BR112013002302B1

BR112013002302B1 - Método de produção de etanol usando levedura de fermentação alcoólica

Info

Publication number: BR112013002302B1
Application number: BR112013002302-3A
Authority: BR
Inventors: Natsuki MAEKAWA; Katoh Yasuhiko; Kiuchi Takafumi; Suthasinee Praneetrattananon; Shinji Okamoto; Hirayama Kazuko; Miyaoka Syunsuke; Tadanobu Hideaki; Sudo Masahiko
Original assignee: Nippon Steel & Sumikin Engineering Co., Ltd.; Ehime Prefecture
Priority date: 2010-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2020-05-12
Also published as: JP5017432B2; US20150132817A1; WO2012017657A1; MX2013001329A; BR122019020410B1; BR112013002302A2; US9617565B2; US20130171707A1; JP2012034596A; US9187768B2; MX342280B

Abstract

método de produção de etanol usando levedura de fermentação alcoólica prover uma levedura de fermentação alcoólica tendo resistência ao limoneno, que é um inibidor da fermentação, e um método de produção de etanol usando a referida levedura de fermentação alcoólica. uma levedura de fermentação alcoólica da espécie saccharomyces cerevisiae (deposição de no. nite bp-890), tendo resistência ao limoneno e podendo crescer na presença de limoneno em uma concentração de 0,1-0,5% em peso, e um método de produção de etanol usando a referida levedura de fermentação alcoólica.

Description

“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL USANDO LEVEDURA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA” [0001] A presente invenção refere-se à uma levedura de fermentação alcoólica tendo resistência ao limoneno, que é um inibidor da fermentação, e à um método de produção de etanol usando a levedura de fermentação alcoólica.

ESTADO DA TÉCNICA [0002] O bioetanol que é um combustível líquido alternativo pode ser produzido através da fermentação do etanol de um suco de extrato de casca de fruta por ação das leveduras adicionadas ao mesmo. A referida técnica para transformar um suco de extrato de casca de fruta, ou um resíduo, em bioetanol através da fermentação é muito usada porque a biomassa, um material não considerado alimento, é usada como um material de partida. Em uma técnica conhecida de produção de etanol usando o referido suco de extrato de casca de fruta, o suco de extrato de casca de fruta é produzido a partir de uma fruta cítrica e concentrado por exemplo, por centrifugação para obtenção de um xarope cítrico. Então, a polpa é removida do xarope cítrico e o xarope cítrico resultante é submetido ao processo de fermentação do etanol através da levedura Saccharomyces ou algo do gênero (ver, por exemplo, a Literatura Patente 1).

Lista de Citação

Literatura Patente [0003] Literatura Patente 1: pedido de patente japonesa em aberto No. 2002153231.

Sumário da invenção

Problema técnico [0004] O citrino é um componente de óleo C10 His), No entanto, o citrus é um componente do óleo terpenóide, o limoneno (fórmula química: C10H16) está contido numa quantidade de 0,2 a 0,5% em peso. Este limoneno é

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2/23 conhecido por inibir a fermentação do etanol, a maioria dos quais está contida na pele. No entanto, espremendo mecanicamente a fruta que contém o pericarpo na etapa de remoção do suco ou no suco removendo uma etapa, uma parte da fruta é liberada no líquido, e está principalmente presente em uma forma micelar no suco. De acordo com os resultados de medição conduzidos pelos inventores, entre o limoneno (0,2 a 0,5% em peso) no suco, a concentração de limoneno presente na forma micelar é muito pequena como 0,01 ~ 0,04% em peso. No entanto, de acordo com os resultados de experimentos em que o limoneno em uma forma de micelar (forma oleosa) foi adicionado ao meio YPD e fermentação de etanol foi realizada usando uma levedura comum, a taxa de produção de etanol diminuiu drasticamente quando a concentração de limoneno adicionado aumentou. Por exemplo, quando o limoneno foi adicionado a 0,1% v/v, a taxa de produção de etanol diminuiu significativamente para cerca de 20%. Em comum, a levedura está presente como partículas finas sólidas numa solução de açúcar e tende a adsorver uma substância oleosa. Por esta razão, presume-se que uma quantidade vestigial (0,05% v/v) de limoneno (oleoso) é adsorvida na levedura para causar inibição da fermentação. Portanto, a fim de remover o limoneno, que é um inibidor da fermentação do suco, é necessário remova um teor de sólidos de 75% ou mais na relação de presença de limoneno e também remova o limoneno micelar que está presente como um líquido leve (uma substância oleosa). No entanto, mesmo que o limoneno tenha sido previamente removido da matéria-prima por centrifugação trifásica ou similar, uma vez que há um período de indução em uma levedura comum convencional, a fermentação não é estável e a taxa de fermentação é lenta. Por isso, é difícil manter uma elevada fermentabilidade durante um longo período de tempo porque a fermentabilidade tende a ser instável devido a contaminação ou algo similar a isso. Em vista de tais circunstâncias, é um objetivo da presente invenção prover uma levedura de

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3/23 fermentação alcoólica resistente ao limoneno inibidor da fermentação e um método para produzir etanol usando o mesmo.

Solução do Problema [0005] Uma levedura de fermentação alcoólica Saccharomyces cellulosae (Saccharomyces. Cerevisiae) de acordo com uma primeira invenção com o objetivo acima descrito depositado o número de adesão NITE P-890.

