPT) - referência aqui incorporada, a título de referência.

[000305] Em uma modalidade preferencial, o DFM e/ou as enzimas para uso na presente invenção podem ser usados em combinação com um ou mais lipídios.

[000306] Por exemplo, o DFM e/ou as enzimas para uso na presente invenção podem ser usados em combinação com uma ou mais mice- las de lipídio. A micela de lipídio pode ser uma micela de lipídio simples ou uma micela de lipídio complexa.

[000307] A micela de lipídio pode ser um agregado de moléculas ori-entadas de substâncias antipáticas, como um lipídio e/ou um óleo.

[000308] Para uso na presente invenção, o termo "agente espessan- te ou gelificante" se refere a um produto que evita a separação por reduzir ou impedir o movimento das partículas, gotículas de líquidos imiscíveis, ar ou sólidos insolúveis. O espessamento ocorre quando moléculas hidratadas individuais causam um aumento na viscosidade, reduzindo a velocidade da separação. A gelificação ocorre quando as moléculas hidratadas se ligam para formar uma rede tridimensional que aprisiona as partículas, assim imobilizando-as.

[000309] O termo "estabilizador" como usado aqui, é definido como um ingrediente ou combinação de ingredientes que impede que um produto (por exemplo, um produto de ração) mude com o tempo.

[000310] O termo "emulsificante", como usado aqui, refere-se a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente de ração) que evita a sepa-ração das emulsões. As emulsões são duas substâncias imiscíveis, uma presente sob a forma de gotícula, contida dentro da outra. As emulsões podem consistir em óleo em água, onde a gotícula ou fase dispersa é óleo e a fase contínua é água; ou água em óleo, onde a água se torna a fase dispersa e a fase contínua é óleo. Espumas, que são gás-em-líquido, e suspensões, que são sólido-em-líquido, também podem ser estabilizadas através do uso de emulsificantes.

[000311] Para uso na presente invenção, o termo "aglutinante" se refere a um ingrediente (por exemplo, um ingrediente de ração) que liga o produto junto através de uma reação física ou química. Durante a "gelificação", por exemplo, a água é absorvida, fornecendo um efeito de ligação. Entretanto, aglutinantes podem absorver outros líquidos, como óleos, os mantendo dentro do produto. No contexto da presente invenção, os aglutinantes seriam tipicamente usados em produtos sólidos ou com baixa umidade, por exemplo, produtos de assamento: bolos, rosquinhas, pão e outros.

[000312] "Carreadores" ou "veículos" significam materiais adequados para administração do DFM e/ou enzimas e incluem quaisquer destes materiais conhecidos na técnica como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizadores, ou similares, que seja não tóxico e que não interaja com nenhum componente da composição de uma forma prejudicial.

[000313] A presente invenção fornece um método para preparar uma composição de aditivo de ração que compreende misturar um DFM e uma xilanase, uma protease, uma fitase e uma amilase com pelo menos um veículo fisiologicamente aceitável selecionado a partir de ao menos um dentre maltodextrina, calcário (carbonato de cálcio), ciclo- dextrina, trigo ou um componente de trigo, sacarose, amido, Na2SO4, talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarose, propileno glicol, 1,3-propano diol, glicose, parabenos, cloreto de sódio, citrato, nitrato, fosfato, cálcio, metabissulfito, formiato e misturas dos mesmos.

[000314] Exemplos de excipientes incluem um ou mais de: celulose microcristalina e outras celuloses, lactose, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, glicina, amido, açúcar de leite e polietileno glicóis com alto peso molecular.

[000315] Exemplos de desintegradores incluem um ou mais de: amido (de preferência amido de milho, batata ou tapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódica e certos silicates complexos.

[000316] Exemplos de aglutinantes de granulação incluem um ou mais de: polivinil pirrolidona, hidróxi-propil-metil celulose (HPMC), hi- dróxi-propil celulose (HPC), sacarose, maltose, gelatina e acácia.

[000317] Exemplos de agentes lubrificantes incluem um ou mais de: estearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerila e talco.

[000318] Exemplos de diluentes incluem um ou mais de: água, eta- nol, propileno glicol e glicerina, e combinações dos mesmos.

[000319] Os outros componentes podem ser usados simultaneamente (por exemplo, quando eles estão em mistura juntos ou até mesmo quando eles são liberados por diferentes vias) ou sequencialmente (por exemplo, eles podem ser liberados por diferentes vias).

[000320] De preferência, quando a composição de aditivo de ração da presente invenção é misturada com outro(s) componente(s), o DFM permanece viável.

[000321] Em uma modalidade, de preferência, a composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção não compreende cromo ou cromo orgânico.

[000322] Em uma modalidade, de preferência, o aditivo de ração de acordo com a presente invenção não contém glucanase.

[000323] Em uma modalidade, de preferência, o aditivo de ração de acordo com a presente invenção não contém ácido ascórbico.

Concentrados

[000324] Os DFMs para uso na presente invenção podem estar sob a forma de concentrados. Tipicamente, estes concentrados compreendem uma concentração substancialmente alta de um DFM.

[000325] As composições de aditivo de ração de acordo com a presente invenção podem ter um teor de células viáveis (unidades de formação de colônia, UFCs) que está na faixa de pelo menos 104 UFC/g (adequadamente, incluindo pelo menos 105 UFC/g, como pelo menos 106 UFC/g, por exemplo, pelo menos 107 UFC/g, pelo menos 108 UFC/g, por exemplo, pelo menos 109 UFC/g) a cerca de 1010 UFC/g (ou mesmo cerca de 1011 UFC/g ou cerca de 1012 UFC/g).

[000326] Quando o DFM está sob a forma de um concentrado, as composições de aditivo de ração de acordo com a presente invenção podem ter um teor de células viáveis na faixa de pelo menos 109 UFC/g a cerca de 1012 UFC/g, de preferência ao menos 1010 UFC/g a cerca de 1012 UFC/g.

[000327] Pós, grânulos e composições líquidas sob a forma de con-centrados podem ser diluídas em água ou ressuspensas em água ou outros diluentes adequados, por exemplo, um meio de crescimento adequado como leite ou óleos minerais ou vegetais, para fornecer composições prontas para uso.

[000328] O DFM ou composição de aditivo de ração da presente invenção ou as combinações da presente invenção sob a forma de concentrados podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[000329] Em um aspecto da presente invenção, as enzimas ou a ração é colocada em contato com uma composição em uma forma concentrada.

[000330] As composições da presente invenção podem ser secadas por atomização ou secadas por congelamento com o uso de métodos conhecidos na técnica.

[000331] Os processos típicos para fazer partículas usando um processo de secagem por atomização envolvem um material sólido que é dissolvido em um solvente adequado (por exemplo, uma cultura de um DFM em um meio de fermentação). Alternativamente, o material pode ser suspenso ou emulsionado em um não solvente para formar uma suspensão ou emulsão. Outros ingredientes (conforme discutido acima) ou componentes, como agentes microbicidas, agentes estabilizan- tes, corantes e agentes que auxiliam o processo de secagem podem, opcionalmente, ser adicionados neste estágio.

[000332] A solução é então atomizada para formar uma névoa fina de gotículas. As gotículas entram imediatamente em uma câmara de secagem onde elas entram em contato com um gás de secagem. O solvente é evaporado das gotículas entro do gás de secagem para so- lificar as gotículas, formando assim, partículas. As partículas são, então, separadas do gás de secagem e coletadas.

Indivíduo

[000333] O termo "indivíduo", como usado aqui, significa um animal que será ou foi administrado com uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção ou uma ração que compreende a dita composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção.

[000334] O termo "indivíduo", como usado aqui, significa um animal. De preferência, o indivíduo é um mamífero, pássaro, peixe ou crustáceo que inclui, por exemplo, gado ou um animal domesticado (por exemplo, um animal de estimação).

[000335] Em uma modalidade, o "indivíduo" é gado.

[000336] O termo "gado", como usado aqui, refere-se a qualquer animal de criação. De preferência, gado é um ou mais de vacas ou touros (incluindo, bezerros), aves domésticas, porcos (incluindo, leitões), aves domésticas (incluindo frangos de corte, galinhas e perus), aves, peixe (incluindo, peixe de água doce, como salmão, bacalhau, truta e carpa, por exemplo, carpa chinesa, e peixes marinhos, como perca do mar), crustáceos (como camarões, moluscos e vieiras), cavalos (incluindo, cavalos de corrida), ovelha (incluindo, cordeiros).

[000337] Em uma modalidade, o termo gado e/ou aves domésticas e/ou galinhas não inclui aves poedeiras.

[000338] Em outra modalidade, o "indivíduo" é um animal domesticado ou animal de estimação ou um animal mantido em um zoológico.

[000339] O termo "animal domesticado ou animal de estimação ou animal mantido em um zoológico" como usado aqui, refere-se a qualquer animal relevante que inclui caninos (por exemplo, cachorros), felinos (por exemplo, gatos), roedores (por exemplo, cobaias, ratos, camundongos), aves, peixe (incluindo, peixe de água doce e peixes marinhos), e cavalos.

[000340] Em uma modalidade, o indivíduo pode ser estimulado por um patógeno entérico.

[000341] A título de exemplo, um indivíduo pode ter um ou mais pa- tógenos entéricos presentes no seu trato gastrointestinal ou trato di-gestivo. Por exemplo, um indivíduo pode ter um ou mais patógenos entéricos no seu trato gastrointestinal ou trato digestivo em um nível que: i) resulte em perda de desempenho do animal e/ou ii) esteja em níveis clinicamente relevantes; ou iii) esteja em níveis subclínicos.

[000342] O patógeno entérico pode ser Clostridium perfringens, por exemplo.

Desempenho

[000343] Como usado aqui, o "desempenho do animal" pode ser de terminado pela eficiência alimentar e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão alimentar e/ou pela digestibilidade de um nu-triente em uma ração (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digestível ou energia metabolizável em uma ração e/ou pela retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade dos animais em evitarem os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou pela resposta imune do indivíduo.

[000344] De preferência o "desempenho do animal" é determinado pela eficiência alimentar e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão alimentar.

[000345] Por "desempenho do animal aprimorado" entende-se que há eficiência alimentar aumentada, e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão alimentar reduzida e/ou digestibilidade de nutrientes ou energia aprimorada em uma ração e/ou pela retenção de nitrogênio aprimorada e/ou pela capacidade aprimorada de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou por uma resposta imune aprimorada no indivíduo resultante do uso da composição de aditivo de ração da presente invenção na ração em comparação à ração que não compreende a dita composição de aditivo de ração.

