CN109055228B - 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法 - Google Patents

碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109055228B
CN109055228B CN201810747776.8A CN201810747776A CN109055228B CN 109055228 B CN109055228 B CN 109055228B CN 201810747776 A CN201810747776 A CN 201810747776A CN 109055228 B CN109055228 B CN 109055228B
Authority
CN
China
Prior art keywords
microalgae
carbonate
water
culture
carbon dioxide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810747776.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109055228A (zh
Inventor
迟占有
张若兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University of Technology
Original Assignee
Dalian University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University of Technology filed Critical Dalian University of Technology
Priority to CN201810747776.8A priority Critical patent/CN109055228B/zh
Publication of CN109055228A publication Critical patent/CN109055228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109055228B publication Critical patent/CN109055228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02C—CAPTURE, STORAGE, SEQUESTRATION OR DISPOSAL OF GREENHOUSE GASES [GHG]
    • Y02C20/00—Capture or disposal of greenhouse gases
    • Y02C20/40—Capture or disposal of greenhouse gases of CO2
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/151—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions, e.g. CO2
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/59—Biological synthesis; Biological purification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法，步骤包括：(1)将所收获的微藻培养液浓缩成微藻浓缩液，再添加碳酸盐及DBU加热进行破壁处理，裂解微藻细胞壁；(2)加入有机试剂进行盐析萃取，使油脂与水相分离，进入有机相；(3)富含碳酸盐的水相中通入二氧化碳至pH值6.5～10.0后，再与相应的微藻培养基混合，培养微藻，重复步骤(1)～(3)。本发明直接采用湿藻进行提油，与传统的干藻提油方法相比，可以省去喷干技术带来的能耗成本。此外，处理后的水相可进行微藻的循环培养，可以有效的回收利用微藻破壁提油过程当中的碳酸盐和水。

Description

碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法
技术领域
本发明涉及微藻油脂提取方法及废水的循环使用，具体是指一种从湿藻中提取油脂，并利用提取后的废水循环培养微藻的方法。
背景技术
微藻是具有光合作用的微生物，其在生物燃料生产方面都有巨大潜在应用。微藻单位面积油脂产率是大豆的130倍，棕榈的10倍，而且大规模培养不占用耕地，在生产生物柴油替代石油方面有着巨大潜力。同时它还具有高光合效率及生长周期短等优势。目前制约微藻生物柴油发展的最主要问题是成本问题，一是降低微藻培养成本，二是从生产工艺上进行改进。