[0006] Um método de produção de etanol de acordo com uma segunda invenção que alcance o objetivo acima descrito usará a levedura de fermentação alcoólica de acordo com a primeira invenção.

[0007] No método de produção de etanol de acordo com a segunda invenção, um material cítrico poderá ser usado como material de partida.

[0008] No método de produção de etanol de acordo com a segunda invenção, um líquido denso obtido submetendo um suco de extrato de resíduo de fruta cítrica ao processo de centrifugação trifásico poderá ser usado como um material de partida.

[0009] No método de produção de etanol de acordo com a segunda invenção, um suco de extrato de resíduo de fruta cítrica contendo um material ácido adicionado ao mesmo poderá ser usado como um material de partida.

[00010] No método de produção de etanol de acordo com a segunda invenção, o material ácido será preferencialmente o ácido nítrico.

Efeitos vantajosos da invenção [00011] Na levedura da fermentação alcoólica de acordo com a reivindicação 1, uma vez que a resistência ao limoneno é superior à da levedura comum, o etanol pode ser gerado eficientemente.

[00012] No modo de produção de etanol de acordo com as reivindicações de 2 a 6, o etanol poderá ser produzido de uma forma mais eficiente a partir de uma matéria-prima contendo limoneno do que quando se utiliza uma levedura comum.

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4/23 [00013] Em particular, no método para produção de etanol de acordo com a reivindicação 3, quando um materual cítrico contendo limoneno é utilizado como matéria prima, o etanol pode ser produzido mais eficientemente do que quando se utiliza uma levedura comum.

[00014] Em particular, no método de produção de etanol de reivindicação 4, uma vez que a concentração de limoneno é reduzida, o etanol pode ser produzido de forma mais eficiente.

[00015] Em particular, no método de produção de etanol de acordo com a reivindicação 5, uma vez que a propagação de bactérias diversas é suprimida, o etanol pode ser produzido de forma mais eficiente.

[00016] Em particular, no método de produção de etanol de reivindicação 6, a corrosão dos materiais de aço usados em um aparelho de produção de etanol não será temida.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 é um diagrama ilustrando a seqüência de base de uma espécie BP-890 de acordo com o Exemplo 1 da presente invenção.

A Figura 2 é uma fotografia microscópica de uma espécie BP-890 (ampliação de 1000 x).

A Figura 3 é um gráfico mostrando a resistência ao limoneno da espécie BP890.

A Figura 4 é um gráfico mostrando a resistência à temperatura elevada da espécie BP-890.

As Figuras 5 (A) e 5 (B) são gráficos mostrando as características de uma fermentação em série da espécie BP-890 e as características de fermentação em um sistema descontínuo de uma levedura comum, respectivamente.

A Figura 6 é um gráfico mostrando as características de fermentação do etanol da espécie BP-890 em um processo de cultura em um sistema semidescontínuo, com alimentação escalonada.

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A Figura 7 é um quadro do processo mostrando etapas em um método de produção de etanol no Exemplo 3 da presente invenção.

A Figura 8 é um diagrama ilustrando a configuração esquemática de um aparelho de fermentação contínuo usado na etapa de fermentação do etanol.

A Figura 9 é um gráfico (1) mostrando os resultados da produção de etanol. A Figura 10 é um gráfico (2) mostrando os resultados da produção de etanol. As Figuras 11 (A) e 11 (B) são um gráfico (3) mostrando os resultados da produção de etanol através de uma levedura comum e um gráfico (4) mostrando os resultados da produção de etanol através da espécie BP-890, respectivamente.

Descrição das Configurações [00017] As configurações da presente invenção serão descritas a seguir tendo por referência os desenhos que as acompanham, em ordem de prover uma compreensão da presente invenção. Uma levedura de fermentação alcoólica de acordo com uma configuração da presente invenção é do gênero Saccharomyces tendo resistência ao limoneno. Esta levedura de fermentação alcoólica tem ainda resistência à temperatura elevada. Quando o etanol for produzido usando a levedura de fermentação alcoólica de acordo com esta configuração, a tangerina de cor laranja (um exemplo de fruta cítrica) será usada como matéria-prima. Entretanto, o alcance técnico da presente invenção não será construído para ser limitado às configurações a seguir.

[00018] Aqui a “resistência ao limoneno” significa uma propriedade de uma levedura que permite a fermentação do etanol em uma produção de 86% ou mais na presença de limoneno em uma concentração de 0,1 a 0,5% em peso de uma matéria-prima. A “resistência à temperatura elevada” significa uma propriedade de uma levedura que permite a fermentação do etanol em uma produção de 86 % ou mais em um ambiente com uma

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6/23 temperatura de fermentação de 40^oC ou maior. A Saccharomyces cerevisiae sem resistência ao limoneno e sem resistência à temperatura elevada é também referida como uma “levedura comum”.

[00019] A presente invenção será descrita a seguir através de Exemplos.

Exemplo 1

Isolamento de uma nova levedura [00020] Um suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja foi coletado a partir de uma linha de produção em uma indústria de fabricação de suco de frutas cítricas colhidas na prefeitura de Ehime. Este suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja foi diluído por um fator de 1,000 e a dissolução foi espalhada em um meio de cultura YPD agar (contendo 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona, e 2 % de glicose) e cultivado à 30 ^oC por cerca de 2 dias.