[000346] De preferência, por "desempenho do animal aprimorado" entende-se que há eficiência alimentar aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão alimentar reduzida.

[000347] Como usado aqui, o termo "eficiência alimentar" se refere à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.

[000348] Por "eficiência alimentar aumentada" entende-se que o uso de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção na ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingesta de ração em comparação com um animal alimentado sem a dita composição de aditivo de ração.

Razão de conversão alimentar (FCR)

[000349] Como usado aqui, o termo "razão de conversão alimentar" se refere à quantidade de ração dada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada.

[000350] Uma razão de conversão alimentar aprimorada significa uma razão de conversão alimentar menor.

[000351] Por "menor razão de conversão alimentar" ou "razão de conversão alimentar aprimorada" entende-se que o uso de uma com-posição de aditivo de ração em uma ração resulta que uma quantidade menor de ração precisa ser dada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação à quantidade de ração necessária para aumentar o peso do animal na mesma quantidade, quando a ração não compreende a dita composição de aditivo de ração.

Digestibilidade de nutrientes

[000352] A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do indivíduo, ou entre o que é administrado ao indivíduo e o que permanece na digestão em um segmento especificado do trato gas-trointestinal, por exemplo, o íleo.

[000353] A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado através da coleção total de excrementos durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador de inerte que não é absorvido pelo animal, e permite ao pesquisador calcular a quantidade do nutriente que desapareceu em todo o trato gastrointestinal ou um segmento do trato gastrointestinal. Tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinzas insolúveis em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma porcentagem do nutriente na ração, ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa de nutriente na ração.

[000354] A digestibilidade de nutrientes, como usado aqui, abrange digestibilidade de amido, digestibilidade de gordura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.

[000355] A digestibilidade de energia, como usado aqui, significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta do material de digestão remanescente em um segmento especificado do trato gas-trointestinal do animal, por exemplo, o íleo. Energia metabolizável, como usado aqui, refere-se à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina, e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou no material de digestão presente em um segmento especificado do trato gastrointestinal usando os mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções adequadas para a excreção de nitrogênio para calcular a energia metabolizável da ração.

Retenção de nitrogênio

[000356] Retenção de nitrogênio, como usado aqui, significa a capa-cidade de um indivíduo reter nitrogênio da dieta como massa corporal. Um equilíbrio de nitrogênio negativo ocorre quando a excreção de ni-trogênio ultrapassa a ingestão diária e é frequentemente vista quando o músculo está sendo perdido. Um equilíbrio de nitrogênio positivo está frequentemente associado com crescimento muscular, particularmente, em animais em crescimento.

[000357] A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a ingestão de nitrogênio e o nitrogênio excretado através da coleta total de excrementos e urina durante um período de tempo. En- tende-se que o nitrogênio excretado inclui proteína não digerida da ração, secreções proteináceas endógenas, proteína microbiana, e nitrogênio urinário.

Sobrevivência

[000358] O termo sobrevivência, como usado aqui, significa o número de indivíduos que permanecem vivos. O termo "sobrevivência aprimorada" pode ser outra forma de dizer "mortalidade reduzida".

Rendimento de carcaça e rendimento da carne

[000359] O termo rendimento da carcaça, como usado aqui, significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo comercial ou experimental de abate. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abatido por alimento, com a cabeça, tripas, parte dos membros e penas ou pele removidos. O termo rendimento da carne, como usado aqui, significa a quantidade de carne comestível como uma proporção do peso corporal vivo, ou a quantidade de uma carne especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo.

Ganho de peso

[000360] A presente invenção fornece, adicionalmente, um método para aumentar o ganho de peso em um indivíduo, por exemplo, aves domésticas ou suínos, que compreende dar ao dito indivíduo uma ração que compreende um composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção.

[000361] Um "ganho de peso aumentado" se refere a um animal que tem peso corporal aumentado ao ser alimentado com a ração que compreende uma composição de aditivo de ração em comparação a um animal que é alimentado com uma ração sem a dita composição de aditivo de ração.

Enterite necrótica

[000362] Enterite necrótica é uma enterotoxemia aguda ou crônica vista em galinhas, perus e patos em todo o mundo, causada pelo Clostridium perfringens. A enterite necrótica é frequentemente caracterizada por uma enterite fibrino-necrótica, geralmente, do intestino delgado médio. A mortalidade pode ser de 5 a 50%, geralmente, em torno de 10%. A infecção ocorre por transmissão fecal-oral. Os esporos do organismo causador são altamente resistentes. Os fatores predisponen- tes incluem coccidiose/coccidiase, dieta (alto teor de proteínas), em patos, possivelmente esforços pesados, dietas de alta viscosidade (frequentemente associadas com grandes inclusões de centeio e trigo na dieta), ração e/ou água contaminada, outras doenças debilitantes.

[000363] A presente invenção se refere ao aumento da resistência do indivíduo à enterite necrótica. Em outras palavras, a presente invenção se refere ao impedimento ou redução do efeito negativo da enterite necrótica.

[000364] O termo "resistência a", como usado aqui, pode abranger o termo "tolerância de". Portanto, em uma modalidade, o indivíduo pode não ser resistente à enterite necrótica, mas o indivíduo pode ser capaz de tolerar a enterite necrótica, isto é, sem os efeitos negativos sobre o desempenho do indivíduo.

[000365] Em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção para tratar ou prevenir enterite necrótica em um indivíduo. Tipicamente, o indivíduo será um que foi ou será estimulado com as espécies Clostridium perfringens e/ou Eimeria. Tal estímulo pode vir do ambiente ou da aplicação de microrganismos vivos na ração ou água potável, por exemplo, quando vacinas de coccídeos vivos são usadas.

[000366] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de aditivo de ração para prevenção e/ou tratamento de coccidiose e/ou enterite necrótica em um indivíduo.

[000367] A presente invenção ainda fornece um método para prevenir e/ou tratar enterite necrótica e/ou coccidiose sendo que uma quantidade eficaz de uma composição de aditivo de ração de acordo com a presente invenção é administrada a um indivíduo.

Resposta imune

[000368] Resposta imune, como usado aqui, significa uma das muitas formas pelas quais os DFMs modulam o sistema imune de animais, incluindo aumento na produção de anticorpos, regulação positiva da imunidade mediada por células, regulação positiva das citoquinas pró-inflamatórias, e aumento da sinalização do receptor do tipo Toll. Entende-se que a estimulação imune do trato gastrointestinal por DFMs pode ser vantajosa para proteger o hospedeiro contra doença, e que a supressão imune do trato gastrointestinal pode ser vantajosa para o hospedeiro porque menos nutrientes e energia são usados para sustentar a função imune.

[000369] De preferência, a resposta imune é uma resposta imune celular.

[000370] De preferência, a resposta imune é medida por observar os marcadores imunes.

Bactérias patogênicas

[000371] O termo bactérias patogênicas, como usado aqui, significa, por exemplo, espécies de clostrídios toxigênicas, por exemplo, Clostridium perfringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade, as bactérias patogênicas podem ser espécies de E. coli patogênicas para aves.

[000372] A presente invenção pode reduzir as populações de bactérias patogênicas no trato gastrointestinal de um indivíduo.

Excreção de nutrientes

[000373] Em uma modalidade, a presente invenção se refere à redução da excreção de nutrientes no esterco. Isto tem efeitos positivos sobre a redução dos riscos ambientais. Por exemplo, em uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere à redução do teor de nitrogênio e/ou fósforo no esterco do indivíduo. Isto, portanto, reduz a quantidade de nitrogênio e/ou fósforo no ambiente, o que pode ser be-néfico.

Probióticos

[000374] Para algumas aplicações, acredita-se que o DFM na com-posição da presente invenção possa exercer um efeito de cultura pro- biótica. Também está dentro do escopo da presente invenção adicionar à composição da presente invenção mais probióticos e/ou prebióti- cos.

[000375] Aqui, um prebiótico é: "um ingrediente alimentar não digestível que afeta de maneira benéfica o hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um ou um número limitado de bactérias benéficas".

[000376] O termo "cultura probiótica", como usado aqui, define microrganismos vivos (incluindo bactérias ou leveduras, por exemplo) que, por exemplo, quando ingeridas ou aplicadas localmente em quantidades suficientes, afeta de maneira benéfica o organismo hospedeiro, isto é, por conferir um ou mais benefícios de saúde demonstráveis ao organismo hospedeiro. Os probióticos podem otimizar o equilíbrio microbiano em uma ou mais superfícies mucosas. Por exemplo, a superfície mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo "probiótico", como usado aqui, também abrange microrganismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imune e ao mesmo tempo reduzem as reações inflamatórias em uma superfície mucosa, por exemplo, o trato gastrointestinal.

[000377] Apesar de não haver limites inferiores ou superiores para a ingestão de probióticos, foi sugerido que pelo menos 106-1012, de pre-ferência ao menos 1O6-1O10, de preferência, 108-109, UFC como uma dose diária será eficaz para se alcançar os efeitos benéficos para a saúde em um indivíduo.

Isolado

[000378] Em um aspecto, adequadamente, a enzima ou DFM usado na presente invenção pode estar em uma forma isolada. O termo "isolado" significa que a enzima ou DFM é pelo menos substancialmente isento de pelo menos um outro componente com o qual a enzima ou DFM está associado naturalmente na natureza e, conforme encontrado na natureza. A enzima ou DFM da presente invenção pode ser fornecido sob uma forma que é substancialmente isenta de um ou mais contaminantes com os quais a substância poderia estar de outro modo associada. Desta forma, por exemplo, ele pode ser substancialmente isento de um ou mais polipeptídeos e/ou moléculas de ácido nucleico potencialmente contaminantes.

Purificado

[000379] Em um aspecto, de preferência, a enzima e/ou DFM de acordo com a presente invenção está em uma forma purificada. O termo "purificado" significa que a enzima e/ou DFM está presente em um nível alto. A enzima e/ou o DFM é desejavelmente o componente predominante presente em uma composição. De preferência, ele está presente a um teor de ao menos cerca de 90%, ou ao menos cerca de 95% ou ao menos cerca de 98%, o dito nível sendo determinado com base no peso seco/peso seco com relação à composição total sendo considerada.

[000380] Contempla-se dentro do escopo da presente invenção que as modalidades da invenção podem ser combinadas de modo que combinações de quaisquer dos elementos aqui descritos estejam in-cluídas dentro do escopo da presente invenção. Em particular, con- templa-se dentro do escopo da presente invenção que quaisquer dos efeitos terapêuticos das bactérias podem ser exibidos concomitante-mente.

Sequência de nucleotídeos

[000381] O escopo da presente invenção abrange sequências de nucleotídeos que codificam proteínas que têm as propriedades especí-ficas aqui definidas.

