BR112013014359B1

BR112013014359B1 - método para produzir um produto químico através de fermentação contínua

Info

Publication number: BR112013014359B1
Application number: BR112013014359A
Authority: BR
Inventors: Cheon Jihoon; Nishida Makoto; Takeuchi Norihiro; Kanamori Satoko; Mimitsuka Takashi; Tanaka Yuji
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2020-02-04
Also published as: US20130330787A1; JP5978995B2; EP2650375B1; AU2011339328A1; EP2650375A4; CA2820876C; TW201307567A; US9365876B2; CN103249840A; EP2650375A1; CA2820876A1; BR112013014359A2; JPWO2012077742A1; WO2012077742A1

Abstract

método para produzir um produto químico através de fermentação contínua a presente invenção se refere a um método para produzir um produto químico através de fermentação contínua, o método que inclui: (a) cultivar uma célula em um meio de cultura em um fermentador para fermentar uma matéria-prima para produzir um produto químico; (b) conduzir a filtração do meio de cultura usando-se um módulo de membrana de separação; (c) separar um permeado contendo o produto químico a partir do meio de cultura enquanto retém um líquido não permeado no fermentador, e (d) fornecer um gás a partir de pelo menos uma entre uma porção inferior do módulo de membrana de separação e um tubo que se comunica entre o fermentador e o módulo de membrana de separação, a fim de ajustar uma velocidade linear do gás no módulo de membrana de separação para 0,15 cm/s a 70 cm/s enquanto fornece o módulo de membrana de separação com um líquido.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO QUÍMICO ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA”

Campo da técnica [001] A presente invenção refere-se a um método de produção de um produto químico por fermentação contínua.

Antecedentes da técnica [002] Um método de fermentação para produzir substâncias que envolve cultivar microrganismos ou células cultivadas pode ser aproximadamente classificado em (1) um método de fermentação em batelada e um método de fermentação em batelada alimentada ou semi-batelada e (2) um método de fermentação contínua. O método de fermentação em batelada, batelada alimentada ou semi-batelada possui vantagens como uso de instalações simples, término de cultura em um curto período de tempo, e pouca possibilidade de contaminação com microrganismos indesejados em vez daqueles cultivados em fermentação de produto utilizando técnicas de cultura de microrganismo puras. Entretanto, a concentração do produto em um meio de cultura aumenta com o tempo, resultando na redução de produtividade e rendimento devido à inibição de fermentação pelo produto ou influência de um aumento na pressão osmótica. Consequentemente, é difícil manter o alto rendimento e alta produtividade de forma estável durante muitas horas.

[003] O método de fermentação contínua, por outro lado, pode manter um alto rendimento e alta produtividade durante mais horas do que o método de fermentação em batelada, batelada alimentada ou semi-batelada mencionado acima ao impedir o acúmulo de uma substância objetiva em um fermentador. A cultura contínua convencional é um método de cultura em que uma quantidade de líquido em um fermentador é mantida constante ao alimentar o fermentador com um meio fresco enquanto descarrega a mesma quantidade do meio de cultura a partir do fermentador. Em cultura em batelada,

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 10/106

2/84 a cultura é concluída quando a concentração de substrato inicial desaparece como resultado do consumo, enquanto em uma cultura contínua, na teoria a cultura pode ser infinitamente continuada.

[004] Na cultura contínua convencional, por outro lado, os microrganismos juntamente com um meio de cultura são descarregados de um fermentador de modo que a concentração de microrganismos no fermentador dificilmente é mantida alta. Se a concentração de microrganismos no fermentador puder ser mantida alta, isso resulta no aprimoramento da eficiência de produção de fermentação por volume de fermentação. Para esse propósito, os microrganismos devem ser mantidos ou submetidos a refluxo no fermentador.

[005] Exemplos do método de reter ou submeter a refluxo os microrganismos em um fermentador incluem um método de conduzir a separação de sólido-líquido de um meio de cultura descarregado por separação centrífuga e retornar os microrganismos precipitados para um fermentador e um método de filtrar o meio de cultura descarregado para separar os microrganismos como sólidos e descarregar apenas o sobrenadante do meio de cultura de um fermentador. Entretanto, o método de utilizar separação centrífuga não é prático devido a um alto custo de energia. O método que utiliza filtração exige uma alta pressão de filtração, como descrito acima, de tal modo que esse foi examinado principalmente em um nível laboratorial.

[006] Portanto, propôs-se um método de fermentação contínua para reter a concentração dos microrganismos ou células cultivadas em um alto meio de cultura. Esse método inclui separar os microrganismos ou células cultivadas através de uma membrana de separação e reter ou submeter a refluxo os microrganismos ou células cultivadas separados desse modo em um meio de cultura enquanto recupera um produto do filtrado. Por exemplo, foram

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 11/106

3/84 descritas tecnologias (Documentos de Patente 1 a 3) referentes à fermentação contínua tipo separação de membrana em um aparelho de fermentação contínua utilizando uma membrana cerâmica.

[007] Por outro lado, foi recentemente proposta uma tecnologia de conduzir a cultura contínua utilizando um aparelho de cultura contínua que utiliza uma membrana de separação de polímero orgânico (referir-se aos Documentos de Patente 4 e 5). De acordo com essa proposta, ao utilizar um aparelho de cultura contínua equipado com um tanque para cultivar microrganismos ou células cultivadas e um tanque para conduzir a separação de membrana entre um produto de fermentação pretendido e os microrganismos ou células cultivadas, uma variedade de produtos químicos pode ser produzida em uma taxa de produção maior comparado com o método de cultura em batelada, batelada alimentada ou semi-batelada.

[008] Nessas tecnologias de fermentação contínua que utilizam uma membrana de separação, a redução no custo de equipamento, um custo de troca de membrana, e uma área de instalação foram examinados utilizando uma membrana de separação excelente em permeabilidade à água para reduzir a área da membrana, reduzindo assim o tamanho do aparelho a partir do ponto de vista de redução de custo. Uma membrana de fibra oca com uma grande área de filtração em relação a seu volume chamou a atenção a partir desse ponto de vista de custo.

[009] Essas membranas de separação inclusive uma membrana de fibra oca, entretanto, às vezes possuem capacidade de filtração deteriorada devido a SS (Sólidos Suspensos) ou material adsorvido fixado na superfície de membrana durante a operação de filtração, tornando impossível garantir uma quantidade de filtrado necessária. Em relação a um método de suprimir a obstrução da membrana com microrganismos ou células cultivadas, foram feitas várias propostas sobre uma tecnologia referente à limpeza de uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 12/106

4/84 membrana de separação porosa ou ajuste de condições de filtração.

[010] Como um método de limpeza de uma membrana de separação porosa, foi descrito, por exemplo, um método de retrolavagem de uma membrana de separação porosa com água quente (Documento de Patente 7), um método de retrolavagem de uma membrana de separação porosa com um permeado da filtração (Documento de Patente 8), e similares.

[011] Ademais, é possível utilizar um método de lavagem que conduz a limpeza enquanto fornece um gás. A limpeza por lavagem já foi empregada para tratamento de água. Por exemplo, o Documento de Patente 9 propôs um método de introduzir um gás em um módulo e ao mesmo tempo, introduzir um gás ou um líquido no lado de filtrado da membrana, desse modo, limpando a membrana.

[012] Por outro lado, há um exemplo de utilizar um método de limpeza de gás em um biorreator de membrana (MBR) para tratamento de água utilizando microrganismos de alta concentração. Por exemplo, um método conhecido (Documento de Patente 10) de fornecer água bruta contendo gás a partir de uma porta de fornecimento de água bruta fornecida na porção inferior de um módulo.

Documento da técnica anterior

Documento de patente

Documento de Patente 1:	JP-A-5-95778
Documento de Patente 2:	JP-A-62-138184
Documento de Patente 3:	JP-A-10-174594
Documento de Patente 4:	WO07/097260
Documento de Patente 5:	JP-A-2008-212138
Documento de Patente 7:	JP-A-2000-317273
Documento de Patente 8:	Patente japonesa aberta à

inspeção pública No. Hei JP-A-11-215980

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 13/106

5/84

Documento de Patente 9: Patente japonesa No. 3948593

Documento de Patente 10: JP-A-2005-88008

Sumário da invenção

Problemas que serão solucionados pela invenção [013] Os métodos de limpeza de uma membrana de separação descritos nos Documentos de Patente 7 e 8 são métodos de limpeza de uma membrana de separação porosa que será usada quando um produto de fermentação for filtrado e recuperado de um meio de cultura após o término da fermentação. Se esse método de limpeza for usado para um método de fermentação contínua que retém os microrganismos ou células cultivadas em um meio de cultura após o tratamento de filtração, é difícil manter a produtividade de fermentação em um alto nível, pois o meio de cultura é diluído.

[014] A tecnologia proposta no Documento de Patente 9 é um método de tratar o fluxo de água de superfície do rio, usado como água bruta objetiva, que possui uma turbidez de 0,1 a 5. As substâncias que causam obstrução são diferentes daquelas que causam obstrução durante a filtração de um meio de cultura de modo que esse método não possa exibir seu efeito totalmente para suprimir a obstrução e deterioração na capacidade de filtração em fermentação contínua.

[015] De acordo com o Documento de Patente 10, um gás é fornecido sob condições destinadas a satisfazer apenas o efeito de lavagem da superfície de membrana e nenhuma consideração é dada à influência de um gás excessivamente fornecido sobre os resultados de fermentação e sobre a separação de filtração de um produto. Isso significa que a tecnologia do Documento de Patente 10 não pode ser aplicada conforme para a produção de um produto químico.

[016] Na técnica convencional, um método de lavagem

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 14/106

6/84 adequado para a operação de fermentação contínua que utiliza uma tecnologia de separação de membrana não foi estudado. Portanto, há a demanda de um método para aumentar a produtividade de fermentação de um produto químico enquanto conduz a limpeza de superfície de membrana para manter a capacidade de filtração de uma membrana de separação.

[017] Um objetivo da presente invenção é proporcionar um método para produzir um produto químico através de fermentação contínua, tal método exige apenas uma operação simples e fácil, porém que mantenha alta produtividade estavelmente durante longas horas.

Meios para solucionar os problemas [018] Os presentes inventores conduziram uma investigação extensiva com uma visão para superar os problemas mencionados acima. Como resultado, descobriu-se que ao fornecer um gás em uma velocidade linear de 0,15 cm/s a 70 cm/s a partir da porção inferior de um módulo de membrana ou de um tubo que se comunica entre um fermentador e o módulo de membrana, se torna possível reduzir a obstrução da membrana, conduzindo assim uma operação de membrana estavelmente durante um longo período de tempo e ao mesmo tempo, aprimorar o desempenho de fermentação. Isso permite a produção estável de um produto químico durante um longo período de tempo. A presente invenção foi realizada com base na descoberta mencionada acima e proporciona os seguintes métodos.

(1) Um método para produzir um produto químico através de fermentação contínua, sendo que o método inclui:

(a) cultivar uma célula em um meio de cultura em um fermentador para fermentar uma matéria-prima de modo a produzir um produto químico;

(b) conduzir a filtração do meio de cultura utilizando um módulo de membrana de separação;

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 15/106

7/84 (c) separar um permeado contendo o produto químico do meio de cultura enquanto retém o líquido não permeado no fermentador, e (d) fornecer um gás a partir de pelo menos uma entre uma porção inferior do módulo de membrana de separação e um tubo que se comunica entre o fermentador e o módulo de membrana de separação para ajustar uma velocidade linear de gás no módulo de membrana de separação para 0,15 cm/s a 70 cm/s enquanto fornece o módulo de membrana de separação com um líquido.

(2) O método para produzir um produto químico de acordo com (1), em que na etapa (d), o gás contém oxigênio.

(3) O método para produzir um produto químico de acordo com (2), inclui adicionalmente, além da etapa (d), uma etapa (e) de fornecer o fermentador com um gás, em que:

o gás é fornecido na etapa (d) intermitentemente, e quando o gás não for fornecido na etapa (d), uma taxa de fornecimento do gás na etapa (e) é aumentada comparada com aquela quando o gás é fornecido na etapa (d).

(4) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (3), em que a filtração na etapa (b) é realizada intermitentemente.

(5) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (4), em que a célula é um microrganismo.

(6) O método para produzir um produto químico de acordo com a reivindicação 5, em que o microrganismo é um microrganismo pertencente a qualquer um entre o Gênero Escherichia, o Gênero Providencia, o Gênero Corynebacterium, o Gênero Brevibacterium, e o Gênero Serratia.

(7) O método para produzir um produto químico de acordo com (6), em que o microrganismo é qualquer um entre Escherichia coif,

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 16/106

8/84

Providencia rettgeri, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Serratia marcescens.

(8) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (4), em que a célula é uma levedura.

(9) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (8), em que o produto químico é um aminoácido.

(10) O método para produzir um produto químico de acordo com (9), em que o aminoácido é L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico, Ltriptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, ácido L-aspártico, L-tirosina, L-metionina, L-serina, L-valina, ou L-leucina.

(11) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (8), em que o produto químico é um ácido orgânico.

(12) O método para produzir um produto químico de acordo com (11), em que o produto químico é ácido láctico.

(13) O método para produzir um produto químico de acordo com qualquer um entre (1) a (8), em que o produto químico é cadaverina.

Vantagem da invenção [019] A presente invenção torna possível estabilizar a propriedade de filtração de uma membrana de separação durante várias horas, aumentar os resultados de fermentação, reduzir a possibilidade de contaminação que ocorre devido a microrganismos indesejados exceto os microrganismos necessários para cultivar e produzir um produto químico, esse é um produto de fermentação, estavelmente em um baixo custo amplamente na indústria de fermentação.

Breve descrição dos desenhos [FIGURA 1] A Figura 1 é uma vista lateral esquemática que mostra um exemplo de um aparelho de fermentação contínua tipo separação

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 17/106

9/84 de membrana que será usado na presente invenção.

[FIGURA 2] A Figura 2 é um gráfico que mostra uma mudança na concentração de microrganismo no Exemplo Comparativo 1 e Exemplos 1 a 4.

[FIGURA 3] A Figura 3 é um gráfico que mostra uma mudança na taxa de produção no Exemplo Comparativo 1 e Exemplos 1 a 4.

[FIGURA 4] A Figura 4 é um gráfico que mostra uma mudança no rendimento relativo ao consumo de glicose no Exemplo Comparativo 1 e Exemplos 1 a 4.

[FIGURA 5] A Figura 5 é um gráfico que mostra uma mudança na diferença de pressão de transmembrana no Exemplo Comparativo 1 e Exemplos 1 a 4.

[FIGURA 6] A Figura 6 é um gráfico que mostra uma mudança na concentração de microrganismo no Exemplo Comparativo 3 e Exemplos 5 a 8.

[FIGURA 7] A Figura 7 é um gráfico que mostra uma mudança na taxa de produção no Exemplo Comparativo 3 e Exemplos 5 a 8.

[FIGURA 8] A Figura 8 é um gráfico que mostra uma mudança no rendimento relativo ao consumo de glicose no Exemplo Comparativo 3 e Exemplos 5 a 8.

[FIGURA 9] A Figura 9 é um gráfico que mostra uma mudança na diferença de pressão de transmembrana no Exemplo Comparativo 3 e Exemplos 5 a 8.

[FIGURA 10] A Figura 10 é um gráfico que mostra uma mudança na concentração de microrganismo no Exemplo Comparativo 5 e Exemplos 9 a

13.

[FIGURA 11] A Figura 11 é um gráfico que mostra uma mudança na taxa de produção no Exemplo Comparativo 5 e Exemplos 9 a 13.