现有技术中公开了许多使用微藻生产生物柴油的工艺。如公开号CN 101580857 A的发明专利中提到将微藻先由湿藻变成藻块或藻粉，加入低碳醇进行酯交换反应，再加入有机溶剂萃取反应液，之后将有机相分离，再将有机试剂蒸馏出去，最终得到生物柴油粗品。再如公开号CN 104560409 A的发明专利中提到将干燥的微藻除杂、粉碎、研磨后加入甲醇，在超声辅助下加热煮沸，之后静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏得粗生物柴油。
尽管目前已经有许多微藻生产生物柴油的工艺，现阶段工业上无法进行大规模生产。导致这一问题的原因主要有：
1、大部分含有微藻细胞壁较厚，直接利用有机溶剂及酸碱法提油消耗时间长，且萃取效率较低。
2、目前工业上微藻生产生物柴油，多数采用原位萃取，这就会对体系中的水分有严格的要求。因此这些工艺需要采用干藻粉作为原料进行油脂提取，这势必会增加喷干成本和能耗损失。
3、采用湿藻直接提取生物柴油会减少喷干所带来的成本和能耗损失，但与此同时会产生大量废液，这些废液的产生会增加环境压力。
发明内容
针对这些问题，本发明公开了一种碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法，是以微藻浓缩液为原料，采用碳酸盐破壁，之后采用乙醇-水-碳酸盐体系进行盐析萃取，最终上相即为脂肪酸和乙醇的混合物，下相中含有大量的碳酸盐，可以用于吸收二氧化碳产生碳酸氢钠，之后用于微藻的循环培养。这节省了微藻的干燥成本，同时，碳酸盐在发挥了细胞破壁的作用后，还能作为二氧化碳吸收剂，为微藻培养提供碳源，而且，循环利用废液，减少了环境压力。
本发明的目的是提供一种采用碳酸盐从湿藻中提取油脂，并利用提取后的废水中碳酸盐循环培养微藻的方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将所收获的微藻培养液浓缩成微藻浓缩液，再添加碳酸盐及1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)，得到反应液，进行反应和细胞破壁，以裂解微藻细胞壁。
所述微藻可以为绿藻门、硅藻门、红藻门等含油量较高的淡水微藻(如富油新绿藻(Neochloris oleoabundans))或海水微藻(如微拟球藻(Nannochloropsissp.)、海水小球藻(seawaterChlorella sp.)、特式杜氏藻(Dunaliella tertiolecta))等。实验室培养或室外大规模培养后，进行浓缩，得到微藻浓缩液。例如，利用离心机离心浓缩，将所收获的干重为1g/L的微藻培养液(藻液)浓缩成浓度为4～60g/L(优选为20～40g/L)的微藻浓缩液(湿藻)。本发明直接采用湿藻(即4～60g/L的微藻浓缩液)进行提油，与传统的干藻提油方法相比，可以省去喷干技术带来的能耗成本。
一般的，浓缩条件为：6,000～10,000r/min，离心5～10min，浓缩4～60倍。
优选的，浓缩条件为：10,000r/min，离心5～10min，浓缩20～40倍。
最优的，浓缩条件为：10,000r/min，离心10min，浓缩20～40倍。
在步骤(1)的微藻浓缩液添加一定量的碳酸盐和DBU，在碳酸盐环境中加热一段时间进行破壁处理，使得微藻的细胞壁裂解。
一般的，碳酸盐为碳酸钠或碳酸钾。
优选的，碳酸盐为碳酸钠。
一般的，碳酸盐与微藻浓缩液中水的质量比为1:2.0～6.5。
优选的，碳酸盐与微藻浓缩液中水的质量比为1:2.5～5.0。
最优的，碳酸盐与微藻浓缩液中水的质量比为1:3.0～5.0。
一般的，DBU与微藻浓缩液中水的质量比为1:5～30。
优选的，DBU与微藻浓缩液中水的质量比为1:5～15。
最优的，DBU与微藻浓缩液中水的质量比为1:5～10。
一般的，步骤(1)的反应条件为：加热温度为50～95℃，加热时间为20～100min。
更优的，步骤(1)的反应条件为：加热温度为85～90℃，加热时间为95～100min。
最优的，步骤(1)的反应条件为：加热温度为90℃，加热时间100min。
(2)在步骤(1)反应后的液体加入有机试剂进行盐析萃取，使油脂进入有机相，并与水相分离。
一般的，所述有机试剂可以是甲醇、乙醇、丙醇、异醇、正丁醇、氯仿、正己烷等。
优选的，所述有机试剂为甲醇或乙醇。
一般的，所述有机试剂的质量分数为3～15％。
优选的，所述有机试剂的质量分数为6～12％。
优选的，所述盐析萃取的静置时间为8h以上，使两相充分分离。
一般的，所述盐析萃取的反应温度为30～60℃。
优选的，所述盐析萃取温度为30～40℃。
(3)在步骤(2)中得到的水相中通入二氧化碳pH值降至6.5～10.0后，再与相对应的微藻培养基以一定体积比混合，例如，可以按1:9～99体积比混合，以此为混合培养基，培养微藻，培养结束后进行收获，重复步骤(1)～(3)，用于微藻的循环培养。前文所述的“相对应的微藻培养基”中所述的“相对应”是指与步骤(1)中培养初始微藻时所用的培养基相对应，相一致。
本发明虽然并未对每种微藻所对应的培养基种类依次列举，但本领域技术人员应该知晓，不同的微藻所选用的最适培养基是不同的，本领域技术人员可以依据现有技术的公知常识，结合培养对象微藻种类的不同，选择与其相对应的最适微藻培养基。