[000382] O termo "sequência de nucleotídeos", como usado aqui, refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos ou sequência de poli-nucleotídeos, e variantes, homólogos, fragmentos e derivados dessas substâncias (como suas porções). A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica, sintética ou recombinante, que pode ser du- pla-fita ou de fita simples, representando a fita senso ou antissenso.

[000383] O termo "sequência de nucleotídeos" em relação à presente invenção inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético, e RNA. De preferência, significa DNA, com mais preferência, sequência de cDNA que codifica a presente invenção.

[000384] Em uma modalidade preferencial, a sequência de nucleotídeos, quando se refere a e quando abrangida pelo escopo propriamente dito da presente invenção, não inclui a sequência de nucleotídeos nativa de acordo com a presente invenção quando no seu ambiente natural e quando ela está ligada a sua(s) sequência(s) associada^) naturalmente que também é/estão no seu ambiente natural. Para facilidade de referência, devemos chamar esta modalidade preferencial de "sequência de nucleotídeos não nativa". Nesse sentido, o termo "sequência de nucleotídeos nativa" significa uma sequência de nucleotídeos inteira que está no seu ambiente nativo e quando ligada operacionalmente a um promotor inteiro com a qual ele está associado naturalmente, cujo promotor também está no seu ambiente nativo. Entretanto, a sequência de aminoácidos abrangida pelo escopo da presente invenção pode ser isolada e/ou purificada após a expressão de uma sequência de nucleotideos no seu organismo nativo. De preferência, entretanto, a sequência de aminoácidos abrangida pelo escopo da presente invenção pode ser expressa por uma sequência de nucleotideos no seu organismo nativo, mas sendo que a sequência de nucleotideos não está sob o controle do promotor com o qual ela está associada naturalmente dentro daquele organismo.

[000385] Tipicamente, a sequência de nucleotideos abrangida pelo escopo da presente invenção é preparada usando técnicas de DNA recombinante (isto é, DNA recombinante). Entretanto, em uma modali-dade alternativa da invenção, a sequência de nucleotideos poderia ser sintetizada, no todo ou em parte, usando métodos químicos bem co-nhecidos na técnica (consulte Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 e Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Preparação da sequência de nucleotideos

[000386] Uma sequência de nucleotideos que codifica qualquer proteína que tenha as propriedades específicas aqui definidas ou uma proteína que seja adequada para modificação pode ser identificada e/ou isolada e/ou purificada a partir de qualquer célula ou organismo que produz a dita proteína. Vários métodos são bem conhecidos na técnica para a identificação e/ou isolamento e/ou purificação de sequências de nucleotideos. A título de exemplo, técnicas de amplificação por PCR para preparar mais de uma sequência podem ser usadas uma vez que uma sequência adequada tenha sido identificada e/ou isolada e/ou purificada.

[000387] A título de exemplo adicional, uma biblioteca de DNA genômico e/ou cDNA pode ser construída usando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a enzima. Se a sequência de aminoácidos da enzima for conhecida, sondas de oligonucleotídeo marcadas podem ser sintetizadas e usadas para identificar clones que codificam enzimas da biblioteca genômica preparada a partir do orga-nismo. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeo marcada con-tendo sequências homólogas a outro gene de enzima conhecido poderia ser usada para identificar clones que codificam enzimas. No último caixa, condições de hibridização e lavagem de menor estringência são usadas.

[000388] Alternativamente, clones que codificam enzimas poderiam ser identificados por inserir fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, como um plasmídio, transformar bactérias negativas para a enzima com a biblioteca de DNA genômico resultante, e, então, plaquear as bactérias transformadas sobre placas de ágar contendo um substrato para a enzima (isto é, maltose) permitindo assim aos clones expressarem a enzima a ser identificada.

[000389] Em uma alternativa ainda adicional, a sequência de nucleo- tídeos que codifica a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos-padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosforoami- dita descrito por Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805. No método de fosforoamidita, oligonucleotídeos são sinteti-zados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores adequados.

[000390] A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica e sintética mista, origem sintética e de cDNA mista, ou de origem ge-nômica e de cDNA mista, preparada pela ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou cDNA (conforme for adequado) de acordo com técnicas-padrão. Cada fragmento ligado corresponde a várias partes da sequência de nucleotídeos inteira. A sequência de DNA pode, também, ser preparada por sistema de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo, conforme descrito em US 4.683.202 ou em Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491).

Sequências de aminoácidos

[000391] O escopo da presente invenção também abrange sequências de aminoácidos de enzimas que têm as propriedades específicas aqui definidas.

[000392] Para uso na presente invenção, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo de "polipeptideo" e/ou do termo "proteína". Em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "peptídeo"; em alguns casos, o termo "sequência de aminoácidos" é sinônimo do termo "enzima".

[000393] A sequência de aminoácidos pode ser preparada/isolada a partir de uma fonte adequada, ou ela pode ser produzida sinteticamente ou ela pode ser preparada pelo uso de técnicas de DNA recombinante.

[000394] A proteína abrangida na presente invenção pode ser usada em conjunto com outras proteínas, particularmente, enzimas. Desta forma, a presente invenção também abrange uma combinação de proteínas, sendo que a combinação compreende a proteína/enzima da presente invenção e outra proteína/enzima, que pode ser outra proteína/enzima de acordo com a presente invenção.

[000395] De preferência, a sequência de aminoácidos, quando se relaciona com e quando abrangida pelo escopo propriamente dito da presente invenção, não é uma enzima nativa. Nesse sentido, o termo "enzima nativa" significa uma enzima inteira que está no seu ambiente nativo e quando ela foi expressa por sua sequência de nucleotídeos nativa.

Identidade de sequência ou homologia de sequência

[000396] A presente invenção abrange, também, o uso de sequências que têm um grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com sequências de aminoácidos de um polipeptídeo que tem as propriedades específicas aqui definidas ou de qualquer sequência de nucleotideos que codifica tal polipeptídeo (mais adiante neste documento chamada de "sequência(s) homóloga(s)"). Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade que tem certa homologia com as sequências de aminoácidos em questão e com as sequências de nucleotideos em questão. Aqui, o termo "homologia" pode ser igualado a "identidade".

[000397] A sequência de aminoácidos e/ou sequência de nucleotideos homóloga deve fornecer e/ou codificar um polipeptídeo que retém a atividade funcional e/ou intensifica a atividade da enzima.

[000398] No presente contexto, uma sequência homóloga é entendida por incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 75, 85 ou 90% idêntica, de preferência ao menos 95 ou 98% idêntica à sequência em questão. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos que a sequência de aminoácidos em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácido que tem propriedades químicas/funções similares), no contexto da presente invenção é preferencial expressar homologia em termos de identidade de sequência.

[000399] No presente contexto, uma sequência homóloga é entendida por incluir uma sequência de nucleotideos que pode ser pelo menos 75, 85 ou 90% idêntica, de preferência ao menos 95 ou 98% idêntica a uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo da presente invenção (a sequência em questão). Tipicamente, os homólogos compreenderão as mesmas sequências que codificam os sítios ativos etc. que a sequência em questão. Embora a homologia também possa ser considerada em termos de similaridade (isto é, resíduos de aminoácido que tem propriedades químicas/funções similares), no contexto da presente invenção é preferencial expressar homologia em termos de identidade de sequência.

[000400] As comparações de homologia podem ser conduzidas por inspeção visual, ou mais geralmente, com o auxílio de programas de comparação de sequências prontamente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências.

[000401] A % de homologia pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, isto é, uma sequência é alinhada com a outra sequência e cada aminoácido em uma sequência é comparado diretamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isto se chama alinhamento "sem lacunas (ungapped)". Tipicamente, tais alinhamentos sem lacunas são feitos apenas em um número relativamente pequeno de resíduos.

[000402] Embora este seja um método muito simples e consistente, ele falha em levar em consideração que, por exemplo, em um par de sequências de outro modo idênticas, uma inserção ou deleção fará com que os resíduos de aminoácido seguintes sejam colocados fora de alinhamento, desta forma, resultando potencialmente em uma grande redução na % de homologia quando um alinhamento global é feito. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequências são projetados para produzir alinhamentos ótimos que levam em consideração possíveis inserções e deleções sem penalizar indevidamente o grau de homologia total. Isto é obtido pela inserção de "lacunas (gaps)" no alinhamento de sequências para tentar otimizar a homologia local.

[000403] Entretanto, estes métodos mais complexos designam "pe-nalidades por lacuna" para cada lacuna que ocorrer no alinhamento para que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequências com o menor número possível de lacunas - refletindo maior relação entre as duas sequências comparadas - irá alcançar um grau maior do que uma com muitas lacunas. Os "custos por lacuna afim" são tipicamente usados, os quais colocam um custo relativamente alto para a existência de uma lacuna e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente na lacuna. Este é o sistema de pontuação de lacunas mais comumente usado. Altas penalidades por lacuna produzirão, logicamente, alinhamentos otimizados com menos lacunas. A maioria dos programas de alinhamento permite que as pe-nalidades por lacuna sejam modificadas. Entretanto, é preferencial usar os valores padrão quando se usa tal programa para comparações entre sequências.

[000404] O cálculo da % de homologia máxima, portanto, exige pri-meiramente a produção de um alinhamento ótimo, levando em consi-deração as penalidades por lacuna. Um programa de computador adequado para executar tal alinhamento é o Vector NTI (Invitrogen Corp.). Exemplos de programas que podem fazer comparações entre sequências incluem, mas não se limitam a, o pacote BLAST (consulte Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4o Ed - capítulo 18), BLAST 2 (consulte FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.qov), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) e AlignX, por exemplo. Pelo menos BLAST, BLAST 2 e FASTA estão disponíveis para busca offline e online (consulte Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7- 60).

[000405] Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento em si tipicamente não se baseia em uma comparação de pares tudo-ou-nada. Em vez disso, uma matriz de pontuação de similaridade em escala é geralmente usada, a qual designa pontuações para cada comparação em pares com base na similaridade química ou na distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz comumente usada é a matriz BLOSUM62 - a matriz padrão para o pacote de programas BLAST. Os programas Vector NTI geralmente usam os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos personalizada, se fornecida (consulte o manual do usuário para detalhes adicionais). Para algumas aplicações, é preferencial usar os valores padrão para o pacote Vector NTI.

[000406] Alternativamente, a porcentagem de homologia pode ser calculada usando o componente de alinhamento múltiplo no Vector NTI (Invitrogen Corp.), com base em um algoritmo análogo ao CLUS- TAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

[000407] Quando o programa tiver produzido um alinhamento ótimo, é possível calcular a % de homologia, de preferência, a % de identidade de sequência. O programa faz isso tipicamente como parte da comparação de sequências e gera um resultado numérico.