[FIGURA 12] A Figura 12 é um gráfico que mostra uma mudança no rendimento relativo ao consumo de glicose no Exemplo Comparativo 5 e

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 18/106

10/84

Exemplos 9 a 13.

[FIGURA 13] A Figura 13 é um gráfico que mostra uma mudança na diferença de pressão de transmembrana no Exemplo Comparativo 5 e Exemplos 9 a 13.

[FIGURA 14] A Figura 14 é um mapa de sequência de plasmídeo pTRS 11.

Modo para realizar a invenção

1. Aparelho de fermentação contínua [020] Um exemplo de um aparelho de fermentação contínua será descrito a seguir com referência à Figura 1. A Figura 1 é uma vista lateral esquemática de um aparelho de fermentação contínua de acordo com a presente modalidade.

[021] Como mostrado na Figura 1, um aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um fermentador (1), um módulo de membrana de separação (2), e tubos para conexão entre o fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2). O fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2) são conectados para constituir um sistema de circulação.

[022] O fermentador (1) é constituído de modo que um meio de cultura possa ser colocado nesse. Mais especificamente, o fermentador (1) é feito de um material excelente em resistência à pressão, resistência ao calor, e propriedade anti-incrustante. O fermentador (1) pode possuir vários formatos como formato cilíndrico e formato colunar poligonal. O fermentador (1) pode possuir um formato que permite o derramamento nesse de uma matéria-prima de fermentação, uma célula, e um sólido, líquido, ou gás necessário para fermentação e agitação da mistura resultante, e se necessário permitir a esterilização, e ainda permite a vedação hermética. A partir do ponto de vista de eficiência de agitação de um meio de cultura, o fermentador (1) é, de preferência, cilíndrico. O fermentador (1) é, de preferência, mantido sob

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 19/106

11/84 pressão para impedir que os microrganismos entrem no fermentador (1) de fora do fermentador e se proliferem nesse. Para controlar a pressão no fermentador (1), proporciona-se um mecanismo como manômetro de fermentador (23) ou similar que será descrito posteriormente.

[023] O módulo de membrana de separação (2) é equipado com muitas membranas de separação como membranas de fibra oca ou membranas de folha plana. Detalhes do módulo de membrana de separação serão descritos posteriormente em detalhes.

[024] O aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um aparelho de controle (28). O aparelho de controle (28) pode realizar vários cálculos. O aparelho de controle (28) controla a operação de cada unidade no aparelho de fermentação contínua (100) com base nos resultados de detecção de vários sensores, entrada por usuários, e vários ajustes.

[025] O aparelho de fermentação contínua (100) é equipado adicionalmente com, como um mecanismo envolvido principalmente em uma etapa de fermentação, um aparelho de fornecimento de gás de fermentador (21), uma válvula de regulação de pressão de fermentador (22), um manômetro de fermentador (23), uma unidade de controle de temperatura (3), um aparelho de agitação (4), uma unidade de controle de pH (5), e uma unidade de controle de nível (6).

[026] O aparelho de fornecimento de gás de fermentador (21) fornece um gás no fermentador (1). O gás fornecido desse modo pode ser recuperado e então fornecido novamente no fermentador (1) por meio do aparelho de fornecimento de gás de fermentador (21).

[027] Com base no controle do aparelho de controle (28), a válvula de regulação de pressão de fermentador (22) libera o ar do fermentador (1) para fora quando a pressão atmosférica no fermentador (1) detectada pelo manômetro de fermentador (23) atingir o limite superior. Desse modo, a

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 20/106

12/84 pressão dentro do fermentador (1) pode ser mantida em um nível apropriado. A pressão dentro do fermentador (1) é mantida, de preferência, em uma pressão maior que a pressão atmosférica externa para impedir que os microrganismos se contaminem no fermentador.

[028] A unidade de controle de temperatura (3) é equipada com um sensor de temperatura e uma unidade de regulação de temperatura. O sensor de temperatura detecta a temperatura de um meio de cultura no fermentador (1). Sob o controle pelo aparelho de controle (28), a unidade de regulação de temperatura funciona de modo que os resultados de detecção do sensor de temperatura estejam dentro de uma faixa predeterminada. Assim, um ambiente de temperatura adequado para fermentação ou proliferação celular pode ser mantido ao manter a temperatura no fermentador (1) constante. A unidade de regulação de temperatura pode possuir uma ou ambas as funções de aquecimento e resfriamento.

[029] O dispositivo de agitação (4) mantém um ambiente de fermentação apropriado ao agitar um meio de cultura no fermentador (1).

[030] A unidade de controle de pH (5) é equipada com um sensor de pH (51) e uma bomba de fornecimento de neutralizador (10). O sensor de pH (51) detecta o pH de um meio de cultura no fermentador (1). A bomba de fornecimento de neutralizador (10) é colocada em um tubo que conecta um tanque de neutralizador e o fermentador (1) e adiciona um neutralizador ao fermentador (1). A bomba de fornecimento de neutralizador (10) funciona com base no controle do aparelho de controle (28) de modo que os resultados de detecção do sensor de pH (51) estejam dentro de uma faixa predeterminada. Como o neutralizador, um ácido ou um álcali é usado.

[031] A unidade de controle de nível (6) é equipada com um sensor de nível (61) e uma bomba de fornecimento intermediária (9). A bomba de fornecimento intermediária (9) é colocada em um tubo que conecta um

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 21/106

13/84 tanque intermediário e o fermentador (1). Com base no controle do aparelho de controle (28), quando os resultados de detecção do sensor de nível (61) mostrarem que o nível de superfície de líquido de um meio de cultura no fermentador (1) está abaixo de um limite inferior predeterminado, a bomba de fornecimento média (9) começa a operação para fornecer um meio para o fermentador (1); e quando a superfície de líquido atingir o limite superior, a operação da bomba de fornecimento média (9) é concluída. Assim, a quantidade de um meio de cultura no fermentador (1) é mantido apropriado.

[032] O aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um sistema de circulação que circula um meio de cultura entre o fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2). Mais especificamente, o aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um tubo (81) que se comunica entre o fermentador (1) e o lado primário do módulo de membrana de separação (2) e um tubo (84) que retorna um concentrado que não passou através da membrana de separação do módulo de membrana de separação (2) para o fermentador (1). Na presente modalidade, o tubo (81) é conectado à porção inferior do módulo de membrana de separação (2) de modo que um meio de cultura seja fornecido ao módulo de membrana de separação (2) a partir da porção inferior desse. No tubo (81) que fornece um meio de cultura do fermentador (1) ao módulo de membrana de separação (2), uma bomba de circulação (8) é colocada. A bomba de circulação (8) funciona para alimentar um meio de cultura do fermentador (1) em direção ao módulo de membrana de separação (2).

[033] Ademais, o aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um tubo (83) que é conectado ao módulo de membrana de separação (2) e descarrega um filtrado (ou seja, um permeado) fora do aparelho. Nesse tubo (83), uma bomba de filtração (11) é fornecida e

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 22/106

14/84 proporciona-se uma válvula de filtração (12) entre a bomba de filtração e o módulo de membrana de separação (2).

[034] O aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com uma constituição para retrolavagem do módulo de membrana de separação (2). O termo retrolavagem significa a limpeza de uma membrana de separação fazendo com que um líquido para limpeza (que pode ser denominado mais adiante líquido de limpeza) passe através da membrana de separação a partir do lado secundário até o lado primário dessa. O aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com um tanque de líquido de limpeza que contém um líquido de limpeza nesse, um tubo (84) que conecta o tanque de líquido de limpeza e o lado secundário do módulo de membrana de separação (2), uma bomba de limpeza (13) fornecida no tubo (84), e uma válvula de limpeza (14) fornecida entre a bomba de limpeza (13) e o módulo de membrana de separação (2). Através dessa bomba de limpeza (13), um líquido de limpeza é distribuído em direção ao módulo de membrana de separação (2).

[035] O tubo (84) pode possuir um manômetro, um medidor de fluxo, um aparelho de esterilização, um filtro de esterilização, e similares.

[036] Uma unidade de controle de diferença de pressão (7) pode detectar uma diferença de pressão de transmembrana (TPD) do módulo de membrana de separação (2). Em outras palavras, essa detecta uma diferença de pressão entre o lado primário (o lado ao qual um meio de cultura é fornecido) e o lado secundário (o lado a partir do qual um permeado, ou seja, um filtrado é descarregado).

[037] O aparelho de fermentação contínua (100) possui ainda uma constituição envolvida na lavagem. A lavagem é um método de limpeza em que um gás é fornecido ao lado primário do módulo de membrana de separação e ao fazer uso de oscilação de um líquido e do gás que ocorre durante a passagem do gás através do módulo de membrana de separação,

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 23/106

15/84 substâncias fixadas na superfície da membrana de separação são removidas dessa.

[038] No aparelho de fermentação contínua (100), particularmente o módulo de membrana de separação (2) é fornecido com um gás a partir de pelo menos uma entre a porção inferior do módulo de membrana de separação (2) e o tubo (81) que se comunica entre o fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2). Esse é equipado com, particularmente como a constituição referente à lavagem, uma fonte de fornecimento de gás, uma porta de fornecimento de gás, e um mecanismo capaz de regular uma taxa de fornecimento de um gás a partir da fonte de fornecimento de gás.

[039] Mais especificamente, o aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com uma válvula de controle de fornecimento de gás de módulo (15), um aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16), uma válvula de controle de fornecimento de gás de tubo (17), um aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), uma válvula de controle de fornecimento de gás de tubo a montante da bomba (19), e um aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20).

[040] Será observado que pelo menos uma das fontes de fornecimento de gás é necessária entre o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), e o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20). Isso significa que as respectivas constituições com apenas um, apenas dois, e todos os três aparelhos de fornecimento de gás são adotadas na modalidade da presente invenção. A válvula de controle de fornecimento de gás de módulo (15), a válvula de controle de fornecimento de gás de tubo (17), e a válvula de controle de fornecimento de gás de tubo a montante da bomba (19) são elementos emparelhados com o aparelho de fornecimento de gás de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 24/106

16/84 lavagem de módulo (16), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), e o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20), respectivamente.

[041] O aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16) é conectado ao lado primário da membrana de separação do módulo de membrana de separação (2), ou seja, no lado ao qual um meio de cultura é fornecido, através de um tubo (86). O tubo (86) é um tubo diferente do tubo (81) através do qual um meio de cultura é fornecido ao módulo de membrana de separação (2). Isso significa que o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16) é diretamente conectado ao módulo de membrana de separação (2) através de uma passagem diferente da rota de fornecimento de um meio de cultura. Ademais, o tubo (86) é conectado à porção inferior do módulo de membrana de separação (2). O termo porção inferior como usado aqui pode significar a porção inferior do módulo de membrana de separação ou uma porção do módulo de membrana de separação dentro de 1/3 da altura a partir da superfície inferior. Através do tubo (86), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16) pode alimentar um gás a partir da porção inferior do módulo de membrana de separação (2). A válvula de controle de fornecimento de gás de módulo (15) é colocada no tubo (86) e pode regular uma quantidade de fornecimento de gás ao abrir ou fechar a válvula.

[042] O aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18) é conectado, a jusante da bomba de circulação (8), conectado ao tubo (81) através de um tubo (87). A válvula de controle de fornecimento de gás de tubo (17) é fornecida sobre o tubo (87) e pode regular uma quantidade de fornecimento de gás ao abrir ou fechar a válvula. O aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18) fornece um gás do tubo (81) que se comunica entre o fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2). Quando o tubo (81) for conectado à porção superior do módulo de membrana de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 25/106

17/84 separação (2), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18) pode fornecer um gás a partir da porção superior do módulo de membrana de separação (2).

[043] O aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20) é conectado ao tubo (81) através de um tubo (88) a montante da bomba de circulação (8). A válvula de controle de fornecimento de gás de tubo a montante da bomba (19) é fornecida sobre o tubo (88) e pode regular uma quantidade de fornecimento de gás ao abrir ou fechar a válvula. O aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20) fornece um gás a partir da porção inferior do módulo de membrana de separação (2) e ao mesmo tempo, fornece um gás a partir do tubo (81) que se comunica entre o fermentador (1) e o módulo de membrana de separação (2). Quando o tubo (81) for conectado à porção superior do módulo de membrana de separação (2), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20) pode fornecer um gás a partir da porção superior do módulo de membrana de separação (2).

[044] Os tubos (86) a (88) podem ser equipados com um aparelho de esterilização ou um filtro de esterilização para impedir que microrganismos indesejados entrem no fermentador (1).

[045] O termo porta de fornecimento de gás como usado aqui significa uma porção a partir da qual um gás é liberado em um meio de cultura ou um líquido. A porta de fornecimento de gás é, de preferência, constituída para permitir a geração de bolhas capazes de limpar a membrana superfície. As bolhas geradas podem ser bolhas finas ou bolhas ásperas. O tamanho das bolhas é alterado ao alterar o formato da porta de fornecimento de gás, dependendo do tipo da membrana de separação ou condições como quantidade de difusão de gás. A porta de fornecimento de gás pode ser formada ao fornecer um tubo feito de cloreto de polivinila ou aço inoxidável com

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 26/106

18/84 um furo de descarga de ar ou um tubo difusor que utiliza uma borracha porosa, cerâmica, ou membrana pode ser usada. O tamanho da porta de fornecimento de gás não é limitado desde que a mesma possa fornecer uma quantidade especificada de um gás ao mesmo tempo, seja grande o suficiente para não causar obstrução com um líquido de fermentação. A porta de fornecimento de gás pode ser equipada com um filtro de esterilização para impedir que microrganismos indesejados entrem no sistema de fermentação.

[046] Na Figura 1, a porta de fornecimento de gás é fornecida na porção de extremidade, de duas porções de extremidade de cada um dos tubos (86) a (88), no lado próximo ao módulo de membrana de separação (2). Em outras palavras, os tubos (86) a (88) são tubos que se conectam a partir da fonte de fornecimento de gás à porta de fornecimento de gás.

[047] Assim, na Figura 1, a porta de fornecimento de gás pode ser fornecida na porção inferior do módulo de membrana de separação. Na constituição de fornecer um meio de cultura a partir do fermentador ao módulo de membrana de separação através de uma bomba, esse pode ser fornecido entre o fermentador e a bomba ou entre a bomba e o módulo de membrana de separação.

[048] Como um exemplo de um mecanismo que mede uma velocidade linear de um gás fornecido por lavagem, os medidores de fluxo (91), (92), e (93) são mostrados na Figura 1. O medidor de fluxo (91) fica disposto no tubo (86) e pode medir a taxa de fluxo de um gás que passa no tubo (86). O medidor de fluxo (91) é utilizado para a medida da velocidade linear de um gás fornecido pelo aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16). O medidor de fluxo (92) fica disposto no tubo (87) e pode medir a taxa de fluxo de um gás que passa no tubo (87). O medidor de fluxo (92) é utilizado para a medida da velocidade linear de um gás fornecido a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18). O medidor de fluxo (93) fica

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 27/106

19/84 disposto no tubo (88) e pode medir a taxa de fluxo de um gás que passa no tubo (88). O medidor de fluxo (93) é utilizado para a medida da velocidade linear de um gás fornecido pelo aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20).

2. Módulo de membrana de separação [049] O módulo de membrana de separação inclui uma membrana de separação e um invólucro para alojar a membrana de separação nesse.