在分离得到富含碳酸盐的水相中通入二氧化碳时，回收其中沉淀下来的碳酸氢盐，并对剩余的水相回收利用，可以用作微藻培养原料，利用碳酸氢盐作为原料培养微藻，收获微藻细胞后，进行浓缩，之后加入碳酸盐，重复以上步骤，实现微藻的循环培养。
通入的二氧化碳可使其pH值下降，例如，可以下降至10.0以下，继续通气可以降至6.5～8.5，这个pH根据不同微藻而不同，其依据是与微藻生长最适pH相同即可，达到微藻生长代谢的适宜范围。
一般的，通入的二氧化碳可使其pH值降至6.5～10.0。
优选的，通入的二氧化碳可使其pH值降至6.5～8.5。
优选的，通入的二氧化碳可使其pH值降至7.0～8.0。
一般的，所述混合培养基中含有NaHCO3或KHCO3浓度为50～300mM。
优选的，所述混合培养基中含有NaHCO3或KHCO3浓度为100～300mM。
一般的，将通入二氧化碳的液体与相对应的微藻培养基按1:9～99体积比混合，即可用于微藻培养。
优选的，将通入二氧化碳的液体与相对应的微藻培养基按1:24～99体积比混合。
最优的，将通入二氧化碳的液体与相对应的微藻培养基按1:24体积比混合。
本发明所述在步骤(2)中得到的有机相中加入氯仿和浓硫酸，对其中的油脂进行转酯化，生产生物柴油。
一般的，单位体积的有机相中可加入2～4倍体积的氯仿和0.1～0.5倍体积的浓硫酸进行乙酯化反应。
优选的，单位体积的有机相中可加入3～4倍体积的氯仿和0.1～0.3倍体积的浓硫酸进行乙酯化反应。
最优的，单位体积的有机相中可加入3.27倍体积的氯仿和0.1倍体积的浓硫酸。
一般的，反应条件为：加热温度为85～95℃，加热时间为1～2h。
优选的，反应条件为：加热温度为90℃，加热时间为1h。
本发明所述步骤(2)中还得到中间相(藻渣)，将其经过过滤后直接用于厌氧发酵，制备生物燃气。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明以湿藻为原料，直接将其浓缩破壁，也就是说，本发明中的原料不是藻粉，不涉及喷干技术，极大地降低微藻提油的成本，工艺步骤大大简化。
(2)本发明的乙醇不仅仅是用来具有提取微藻油脂的作用，它还是用来参与微藻油脂乙酯化转变为生物柴油的原料，也就是说，本发明中用于盐析萃取的乙醇，在萃取之后不用采用旋蒸技术将其回收，而将其直接用于微藻油脂乙酯化反应，极大地降低工艺中的能量消耗。
(3)本发明的碳酸盐不仅仅是用来破碎微藻细胞，它还具有为下一批微藻生长提供碳源的作用，也就是说，碳酸盐使微藻破壁后，经盐析萃取后，使其浓缩于水相中，直接将其按一定体积加入到新鲜培养基中，为下一批微藻提供碳源，避免了将水分蒸发将盐回收的工艺，工艺步骤大大简化，能量消耗大大降低。
(4)本发明中湿藻细胞破碎后产生的废水废渣，在盐析萃取作用下，浓缩于下相，与碳酸盐一起混合于新鲜培养基中，用于下批微藻培养，减少了环境的压力。
总之，本发明提供了一种从湿藻中提取油脂，并利用提取后的废水循环培养微藻的新方法。该方法以湿藻为原料，将其浓缩后，采用离子液体和碱液破壁，之后采用乙醇-水-碳酸钠体系进行盐析萃取，最终上相即为脂肪酸和乙醇的混合物，下相中含有大量的碳酸钠可以用于微藻的循环培养。节省了喷干技术产生的成本和能耗，同时将该工艺产生的废液有效的利用，减少了环境的压力。
附图说明
图1本发明微藻提油循环培养的流程图；
图2实施例4中乙醇的用量对脂肪酸在体系中分配系数和回收率的影响，其中a为乙醇用量对脂肪酸在体系中分配系数的影响，b为乙醇用量对脂肪酸在体系中回收率的影响；
图3实施例8中添加不同体积比的萃取体系中的下相对富油新绿藻生长及脂肪酸积累的影响，其中a为添加不同体积比的萃取体系中的下相对富油新绿藻干重的影响，b为添加不同体积比的萃取体系中的下相对培养基中pH的影响，c为添加不同体积比的萃取体系中的下相对富油新绿藻脂肪酸含量的影响，d为添加不同体积比的萃取体系中的下相对富油新绿藻脂肪酸单位体积产量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的有关技术问题作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1富油新绿藻破壁
将0.1g/L的富油新绿藻(The Culture Collection of Algae at theUniversity of Texas at Austin)(UTEX 1185)接种于1L锥形瓶中，将其置于摇床上，在光强为4500lux的LED灯板下，温度为25℃条件下培养7天，得到富油新绿藻。本实施例中采用的培养基为：https://utex.org/products/bristol-medium。取100mL富油新绿藻藻液进行20倍离心浓缩(10000r/min，5min)，将离心得到的20g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到5mL体积(即水的质量视为5g)，即浓缩20倍。向其中加入一定质量的DBU和碳酸钠粉末，在一定温度条件下反应一段时间，即可破壁。
