CN104059773A - 一种湿法提取纯化微藻藻油的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种湿法来提取纯化微藻藻油的方法，包括如下步骤：1)向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速搅拌均匀，离心，收集沉淀，获得脱水处理后的藻泥；2)向步骤1)获得的脱水处理后的藻泥中加入无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液，同时对藻泥进行细胞破壁处理，提取微藻中的粗油；3)离心，收集步骤2)提取得到的粗油，向其中加入水和无机盐，搅拌均匀，形成粗油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均匀后静置分层或离心分层，共形成三层，分别是上层溶液、中间层固形物和下层溶液，收集上层溶液；4)将上层溶液进行脱溶剂处理，获得微藻藻油。本发明的方法提取纯化微藻藻油，其可酯化油脂得率高，容易操作，能耗低。

Description

一种湿法提取纯化微藻藻油的方法

技术领域

本发明涉及能源和微藻生物技术领域，特别涉及一种通过乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取来获得纯化微藻藻油的方法。

背景技术

随着人口的增长及生活水平的提高，世界范围内对能源，尤其是运输能源的需求量不断增大；与此同时，全球气候变暖及石油储量减少的问题日益突出。作为一种可本土供应的、容易生物降解的，以及可直接应用于现存柴油机并减少尾气排放的能源，生物柴油被广泛的认为是最具潜力的石油替代品。

目前，生物柴油开发面临的一个主要障碍是可再生原料的获得。据估计，原料成本占生物柴油总生产成本的45～58％(Energy Policy,2006,34(17):3268-3283)。因此，廉价的、且不影响食品市场的原料是未来可再生生物柴油发展的关键。而微藻，作为一种水生非食物作物，被认为最理想的生物柴油炼制原料，其产油能力是传统陆生作物的15～300倍(BiotechnologyAdvances,2007,25(3):294-306)，在理想条件下，其每亩的产能可达到5000～15000加仑每年，且不争地、争水、争粮。

如今，微藻中的甘油三酯通过酯交换反应制备生物柴油的技术已取得重大的突破，而微藻生物质的综合利用以及高成本的油脂提取技术是微藻生物柴油规模化开发的主要障碍。尤其是油脂提取过程，传统方法通常需要对微藻进行干燥处理，并涉及有毒溶剂的使用，导致藻类基质的污染问题。

普通小球藻(Chlorella vulgaris)用于炼制生物柴油的生命周期评估显示，传统的以干燥藻粉为原料的有机溶剂提取法中，小球藻的采收和干燥占整个炼制过程能源消耗的60％以上(The International Journal of Life Cycle Assessment,2010,15(7):704-714)，使得微藻生物柴油的炼制成本至少是传统柴油的10倍以上。

近年来，国内外科研工作者对从微藻培养池或藻泥中湿法提取油脂的技术进行了广泛地研究。但由于微藻坚韧的细胞壁，一些物种甚至还有额外的矿物质层，如硅藻，能够抵御外界高强度的破坏作用，使得湿法提取过程需要高强度的能源消耗。

酸碱水提法(Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2000,75(5):348-352)作为一种无需干燥且避免使用有机溶剂的提取方法，曾广泛应用于生物质能源的开发。但该方法存在以下不足：1、油脂提取过程把蛋白质等其它成分也一并提取出来，造成营养物质的浪费；2、由于油脂在水中的溶解度小，酸碱水提法的油脂提取率往往仅有40～70％；3、由此产生的酸碱废水处理成本较高。

超临界流体萃取(SFE)(如超临界水、乙醇、甲醇等)是一种利用化合物在流体中的溶解度在高压和高温条件下显著性增加的提取方法[34]。虽然该方法避免了微藻干燥过程，且提取率高，可综合利用微藻生物质，但保持高压和高温所需的设备及能源投入巨大，限制了其在生物能源方面规模化的应用。

Teixeira等人提出了通过离子液体高效破坏细胞壁提取油脂的方法(Green Chemistry,2012,14(2):419-427)，常压100℃下，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)在[BMIM]Cl中处理15min后，95％以上的细胞消失，该方法可直接应用于含水量90％以上的藻泥。但离子液体价格高昂，且回收难度大。