[00021] Leveduras variadas formando colônias em uma placa de cultura de petri foram tomadas e submetidas ao meio de cultura YPD puro (contendo 2 % de extrato de levedura, 2 % de peptona, e 10 % de glicose, ph: 6.5 a 7.0).

Triagem de leveduras [00022] Uma levedura tendo resistência ao limoneno foi exibida a partir das leveduras de cultura pura.

[00023] Mais especificamente, a fermentação de etanol foi desenvolvida usando diversas soluções de açúcar como matéria-prima com concentrações de limoneno diferentes dentro de uma faixa de 0,02 a 0,2% v/v. Então, as espécies tendo alta fermentabilidade de etanol nas soluções de açúcar com concentrações de limoneno diferentes foram selecionadas como espécies resistentes ao limoneno. Entre estas espécies resistentes ao limoneno, uma espécie tendo particularmente alta resistência ao limoneno foi depositada (deposição de No. NITE BP-890). Na descrição presente, a

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7/23 espécie depositada é aqui referida como uma “espécie BP-890”. A espécie BP-890 foi depositada pela seguinte autoridade depositária através do pedido depositado pelos presentes titulares.

(1) Nome: NITE (Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação do Japão), Depositário de Material Biológico para fins de Patente (NPDM);

(2) Endereço: 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818 Japão;

(3) Número de telefone: 0438-20-5580;

(4) No. de deposição: NITE BP-890;

(5) No. de deposição no momento do depósito original: NITE P-890;

(6) Data do depósito original: 28 de janeiro de 2010;

(7) Data de conversão de acordo com o Tratado de Budapeste: 3 de junho de 2011.

Identificação da espécie BP-890 [00024] O DNA foi extraído da espécie BP-890 e a região D2LSUrDNA foi ampliada por PCR. A seqüência de base do produto obtido por PCR foi determinada por uma seqüência direta (ver Figura 1). Baseado nesta seqüência de base, uma pesquisa de BLAST foi desenvolvida nas seqüências D2LSUrDNA de microorganismos semelhantes em uma base de dados para identificar os microorganismos considerados como espécies intimamente relacionadas. Conforme mostrado nos resultados da Tabela 1, a espécie BP-890 foi descoberta sendo uma levedura da espécie Saccharomyces Cerevisiae.

Tabela 1

RESULTADOS DE BLAST PARA ESPÉCIE BP-890

Adesão	Descrição	Pontuação Máx	Pontuação Total	Cobertura consultada	Ident. Máx (Homol ogia)
AB362220.1	Gene da Saccharomyces cerevisiae para RNA ribossômico 26S, seqüência parcial, espécie: TY-2	578	578	99%	99%
DQ888227.1	Clonagem de construção sintética pNOY373 de RNA ribossômico 35S, RNA ribossômico 18S, RNA	578	578	99%	99%

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	ribossômico 5.8S, RNA ribossômico 25S, e RNA ribossômico 5S, seqüência completa
DQ674258.1	Gene de RNA ribossômico L66 28S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	578	578	99%	99%
AY497669.1	Gene de RNA ribossômico CBS 1171 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	578	578	99%	99%
J01355.1	Gene de RNA ribossômico 25S de saccharomyces cerevisiae, seqüência completa	578	578	99%	99%
AY048154.1	Gene de RNA ribossômico NRLL Y-12632 26S de saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	578	578	99%	99%
AY529515.1	Gene de RNA ribossômico 40 26S de saccharomyces cerevisiae isolada, seqüência parcial	578	578	99%	99%
Z73326.1	Quadro aberto de leitura ORF YLR154c do cromossomo da s. cerevisiae XII	578	578	99%	99%
U53879.1	Cosmídeo 9634 do cromossomo XII da saccharomyces cerevisiae	578	1156	99%	99%
GQ121701.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y152 (DX11-2) de espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%
CQ121699.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y150 (DX10-3) 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%
GQ121698.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y149 (DX10-2) 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%
GQ121692.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y143 (DX8-1) 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%
GQ121690.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y141 (DX7-3) 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%
GQ121688.1	Gene da maior subunidade de RNA ribossômico IMAU6Y139 (DX7-1) 26S da espécie saccharomyces cerevisiae, seqüência parcial	576	576	98%	100%

Propriedades micológicas [00025] A espécie BP-890 tem as seguintes propriedades micológicas:

1. forma celular: esférica (ver Figura 2);

2. forma de colônia: branca (sem brilho, ondulada);

3. forma de proliferação: desenvolvimento multilateral;

4. temperatura de crescimento óptimo: 30 ^o C;

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5. ph de crescimento óptimo: 4.0;

6. natureza coesiva: não;

7. açúcares fermentáveis: sacarose, glicose, e frutose.

Exemplo 2

Teste de resistência ao limoneno [00026] A espécie BP-890 foi submetida à fermentação em um sistema descontínuo (método de agitação) com limoneno adicionado em concentrações diferentes para testar a fermentabilidade do etanol. As condições experimentais foram as seguintes.

Condição Experimental

1. temperatura de fermentação: 30 ^o C;

2. taxa de agitação: 120 rpm (amplitude 10 mm);

3. tempo de fermentação: 24 horas;

4. matéria-prima: meio de cultura YPD;

[00027] Os resultados foram mostrados na Figura 3. Na Figura 3, a linha horizontal representa a quantidade (% v/v) de limoneno adicionado a um meio de cultura YPD, e a linha vertical representa a taxa de produção de etanol (%).