本实施例针对反应时间、DBU的添加量、碳酸钠的添加量及反应温度四种变量对该藻破壁率的影响进行探究，之后采用氯仿对破壁后的微藻进行萃取，再加入甲醇-氯仿-浓硫酸混和溶液进行甲脂化反应，以最终通过气相色谱检测得到的脂肪酸甲脂作为响应值，采用中心合成实验设计优化该藻的破壁率。本实施例针对上述四种变量选取五个水平，分别为：反应时间(A)(20、40、60、80、100min)、DBU的添加量(即DBU与水的质量比)(B)(1:5、1:7.5、1:10、1:12.5、1:15)、碳酸钠的添加量(即碳酸钠与水的质量比)(C)(1:2、1:3、1:4、1:5、1:6)，采用如下30个实验组合，具体值见表1，实验结果分析见表2。使用同批湿藻冻干后法进行转脂化，并将气相色谱检测的该藻总脂肪酸含量作为本实施例的阳性对照。采用同种浓缩方式浓缩等量藻液后，不经加热，直接采用氯仿萃取为本实验的阴性对照。最终测得阴性对照提油率为3.74％±0.03，该结果说明氯仿对富油新绿藻的破壁率影响不明显。
表1中心合成实验中不同变量下富油新绿藻的破壁率
Figure GDA0003392389250000051
Figure GDA0003392389250000061
表2富油新绿藻破壁中心合成实验方差分析结果
Figure GDA0003392389250000062
Figure GDA0003392389250000071
表2中的p值，其中p≤0.05的项对破壁率影响显著，即反应时间-反应温度对该藻的破壁率的影响是显著的；p≤0.01的项对破壁率影响极显著，即反应时间、DBU的添加量、碳酸钠的添加量、反应时间-碳酸钠的添加量对该藻的破壁率的影响是极其显著的。
结合表1和表2的结果进行分析，碳酸钠与水的质量比越大，破壁效果越好。因此对于富油新绿藻，碳酸钠与水的质量比为1:5以上更适用于该藻破壁。当碳酸盐浓度过高时，后期萃取中加入乙醇会使盐析出，因此富油新绿藻的破壁的最优碳酸钠与水的质量比为1:3～5。DBU浓度对富油新绿藻破壁率影响也很显著，实验结果表明DBU浓度越高，破壁效果越好，因此最优的DBU与水的质量比为1:5～7.5。实验结果表明反应时间越长，破壁效果越好，因此最优的反应时间为80～100min。尽管表3中的数据显示，反应温度对破壁效果不显著，但考虑到高温有利于提高DBU的稳定性及低温会避免水分的蒸发，提高封闭系统的稳定性，因此确定最优的反应温度为85～90℃。
综上所述，富油新绿藻破壁的最优条件为：碳酸钠与水的质量比为1:3～5，DBU与水的质量比为1:5～7.5，反应时间为为80～100min，反应温度为85～90℃。在最优条件下，富油新绿藻的破壁率可达到86.2％以上。
实施例2海水小球藻破壁
将0.1g/L的海水小球藻(中国科学院海洋研究所CHI-1)接种于1L锥形瓶中，将其置于摇床上，在光强为4500lux的LED灯板下，温度为25℃条件下培养7天，得到海水小球藻。取200mL海水小球藻藻液进行40倍离心浓缩(10000r/min，5min)，将离心得到的40g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到5mL体积(即水的质量视为5g)，即浓缩40倍。向体系中加入DBU和碳酸钠粉末。DBU与水的质量比为1:7.5，碳酸钠与水的质量比为1:3。采用恒温水浴加热，在85℃下反应80min，得到破壁后的微藻混合液，测定最终破壁率为83.7％。
本实施例中采用的培养基为：https://utex.org/products/f_2-medium。
实施例3微拟球藻破壁
将0.1g/L的微拟球藻(中国科学院海洋研究所chy-1)接种于1L锥形瓶中，将其置于摇床上，在光强为4500lux的LED灯板下，温度为25℃条件下培养7天，得到微拟球藻。取400mL微拟球藻藻液进行25倍离心浓缩(10000r/min，5min)，将离心得到的25g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到8mL体积(即水的质量视为5g)，即浓缩25倍。向体系中加入DBU和碳酸钠粉末。DBU与水的质量比为1:7.5，碳酸钠与水的质量比为1:3。采用恒温水浴加热，在90℃下反应100min，得到破壁后的微藻混合液，测定最终破壁率为93.5％。
本实施例中采用的培养基为：https://utex.org/products/f_2-medium。
实施例4富油新绿藻油脂提取
富油新绿藻的培养见实施例1，取300mL富油新绿藻藻液进行20倍离心浓缩(10000r/min，5min)，将离心得到的20g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到15mL体积(即水的质量视为15g)，即浓缩20倍。向体系中加入DBU和碳酸钠粉末。DBU与水的质量比为1:7.5，碳酸钠与水的质量比分别为1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5。采用恒温水浴加热，在90℃下反应100min。待其冷却至室温，向破壁后的微藻混合液体系中加入质量分数分别为6％、9％、12％的乙醇，将该体系置于漩涡混匀器上震荡1min，于30℃下静置8h。最终分别取上相(乙醇相)和下相(水相)样品测定脂肪酸分配系数(K)和回收率(Y)。