[050] A membrana de separação que será usada para o módulo de membrana de separação pode ser uma membrana orgânica ou uma membrana inorgânica. A membrana de separação não é limitada desde que essa seja uma membrana usável para a filtração de um meio de cultura e possua durabilidade contra limpeza com um gás. Exemplos da membrana de separação incluem membranas feitas de fluoreto de polivinilideno, polissulfona, polietersulfona, politetrafluoroetileno, polietileno, polipropileno, e cerâmica. Entre esses, as membranas de separação feitas de fluoreto de polivinilideno são particularmente preferidas, pois essas são resistentes à incrustação com um líquido de fermentação, podem ser facilmente limpas, e são excelentes em durabilidade contra limpeza com um gás.

[051] A membrana de separação é, de preferência, uma película porosa que possui poros com um tamanho de poro médio de 0,001 pm ou maior, porém menor que 10 pm para separar efetivamente as células no líquido de fermentação. A membrana de separação pode possuir qualquer formato e cada uma entre a membrana de folha plana ou uma membrana de fibra oca pode ser usada, porém prefere-se a membrana de fibra oca que possui uma grande área de membrana relativa ao volume do módulo. O tamanho de poro médio da membrana é determinado de acordo com o método descrito em ASTM: F316-86 (outro nome: método semi-seco). O que é determinado por

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 28/106

20/84 esse método semi-seco é o tamanho de poro médio de uma camada de poro mínima de uma membrana.

[052] A seguinte descrição consiste em condições de medida padrão de um tamanho de poro médio quando o método semi-seco for usado.

Líquido usado: etanol

Temperatura de medida: 25°C

Taxa de elevação de pressão: 1 kPa/seg [053] O tamanho de poro médio [pm] é determinado a partir da seguinte equação:

Tamanho de poro médio [pm] = (2860 x tensão superficial [mN/m])/pressão de ar semi-seco [Pa] [054] A tensão superficial a 25°C de etanol é 21,97 mN/m (The Chemical Society of Japan, Kagaku Binran Kisohen Kaitei 3rd Edition, p. 11-82, Maruzen, 1984) de modo que as condições de medida padrão da presente invenção, o tamanho de poro médio possam ser determinados a partir da seguinte equação:

Tamanho de poro médio [gm] = 62834.2/(pressão de ar semi-seco [Pa]).

[055] O diâmetro externo de uma membrana de fibra oca tipo pressão externa é, de preferência, 0,5 mm a 3 mm. Quando o diâmetro externo for 0,5 mm ou maior, a resistência do filtrado que flui na membrana de fibra oca pode ser suprimida em um nível relativamente baixo. Quando o diâmetro externo for 3 mm ou menor, por outro lado, a membrana de fibra oca pode ser impedida de ser deformada pela pressão externa devido ao líquido ou gás de fermentação.

[056] O diâmetro interno de uma membrana de fibra oca tipo pressão interna é, de preferência, 0,5 mm a 3 mm. Quando o diâmetro interno for 0,5 mm ou maior, a resistência de um líquido de fermentação que flui na

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 29/106

21/84 membrana de fibra oca pode ser suprimida em um nível relativamente baixo. Quando o diâmetro interno for 3 mm ou menor, por outro lado, um aumento no número de módulos usados pode ser suprimido devido ao fato de uma área de superfície de membrana poder ser garantida.

[057] O invólucro do módulo de membrana de separação é feito de um material excelente em resistência à pressão e o formato desse não é limitado desde que permita o fornecimento de um líquido de fermentação ao lado primário do módulo. Exemplos incluem um formato cilíndrico e formato colunar poligonal. Em consideração do fluxo do líquido de fermentação e propriedade de manuseio, o invólucro possui, de preferência, um formato cilíndrico.

3. Método de produção de produto químico [058] O método de produção de acordo com a presente modalidade é um método para produzir um produto químico através de fermentação contínua e possui as seguintes etapas (a) a (d):

(a) cultivar as células em um meio de cultura em um fermentador para fermentar uma matéria-prima de modo a preparar um produto químico;

(c) separar um permeado contendo o produto químico do meio de cultura enquanto retém um líquido não permeado no fermentador, e (d) fornecer um gás a partir de pelo menos um entre uma porção inferior do módulo de membrana de separação e um tubo que se comunica entre o fermentador e o módulo de membrana de separação para ajustar uma velocidade linear do gás no módulo de membrana de separação para 0,15 cm/s a 70 cm/s enquanto fornece o módulo de membrana de separação com um líquido.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 30/106

22/84 [059] Uma descrição será feita a seguir sobre cada etapa. Será observado que as etapas (a) a (c) podem ser denominadas etapas de cultura de célula contínua ou etapas de fermentação contínua.

3-1. (a) Etapa de preparação de produto químico [Células] [060] As células como usado aqui consistem em um conceito que inclui microrganismos, células cultivadas, células eucarióticas, e células procarióticas. Exemplos dos microrganismos incluem levedura popularmente usada na indústria de fermentação como levedura de panificação; microrganismos como Escherichia colt, microrganismos de ácido láctico, e microrganismos corineformes; microrganismos filamentosos; e actinomiceto. As células cultivadas são células derivadas de organismos multicelulares e exemplos dessas incluem células animais e células de insetos. As células que serão usadas para a produção de um produto químico podem ser aquelas isoladas de um ambiente natural ou aquelas que possuem algumas propriedades alteradas por mutação ou recombinação de gene.

[061] As células eucarióticas possuem uma estrutura denominada núcleo celular (núcleo) e claramente discriminadas de organismos procarióticos que não possuem núcleo celular (que será denominado mais adiante simplesmente núcleo). Para a produção de um produto químico, as leveduras são, de preferência, usadas entre células eucarióticas. Exemplos das leveduras adequadas para a produção de um produto químico incluem leveduras pertencentes ao Gênero Saccharomyces e leveduras pertencentes a Saccharomyces cerevisiae.

[062] As células procarióticas não possuem uma estrutura denominada núcleo celular (núcleo) e são claramente discriminadas de células eucarióticas que possuem um núcleo celular (núcleo). Para a produção de um produto químico, os microrganismos de ácido láctico são preferidos

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 31/106

23/84 entre as células procarióticas.

[063] As células são selecionadas dependendo de um produto químico que será preparado, matéria-prima, condições de cultura, e similares.

[064] Exemplos de células que produzem L-aminoácidos incluem microrganismos popularmente usados na indústria de fermentação como Escherichia colt e microrganismos corineformes.

[065] Mais especificamente, exemplos de L-treonina que produzem microrganismos incluem microrganismos pertencentes ao Gênero Escherichia, Gênero Providencia, Gênero Corynebacterium, Gênero Brevibacterium, e Gênero Serratia. Entre esses, Escherichia coli, Providencia rettgeri, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Serratia marcescens são particularmente preferidos.

[066] Exemplos dos microrganismos que produzem L-lisina incluem microrganismos pertencentes ao Gênero Escherichia, Gênero Corynebacterium, e Gênero Brevibacterium. Entre esses, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, e Brevibacterium lactofermentum são particularmente preferidos.

[067] Como microrganismos que produzem ácido L-glutâmico, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, e Brevibacterium lactofermentum são preferidos.

[068] Exemplos de microrganismos que produzem L-triptofano incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, e Escherichia coli.

[069] Exemplos de microrganismos que produzem L-isoleucina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum e Serratia marcescens.

[070] Exemplos de microrganismos que produzem L-glutamina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 32/106

24/84 lactofermentum, e Flavobacterium rigense.

[071] Exemplos de microrganismos que produzem L-arginina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Serratia marcescens, Escherichia coli, e Bacillus subtilis.

[072] Exemplos de microrganismos que produzem L-alanina incluem Brevibacterium flavum e Arthrobacter oxydans.

[073] Exemplos de microrganismos que produzem L-histidina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium ammoniagenes, Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus subtilis, e Streptomyces coelicolor.

[074] Exemplos de microrganismos que produzem L-prolina incluem Corynebacterium glutamicum, Kurthia catenaforma, Serratia marcescens, e Escherichia coli.

[075] Exemplos de microrganismos que produzem L-fenilalanina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Escherichia coll.

[076] Exemplos de microrganismos que produzem ácido Laspártico incluem Brevibacterium flavum, Bacillus megatherium, Escherichia coli, e Pseudomonas fluorescens.

[077] Exemplos de microrganismos que produzem L-tirosina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Escherichia coli.

[078] Como microrganismos que produzem L-metionina, Corynebacterium glutamicum é preferido.

[079] Exemplos de microrganismos que produzem serina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Arthrobacter oxydans.

[080] Exemplos de microrganismos que produzem L-serina

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 33/106

25/84 incluem Corynebacterium acetoacidophilum e Brevibacterium lactofermentum.

[081] Exemplos de microrganismos que produzem L-valina incluem Brevibacterium lactofermentum, Serratia marcescens, e Klebsiella pneumoniae.

[082] Exemplos de microrganismos que produzem L-leucina incluem Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium lactofermentum, e Serratia marcescens.

[083] Os microrganismos que possuem capacidade de produção de um L-aminoácido podem ser isolados do ambiente natural ou possuem algumas propriedades modificadas por mutação ou recombinação genética. Exemplos incluem Providencia rettgeri que possuem produtividade de Ltreonina aprimorada, descritos em JP-A-2-219582 e Corynebacterium glutamicum que possuem produtividade de L-alanina aprimorada, descritos em JP-T-3-500486.

[084] A separação e purificação de um L-aminoácido contido em um meio de cultura podem ser realizadas utilizando métodos convencionalmente conhecidos como filtração, concentração, destilação, e cristalização em combinação.

[085] Para a produção de ácido láctico, a levedura é preferida como a célula eucariótica e microrganismos de ácido láctico são preferidos como a célula procariótica. Entre esses, prefere-se a levedura obtida ao introduzir um gene que codifica lactato desidrogenase em células. Em particular, microrganismos de ácido láctico que mostram, de preferência, um rendimento, em relação ao consumo de glicose, de 50% ou mais, com mais preferência, um rendimento, relativo e ao consumo de glicose, de 80% ou mais são preferidos. O termo rendimento relativo ao consumo de glicose significa uma razão (razão de peso) da quantidade de produção de ácido láctico em relação à quantidade de glicose consumida.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 34/106

26/84 [086] Exemplos de microrganismos de ácido láctico incluem cepas de ocorrência natural que possuem a capacidade de sintetizar ácido láctico como microrganismos pertencentes ao Gênero Lactobacillus, Gênero Bacillus, Gênero Pediococcus, Gênero Tetragenococcus, Gênero Carnobacterium, Gênero Vagococcus, Gênero Leuconostoc, Gênero Oenococcus, Gênero Atopobium, Gênero Streptococcus, Gênero Enterococcus, Gênero Lactococcus, e Gênero Sporolactobacillus.

[087] Os microrganismos de ácido láctico que possuem um alto rendimento de ácido láctico em relação ao consumo de glicose ou microrganismos de ácido láctico capazes de fornecer ácido láctico com alta pureza óptica podem ser selecionados e usados. Exemplos de microrganismos de ácido láctico que possuem a capacidade de produzir ácido D-láctico incluem seletivamente microrganismos que produzem ácido D-láctico pertencentes ao Gênero Sporolactobacillus. Exemplos específicos preferidos incluem Sporolactobacillus laevolacticus e Sporolactobacillus inulinus. Exemplos mais preferidos incluem Sporolactobacillus laevolacticus AT 23492, ATCC 23493, ATCC 23494, ATCC23495, ATCC 23496, ATCC 223549, IAM12326, IAM12327, IAM 12328, IAM 12329, IAM 12330, IAM 12331, IAM 12379, DSM 2315, DSM 6477, DSM 6510, DSM 6511, DSM 6763, DSM 6764, and DSM 6771 e Sporolactobacillus inulinus JCM 6014.

[088] Exemplos de microrganismos de ácido láctico que possuem um alto rendimento de ácido L-láctico em relação ao consumo de glicose incluem Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus animalis, Lactobacillus agilis, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sharpeae, Pediococcus dextrinicus, e Lactococcus lactic. Esses microrganismos podem ser selecionados e usados para produzir ácido L-láctico.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 35/106

27/84 [089] Para a produção de ácido D-láctico, as células do tipo ocorrência natural que possuem atividade enzimática reforçada de D-lactato desidrogenase (que pode ser denominada mais adiante DLDH) também são, de preferência, usadas. Para aumentar a atividade enzimática, uma mutagênese química convencionalmente conhecida também pode ser empregada. A atividade enzimática de D-lactato desidrogenase também pode ser aumentada ao incorporar, em células, um gene que codifica D-lactato desidrogenase. Isso significa que as células recombinantes também são, de preferência, usadas para a produção de um produto químico.

[090] Quando o ácido D-láctico for produzido utilizando células recombinantes, microrganismos de Escherichia coli e ácido láctico são preferidos como células procarióticas, enquanto as leveduras são preferidas como células eucarióticas. Entre essas, as leveduras são particularmente preferidas.

[091] Assim como um gene que codifica D-lactato desidrogenase, os genes derivados a partir de Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, e Bacillus laevolacticus são preferenciais, sendo que os genes derivados a partir de Bacillus laevolacticus são mais preferenciais.

[092] Quando ácido L-láctico é produzido, podem-se usar as células artificialmente transmitidas com a capacidade de produção de ácido láctico ou as células tendo uma capacidade de produção de ácido láctico artificialmente imposta. Por exemplo, as células transmitidas com a capacidade de produção de ácido L-láctico ou tendo uma capacidade de produção de ácido L-láctico imposta podem ser obtidas introduzindo-se um gene de L-lactato desidrogenase (que pode ser denominado nas partes que se seguem como “LLDH”) em células. Assim com um método de transmitir células com uma capacidade de produção de ácido L-láctico ou impor estar capacidade, pode-se usar um método convencionalmente conhecido de mutagênese química. As

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 36/106

28/84 células com uma capacidade de produção de ácido L-láctico imposta também podem ser obtidas incorporando-se L-LDH nas células. Isto significa que as células recombinantes são preferencialmente usadas.

[093] Quando ácido L-láctico for produzido utilizando-se células recombinantes, as células procarióticas, tal como Escherichia coli e microrganismos de ácido láctico e as células eucarióticas, tais como leveduras são preferenciais como células hospedeiras, sendo que as leveduras são particularmente preferenciais. Dentre as leveduras, aquelas pertencentes ao gênero Saccharomyces são preferenciais, com Saccharomyces cerevisiae sendo mais preferencial.

[094] A sequência de L-LDH não é limitada a uma sequência específica desde que ela codifique uma proteína tendo atividade de converter dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzido (NADH) e ácido pirúvico em dinucleotídeo de nicotinamida e adenina oxidado (NAD+) e em ácido L-láctico, respectivamente. Por exemplo, assim como L-LDH, um gene derivado a partir de microrganismos de ácido láctico tendo um alto teor de leveduras em relação ao consumo de glicose, pode-se usar um gene derivado a partir de mamíferos, ou um gene derivado a partir de rãs. Assim como o gene derivado a partir de mamíferos, o L-LDH derivado a partir de Homo sapiens é preferencial. Assim como um gene derivado de rãs, o L-LDH derivado a partir de uma rã pertencente à família Pipidae é particularmente preferencial. Ademais, o L-LDH derivado a partir de Xenopus laevis, dentre as rãs pertencentes à família Pipidae, é preferencialmente usado.