[000408] Se as penalidades por lacuna forem usadas quando se de-termina a de identidade de sequência, então, de preferência, os seguintes parâmetros são usados para o alinhamento de pares de sequências:

[000409] Em uma modalidade, o CLUSTAL pode ser usado com a penalidade por lacuna e a extensão da lacuna ajustadas conforme de-finido acima.

[000410] Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos é determinado ao longo de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos, de preferência, ao longo de pelo menos 30 nucleotídeos contíguos, de preferência, ao longo de pelo menos 40 nucleotídeos contíguos, de preferência, ao longo de pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, de preferência, ao longo de pelo menos 60 nucleotídeos contíguos, de preferência, ao longo de pelo menos 100 nucleotídeos contíguos.

[000411] Adequadamente, o grau de identidade com relação a uma sequência de nucleotídeos pode ser determinado ao longo de toda a sequência.

Hibridização

[000412] A presente invenção abrange, também sequências que são complementares às sequências de ácidos nucleicos da presente in-venção ou sequências que são capazes de hibridizar às sequências da presente invenção ou a sequências que são complementares a elas.

[000413] O termo "hibridização" como usado aqui, deve incluir "o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se une com uma fita complementar através de pareamento de bases" assim como o processo de amplificação, conforme executado nas tecnologias de sistema de reação em cadeia de polimerase (PCR).

[000414] A presente invenção abrange, também, o uso de sequências de nucleotídeos que são capazes de hibridizar às sequências que são complementares às sequências aqui apresentadas, ou qualquer derivado, fragmento ou derivado do mesmo.

[000415] O termo "variante" também abrange sequências que são complementares às sequências que são capazes de hibridizar às se-quências de nucleotídeos aqui apresentadas.

[000416] De preferência, sequências complementares são aquelas capazes de hibridizar sob condições estringentes (por exemplo, 50°C e 0,2xSSC {1xSSC = NaCI 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}) às se-quências de nucleotídeos aqui apresentadas.

[000417] Com mais preferência, sequências complementares são aqueles que são capazes de hibridizar sob condições de alta estrin- gência (por exemplo, 65°C e 0,1xSSC {1xSSC = NaCI 0,15 M, Nascitrato 0,015 M pH 7,0}) às sequências de nucleotideos aqui apresentadas.

[000418] Em um aspecto mais preferencial, presente invenção com-preende sequências de nucleotideos que podem hibridizar à sequência de nucleotideos da presente invenção, ou ao seu complemento, sob condições altamente estringentes (por exemplo, 65°C e 0,1xSSC). Exemplos

Exemplo 1 Materiais e Métodos

[000419] Três mil e seiscentos pintos Cobb machos de um dia de idade foram comprados de uma chocadeira comercial. No início do estudo, cinquenta machos foram alocados a cada galinheiro de tratamento por blocos. O estudo consistiu nos seguintes tratamentos (Tabela 1):

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase de Bacillus licheniformis, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 93/129 5 4 Axtra XAP ® fornecida pela Danisco A/S. Petição 870200053635, de 30/04/2020, pág. 97/145

[000420] Os pesos das aves por galinheiro foram registrados no início do estudo, nos dias 23, 35 e no término (dia 42). O galinheiro era a unidade de medida. As dietas dos frangos de corte foram dadas como farelos (iniciais) ou péletes (de crescimento e terminação). As dietas satisfazem ou superam os padrões NRC (Tabela 2). O misturador foi descartado para evitar contaminação cruzada das dietas. Todas as rações de tratamento foram misturadas usando um misturador Davis S-20 e peletizadas usando um moinho California Pellet Mill (temperatura do pélete frio de 65 a 70 C). As amostras foram coletadas de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada lote e misturadas juntas para confirmar as atividades enzimáticas e a presença de Enviva Pro na ração.

[000421] As aves receberam ração à vontade adequada para o tra-tamento do dia 0 a 42. As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli no plano de fundo. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação. Uma alte-ração da dieta inicial para a de crescimento ocorreu no dia 23. A dieta de crescimento foi substituída pela dieta de terminação no dia 35. Em cada alteração da ração, os alimentadores foram removidos dos galinheiros por bloco, pesados de novo, esvaziados e cheios novamente com a dieta de tratamento adequada. No dia final do estudo, a ração foi pesada. Os galinheiros foram verificados diariamente para mortalidade. Quando uma ave foi selecionada para abate ou encontrada morta, a data e o peso da remoção (kg) foram registrados. Uma necropsia grosseira foi feita em todas as aves mortas ou selecionadas para abate para determinar o sexo e a provável causa da morte. Sinais de enterite necrótica foram observados.

[000422] Todos os galinheiros tinham aproximadamente 10,2 cm (4 polegadas) de leito construído com um revestimento de serragem de pinheiro fresco.

[000423] Todas as aves foram vacinadas por pulverização antes de serem colocadas em galinheiros com uma vacina de coccidiose co-mercial (Coccivac-B). Nos dias 20, 21 e 22 todas as aves, exceto o tratamento 1, foram administradas com um caldo de cultura de C. per-fringens. Um isolado de campo de C. perfringens conhecido por causar NE e que se origina de uma operação com frangos de corte comercial foi utilizado como o organismo estimulador. O inóculo fresco foi usado todo dia. Os níveis de titulação foram de aproximadamente 1,0 X 108-9. Cada galinheiro recebeu a mesma quantidade de inóculo. O inóculo foi administrado por misturá-lo na ração encontrada na base do tubo ali- mentador. No dia 23, cinco aves de cada galinheiro foram selecionadas, eutanizadas, pesadas em grupo, e examinadas para o grau de presença de lesões de enterite necrótica. A pontuação teve por base uma pontuação de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo o mais grave (0 = nenhum, 1 = leve, 2 = moderado, 3 = acentuado/grave; Hofacre et al., 2003 J. Appl. Poult. Res. 12:60-64). Nenhuma terapia farmacológica concomitante foi usada durante o estudo.

[000424] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. Os galinheiros foram usados como a unidade experimental.

Resultados

[000425] A Figura 1 mostra os escores da lesão de enterite necrótica de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica com base em um sistema de pontuações de 0 a 3. SEM agrupado = 0,15

[000426] O tratamento de controle estimulado aumentou os escores da lesão em comparação ao tratamento de controle não estimulado. A adição de DFMs com uma combinação de uma xilanase, amilase, pro-tease e fitase reduziu os escores da lesão em comparação a todos os outros tratamentos. A adição de DFMs em combinação com as enzimas reduziu os escores da lesão em comparação aos DFMs sozinhos ou às enzimas sozinhas.

[000427] A Figura 2 mostra o ganho de peso corporal de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica. Desvio-padrão da média (SEM) agrupado = 28,6

[000428] A Figura 2 mostra que uma combinação de DMF (Enviva Pro®) com uma combinação de uma xilanase, uma amilase, uma protease e uma fitase melhorou significativamente o ganho de peso corporal (ganho de PC) em frangos de corte estimulados com Clostridium perfringens em comparação ao controle estimulado - mesmo que re-sultando em um ganho de PC aprimorado em relação a um controle negativo (isto é, um controle não estimulado). Isto foi significativamente melhor que qualquer outro tratamento.

[000429] A Figura 3 mostra a razão de conversão alimentar de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica. Desvio- padrão da média (SEM) agrupado = 0,016

[000430] A combinação de Enviva Pro (DFM) com uma xilanase, amilase, protease e fitase melhorou significativamente (reduziu) FCR (g de ganho de PC/g de ingesta de ração) de frangos de corte desde o nascimento até 42 dias em comparação ao controle estimulado, e às enzimas sozinhas e aos outros tratamentos.

Exemplo 2. Materiais e Métodos

[000431] 500 pintos de corte Cobb machos foram obtidos a partir de uma chocadeira comercial. Um total de 26 pintos foi distribuído aleatoriamente a um de 8 galinheiros de reprodução por tratamento. Galinheiros de chão (1,5 m2/galinheiro (16 pé2/galinheiro)) estavam localizados em um alojamento com cortina laterais contendo aquecimento controlado, ventiladores de circulação, lâmpadas de calor e serragem de madeira fresca. As aves foram expostas à luz fluorescente em um ciclo de 24 h de luz pelos primeiros quatro dias e, então, um ciclo de 16 horas de luz:8 horas de escuro pelo restante do experimento. A ração foi fornecida em alimentadores de sino e a água foi suprida à vontade através de bebedores com bico. Uma dose 5X de Coccivac-B (Intervet) foi administrada manualmente com uma seringa dentro da cavidade bucal dos pintos com um dia de idade. Tabela 3, Desenho experimental do exemplo 2.

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase de Bacillus amylollquefaciens, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 Avizyme 1505 ® fornecida pela Danisco A/S. 98/129 Petição 870200053635, de 30/04/2020, pág. 102/145

[000432] Os pintos foram administrados com dietas com ou sem Enviva Pro ou xilanase, amilase, e protease (Avizyme 1502; Tabela 3). As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação.

[000433] Todas as dietas eram dietas à base de milho-farelo de soja- DDGS. As dietas iniciais foram fornecidas durante o estudo (d 1-20). As dietas foram peletizadas (65 a 70°C) e esfareladas. As amostras foram coletadas de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada lote e misturadas juntas para confirmar as atividades enzimáticas e a presença de Enviva Pro na ração. Tabela 4. Composição da dieta experimental do exemplo 2.

[000434] Os pesos corporais e os pesos dos alimentadores foram registrados no dia 1, 11, 20, 38 e 48 para calcular a ingesta de ração, o ganho de peso corporal e a conversão alimentar. A mortalidade e as seleções para abate foram monitoradas diariamente e usadas para ajustar o consumo de ração e o ganho. Uma ave de seis galinheiros para reprodução foi eutanizada por deslocamento cervical para coleta de raspagens mucosas nos dias 11 e 20. Raspagens mucosas foram coletadas do íleo (divertículo de Meckel até a junção íleo-cecal). O íleo foi removido e cortado ao longo de seu comprimento para expor o lú- men e, então, lavado rapidamente e suavamente com PBS para remover o material de digestão. A borda de uma lâmina para microscópio foi usada para remover a camada mucosa por raspagem ao longo do comprimento da seção de tecido cortada. A camada mucosa foi imediatamente fixada por congelamento entre placas de alumínio em N líquido para preservar a integridade do RNA e foi armazenada em sacos "whirl-pack" individuais. Amostras de tecido congeladas foram armazenadas em N líquido durante a amostragem e a -80 C antes da análise. O RNA total da raspagem mucosa foi isolado usando o reagente Trizol (Invitrogen) usando um homogeneizador mecânico para rompimento do tecido. O RNA total (0,5 pg) foi transcrito de forma reversa em DNA complementar usando iScript (Bio-Rad) de acordo com as recomendações do fabricante. A quantidade de mRNA dos genes citoquina inflamatória secretados (interleucina-10, interferon- y e inter- leucina-17) foi avaliada usando iniciadores específicos para galinhas. Adicionalmente, a quantidade de mRNA de TATA-BP, HPRT-1 e β- actina foi medida para normalização de dados usando o software ge- Norm. O número de vezes de alteração na quantidade de mRNA na expressão gênica foi determinada usando a equação delta-delta Ct modificada, conforme descrito por Rudrappa e Humphrey (2007) J. Nutr. 137: 427-432 e transformado em log para análise dos dados.