从图2可以看出，脂肪酸具有较高的分配系数和回收率，表明脂肪酸更倾向于集中在上相。其中体系中的乙醇质量分数与分配系数和脂肪酸回收率呈正相关关系，当体系中乙醇浓度增加时，分配系数和脂肪酸回收率增加。当乙醇浓度增加到12％(w/w)，碳酸钠与水的质量比为1:3时，下相开始有盐析出。图2的结果表明，当乙醇浓度为9％(w/w)，碳酸钠与水的质量比为1:3时，脂肪酸分配系数和回收率分别达到最大，分别为96.7和97.9％，表明几乎绝大部分脂肪酸都集中在上相。
综上所述，富油新绿藻油脂提取的最优条件为乙醇质量分数为9～12％，碳酸钠与水的质量比为1:3～3.5。在最优条件下，富油新绿藻脂肪酸的分配系数可达到69.1以上，脂肪酸回收率可达到97.7％以上。
实施例5特式杜氏藻油脂提取
将0.1g/L的特式杜氏藻(中国科学院淡水藻种库FACHBb-821)接种于1L锥形瓶中，将其置于摇床上，在光强为4500lux的LED灯板下，温度为25℃条件下培养7天，得到特式杜氏藻。取200mL特式杜氏藻藻液进行20倍离心浓缩(10000r/min，5min)，将离心得到的20g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到10mL体积(即水的质量视为10g)，即浓缩20倍。向体系中加入DBU和碳酸钠粉末。DBU与水的质量比为1:7.5，碳酸钠与水的质量比为1:3。采用恒温水浴加热，在90℃下反应100min。待其冷却至室温，向破壁后的微藻混合液体系中加入质量分数9％的乙醇，将该体系置于漩涡混匀器上震荡1min，于30℃下静置8h。最终分别取上相(乙醇相)和下相(水相)样品测定脂肪酸分配系数和回收率。最终脂肪酸分配系数和回收率分别达到95.8和98.9％，油脂提取率为130％。
本实施例中采用的培养基为：http://algae.ihb.ac.cn/Products/ProductDetail.aspx？product＝18。
实施例6微拟球藻油脂提取
微拟球藻的培养见实施例3，取300mL微拟球藻藻液进行20倍离心浓缩，离心得到的20g/L的微藻浓缩液中加入去离子水定容到15mL体积(即水的质量视为15g)，即浓缩20倍。向体系中加入DBU和碳酸钠粉末。DBU与水的质量比为1:7.5，碳酸钠与水的质量比为1:4。采用恒温水浴加热，在90℃下反应100min。待其冷却至室温，向破壁后的微藻混合液体系中加入质量分数12％的甲醇，将该体系置于漩涡混匀器上震荡1min，于30℃下静置8h。最终分别取上相(甲醇相)和下相(水相)样品测定脂肪酸分配系数和回收率。最终脂肪酸分配系数和回收率分别达到60.3和97.5％，油脂提取率为103％。
实施例7特式杜氏藻油转酯化
实施例5中萃取结束后，向已分离出的上相(乙醇相)中加入3.27倍(体积比)的氯仿，0.1倍(体积比)浓硫酸，在恒温水浴90℃条件加热1h，完成转乙酯化。最终油脂的转化率达到98％。
实施例8富油新绿藻的循环培养
实施例4中萃取结束后，向已分离出的萃取体系的下相(水相)中通入二氧化碳，直至pH降至8.0，达到富油新绿藻生长所需的最适pH范围。将通入二氧化碳的下相与新鲜培养基(pH＝8.0)分别按1:11.5、1:15.7、1:24、1:49、1:99体积比混合，即下相体积分数为1％、2％、4％、6％、8％。加入NaHCO3粉末直至混合培养基中的NaHCO3浓度为300mM。将0.1g/L的富油新绿藻接种于1L锥形瓶中，将其置于摇床上，在光强为4500lux的LED灯板下，温度为25℃条件下培养7天。
观察图3a发现，培养到第7天时，添加萃取体系中的下相(v/v)为6％和8％的培养基中培养的微藻的干重略低于新鲜培养基中的微藻干重。观察图3b中，发现添加萃取体系中的下相的培养基比新鲜培养基对pH值具有更强的缓冲效果。萃取体系中的下相的添加比例越高，其对pH的缓冲能力就越强。观察图3c发现随着萃取体系中的下相体积添加比例的提高，富油新绿藻的总脂肪酸含量也会随之提高。当添加萃取体系中的下相(v/v)为4～8％时，富油新绿藻的总脂肪酸在第7天积累量能达到20％(DCW)以上，显著地高于空白对照组。如图3d所示，当添加萃取体系中的下相(v/v)为4％时，总脂肪酸单位体积产量最高，可达到0.35g/L，是对照组的1.63倍。添加其它体积比的萃取体系中的下相的培养基中的总脂肪酸单位体积产量均高于空白对照组。
综上所述，萃取体系中的下相与新鲜培养基按1:11.5～99体积比(即下相体积分数1～8％)混合为富油新绿藻循环培养的优选混合比例。按1:24体积比(即下相体积分数4％)将萃取体系中的下相与新鲜培养基混合为富油新绿藻循环培养的最优混合比例。富油新绿藻在最优混合比例的混合培养基中培养7天，干重可达到1.68g/L，总脂肪酸含量为20.6％(DCW)，脂肪酸单位体积产量为0.35g/L，是新鲜培养基培养的微藻的1.63倍。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (9)

1.一种碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所收获的微藻培养液浓缩成微藻浓缩液，再添加碳酸盐及1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，得到反应液，进行反应和细胞破壁；