[095] O L-LDH derivado a partir de seres humanos ou rãs inclui genes tipo mutante, tais como os genes geneticamente polimórficos e genes mutagênicos. O termo “genes geneticamente polimórficos” significa genes tendo uma sequência de base parcialmente alterada devido à mutagênese natural nos genes. O termo “genes mutagênicos” significa genes tendo uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 37/106

29/84 mutação introduzida artificialmente. A mutagênese pode ser obtida, por exemplo, através de um método que usa um kit para introduzir mutagênese sítio-específica (Mutan-K (produto de Takara Bio)) ou através de um método que usa um kit para introduzir mutagênese aleatória (BD Diversify PCR Random Mutagenesis (produto de CLONTECH)). O L-LDH derivado a partir de seres humanos ou rãs tem uma deleção ou inserção em uma parte da sequência de base do mesmo desde que codifique uma proteína tendo uma atividade de converter NADH e ácido pirúvico em NAD+ e ácido L-láctico, respectivamente.

[096] A seguir, fornece-se uma descrição sobre a produção de ácido pirúvico. Exemplos de células que produzem ácido pirúvico incluem microrganismos pertencentes ao gênero Pseudomonas, ao gênero Corynebacterium, ao gênero Escherichia, e ao gênero Acinetobacter. Microrganismos como Pseudomonas fuluorescens, Pseudomonas aeruginosa, e Escherichia coli são mais preferenciais. Microrganismos tendo propriedades parcialmente modificadas por mutação ou recombinação genética também podem ser usados. Por exemplo, microrganismos obtidos por mutação ou deleção de um gene ATPase envolvido diretamente na produção de ATP por fosforilação oxidativa também são preferencialmente usados.

[097] Bolores e leveduras também são preferenciais. Exemplos incluem bolores e leveduras pertencentes ao gênero Saccharomyces, ao gênero Toluropusis, ao gênero Candida, e ao gênero Schizophyllum. Com mais preferência, bolores e leveduras pertencentes a Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces copsis, Candida glabrata, Candida lipolytica, Toluropusis glabrata, e Schizophyllum commune podem ser usados para produzir ácido pirúvico.

[098] A separação e purificação do ácido pirúvico contido em um meio de cultura podem ser conduzidas por um método que usa filtração e uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 38/106

30/84 coluna de troca de aniônica. Por exemplo, um método de purificação que usa um trocador de íons fracamente básicos descrito em JP-A-6-345683 pode ser preferencialmente usado.

[099] Proporciona-se uma descrição sobre a produção de ácido succínico. Assim como as células produtoras de ácido succínico, por exemplo, os microrganismos pertencentes ao gênero Anaerobiospirillum e ao gênero Actinobacillus podem ser preferencialmente usados. Exemplos específicos destes incluem Anaerobiospirillum succiniciproducens descrito na Patente US No. 5.143.833 e Actinobacillus succinogenes descrito por James B. Mckinlay, et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 71, 6651-6656 (2005)). Além disso, microrganismos corineformes tais como aqueles pertencentes ao gênero Corynebacterium e ao gênero Brevibacterium e Escherichia Cali também podem ser usados. Dentre os microrganismos corineformes, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, e Brevibacterium lactofermentum são preferenciais.

[0100] A produtividade de ácido succínico pode ser aperfeiçoada utilizando-se microrganismos tendo uma capacidade de produção de ácido succínico aperfeiçoada por recombinação genética. Exemplos desses microrganismos incluem Brevibacterium flavum MJ233AB-41 deficiente de lactato desidrogenase (FERM BP-1498) descrito em JP-A-2005-27533, Corynebacterium glutamicum, e cepas de Escherichia coli AFP111 que são desprovidas de piruvato formato liase e deficiente de lactato desidrogenase, descritas na Patente US No. 5.770.435.

[0101] A seguir, proporciona-se uma descrição sobre a produção de ácido itacônico. Como células utilizáveis para produção de ácido itacônico, por exemplo, bolores e leveduras são preferencialmente usados. Os bolores pertencentes ao gênero Aspergillus ou ao gênero Ustilago ou leveduras pertencentes ao gênero Candida ou ao gênero Rhodotorula são mais

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 39/106

31/84 preferenciais. Dentre estes, os bolores como Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus, Ustilago maydis, Ustilago cynodontis, e Ustilago rabenhorstina, e Candia Antarctica podem ser preferencialmente usados na produção de ácido itacônico.

[0102] A seguir, proporciona-se uma descrição sobre a produção de cadaverina. Como células utilizáveis para a produção de cadaverina, os microrganismos tendo uma capacidade enzimática acentuada de uma lisina descarboxilase e/ou de um antiportador de lisina cadaverina são preferenciais, dentre estes, os microrganismos recombinantes tendo, incorporados neles, um gene que codifica lisina descarboxilase e/ou um antiportador de lisina cadaverina são mais preferenciais e os microrganismos recombinantes tendo, incorporados neles, um ou mais genes que codificam lisina descarboxilase são ainda mais preferenciais.

[0103] Quando cadaverina é produzida, os microrganismos recombinantes preferenciais são microrganismos de Escherichia coli e corineformes, com mais preferência, microrganismos corineformes tendo uma atividade de lisina descarboxilase e tendo pelo menos uma propriedade selecionada a partir de auxotrofia à homoserina e resistência a S-(2-aminoetil)L-cisteina. Os microrganismos mais preferenciais são aqueles deficientes em atividade de homoserina desidrogenase, com ainda mais preferência, aqueles que se tornam deficientes em atividade de homoserina desidrogenase devido à mutação com um gene inserido. Além disso, gênero de microrganismos corineformes é, de preferência, pelo menos um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em gênero Corynebacuterium e gênero Brevibacterium, com Corynebacuterium gulutamicum sendo ainda mais preferencial.

[Meio] [0104] O termo “matéria-prima de fermentação” (nas partes que se seguem simplesmente denominado como “matéria-prima”) significa uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 40/106

32/84 substância a partir da qual um produto químico pretendido é obtido através de fermentação. A matéria-prima pode ser alterada dependendo das células, das conduções de cultura, e do produto químico pretendido.

[0105] O meio a ser usado para cultura contém, assim como a matéria-prima, componentes capazes de acelerar o crescimento de células para produzir consistentemente um produto químico que seja um produto de fermentação pretendido. Conforme o uso em questão, o termo “meio” significa um meio líquido exceto onde especificamente indicado em contrário. O meio contém, por exemplo, uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e sais inorgânicos, e de acordo com a necessidade, aminoácidos e nutrientes com traço orgânico, tais como vitaminas.

[0106] Exemplos da fonte de carbono incluem açúcares, tais como glicose, sacarose, frutose, galactose e lactose; amidos contendo esses açúcares, hidrolisatos de amido, melaços de batata-doce, melaço de beterraba sacarina, e caldo de cana; extratos ou concentrados de melaço de beterraba sacarina ou caldo de cana; xaropes (melaço Hi Test); açúcares de matériaprima obtidos purificando-se ou cristalizando-se o melaço de beterraba sacarina ou o caldo de cana; açúcares purificados obtidos purificando-se ou cristalizando-se o melaço de beterraba sacarina ou o caldo de cana; ácidos orgânicos, como ácido acético e ácido fumárico; álcoois, como etanol; e glicerina. Conforme o uso em questão, o termo “açúcares” significa carboidratos que são os primeiros produtos de oxidação de álcoois polivalentes, têm um grupo aldeído ou um grupo cetona, e são classificados em aldoses, ou seja, açúcares contendo aldeídos e cetoses, ou seja, açúcares contendo cetonas.

[0107] Exemplos da fonte de nitrogênio incluem gás amônia, água de amônia, sais de amônia, ureia, nitratos, e outras fontes de nitrogênio orgânicas a serem usadas de modo auxiliar, por exemplo, tortas de óleo,

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 41/106

33/84 hidrolisatos de soja, hidrolisatos de caseína, outros aminoácidos, vitaminas, licor de maceração de milho, leveduras ou extratos de levedura, extratos de carne, peptídeos, como peptona, e várias células fermentadas e hidrolisatos destas.

[0108] Como os sais inorgânicos, fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês, e similares podem ser usados conforme a necessidade.

[Meio de Cultura] [0109] Um meio de cultura contém um meio e células submetidas à cultura no mesmo e também podem conter um produto químico produzido como resultado da cultura.

[0110] O filtrado obtido utilizando-se o módulo de membrana de separação substancialmente não contém células, mas, por motivos de conveniência de descrição, o filtrado também pode ser denominado como “meio de cultura”.

[Cultura] [0111] No aparelho de fermentação contínua (100), conduz-se uma cultura contínua extraindo-se um meio de cultura a partir do fermentador (1) enquanto se introduz uma matéria-prima de fermentação no fermentador (1).

[0112] Após uma cultura em lotes ou uma cultura por lotes descontínuos alimentados ser conduzida no estágio inicial de cultura para aumentar a concentração celular, pode-se iniciar a cultura contínua. Neste momento, as células podem ser extraídas conforme a necessidade. Na produção de um produto químico, aos o aumento na concentração celular, as células altamente concentradas são inoculadas e a cultura contínua pode ser conduzida junto ao início de cultura.

[0113] Proporciona-se uma descrição sobre a introdução da

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 42/106

34/84 matéria-prima. Na Figura 1, devido à operação da bomba de fornecimento de meio (9) durante a cultura, um meio é introduzido no fermentador (1) e, como resultado, introduz-se a matéria-prima.

[0114] Embora a cultura seja conduzida, a introdução da matériaprima pode ser continuada sem encerrá-la ou a introdução da matéria-prima e o encerramento desta podem ser comutadas dependendo da situação. Por exemplo, conforme descrito anteriormente, a iniciação e o encerramento da introdução de um meio podem ser conduzidos com base nos resultados de detecção do sensor de nível (61) ou podem ser conduzidas em intervalos de tempo regulares com base nos resultados de medição utilizando-se um temporizador, que não é ilustrado. Ambas as introduções automáticas e manuais da matéria-prima estão incluídas no escopo técnico da presente invenção.

[0115] A seguir, proporciona-se uma descrição sobre a extração de um meio de cultura. Com a finalidade de se obter uma produtividade eficiente, a concentração de células em um meio de cultura é preferencialmente mantida alta até o ponto em que o ambiente do meio de cultura se torne inapropriado para a proliferação de microrganismos ou células cultivadas para aumentar a proporção que leva à morte.

[0116] No aparelho de fermentação contínua (100), pode-se conduzir uma cultura contínua enquanto se extrai um meio de cultura para recuperar um produto químico utilizando-se um sistema de circulação e mantendo-se a concentração de células alta. A extração de um meio de cultura utilizando-se um sistema de circulação será descrita mais adiante em detalhes.

[0117] Uma passagem para extração, assim como o tubo (81) conectado ao módulo de membrana de separação (2) podem ser conectado ao fermentador (1) e a extração de um meio de cultura pode ser conduzida por meio desta passagem para extração. Neste momento, não somente uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 43/106

35/84 porção líquida do meio de cultura, mas também as células podem ser extraídas.

[0118] Durante a cultura, células frescas podem ser introduzidas no fermentador (1). As células podem ser introduzidas seja manual ou automaticamente.

[0119] No fermentador, o suprimento de matéria-prima e a iniciação da extração do meio de cultura podem não ser necessariamente conduzidos simultaneamente. O suprimento de matéria-prima e a extração de um meio de cultura podem ser conduzidos sucessiva ou intermitentemente.

[0120] Por motivos de conveniência administrativa, é geralmente preferencial conduzir uma operação de cultura contínua em um único fermentador. No entanto, o número de fermentadores não é limitado enquanto o método empregado for um método de cultura de fermentação contínua no qual um produto é formado durante a proliferação de células. Pode-se usar uma pluralidade de fermentadores quando o fermentador tiver uma capacidade pequena. Neste caso, pode-se atingir uma alta produtividade mesmo conduzindo-se uma cultura contínua em uma pluralidade de fermentadores conectados em paralelo ou em série através de tubos.

[0121] No aparelho de fermentação contínua (100) mostrado na Figura 1, um meio de cultura no aparelho de fermentação (1) é agitado por um aparelho de agitação (4) e as condições adequadas para fermentação são mantidas pela unidade de controle de temperatura (3), pela unidade de controle de pH (5), pela unidade de controle de nível (6), pelo aparelho de fornecimento de gás de fermentador (21), e similares.

[0122] A cultura de células pode ser geralmente conduzida em pH de 3 a 10 e em uma temperatura de 15°C a 65°C. O pH do meio de cultura é ajustado dentro de uma faixa predeterminada na faixa supramencionada com um ácido inorgânico ou orgânico ou uma substância alcalina, ou, além disso,

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 44/106

36/84 com ureia, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, gás amônia, ou similares. No aparelho de fermentação contínua (100), sob o controle do aparelho de controle (28), o pH é automaticamente controlado pela unidade de controle de pH (5), enquanto a temperatura é automaticamente controlada pela unidade de controle de temperatura (3).

3-2. Etapa de filtração etapa (b) de meio de cultura [0123] Uma etapa de filtração permite uma recuperação contínua de um produto químico a partir de um meio de cultura e também a continuação da cultura. De modo mais específico, na Figura 1, um meio de cultura é extraído a partir do fermentador (1) por meio da bomba de circulação (8), flui através do tubo (81), e é fornecido ao módulo de membrana de separação (2). O meio de cultura é separado em um concentrado e em um permeado pelo módulo de membrana de separação (2).

[0124] A bomba (8) mostrada na Figura 1 corresponde a uma bomba de circulação de fluxo cruzado e a filtração de fluxo cruzado é conduzida no módulo de membrana de separação (2). A presente invenção não se limita a isto e a filtração convencional pode ser usada como um método de filtração de membrana. No entanto, na operação de fermentação contínua, uma grande quantidade de incrustações de tais microrganismos é fixada à membrana de modo que a filtração de fluxo cruzado seja preferencial com a finalidade de remover efetivamente essas incrustações. Quando uma filtração de fluxo cruzado for empregada, as incrustações podem ser removidas fazendo-se uso de uma força de cisalhamento do meio de cultura. Uma eficiência de limpeza maior pode ser alcançada utilizando-se a filtração de fluxo cruzado e lavagem em combinação.

[0125] Uma força impulsora de filtração pode ser obtida utilizando-se um sifão que faz uso de uma diferença de nível (diferença de cabeça de água) entre o fermentador e o módulo de membrana de separação

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 45/106

37/84 ou obtida utilizando-se uma diferença de pressão de transmembrana que ocorre pela bomba de circulação de fluxo cruzado. Como a força impulsora de filtração, uma bomba de sucção pode ser disposta no lado do filtrado do módulo de membrana de separação. Na modalidade mostrada na Figura 1, a bomba de filtração (11) corresponde a uma bomba de sucção.

[0126] Quando a bomba de circulação de fluxo cruzado for usada, uma diferença de pressão de transmembrana pode ser controlada pela pressão de uma bomba de sucção. A diferença de pressão de transmembrana também pode ser controlada pela pressão de um gás ou líquido a serem introduzidos ao lado primário do módulo de membrana de separação. Uma diferença entre a pressão sobre o lado primário do módulo de membrana de separação e a pressão sobre o lado de filtrado é detectada como a diferença de pressão de transmembrana e com base nesta diferença de pressão de transmembrana, pode-se conduzir o controle da bomba, e similares.

[0127] Na constituição da Figura 1, um meio de cultura é fornecido a partir do fermentador (1) ao módulo de membrana de separação (2) por meio da bomba de circulação (8). A operação da bomba de circulação (8) e da bomba de filtração (11) é controlada dependendo da diferença de pressão de transmembrana detectada pela unidade de controle de diferença de pressão (7) e, como resultado, uma quantidade de um meio de cultura a ser fornecida ao módulo de membrana de separação (2) é regulada de modo apropriado.