[000435] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. As aves foram usadas como a unidade experimental para os dados de mRNA. Resultados

[000436] A Figura 4 mostra a quantidade de mRNA do gene do inter- feron-gama nas raspagens mucosas do íleo de frangos de corte. Idade 11 dias: Desvio-padrão da média agrupado = 0,1 Idade 20 dias Desvio-padrão da média agrupado = 0,6

[000437] A combinação de Enviva Pro e xilanase, amilase, protease + fitase regulou positivamente a expressão de IFR-g no íleo de frangos de corte de 11 dias de idade que receberam 5 vezes uma vacina anti- coccidiose viva na choca em comparação ao controle negativo, Enviva Pro + fitase, e xilanase, amilase, protease + fitase. No dia 21, Enviva Pro + fitase, e a combinação de Enviva Pro e xilanase, amilase, protease + fitase regulou negativamente a expressão de IFR-g no íleo em comparação ao controle negativo. Estes dados sugerem que a modulação da resposta imune pode ser um dos mecanismos de desempenho aprimorado dos DFMs em combinação com as 4 enzimas em frangos de corte.

[000438] A Figura 15 mostra a razão de conversão alimentar de frangos de corte no dia 48 de idade. Idade 48 dias: Desvio-padrão da média agrupado = 0,041 Exemplo 3

Materiais e Métodos

[000439] Um teste de digestibilidade com frangos de corte foi conduzido para determinar os efeitos das enzimas da dieta e dos tratamentos com DFMs sobre a utilização de nutrientes. As gaiolas foram aloja- das em salas com ambiente controlado. As aves receberam 20 horas de iluminação fluorescente e foram deixadas com livre acesso às dietas e à água. No dia 1, uma vacina viva para coccidiose de frangos de corte foi dada a todos os pintos através da água potável. Papel foi colocado no piso de arame da gaiola pelos primeiros três dias para permitir a reciclagem dos oocistos de Eimeria. O estudo consistiu nos seguintes tratamentos (Tabela 5): Tabela 5. Desenho experimental do exemplo 3.

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase 1 de Bacillus amyloliquefaciens, amilase 2 de Bacillus li-cheniformis, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 Avizyme 1505 ® fornecida pela Danisco A/S. 5 Axtra XAP ® fornecida pela Danisco A/S.

[000440] 192 aves foram pesadas individualmente e distribuídas, com base no peso corporal, a 48 gaiolas (4 aves/ gaiola). Os 8 tratamentos dietéticos foram então atribuídos aleatoriamente a seis gaiolas cada. As aves receberam ração inicial adequada para o tratamento de 0 a 21 dias. As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação. As aves foram alimentadas com as dietas iniciais (Tabela 6) em forma de purê durante todo o experimento. Tabela 6. Composição da dieta experimental do exemplo 3.

[000441] No dia 21, quatro aves por gaiola foram eutanizadas por injeção intracardíaca de pentobarbitona de sódio e os conteúdos do íleo inferior foram expressos por lavagem suave com água destilada Os materiais de digestão das aves dentro de uma gaiola foram agrupados, resultando em seis amostras por tratamento de dieta. As amostras do material de digestão foram congeladas imediatamente após a coleta, liofilizadas e processadas. As amostras do material de digestão e as dietas foram analisadas quanto a Ti, DM, GE, amido, gordura, N e aminoácidos, excluindo triptofano, de acordo com procedimentos padrão. O cálculo dos coeficientes de digestibilidade do íleo foi feito conforme relatado por Ravindran et al. (2005), com base na concentração de Ti indigestível. A contribuição de energia do amido, gordura e proteína para a energia digestível do íleo foi calculada com base na energia bruta média do amido (4,2 kcal/g), gordura (9,4 kcal/g), ou proteína (5,5 kcal/kg). O aprimoramento dos aminoácidos digestíveis em resposta às enzimas e aos DFMs foi expresso em relação à quantidade de aminoácidos não digeridos no nível do íleo; o coeficiente angular daquela função linear foi usado como um indicador dos efeitos dos aditivos sobre a digestibilidade de aminoácidos.

[000442] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. As gaiolas foram usadas como a unidade experimental.

Resultados

[000443] A Figura 5 mostra a energia digestível aparente do íleo de frangos de corte em 21 dias de idade. Desvio-padrão da média agrupado = 0,027

[000444] A adição de Enviva Pro (um DFM) em combinação com uma amilase, xilanase, protease e fitase mostrou aumentos comercialmente relevantes da energia digestível do íleo em comparação com as enzimas sozinhas e com os controles negativos. Estes dados indicam que os DFMs melhoraram os efeitos destas enzimas exógenas sobre a digestibilidade de energia das dietas de aves domésticas. A título de esclarecimento, Amilase 2 é através do uso da amilase em AxtraXAP e Amilase 1 é através do uso da amilase em Avizyme 1502.

[000445] A Figura 6 mostra os aumentos da digestibilidade de aminoácidos do íleo para três tratamentos dietéticos em função do tratamento de controle como uma função dos aminoácidos não digeridos do íleo no tratamento de controle usando frangos de corte com 21 dias.

[000446] A Figura apresenta o aprimoramento na digestibilidade de aminoácidos do íleo dos tratamentos dietéticos com relação à fração não digerida de aminoácidos no íleo de frangos de corte no tratamento de controle. Cada ponto dentro de um tratamento representa um dos aminoácidos medidos. A adição de Enviva Pro sobre a xilanase, amilase 2, protease + fitase aumentou a digestibilidade do íleo dos aminoácidos (+11,3%) em comparação a Enviva Pro + fitase (+3,6%) e xilanase, amilase 2, protease + fitase sozinhos (isto é, sem DFM) (+4,7%). Estes dados indicam que os DFMs melhoraram a eficácia destas enzimas exógenas em aumentar a digestibilidade de aminoácidos das dietas de aves domésticas.

[000447] A Figura 7 mostra o aprimoramento da energia digestível do íleo com relação ao tratamento de controle usando frangos de corte com 21 dias de idade.

[000448] A Figura apresenta o incremento da energia digestível do íleo de cada tratamento dietético em comparação ao tratamento de controle negativo com fitase. Adicionalmente, as contribuições calcula- das de energia proveniente do amido, gordura ou proteína são apre-sentadas. A adição de Enviva Pro em combinação com xilanase, amilase 2, protease + fitase aumentou a energia digestível do íleo em comparação ao tratamento com Enviva Pro + fitase e ao tratamento com xilanase, amilase 2, protease + fitase sozinhos. A adição de Enviva Pro em combinação com xilanase, amilase 1, protease + fitase produziu aumentos comercialmente importantes na energia digestível do íleo em comparação com as enzimas sozinhas. Estes dados indicam uma capacidade aprimorada das 4 enzimas em aumentar a energia digestível do íleo das dietas de frangos de corte na presença de DFMs.

Exemplo 4 Materiais e Métodos

[000449] Um teste de digestibilidade com frangos de corte foi conduzido para determinar os efeitos das enzimas da dieta e dos tratamentos com DFMs sobre a utilização de nutrientes. As gaiolas foram alojadas em salas com ambiente controlado. As aves receberam 20 horas de iluminação fluorescente e foram deixadas com livre acesso às dietas e à água. No dia 1, uma vacina viva para coccidiose de frangos de corte foi dada a todos os pintos através da água potável. Papel foi colocado no piso de arame da gaiola pelos primeiros três dias para permitir a reciclagem dos oocistos de Eimeria. O estudo consistiu nos seguintes tratamentos (Tabela 7): Tabela 7. Desenho experimental do exemplo 4.

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase 1 de Bacillus amyloliquefaciens, amilase 2 de Bacillus li-cheniformis, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus sub-tilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 Avizyme 1505 ® fornecida pela Danisco A/S. 5 Axtra XAP ® fornecida pela Danisco A/S.

[000450] 144 aves foram pesadas individualmente e distribuídas, com base no peso corporal, a 36 gaiolas (4 aves/ gaiola). Os 6 tratamentos dietéticos foram então atribuídos aleatoriamente a seis gaiolas cada. As aves receberam ração inicial adequada para o tratamento de 0 a 21 dias. As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação. As aves foram alimentadas com as dietas iniciais (Tabela 6) em forma de purê durante todo o experimento. Tabela 8. Composição da dieta experimental do exemplo 4^

[000451] A ingesta de ração e a produção total de excrementos foram medidas quantitativamente por gaiola ao longo de quatro dias consecutivos (do dia 17 ao 20) para a determinação da energia meta- bolizável aparente corrigida para o nitrogênio (AMEn) e da retenção de nitrogênio. As coletas diárias dos excrementos foram agrupadas no interior de uma gaiola, misturadas em um misturador e subamostra- das. Cada subamostra foi liofilizada, triturada para passar através de uma peneira de 0,5 mm e armazenada em recipientes plásticos herméticos ao ar a - 4 C até a análise. As amostras processadas foram analisadas para DM, GE e N usando procedimentos padrão.

[000452] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. As gaiolas foram usadas como a unidade experimental. Resultados

[000453] A Figura 8 mostra a energia metabolizável aparente corrigida para o nitrogênio AMEn de tratamentos dietéticos dados a frangos de corte com 17 a 21 dias de idade. Desvio-padrão da média agrupado = 0,015

[000454] A adição de Enviva Pro em combinações com xilanase, amilase, protease + fitase aumentou a AMEn das dietas em resposta às enzimas em comparação à dieta de controle negativo. Em particular, a adição de Enviva Pro em combinação com xilanase, amilase 2, protease + fitase aumentou a AMEn das dietas em resposta às enzimas em comparação com as dietas com apenas Enviva Pro.

