BR112013012811B1 - peptídeo derivado de lactoferrina humana, e processo para preparação de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero - Google Patents

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Abstract

PEPTÍDEO DERIVADO DE LACTOFERRINA HUMANA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO. A invenção refere-se a um peptídeo derivado de lactoferrina humana para uso como um agente de mascaramento de antígeno na produção de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero, onde a substância ativa biológica é capaz de induzir uma indesejada resposta imune pelo organismo mamífero, onde a composição farmacêutica compreende um agregado supramolecular da substância ativa biológica e o peptídeo derivado de lactoferrina humana, com o efeito de que após liberação de composição farmacêutica para o organismo mamífero, não há nenhuma ou somente uma diminuída indução da indesejada resposta imune contra a substância ativa biológica.

Description

Antecedentes Técnicos
[0001] Conhecimento genérico sobre imunoglobulina G: Imunoglobulina G (IgG) são moléculas de anticorpos. IgG é a imunoglobulina mais abundante e é aproximadamente e igualmente distribuída em sangue e em fluidos de tecidos, constituindo a principal porção de imunoglobulinas de soro em animais mamíferos e em seres humanos. Moléculas IgG são sintetizadas e secretadas por células B de plasma.
[0002] Anticorpos IgG estão predominantemente envolvidos na resposta imune secundária. A presença de IgG específica genericamente corresponde a maturação da resposta de anticorpos. IgG é o único isotipo de anticorpo que pode passar através de placenta humana, pelo que provendo proteção para o feto no útero. Junto com IgA secretada no leite de mama, IgG residual absorvida através de placenta provê o neonato com imunidade humoral antes de seu próprio sistema imune desenvolver-se.
[0003] IgG pode ligar-se a muitos tipos de patógenos, por exemplo, vírus, bactérias, e fungos, e protege o corpo contra os mesmos através de aglutinação e imobilização, ativação de complemento (caminho clássico), opsonização para fagocitose e/ou neutralização de suas toxinas. Ela também desempenha um importante papel em citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[0004] As respostas imunes gerando IgG mamífera são fortemente conectadas com outras cascatas de respostas imunes e caminhos de sinalização. De modo que motivos e receptores imunógenos ou hapteno, e famílias de receptores correlacionam e regulam em muitas maneiras conhecidas e desconhecidas em indivíduos mamíferos, individualmente.
[0005] É por isso que qualquer agente biologicamente ativo introduzido como um agente terapêutico pode introduzir resposta imune, desejada e indesejada mesmo após muitas dosagens individuais.
[0006] WO2007/048599 descreve sistemas de liberação de fármaco em partículas baseados em um carreador polimérico, caracterizados em que pelo menos uma substância sinal para transporte através de uma barreira biológica e pelo menos um ingrediente ativo são incluídos, com carreador, substância sinal e ingrediente ativo não mostrando ligações covalentes uns com os outros. A substância sinal é lactoferrina ou um peptídeo derivado de lactoferrina.
[0007] Em uma modalidade particularmente preferida, um peptídeo sinal é selecionado do grupo de peptídeos tendo uma sequência de aminoácidos
Figure img0001
ou um seu derivado.
[0008] Em uma modalidade preferida, os peptídeos de penetração de célula do WO 2007/048599 compreendem uma sequência de aminoácidos como mostrada no WO 2007/048599 em SEQ IDs NOs: 3, 4, 29 ou 30 ou uma sequência correspondente com uma identidade de pelo menos 40%, preferivelmente de pelo menos 50%, particularmente preferivelmente com uma identidade de mais que 75% ou melhor de mais que 90%.
[0009] WO 2007/076904A1 descreve um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 8 aminoácidos consecutivos da proteína lactoferrina humana ou da proteína lactoferrina bovina, pelo que o peptídeo é apropriado para atuar como um peptídeo de penetração de célula. Muitos dos peptídeos mencionados no WO 2007/076904A1 e no WO 2007/048599 são idênticos.
[00010] O peptídeo de penetração em célula mais promissor em WO 2007/076904A1 com os melhores efeitos nos exemplos é KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ ID No. 3 no WO 2007/076904A1, SEQ ID No. 1 aqui).
[00011] Os peptídeos de penetração em célula derivados de lactoferrina são pretendidos para permitirem o transporte de moléculas de carga, que são ingredientes farmacêuticos ativos como DNA, RNA, peptídeos ou antígenos para vacinação, que podem ser ingeridos oralmente, através de membranas biológicas e assim permitir eficiente absorção destas moléculas no organismo humano ou animal.
Problema e Solução
[00012] Quando uma substância ativa biológica que é liberada para um organismo mamífero de modo a curar uma doença induz uma resposta imune indesejada isto pode tornar-se um problema sério, quando a mesma substância ativa biológica tem de ser liberada mais tarde para aquele certo organismo uma vez mais.