[0128] A filtração pode ser conduzida seja continua ou intermitentemente. Quando a filtração for conduzida intermitentemente, a filtração pode ser encerrada durante um tempo predeterminado (por exemplo, de 0,1 a 10 minutos) sempre que a filtração for conduzida continuamente, por exemplo, de 5 a 120 minutos. Com mais preferência, a filtração é encerrada de 0,25 a 3 minutos sempre que a filtração for contínua durante 5 a 10 minutos.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 46/106

38/84

Conforme será descrito mais adiante, a lavagem pode ser conduzida seja durante o encerramento da filtração ou durante a filtração.

3-3. Etapa de separação e circulação (c) [0129] As células no meio de cultura não são permeadas através da membrana de separação de modo que o concentrado (líquido que permaneceu sem ser permeado através da membrana de separação) que passou através do módulo de membrana de separação (2) tenha uma concentração celular aumentada. Visto que o concentrado é retornado ao fermentador (1) por meio do tubo (82), as células ficam retidas no fermentador (1). O filtrado que passou através da membrana de separação do módulo de membrana de separação (2) é descarregado para fora do aparelho por meio do tubo (83).

[0130] Portanto, a concentração celular no fermentador (1) é mantida alta e um produto químico é separado do sistema de cultura continuamente.

3-4. Primeira etapa de fornecimento de gás (d) [0131] A primeira etapa de fornecimento de gás (d) é conduzida como uma limpeza por lavagem na constituição da Figura 1. Conforme descrito anteriormente, na constituição mostrada na Figura 1, um gás de lavagem é fornecido por meio de qualquer um ou mais entre o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), e o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20). Com o gás fornecido desta forma, as incrustações são removidas da membrana de separação no módulo de membrana de separação.

[0132] Quando uma lavagem for iniciada, pelo menos uma entre a válvula de controle de fornecimento de gás de módulo (15), a válvula de controle de fornecimento de gás de tubo (17), e a válvula de controle de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 47/106

39/84 fornecimento de gás de tubo a montante da bomba (19) é aberta seja pelo controle com o aparelho de controle (28) ou manualmente. Quando a lavagem for encerrada, estas válvulas são fechadas similarmente pelo controle com o aparelho de controle (28) ou manualmente.

[0133] Durante a lavagem, um líquido é fornecido ao módulo de membrana de separação. Pode-se produzir um efeito de alta limpeza pela combinação de um efeito de limpeza por lavagem e um efeito de limpeza pelo fluxo de líquido no módulo de membrana de separação.

[0134] Particularmente na constituição mostrada na Figura 1, um meio de cultura é fornecido a partir do fermentador (1) ao módulo de membrana de separação (2) durante a lavagem. De modo mais específico, enquanto um gás de lavagem é fornecido, a bomba de circulação (8) é operada. Neste momento, a bomba de filtração (11) pode ser encerrada e, ao mesmo tempo, a válvula de filtração (12) pode ser fechada. A filtração pode ser encerrada. Alternativamente, a bomba de filtração (11) pode ser operada e, ao mesmo tempo, a válvula de filtração (12) pode ser aberta.

[0135] Portanto, um efeito de alta limpeza pode ser produzido pela força de cisalhamento derivada a partir do fluxo de um meio de cultura e do efeito de limpeza por lavagem. Deve-se notar que o líquido fornecido ao módulo de membrana de separação no momento do fornecimento de gás não é limitado a um meio de cultura. Além do meio de cultura, por exemplo, pode-se usar um líquido que não inibe a fermentação, tal como um meio não contendo células.

[0136] Exemplos do gás utilizável para lavagem incluem um gás comprimido fornecido por meio de um cilindro de gás, soprador, compressor, ou tubo. Isto significa que, assim como o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16), o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), e o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 48/106

40/84 da bomba (20), um aparelho utilizável é aquele capaz de comprimir um gás enquanto fornece o gás em uma pressão predeterminada ou um tanque capaz de alojar um gás comprimido e fornecer o gás em uma pressão predeterminada.

[0137] Quando uma fermentação aeróbica for conduzida no fermentador (1), o gás fornecido por lavagem é, de preferência, um gás contendo oxigênio e pode ser oxigênio puro. A concentração de oxigênio pode ser regulada misturando-se um gás que não afeta adversamente a fermentação, como o ar, nitrogênio, dióxido de carbono, metano ou um gás misturado destes. Com a finalidade e aumentar uma taxa de fornecimento de oxigênio, um meio utilizável é aquele que mantém a concentração de oxigênio em 21% ou maior, adicionando-se oxigênio ao ar, aplicando-se uma pressão a um meio de cultura, elevando-se uma taxa de agitação, ou elevando-se uma taxa de aeração.

[0138] Por outro lado, quando uma fermentação anaeróbica for conduzida no fermentador (1) e se uma taxa de fornecimento de oxigênio precisar ser reduzida, também é possível fornecer uma mistura do ar com um gás isento de oxigênio, tal como dióxido de carbono, nitrogênio, metano, ou argônio.

[0139] A velocidade linear do gás a ser fornecido ao módulo de membrana de separação é uma quantidade de fornecimento do gás por área em corte transversal do módulo de membrana e é determinada de acordo com a equação (1) a seguir:

Velocidade linear do gás (m/s) = quantidade de fornecimento de gás (m³/s) x 100 - (área em corte transversal interna do módulo de membrana de separação (m²) x (100 - razão de preenchimento de membrana (%)) ... (1) [0140] Por exemplo, o módulo de membrana de separação é equipado com um recipiente cilíndrico tendo um raio interno R e (a) pedaços de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 49/106

41/84 membrana de fibra oca alojadas no recipiente e tendo um raio externo r, a área em corte transversal interna do módulo de membrana de separação é %R2, e a razão de preenchimento de membrana é representada por (axr² - R² x 100). A razão de preenchimento de membrana de um módulo de membrana plana também pode ser calculada com base na área em corte transversal de um recipiente (ou seja, uma área em corte transversal interna do módulo), na área em corte transversal da membrana plana, e no número de membranas planas.

[0141] No aparelho de controle (28) na constituição da Figura 1, a velocidade linear de um gás a ser fornecido ao módulo de membrana de separação (2) pode ser determinada invertendo-se a quantidade de fornecimento de gás medida no medidor de fluxo (91), (92), ou (93) na equação (1) anterior. O aparelho de controle (28) pode controlar a abertura ou o fechamento da válvula (15), (17), ou (19) de modo que a velocidade linear do gás se enquadre dentro da faixa descrita anteriormente.

[0142] Quando o gás de lavagem for fornecido apenas por meio do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16), a taxa de fornecimento de gás é regulada abrindo-se ou fechando-se a válvula (15) com base nos resultados de detecção do medidor de fluxo (91). Quando o gás for fornecido pelo aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18), a taxa de fornecimento de gás é regulada abrindo-se ou fechando-se a válvula (17) com base nos resultados de detecção do medidor de fluxo (92). Quando o gás for fornecido a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20), a taxa de fornecimento de gás é regulada abrindo-se ou fechando-se a válvula (19) com base nos resultados de detecção do medidor de fluxo (93).

[0143] A regulação da velocidade linear do gás pode ser automaticamente controlada usando-se o aparelho de controle (28) e uma

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 50/106

42/84 válvula automática ou pode ser manualmente controlada usando-se uma válvula manual.

[0144] Na velocidade linear do gás de 0,15 cm/s ou maior, a lavagem é eficaz e, também, a agitação de um meio de cultura, fornecimento de oxigênio, e similares, causados pelo fornecimento de gás são are eficazes. Conforme descrito acima, o aparelho de fermentação contínua (100) é equipado com a válvula (22) e uma porta de descarga para transferir o ar para fora do fermentador (1). Uma velocidade linear do gás excessivamente grande aumenta uma quantidade de formação de espuma de um meio de cultura e tende a causar problemas, tal como, a geração de contaminação devido às espumas que transbordam a partir da porta de descarga e má detecção, através do sensor de nível, da posição da superfície do líquido no fermentador (1) devido às espumas, de modo que a velocidade linear do gás seja, de preferência, de 70 cm/s ou menos.

[0145] A limpeza por lavagem é eficaz para a remoção de incrustantes, tais como, células fixadas à superfície da membrana de separação. A limpeza por lavagem também é eficaz para aprimorar uma eficiência de fermentação. O gás fornecido por lavagem entra em contato com um meio de cultura, flui em um tubo enquanto entra em contato com um líquido de fermentação, entra em contato com uma membrana de separação e oscila a membrana no módulo de membrana de separação, flui a partir do módulo de membrana de separação até o fermentador enquanto entra em contato com o líquido de fermentação em um tubo, é agitado no fermentador e, então, se eleva até um espaço acima da superfície do líquido de fermentação para conclui o contato com o líquido de fermentação. Por outro lado, quando o gás é diretamente fornecido para o fermentador, o gás agitado no fermentador se eleva imediatamente até um espaço acima da superfície do líquido de fermentação para concluir o contato com o líquido de fermentação.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 51/106

43/84 [0146] Nenhuma limitação específica é imposta às condições de lavagem, ou seja, tempo de lavagem, frequência, tempo por lavagem, e similares. As condições de lavagem podem ser alteradas dependendo de diversas condições, tais como, diferença de pressão de transmembrana, alteração na diferença de pressão de transmembrana, pressão no fermentador, tipo de um gás a ser fornecido, tipo de células a serem cultivadas, tipos de produtos químicos a serem produzidos e tipo de matéria-prima. Por exemplo, a lavagem pode ser conduzida de maneira sucessiva, em intervalos de um tempo predeterminado após a conclusão da lavagem anterior, ou quando uma quantidade de fornecimento de um meio de cultura para o módulo de membrana de separação (2), ou seja, uma quantidade de filtração ou uma diferença de pressão de transmembrana atingir um valor predeterminado. O aparelho de fermentação contínua (100) pode ser equipado com um dispositivo de medição, tal como, um temporizador, que não é ilustrado, a fim de determinar o tempo inicial ou final de lavagem.

[0147] Por exemplo, a frequência de limpeza por lavagem é, de preferência, 0,1 tempo/hora a 360 tempos/hora, mais preferencialmente 12 tempos/hora a 120 tempos/hora. As frequências de limpeza por lavagem de 360 tempos/hora ou mais, dificilmente causam problemas, tais como, inconveniências devido à formação de espuma de um meio de cultura, dano a uma membrana de filtração, e um aumento no custo de operação. As frequências de limpeza por lavagem de 0,1 tempo/hora ou mais, por outro lado, permitem alcançar um efeito de limpeza suficiente e impedir a contaminação de microrganismos indesejados porque a pressão no fermentador pode ser mantida suficientemente alta.

[0148] O tempo limpeza por lavagem pode ser uma vez determinado, dependendo da frequência de limpeza por lavagem, uma diferença de pressão de transmembrana, uma alteração na diferença de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 52/106

44/84 pressão de transmembrana, uma pressão no fermentador, e uma taxa de produção de um produto químico.

[0149] O tempo de limpeza para a limpeza por lavagem intermitente é 5 segundos/tempo a 1 hora/tempo, mais preferencialmente, 10 segundos/tempo a 600 segundos/tempo. O tempo de limpeza por lavagem dentro de uma hora pode impedir a ocorrência de problemas, tais como, dano ou secagem de uma membrana de filtração e um aumento no custo de operação. O tempo de limpeza por lavagem de 5 segundos ou mais pode atingir um efeito de limpeza suficiente e ao mesmo tempo pode impedir a contaminação de microrganismos indesejados no fermentador porque uma redução de pressão neste pode ser suprimida. Deve-se notar que a velocidade linear do gás pode ser regulada dependendo do tempo de limpeza por lavagem.

3-5. Segunda etapa de fornecimento de gás [0150] O método de produção de um produto químico pode ter adicionalmente uma etapa de fornecimento de um gás para o fermentador além da etapa (d). Na constituição da Figura 1, esta etapa de fornecimento de um gás para o fermentador (1) pode ser conduzida usando-se o aparelho de fornecimento de gás fermentador (21) e o aparelho de agitação (4).

[0151] Em particular, quando a limpeza por lavagem for conduzida de maneira intermitente, uma quantidade de fornecimento de gás necessária para o desenvolvimento de microrganismos pode ser mantida ao fornecer um gás para o fermentador enquanto termina o fornecimento de gás para lavagem. Isto é, quando a lavagem for conduzida de maneira intermitente no aparelho de fermentação contínua (100), o aparelho de controle (28) funciona, de modo que uma taxa de fornecimento de gás para o fermentador (1) por meio de outro mecanismo, tal como, o aparelho de fornecimento de gás fermentador (21) e o agitador (4) no momento de terminar a lavagem aumenta

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 53/106

45/84 ao longo de uma taxa de fornecimento de gás até o fermentador (1) por meio do outro mecanismo no momento de conduzir a lavagem. A extensão do aumento na taxa de fornecimento pode ser alterada, dependendo das condições de fermentação, e similares.

3-6. Retrolavagem [0152] O método de produção de um produto químico tem adicionalmente uma etapa de retrolavagem da membrana de separação do módulo de membrana de separação. Na constituição da Figura 1, o tubo de limpeza (84) é conectado ao lado secundário do módulo de membrana de separação (2), de modo que um líquido de limpeza possa ser introduzido no módulo de membrana de separação (2) por meio de uma bomba de limpeza (13).

[0153] Quando a retrolavagem for conduzida, a filtração é interrompida para impedir que um líquido de limpeza entre em um tanque de filtrado no qual um filtrado é retido. Em outras palavras, a válvula de filtração (12) é fechada e ao mesmo tempo, a bomba de filtração (11) é terminada. Sob este estado, a válvula de limpeza (14) é aberta e a bomba de limpeza (13) começa a operação, através da qual a retrolavagem é conduzida.

[0154] Quando a retrolavagem for terminada, a válvula de limpeza (14) é fechada e a bomba de limpeza (13) é terminada. Sob este estado, a válvula de filtração (12) é aberta e a bomba de filtração (11) começa a operação, através da qual a filtração é conduzida.

[0155] Tal controle pode ser conduzido por meio do aparelho de controle (28). O aparelho de fermentação contínua (100) pode ser equipado com um dispositivo de medição, tal como, um temporizador, que não é ilustrado, a fim de determinar o tempo inicial ou tempo final de retrolavagem.

[0156] Os exemplos do líquido de limpeza a ser usado para a retrolavagem incluem líquidos que não têm efeito adverso na fermentação e, ao

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 54/106

46/84 mesmo tempo, capazes de limpar a membrana de separação, tal como, água, o filtrado, o meio de fermentação, alguns componentes a serem adicionados ao meio de fermentação, e uma solução aquosa de ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio ou hipoclorito de sódio, e misturas destes.

4. Produto químico [0157] O produto químico disponível através do método de produção descrito no presente documento é uma substância produzida por células em um meio de cultura. Os exemplos do produto químico incluem massa de substâncias produzidas na indústria de fermentação, tais como, álcoois, ácidos orgânicos, diaminas, aminoácidos e ácidos nucleicos. O método de produção também pode ser aplicado à produção de uma substância, tais como, enzimas, antibióticos e proteínas recombinantes.

[0158] Os exemplos de álcoois incluem etanol, 1,3-butanodiol,

1,4-butanodiol e glicerol.

[0159] Os exemplos de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico, aminoácido, e ácido cítrico. Os exemplos de diaminas incluem cadaverina, enquanto aqueles dos ácidos nucleicos incluem inosina, guanosina e citidina.

[0160] Os exemplos de aminoácidos incluem L-treonina, L-lisina, L-ácido glutâmico, L-triptofano, L-isoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-fenilalanina, L-ácido aspártico, L-tirosina, L-metionina, L-serina, L-valina e L-leucina. Destes, L-treonina, L-lisina e L-ácido glutâmico são particularmente preferidos.

