CN103820509B - 一种周期短产率高的l-赖氨酸发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种周期短产率高的L‑赖氨酸发酵方法，采用分流方式将连续发酵工艺中排出的发酵液接入新的发酵培养基中，在流加碳源、氮源的条件下进一步发酵培养。经本发明所述发酵方法发酵L‑赖氨酸，周期为32h，产酸18.5%，转化率72%，效果显著。

Description

一种周期短产率高的L-赖氨酸发酵方法
技术领域
本发明涉及一种周期短产率高的L-赖氨酸发酵方法，属于生物发酵技术领域。
背景技术
人们知道，蛋白质是构成人体细胞的主要成份，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，然后人体又利用这些氨基酸再合成新的人体蛋白质，如免疫抗体、消化酶、血浆蛋白、生长激素等都是合成后的人体蛋白质。在合成蛋白质的各种氨基酸中，L-赖氨酸是最重要的一种，少了它，其它氨基酸就受到限制或得不到利用，科学家称它为人体第一必需氨基酸。科学家还发现，L-赖氨酸是控制人体生长的重要物质抑长素(Somatotation,ss)中最重要的也是最必需的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用。人体不能自身合成L-赖氨酸，必须从食物中吸取赖氨酸是帮助其它营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质，人体只有补充了足够的L-赖氨酸才能提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育。
赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。
现有L-赖氨酸大多是采用连续发酵工艺制备。将产L-赖氨酸的菌株通过多级种子罐培养后，接种至发酵罐，待发酵液体积为发酵罐体积的80%时，开始连续排料，并以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出发酵液，所得发酵液进一步提取得到L-赖氨酸。但发酵周期也较长，前期菌体的生长、繁殖占用了一部分发酵周期，此时产酸极低，单罐产酸和转化率也较低。
发明内容
为了克服在赖氨酸发酵生产过程中存在的上述技术问题，本发明旨在提供一种新的L-赖氨酸发酵方法，有效缩短发酵周期、提高产酸量，减少种子罐的染菌风险。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种周期短产率高的L-赖氨酸发酵方法，采用分流方式将连续发酵工艺中排出的发酵液接入新的发酵培养基中，在流加碳源、氮源的条件下进一步发酵培养。
所述L-赖氨酸发酵方法，具体包括如下步骤：
1）在连续发酵过程中，待第一发酵装置的发酵液OD值为35-60%时，将其发酵液连续排出并流加至装有新发酵培养基的第二发酵装置内，同时始终保持第一发酵装置中发酵液体积恒定；
2）向第二发酵装置中流加碳源；
3）向第二发酵装置中流加氮源；
4）当第二发酵装置中的发酵液体积达到80%，将第二发酵装置中的发酵液进一步分流流加至第三发酵装置中继续发酵，以此类推，当其中任一发酵装置中的发酵液体积为发酵装置的80%时，将其发酵液分流流加至下一个发酵装置中，保证每一个发酵装置中发酵液体积恒定，从而实现分流同步发酵，以获得更好的产酸效果，减少发酵周期。
5）当任一发酵装置的产酸水平呈下降趋势时，结束发酵过程，并将所有发酵液进一步提取，得到L-赖氨酸。
在上述发酵方法步骤4）中，当任一发酵装置中发酵液的OD值至30%时，停止向其流加，并将前一发酵装置中排出的发酵液直接流加至下一发酵装置中，以此类推；
当任一发酵装置中发酵液的OD值大于60%时，停止其向其它发酵罐中流加，并将其中发酵液进一步提取得到L-赖氨酸。
在连续发酵过程中，排出的发酵液OD值对后续发酵产酸的影响较为明显。OD值过低时，菌体自身生长周期较长，导致总发酵周期较长；OD值过高时，菌体已进入衰老期，产酸能力减退，且此后的产酸已经达到较高水平，继续作为种子使用会增加产物抑制作用，降低产酸，不适合继续发酵。同时为了兼顾排出发酵液的发酵时间与原连续发酵时间保持同步，本发明限定分流发酵培养的发酵液OD为35-60%，优选40-50%。
在本发明发酵方法中，所述发酵培养条件为：温度35-40℃；压力0.05-0.1MPa；pH6.5-7.0；风量0.3-0.8vvm。
在步骤2）中，所述流加碳源后发酵液中还原糖含量为0.1-1%，优选0.5-0.7％；在步骤3）中，所述流加氮源后发酵液中铵含量为0.1-0.7%，优选0.2-0.3％。所述碳源为葡萄糖；所述氮源为硫酸铵。
所述流加碳源过程中还加入微量元素，由于补料的不断增加和发酵的排料，其中的微量元素会大量损失，不利于发酵的进行，所以我们在补碳源过程中加入微量元素。所述微量元素为本发明发酵菌株发酵所需的营养元素，如硫酸镁、硫酸铁，维生素H，维生素B1；优选为FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg/L、VB12mg/L。
所述发酵培养基配方：葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH（维生素Ｈ）150μg、VB1（维生素B1）1mg；pH=7.2-7.5，121℃温度下灭菌30min并降温至37℃。
现有技术中连续发酵排出的发酵液直接进入提取工序，整个发酵周期长，产酸低，为了改善这一问题，本发明采用发酵液分流发酵的方式，将连续发酵中排出的发酵液流加至另一发酵培养基中再次发酵产酸，并可多次分流。
采用上述技术方案发酵生产赖氨酸，既提高了产酸的效率，又保证了原始接种用发酵罐的若干子代发酵罐可以继续向下连续接种使用，从而实现缩短发酵周期、增加产酸量、提高转化率、减少种子罐的染菌风险的目的。经本发明所述发酵方法发酵L-赖氨酸，周期为32h，产酸18.5%，转化率72%，效果显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
⑴将常规培养的种子罐种子按10%的比例接入用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中，压力：0.1MPa；Ph：6.5-7.0；风量：0.3-0.8vvm；DO30-60%条件下培养。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg/L、VB12mg/L后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。