(2)在步骤(1)反应后的液体中加入有机试剂进行盐析萃取，得到有机相、水相；
(3)在步骤(2)中得到的水相中通入二氧化碳至pH值6.5～10.0后，并以一定比例添加至微藻培养基中培养微藻，重复步骤(1)～(3)；
步骤(1)中所述碳酸盐为碳酸钠或碳酸钾，所述碳酸盐与微藻浓缩液中水的质量比为1:3～5；
步骤(1)中所述1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯与微藻浓缩液中水的质量比为1:5～7.5；
步骤(1)的反应条件为：加热温度85～90℃，加热时间80～100min；
步骤(2)中所述有机试剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、氯仿或正己烷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所得的水相中通入二氧化碳时，回收其中沉淀下来的碳酸氢盐，并对剩余水相回收利用，重新用于微藻培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述有机试剂的质量分数为3～15％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述盐析萃取的反应温度为30～60℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述水相与微藻培养基体积比例为1:9～99。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中得到的有机相中加入氯仿及浓硫酸，进行转酯化反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，单位体积的有机相加入2～4倍体积的氯仿和0.1～0.5倍体积的浓硫酸，在85～95℃下反应1～2h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻为绿藻门或硅藻门。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述微藻为富油新绿藻（ Neochloris oleoabundans ） 、小球藻（ Chlorella sp. ） 、杜氏藻（ Dunaliella sp. ） 或微拟球藻（ Nannochloropsissp. ）。
CN201810747776.8A 2018-07-10 2018-07-10 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法 Active CN109055228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810747776.8A CN109055228B (zh) 2018-07-10 2018-07-10 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810747776.8A CN109055228B (zh) 2018-07-10 2018-07-10 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109055228A CN109055228A (zh) 2018-12-21
CN109055228B true CN109055228B (zh) 2022-02-11

Family

ID=64819201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810747776.8A Active CN109055228B (zh) 2018-07-10 2018-07-10 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109055228B (zh)

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045352A (zh) * 2011-10-17 2013-04-17 中国石油化工股份有限公司 一种微藻油脂的提纯方法
CN102703135B (zh) * 2012-05-03 2014-08-13 北京国力源高分子科技研发中心 一种制备生物柴油的方法
CN103013833B (zh) * 2012-12-28 2014-10-29 中国科学院南海海洋研究所 一种高pH诱导、耦合二氧化碳减排的微藻采收新方法
CN103484373B (zh) * 2013-10-01 2016-03-09 陈意民 一种浓缩收集微藻的方法
CN103756981A (zh) * 2014-01-15 2014-04-30 李美凤 离子液体用于螺旋藻Fe-SOD酶的提取
CN103897801A (zh) * 2014-03-18 2014-07-02 中国农业机械化科学研究院 湿法提取小球藻油脂的方法及装置