[00013] Foi um objetivo da presente invenção encontrar um agente de mascaramento de antígeno que possa ser usado como um adjuvante ou como um excipiente na produção de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância biológica ativa em um organismo mamífero, onde a substância ativa biológica é capaz de induzir uma indesejada resposta imune pelo organismo mamífero, com o efeito de que após liberação de composição farmacêutica para o organismo humano, não há nenhuma ou somente uma diminuída indução da indesejada resposta imune contra a substância ativa biológica.
[00014] O problema é resolvido por um peptídeo derivado de lactoferrina humana para uso como um agente de mascaramento de antígeno na produção de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero, onde a substância ativa biológica é capaz de induzir uma indesejada resposta imune pelo organismo mamífero, onde a composição farmacêutica compreende um agregado supramolecular da substância ativa biológica e o peptídeo derivado de lactoferrina humana, com o efeito de que após liberação da composição farmacêutica para o organismo mamífero, não há nenhuma ou somente uma diminuída indução da indesejada resposta imune contra a substância ativa biológica.
Detalhes da Invenção
[00015] A invenção refere-se um peptídeo derivado de lactoferrina humana para uso como um agente de mascaramento de antígeno na produção de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero, onde a substância ativa biológica sozinha é capaz de induzir uma indesejada resposta imune pelo organismo mamífero, onde a composição farmacêutica compreende um conjugado da substância ativa biológica e o peptídeo derivado de lactoferrina humana, como efeito de que após liberação da composição farmacêutica para o organismo mamífero, não há nenhuma ou somente uma diminuída indução da indesejada resposta imune contra a substância ativa biológica.
[00016] Uma vez que o peptídeo derivado de lactoferrina humana é derivado de lactoferrina humana ele não é imunogênico para o sistema imunogênico humano. Surpreendentemente, o peptídeo derivado de lactoferrina humana não é, ou somente em uma baixa extensão, imunogênico para o sistema imunogênico de animais mamíferos, preferivelmente para animais de produção ou para animais domésticos, como, por exemplo, porcos, ovelha, vacas ou cães usados como espécies modelos no desenvolvimento de fármacos embora as sequências não sejam geneticamente conservadas. Assim os benefícios da presente invenção não são limitados à aplicação no homem, mas também podem ser aplicados a aplicações veterinárias e o desenvolvimento de terapias humanas usando modelos animais.
Peptídeo Derivado de Lactoferrina Humana
[00017] O peptídeo derivado de lactoferrina humana pode ter um comprimento de 19 a 30 aminoácidos.
[00018] O peptídeo derivado de lactoferrina humana pode ter um comprimento de 19 a 30 aminoácidos e pode incluir uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR ou uma sequência que é pelo menos 90, 95 ou 98% homóloga àquela sequência de SEQ ID NO. 1.
[00019] O peptídeo derivado de lactoferrina humana é preferivelmente um peptídeo com uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR ou uma sequência que é pelo menos 90, 95 ou 98% homóloga àquela sequência.
[00020] Mais preferivelmente, o peptídeo derivado de lactoferrina humana é pelo menos 90, 95 ou 98% homólogo à sequência SEQ ID NO: 1 e onde os resíduos cisteína em posições 2 e 19 estão presentes. Preferivelmente os resíduos cisteína estão presentes na forma oxidada, formando uma ponte Cys-Cys interna.
[00021] Qualquer adicional modificação química padrão usada em síntese GMP de peptídeo tal como N-acetilação, acilação, metilação, benzilação, amidação-C, esterificação, ésteres volumosos de termina- C, modificações isostéricas de aminoácidos e aminoácidos não- naturais como tiofenil-alanina ou ciclo prolina-alanina ou qualquer outra substituição de aminoácido com cadeia principal amida, éster ou éter pode ser incluída.
[00022] Entretanto, é preferido que, exceto para a formação da ponte Cys-Cys interna, o peptídeo derivado de lactoferrina humana não mostrará adicionais modificações químicas.
Substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune por um organismo mamífero
[00023] Uma substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune por um organismo mamífero é usualmente compreendida ou contida em uma forma farmacêutica ou em uma preparação farmacêutica.
[00024] Substâncias ativas biológicas que são pretendidas para serem usadas para indução de uma desejada resposta imune pelo organismo mamífero, por exemplo, maioria de vacinas, não estão sob o escopo da definição "indesejada resposta imune".
[00025] A substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune pelo organismo mamífero pode ser preferivelmente selecionada do grupo de proteínas ativas biológicas ou peptídeos ativos biológicos, antissoros, anticorpos policlonais ou monoclonais. Também são para serem nomeadas proteínas recombinantes provendo outros "receptores solúveis" ou "ligantes de receptores solúveis" ou proteínas recombinantes modificadas como entidades polietileno glicol (PEG)-iladas assim como agentes terapêuticos com o risco de imunogenicidade como efeito colateral indesejado incluindo moléculas pequenas onde tal risco é conhecido ou potencialmente relevante tais como antibióticos, fármacos- peptídeos e miméticos-peptídeos.