[00028] Como foi possível observar a partir da figura, com a levedura comum, conforme a concentração de limoneno aumentava, a taxa de produção de etanol diminuía. Entretanto, com a espécie BP-890, até que a concentração de limoneno adicionado chegasse a cerca de 0,1 % v/v, a taxa de produção de etanol era maior do que 90 % e a taxa de produção de etanol não diminuiu.

Teste de resistência à temperatura elevada [00029] Os experimentos de fermentação em um sistema descontínuo foram acompanhados por 24 horas usando um meio de cultura YPD em temperaturas de fermentação de 30^oC, 37^oC, 40^oC, 42^oC, e 45^oC. As condições experimentais foram as seguintes.

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Condição experimental

1. taxa de agitação: 120 rpm (amplitude: 10 mm);

2. tempo de fermentação: 24 horas;

3. matéria-prima: meio de cultura YPD;

[00030] Os resultados foram mostrados na Figura 4. Na Figura, a linha horizontal representa temperatura, a linha vertical representa a taxa de produção de etanol. Há porções nas quais a taxa de produção de etanol foi levemente maior do que 100 %. Estas taxas de produção de etanol maiores devem ter ocorrido devido a um erro de medida.

[00031] Como foi possível observar a partir da figura, a levedura comum foi capaz de fermentar somente a partir de uma temperatura de fermentação de 37 ^o C. Entretanto, a espécie BP-890 foi capaz de fermentar a partir de uma temperatura de fermentação de 40 ^o C em uma produção elevada de 90 % ou maior. Mais especificamente, a espécie BP-890 teve uma resistência à temperatura elevada. Além disso, a taxa de produção de etanol da espécie BP-890 foi cerca de 70 % mesmo à 42 ^o C, e a BP-890 teve capacidade de fermentação mesmo à uma temperatura de 42 ^o C em uma produção relativamente elevada.

Teste de fermentação do etanol (1) [00032] Um processo de sistema de cultura descontínuo foi desenvolvido na presença de limoneno para testar a produção de etanol e o crescimento de leveduras. As condições experimentais foram as seguintes.

Condição experimental

1. temperatura de fermentação: 30 ^o C;

2. taxa de agitação: 120 rpm;

3. tempo de fermentação: 24 horas;

4. matéria-prima: líquido denso obtido pelo processo de centrifugação trifásico do suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja (fruta cítrica unshiu) (o ph sendo regulado para 3.5).

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11/23 [00033] Os resultados para a espécie BP-890 foram mostrados na Figura 5 (A). Na Figura 5, a linha horizontal representa o tempo, e a linha vertical representa as concentrações (g/L) de sacarose, glicose, e frutose, e de etanol e a concentração (células/ml) de levedura.

[00034] Conforme mostrado na Figura 5 (B) , a levedura comum apresentou um período de indução de cerca de 8 horas. Entretanto, a espécie BP-890 não apresentou período de indução, e a proliferação foi iniciada imediatamente após o início da cultura. A taxa de proliferação de levedura e a taxa de produção de etanol foram maiores com a espécie BP890 do que com a levedura comum.

[00035] Devido à estas características, o uso da espécie BP-890 para a fermentação do etanol permitiu que a cultura fosse desempenhada de uma forma mais estável e em um período mais curto de tempo do que quando o uso da levedura comum foi efetuado e também permitiu uma fermentação eficiente com o desempenho de um curto tempo de permanência.

[00036] A produção de etanol foi testada de maneira semelhante usando os três matérias-primas preparadas a seguir a partir do suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja sob diferentes condições, isto é, com ou sem o processo de centrifugação trifásico e com ou sem adição de ácido nítrico.

(1) Suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja tendo um ph de 3.5 regulado através da adição de ácido nítrico (sem o processo de centrifugação trifásico);

(2) Líquido denso obtido através do processo de centrifugação trifásico do suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja (sem controle de ph);

(3) Suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja (sem o processo de centrifugação trifásico e sem controle de ph).

[00037] O efeito do processo de centrifugação trifásico é a remoção do limoneno. A espécie BP-890 teve resistência ao limoneno. Portanto, parece

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12/23 que a remoção do limoneno foi desnecessária. Entretanto, a condição de o suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja ser ou não submetido ao processo de centrifugação trifásico será considerada por causa das seguintes razões:

(1) embora a espécie BP-890 tenha resistência ao limoneno, é esperado que a taxa de produção de etanol seja mais aperfeiçoada quando a concentração de limoneno for baixa, e (2) o limoneno não pode ser completamente removido pelo processo de centrifugação trifásico. O efeito da adição do ácido nítrico é de interromper a propagação de bactérias indesejadas. Os detalhes dos efeitos do processo de centrifugação trifásico e da adição de ácido nítrico serão descritos posteriormente.

[00038] Os resultados sob estas condições foram mostrados nas Tabelas 2 a 4.