Exemplos [0161] A presente invenção será posteriormente descrita no presente documento de maneira mais específica através dos Exemplos. Entretanto, deve-se ter em mente que a presente invenção não é limitada a ou

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 55/106

47/84 por estes Exemplos. A constituição esquemática de um aparelho de fermentação contínua usado nos Exemplos a seguir é similar àquela da Figura 1, exceto para a constituição que se refere à limpeza por lavagem. Nos Exemplos a seguir, L-treonina e L-lisina foram produzidas como um produto químico através de fermentação contínua.

[A. Método de medição de concentração de L-treonina] [0162] A concentração de L-treonina contida em um meio de cultura foi medida usando o seguinte método. Após 25 pL de um meio de cultura que contém L-treonina a ser medido serem pesados, 150 pL de NaHCOa (75 mM) e, como um padrão interno, 25 pl de L-metionina (2 g/L) foram adicionados. À solução resultante foram adicionados 900 pl de etanol e 150 pl de 0,2M dinitrofluorobenzeno (DFNB), seguida pela mistura. A mistura resultante foi permitida a repousar a 37°C por uma hora e, então, submetida à análise HPLC sob as seguintes condições.

Coluna: CAPCELLPAK C18 TYPE SG120 (produto disponível junto a Shiseido)

Fase móvel: 0,1% (peso por volume) de H3PO4: acetonitrila=7:3 (taxa de fluxo: 1,2 mL/min.)

Método de detecção: UV (360 nm)

Temperatura: 23°C [0163] Uma curva de calibração foi desenhada ao conduzir a análise enquanto se usa L-treonina que tem uma concentração conhecida como uma preparação padrão e representando-se graficamente a concentração de L-treonina na abscissa e uma razão entre (área de Ltreonina)/(L-metionina (área de padrão interno)) na ordenada.

[B. Método de medição de concentração de L-lisina] [0164] A concentração de L-lisina contida em um meio de cultura foi medida usando o seguinte método. Após 25 pL de um meio de cultura que

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 56/106

48/84 contém L-lisina a ser medido serem pesados, 400 pL de NaHCOa (75 mM) e, como um padrão interno, 25 pL de 1,4-butanodiol (2 g/L) foram adicionados. À solução resultante foram adicionados 150 μΙ de 0,2 MDNFB e a mistura resultante foi reagida a 37°C por uma hora.

[0165] A mistura de reação (50 μ^ foi dissolvida em 1 mL de acetonitrila e 10 μl de um sobrenadante obtido centrifugando-se a solução resultante a 10.000 rpm por 5 minutos fio analisada sob as seguintes condições usando-se HPLC.

Coluna: CAPCELLPAK C18 TYPE SG120 (produto disponível junto a Shiseido)

Fase móvel: (0,1% (em peso) de solução aquosa de ácido fosfórico):acetonitrila=45:55 (taxa de fluxo: 1 mL/min.)

Método de detecção: UV (360 nm)

Temperatura: 23°C [0166] Uma curva de calibração foi desenhada ao conduzir a análise enquanto se usa L-lisina que tem uma concentração conhecida como uma preparação padrão e representar graficamente a concentração de L-lisina na abscissa e uma razão entre (área de L-lisina)/(1,4-butanodiol (área de padrão interno) na ordenada.

[C. Método de medição de concentração de ácido L-láctico] [0167] A concentração de ácido L-láctico contida em um meio de cultura foi medida usando o seguinte método. Esta foi confirmada pesando-se 100 μL de um meio de cultura que contém ácido L-láctico e que mede uma quantidade de ácido lático sob as seguintes condições usando-se HPLC.

Coluna: Shim-Pack SPR-H (produto disponível junto a Shimadzu)

Fase móvel: 5 mM de p-ácido toluenossulfônico (taxa de fluxo: 0,8 mL/min.)

Líquido de reação: 5mM de p-ácido toluenossulfônico, 20 mM BisPetição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 57/106

49/84

Tris, 0,1 de mM EDTA^.2Na (taxa de fluxo: 0,8 mL/min.)

Método de detecção: eletrocondutividade

Temperatura: 45°C.

[0168] Uma curva de calibração foi desenhada ao conduzir a análise enquanto se usa ácido L-láctico que tem uma concentração conhecida como uma preparação padrão e representar graficamente a concentração de ácido L-láctico na abscissa e uma área de pico de detecção na ordenada.

[D. Método de medição de concentração de glicose] [0169] Glucose test Wako C (marca registrada) (produto disponível junto a Wako Pure Chemical Industries) foi usado para medir a concentração de glicose.

[0170] A concentração de microrganismos foi determinada medindo-se a absorção a OD 600 nm de um líquido de fermentação apropriadamente diluído.

[E. Fabricação de módulo de fibra oca] [0171] Um módulo tipo fibra oca fluoreto de polivinilideno pressurizado HFS 1020 fabricado por Toray Industries foi desmontado e apenas uma porção não fixada com um adesivo foi removida. A membrana de fibra oca de fluoreto de polivinilideno, deste modo, foi alojada em uma caixa para preparar um módulo de membrana de fibra oca como um módulo de membrana de separação. A caixa usada foi produzida a partir de uma resina de policarbonato. O módulo de membrana de fibra oca preparado deste modo tinha uma capacidade de 0,02 L e uma área de filtração efetiva de 200 cm². Em todos os Exemplos e Exemplos Comparativos, um módulo do mesmo tipo foi empregado.

[F. Preparação de cepa recombinante do gene a ser usada para a preparação de L-lisina através de fermentação contínua]

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 58/106

50/84 [0172] Como um microrganismo que tem uma capacidade de produção de L-lisina, uma cepa rompida do gene homosserina desidrogenase (HOM) de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (que no presente documento será abreviada como cepa ATCC13032) foi preparada. De maneira mais específica, a modificação genética foi conduzida de acordo com o método descrito no documento JP-A-2008-212138. A cepa obtida deste modo é chamada de cepa de Corynebacterium glutamicum delta-HOM (que no presente documento será abreviada como cepa delta-HOM ). Usando-se a cepa delta-HOM, a fermentação contínua da L-lisina foi conduzida conforme posteriormente descrito.

[G. Preparação de cepa recombinante do gene a ser usado para a preparação de ácido L-láctico através de fermentação contínua] [0173] Uma levedura que tem um gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido no local PDC1, local SED1 e local TDH3 foi preparada. O gene ldh tem uma sequência de base descrita em SEQ ID NO: 1. A clonagem do gene ldh derivado de Xenopus laevis foi conduzida usando PCR. Na PCR, um DNA fagemídeo foi usado como um modelo que foi preparado usando uma biblioteca de cDNA (produto disponível junto a STRATAGENE) derivada do rim de Xenopus laevis de acordo com o protocolo anexado a este.

[0174] Na PCR, a KOD-Plus polymerase (produto disponível junto a Toyobo) foi usada. Como um buffer de reação, a mistura de dNTP, e similares, aqueles fixados a este foram usados.

[0175] Uma solução de reação de PCR tinha 50 pl por amostra e foi preparada a fim de conter 50 ng/amostra do DNA fagemídeo preparado de acordo com o protocolo do fabricante, 50 pmol/amostra de iniciadores e 1 Unidade/amostra de polimerase KOD-Plus. A solução de reação foi termicamente desnaturada (desnaturação térmica) usando-se um dispositivo de amplificação de PCR iCycler (produto disponível junto a BIO-RAD) a 94°C por 5

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 59/106

51/84 minutos, seguido por 30 ciclos de tratamento incluindo a desnaturação térmica a 94°C por 30 segundos, recozimento do iniciador a 55°C por 30 segundos, e a extensão da cepa complementar a 68°C por 1 minuto. A solução de reação foi, então, resfriada a 4°C. Os iniciadores (SEQ ID NOS: 2 e 3) para a amplificação de gene foram preparados, de modo que a sequência de reconhecimento Sall e a sequência de reconhecimento Notl fossem adicionadas à extremidade 5' e à extremidade 3', respectivamente.

[0176] O fragmento de amplificação PCR foi purificado, fosforilado, e as extremidades deste, com T4 polynucleotide Kinase (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.) e, então, ligado a um vetor pUC 118 (que foi digerido com uma enzima de restrição HincIl e as extremidades digeridas foram submetidas ao tratamento de desfosforilação). A ligação foi conduzida usando a DNA Ligation Kit Ver.2 (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.). As células competentes de Escherichia call DH5 t (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.) foram transformadas com a solução de ligação, semeadas em uma placa LB contendo 50 pg/mL de uma ampicilina antibiótico, e cultivadas de um dia para o outro. Os DNAs de plasmídeo foram coletados a partir das colônias desenvolvidas, deste modo, usando-se um método de minipreparação (miniprep) e digeridos com enzimas de restrição Sall e Notl. Então, um plasmídeo que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis inserido neste foi selecionado. A série de operação descrita acima foi totalmente realizada de acordo com o protocolo do fabricante.

[0177] O vetor pUC 118 que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis inserido neste foi digerido com enzimas de restrição Sall e NotI e os fragmentos de DNA foram separados usando a eletroforese em gel de agarose a 1%. Então, o fragmento contendo o gene ldh derivado de Xenopus laevis foi purificado de acordo com um método convencional.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 60/106

52/84 [0178] O fragmento contendo gene Idh obtido deste modo foi ligado ao local de digestão XhoUNotl no vetor de expressão pTRS 11 mostrado na Figura 14. O DNA de pIasmídeo foi recuperado de uma maneira simiIar àquela descrita acima e digerido com enzimas de restrição Xhol e Notl para selecionar um vetor de expressão que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido neste. O vetor de expressão que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido neste e preparado de tal modo será posteriormente chamado no presente documento de pTRS 102.

[0179] Usando este pTRS 102 como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 4 e 5) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para amplificar um fragmento de PCR de 1,3 kb que contém o gene ldh derivado de Xenopus laevis e a sequência de terminador TDH3. Incidentalmente, a SEQ ID NO: 4 foi projetada, de modo que uma sequência que corresponde a 60 pb a montante do códon de iniciação do gene PDC1 fosse adicionada.

[0180] A seguir, com o plasmídeo pRS424 como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 6 e 7) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para amplificar um fragmento de PCR de 1,2 kb que contém um gene TRP 1 como um marcador de seleção de levedura. Incidentalmente, a SEQ ID NO: 7 foi projetada, de modo que uma sequência que corresponde a 60 pb a jusante do códon de terminação do gene PDC1 fosse adicionada.

[0181] Os fragmentos de DNA individuais obtidos deste modo foram separados usando a eletroforese em gel de agarose a 1% e purificados de uma maneira convencional. Usando uma mistura do fragmento de 1,3 kb resultante e o fragmento 1,2 kb como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 4 e 7) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada. Como um resultado, um fragmento de PCR de cerca de 2,5

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 61/106

53/84 kb foi amplificado. No fragmento resultante, as sequências que correspondem a 60 pb a montante e a jusante do gene PDC1 foram adicionadas à extremidade 5' e à extremidade 3', respectivamente e o gene ldh derivado de Xenopus laevis, o terminador TDH3 e o gene TRP I foram ligados uns aos outros.

[0182] O fragmento de PCR resultante foi separado usando a eletroforese em gel de agarose a 1%, purificado de uma maneira convencional, transformado em uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae NBRC 10505, e cultivado em um meio livre de triptofano. Deste modo, uma cepa transformante que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido em um local a jusante do promotor de gene PDC1 no cromossomo foi selecionada.

[0183] Conforme descrito abaixo, confirmou-se que a cepa transformante obtida deste modo era uma levedura que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido a jusante do promotor de gene PDC1 no cromossomo. Primeiro, um DNA genômico da cepa transformante foi preparado usando um kit de extração de DNA genômico Dr. GenTLE (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.). Usando-se o DNA genômico resultante como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 7 e 8) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida a obter um fragmento de DNA amplificado de cerca de 2.8 kb. Como um resultado, confirmou-se que a cepa transformante obtida deste modo era a levedura mencionada acima. Quando uma cepa não transformante for usada, um fragmento de DNA amplificado de cerca de 2,1 kb pode ser obtido usando a PCR mencionada acima.

[0184] A cepa transformante que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido em um local a jusante do promotor de gene PDC1 no cromossomo será posteriormente chamada de cepa B2. As sequências a montante e a jusante do gene PDC1 podem ser obtidas a partir do banco de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 62/106

54/84 dados Saccharomyces Genome Database (URL:

http://ww.leveduragenome.org/).

[0185] Então, o gene ldh descrito na SEQ ID NO: 1 foi introduzido no lócus do gene SED1 desta cepa B2. Descrita de maneira específica, usando o pTRS 102 descrito acima como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 5 e 9) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para amplificar um fragmento de PCR de 1,3 kb que contém o gene ldh derivado de Xenopus laevis e a sequência de terminador TDH3. A SEQ ID NO: 9 foi projetada, de modo que a sequência que corresponde a 60 pb a montante do códon de iniciação do gene SED 1 fosse adicionada.

[0186] A seguir, usando-se o plasmídeo pRS423 como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 6 e 10) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para amplificar um fragmento de PCR de cerca de 1,3 kb que contém um gene HISS, ou seja, um marcador de seleção de levedura. A SEQ ID NO: 10 foi projetada, de modo que a sequência que corresponde a 60 pb a jusante do códon de terminação do gene SED 1 fosse adicionada.

[0187] Os fragmentos de DNA obtidos deste modo foram separados usando a eletroforese em gel de agarose a 1% e purificados de uma maneira convencional. Usando uma mistura dos dois fragmentos de cerca de

1,3 kb obtidos deste modo como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 9 e 10) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um fragmento de PCR de cerca de 2,6 kb em que as sequências que correspondem a 60 pb a montante e a jusante do gene SED1 foram adicionadas à extremidade 5' e à extremidade 3', respectivamente, e o gene ldh derivado de Xenopus laevis, o terminador TDH3 e o gene HIS3 foram ligados uns aos outros.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 63/106

55/84 [0188] O fragmento de PCR foi separado usando a eletroforese em gel de agarose a 1%, purificado de uma maneira convencional, transformado na cepa B2, e cultivado em um meio livre de histidina. Deste modo, uma cepa transformante que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido em um local a jusante do promotor de gene SED1 no cromossomo foi selecionada.

[0189] Conforme descrito abaixo, confirmou-se que a cepa transformante obtida deste modo era uma levedura que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido em um local a jusante do promotor de gene SED1 no cromossomo. Primeiro, o DNA genômico da cepa transformante foi preparado usando um kit de extração de DNA genômico Dr. GenTLE (produto disponível junto a TAKARA BIO INC). Usando-se o DNA genômico resultante como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 11 e 12) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida a obter um fragmento de DNA amplificado de cerca de 2,9 kb. Como um resultado, confirmou-se que a cepa transformante obtida deste modo era uma levedura que tem o gene mencionado introduzido nesta. Quando uma cepa não transformada for usada, um fragmento de DNA amplificado de cerca de 1,4 kb é obtido usando a PCR mencionada acima. A cepa transformante que tem o gene ldh derivado de Xenopus laevis introduzido em um local a jusante do promotor de gene SED1 no cromossomo será posteriormente chamada de cepa SUO14-I [0190] A seguir, o gene ldh descrito na SEQ ID NO: 1 foi introduzido no lócus TDH3 de SU014-1. A introdução no lócus TDH3 foi conduzida preparando-se um plasmídeo ao substituir o terminador TDH3 do pTRS 102 por um terminador ADH1.