[00026] A substância ativa biológica que é capaz de produzir uma resposta imune IgG indesejada pode estar compreendida em uma amostra de sangue que sofre transfusão para um organismo mamífero.
[00027] A substância ativa biológica que é capaz de induzir uma resposta imune IgG indesejada é compreendida em ou sobre a superfície de um órgão que é transplantado para um organismo mamífero.
Resposta imune indesejada
[00028] Uma resposta imune indesejada pelo organismo mamífero é a resposta do sistema imune através de produção de anticorpos contra uma substância ativa biológica que é liberada para um organismo mamífero de modo a exercer um desejado efeito terapêutico benéfico que é diferente de uma resposta imune ou na qual a resposta imune é um indesejado efeito colateral.
[00029] A resposta imune indesejada pode ser (predominante) uma resposta imune IgG.
[00030] A resposta imune indesejada pode ser (predominante) uma resposta imune IgE.
[00031] Mesmo se a resposta imune indesejada pode não causar indesejados efeitos colaterais na primeira liberação daquela forma farmacêutica ou em uma preparação farmacêutica compreendendo ou contendo a substância ativa biológica que é capaz de induzir a indesejada resposta imune, a indesejada resposta imune pode causar indesejados efeitos colaterais quando a preparação farmacêutica compreendendo ou contendo a substância ativa biológica que é capaz de induzir a indesejada resposta imune (IgG ou IgE) é ou tem de ser liberada uma segunda vez ou uma outra vez ou várias vezes ou sobre um período de tempo. Neste caso, por exemplo, níveis existentes de IgG no plasma podem inativar parcial ou inteiramente a substância ativa biológica e diminuir seu desejado efeito terapêutico. Em alguns casos, a inativação parcial ou total da substância ativa biológica também pode seguir junto com irritações, febre ou outros efeitos colaterais indesejados. Estes efeitos colaterais podem ser não- especificamente induzidos pela presença dos agregados ou precipitados de anticorpo-IgG com a substância ativa biológica.
[00032] Exemplos típicos de uma substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune IgG por um organismo mamífero são, por exemplo: antissoros antiveneno contra o veneno de animais venenosos. Por exemplo, cobras, insetos, aranhas ou certas espécies de água-viva, onde os antissoros são produzidos por animais, usualmente por cavalos, onde os antissoros são pretendidos para curarem um ser humano que teve contato com aquele veneno. Após a primeira liberação daquele antissoro o ser humano individual desenvolve uma indesejada resposta imune IgG predominante contra as proteínas de cavalo, principalmente anticorpos IgG de cavalo compreendidos naquele antissoro.
[00033] É bem conhecido o caso de específicos antissoros anti- veneno de cobra produzidos por cavalos, os quais quando são liberados para um humano que foi picado pelas certas espécies de cobras de modo a currar os severos efeitos do veneno de cobra. Após a primeira liberação do antissoro antiveneno de cobra, a pessoa individual pode ser curada pela inativação do veneno, mas pode desenvolver uma indesejada resposta imune IgG contra as proteínas de cobra, principalmente anticorpos IgG de cavalo compreendidos naquele soro. Quando a mesma pessoa é posteriormente picada pela mesma ou outra cobra tratamento da mesma novamente com antissoros antiveneno de cobra, de cavalo, pode ser perigoso devido ao presente nível de anticorpos IgG desenvolvidos contra as proteínas de soro de cavalo.
[00034] Também são conhecidas terapias imuno moduladoras de síndromes mielodisplásticas de baixo risco humanas onde são empregadas globulinas antilinfócito / anti-timo-linfócito. Nestas terapias globulinas direcionadas contra células imunogênicas humanas que são produzidas em coelhos ou em cavalos são liberadas para o paciente humano sobre um certo período de tempo. Também neste caso existe o perigo de indesejada resposta imune IgG contra as proteínas de coelho ou cavalo, principalmente anticorpos IgG de cavalo, compreendidos naquelas frações de globulina. Esta indesejada resposta imune IgG pode influenciar negativamente a presente ou uma repetida terapia.
[00035] É ainda conhecida a aplicação de preparações farmacêuticas compreendendo ou contendo anticorpos monoclonais elevados contra epítopos sobre células de câncer.
[00036] Outros casos onde a supressão de uma indesejada resposta imune IgG no sentido da invenção pode ser benéfica pode ser o campo de transferência de sangue, onde incompatibilidades entre o sangue que é transferido e o sistema imune do paciente no sentido de indesejada resposta imune IgG pode ocorrer.
[00037] Um outro caso onde a supressão de uma indesejada resposta imune IgG no sentido da invenção pode ser benéfica pode ser o campo de transferência de órgão, onde incompatibilidades entre o órgão transferido, seja ele rim, fígado, pulmão ou coração entre outros exemplos, e o sistema imune do paciente no sentido de indesejada resposta imune IgG poder ocorrer e assim poder pelo menos parcialmente promover reações de repulsão ou rejeição.