Tabela 2

RESULTADO DO TESTE DE FERMENTAÇÃO DO ETANOL (CENTRIFUGAÇÃO: NÃO, CONTROLE DE Ph: SIM)

		SACAROSE [g/l]	GLICOSE [g/l]	FRUTOSE [g/l]	TOTAL DOS TRÊS AÇÚCARES [g/l]	ETANOL [g/l]	TAXA DE PRODUÇÃO DE ETANOL [%]
LEVEDURA	ANTES FERMENTAÇÃO	22,9	30,4	30,0	83,3	0,0	-
COMUM	APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	0,0	1,2	1,2	39,2	92,1
ESPÉCIE	ANTES FERMENTAÇÃO	27,0	20,5	26,3	73,8	4,9	-
BP-890	APÓS FERMENTAÇÃO	1,9	0,0	2,3	4,1	43,9	103,5

[00039] A Tabela 2 apresenta o resultado das medidas de concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose, e de etanol antes e após a fermentação, e a taxa de produção de etanol (%) para cada um levedura comum e de espécie BP-890.

Tabela 3

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RESULTADO DO TESTE DE FERMENTAÇÃO DO ETANOL (CENTRIFUGAÇÃO: SIM, CONTROLE DE Ph: NÃO)

		SACAROSE [g/l]	GLICOSE [g/l]	FRUTOSE [g/l]	TOTAL DOS TRÊS AÇÚCARES [g/l]	ETANOL [g/l]	TAXA DE PRODUÇÃO DE ETANOL [%]	TAXA DE PRODUÇÃO MÉDIA DE ETANOL [%]
LEVEDURA COMUM	ANTES FERMENTAÇÃO	23,2	15,1	14,1	52,5	0,0	-	-
APÓS FERMENTAÇÃO	0.0	5.3	1.8	7.0	24,3	90.7	89.9
APÓS FERMENTAÇÃO	0.0	6.3	1.3	7.7	23.9	89,0
ESPÉCIE BP-890	ANTES FERMENTAÇÃO	22,5	14,6	13,6	50,7	0,0	-	-
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	0,0	2,0	2,0	23,6	90,9	94,1
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	0,0	2,1	2,1	25,2	97,3

[00040] A Tabela 3 apresenta o resultado das medidas de concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose, e de etanol antes e após a fermentação e a taxa de produção de etanol (%) para cada uma levedura comum e de espécie BP-890.

[00041] Os dados foram medidos por duas vezes após a fermentação e representados como “após fermentação (1)” e “após fermentação (2)”. Uma taxa média de produção de etanol (%) é a média das duas taxas de produção de etanol medidas (%).

Tabela 4

RESULTADO DO TESTE DE FERMENTAÇÃO (CENTRIFUGAÇÃO: NÃO, CONTROLE DE Ph: NÃO)

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		SACAROSE [g/l]	GLICOSE [g/l]	FRUTOSE [g/l]	TOTAL DOS TRÊS AÇÚCARES [g/l]	ETANOL [g/l]	TAXA DE PRODUÇÃO DE ETANOL [%]	TAXA MÉDIA DE PRODUÇÃO DE ETANOL [%]
LEVEDURA COMUM	ANTES FERMENTAÇÃO	25,1	23,9	28,3	77,3	0,0	-	-
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	11,2	2,2	13,4	15,0	38,1	36,0
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	12,5	6,5	19,0	13,4	34,0
ESPÉCIE BP-890	ANTES FERMENTAÇÃO	25,1	23,9	28,3	77,3	0,0	-	-
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	9,1	1,7	10,8	21,5	54,4	50,9
APÓS FERMENTAÇÃO	0,0	10,8	3,1	13,9	18,7	47,3

[00042] A Tabela 4 apresenta dados semelhantes aos dados na Tabela

3.

[00043] Conforme está claro a partir dos resultados nas Tabelas 2 e 4, as taxas de produção de etanol foram maiores com a espécie BP-890 do que com a levedura comum. Em particular, para o suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja sem o tratamento de centrifugação e sem o controle de Ph (matéria-prima não tratada), quando a espécie BP-890 foi usada, a taxa de produção de etanol foi cerca de 15% maior do que aquela com a levedura comum (ver Tabela 4). Na Tabela 2, o etanol estava presente antes da fermentação. Isto se deu porque o etanol contido em uma solução de cultura de levedura adicionada ao material de partida foi detectado.

Teste de fermentação de etanol (2) [00044] O processo de cultura em sistema semi-descontínuo, com alimentação escalonada foi desenvolvido usando um líquido denso obtido através do processo de centrifugação trifásico de um suco de extrato de

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15/23 resíduo de tangerina cor laranja como um material de partida para testar a produção de etanol e o crescimento da levedura. As condições experimentais foram as seguintes.

Condição experimental

1. temperatura: 30^oC

2. taxa de agitação: 150 rpm

3. alimentação do material de partida: 3,3 ml/min

4. volume do reator: 5 L

5. quantidade de ar gerado: 0,05 vvm

6. quantidade de levedura adicionada: 3,0 % v/v

7. material de partida: suco de extrato de resíduo de tangerina cor laranja (fruta cítrica unshiu) [00045] Os resultados foram mostrados na Figura 6. Na Figura 6, a linha horizontal representa o tempo, e a linha vertical representa a concentração de etanol (g/l) e a concentração de levedura (células/líquido).