膜分离原位萃取法利用具有生物相容性溶剂(如十二烷、右旋柠檬烯和对伞花烃等)，微藻培养的同时进行油脂的提取，无需破坏细胞壁即可萃取培养池中微藻细胞中的油脂(Bioresource Technology,2013,134(2013):271-275)，但该方法提取效率低，且需要进一步的研究以确定其对微藻细胞活力及油脂合成是否具有长期的影响。

在目前的大多数湿法提取微藻油脂的方法中，或需要高能耗的微藻干燥过程，或需要高昂的设备及能源投入，或无法利用微藻中除油脂外的其它营养物质，或油脂提取率低等。对于微藻生物柴油的开发，高成本的生物质干燥和油脂提取过程，以及微藻生物质的综合利用是其规模化开发的主要障碍。

发明内容

为弥补现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提出一种乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取纯化以获得较纯净的微藻藻油的方法，该方法提取纯化微藻藻油，其可酯化油脂得率高，容易操作，能耗低。

本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

一种以乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取来获得纯化微藻藻油的方法，包括如下步骤：

1)脱水处理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，快速搅拌均匀，离心，收集沉淀，获得脱水处理后的藻泥；

2)湿法提油：向步骤1)获得的脱水处理后的藻泥中加入无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液，同时对藻泥进行细胞破壁处理，提取微藻中的粗油；

3)离心，收集步骤2)提取得到的粗油，向其中加入水和无机盐，搅拌均匀，形成粗油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均匀后静置分层或离心分层，共形成三层，分别是上层溶液、中间层固形物和下层溶液，收集上层溶液；

4)将上层溶液进行脱溶剂处理，获得微藻藻油。

进一步的，步骤1)中，乙醇溶液的加入量为所述采收的微藻藻泥中所含水量的0.1～5倍体积的量，所述的乙醇溶液为浓度在30％(v/v)以上的乙醇水溶液。

优选的，乙醇溶液的加入量为所述采收的微藻藻泥中所含水量的0.5～2倍体积的量，所述乙醇溶液为浓度在70～90％(v/v)的乙醇水溶液。采用该优选条件，脱水效果最佳，而且微藻中脂肪酸甲酯(FAME)的损失率较小。而乙醇溶液添加量的继续增加，脱水后藻泥含水量不会明显的减少更多，但是，微藻中FAME的损失率会大大增加。

进一步的，步骤2)中，所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液的加入量为，相对每毫克脱水处理后藻泥干重，向其中加入5～50mL所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液(例如体积分数为95％的乙醇水溶液)，步骤2)中进行提取的温度为90℃，提取的时间为80min。

优选的，相对每毫克脱水处理后藻泥干重，加入10～20mL所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液。

进一步的，步骤2)中所述无毒性或微毒性的有机溶剂选自乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或多种组合。

步骤2)中，对藻泥进行细胞破壁处理采用本技术领域常用的细胞破壁处理方法即可，并无特别限制，例如可以高压均质、微波、超声波、脉冲电场、冻融、研磨、酸处理、碱处理中的一种或多种组合的方式，这些均是本技术领域常用的细胞破壁方式。在一种具体实施方式中，步骤2)具体可按如下方法操作：将步骤1)脱水后的藻泥置于微波反应罐中，相对每毫克脱水处理后藻泥干重，向其中加入5～50mL所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液，微波频率范围调节为800MHZ～1000MHZ，提取温度为90℃，提取时间为80min。

优选的，步骤3)中，向粗油中加入水的量为使粗油水溶液中水的体积分数达到10％～90％，向粗油中加入无机盐的量为使其在粗油水溶液中的浓度达到0.01～5mol/L；向所述粗油水溶液中加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.01～4倍体积的量。加入一定浓度的无机盐，对油/水乳状液具有反乳化作用，促进油水分离，有助于提高油脂在正己烷层的溶解效率。

更为优选的，步骤3)中，向粗油中加入水的量为使粗油水溶液中水的体积分数达到40％～60％，向粗油中加入无机盐的量为使其在粗油水溶液中的浓度达到0.05～2mol/L；向所述粗油水溶液中加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.2～0.8倍体积的量。采用该更为优选的条件，正己烷萃取油脂的效果更好，可更好的提高FAME回收率。所述无机盐选自氯化钙、氯化镁、氯化钠、氯化钾、硫酸铵中的一种或多种的组合。其中，以氯化钙最佳。