WO2015184629A1 (zh) * 2014-06-06 2015-12-10 台湾中油股份有限公司 以耐水酸性离子液体进行微藻破壁与萃油同时酯化藻油的方法
TWI513813B (zh) * 2014-06-06 2015-12-21 Cpc Corp Taiwan 以耐水酸性離子液體進行微藻破壁與萃油同時酯化藻油之方法
CN104059773A (zh) * 2014-07-02 2014-09-24 华南理工大学 一种湿法提取纯化微藻藻油的方法
EP3172297B1 (en) * 2014-07-23 2018-07-25 Stamicarbon B.V. acting under the name of MT Innovation Center Method for treating algae
CN105623831B (zh) * 2014-10-28 2019-09-10 中国石油化工股份有限公司 一种微藻油脂的提取方法
CN107488501A (zh) * 2017-09-21 2017-12-19 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 微生物来源的多不饱和脂肪酸油脂及其制备工艺
CN107473999B (zh) * 2017-09-21 2020-05-08 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 微生物的破壁方法及类胡萝卜素产品

Also Published As

Publication number Publication date
CN109055228A (zh) 2018-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Phong et al. Proteins recovery from wet microalgae using liquid biphasic flotation (LBF)
CN101580857B (zh) 微藻一步法制备生物能源
CN103045352A (zh) 一种微藻油脂的提纯方法
US8986962B2 (en) Organism co-culture in the production of biofuels
Brar et al. Potential of oleaginous yeast Trichosporon sp., for conversion of sugarcane bagasse hydrolysate into biodiesel
Muthukumar et al. Biodiesel production from marine microalgae Chlorella marina and Nannochloropsis salina
CN104312720A (zh) 一种提取小球藻中油脂的方法
CN103993046A (zh) 一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法
CN103911217B (zh) 一种一步法制生物柴油的方法
US10301656B2 (en) Oleaginous yeast variant, method for obtaining thereof and use thereof for lipid production
CN103937604A (zh) 一种提取微藻中油脂的方法
CN109055228B (zh) 碳酸盐辅助提取微藻油脂并吸收二氧化碳循环培养的方法
CN104560731A (zh) 一种高产角鲨烯的类酵母菌及其应用
CN102234565B (zh) 一种重复利用布朗葡萄藻细胞提取生物质油的方法
CN104232559A (zh) 养殖微藻的方法及生产油脂的方法
Krishnan et al. Extraction of algal neutral lipids for biofuel production
US11898189B2 (en) Microalgal strain and its use for the production of lipids
CN104560375B (zh) 一种微藻油脂的提取方法
CN105623831B (zh) 一种微藻油脂的提取方法
CN103571610A (zh) 一种微藻油脂的提纯方法
CN105669258A (zh) 一种产油微生物发酵培养液的资源化利用方法
CN106467894B (zh) 一株高产淀粉和油脂的单针藻及其培养应用
WO2015044721A1 (en) Microalgae biorefinery for biofuel and valuable products production
Ganesan et al. Algal biodiesel: technology, hurdles, and future directions
CN114164115B (zh) 一种新的淡水产油微藻物种及其培养方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant