BR112012005888B1

BR112012005888B1 - sensores de nanoporo de grafeno e método para avaliar uma molécula de polímero

Info

Publication number: BR112012005888B1
Application number: BR112012005888A
Authority: BR
Inventors: Branton Daniel; Slaven Garaj; A Golovchenko Jene
Original assignee: Harvard College
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2019-10-22
Also published as: AU2010307229B2; CN102630304B; AU2018201010A1; CA2772789A1; JP2013505448A; JP6054922B2; EP2470899B1; CA2772789C; WO2011046706A1; EP3196645B1; KR20120069720A; US20200158712A1; CN102630304A; US10564144B2; EP2470899A1; JP2015014613A; AU2018201010B2; EP3196645A1; KR101732207B1; US20120234679A1

Abstract

sensores de nanoporo de grafeno e método para avaliar uma molécula de polímero a presente invenção refere-se a uma membrana de grafeno substancialmente exposta de camada única incluindo um nanoporo se estendendo através de uma espessura da membrana de grafeno a partir de uma primeira e segunda superfície da membrana oposta a uma primeira superfície da membrana de grafeno. uma conexão a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para um primeiro reservatório fornecido, na primeira superfície da membrana de grafeno, uma espécie em uma solução iônica para o nanoporo, e uma conexão a partir da segunda superfície da membrana de grafeno para um segundo reservatório é fornecido para recolher as espécies e solução iônica após a translocação das espécies e da solução iônica através do nanoporo a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para a segunda superfície da membrana de grafeno. um circuito eléctrico é conectado em lados opostos do nanoporo para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo na membrana de grafeno.

Description

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SENSORES DE NANOPORO DE GRAFENO E MÉTODO PARA AVALIAR UMA MOLÉCULA DE POLÍMERO.

Referência Cruzada para Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 61/243, 607, depositado em 18 de setembro de 2009, a totalidade do que é aqui incorporado por referência. Este pedido também reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 61/355, 528, depositado em 16 de junho de 2010, a totalidade do que é aqui incorporado por referência.

Declaração Referente à Pesquisa Patrocinada Federalmente [002] Esta invenção foi feita com suporte do Governo sob contrato N° 2R01HG003703-04 concedido pelo NIH. O Governo tem certos direitos na invenção.

Antecedentes [003] Esta invenção refere-se geralmente para a detecção e análise molecular, e mais particularmente refere-se a configurações de um nanoporo disposto para detectar moléculas que se translocam através do nanoporo.

[004] A detecção, caracterização, identificação e sequenciação de moléculas, incluindo biomoléculas, por exemplo, polinucleotídeos, tais como as moléculas do ácido nucleico do biopolímero DNA, RNA e de ácido nucleico peptídico (PNA), bem como as proteínas, e outras moléculas biológicas, é um campo amplo e importante. Existe atualmente uma grande necessidade de processos que podem determinar o estado de hibridização, a configuração, o monômero de empilhamento, e da sequência de moléculas de polímero de uma maneira rápida, confiável, e de baixo custo. Avanços na fabricação do polímero de síntese e os avanços no desenvolvimento biológico e na medicina, em particular na área da terapia genética, desenvolvimento de novos pro

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2/29 dutos farmacêuticos e combinação da terapia adequada para o paciente, são em grande parte dependentes de tais processos.

[005] Em um processo para a análise molecular, tem sido mostrado que as moléculas, tais como os ácidos nucleicos e proteínas podem ser transportados através de um poro de nanoescala de estado natural ou sólido, ou nanoporo, e que as características da molécula, incluindo a sua identificação, seu estado de hibridização, sua interação com outras moléculas, e sua sequência, isto é, a ordem linear dos monômeros de que um polímero é composto, podem ser discernidas por e durante o transporte através do nanoporo. O transporte de uma molécula através de um nanoporo pode ser realizado por, por exemplo, eletroforese, ou outro mecanismo de translocação.

[006] Em uma configuração particularmente popular para a análise molecular com um nanoporo, o fluxo da corrente iônica através de um nanoporo é monitorado enquanto uma solução líquida iônica, e as moléculas a serem estudadas que são fornecidas na solução, percorrem o nanoporo. Como moléculas na solução iônica se translocam através do nanoporo, as moléculas pelo menos parcialmente bloqueiam o fluxo da solução de líquido, e os íons na solução, através do nanoporo. Este bloqueio da solução iônica pode ser detectado como uma redução na medida da corrente iônica através do nanoporo. Com uma configuração que impõe a passagem de uma única molécula no nanoporo, esta técnica de medição do bloqueio iônico tem sido demonstrado para detectar com sucesso eventos de translocação molecular individual no nanoporo.

[007] Idealmente, essa técnica de medição do bloqueio iônico para análise molecular, como outras que têm sido propostas, deve permitir a caracterização molecular com alta sensibilidade e resolução sobre a escala de resolução de um único monômero. Resolução não ambígua de características individuais de monômero é crítica para

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3/29 aplicações confiáveis, tais como aplicações de sequenciamento biomolecular. Mas esta capacidade tem sido difícil de obter na prática, particularmente para configurações de nanoporo em estado sólido. Foi constatado que o comprimento de um nanoporo em estado sólido, determinado pela espessura de uma camada de material ou de camadas em que o nanoporo é formado, impacta na natureza da passagem molecular do nanoporo, e limita diretamente a sensibilidade e a resolução com a qual moléculas no nanoporo podem ser detectadas e analisadas.

Sumário da Invenção [008] É fornecido um sensor de nanoporo que supera as limitações de sensibilidade e resolução de sensores convencionais. Em um exemplo é fornecido um sensor de nanoporo incluindo uma membrana em estado sólido tendo uma espessura entre a primeira superfície da membrana e a segunda superfície da membrana oposta a primeira superfície da membrana que é menor que cerca de 1nm. Um nanoporo se estende através da espessura da membrana entre as primeira e segunda superfícies da membrana e tem um diâmetro que é maior do que a espessura da membrana. Existe uma conexão a partir da primeira superfície da membrana a um primeiro reservatório para fornecer, na primeira superfície da membrana, uma espécie em uma solução iônica para o nanoporo, e uma conexão a partir da segunda superfície da membrana a um segundo reservatório para recolher as espécies e solução iônica após a translocação das espécies e da solução iônica através do nanoporo da primeira superfície da membrana para a segunda superfície da membrana. Um circuito eléctrico está conectado para monitorar a translocação das espécies na solução iônica através do nanoporo na membrana.

[009] Este sensor de nanoporo pode ser fornecido como um sensor de nanoporo de grafeno. Aqui, é fornecida uma membrana de gra

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4/29 feno substancialmente exposta de camada única incluindo um nanoporo que se estende através de uma espessura da membrana do grafeno a partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície da membrana de grafeno oposta à primeira superfície da membrana de grafeno. Uma conexão a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para um primeiro reservatório fornece, na primeira superfície da membrana de grafeno, uma espécie de uma solução iônica para o nanoporo, e uma conexão a partir da segunda superfície da membrana de grafeno para um segundo reservatório é proporcionado para recolher as espécies e a solução iônica após a translocação das espécies e solução iônica através do nanoporo a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para a segunda superfície da membrana de grafeno. Um circuito elétrico está conectado em lados opostos do nanoporo para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo na membrana de grafeno.

[0010] Em um sensor de nanoporo de grafeno adicional uma membrana de grafeno substancialmente exposta da camada única, inclui um nanoporo que se estende através de uma espessura da membrana do grafeno a partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície da membrana de grafeno oposta à primeira superfície de grafeno e que tem um diâmetro que é menor do que cerca de 3 nm e maior do que a espessura do grafeno. Um circuito eléctrico está conectado em lados opostos do nanoporo para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo na membrana de grafeno.

[0011] Estas configurações permitem um método para avaliação de uma molécula de polímero em que a molécula de polímero a ser avaliada é fornecida em uma solução iônica. A molécula de polímero na solução iônica é translocada através de um nanoporo em uma membrana de grafeno substancialmente exposta de camada única a

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5/29 partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície da membrana de grafeno oposta à primeira superfície de grafeno e o fluxo da corrente iônica através do nanoporo na membrana de grafeno é monitorada.

[0012] Estes métodos de disposição de sensores e de detecção permitem alta resolução, detecção e análise molecular de alta sensibilidade, conseguindo assim a detecção de monômeros estreitamente espaçados em um polímero e, por conseguinte, sequencialmente resolvem os diferentes bloqueios iônicos causados por cada monômero em, por exemplo, um fio de um polímero de DNA. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição seguinte e figuras que seguem, e a partir das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos [0013] A figura 1 é uma visão perspectiva esquemática de um exemplo dispositivo de nanoporo de grafeno para detecção de moléculas por medição do fluxo iônico através do nanoporo;

as figuras 2A-2E são vistas laterais esquemáticas de seis nanoporos teóricos nas membranas, cada nanoporo de 2,4 nm de diâmetro e variando no comprimento do nanoporo a partir de 0,6 nm, 1 nm, 2 nm, 5 nm e 10 nm, respectivamente, com a densidade média da corrente iônica em várias regiões através de cada nanoporo representando os comprimentos de setas mostradas nos nanoporos;

figura 3 é um gráfico de bloqueio da corrente iônica, definido como o valor absoluto da diferença entre a corrente iônica através de um desbloqueado do nanoporo e a corrente iônica através do mesmo nanoporo quando bloqueado com uma molécula do diâmetro indicado, para uma solução iônica de 3M KCI e um desvio do nanoporo de 160mV, para os nanoporos tendo um diâmetro de 2,5 nm e comprimento efetivo de 0,6 nm, 2 nm, 5 nm, e 10 nm;

figura 4 é uma imagem de difração de raios-X de uma

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6/29 membrana de grafeno experimental, exibindo o requerido padrão hexagonal que surge a partir do empacotamento hexagonal de átomos de carbono em uma camada única de grafeno;

figura 5 é um gráfico de medições de deslocamento Raman para uma membrana de grafeno experimental indicando uma membrana de grafeno de camada única;

figura 6 é um gráfico de dados medidos experimentalmente da corrente iônica como uma função da polarização de voltagem aplicada entre as soluções iónicas 3M de KCI em lados cis e trans de uma membrana de grafeno experimental;

figura 7 mostra o gráfico da figura 6 e um gráfico da corrente iônica como uma função de voltagem para uma membrana de grafeno experimental incluindo um nanoporo de 8 nm de largura;

figura 8 é um gráfico da condutividade iônica como uma função do diâmetro de nanoporo para nanoporos tendo um comprimento de 0,6 nm, 2 nm, e 10 nm;

figura 9 é um gráfico da corrente iônica medida como uma função de tempo para um nanoporo de 2,5 nm em uma membrana de grafeno experimental como fragmentos do DNA translocados através do nanoporo;

figuras 10A-10C são gráficos da corrente iônica medida como uma função do tempo tomado a partir do gráfico da figura 9, mostrando em detalhe o perfil corrente para a translocação do DNA no nanoporo em forma de arquivo único, em forma de parcialmente dobrada e dobrada ao meio;

figura 11 é um gráfico de bloqueio da corrente iônica como uma função de translocação do DNA em um nanoporo em uma membrana do grafeno para 400 eventos de translocação; e.

figura 12 é um gráfico da mudança percentual no bloqueio da corrente iônica como uma função da distância através de um nano

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7/29 poro, para um nanoporo de 0,6 nm de comprimento e para um nanoporo de 1,5 nm de comprimento.

Descrição Detalhada [0014] A figura 1 é uma visão em perspectiva esquemática de um exemplo de um dispositivo de caracterização molecular de um nanoporo de grafeno 10. Para clareza da discussão, características do dispositivo ilustradas na figura 1 não são mostradas em escala. Como mostrado na figura 1, no dispositivo, é fornecida uma abertura de escala nanométrica, ou nanoporo 12, em uma membrana de grafeno exposta de camada única 14. A membrana do grafeno é autossuportada, significando que não existem estruturas sob a extensão da membrana para suportar a membrana. Nas extremidades da membrana, pode ser fornecido, por exemplo, uma estrutura de suporte 16, que por sua vez pode ser fornecido sobre um substrato de suporte ou de outra estrutura 18. A membrana de grafeno exposta autossuportada é configurada em uma célula fluídica tal que no primeiro, ou cis, lado da membrana de grafeno é uma conexão para o primeiro reservatório de líquido ou estoque de líquido contendo uma solução líquida incluindo moléculas 20 a ser caracterizada, e no segundo, ou trans, lado da membrana de grafeno é uma conexão para um segundo reservatório de líquido, em que moléculas caracterizadas são transportadas por translocação através do nanoporo de grafeno 12.

[0015] Em uma aplicação do nanoporo de grafeno, mostrado na figura, as moléculas 20 a serem caracterizadas compreendem cadeia simples de moléculas do DNA (ssDNA) tendo uma sequência de bases de nucleósidos 22 a serem caracterizadas, por exemplo, através da determinação da identidade da sequência de bases ao longo de cada cadeia principal de ssDNA. Para clareza da discussão esse exemplo de sequencia será empregado na descrição seguinte, mas tal não é a aplicação exclusiva da caracterização do dispositivo de nanoporo de

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8/29 grafeno. Além disso, o sequenciamento da operação descrito abaixo não está limitado ao exemplo de DNA; o polinucleótido RNA pode ser caracterizado similarmente. A caracterização molecular habilitada pelo dispositivo de nanoporo de grafeno inclui uma ampla variedade de análises, incluindo, por exemplo, sequenciação, detecção de hibridização, detecção e análise de interação molecular, detecção de configuração, e outras caracterizações moleculares. As moléculas 20 a serem caracterizadas podem incluir, em geral, qualquer molécula, incluindo polímeros e biomoléculas tais como proteínas, ácidos nucleicos, tais como os polinucleótidos DNA e RNA, os polímeros de açúcar, e outras biomoléculas. A discussão abaixo é, portanto, não destinada a ser limitante a uma aplicação particular, mas fornece detalhes de um exemplo numa faixa de concretizações para caracterização molecular.

[0016] É fornecida para o nanoporo de grafeno da figura 1 uma disposição de características para causar moléculas 20 a atravessar o nanoporo através da membrana de grafeno exposta autossuportada de camada única. Por exemplo, podem ser fornecidos eletrodos de cloreto de prata 24, 26, imersos nas soluções de ambos os lados da membrana de grafeno 14, para controlar a voltagem de cada solução através da membrana de grafeno. A aplicação de um desvio de voltagem entre os eletrodos 24 nas duas soluções em lados opostos da membrana faz com que as moléculas, por exemplo, moléculas de ssDNA, fornecidas na solução no primeiro, ou cis, lado da membrana, a ser conduzido eletroforeticamente para dentro e através do nanoporo 12 para a solução sobre o segundo, ou terceiro, lado da membrana, porque a cadeia principal do DNA é carregada negativamente, quando em solução.

[0017] Os presentes inventores fizeram uma surpreendente descoberta de que a resistividade iônica perpendicular ao plano de uma membrana de grafeno exposta de camada única que separa dois re

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9/29 servatórios cheios de soluções iônicas é extremamente grande, o que toma possível estabelecer uma polarização de voltagem significativa através da membrana de grafeno, entre as duas soluções, da maneira descrita acima. Como explicado mais detalhadamente na discussão experimental abaixo, esta descoberta permite a configuração da fig. 1, no qual o controle elétrico da potencialidade através de uma camada única de grafeno pode ser mantido de uma maneira necessária para eletroforese molecular.

[0018] É ainda descoberto que uma membrana de grafeno exposta de camada única é suficientemente mecanicamente robusta para operar como uma barreira estrutural entre dois reservatórios cheios de solução estando ou não estes reservatórios em comunicação direta um com o outro através de um nanoporo na membrana de grafeno que é suportada apenas nas suas extremidades por uma estrutura, isto é, que é autossuportada através da sua extensão. Como um resultado, uma membrana de nanoporo articulado de uma camada de grafeno única exposta pode operar para separar dois reservatórios cheios de soluções iônicas, usando métodos conhecidos por aqueles que estão familiarizados com o campo de nanoporo, por aplicação de um desvio da voltagem entre as duas soluções iônicas no lado cis e trans da membrana de grafeno exposta para eletroforeticamente conduzir as moléculas através do nanoporo.

[0019] Outras técnicas e disposições podem ser empregadas para desenhar moléculas através do nanoporo, e nenhuma técnica particular é necessária. Mais detalhes e exemplos para a condução eletroforética de translocação molecular através de um nanoporo são fornecidos em Escala de avaliação atômica e molecular de biopolímeros, EUA n ⁰ 6.627.067, para Branton e outros, emitido em 30 de setembro de 2003, a totalidade do que é aqui incorporada por referência.

[0020] Como mostrado na figura 1, pode ser fornecido um circuito

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26, 28 para a medição das mudanças no fluxo da corrente iônica entre os lados cis e trans da membrana de grafeno, através do nanoporo 12. Com esta configuração, a translocação de moléculas através do nanoporo 12 pode ser detectada e com base na detecção, pode ser analisado como as moléculas são conduzidas através do nanoporo. Esta técnica de detecção molecular é apenas uma de uma ampla faixa de técnicas de detecção que podem ser empregadas com membrana de grafeno e nanoporo. Corrente de tunelamento entre os eletrodos, por exemplo, entre nanotubos de carbono ou outras sondas articuladas no nanoporo, mudanças da condutividade em sondas ou na própria membrana de grafeno, ou outra técnica de detecção molecular pode ser empregada, como descrito, por exemplo, em Caracterização Molecular com controle de Nanotubos de carbono, dos EUA No. 7.468.271 por Golovchenko e outros, emitida em 23 de dezembro de 2008, a totalidade do que é aqui incorporado por referência.

[0021] Considerando especificamente a técnica de detecção molecular por medição do fluxo de corrente iônica, os presentes inventores fizeram uma surpreendente descoberta de que a corrente iônica através do nanoporo da membrana de grafeno exposta de camada única, quando vazio de uma espécie de translocação, e o fluxo da corrente iônica através do nanoporo, quando bloqueado por uma molécula que está no nanoporo, são ambos aproximadamente 3 vezes maior do que o fluxo da corrente iônica através de um nanoporo de diâmetro similar em qualquer outra interface de membrana conhecida em estado lipídico ou sólido. Este fluxo de corrente iônica significativamente maior através de um nanoporo em uma membrana de grafeno exposta de camada única, comparado a um bioporo ou nanoporo de diâmetro semelhante em outra membrana de estado sólido, é compreendido pelos inventores a ser devido à finura da membrana de grafeno e correspondentemente, o comprimento do nanoporo através da membrana.

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11/29 [0022] Uma membrana de grafeno exposta é uma camada única de átomo de uma rede de carbono hexagonal que é, portanto, atomicamente fina, sendo apenas cerca de 0,3 nm de espessura. Nesta espessura, o fluxo iônico por meio de um nanoporo na membrana de grafeno exposta de camada única pode ser caracterizado em um regime em que o comprimento do nanoporo é muito menor que o diâmetro do poro. Neste regime, a condutividade iônica do nanoporo é proporcional ao diâmetro do nanoporo, d, e a densidade de corrente iônica através do nanoporo é nitidamente um pico na nanoporo periférico, isto é, na extremidade do nanoporo, comparado com a densidade de corrente no meio do nanoporo. Em contraste, nanoporos tendo um comprimento que é maior do que o diâmetro do nanoporo é caracterizado por uma condutividade iônica que é proporcional à área do nanoporo, e que é homogênea através do diâmetro de nanoporo, com condutividade iônica uniformemente fluindo para baixo através do meio do nanoporo bem como na periferia do nanoporo.

[0023] A clara distinção entre condutividades de nanoporo nestes dois regimes de comprimento de nanoporo está ilustrada nas figuras 2A-2E. Referindo-se a essas figuras, são as representações mostradas da densidade média da corrente menos dez pontos através de cada nanoporo tendo um diâmetro de 2,4 nm e tendo um comprimento de 0,6 nm, 1 nm, 2 nm, 5 nm e 10 nm, respectivamente Os comprimentos relativos das setas nas figuras indicam a densidade relativa média de corrente na região em um nanoporo que é representado pela localização de cada seta. Como mostrado nas figuras 2A-2C, para comprimentos de nanoporo que são menores do que o diâmetro do nanoporo de 2,4nm, a densidade de corrente é um pico no nanoporo periférico. Como o comprimento do nanoporo se aproxima do diâmetro do nanoporo, a condutividade através do nanoporo torna-se mais uniforme. Quando o comprimento do nanoporo é maior do que o diâmetro

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12/29 do nanoporo, como nas figuras 2D e 2E, a condutividade iônica é uniformemente homogênea em todo o nanoporo, com nenhuma preferência para a periferia do nanoporo. A densidade de corrente local dentro de regiões diferentes dos nanoporos torna-se mais e mais homogêneas quando o comprimento nanoporo é aumentado.

[0024] Como consequência, um nanoporo em uma membrana de grafeno exposta de camada única em que o diâmetro do nanoporo é maior do que o comprimento do nanoporo exibe uma condutividade iônica total, em um estado livre, que é significativamente maior do que a condutividade total de um nanoporo de diâmetro igual em uma membrana com uma espessura maior do que o diâmetro do nanoporo. Outras condições que são iguais, os melhores resultados de condutividade em uma significativa corrente iônica total maior através de um nanoporo aberto de um dado diâmetro de uma membrana mais fina do que o diâmetro de um nanoporo aberto de diâmetro igual em uma membrana mais espessa do que o diâmetro. As maiores correntes iônicas através da membrana de grafeno facilitam a alta precisão da medição do fluxo da corrente iônica através do nanoporo.

[0025] Por que a corrente iônica através de nanoporos possuindo um comprimento menor que o diâmetro do nanoporo é principalmente na periferia do nanoporo em vez de através do eixo central nanoporo, pequenas alterações no diâmetro das moléculas que percorrem centralmente o nanoporo têm um enorme efeito sobre a mudança na corrente de fluxo iônico. Isto é devido ao fato das diferenças no diâmetro das moléculas serem manifestadas na extremidade do nanoporo, onde o fluxo da corrente iônica é maior para um comprimento de nanoporos curto, em vez de no centro do nanoporo, enquanto para o comprimento de nanoporos curto a corrente iônica é mais baixa. Como resultado, um nanoporo de grafeno de camada única exposto tendo um comprimento menor que o diâmetro do nanoporo é mais sensível às partícu

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Ias molecularmente dimensionadas ou diferenças de partículas dimensionadas de forma diferente, moléculas, ou dos respectivos componentes que são nanoporos com um comprimento maior que o diâmetro do nanoporo.

[0026] A consequência dessa consideração é mostrada quantitativamente na figura 3, na qual existe traçado o nível de bloqueio da corrente iônica computado em um nanoporo como uma função do diâmetro de moléculas de polímero centralmente atravessando nanoporos possuindo um diâmetro de 2,5 nm e com comprimentos eficazes de 0,6 nm, 2 nm, 5 nm e 10 nm. O bloqueio da corrente computado é o valor absoluto da diferença entre a corrente iônica através de um nanoporo desbloqueado, isto é, nenhuma molécula de polímero no nanoporo, e a corrente iônica através do nanoporo mesmo quando bloqueado com um polímero do diâmetro indicado. Os gráficos assumem translocação da molécula com uma solução iônica de KCI 3M e um desvio de voltagem de 160mV entre lados cis e trans do nanoporo. Como mostrado nos gráficos aqui, a corrente iônica através dos nanoporos demonstra o aumento da sensibilidade a alterações no diâmetro das moléculas de translocação enquanto o comprimento dos nanoporos é diminuído.

[0027] Os inventores têm ainda descoberto que a sensibilidade na condutividade de um nanoporo para mudanças nos diâmetros das moléculas de translocação é maximizada quando o diâmetro do nanoporo é ajustado para ser tão próximo quanto possível ao diâmetro das moléculas de translocação. Esta condição é verdadeira para nanoporos de qualquer comprimento. Por exemplo, como mostrado nos gráficos da figura 3, para os nanoporos de 2,5 nm de diâmetro, enquanto o diâmetro da molécula de translocação se aproxima do diâmetro do nanoporo, o bloqueio da corrente aumenta, mesmo quando o comprimento de nanoporo é maior do que o diâmetro do nanoporo. Mas, para

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14/29 nanoporos em que o comprimento do nanoporo é inferior ao diâmetro do nanoporo, ou seja, 2 nm e 0,6 nm, nos dados traçados, é mostrado que tais nanoporos de curto comprimento são muito mais agudamente sensíveis a pequenas alterações no diâmetro da molécula de translocação enquanto o diâmetro da molécula se aproxima do diâmetro do nanoporo. Para estes nanoporos as correntes de bloqueio sobem exponencialmente com o aumento do diâmetro da molécula de bloqueio. Para os 5 nm e 10 nm de comprimento dos nanoporos, que são maiores do que o diâmetro do nanoporo, as correntes de bloqueio aumentam apenas em uma maneira quase linear, mesmo quando os diâmetros das moléculas de bloqueio aproximam-se do diâmetro do nanoporo.

[0028] Assim, a resolução de diferenças estreitamente espaçados em translocação de diâmetros moléculas é de preferência maximizada através do fornecimento em uma membrana de grafeno de camada única, um nanoporo tendo um diâmetro que é tanto maior do que a espessura externa da membrana, mas não muito maior do que o diâmetro esperado para as moléculas que são translocadas do nanoporo, por exemplo, não mais do que 5% maior. Para determinar esta segunda condição para o diâmetro do nanoporo para uma dada aplicação, não pode ser efetuada uma análise semelhante à descrita no exemplo abaixo. Resumidamente, na tal análise, existe através da determinada, por exemplo, uma equação de Laplace, a densidade da corrente iônica da solução iônica que será usada para a translocação da molécula, a sensibilidade desejada da detecção de translocação da molécula é definida, e os requisitos gerais para o diâmetro do nanoporo viável são determinados. Com base nestes fatores, e a limitação da restrição que o diâmetro do nanoporo é maior do que a espessura da membrana, um diâmetro do nanoporo que otimiza todos estes fatores podem então ser selecionados.

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15/29 [0029] Os inventores tem ainda descoberto que o ruído elétrico de um nanoporo de grafeno de camada única exposto que separa dois reservatórios cheios de soluções iónicas eletricamente tendenciosas, proporcionalmente, não maior do que o ruído elétrico a partir de qualquer outro estado sólido do nanoporo. Como resultado, uma vez que a corrente iônica é mudada, ou seja, o bloqueio iônico, através de um nanoporo de grafeno é maior durante a passagem de uma molécula de qualquer diâmetro dado do que em outros nanoporos conhecidos que têm um comprimento maior que o diâmetro nanoporo, um nanoporo de grafeno de camada única exposto pode produzir uma melhor relação sinal-ruído do que outros nanoporos conhecidos porque a maioria do número de íons contados por unidade de tempo, ou por travessia do nucleobase, será mais preciso do que a uma taxa menor de contagem. Estas descobertas, juntamente com a inércia química conhecida e força excepcionalmente grande do grafeno, estabelece uma membrana de grafeno de nanoporo articulado de camada única exposta como uma interface superior para a detecção e caracterização molecular.

[0030] Como resultado destas descobertas, é preferido que a membrana fosse fornecida como uma única camada de grafeno que é exposta, isto é, que não está revestida de ambos os lados com qualquer camada de material ou espécies que contribui para a espessura do grafeno da membrana. Neste estado, a espessura da membrana é minimizada e é segura no regime do nanoporo de curto comprimento no qual o fluxo periférico da corrente iônico é maximizado e em que a condutividade do nanoporo como uma função de alterações nas dimensões físicas analisadas é maximizada. O comprimento muito curto do nanoporo fornecido pela membrana de grafeno também torna possível para um nanoporo de grafeno para detectar monômeros estreitamente espaçados em um polímero e, portanto, para resolver os blo

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16/29 queios iônicos sequencialmente diferentes causados por cada monômero em, por exemplo, um fio de um polímero de DNA.