可选的，步骤1)和步骤3)分别重复操作两次或多次。

本发明的方法中，所述微藻没有特别的限制，譬如为微绿球藻等。

本发明的有益效果：

1、湿法提油前对采收的微藻藻泥进行乙醇脱水处理，不仅有效降低了微藻干燥所需的能耗，并大幅减少了湿法提油过程中藻泥含水量对可酯化油脂提取率的影响，同时，脱水处理后获得的色素等物质可用于进行综合利用。

2、以无毒性或微毒性的有机试剂为提取溶剂，使得提取后的藻渣可作为其它营养物质提取的原料，或用于动物饲料的开发。

3、正己烷萃取过程中，粗油中的蛋白质、色素等物质的去除率高，可酯化油脂的损失小，且该过程不改变油脂中脂肪酸的组成。

4、本发明的方法可酯化油脂的得率高，设备及能源成本低，容易操作，便于工业化应用。

附图说明

图1是本发明的乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取纯化获得较纯净的微藻藻油的基本流程示意图；

图2是实施例4～8中藻泥经不同浓度乙醇溶液脱水后，藻泥中含液率和含水量的变化，及脱水前后微藻中FAME损失率的情况；

图3是实施例6和9～11中藻泥经添加不同量乙醇溶液脱水后，藻泥中含液率和含水量的变化，及脱水前后微藻中FAME损失率的情况；

图4是实施例6和12～13中藻泥经乙醇溶液脱水不同次数后，藻泥中含液率和含水量的变化，及脱水前后微藻中FAME损失率的情况；

图5是实施例14～19中藻泥的含水量对微波辅助湿法提油过程可酯化油脂得率的影响；

图6是实施例20～25中添加的无机盐种类对FAME回收率的影响；

图7是实施例20和26～30中粗油水溶液中氯化钙的浓度对FAME回收率的影响；

图8是实施例27和31～36中粗油水溶液中水的体积分数对FAME回收率的影响；

图9是实施例27和37～43中添加的正己烷与粗油水溶液的体积比对FAME回收率的影响；

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明：

以下实施例选用的原料均为海洋微绿球藻(Nannochloris sp.)藻泥，由中国科学院南海海洋研究所户外跑道池培养获得。离心获得的藻泥用去离子水洗涤震荡后，10000r/min离心8min，去掉上清，重复2次后，收集藻泥作为采收的微藻藻泥，备用。

实施例1

一种以乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取来提取纯化微藻藻油的方法，按照如下步骤进行：

1)脱水处理：称取5g采收的微藻藻泥于50mL无菌离心管，向微藻藻泥中加入乙醇溶液，该乙醇溶液的加入量为微藻藻泥中所含有的水的1倍体积的量，该乙醇溶液为83％(V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后进行涡旋0.5min，10000r/min离心5min，收集沉淀，获得脱水后的藻泥；

经检测，脱水后藻泥中含水量由刚采收的藻泥的90％降至37.41％。在该脱水处理过程中，FAME损失率仅为6.02％。

2)湿法提油：将步骤1脱水后的藻泥置于微波反应罐(Milestone ETHOS A)中，相对每毫克脱水处理后的藻泥干重，向其中加入20mL95％(v/v)的乙醇水溶液作为提取溶剂，微波频率范围调节为800MHZ～1000MHZ，提取温度为90℃，提取时间为80min。

3)油脂提取完成后，10000r/min离心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和氯化钙，搅拌均匀后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的体积分数为50％为准，氯化钙的加入量以使粗油水溶液中氯化钙的浓度为0.1mol/L为准。然后向粗油水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.4倍体积的量，混匀后静置720min，收集上层溶液。

4)将收集的上层溶液进行真空旋转蒸发以脱除溶剂，获得微藻藻油。

经实施例1提取纯化后的微藻油脂，经检测，其中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和蛋白质的含量分别减少为原步骤2获得的粗油中含量的20.28％、32.11％、30.35％和1.21％，同时脂肪酸的浓度浓缩为粗油的1.60倍，脂肪酸组成无显著性变化(p＞0.05)，即没有改变油脂的组成。FAME的回收率达到95.8％。