[00038] A substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune IgG pelo organismo mamífero assim pode compreender proteínas ou peptídeos farmacológica ou biologicamente ativos, especialmente proteínas ou peptídeos que não são nativos para o organismo mamífero para o qual eles são liberados.
[00039] Não nativos pode significar que as proteínas ou peptídeos ativos biológicos são originados tanto de outras espécies, preferivelmente de outras espécies mamíferas, em comparação a espécies para as quais eles são liberados, ou das mesmas espécies ou de origem semissintética.
[00040] Não nativo pode significar que as proteínas ou peptídeos ativos biológicos foram modificados em uma maneira que os torna detectáveis através de resposta imune IgG do organismo mamífero para o qual eles são pretendidos serem liberados.
[00041] O preferido organismo mamífero para o qual a substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune IgG pode ser liberada é Homo sapiens.
[00042] Por exemplo, uma proteína que origina de um certo organismo mamífero pode tornar-se detectável através da resposta imune IgG daquele organismo mamífero quando ela foi produzida por um organismo microbiano recombinante.
[00043] Por exemplo, uma proteína glicosilada originando de um organismo de fonte eucariótica, mas que foi produzida em um organismo procariótico recombinante usualmente carecerá de glicosilação. Assim a proteína recombinante pode se tornar detectável através de resposta-IgG daquele organismo mamífero de fonte original quando é liberada de volta para aquele organismo na forma de uma preparação farmacêutica.
[00044] Efeitos colaterais em conexão com indesejada resposta imune IgE são bem conhecidos, por exemplo, como alergias, anafilaxias ou mesmo choque anafilático.
[00045] A substância ativa biológica que é capaz de induzir uma indesejada resposta imune IgG ou IgE pelo organismo mamífero pode compreender preparações que compreendem ou consistem em antissoros ou anticorpos policlonais ou monoclonais ou proteínas recombinantes provendo outros "receptores solúveis"ou "ligantes de receptores solúveis"ou proteínas recombinantes modificadas como 'polietileno glicol polietileno glicol (PEG)-ilado, entidades truncadas, ou geneticamente modificadas assim como agentes terapêuticos com o risco de imunogenicidade como indesejados ou críticos ou letais efeitos colaterais como anafilaxia e choque anafilático incluindo moléculas pequenas como antibióticos, anestésicos onde tal risco é conhecido assim como qualquer composto ativo biologicamente onde imunogenicidade é potencialmente relevante incluindo fármacos - peptídeo e miméticos - peptídeo, fatores de crescimento ou necrose, ou misturas de tais frações de fluidos do corpo tais como fatores de sangue a partir de sangue humano ou culturas de células.
[00046] Além disso, o efeito imuno modulador de fragmento lactoferrina humana pode ser usado para efeitos de mascaramento de antígeno de modo a manipular os potenciais agentes de indução de resposta imune no campo de alergia. Por exemplo, a associação de fragmento de lactoferrina humana com pólen, pólen-grama, proteínas de leite, melitina, proteínas de ovo, etc., pode manipular a reação alérgica de um organismo humano contra estes epítopos e antígenos.
Composição Farmacêutica
[00047] O peptídeo derivado de lactoferrina humana pode ser usado como um agente de mascaramento de antígeno na produção de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero.
[00048] Uma composição farmacêutica pode ser uma forma farmacêutica ou preferivelmente forma farmacêutica multipartículas, preferivelmente selecionada de pelotas, grânulos, minicomprimidos, comprimidos ou cápsulas ou outras formas farmacêuticas. A composição farmacêutica também pode incluir composições farmacêuticas veterinárias.
[00049] A composição farmacêutica compreendendo o peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica ainda pode compreender excipientes, que são conhecidos por aqueles versados na técnica serem úteis na formulação de formas farmacêuticas. Típicos excipientes são antioxidantes, abrilhantadores, agentes ligantes, diluentes, materiais de enchimento, agentes aromatizantes, auxiliares de fluxo, fragrâncias, glidantes, agentes de promoção de penetração, pigmentos, plastificantes, polímeros, agentes de formação de poros, solventes ou estabilizantes.
[00050] A composição farmacêutica pode compreender essencialmente ou pode conter até 80, até 50, até 25, até 10% em peso de quaisquer excipientes farmacêuticos, por exemplo, ainda excipientes, que são conhecidos por aqueles versados serem úteis na formulação de formas farmacêuticas.
Agregado SupramMolecular
[00051] Mais preferivelmente, o peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica formam um agregado supramolecular, que também pode ser chamado um complexo ou conjugado, onde o peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica não estão ligados covalentemente um ao outro. Neste caso, o agregado supramolecular é mantido junto, por exemplo, por forças iônicas ou por forças de Van-der-Waals.
[00052] Estes agregados supramoleculares podem ser muito vantajosamente preparados através de adição do composto ativo biológico em meios de processo ou aquosos a uma solução ou suspensão de peptídeo derivado de lactoferrina humana. Esta solução tem de ser suavemente misturada por um curto período, preferivelmente até 2 minutos, ou incubada por até 1 hora, até 2 horas ou acima.