[0191] Primeiro, um DNA genômico foi preparado a partir da cepa NBRC10505 usando-se um kit de extração de DNA genômico Dr. GenTLE

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 64/106

56/84 (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.). Usando-se o DNA genômico extraído como um modelo e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 13 e 14) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida, através da qual um fragmento de PCR que contém o promotor ADH1 foi amplificado. No lado de extremidade 5' da SEQ ID NO: 13 foi adicionada uma sequência de reconhecimento Notl e no lado de extremidade 3' da SEQ ID NO: 14 foi adicionada uma sequência de reconhecimento HindIll.

[0192] O fragmento amplificado por PCR foi purificado, fosforilado, na extremidade deste, com T4 polynucleotide Kinase (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.) e, então, ligado a um vetor pUC118 (que foi digerido com uma enzima de restrição Hincll e as extremidades digeridas foram submetidas ao tratamento de desfosforilação). A solução de ligação foi transformada em E. coli DH5a Competent Cells (produto disponível junto a TAKARA BIO INC.), seguida pela semeadura e cultivo em uma placa LB contendo 50 p.g/mL de ampicilina, ou seja, um antibiótico. A partir das colônias desenvolvidas deste modo, um DNA de plasmídeo foi recuperado através de um procedimento de mini-preparação e digerido com as enzimas de restrição Notl e HindIll para selecionar um plasmídeo que tem um terminador ADH1 inserido neste. Deste modo, o plasmídeo preparado será chamado de pUC118-ADHlt.

[0193] A seguir, pUC118-ADHlt foi digerido com enzimas de restrição Notl e HindlIl; o fragmento de DNA foi separado usando a eletroforese em gel de agarose a 1%; e um fragmento que contém o terminador ADH1 foi purificado de uma maneira convencional. O fragmento resultante contendo o terminador ADHI foi ligado ao local de digestão Notl/Hindlll no pTRS102. Um DNA de plasmídeo foi recuperado de uma maneira similar àquela descrita acima, seguida pela digestão com enzimas de restrição NotI e Hindlll para selecionar um plasmídeo que tem o terminador ADH1 em vez do terminador

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 65/106

57/84

TDH3. O plasmídeo preparado deste modo será posteriormente chamado de pTRS 150.

[0194] Usando-se este pTRS 150 como um modelo e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 15 e 16) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida. Através desta PCR, um fragmento de PCR de 1,3 kb que contém um gene L-ldh derivado de rã e a sequência de terminador ADH1 foi amplificada. O iniciador da SEQ ID NO: 16 foi projetado, de modo que a sequência que corresponde a 60 pb a montante do códon de iniciação do gene TDH3 fosse adicionada.

[0195] A seguir, como o plasmídeo pRS426 como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 17 e 18) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida. Através desta PCR, um fragmento de PCR de 1,2 kb contendo um gene URA3, ou seja, um marcador de seleção de levedura, foi amplificado. O iniciador da SEQ ID NO: 18 foi projetado, de modo que a sequência que corresponde a 60 pb a jusante do códon de terminação do gene TDH3 fosse adicionada.

[0196] Estes fragmentos de PCR obtidos deste modo foram separados usando a eletroforese em gel de agarose a 1% e purificados de uma maneira convencional. Usando uma mistura do fragmento de 1,3 kb resultante e fragmento de 1,2 kb como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 16 e 18) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada. De tal modo, um fragmento de PCR de cerca de 2,5 kb no qual o gene L-Idh derivado de rã, o terminador ADH1 e o gene URA eram ligados uns aos outros foi amplificado.

[0197] O fragmento de PCR foi separado usando a eletroforese em gel de agarose a 1% e purificado de uma maneira convencional. Então, o fragmento obtido deste modo foi transformado na cepa SUO14-I, seguido pelo cultivo em um meio livre de uracila. De tal modo, uma cepa transformante que

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 66/106

58/84 tem um cromossomo no qual um gene L-ldh derivado de rã foi introduzido em um local a jusante do promotor de gene TDH3 foi selecionada.

[0198] Conforme descrito abaixo, confirmou-se que a cepa transformante obtida deste modo era uma levedura na qual o gene L-Idh derivado de rã foi introduzido em um local a jusante do promotor de gene TDH3 no cromossomo. Primeiro, o DNA genômico da cepa transformante foi preparado usando um kit de extração de DNA genômico Dr. GenTLE (produto disponível junto a TAKARA BIO NC). Usando-se o DNA genômico resultante como um modelo de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOS: 19 e 20) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi conduzida. Quando um fragmento de DNA amplificado de cerca de 2,8 kb for obtido através da PCR acima, a cepa transformante é a levedura descrita acima. Quando uma cepa não transformada for usada, um fragmento de DNA amplificado de cerca de 2.1 kb é obtido usando-se a PCR mencionada acima. A cepa transformante que tem o gene L-ldh derivado de rã introduzido em um local a jusante do promotor de gene TDH3 no cromossomo será posteriormente chamada de cepa SUO14-II.

[0199] A seguir, uma célula diploide foi obtida unindo se uma cepa de levedura SW015 que tem uma mutação sensível à temperatura em um gene pdc5 e na cepa SUO14-II obtida acima. A cepa SW015 é descrita no WO2007/097260. Os ascos da célula diploide foram formados em um meio de formação de asco. Os ascos foram dissecados por meio de um micromanipulador para obter células monoploides, respectivamente.

[0200] A auxotrofia das células monoploides obtidas deste modo foi examinada. A partir das células monoploides adquiridas, as cepas que exibem um tipo de combinação MATa e tipo de combinação MATa foram selecionados a partir das cepas que têm o gene ldh derivado de XenopusLaevis inserido no lócus, lócus sedl e lócus tdh3 e que têm uma mutação

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 67/106

59/84 sensível à temperatura em um gene pdc5 (incapaz de se desenvolver a 34°C). Entre as cepas de levedura obtidas deste modo, a cepa que exibe um tipo de combinação MATa e a cepa que exibe um tipo de combinação MATct serão posteriormente chamados de cepa SU014-8A e cepa SU014-3B , respectivamente.

[0201] A cepa SU014-8A e a cepa SU014-3B obtidas deste modo foram unidas para obterem uma cepa diploide auxotrófica que tem auxotrofia. A cepa resultante será chamada de SU014.

[H. Produção de L-treonina através de fermentação contínua] (Exemplo Comparativo 1) [0202] A fermentação contínua de L-treonina foi conduzida operando-se o aparelho de fermentação contínua mostrado na Figura 1. Como a membrana de separação, a membrana de fibra oca descrita acima foi usada. A seguir, se descreve as condições de operação da fermentação contínua de L-treonina comum aos seguintes Exemplos e Exemplos Comparativos.

Condições comuns

Microrganismo: cepa de Providencia rettgeri SGR588-77 (FERMP-10528)

Meio: meio de fermentação de L-treonina (Tabela 1)

Volume de líquido de fermentação: 3,0 (L)

Volume de membrana de fibra oca MD: 0,02 (L)

Temperatura: 37 (°C)

Taxa de agitação de fermentador: 350 (rpm)

Esterilização: um fermentador que inclui um módulo de membrana de fibra oca e um meio usado são submetidos à esterilização por vapor de alta pressão (2 pressões atmosféricas) em uma autoclave a 121°C por 20 min.

Ajuste de pH: ajustado em pH 7 com uma solução de amônia

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 68/106

60/84 aquosa a 28%

Taxa de fluxo de bomba de circulação: 3L/min.

Taxa de filtração: 170 ml/h (fixa) [Tabela 1] meio de fermentação de L-treonina para Providencia rettzeri

Componente	Quantidade	Unidade
Glicose	60	g/L
Sulfato de amônio	5	g/L
Fosfato de potássio dihidrogenado	1	g/L
Heptahidrato de sulfato de magnésio	0,4	g/L
Heptahidrato de sulfato de ferro	2	ppm
Pentahidrato de sulfato de manganês	2	ppm
L-Isoleucina	10	g/L

[0203] As condições específicas a este Exemplo Comparativo (condições alteradas) são da seguinte maneira.

Condições alteradas:

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16): nenhuma

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): nenhuma

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): nenhuma

Velocidade linear do gás: 0 cm/s [0204] Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás fermentador (21): 75 ml/min. As condições, tal como, um meio, e similares, descritas abaixo são comuns aos Exemplos e Exemplos

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 69/106

61/84

Comparativos. Em relação às matérias-primas de fermentação, a glicose foi usada como uma fonte de carbono independente da substância química pretendida. Como uma fonte de nitrogênio e sal inorgânico, as substâncias descritas abaixo foram usadas, respectivamente.

[0205] Primeiro, uma cepa de Providencia rettgeri SGR588-77 raspada a partir de um meio de agar foi inoculada em um frasco cônico de 500ml carregado com 100 ml de um meio de glicose-caldo (1% de glicose, 3% de caldo (produto disponível junto a Nissui Co. , Ltd.)) e foi cultivada a 37°C sob agitação a 140 rpm (isto significa que a pré-cultura foi conduzida). A pré-cultura foi inoculada em um aparelho de fermentação contínua carregado com 3 L de um meio de fermentação de L-treonina (Tabela 1) e foi cultivada por 24 horas. Então, a cultura contínua foi conduzida fornecendo-se continuamente o meio de fermentação de L-treonina enquanto controla a quantidade de fornecimento do meio, de modo que a quantidade de meio de cultura no fermentador se torne constante. Deste modo, a L-treonina foi produzida através de fermentação contínua.

[0206] A concentração de L-treonina e a concentração de glicose residual contida no filtrado foram medidas usando os métodos mostrados em [A] e [D], respectivamente.

[0207] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo Comparativo são mostradas na Figura 2; as alterações na taxa de produção de L-treonina (g/L/h) são mostradas na Figura 3; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 4. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 5.

(Exemplo Comparativo 2)

Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 1 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 70/106

62/84

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 2500 ml/min.

Velocidade linear do gás: 88.5 cm/s

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás fermentador (21): 75 ml/min.

A velocidade linear do gás foi medida usando-se o medidor de fluxo (93).

[0208] No presente Exemplo Comparativo, a formação de espuma severa do líquido de fermentação no fermentador ocorreu. As espumas resultantes que alcançaram a porta de escape presente na porção superior do fermentador, entraram em contato com ar externo, e causaram contaminação, tornando impossível conduzir a fermentação contínua.

(Exemplo 1) [0209] A fermentação contínua foi conduzida sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 1, exceto para as seguintes condições.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16): 5 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0,18 cm/s

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 71/106

63/84 de gás fermentador (21): 75 ml/min.

[0210] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 2; as alterações na taxa de produção de L-treonina (g/L/h) são mostradas na Figura 3; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 4. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 5.

[0211] Comparado ao Exemplo Comparativo 1, um aumento da taxa de produção de L-treonina é aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-treonina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 1 e a diferença de pressão de transmembrana altera em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. A limpeza de uma membrana superfície usando-se tal método simples e fácil torna possível aumentar a produtividade de um produto químico através de fermentação contínua enquanto mantém a propriedade de filtração da membrana de separação.

(Exemplo 2) [0212] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 1 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 300 ml/min.

Velocidade linear do gás: 10,4 cm/s

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 72/106

64/84

[0213] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 2; as alterações na taxa de produção de L-treonina (g/L/h) são mostradas na Figura 3; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 4. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 5.

[0214] Comparado ao Exemplo Comparativo 1 e Exemplo 1, um aumento da taxa de produção de L-treonina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-treonina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 1, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada.

(Exemplo 3) [0215] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 1 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): 500 ml/min.

Velocidade linear do gás: 17,4 cm/s

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 73/106

65/84 [0216] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 2; as alterações na taxa de produção de L-treonina (g/L/h) são mostradas na Figura 3; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 4. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 5.

[0217] Comparado ao Exemplo Comparativo 1, Exemplo 1, e Exemplo 2, um aumento da taxa de produção de L-treonina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-treonina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 1, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Deste modo, confirmou-se que a lavagem é eficaz independente da posição de fornecimento desta.

(Exemplo 4)

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 2000 ml/min.

Velocidade linear do gás: 70 cm/s

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 74/106

66/84 [0218] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 2; as alterações na taxa de produção de L-treonina (g/L/h) são mostradas na Figura, 3; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 4. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 5.

[0219] Comparado ao Exemplo Comparativo 1, um aumento da taxa de produção de L-treonina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-treonina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 1, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se que no presente Exemplo, Comparado ao Exemplo Comparativo 2, a fermentação contínua pode ser conduzida por um período de tempo longo sem causar muita espuma e contaminação.

[1. Produção de L-lisina através de fermentação contínua] (Exemplo Comparativo 3) [0220] Usando-se o aparelho de fermentação contínua mostrado na Figura 1, a fermentação contínua de L-lisina foi conduzida. Como a membrana de separação, a membrana de fibra oca fabricada em [F] foi usada. A seguir, se descreve as condições de operação for fermentação contínua de L-lisina comuns aos Exemplos e Exemplos Comparativos.

Condições comuns:

Microrganismo: cepa de Corynebacterium glutamicum delta-HOM

Meio: meio de fermentação L-lisina (Tabela 2)

Volume de líquido de fermentação: 3,0 (L)

Volume de membrana de fibra oca MD: 0,02 (L)

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 75/106

67/84

Temperatura: 30 (°C)

Taxa de agitação de fermentador: 350 (rpm)

Esterilização: o fermentador que inclui um módulo de membrana de fibra oca e um meio usado foi submetido à esterilização por vapor de alta pressão (2 pressões atmosféricas) em uma autoclave a 121°C por 20 minutos.

Ajuste de pH: ajustado em pH 7,3 com uma solução de amônia aquosa a 28%.

Taxa de fluxo de bomba de circulação: 3 L/min.

Taxa de filtração: 170 ml/h (fixa) [Tabela 2]

Meio de fermentação de L-lisina para Corvnebacterium

Componente	Quantidade	Unidade
Glicose	100	g/L
Ureia	1	g/L
Extrato de levedura	5	g/L
Hidrogenofosfato dipotássico	2,5	g/L
Heptahidrato de sulfato de magnésio	175	g/L
Cloreto de cálcio desidratado	205	g/L
Heptahidrato de sulfato de ferro	0,05	g/L
Pentahidrato de sulfato de manganês	13	ppm
Pentahidrato de sulfato de cobre	6,3	ppm
Heptahidrato de sulfato de zinco	13	ppm
Hexahidrato de cloreto de níquel	5	ppm
Hexahidrato de cloreto de cobalto	1,3	ppm

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 76/106

68/84

Componente	Quantidade	Unidade
Molibdênio	1,3	ppm
β-alanina	23	ppm
Ácido nicotínico	14	ppm
Biotina	0,5	ppm
Tiamina	7	ppm

Condições alteradas:

Velocidade linear do gás: 0 cmls

A cepa delta-HOM raspada a partir de um meio de agar foi inoculada em um tubo de teste carregado com 5 ml de um meio BY (0,5% de extrato de levedura, 0,7% de extrato de carne, 1% de peptona e 0,3% de cloreto de sódio), seguido pela agitação da cultura a 30°C por 24 horas (précultura). Toda a quantidade do meio pré-cultura obtida deste modo foi inoculada em um frasco cônico de 500-mL carregado com 50 mL do meio mostrado na Tabela 2 e pré-cultivada a 30°C. O meio de pré-cultura obtido deste modo foi inoculado em um aparelho de fermentação contínua carregado com 3L de um meio de fermentação L-lisina e cultivado por 24 horas. Então, a cultura contínua foi conduzida fornecendo-se continuamente um meio de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 77/106

69/84 fermentação L-lisina enquanto controla para que a quantidade de fornecimento do meio de cultura no fermentador seja constante. De tal modo, a produção de L-treonina através de fermentação contínua foi conduzida.