[00046] Conforme foi possível observar a partir da figura, a solução submetida ao processo de centrifugação trifásico e tendo uma baixa concentração de limoneno apresentou um período de indução de cerca de 4 horas quando a levedura comum foi usada. Entretanto, quando a espécie BP-890 foi usada, não houve período de indução, e a proliferação foi imediatamente iniciada após o início da cultura. Com a espécie BP-890, a produção de etanol foi iniciada imediatamente após o início da cultura e alcançou um pico em 15 horas. Mais especificamente, com a espécie BP890, a taxa de produção de etanol foi maior do que com a levedura comum. Em outras palavras, a espécie BP-890 não apresentou período de indução mesmo quando usada para um material de partida submetido ao processo de centrifugação trifásico e tendo uma baixa concentração de limoneno permitindo uma fermentação estável.

Exemplo 3

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16/23

Produção de etanol [1] usando a espécie BP-890 [00047] O etanol foi produzido usando a espécie BP-890 e iyokan (fruta cítrica japonesa) como um exemplo de material de partida. Uma descrição de um método de produção será dada primeiro.

[00048] O método de produção de etanol inclui um processo inicial e um processo final conforme mostrado na Figura 7. O processo inicial inclui uma etapa de espremedura do suco P1, uma etapa de mistura P2, e uma etapa de extração do extrato P3. O processo final inclui uma etapa de centrifugação trifásica P4, uma etapa de mistura do ácido P5, uma etapa de fermentação P6, e uma etapa de destilação P7. Cada uma destas etapas serão descritas a seguir.

[00049] A etapa de espremedura do suco P1 é uma etapa de espremer a iyokan usando um aparelho espremedor de suco, tal como, em série, ou do tipo processador de polpa. Nesta etapa, o resíduo do suco 11 e o suco 12 serão produzidos.

[00050] A etapa de mistura P2 é uma etapa de misturar o resíduo do suco 11 produzido na etapa de espremedura do suco P1 com cal hidratada sendo um exemplo de um material alcalino. Uma vez que o resíduo do suco 11 produzido na etapa de espremedura do suco P1 tem a forma de um gel ou pasta, um extrato não poderá ser extraído de maneira eficiente usando um espremedor. Entretanto, a adição e mistura da cal hidratada permitirá que o extrato seja extraído de forma eficiente.

[00051] A etapa de extração do extrato P3 é uma etapa de espremer o resíduo do suco 11 que foi tratado de modo a ser facilmente espremido na etapa de mistura P2 para desta forma submeter o resíduo do suco 11 ao tratamento de desaguamento.

[00052] A etapa de centrifugação trifásica P4 é uma etapa de submeter o suco de extrato de resíduo de fruta 13 produzido na etapa de extração do

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17/23 extrato P3 ao processo de centrifugação trifásico para formar um líquido denso 15, um líquido fraco 16, e sólidos 17.

[00053] Na etapa de centrifugação trifásica P4, limoneno, ou um inibidor de fermentação, contido no suco de extrato de resíduo de fruta 13 será removido junto com o líquido fraco (substância oleosa) 16 e os sólidos 17. Desta maneira, a concentração de limoneno na parte líquida do líquido denso 15 poderá ser reduzida para 0,01 % em peso ou menor, e a concentração total de limoneno incluindo limoneno nos sólidos do líquido denso 15 poderá ser reduzida para 0,1 % em peso ou menor.

[00054] Submetendo o suco de extrato de resíduo de fruta 13 à centrifugação trifásica para remover o inibidor da fermentação nesta etapa, as propriedades de proliferação da levedura durante a fermentação do etanol serão aperfeiçoadas. A fermentabilidade será desta forma estabilizada, e a taxa de produção de etanol será aumentada.

[00055] Uma vez que a centrifugação trifásica usada nesta etapa separa o líquido fraco do líquido denso com uma pequena diferença na gravidade específica, será preferível que a centrifugação trifásica usada nesta etapa seja uma centrífuga com rotor de discos podendo ter uma grande área de sedimentação. Quando uma força centrífuga de 5,000 G ou maior estiver disponível, a separação poderá ser desenvolvida industrialmente.

[00056] A etapa de mistura do ácido P5 é uma etapa de mistura do líquido denso 15 produzido na etapa de centrifugação trifásica P4 com ácido nítrico que é um exemplo de um material ácido para formar uma solução misturada ao ácido 18. Mais especificamente, nesta etapa, 60 % de ácido nítrico concentrado será adicionado ao líquido denso 15 produzido na etapa de centrifugação trifásica P4, e a mistura será agitada e misturada usando um misturador ou uma bomba misturadora. O Ph do líquido denso 15 será então regulado para 3,5 e a solução misturada ao ácido 18 será produzida.

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18/23 [00057] Uma vez que a gravidade específica do ácido nítrico é maior do que a gravidade específica do líquido denso 15 produzido na etapa de centrifugação trifásica P4, a mistura será continuamente ou regularmente agitada após adição do ácido nítrico.

[00058] Nesta etapa, a quantidade de bactéria indesejada na solução misturada ao ácido 18 será reduzida para cerca de 1/10 a 1/1,000 da quantidade anterior à adição de ácido nítrico. O ph após o ajuste será definido em consideração aos fatos de que (1) o ph óptimo para a vida de uma bactéria indesejada é de 5,0 a 7,0, e (2) o ph óptimo para o crescimento da levedura necessária para a fermentação do etanol na próxima etapa é de 3,5 a 6,0. Mais especificamente, nesta etapa, o ph será regulado de modo que a levedura possa crescer com a propagação da bactéria indesejada interrompida. O referido ph é, por exemplo, de 3,0 a 4,0.