[000455] A Figura 9 mostra a retenção de nitrogênio de frangos de corte com 17 a 21 dias de idade. Desvio-padrão da média agrupado = 0,006

[000456] A adição de Enviva Pro em combinação com xilanase, amilase, protease + fitase aumentou a retenção de nitrogênio de frangos de corte em resposta às enzimas em comparação à dieta de controle negativo. Em particular, a adição de Enviva Pro sobre a xilanase, amilase 2, protease + fitase aumentou a retenção de nitrogênio de frangos de corte em resposta às enzimas em comparação aos frangos de corte alimentados com dietas apenas com Enviva Pro.

Exemplo 5 Materiais e métodos

[000457] 308 pintos de corte Ross machos foram obtidos a partir de uma chocadeira comercial. Um total de 10 pintos foi distribuído aleatoriamente a um de 6 gaiolas em replicata por tratamento. As aves foram expostas à luz fluorescente em um ciclo de 24 h de luz pelos primeiros quatro dias e, então, um ciclo de 16 horas de luz:8 horas de escuro pelo restante do experimento. Ração e água foram supridos à vontade. O design experimental consistiu nos seguintes tratamentos.

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase de Bacillus amyloliquefaciens, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 2 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 Avizyme 1505 ® fornecida pela Danisco A/S. 111/129 Petição 870200053635, de 30/04/2020, pág. 115/145

[000458] Nos tratamentos 2 a 6, uma vacina para coccidiose super- dosada (dose recomendada x5) (B, Intervet) foi administrada manualmente com uma seringa na cavidade bucal de pintos com um dia de idade. No tratamento 2, salinomicina (Bio-cox) foi usada no nível aprovado (60 g/MT) como um coccidiostático. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação cruzada com oocistos de Eimeria e DFMs. As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco A/S nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli no plano de fundo. Tabela 10. Composição da dieta experimental do exemplo 5.

[000459] 2 aves por gaiola replicada foram eutanizadas com 14 dias de idade para coleta das raspagens mucosas do íleo médio. Os íleos foram lavados com fluxo de água destilada e abertos por corte com um par de tesouras. As seções abertas foram dispostas de maneira plana sobre uma placa de vidro limpa. A mucosa foi cuidadosamente raspada da região média do íleo com a borda longa de uma lâmina de vidro. Cada amostra foi armazenada em 2 ml de RNAIater (Ambion) e congelada em um congelador a -80 C. As amostras foram descongeladas sobre gelo. O RNA total foi isolado com reagente Trizol de acordo com protocolos padrão. A integridade do RNA foi determinada em um gel de agarose. O RNA foi transcrito de modo reverso com a transcriptase reversa de MMLV. A expressão de mucina (MUC2) foi determinada por PCR em tempo real em um equipamento MylQ em tempo real da Bio- rad.

[000460] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. As aves foram usadas como a unidade experimental para os dados de mRNA. Resultados

[000461] A Figura 10 mostra a quantidade de mRNA do gene MUC2 nas raspagens mucosas do íleo de frangos de corte com 14 dias de idade. Desvio-padrão da média agrupado=0,14

[000462] A adição de Enviva Pro em combinação com xilanase, amilase, protease + fitase regulou negativamente a expressão de MUC 2 no íleo de frangos de corte estimulados com uma dose 5 X de uma vacina viva para coccidiose em comparação ao controle estimulado. Estes dados sugerem que uma redução das perdas de aminoácidos endógenos causadas pela secreção reduzida de mucina pode ser responsável pelo desempenho aprimorado dos frangos de corte que recebem combinações de DFMs e as 4 enzimas.

Exemplo 6 Materiais e métodos

[000463] Amostras de tecido foram retiradas de pintos de corte do teste apresentado no exemplo 1 aos 23 dias de idade. As especificações dos tratamentos são apresentadas na Tabela 1. O jejuno, o pâncreas e o fígado foram removidos de 2 aves de cada galinheiro e a mucosa agrupada resultando em oito amostras por tratamento. As amostras foram enxaguadas em solução tampão (PBS) imersa em um reagente de armazenamento de tecido (RNAIater) de acordo com o protocolo do fabricante e armazenadas a -80°C. O RNA total foi isolado de cada amostra de tecido usando um método de extração com fe- nol-clorofórmio em uma única etapa, conforme descrito por Cho- mczynski e Saachi (1987; Anal. Biochem. 162:156-9). A concentração do RNA foi determinada mediante a medição da absorbância a 260 nm (Nanodrop) e a integridade foi monitorada por eletroforese em gel em géis de agarose a 1,2%. Apenas RNA com pureza suficiente e tendo uma razão entre a absorção a 260 nm e a 280 nm maior que 1,87 foram considerados para uso.

[000464] Os microarranjos foram fabricados usando oligonucleotí- deos com 70 pares de bases (Opereon Biotechnologies Inc) de acordo com o protocolo descrito por Druyan et al. (2008; Poult. Sci. 87:2418- 29). O design experimental do arranjo foi um design de laço entrelaçado completo, conforme descrito por Garosi et al. (2005; Br. J. Nutr. 93:425-32) em que cada amostra é comparada diretamente com as outras em múltiplos pares, permitindo a todos os tratamentos serem comparados. As amostras foram marcadas de acordo com o método descrito por Druyan et al. (2008; Poult. Sci. 87:2418-29) em que metade das amostras seria marcada com Cy3 e metade com Cy5, que são corantes fluorescentes de cianina. A hibridização foi executada usando o kit de hibridização de microarranjo Pronto Plus! antes da adição de sondas de cDNA marcadas com Cy3 e Cy5 e as amostras foram cobertas com uma lamínula de vidro transparente (Lifterslip) e deixadas para hibridizar por 16 horas. Os microarranjos foram então digitaliza- dos em um digitalizador de microarranjo Scan Array Gx PLUS ajustado para uma energia de laser de 65% para adquirir as imagens.

[000465] O RNA total das amostras individuais foi transcrito de modo reverso para produzir cDNA que foi, então, usado como um molde para as amplificações de qPCR, conforme descrito por Druyan et al. (2008; Poult. Sei. 87:2418-29). Os parâmetros de termociclagem foram otimizados para cada gene e cada gene foi amplificado independen-temente em duplicata dentro de uma única passagem do instrumento.

[000466] Os arquivos de dados foram gerados a partir das imagens digitalizadas dos microarranjos, mas extraindo os dados brutos de in-tensidade para cada lâmina e a combinação de corantes usando o Software ScanAlyze. Os arquivos de dados de intensidade foram então analisados usando JMP Genomics que inclui uma transformação Iog2 inicial. A normalização dos dados foi feita usando regressão localmente ponderada e suavização primeiro dentro do arranjo e através de todos os arranjos. As intensidades de Iog2 normalizadas resultantes foram analisadas usando um modelo ANOVA misto.

[000467] As intensidades médias foram comparadas usando um limite de significância baseado na correção de Bongerroni de P=0,05. Para o arranjo completo, incluindo todas as réplicas, uma intensidade média por grade foi calculada para cada gene usando as 3 sondas lado a lado, resultando em um total de quatro médias replicadas, uma de cada grade, por gene. Os dados para a razão Ct das amostras em duplicata (Ct do gene da amostra: Ct do GAPDH da amostra) dependendo do tratamento foram submetidos a ANOVA unidirecional.

Resultados

[000468] Os dados de expressão foram coletados usando a plataforma de microarranjo e um "mapa de calor" foi produzido para visualizar os dados para o jejuno (Figura 16) e pâncreas (Figura 17). Os níveis de expressão relativos de seis genes de interesse foram converti- dos em indicações visuais com base na escala vista na Figura 16. Os genes menos expressos são marcados com um sinal de menos e os genes altamente expressos são marcados com um sinal de mais ("+"); enquanto uma maior intensidade cinza mostra uma diferença maior do nível de expressão médio dos tratamentos. Os genes que foram medidos e suas supostas funções, conforme visto na Tabela 11. PCR em tempo real foi usado para validar a expressão gênica mostrada no mapa de calor para sucrase-isomaltase (SI) e amilase 2A (AMY2a) e elas estavam altamente correlacionadas aos dados do arranjo. Tabela 11. Função suposta dos genes medidos.

[000469 A Figura 16 mostra um mapa de calor dos perfis de expres- são dos genes de interesse para todos os tratamentos para o jejuno aos 23 dias de idade.

[000470] A Figura 17 mostra um mapa de calor do perfil de expressão de alfa amilase de galinha para todos os tratamentos no pâncreas em 23 dias de idade.

[000471] Nas Figuras 16 e 17, o código é o seguinte: Controle não estimulado= Controle não estimulado + fitase CC = Controle estimulado + fitase CC+ Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase CC+ XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease CC+ EP = Controle estimulado + fitase + Enviva Pro CC+ EP + Amilase = Controle estimulado + fitase + amilase + Enviva Pro CC+ EP + XAP = Controle estimulado + fitase + xilanase + amilase + protease + Enviva Pro.

[000472] A expressão do transportador de oligopeptídeo 1 (PEPT1) foi aumentada pela xilanase + amilase + protease + fitase, e foi ainda mais aumentada quando em combinação com Enviva Pro. PEPT1 faz parte de um sistema de transporte de peptideos e é responsável pela absorção de uma ampla gama de di- e tri-peptídeos.

[000473] A expressão de glicoquinase (GCK) foi regulada negativamente pelo controle estimulado, mas uma combinação de amilase + fitase ou xilanase + amilase + protease + fitase com Enviva Pro produziu uma regulação positiva similar ao controle não estimulado. A extensão da regulação positiva foi maior que quando a xilanase+ amila- se+ protease+ fitase foram usadas com Enviva Pro.

[000474] Um estrutura similar também foi visto com sucrase iso- maltase (SI), onde a combinação de Enviva Pro e amilase + fitase ou xilanase + amilase + protease + fitase produziu uma regulação positiva maior que os controles estimulado e não estimulado. A GCK é uma enzima chave no metabolismo de glicose e a SI é responsável pela hidrólise de sacarose e iso-maltose, e então, tem um importante papel na digestão e absorção de carboidratos em animais.

[000475] A proteína de junção oclusiva 1 (ZO1) foi a mais altamente expressa no controle estimulado. Uma redução foi vista com os trata-mentos com enzima, mas uma regulação negativa maior na expressão foi vista quando Enviva Pro foi usado e assim, particularmente, quando em combinação com xilanase + amilase + protease + fitase, que produziram um nível similar de regulação negativa que o controle não estimulado. ZO1 é uma proteína que está sobre a face citoplasmática das junções oclusivas, há vários papéis para esta proteína, variando de transdução de sinal para a montagem da junção oclusiva até estabilidade das próprias junções oclusivas.