[00053] Além do peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica o agregado supramolecular adicionalmente pode compreender ou conter um carreador, por exemplo, um polímero carreador como um polímero dendrítico.
[00054] Também possível, porém menos preferido o peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica formam um agregado supramolecular onde o peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica são covalentemente ligados um ao outro. Neste caso o agregado supramolecular pode ser formado por uma reação química de grupos reativos em peptídeo derivado de lactoferrina humana com grupos reativos na substância ativa biológica. Moléculas ligantes reativas químicas adicionais alternativas podem ser usadas para conectarem as moléculas.
[00055] Preferivelmente os agregados supramoleculares podem compreender essencialmente ou podem conter pelo menos 20%, pelo menos 50% em peso, pelo menos 80%, pelo menos 90% em peso ou 100% do peptídeo derivado de lactoferrina humana e a substância ativa biológica. O agregado supramolecular pode ser uma parte de uma composição farmacêutica que ainda pode compreender excipientes.
[00056] Preferivelmente a composição farmacêutica pode compreender essencialmente ou pode conter pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 90% em peso ou 100% do agregado supramolecular.
Processo para Preparação de uma Composição Farmacêutica
[00057] As invenções também referem-se a um processo para preparação de uma composição farmacêutica como aqui definida através de mistura de peptídeo derivado de lactoferrina humana e o agente biologicamente ativo sob condições nativas, incubação de mistura para permitir a formação (covalente ou não-covalente) de um agregado supramolecular e adição de mistura à composição farmacêutica.
[00058] Na modalidade mais simples a composição farmacêutica pode ser idêntica com a dita mistura o que significa que a composição farmacêutica final essencialmente contém somente o peptídeo derivado de lactoferrina humana e o agente biologicamente ativo. Entretanto, em muitos casos pode ser vantajoso ou apropriado ainda adicionar excipientes farmacêuticos para formar a composição farmacêutica (final).
[00059] Condições nativas devem significar condições sob as quais a atividade biológica do peptídeo derivado de lactoferrina humana e o agente biologicamente ativo são mantidos. Uma condição nativa pode ser, por exemplo, a mistura de peptídeo derivado de lactoferrina humana e o agente biologicamente ativo em uma solução aquosa tampão, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, ou em solução fisiológica de cloreto de sódio.
[00060] Incubação de mistura para permitir a formação de agregados supramoleculares deve significar tempo suficiente para permitir a agregação de peptídeo derivado de lactoferrina humana e o agente biologicamente ativo. Usualmente mistura e incubação por até 2 minutos em temperatura ambiente pode ser suficiente. Entretanto, incubação por até 1 hora, até 2 horas ou acima também pode ser apropriada. Apropriadas temperaturas para a formação de agregados supramoleculares podem estar na faixa de 0 e 37oC, preferivelmente 4 a 30oC, temperatura ambiente ao redor de 18 a 28oC pode ser apropriada.
Exemplos Exemplo 1: acoplamento não-covalente de fragmento de lactoferrina humana (hLf) com lisado bacteriano Material:
[00061] Lisado bacteriano de Escherichia coli, fragmento de lactoferrina humana, SEQ.ID.No.1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR solução salina tamponada com fosfato, pH = 7,4 (h. Eur.): 5,97 g de hidrogeno fosfato de dissódio di-hidratado (correspondendo a 4,76 g de hidrogeno fosfato de dissódio), 0,38 g de diidrogeno fosfato de potássio e 16 g de cloreto de sódio foram dissolvidos em 1,8 L de água destilada. A seguir a solução clara preparada foi colocada em frasco volumétrico de 2 L, completada para volume com água destilada e subsequentemente homogeneizada. Então o pH foi ajustado para 7,43 a 23,2oC usando 3 mL de HCl 1 N antes de enchimento de solução final em garrafas de PE.
Dispositivo:
[00062] Malvern Zetasizer Nano ZS90; parâmetros de tamanho:
[00063] Material: Proteína RI: 1,45 Absorção: 0,00, Dispersante: Água 25oC: 0,8872 cP
[00064] RI: 1,330; 37oC: 0,6864 cP RI: 1,330, Célula: DTS 1060C: célula zeta descartável limpa
[00065] Medição: 3 corridas automáticas, processo de posicionamento: buscar por ótima posição, seleção de atenção automática, modelo de análise: propósito genérico
[00066] Parâmetros Zeta: constante dielétrica: 78,5 a 25oC e 74,4 a 37oC
[00067] Modelo: Smoluchowski F(KA) valor: 1,5, medição: 3 corridas automáticas
Seleção de atenção automática Preparação de Amostra
[00068] Oxidação de peptídeo: O peptídeo foi dissolvido para uma concentração abaixo de 1 mM (2,75 mg/mL) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 (Ph. Eur.), por exemplo, 5 mg em 10 mL ( = 0,5 mg/mL). A solução foi purgada com oxigênio puro por 5 minutos a 37oC. Incubada por 2 horas a 37oC.