[00059] A etapa de fermentação P6 é uma etapa de adicionar a espécie Saccharomyces Cerevisiae BP-890 ao líquido denso 15 (solução misturada ao ácido 18) com seu ph regulado na etapa de mistura do ácido P5 para desenvolver assim a fermentação do etanol. A fermentação nesta etapa é uma fermentação contínua, porém, poderá ser uma fermentação descontínua.

[00060] A etapa de destilação P7 é uma etapa de destilação da solução de fermentação do etanol produzida na etapa de fermentação P6. Nesta etapa, o etanol 19 poderá ser purificado.

[00061] O etanol foi produzido usando a espécie BP-890 de acordo com as etapas de produção acima descritas.

[00062] Primeiro, na etapa de espremedura do suco P1, a iyokan usada como material de partida foi espremida. Após isso, na etapa de mistura P2, cal hidratada foi misturada ao resíduo do suco produzido 11. Então, na etapa de extração do extrato P3, o resíduo do suco 11 contendo cal hidratada misturada nele foi espremido para produzir um suco de extrato da resíduo de

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19/23 fruta 13. Após isso, na etapa de centrifugação trifásica P4, o suco de extrato de resíduo de fruta 13 produzido na etapa de extração de extrato P3 foi submetido à centrifugação trifásica para separar o líquido denso 15. Então, na etapa de mistura do ácido P5, foi adicionado ácido nítrico ao líquido denso 15 para regular seu ph para 3,5, e a mistura foi agitada por 2 horas para produzir uma solução misturada ao ácido 18. Então, na etapa de fermentação P6, a fermentação contínua foi desenvolvida.

[00063] Um aparelho de fermentação contínua 20 usado na etapa de fermentação P6 será descrito a seguir. Conforme mostrado na Figura 8, na etapa de fermentação P6, a solução misturada ao ácido 18 (ph: 3.5) usada como material de partida foi alimentada a partir de uma bomba 21 para um biorreator 22. No biorreator 22, a fermentação contínua (tempo médio de permanência: 24 horas) foi desenvolvida. A solução fermentada transbordou na parte superior do aparelho de fermentação contínua 20. Durante a fermentação, ar esterilizado foi gerado dentro da solução fermentada no biorreator 22. A solução fermentada foi continuamente agitada usando um rotor de três lâminas 25. A temperatura dentro do biorreator 22 foi mantida através de um banho termostático 26.

[00064] As condições detalhadas da fermentação foram as seguintes. Condições de fermentação contínua.

1. temperatura de fermentação: 30 ^o C;

2. taxa de agitação: 150 rpm;

3. tempo de fermentação: 24 horas (tempo de permanência);

4. quantidade de levedura adicionada: 3,0% v/v;

5. volume do reator: 5 L;

6. taxa de diluição: 0,04 (1/h);

7. quantidade de ar esterilizado gerado: 0.05 vvm;

8. Outros: a taxa de diluição foi alterada na faixa de 0,014 para 0,04 durante a fermentação contínua.

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20/23 [00065] Os resultados foram mostrados na Figura 9. Na Figura 9, a linha horizontal representa o tempo gasto, e a linha vertical representa as concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose, e etanol, a concentração total (g/l) de todos os açúcares, e a concentração de levedura (célula/ml).

[00066] Neste Exemplo, a taxa de diluição D foi alterada na faixa de 0,014 para 0,04. Entretanto, o etanol foi produzido de maneira estável em relação às alterações na taxa de diluição D. Comummente, quando a taxa de diluição D for alterada durante a fermentação contínua usando a levedura comum, a fermentabilidade se tornará instável, e a quantidade de etanol produzido e a quantidade de leveduras diminuirão conforme o tempo gasto, de modo que ocorrerá uma falha na fermentação. A taxa média de produção de etanol foi de 105,4 %. A taxa média de produção de etanol excedeu 100 %. Isto pode ser ocasionado por duas razões a seguir. Primeiro, os açúcares considerados para registrar a taxa média de produção de etanol foram sacarose, glicose, e frutose mas os açúcares fermentados com leveduras foram outros. Segundo, a taxa média de produção de etanol foi registrada para ser maior devido a um erro de medida.

Exemplo 4

Produção de etanol [2] usando a espécie BP-890.

Este Exemplo é diferente do Exemplo 3 nos dois pontos a seguir. A etapa de centrifugação P4 foi omitida e a taxa de alterações na taxa de diluição D foi modificada. Mais especificamente, após um suco de extrato de resíduo de fruta ser produzido na etapa de extração do extrato P3, a etapa de centrifugação P4 foi omitida, e ácido nítrico foi adicionado ao suco de extrato de resíduo de fruta na etapa de mistura do ácido P5 para produzir uma solução misturada ao ácido tendo um ph de 3,5. A solução misturada ao ácido foi alimentada para o biorreator 22 para desenvolver a etapa de fermentação P6. A concentração de limoneno na solução misturada ao ácido preparada regulando o ph do suco de extrato de resíduo de fruta 13

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21/23 (o total da concentração de limoneno aderindo aos sólidos e a concentração de limoneno presente na solução) foi de 0,2 % v/v.