[000476] O antígeno de célula T CD3 (CD3D) estava altamente expresso no controle estimulado. Os tratamentos apenas com enzima reduziram um pouco a expressão, mas ela foi significativamente regulada negativamente quando em combinação com Enviva Pro. A combinação de xilanase + amilase + protease+ fitase produziu a maior regulação negativa dos tratamentos de enzima, e, quando em combinação com Enviva Pro, produziu uma regulação negativa ainda maior, próxima daquela vista para o controle não estimulado. CD3D é uma molécula de superfície encontrada em células T e desempenha um importante papel na transdução de sinal durante o engate do receptor de célula T e faz parte do complexo receptor de célula T/CD3.

[000477] A alfa amilase (AMY2A) estava altamente expressa nos controles não estimulados e estimulados, mas a adição de amilase + fitase ou xilanase + amilase + protease + fitase resultou em expressão reduzida, que foi ainda mais reduzida quando Enviva Pro foi usado na combinação, particularmente, para xilanase + amilase + protease + fitase. A alfa amilase de galinha é produzida principalmente no pâncreas e tem um papel importante na digestão do amido.

Discussão

[000478] O aumento na expressão do transportador de oligopeptídeo transportador de peptídeo 1 (PEPT1) quando xilanase + amilase + pro-tease + fitase foram dadas, particularmente, em combinação com Enviva Pro, sugere uma disponibilidade aumentada dos peptídeos e, assim, uma necessidade maior de transportadores de peptídeo, o que indica um efeito sinérgico das enzimas e DFMs para aumentar a ad- sorção de peptídeos para o animal, o que permite maior crescimento. Os resultados do desempenho do animal do exemplo 1 corroboram esta conclusão. O aumento na expressão de glucoquinase e sucrase isomerase com a combinação de amilase + fitase, ou xilanase + amilase + protease + fitase, e Enviva Pro sugere que houve uma absorção aumentada de glicose, e uma disponibilidade aumentada de sacarose e isomaltose na borda em escova, o que indica uma interação positiva entre a enzima e os DFMs para aumentar a absorção de carboidratos no intestino delgado e, assim, aumentar a disponibilidade de energia proveniente da dieta. A redução da expressão de glucoquinase para o controle estimulado sugere que o estímulo com Clostridium perfringens causou dano à mucosa e que a adição de Enviva Pro e xilanase + ami-lase + protease + fitase aliviou isto.

[000479] O efeito do Enviva Pro na redução da expressão da proteína de junção oclusiva 1 indica menor necessidade de degradação (turnover) da proteína no intestino, o que pode estar relacionado a uma alta integridade intestinal. A expressão aumentada no controle estimulado, entretanto, sugere que a degradação/necessidade da proteína foi alta devido à falha da integridade intestinal, possivelmente devido às infecções por coccídios e Clostridium perfringens. As enzimas sozinhas tiveram algum efeito na melhora disto, mas o efeito aditivo visto com Enviva Pro sugere um benefício maior gerado pela combinação. Isto indica que Enviva Pro age aumentando a integridade intestinal e, desta forma, beneficia a saúde do animal. O aumento da integridade intestinal e, assim, da capacidade de absorção, pode ser um dos mecanismos pelos quais a eficácia das enzimas exógenas é aumentada quando um DFM está presente.

[000480] A expressão aumentada do antígeno de célula T CD3 no controle estimulado indica aumento da resposta imunológica mediada por células causado pelo estímulo. Nestas condições, as aves estarão sendo submetidas a um desempenho abaixo de ótimo porque a resposta imune irá demandar energia que poderia ser usada para o cres- cimento, e porque algumas aves sentirão uma resposta à doença sis-têmica. A expressão aumentada deste marcador imunológico foi acen- tuadamente revertida quando Enviva Pro foi usado sozinho ou em combinação com enzimas. A regulação negativa da resposta imune no intestino pode ser um dos mecanismos pelos quais a eficácia das en-zimas exógenas na absorção de nutrientes e no desempenho é au-mentada quando um DFM está presente.

[000481] A regulação negativa da produção de alfa amilase (AMY2A) que foi vista com a combinação de amilase + fitase, ou xilanase + amilase + protease + fitase sugere que a galinha está reduzindo sua produção de amilase endógena como uma resposta às enzimas exógenas supridas. O efeito aditivo visto com Enviva Pro e xilanase + amilase + protease + fitase sugere que o DFM está funcionando de modo sinér- gico com as enzimas exógenas para permitir que a ave use a energia que teria gasto produzindo enzimas para digestão de amido na dieta.

[000482] O efeito líquido de uma resposta imune regulada negativamente e maior integridade intestinal e uma melhor digestão e absorção de nutrientes com a combinação de enzimas e DFMs, determina claramente desempenho de produção intensificado dos frangos de corte. Exemplo 7

Materiais e Métodos

[000483] Um teste de digestibilidade com frangos de corte foi conduzido para determinar os efeitos das enzimas da dieta e dos tratamentos com DFM sobre a utilização de energia. 308 pintos Ross machos com 288 dias de idade foram obtidos a partir de uma chocadeira comercial e chocados em galinheiros com bateria em arame farpado até o dia 14. As aves foram vacinadas com uma vacina viva para coccí- dios na choca (Coccivac-B). Os pintos foram alimentados com uma dieta inicial à base de milho-SBM-DDGS. As dietas experimentais foram dadas aos pintos do dia 14 até o dia 21. A ração e a água foram fornecidas à vontade durante todo o período de 21 dias. Seis pintos foram alojados por galinheiro em galinheiros com bateria localizados dentro de uma sala com ambiente controlado, onde eles receberam calor suplementar começando em 35°C no dia da idade e reduzindo 2°C semanalmente. Luz foi fornecida a 23Luz:1 Escuro. No dia 15, os pintos foram pesados individualmente, classificados, as asas foram atadas e foram alocados aleatoriamente às unidades experimentais usando um design completamente randomizado. Cada tratamento consistiu em 8 galinheiros por tratamento. O estudo consistiu nos seguintes tratamentos (Tabela 12):

1 Fitase de Buttiauxella. 2 Amilase de Bacillus licheniformis, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 GalliPro Tect é um DFM compreendido por uma cepa de Bacillus licheniformis (DSM17236).

[000484] As enzimas e os DFMs foram supridos e fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação cruzada. As aves foram alimentadas com as dietas iniciais (Tabela 13) em forma de purê durante o período experimental.

[000485] Bandejas para excrementos limpas foram colocadas no lugar para os últimos 2 dias e amostras de excrementos foram coletadas por galinheiro no dia 21. As amostras de excrementos coletadas foram congeladas a -20°C antes de serem secas em forno a 65°C durante 3 dias para determinar a matéria seca (AOAC International, 2005; méto- do 934.01). As amostras de ração também foram corrigidas para a base de matéria seca pela medição de 5,0 g de cada amostra e secagem das mesmas em um forno a 100°C durante 24 h. As amostras de ex-crementos foram então trituradas através de uma malha de 1 mm en-quanto as amostras de ração foram trituradas para uma malha de 0,5 mm. As amostras de excrementos e as dietas foram analisadas para Ti, DM, GE, e N, de acordo com procedimentos padrão. O cálculo da energia metabolizável aparente (AME) se baseou na concentração do marcador indigestível (Ti) e na energia bruta das dietas e excrementos. As correções adequadas foram feitas para diferenças no teor de umidade. AME corrigido para N (AMEn) foi determinado para retenção de nitrogênio zero pela multiplicação por 8,22 kcal por grama de nitrogênio retido no corpo (Hill e Anderson, 1958; J. Nutr. 64:587-603).

[000486] As médias foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consideradas a P<0,05. As gaiolas foram usadas como a unidade experimental.

Resultados

[000487] A Figura 18 mostra a energia metabolizável aparente corrigida pela retenção de nitrogênio (AMEn) de frangos de corte com 21 dias de idade. Efeito do DFM; P<0,001; Efeito da enzima; P<0,001; Efeito de DFM x Enzima; P=0,27; Desvio-padrão da média (SEM) agrupado =32 kcal.

[000488] A adição de xilanase, amilase, protease, e fitase, em com-binação com Enviva Pro ou GalliPro Tect resultou em aprimoramentos na AMEn em função do tratamento de controle, que foram significativamente maiores em comparação às enzimas ou aos DFMs sozinhos. Os aumentos de AMEn causados pela combinação de xilanase, amilase, protease, fitase, e Enviva Pro (235 kcal/kg) ou GalliPro Tect (215 kcal/kg) foram maiores que a adição das enzimas e os efeitos do DFM quando aplicado separadamente (152 kcal/kg para Enviva Pro, ou 120 kcal/kg para GalliPro Tect), em comparação ao tratamento de controle negativo. Exemplo 8

Materiais e métodos

[000489] Mil e quatrocentos pintos Cobb machos de um dia de idade foram comprados de uma chocadeira comercial. No início do estudo, cinquenta machos foram alocados a um de sete galinheiros por trata-mento por blocos. O estudo consistiu nos seguintes tratamentos (Tabela 1):

1 Fitase de E. coli. 2 Amilase de Bacillus licheniformis, xilanase de Trichoderma reesei, protease de Bacillus subtilis. 3 Enviva Pro ® é uma combinação das cepas Bs2084, LSSAO1 e 15AP4 de Bacillus subtilis, fornecida pela Danisco A/S. 4 Axtra XAP ® fornecida pela Danisco A/S.

[000490] Os pesos das aves por galinheiro foram registrados no início do estudo, no dia 21 e no término (dia 42). O galinheiro era a unidade de medida. As dietas dos frangos de corte foram dadas como farelos (iniciais) ou péletes (de crescrimento e terminação). As dietas satisfazem ou superam os padrões NRC (Tabela 2). O misturador foi descartado para evitar contaminação cruzada das dietas. Todas as rações de tratamento foram misturadas usando um misturador Davis S-20 e peletizadas usando um moinho California Pellet Mill (temperatura do pélete frio de 65 a 70 C). As amostras foram coletadas de cada dieta de tratamento do início, meio e fim de cada lote e misturadas juntas para confirmar as atividades enzimáticas e a presença de Enviva Pro na ração. Tabela 2. Composição da dieta experimental do exemplo 8.

[000491] As aves receberam ração à vontade adequada para o tra- tamento do dia 0 a 42. As enzimas e Enviva Pro foram fornecidos pela Danisco nas misturas e níveis adequados para todos os tratamentos experimentais. Todas as dietas continham 500 FTU de fitase de E. coli no plano de fundo. Os galinheiros foram dispostos dentro da instalação para evitar o contato direto de modo a evitar contaminação.