[00069] Para o lisado bacteriano, diluição de 1 mL de lisado de células bacterianas foi diluída até 10 mL com PBS, pH 7,4 (Ph. Eur.).
[00070] Ligação às partículas de lisado foi obtida através de adição de 1 mL de lisado bacteriano (= 1,2 mg de E.coli) com 0,097714286 mg de hLF.
[00071] 20 microlitros de uma solução de 0,5 mg/mL de peptídeo foram adicionados a 1 mL da vacina previamente diluída (0,12 mg/mL) e incubados 2 horas sob baixa agitação, 100-150 rpm, a 4oC, evitando qualquer desenvolvimento de espuma.
Figure img0002
Tabela 1: amostras analisadas e suas composições
Verificações Potencial Zeta (Figura 1)
[00072] Foi mostrado que o lisado de E. coli é uma suspensão, consistindo em partículas de superfície carregada negativamente. O fragmento peptídeo hLF, mesmo se formação de agregados é observada, mostra uma carga positiva total, e a adição do segundo ao primeiro resulta em uma variação das propriedades de superfície de lisado.
Tamanho de Partícula (Figura 2)
[00073] A Figura "tamanho de partícula" mostra as médias
[00074] Dados de tamanho de partícula mostram as verificações: . Agregação é propensa a ocorrer em todos os casos: vacina sozinha, fragmento de hLF sozinho, e a combinação dos mesmos. . Estes fenômenos de agregação conduzem a maiores tamanhos de partículas . Agregação e sedimentação podem ocorrer, revertidos por meio de sonificação e/ou apropriada agitação.
Exemplo 2: Imuno modulação de sistema imune de rato através de tratamento com antígeno, fragmento de lactoferrina humana e combinação de antígeno e fragmento de lactoferrina humana Material
[00075] Lisado bacteriano: Klebsiella pneumoniae CECT 141; 12 000 milhões de bactérias/mL (dez vezes a concentração final), formulação não-glicerinada padrão, sem fenol
[00076] Fragmento hLF, SEQ.ID.No.1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR forma oxidada, como produto liofilizado; dosado em frascos de 50 mg cada, em frascos de 25 mL, para ser reconstituído e usado como solução estoque para o comprimento do ensaio. Uma vez reconstituído, manter resfriado (4oC).
[00077] Esterilizar solução salina tamponada com fosfato (PBS) através de qualquer procedimento apropriado e estocar em um recipiente apropriado quando não usada imediatamente após elaboração. Considerar sua estocagem a 4oC por períodos mais longos de tempo.
Procedimentos:
[00078] Reconstituição da solução estoque de hLF foi realizada através de reconstituição do fragmento de hLF de 50 mg em um frasco através de adição de 20 mL de PBS. Foi assegurada uma reconstituição própria, completa, para uma solução livre de partículas, homogênea, clara. O frasco foi agitado suavemente através de repetida inversão do frasco fechado. O resultado foi a solução estoque de hLF para o experimento: concentração nominal de 2,5 mg/mL.
[00079] A diluição de hLF para o experimento animal foi realizada diariamente. Para isto 1 mL da solução estoque de hLF reconstituída foi transferido para um novo frasco de 25 mL, seguido pela adição de 21,5 mL de PBS e mistura cuidadosa através de repetidas inversões do frasco fechado para evitar formação de espuma. O resultado foi a diluição de estoque diária, concentração nominal 0,1 mg/mL. Formulação "A+B"
[00080] 4,5 mL da diluição diária de hLF foram transferidos para um frasco apropriado (5 mL de capacidade ou maior), seguido pela adição de 0,5 mL do lisado bacteriano de 12 000 milhões de bactérias/mL, e mistura cuidadosa através de repetidas inversões do frasco fechado para evitarformação de espuma. O resultado foi 5 mL de vacina A+B, 1200 milhões de bactérias/mL, 0,1 mg de fragmento hLF/mL, assegurando a razão 12:1.
Formulação "B"
[00081] 4,5 mL da diluição de hLF diária foram transferidos para um frasco apropriado (capacidade de 5 mL ou maior), seguido pela adição de 0,5 mL de PBS e mistura cuidadosa através de repetidas inversões do frasco fechado e evitando formação de espuma. O resultado foram 5 mL de solução de fragmento hLF de 0,1 mg/mL.
Formulação "A"
[00082] 0,5 mL do lisado bacteriano (12 000 milhões de bactérias/mL) foi transferido para um frasco apropriado (capacidade de 5 mL ou maior), seguido pela adição de 4,5 mL de PBS, e misturando cuidadosamente através de repetidas inversões do frasco fechado e evitar formação de espuma. O resultado foram 5 mL de lisado bacteriano, 1200 milhões de bactérias/mL (lisado bacteriano "A")
Doses e Administração dos Tratamentos: Administração "A+B"
[00083] Plicação de 0,5 mL de "A+B" a cada um dos três ratos de grupo A+B (i.p.).