实施例2

一种以乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取来提取纯化微藻藻油的方法，按照如下步骤进行：

1)脱水处理：称取5g采收的微藻藻泥于50mL无菌离心管，向微藻藻泥中加入乙醇溶液，该乙醇溶液的加入量为微藻藻泥中所含有的水的0.5倍体积的量，该乙醇溶液为72％(V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后进行涡旋0.5min，10000r/min离心5min，收集沉淀，获得脱水后的藻泥；

经检测，脱水后藻泥中含水量由刚采收的藻泥的90％降至54.47％。在该脱水处理过程中，FAME损失率为4.21％。

2)湿法提油：将步骤1脱水后的藻泥置于微波反应罐(Milestone ETHOS A)中，相对每毫克脱水处理后的藻泥干重，向其中加入10mL95％(v/v)的乙醇水溶液作为提取溶剂，微波频率范围调节为800MHZ～1000MHZ，提取温度为90℃，提取时间为80min。

3)油脂提取完成后，10000r/min离心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和氯化钙，搅拌均匀后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的体积分数为40％为准，氯化钙的加入量以使粗油水溶液中氯化钙的浓度为0.05mol/L为准。然后向粗油水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.2倍体积的量，混匀后静置720min，收集上层溶液。

4)将收集的上层溶液进行真空旋转蒸发以脱除溶剂，获得微藻藻油。

经实施例1提取纯化后的微藻油脂，经检测，其脂肪酸的浓度浓缩为粗油的1.3倍，脂肪酸组成无显著性变化(p＞0.05)，即没有改变油脂的组成。FAME的回收率达到51.3％。

实施例3

一种以乙醇脱水-湿法提油-正己烷萃取来提取纯化微藻藻油的方法，按照如下步骤进行：

1)脱水处理：称取5g采收的微藻藻泥于50mL无菌离心管，向微藻藻泥中加入乙醇溶液，该乙醇溶液的加入量为微藻藻泥中所含有的水的2倍体积的量，该乙醇溶液为90％(V/V)的乙醇水溶液，加入乙醇溶液后进行涡旋0.5min，10000r/min离心5min，收集沉淀，获得脱水后的藻泥；

经检测，脱水后藻泥中含水量由刚采收的藻泥的90％降至48.34％。在该脱水处理过程中，FAME损失率仅为16.12％。

2)湿法提油：将步骤1脱水后的藻泥置于微波反应罐(Milestone ETHOS A)中，相对每毫克脱水处理后的藻泥干重，向其中加入50mL95％(v/v)的乙醇水溶液作为提取溶剂，微波频率范围调节为800MHZ～1000MHZ，提取温度为90℃，提取时间为80min。

3)油脂提取完成后，10000r/min离心8min，收集提取的粗油。向粗油中加入水和氯化钙，搅拌均匀后，形成粗油水溶液，加入的水量以使粗油水溶液中水的体积分数为60％为准，氯化钙的加入量以使粗油水溶液中氯化钙的浓度为2mol/L为准。然后向粗油水溶液中加入正己烷，加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.8倍体积的量，混匀后静置720min，收集上层溶液。

4)将收集的上层溶液进行真空旋转蒸发以脱除溶剂，获得微藻藻油。

经实施例1提取纯化后的微藻油脂，经检测，其脂肪酸的浓度浓缩为粗油的1.2倍，脂肪酸组成无显著性变化(p＞0.05)，即没有改变油脂的组成。FAME的回收率达到47.1％。

本申请发明人还通过多个实验对本发明所提供的方法中的多个影响因素进行了研究，详细内容如下：

实施例4～8为研究在脱水处理步骤中乙醇溶液的浓度对脱水效果的影响的实施例。

实施例4

海洋微绿球藻藻泥用去离子水洗涤震荡后，10000r/min离心8min，去掉上清，重复2次后，收集藻泥备用。

乙醇脱水处理：称取5g藻泥于50mL无菌离心管，按乙醇溶液与原藻泥中的水的体积比1:1添加60％(V/V)的乙醇水溶液，涡旋0.5min，10000r/min离心5min，脱水后的藻泥转入15mL无菌离心管待测。

实施例5～8

实施例5～8与实施例4均基本相同，其不同点在于添加的乙醇溶液的浓度不同，实施例5～8的乙醇溶液的浓度依次分别为72％(V/V)、83％(V/V)、90％(V/V)和100％。