[00067] Os resultados foram mostrados na Figura 10. Na Figura 10, a linha horizontal representa o tempo gasto (h), e a linha vertical representa as concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose, e etanol, e concentração total (g/l) de todos os açúcares, e a concentração (células/ml) de levedura. [00068] Neste exemplo, a taxa de diluição D foi alterada na faixa de 0,4 para 0,08. Entretanto, o etanol foi produzido de forma estável, independentemente das alterações na taxa de diluição D. A taxa média de produção do etanol foi de 88,5 %.

Exemplo 5

Produção de etanol [3] usando a espécie BP-890.

[00069] Neste exemplo, as condições de operação do aparelho de fermentação contínua 20 (ver Figura 8) foram diferentes daqueles no Exemplo 3 acima. Mais especificamente, a levedura comum e a espécie BP890 foram usadas, e a fermentação contínua foi desenvolvida para cada uma destas leveduras sob as condições de operação nas quais o tratamento de fermentação foi interrompido e repetidamente resumido de acordo com a operação da indústria fabricante do suco. A concentração de limoneno na solução misturada ao ácido preparada regulando o ph do suco de extrato de resíduo de fruta 12 foi de cerca de 0,03 volume %.

[00070] Os detalhes das condições de operação do aparelho de fermentação contínua 20 foram os seguintes.

Condições de operação.

1. Um período de fermentação (12 horas) no qual a fermentação do etanol foi desenvolvida, e um período de intervalo (12 horas) no qual a alimentação do material de partida foi parada para interromper a fermentação foram repetidos (o processamento do material de partida foi

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22/23 desenvolvido em meio dia, e o processamento foi parado na outra metade do dia).

2. A taxa de diluição D durante o período de fermentação foi de 0,08 (tempo médio de permanência: 12 horas).

3. Durante o período de intervalo, a temperatura dentro do biorreator 22 foi mantida em 30^oC. A agitação e o gerador de ar esterilizado continuaram a operar (somente a alimentação do material de partida foi interrompida).

[00071] O resultado usando a levedura comum e a espécie BP-890 foi apresentado nas Figuras 11 (A) e 11 (B). Na Figura 11 (A), a linha horizontal representa o tempo gasto (h) e a linha vertical representa concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose e etanol, a concentração total (g/l) de todos os açúcares, a concentração total (g/l) de todos os açúcares em uma solução influxo, e a concentração (células/ml) de levedura.

[00072] Na Figura 11, a linha horizontal representa o tempo gasto (h), e a linha vertical representa as concentrações (g/l) de sacarose, glicose, frutose, e etanol, a concentração total (g/l) de todos os açúcares, a concentração total (g/l) destes três açúcares em uma solução influxo, e a concentração (células/ml) de levedura.

[00073] Neste Exemplo, quando a alimentação do material de partida foi interrompida na presença do limoneno que é o inibidor de crescimento, o crescimento da levedura comum sem resistência ao limoneno foi inibido pelo limoneno e também adversamente afetado pela subnutrição, etc. Isto fez com que houvesse uma redução significante na taxa de crescimento da levedura, morte da levedura, e desta forma a quantidade de levedura diminuiu. Então a fermentação deteriorou. Entretanto, com a espécie BP-890 não foi observado nenhuma redução na quantidade de levedura mesmo quando a alimentação do material de partida foi interrompida e a fermentação elevada foi mantida de forma estável. Mais especificamente, estabilizar a operação é impossível com a levedura comum sob as

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23/23 condições nas quais a alimentação do material de partida foi temporariamente interrompida, por exemplo, interrompida no período noturno de acordo com a operação de uma indústria de fabricação de suco. Entretanto, a espécie BP-890 tendo resistência ao limoneno permitiu fermentação estável mesmo sob as referidas condições.

[00074] A presente invenção não está limitada às configurações acima descritas e Exemplos, e qualquer alteração poderá ser feita contanto que o alcance da invenção não seja alterado.

[00075] Nos Exemplos 3 e 4 descritos acima, a fermentação do etanol foi desenvolvida usando o suco de extrato de resíduo de fruta 13 obtido na etapa de extração do extrato P3. Entretanto, a fermentação do etanol (fermentação sólida) poderá ser desenvolvida usando, como material de partida, o resíduo do suco 11 obtido na etapa de espremedura do suco P1. Lista de sinais de referência

11: resíduo do suco

12:suco

13: suco de extrato de resíduo de fruta

14: polpa da fruta

15: líquido denso

16: líquido fraco

17: sólidos

18: solução misturada ao ácido

19: etanol

20: aparelho de fermentação contínua

21: bomba

22: biorreator

25: rotor de três lâminas

26: banho termostático.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL USANDO LEVEDURA DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA” caracterizada por a levedura ser do gênero Saccharomyces cellulogiae, (Saccharomyces.Cerevisiae) deposição número de acesso NITE P - 890.
2. - “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um material cítrico ser usado como matéria-prima.
3. - “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um componente líquido denso obtido pela sujeição do extrato de um resíduo do suco cítrico em centrifugação trifásica ser usado como matéria-prima
4. - “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um extrato de resíduo do suco cítrico contendo um material ácido ser usado como matéria-prima.
5. - “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ETANOL” de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a substância ácida ser ácido nítrico.