[0221] A concentração de L-lisina produzida no filtrado e a concentração de glicose residual foram medidas conforme necessário usandose os métodos mostrados em [B] e [D], respectivamente.

[0222] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo Comparativo são mostradas na Figura 6; as alterações na taxa de produção de L-lisina (g/L/h) são mostradas na Figura 7; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 8. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 9.

(Exemplo Comparativo 4) [0223] A fermentação contínua foi conduzida sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 3 exceto para as seguintes condições.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): 2300 ml/min.

Velocidade linear do gás: 81,3 cm/s

[0224] No presente Exemplo Comparativo, o líquido de fermentação no fermentador severamente espumado e a espuma causaram um mau funcionamento de um sensor de nível para controlar uma superfície do

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 78/106

70/84 líquido. Como um resultado, o fornecimento de meio foi interrompido e o líquido de fermentação foi drenado, tornado impossível conduzir a fermentação contínua.

(Exemplo 5) [0225] A fermentação contínua foi conduzida sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 3, exceto para as seguintes condições.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16): 800 ml/min.

Velocidade linear do gás: 27,8 cm/s

[0226] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 6; alterações na taxa de produção de L-lisina (g/L/h) são mostradas na Figura 7; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 8. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 9.

[0227] Comparado ao Exemplo Comparativo 3, um aumento da taxa de produção de L-lisina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-lisina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 3, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 79/106

71/84 de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. A limpeza de uma membrana superfície usando-se tal método simples e fácil torna possível aumentar a produtividade de um produto químico através de fermentação contínua enquanto mantém a propriedade de filtração da membrana de separação.

(Exemplo 6)

A fermentação contínua foi conduzida sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 3 exceto para as seguintes condições.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 1000 ml/min.

Velocidade linear do gás: 34,7 cm/s

[0228] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 6; alterações na taxa de produção de L-lisina (g/L/h) são mostradas na Figura 7; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 8. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 9.

[0229] Comparado ao Exemplo Comparativo 3 e Exemplo 5, um aumento da taxa de produção de L-lisina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-lisina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 80/106

72/84 pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 3, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada.

(Exemplo 7)

Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 3 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): 1200 ml/min.

Velocidade linear do gás: 41,7 cm/s

[0230] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 6; alterações na taxa de produção de L-lisina (g/L/h) são mostradas na Figura 7; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 8. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 9.

[0231] Comparado ao Exemplo Comparativo 3, Exemplo 5 e Exemplo 6, um aumento da taxa de produção de L-lisina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-lisina e o rendimento relativo ao consumo de glicose são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do

Exemplo Comparativo 3, de modo que a diferença de pressão de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 81/106

73/84 transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Portanto, confirmou-se que a lavagem mostra seu efeito independente de sua posição de fornecimento.

(Exemplo 8) [0232] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 3 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): 1500 ml/min.

Velocidade linear do gás: 52,1 cm/s

[0233] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 6; as alterações na taxa de produção de L-lisina (g/L/h) são mostradas na Figura 7; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 8. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 9.

[0234] Comparado ao Exemplo Comparativo 3, um aumento da taxa de produção de L-lisina é adicionalmente aprimorado e, além disso, a taxa de produção de L-lisina e o rendimento relativo ao consumo de glicose no estágio inicial de operação são aprimorados. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 3, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 82/106

74/84 em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se a partir da comparação com o Exemplo Comparativo 4 que a operação a longo prazo pode ser conduzida no presente Exemplo por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado.

[J. Produção de ácido L-láctico através de fermentação contínua] (Exemplo Comparativo 5) [0235] Usando-se o aparelho de fermentação contínua mostrado na Figura 1, a fermentação contínua de ácido L-láctico foi conduzida. Como a membrana de separação, a membrana de fibra oca fabricada em [F] foi usada. A seguir, se descreve as condições comuns de operação na fermentação contínua de ácido L-láctico.

Condições comuns:

Microrganismo: cepa de Saccharomyces cerevisiae SU014

Meio: meio de fermentação (Tabela 3)

Volume de líquido de fermentação: 1,0 (L)

Volume de membrana de fibra oca MD: 0,007 (L)

Temperatura: 32 (°C)

Taxa de agitação de fermentador: 400 (rpm)

Esterilização: um fermentador que inclui um módulo de membrana de fibra oca e um meio usado submetido à esterilização por vapor de alta pressão (2 pressões atmosféricas) em uma autoclave a 121°C por 20 min.

Ajuste de pH: ajustado em pH 4,5 com 5N de uma solução aquosa de hidróxido de cálcio

Taxa de fluxo de bomba de circulação: 1,7 L/min.

Taxa de filtração: 225 ml/h (fixa) [Tabela 3]

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 83/106

75/84

Meio de fermentação de ácido lático de levedura

Açúcar de matéria-prima	100	g
Sulfato de amônio	1,5	g

até 1L

Condições alteradas:

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 1 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0.035 cm/s

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás fermentador (21): 125 ml/min.

[0236] Uma cepa SW-1 raspada de um meio de agar foi inoculada em um tubo de teste carregado com 5 ml de um meio SC (glicose: 100 g/L, base de nitrogênio de levedura: 6,7 g/L, 19 aminoácidos padrão exceto leucina: 152 mg/L, leucina: 760 mg/L, inositol: 152 mg/L, p-ácido aminobenzóico: 16 mg/L, adenina:40 mg/L, e uracila: 152 mg/L), seguida pela agitação da cultura a 30°C por 24 horas (pré-cultura). Toda a quantidade do meio de pré-cultura obtida deste modo foi inoculada em um frasco cônico de 500-mL carregado com 50 mL do meio mostrado na Tabela 3 e pré-cultivado a 30°C. O meio de pré-cultura obtido deste modo foi inoculado em um aparelho de fermentação contínua carregado com 1,0 L de um meio de fermentação de ácido L-láctico e cultivado por 24 horas. Então, o cultivo contínuo foi conduzido fornecendo-se continuamente um meio de fermentação de ácido L-láctico enquanto se controla a quantidade de fornecimento do meio de cultura no

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 84/106

76/84 fermentador para ser constante. De tal modo, produção de ácido L-láctico através de fermentação contínua foi conduzida.

[0237] A concentração de ácido L-láctico produzida no filtrado e a concentração de glicose residual foram medidas conforme necessário de acordo com os métodos mostrados em [C] e [D], respectivamente.

[0238] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo Comparativo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na Figura 11; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 12. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 13.

(Exemplo 9) [0239] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 5 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 4 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0,15 cm/s

[0240] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na Figura 11; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 85/106

77/84 são mostradas na Figura 12. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 13.

[0241] Comparado ao Exemplo Comparativo 5, o rendimento relativo ao consumo de glicose mostra uma ligeira redução, porém, a taxa de produção de ácido L-láctico é aprimorada. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 5, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se a partir da comparação com o Exemplo Comparativo 6 que a operação a longo prazo pode ser conduzida no presente Exemplo por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado.

(Exemplo 10)

Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 5 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 5 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0,18 cm/s

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás fermentador (21): 150 ml/min.

[0242] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 86/106

78/84

Figura 11; e as alterações no rendimento (%) relativas ao consumo de glicose são mostradas na Figura 12. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 13.

[0243] Comparado ao Exemplo Comparativo 5, o rendimento relativo ao consumo de glicose mostra uma ligeira redução, porém, a taxa de produção de ácido L-láctico é aprimorada. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 5, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se a partir da comparação com o Exemplo Comparativo 6 que a operação a longo prazo pode ser conduzida por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado.

(Exemplo 11)

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 10 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0,35 cm/s

[0244] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 87/106

79/84

[0245] Comparado ao Exemplo Comparativo 5, o rendimento relativo ao consumo de glicose mostra uma ligeira redução, porém, a taxa de produção de ácido L-láctico é aprimorada. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 5, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se a partir da comparação com o Exemplo Comparativo 6 que a operação a longo prazo pode ser conduzida por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado.

(Exemplo 12) [0246] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 5 exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20): 10 ml/min.

Velocidade linear do gás: 0,35 cm/s

[0247] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 88/106

80/84

[0248] Comparado ao Exemplo Comparativo 5, o rendimento relativo ao consumo de glicose mostra uma ligeira redução, porém, a taxa de produção de ácido L-láctico é aprimorada. Uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 5, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. Confirmou-se a partir da comparação com o Exemplo Comparativo 6 que a operação a longo prazo pode ser conduzida por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado. Comparado ao Exemplo 11, o fornecimento de um gás a partir do tubo de bomba a montante distante do módulo aumentou ligeiramente uma taxa de produção de ácido lático mesmo na mesma velocidade linear do gás.

(Exemplo 13) [0249] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 5, exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida	a partir	do	aparelho	de
fornecimento de gás de lavagem de módulo (16):	nenhuma
Quantidade de gás fornecida	a partir	do	aparelho	de
fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): 20 ml/min.
Quantidade de gás fornecida	a partir	do	aparelho	de
fornecimento de gás de lavagem de tubo a	montante	da	bomba (	20):
nenhuma
Velocidade linear do gás: 0,71 cm/s
Quantidade de gás fornecida	a partir	do	aparelho	de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 89/106

81/84 fornecimento de gás fermentador (21): 0 ml/min.

[0250] As alterações na concentração de microrganismo (-) no líquido de fermentação no presente Exemplo são mostradas na Figura 10; alterações na taxa de produção de ácido L-láctico (g/L/h) são mostradas na Figura 11; e as alterações no rendimento (%) relativas à concentração de glicose são mostradas na Figura 12. Além disso, as alterações na diferença de pressão de transmembrana (kPa) são mostradas na Figura 13.

[0251] A taxa de produção de ácido L-láctico e o rendimento relativo ao consumo de glicose são iguais aqueles do Exemplo Comparativo 5 em que o fermentador foi aerada a 125 min./mL. Além disso, uma taxa de aumento da diferença de pressão de transmembrana é menor que a do Exemplo Comparativo 5, de modo que a diferença de pressão de transmembrana altere em níveis baixos. A aparência de um efeito de limpeza de membrana, portanto, foi confirmada. A aeração a partir do fundo de MD reduz consideravelmente a quantidade de aeração e, deste modo, reduz um custo de operação e produz um efeito de limpeza da membrana. Como um resultado, a fermentação contínua estável pode ser conduzida por um período de tempo longo. Também, confirmou-se que comparada ao Exemplo Comparativo 6, a operação pode ser conduzida por um período de tempo longo por causa da menor formação de espuma e de um nível de superfície do líquido geralmente controlado.

(Exemplo Comparativo 6) [0252] Sob condições similares àquelas empregadas no Exemplo Comparativo 5, exceto para as seguintes condições, a fermentação contínua foi conduzida.

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 90/106

82/84 fornecimento de gás de lavagem de tubo (18): nenhuma

Velocidade linear do gás: 81,3 cm/s

Quantidade de gás fornecida a partir do aparelho de fornecimento de gás fermentador (21): 0 ml/min.

[0253] No presente Exemplo Comparativo, as espumas severamente geradas no fermentador atingiram a porta de escape presente na porção superior do fermentador e entraram em contato com o ar externo e, portanto, a contaminação ocorreu, tornando impossível conduzir a fermentação contínua.

Aplicabilidade Industrial [0254] Na presente invenção, uma vez que um método simples de fácil de fornecer um módulo de membrana de separação com um gás é empregado, é possível aprimorar a estabilidade a longo prazo dos resultados de operação e fermentação de módulo de membrana de separação enquanto suprime a possibilidade de causar contaminação com microrganismos indesejados diferentes daquelas microrganismos necessários para a cultura. Portanto, este método é amplamente usado na indústria de fermentação e contribui com a produção estável de um produto químico, que é um produto de fermentação, a um baixo custo.

Descrição das Referências Numéricas (1) Fermentador (2) Módulo de membrana de separação (3) Unidade de controle de temperatura (4) Aparelho de agitação (5) Unidade de controle de pH

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 91/106

83/84 (6) Unidade de controle de nível (7) Unidade de controle de diferença de pressão (8) Bomba de circulação (9) Bomba de fornecimento de meio (10) Bomba de fornecimento de neutralizador (11) Bomba de filtração (12) Válvula de filtração (13) Bomba de limpeza (14) Válvula de limpeza (15) Válvula de controle de módulo fornecimento de gás (16) Aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (17) Válvula de controle de fornecimento de gás de tubo (18) Aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (19) Válvula de controle de fornecimento de gás de tubo a montante da bomba (20) Aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (21) Aparelho de fornecimento de gás fermentador (22) Válvula de controle de pressão de fermentador (23) medidor de pressão de fermentador (28) Unidade de controle (51) Sensor de pH (61) Sensor de nível (81) Tubo para comunicação entre o fermentador (1) e o lado primário do módulo de membrana de separação (2) (82) Tubo para retornar um concentrado que não passou através da membrana de separação do módulo de membrana de separação (2) até o fermentador (1)

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 92/106

84/84 (83) Tubo conectado ao módulo de membrana de separação (2) para descarregar um filtrado fora do aparelho (84) Tubo para conectar um tanque de líquido de limpeza e o lado secundário do módulo de membrana de separação (2) (86) Tubo para conectar o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de módulo (16) e o (15) módulo de membrana de separação (2) (87) Tubo para conectar o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo (18) e o tubo (81) (88) Tubo para conectar o aparelho de fornecimento de gás de lavagem de tubo a montante da bomba (20) e o tubo (81) (91) Medidor de fluxo (92) Medidor de fluxo (93) Medidor de fluxo (100) Aparelho de fermentação contínua

Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO QUÍMICO ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO CONTÍNUA, caracterizado pelo método compreender:

(a) cultivar uma célula em um meio de cultura em um fermentador para fermentar uma matéria-prima para produzir um produto químico;

(b) conduzir a filtração do meio de cultura usando-se um módulo de membrana de separação;

(c) separar um permeado que contém o produto químico do meio de cultura enquanto retém um líquido não permeado no fermentador, e (d) fornecer um gás a partir de pelo menos uma entre uma porção inferior do módulo de membrana de separação e um tubo que se comunica entre o fermentador e o módulo de membrana de separação, a fim de ajustar uma velocidade linear do gás no módulo de membrana de separação para 0,15 cm/s a 70 cm/s enquanto fornece o módulo de membrana de separação com o meio de cultura.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa (d), o gás conter oxigênio.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente, além da etapa (d), uma etapa (e) de fornecer o fermentador com um gás, em que:

o gás é fornecido na etapa (d) de maneira intermitente, e quando o gás não for fornecido na etapa (d), uma taxa de fornecimento do gás na etapa (e) é aumentada comparada àquela quando o gás é fornecido na etapa (d).
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela filtração na etapa (b) ser conduzida de

Petição 870190056526, de 18/06/2019, pág. 94/106

2/2 maneira intermitente.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela célula ser um microrganismo.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo microrganismo ser um microrganismo que pertence a qualquer um entre o Gênero Escherichia, o Gênero Providencia, o Gênero Corynebacterium, o Gênero Brevibacterium e o Gênero Serratia.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo microrganismo ser qualquer um entre Escherichia coli, Providencia rettgeri, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, e Serratia marcescens.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela célula ser uma levedura.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo produto químico ser um aminoácido.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo aminoácido ser L-treonina, L-lisina, L-ácido glutâmico, L-triptofano, Lisoleucina, L-glutamina, L-arginina, L-alanina, L-histidina, L-prolina, Lfenilalanina, L-ácido aspártico, L-tirosina, L-metionina, L-serina, L-valina ou Lleucina.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo produto químico ser um ácido orgânico.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo produto químico ser ácido lático.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo produto químico ser cadaverina.