实施例4～8脱水效果分析

未经乙醇脱水处理的藻泥含水量为89％，不同浓度的乙醇溶液，在相同的添加量下，对藻泥脱水效果表现出显著性(p≥0.05)差异，参见图2。当添加的乙醇浓度小于等于83％(V/V)时，随着添加的乙醇浓度增加，脱水后藻泥中含液率及含水量下降，这是因为随着添加的乙醇浓度增加，脱水过程中乙醇的含量增加，藻泥中的水被乙醇取代的量增加。添加60％(V/V)、72％(V/V)、83％(V/V)的乙醇溶液时，藻泥中的含水量分别下降至55.63％、50.98％和37.41％。而当添加的乙醇浓度为90.00％(V/V)和100.00％时，由于疏水性过大，脱水时湿藻泥结团，导致添加的乙醇溶液无法与藻泥内部的水进行顺利的交换，乙醇脱水的效果有所下降。此外，随着添加的乙醇浓度增加，微藻中FAME损失率增加，这是由于脱水过程中，乙醇浓度的增加导致油脂在溶液中的溶解度增加，当乙醇浓度为90.00％(V/V)和100.00％时，FAME的损失率分别达到14.49％和18.31％。综合比较下，实施例3的脱水效果较好，脱水后藻泥中水的质量分数为37.41％，FAME的损失率为6.02％。

实施例9～11为研究在脱水处理步骤中乙醇溶液的加入量对脱水效果的影响的实施例。

实施例9～11与实施例6均基本相同，其不同点在于添加的乙醇溶液与原藻泥中水的体积比不同，实施例9～11添加的乙醇溶液与原藻泥中水的体积比依次分别为1:2、2:1和5:1。

实施例6和9～11脱水效果分析

如图3所示，随着乙醇溶液的添加量增加，脱水后藻泥的含液率减少，这是因为，滤饼或以其它方式脱水后物质中液体的含量与液体的表面张力成正比，而随着乙醇溶液添加量的增加，脱水过程中乙醇浓度增加，引起液体整体的表面张力减小，从而导致藻泥中保留的液体含量减少。当添加的乙醇溶液与原藻泥中的水的体积比为1:1时，脱水后，藻泥含水量下降至37.41％，微藻中FAME的损失率为6.02％。随着乙醇溶液添加量的继续增加，脱水后藻泥含水量减少则趋于缓慢，与此同时，微藻中FAME的损失率呈直线升高趋势。综合考虑后，实施例6的脱水效果最好。

实施例12～13为研究在脱水处理步骤的重复次数对脱水效果的影响。

实施例12～13与实施例6均基本相同，其不同点在于脱水步骤的重复次数不同，实施例6为脱水1次，而实施例12～13的脱水的次数依次分别为2和3。

实施例6和12～13脱水效果分析

由于采收后的藻泥含水量较高(82.17％～95.88％)，需要进行乙醇的多级脱水才能达到理想含水量的藻泥，如图4所示，湿藻泥经过一次、二次和三次乙醇脱水后，藻泥中含水量分别降至37.42％、25.32％和19.61％，同时，微藻中FAME的损失率分别达到6.02％、18.31％和25.28％。为减少FAME的损失，实施例6的脱水方案为最佳。

实施例14～19为研究湿法提油步骤中，藻泥脱水程度(或含水量)对提取效果的影响。

实施例14

微藻粗油提取：称取生物质干重为1g含水量为95％的藻泥于50mL微波反应罐，按料液比1:20添加95％(V/V)的乙醇溶液作为提取溶剂，提取条件：Milestone ETHOS A采用温度控制模式，微波频率范围800MHZ～1000MHZ自动调节，提取温度为90℃，提取时间为80min。油脂提取完成后，10000r/min离心8min，收集提取的粗油，真空旋转蒸发后，用氯仿定容至10mL，取2mL的定容液，测定可酯化油脂的含量。