[00084] Aplicação de 0,5 mL de "A+B" a cada um dos três ratos do grupo α + β (intragastricamente).
Administração "B"
[00085] Aplicação de 0,5 mL de B aos ratos do grupo B (i.p.).
[00086] Aplicação de 0,5 mL de B aos três ratos de grupo β (intragastricamente).
Administração "A"
[00087] Aplicação de 0,5 mL de vacina A aos três ratos de grupo A
[00088] Aplicação de 0,5 mL de vacina A aos três ratos de grupo α
Tratamento Animal
[00089] Lisados orais de Klebsiella pneumoniae CECT 141 foram usados como modelo para um inoculum que induz resposta imune IgG em ratos como organismos modelos quando administrados intragastricamente ou intraperitonealmente. O peptídeo derivado de lactoferrina humana com a sequência de aminoácidos SEQ.ID.No.1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR foi usado para formar conjugados com os lisados de Klebsiella pneumoniae CECT 141 da seguinte maneira:
[00090] Seis grupos de três ratos foram usados a. Grupo A: Será administrado lisado bacteriano (Formula "A") intraperitonealmente b. Grupo B: Será administrado fragmento hLF (Formulação "B") intraperitonealmente c. Grupo C: conjugado (Formulação "A+B") será administrado intraperitonealmente d. Grupo α: Será administrado Formulação "A" intragastricamente e. Grupo β: Será administrado com Formulação "B" intragastricamente f. Grupo δ: Será administradocom Formula "A+B" intragastricamente Duração do experimento: 4 semanas (28 dias) Padrão de Aplicação de Produto
Figure img0003
Tabela 2: Tratamento de grupos de ratos e quantidade
Parâmetros e Esquema de Amostragem
[00091] O parâmetro a ser medido é IgG total. O processo será realizado por ELISA. O esquema de amostragem para todos os grupos será como se segue (tabela 3):
Figure img0004
Figure img0005
Tabela 3: Amostras de sangue podem ser tomadas através do seguinte esquema
Verificações Variação nos níveis de IgG sobre o tempo Grupo Controle (Figura 3)
[00092] Nos animais do grupo controle, os níveis de IgG serão mantidos constantes sobre o tempo sem diferenças estatisticamente significantes observadas entre os vários tempos estudados.
Grupo com lactoferrina humana (hLF, Formulação-"B") (Figura 4):
[00093] Tratamento com lactoferrina humana não parece induzir qualquer efeito sobre níveis de IgG sobre o tempo, sem diferenças estatisticamente significantes observadas entre os níveis de IgG dos ratos sofrendo o tratamento hLF em qualquer um dos tempos de estudo independente do modo de administração.
Grupo tratado com extrato bacteriano (Formulação-"A") (Figura 5):
[00094] Nos animais sofrendo tratamento intraperitoneal com extrato bacteriano, observou-se que os níveis de IgG tendem a aumentar significativamente com o tempo. Adicionalmente, deve ser notado que os níveis de IgG aumentam com o número de doses de extrato bacteriano, o que significa que o efeito deste tratamento é cumulativo, explicando o aumento de níveis de IgG com o tempo. O mesmo comportamento é observado em animais tratados intragastricamente com extrato bacteriano. Estes resultados são muito importantes porque eles indicam que o efeito de extrato bacteriano sobre níveis de IgG é independente do modo de administração.
Grupo tratado com extrato bacteriano + hLf (Figura 6)
[00095] Como para os animais sofrendo tratamento com extrato bacteriano + hLf, dois fatos básicos devem ser notados. Primeiro de tudo, pode-se observar que a IgG não varia significantemente a partir dos níveis detectados no grupo controle, independentemente do modo de administração usado. Por outro lado, os níveis de IgG detectados em cada tempo de estudo não atingem os níveis esperados baseado no efeito do extrato bacteriano tanto com administração intraperitoneal como intragástrica.
Análise comparativa de níveis de IgG entre os vários grupos Administração Intraperitoneal Controle vs. grupo de extrato bacteriano
[00096] Quando foram comparados os níveis de IgG do grupo controle com aqueles encontrados no grupo que sofreu tratamento com extrato bacteriano, observou-se um aumento estatisticamente significante no último grupo iniciando no 6o dia após a primeira administração de lisado bacteriano (p<0,001). Estas diferenças são mantidas em todos os momentos até término de estudo no dia 27.
Grupo controle vs. grupo hLf:
[00097] Com administração intraperitoneal, não foi observada diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os níveis de IgG dos ratos que sofreram tratamento com hLF e aqueles encontrados no grupo controle em qualquer um dos momentos de estudo.
Grupo controle vs. hLf + grupo de extrato bacteriano:
[00098] Não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os níveis de IgG dos ratos que sofreram tratamento conjugado com hLF + lisado bacteriano e aqueles encontrados no grupo controle em qualquer momento do estudo.