⑵在⑴的发酵液体积为发酵罐体积的80%时开始连续排料，并维持发酵液体积为发酵罐体积的80%，将排出的发酵液在无菌条件下接入另一用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中培养，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养，直至⑵的OD值为30时停止流加⑴的发酵液。未接种时发酵培养基的体积没过电极即可。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为36h，产酸19%，转化率71%。
实施例2
⑴将常规培养的种子罐种子按10%的比例接入用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。
⑵在⑴的发酵液体积为发酵罐体积的80%时开始连续排料，并维持发酵液体积为发酵罐体积的80%，将排出的发酵液在无菌条件下接入另一用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中培养，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养，直至⑵的OD值为30时停止流加⑴的发酵液。未接种时发酵培养基的体积没过电极即可。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为36h，产酸19%，转化率71%。
⑶在⑵的发酵液体积为发酵罐体积的80%时开始连续排料，并维持发酵液体积为发酵罐体积的80%，将排出的发酵液在无菌条件下接入另一用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中培养，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养，直至⑶的OD值为30时停止流加⑵的发酵液。未接种时发酵培养基的体积没过电极即可。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为37h，产酸19.5%，转化率69%。
实施例3
⑴将常规培养的种子罐种子按10%的比例接入用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。
⑵在⑴的发酵液体积为发酵罐体积的80%时开始连续排料，并维持发酵液体积为发酵罐体积的80%，将排出的发酵液在无菌条件下接入另一用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中培养，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养，直至⑵的OD值为30时停止流加⑴的发酵液。未接种时发酵培养基的体积没过电极即可。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为36h，产酸19%，转化率71%。
⑶在⑵的OD值为30时，⑴停止向⑵流加发酵液，此时⑴可以将排出的发酵液在无菌条件下继续接入另一用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中培养，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养，直至⑶的OD值为30时停止流加⑴的发酵液。未接种时发酵培养基的体积没过电极即可。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为32h，产酸18.5%，转化率72%。
对照例1现有连续发酵产酸方法
将常规培养的种子罐种子按10%的比例接入用葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O0.015g/L、MnSO4·H2O0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH150μg、VB11mg、Ph7.2～7.5，121℃、30min灭菌并降温至37℃的培养基中，压力：0.1MPa；Ph：6.5～7.0；风量：0.3～0.8vvm；DO30%～60%条件下培养。流加糖中加入121℃、30min灭菌FeSO4·7H2O0.03g/L、MnSO4·H2O0.03g/L、VH300μg、VB12mg后摇匀，流加糖后控制发酵液中还原糖含量为0.5%，流加铵后发酵液中铵含量为0.3%，直至发酵结束。此时周期为48h，产酸16%，转化率62%。
对照例2种子罐染菌对比
在常规赖氨酸发酵中，使用本实验室的相同设备，从一级种子罐到发酵罐因染菌而无法继续进行发酵的批次占总试验批次的12%，而采用新工艺后，从一级种子罐到发酵罐因染菌而无法继续进行发酵的批次占总试验批次的1%。由此可见，采用本发明发酵方法能够有效降低种子罐的染菌风险。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种周期短产率高的L-赖氨酸发酵方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)在连续发酵过程中，待第一发酵装置的发酵液OD值为40-50时，将第一发酵装置的发酵液连续排出并流加至装有新发酵培养基的第二发酵装置内，同时始终保持第一发酵装置中发酵液体积恒定；
2)向第二发酵装置中流加碳源；
3)向第二发酵装置中流加氮源；
4)当第二发酵装置中的发酵液体积达到80％，将第二发酵装置中的发酵液进一步分流流加至第三发酵装置中继续发酵，以此类推，当其中任一发酵装置中的发酵液体积为发酵装置的80％时，将其发酵液分流流加至下一个发酵装置中，保证每一个发酵装置中发酵液体积恒定；
5)当任一发酵装置的产酸水平呈下降趋势时，结束发酵过程，并将所有发酵液进一步提取，得到L-赖氨酸；
其中，所述步骤4)中，当任一发酵装置中发酵液的OD值至30时，停止向其流加，并将前一发酵装置中排出的发酵液直接流加至下一发酵装置中，以此类推；当任一发酵装置中发酵液的OD值大于60时，停止向其它发酵罐中流加，并将其中发酵液进一步提取得到L-赖氨酸；
所述发酵培养条件为：温度35-40℃；压力0.05-0.1MPa；pH6.5-7.0；风量0.3-0.8vvm；
在步骤2)中，所述流加碳源后发酵液中还原糖含量为0.5-0.7％；
在步骤3)中，所述流加氮源后发酵液中铵含量为0.2-0.3％；
所述流加碳源过程中还加入营养元素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养元素为硫酸镁、硫酸铁，维生素H，维生素B1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方：葡萄糖140g/L、硫酸铵50g/L、KH2PO4·3H2O 4.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、MnSO4·H2O 0.015g/L、豆饼水解液30g/L、VH 150μg、VB1 1mg；pH＝7.2-7.5，121℃温度下灭菌30min并降温至37℃。
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