可酯化油脂得率＝提取的可酯化油脂含量/微藻生物质干重×100％

实施例15～19

实施例15～19与实施例14均基本相同，其不同点在于所用藻泥的含水量不同，实施例15～19的所用藻泥的含水量依次分别为10％、20％、40％、60％和80％。

实施例14～19可酯化油脂提取效果分析

如图5所示，藻泥含水量对微波辅助湿法提取微藻中的可酯化油脂具有较大的影响，当含水量从10％上升至95％时，FAME的得率下降了75.19％。因此，需要对新鲜采收的藻泥(含水量约80～95％)进行一定程度的脱水，当藻泥中的含水量降到20％～40％时，藻泥中的含水量对可酯化油脂的提取率无显著性影响(p＞0.05)，该含水量可作为藻泥提取前脱水的目标值。由实施例6可知，新鲜采收的含水率为89％的藻泥，经83％的乙醇溶液一次脱水后，藻泥中的水的质量分数即可下降至37.42％，能够满足微波辅助湿法提油过程对藻泥含水率的需要。

实施例20～25为研究在萃取步骤中无机盐对油脂纯化效果。

实施例20

微藻油脂的萃取纯化：准确量取5mL实施例17提取的微藻粗油，加入水和氯化钙，搅拌均匀后，形成粗油水溶液，使粗油水溶液中水的体积分数为0.5，氯化钙的浓度为0.5mol/L，再按正己烷与粗油水溶液的体积比为1的量添加正己烷溶液，混匀后静置1440min，收集上层溶液，真空旋转蒸发后，用氯仿定容至10mL，准确量取2mL定容液，测定可酯化油脂的含量。再准确量取2mL定容液，分别按Lowry(Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):265-275)和Stein(CUP Archive,1979)的方法测定蛋白质和色素含量。

可酯化油脂回收率＝萃取获得的可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含量×100％

实施例21～25

实施例21～25与实施例20均基本相同，其不同点在于无机盐的种类不同，实施例21～24的所用无机盐依次分别为氯化镁、氯化钠、氯化钾和硫酸铵。实施例25则不加任何无机盐。

实施例20～25可酯化油脂纯化效果分析

由图6可知，以不加任何无机盐的纯化过程为对照，添加一定量无机盐后，FAME的回收率提高了12.31～45.88％，这是因为加入一定浓度的无机盐对油/水乳状液具有反乳化作用，促进油水分离，提高油脂在正己烷层的溶解效率。其中，实施例20获得的FAME回收率最高，达84.99％。

实施例26～30为研究无机盐浓度对油脂纯化效果的影响。

实施例26～30与实施例20均基本相同，其不同点在于氯化钙的浓度不同，实施例26～30的氯化钙浓度依次分别为0.05、0.1、0.25、0.5和2mol/L。

实施例20和26～30可酯化油脂纯化效果分析

由图7可知，氯化钙的浓度为0.00～0.10mol/L时，FAME回收率随氯化钙浓度的增加而增加，当氯化钙浓度为0.10mol/L时，FAME回收率最高，而继续提高氯化钙浓度，FAME回收率无显著性增加。综合考虑生产投入及FAME回收率，实施例27的效果较好。

实施例31～36为研究萃取步骤中加入水的量对油脂纯化效果的影响。

实施例31～36与实施例27均基本相同，其不同点在于加入水的量不同，实施例31～36的粗油水溶液中水的体积分数依次分别为0.2、0.3、0.4、0.6、0.7和0.8。

实施例27和31～36可酯化油脂纯化效果分析

由图8可知，当粗油水溶液中水的体积分数从0.2增加到0.5时，FAME的回收率从25.91％逐渐增加至最大值83.06％，提高了2.21倍。这是由于粗油水溶液的极性随着水的体积分数增加而增大，使油脂更倾向溶于正己烷中。当水的体积分数继续从50％增加到80％时，FAME回收率随着水的体积分数增加而下降，这是由于当粗油水溶液中水的体积分数超过50％后，乳状液形成，且其稳定性随着水的体积分数增加而增加，导致正己烷萃取油脂越来越困难。实施例27的效果较好。

实施例37～43为研究萃取步骤中正己烷的加入量对油脂纯化效果的影响。

实施例37～43与实施例27均基本相同，其不同点在于正己烷的添加量不同，实施例37～43的正己烷与粗油水溶液的体积比依次分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2和4。

实施例27和37～43可酯化油脂纯化效果分析

由图9可知，随着正己烷与粗油水溶液的体积比，油脂在两相中的分布平衡向正己烷层移动，FAME的回收率增加，当体积比为0.4和0.6时，FAME的回收率分别达到95.49％和96.92％，但两者无显著性差异(p＞0.05)。而继续增加正己烷的用量，FAME的回收率不断降低。综合考虑正己烷的用量和FMAE的回收率，实施例39的效果较好。