[000492] Uma alteração da dieta inicial para a de crescimento ocorreu no dia 21. A dieta de crescimento foi substituída pela dieta de terminação no dia 35. Em cada alteração da ração, os alimentadores foram removidos dos galinheiros por bloco, pesados de novo, esvaziados e cheios novamente com a dieta de tratamento adequada. No dia final do estudo, a ração foi pesada. Os galinheiros foram verificados diariamente para mortalidade. Quando uma ave foi selecionada para abate ou encontrada morta, a data e o peso da remoção (kg) foram registrados. Uma necropsia grosseira foi feita em todas as aves mortas ou selecionadas para abate para determinar o sexo e a provável causa da morte. Sinais de enterite necrótica foram observados.

[000493] Todos os galinheiros tinham aproximadamente 10,2 cm (4 polegadas) de leito construído com um revestimento de serragem de pinheiro fresco.

[000494] Todas as aves foram vacinadas por pulverização antes de serem colocadas em galinheiros com uma vacina de coccidiose co-mercial (Coccivac-B). Nos dias 18, 19, e 20 todas as aves, exceto o tratamento 1, foram administradas com um caldo de cultura de C. per-fringens. Um isolado de campo de C. perfringens conhecido por causar enterite necrótica e que se origina de uma operação com frangos de corte comercial foi utilizado como o organismo estimulador. O inóculo fresco foi usado todo dia. Os níveis de titulação foram de aproximada-mente 1,0 X 108'9. Cada galinheiro recebeu a mesma quantidade de inóculo. O inóculo foi administrado por misturá-lo na ração encontrada na base do tubo alimentador.

Coleta da amostra

[000495] No dia 21, um total de 8 aves por tratamento (1 a 2 aves por galinheiro) foram eutanizadas e o trato gastrointestinal total desde abaixo da moela até a junção íleo-cecal foi coletado de cada ave e enviado de um dia para o outro sobre gelo para o laboratório. As amos tras foram posteriormente dissecadas no laboratório para obter uma porção de 20 cm do jejuno circundando o divertículo de Meckle; o res-tante do trato intestinal foi descartado. As seções foram enxaguadas com 0,1% de peptona para remover os conteúdos intestinais e abertas longitudinalmente para expor o revestimento epitelial. As seções foram mastigadas em 99 ml de 0,1% de peptona a 7,0 golpes/s durante 60 s para liberar as células bacterianas associadas com a mucosa. As bac-térias foram coletadas da solução mastigada por centrifugação a 12.000 x g durante 10 minutos. O pélete bacteriano resultante foi res- suspenso em 10 ml de caldo MRS + 10% de glicerol, congelado rapidamente em nitrogênio líquido, e armazenado a -20°C até análise posterior.

Isolamento de DNA

[000496] O DNA genômico foi isolado de todas as amostras por extração com fenol clorofórmio e purificado usando o kit de purificação High Pure PCR Template da Roche Applied Science (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, EUA). As amostras foram agrupadas aleatoriamente em pares no nível do DNA após extração, para um total de quatro amostras por tratamento.

Pirossequenciamento

[000497] O pirossequenciamento do amplicon FLX codificado pela etiqueta bacteriana foi feito conforme descrito por Dowd (Dowd et al. 2008; BMC Microbiol. 8, 125). Uma quantidade equivalente de DNA isolado da mucosa intestinal de cada ave foi analisada em amostras agrupadas contendo DNA de duas aves. A região V1-V3 do gene do rRNA 16S foi amplificada em cada amostra usando os iniciadores 28 F (5’- GAGTTTGATCNTGGCTCAG) e 519R (5’- GTNTTACNGCGG- CKGCTG). Após o sequenciamento, os dados brutos foram submetidos a triagem e adaptados com base na qualidade. As sequências foram classificadas pelas amostras individuais com base em sequências de código de barras. As etiquetas de código de barras foram removidas e as sequências ribossomais não bacterianas foram removidas. A composição da comunidade bacteriana foi determinada usando com-paração BlastN a uma base de dados de qualidade controlada e curada manualmente derivada do NCBI. A abundância relativa de cada ID bacteriana foi determinada para cada amostra. Os dados foram compi-lados em cada nível taxonômico usando a nomenclatura do NCBI.

Análise estatística

[000498] As médias dos dados sobre desempenho foram separadas usando testes de t pareados. As diferenças significativas foram consi-deradas a P<0,05. Os galinheiros foram usados como a unidade expe-rimental.

[000499] Identificações do nível do gênero foram usadas para a análise dos dados de pirossequenciamento. A abundância relativa de cada gênero foi calculada e usada para a análise. Os resultados foram ana-lisados usando uma análise de modelo categórico e, então, uma pro-babilidade de Chi-quadrado foi calculada usando JMP 8.0.2 (SAS insti-tute, Cary, NC, EUA), onde cada amostra representando uma ave foi considerada uma unidade experimental.

Resultados:

[000500] A Figura 19 mostra a razão de conversão alimentar (FCR) de frangos de corte em um modelo de estímulo de enterite necrótica (SEM agrupado: 0,015).

[000501] A combinação de Enviva Pro com xilanase, amilase, protease + fitase reduziu FCR (g de ganho de PC/g de ingesta de ração) em comparação ao tratamento com controle estimulado e ao uso de apenas Enviva Pro e fitase. A razão de conversão alimentar foi reduzida pela combinação até o nível do controle não estimulado + fitase.

[000502] A Figura 20 mostra a abundância relativa de Lactobacillus spp. no 21 d na mucosa do jejuno de frangos de corte, ChSq <0,0001.

[000503] A Figura 20 mostra a abundância relativa de Lactobacillus spp. em comparação a outras espécies na mucosa do jejuno de frangos de corte em 21 dias em um modelo de estímulo de enterite necrótica. A proporção de Lactobacilli foi reduzida no controle estimulado em comparação ao controle não estimulado. A combinação de Enviva Pro, xilanase, amilase, protease + fitase aumenta a proporção de Lactobacilli mais do que Enviva Pro e fitase sozinhas e o controle estimulado.

[000504] Os Lactobacilli são amplamente usados como probióticos para uso em seres humanos e animais (Patterson e Burkeholder 2003; Poult Sci 82 (4) 627-31) e foi documentado que eles melhoram a saúde do trato gastrointestinal para um nível que poderia ser comparável aos promotores de crescimento antibiótico (Awad et al. 2009 Poult Sci 88 (1) 49-56). Desta forma, mediante o aumento da proporção de Lactobacilli na microbiota do trato gastrointestinal, a combinação de Enviva Pro, xilanase, amilase, protease + fitase pode melhorar a saúde do trato gastrointestinal e afetar positivamente a eficiência alimentar.

[000505] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima estão aqui incorporados, a título de referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistema descritos da invenção ficarão evidentes aos versados na técnica, sem que se desvie do espírito e escopo da invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve-se compreender que a invenção, tal como reivindicada, não deve ficar indevidamente limitada a essas modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos de realização da invenção descritos, que são óbvias para os versados em bioquímica e biotecnologia ou campos relacionados, destinam-se a estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

1. Composição de aditivo de ração, caracterizada pelo fato de que compreende um microrganismo de alimentação direta (DFM) em combinação com uma subtilisiπa, uma xilanase, uma a-amilase e uma 6-fitase, em que o microrganismo de alimentação direta compreende uma bactéria de uma ou mais das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens e suas combinações, em que a 6-fitase está presente em uma dosagem compreendida entre 200FTU/g de composição de aditivo de ração e 10.000 FTU/g de composição de aditivo de ração, em que a-amilase está presente em uma dosagem entre 50 AU g de composição de aditivo de ração e 20.000 AU/g de composição de aditivo de ração, em que a xilanase está presente em uma dosagem entre 500 XU/g de composição de aditivo de ração e 40.000 XU/g de composição de aditivo de ração, em que a subtilisiπa está presente em uma dosagem entre 1.000 PU/g de composição de aditivo de ração e 60.000 PU/g de composição de aditivo de ração, e em que o DFM está presente em uma dosagem compreendida entre 3,75x107 CFU/g de composição de aditivo de ração e 1x1011 CFU/g de composição de aditivo de ração.

2. Composição de aditivo de ração de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o microrganismo de alimentação direta é uma bactéria viável.

3. Composição de aditivo de ração de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadoa pelo fato de que o microrganismo de alimentação direta é uma ou mais das seguintes cepas: Bacillus subtilis cepas 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA-6507); 22C-P1 (PTA- 6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-50105); BS 18 (NRRL B-50633); e BS 278 (NRRL B-50634).

4. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o microrganismo de alimentação direta está na forma de um endosporo.

5. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a xilanase é uma endo-1,4-β-d-xilanase ou uma 1,4 β-xilosidase, preferencialmente uma endo-1,4-β-d-xilanase.

6. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a xilanase é de Bacillus, Trichoderma, Thermomyces, Aspergillus, Penicillium ou Humicola.

7. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a 6-fitase é uma fitase de E. coli ou uma fitase de Buttiauxella ou uma fitase de Hafnia ou uma fitase Citrobacter ou uma fitase de Aspergillus ou uma fitase de Penicillium ou uma fitase de Trichoderma ou uma fitase Hansen ula.

8. Composição de aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a-amilase é de Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, Trichoderma spp. ou Aspergillus spp.

9. Método de preparação de uma composição de aditivo de ração, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de um microrganismo de alimentação direta com uma subtilisina, uma xilanase, uma a-amilase e uma 6-fitase, em que o microrganismo de alimentação direta compreende uma bactéria de um ou mais das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens e suas combinações.

10. Método de preparação de uma composição de aditivo de ração, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o acondicionamento da composição de aditivo de ração.

11. Ração, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

12. Ração de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a 6-fitase está presente em uma dosagem entre 400 FSU/kg de ração e 1.000 FTU/kg de ração.

13. Ração de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a-amilase está presente em uma dosagem entre 100 AU/kg de ração e 2.000 AU/kg de ração.

14. Ração de acordo com qualquer uma das reivindicaes 11 a 13, caracterizada pelo fato de que a xilanase está presente em uma dosagem entre 1.000 XU/kg de ração e 4.000 XU/kg de ração.

15. Ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a protease está presente em uma dosagem entre 2.000 PU/kg de ração a 6.000 PU/kg de ração.

16. Ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que o DFM está presente em uma dosagem entre 7,5x104 CFU/kg de ração e 1x107 CFU/kg de ração.

17. Método de preparação de uma ração, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de um componente de ração com uma composição de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

18. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração compreendendo um microrganismo de alimentação direta em combinação com uma subtilisina, uma xilanase, uma a-amilase e uma 6-fitase, em que o microrganismo de alimentação direta compreende uma bactéria de uma ou mais das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens e suas combinações.

19. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição de aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em combinação com um mineral e/ou uma vitamina.