Grupo de extrato bacteriano vs. grupo hLf:
[00099] Os níveis de IgG encontrados em ratos que sofreram tratamento com o extrato bacteriano sozinho são significantemente maiores (P<0,001) que os níveis encontrados nos animais que sofreram tratamento com hLF sozinha a partir dos primeiros dias (6d) até o término do estudo no dia 27 após a primeira administração.
Grupo de extrato bacteriano vs. grupo de extrato bacteriano + hLf:
[000100] Os níveis de IgG encontrados nos ratos que sofreram tratamento com o extrato bacteriano sozinho são significantemente maiores (p<0,001) que os níveis de IgG encontrados nos animais que sofreram tratamento combinado com hLF e extrato bacteriano em todos os tempos de estudo após a primeira administração.
Grupos hLf vs. grupo de extrato bacteriano + hLf:
[000101] Nenhuma diferença estatisticamente significante foi verificada (p>0,005) entre os níveis de IgG dos ratos que sofreram tratamento com hLf e aqueles detectados nos animais que sofreram tratamento combinado com extrato bacteriano + hLf. Isto sugere que ali tem de haver um efeito protetor de hLf que mascara o efeito de tratamento com extrato bacteriano.
Administração Intragástrica
[000102] Quando os vários tratamentos são administrados intragastricamente, os resultados são similares àqueles descritos na administração intraperitoneal; entretanto, foram encontradas umas poucas diferenças pequenas entre ambos modos de administração. Neste caso, as diferenças com relação aos níveis de IgG detectadas nos animais tratados com o extrato bacteriano e o resto dos grupos (controle, hLf, hLf + extrato) começando a ser estatisticamente significante(p<0,001) partindo do dia 13 após o início de tratamento ao invés de dia 6, como ocorreu quando o modo intraperitoneal de administração foi usado, isto é, ali parece haver um leve retardo na resposta imune em administração intragástrica. Por outro lado, nós vemos significantes diferenças no dia 6 do estudo entre o grupo de animais sofrendo tratamento com hLf e o grupo de animais sofrendo tratamento com hLf + extrato, com superiores níveis de IgG no grupo hLf.
Exemplo 2
[000103] 3 diferentes classes de culturas de células e proteínas glicosiladas naturalmente derivadas de sangue foram misturadas em um tampão eletrólito padrão fisiologicamente similar, ou seja, nativo, com a concentração mostrada na Tabela com o mesmo 22-mero dos peptídeos de lactoferrina humana descritos acima (usando SEQ ID NO. 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR).
[000104] Uma imediata medição da mudança em cinéticas de difusão com uma montagem de microscópio confocal-correlação- tempo padrão usando rótulos fluorescentes, mostrou mesmo através de baixa concentração (hLf 94 nM em HBS, 0,1% BSA, 130 nM IgG1) a facilidade de formulação para todas as três classes de compostos através de ligação moderada não-específica do fragmento para os exemplos de classes de proteína terapêutica incluindo a classe de composto de exemplo 1.
[000105] A coluna f1 mostra sem otimização do experimento a mudança de uma cinética de difusão aparente nos canais do fragmento - hLf. A proteína I é albumina uma fração de proteína do sangue, conhecida em sua versão humana recombinante ou como produto-sangue, proteína II é um anticorpo IgG seletivo. Ambos de fontes comerciais. hLf como a referência move-se como "livre" no elemento volume do foco do microscópio enquanto cerca de 4% ou 15% respectivamente do fragmento são ligados não-especificamente e movem-se mais lentos. Indicando que um agregado supramolecular do fragmento-hLf é materializado na formulação amostra. Tabela 4
Figure img0006
Lista de Figuras
[000106] A Figura 1: diâmetro de partículas medido com zetasizer
[000107] A Figura 2: potencial Zeta de partículas medido com zetasizer
[000108] A Figura 3: nível de IgG em grupo controle
[000109] A Figura 4: nível de IgG em grupos tratados com Formulação-"B" (hLf)
[000110] A Figura 5: nível de IgG em grupos tratados com Formulação-"A" (lisados bacterianos)
[000111] A Figura 6: nível de IgG em grupos tratados com Formulação-"A+B" (lisados bacterianos + hLf)

Claims (2)

1. Peptídeo derivado de lactoferrina humana, caracterizado pelo fato de que é um peptídeo com um comprimento de 19 a 30 aminoácidos e inclui uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR.
2. Processo para preparação de uma composição farmacêutica para liberação de uma substância ativa biológica em um organismo mamífero, em que a substância ativa biológica é selecionada dentre o grupo de proteínas ativas biológicas ou peptídeos ativos biológicos, anticorpos policlonais ou monoclonais ou antissoros, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: misturar o peptídeo derivado de lactoferrina humana, como definida na reivindicação 1, e a substância ativa biológica sob condições nativas, incubar a mistura para permitir a formação de um agregado supramolecular, e adicionar a mistura à composição farmacêutica final.
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