实施例中涉及的部分测定方法介绍如下：

藻泥中含水量的测定：即水占藻泥的质量分数，称取5g藻泥于快速水分分析仪的托盘中，105℃烘干至恒重，计算差值。

微藻中可酯化油脂含量的测定：微藻中的可酯化油脂，即可转化为脂肪酸甲酯(FAME)的油脂，以样品经甲酯化后，采用气质色谱-质谱联用法测得的FAME的含量计算。原藻泥及脱水后的藻泥，冷冻干燥后，以BF3为催化剂进行甲酯化：准确称取0.01g藻粉于10mL螺口玻璃管中，加0.1mL浓度为1mg/mL的C19:0二氯甲烷溶液，氮气吹干后，加2mL浓度为0.5mol/L的NaOH-CH3OH溶液，75℃水浴15min，冷却后，加入2mL BF3-CH3OH溶液，75℃水浴15min，冷却后，加入1mL饱和NaCl溶液，2mL正己烷溶液，4000r/min离心8min，取1mL上层液，经过0.22μm微孔滤膜过滤后，放入气相色谱进样瓶中。分析条件：Agilent6890N-5975气相色谱质谱联用仪，以高纯氦气作为载气，恒流流速为1mL/min。进样量1μL，分流比2:1，进样口和检测器温度分别为235℃和240℃。升温程序：110℃保持2min，然后以5℃/min升至220℃保持10min。质谱分析采用扫描方式，扫描范围33.00-450.00u。各峰型的鉴定采用NIST05a谱库自动检索。根据各脂肪酸相对于C19:0内标的峰面积，计算各脂肪酸组分的绝对含量，再换算出在总脂干重中的脂肪酸含量。

FAME损失率＝(原微藻中FAME含量-脱水后微藻中FAME含量)/原微藻中FAME含量×100％

FAME的回收率＝萃取获得的产物中可酯化油脂含量/粗油中的可酯化油脂含量×100％

文中未特别说明之处，均可采用本技术领域现有常规技术进行，在此不再赘述。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种湿法提取纯化微藻藻油的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)脱水处理：向采收的微藻藻泥中加入乙醇溶液，搅拌均匀，离心，收集沉淀，获得脱水处理后的藻泥；

2)湿法提油：向步骤1)获得的脱水处理后的藻泥中加入无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液，同时对藻泥进行细胞破壁处理，提取微藻中的粗油；

3)离心，收集步骤2)提取得到的粗油，向其中加入水和无机盐，搅拌均匀，形成粗油水溶液，再向粗油水溶液中加入正己烷，混合均匀后静置分层或离心分层，收集上层溶液；

4)将上层溶液进行脱溶剂处理，获得纯化微藻藻油。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，乙醇溶液的加入量为所述采收的微藻藻泥中所含水量的0.1～5倍体积的量，所述的乙醇溶液为浓度在30％(v/v)以上的乙醇水溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，乙醇溶液的加入量为所述采收的微藻藻泥中所含水量的0.5～2倍体积的量，所述乙醇溶液为浓度在70～90％(v/v)的乙醇水溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液的加入量为，相对每毫克脱水处理后藻泥干重，向其中加入5～50mL所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液，步骤2)中进行提取的温度为90℃，提取的时间为80min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，相对每毫克脱水处理后藻泥干重，加入10～20mL所述的无毒性或微毒性的有机溶剂或其水溶液。

6.根据权利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述无毒性或微毒性的有机溶剂选自乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1或4或5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，对藻泥进行细胞破壁处理采用高压均质、微波、超声波、脉冲电场、冻融、研磨、酸处理、碱处理中的一种或多种组合的方式。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，向粗油中加入水的量为使粗油水溶液中水的体积分数达到10％～90％，向粗油中加入无机盐的量为使其在粗油水溶液中的浓度达到0.01～5mol/L；向所述粗油水溶液中加入正己烷的量为所述粗油水溶液的0.01～4倍体积的量。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自氯化钙、氯化镁、氯化钠、氯化钾、硫酸铵中的一种或多种的组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)分别重复操作两次或多次。