[0031] É reconhecido que uma membrana de grafeno de camada única tem uma afinidade para muitas moléculas, tais como moléculas de polímero, como DNA e RNA. Pode, portanto, ser esperado que o DNA, RNA, e outras moléculas tenham uma tendência para adsorver sobre uma membrana de grafeno preferencialmente exposta. É preferido que as propriedades de absorção da superfície de grafeno sejam pelo menos parcialmente inibidas com um ambiente apropriado e/ou tratamento de superfície, que mantém a membrana num estado exposto sem camadas superficiais agregadas.

[0032] Por exemplo, pode ser fornecida uma solução iônica que é caracterizada por um pH superior a cerca de 8, por exemplo, entre cerca de 8,5 e 11 e que inclui uma concentração de sal relativamente elevado, por exemplo, superior a cerca de 2M e na faixa a partir de 2,1 M para 5M. Ao empregar uma solução básica de força iônica elevada, a adesão das moléculas para a superfície da membrana de grafeno exposta é minimizada. Qualquer sal adequado selecionado pode ser utilizado, por exemplo, KCI, NaCI, LiCI, RbCI, MgCh, ou qualquer sal prontamente solúvel, cujo interação com a molécula de análise não é destrutiva.

[0033] Além disso, como explicado em detalhe abaixo, durante a síntese e manipulação da membrana de grafeno é preferido o extremo cuidado no sentido de manter a membrana em um estado primitivo de tal modo que substancialmente nenhum resíduo ou outras espécies, que podem atrair as moléculas até a superfície do grafeno, estejam presentes. Também é reconhecido que, na operação, a membrana de grafeno pode ser eletricamente manipulada para repelir as moléculas a partir da superfície de grafeno. Por exemplo, dada a translocação de moléculas de DNA negativamente carregadas através de um nanoporo

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17/29 em uma membrana de grafeno, uma membrana de grafeno pode ela própria ser eletricamente polarizada a um potencial negativo, que repele a molécula de DNA carregada negativamente. Aqui o contato elétrico pode ser feito para a membrana de grafeno de qualquer maneira adequada que permite a aplicação de uma voltagem selecionada. Em um tal cenário, a voltagem entre as soluções iônicas em ambos os lados da membrana de grafeno pode ser ajustada suficientemente elevada para produzir uma força eletroforética que supera a repulsão na superfície de grafeno para causar a translocação do DNA através do nanoporo em vez de adsorção na superfície do grafeno.

[0034] Indo para métodos para produzir o dispositivo do grafeno no nanoporo, uma camada única exposta de grafeno pode ser sintetizada por qualquer técnica conveniente e apropriada, e nenhuma técnica de síntese específica é necessária. Em geral, deposição química atmosférica de vapor com gás metano sobre um material catalisador, por exemplo, uma camada de níquel, pode ser empregada para formar a camada de grafeno. A espectroscopia Raman, microscopia eletrônica de transmissão, e os estudos da área de difração selecionada podem ser utilizados para verificar se uma região sintetizada de grafeno a ser empregada é verdadeiramente de camada única na natureza.

[0035] A transferência da camada de grafeno para uma estrutura do dispositivo para a disposição como uma membrana de grafeno pode ser realizada por qualquer técnica adequada, mas é preferido que quaisquer materiais utilizados na transferência não danifiquem a superfície de grafeno. Em uma técnica preferível, um material manipulador selecionado é revestido sobre a camada de grafeno sintetizada sobre o material catalisador e o substrato. Para muitas aplicações, pode ser preferível utilizar um material de manipulação que é facilmente removido da superfície de grafeno uma vez que a manipulação da ca

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18/29 mada de grafeno está completa. Copolímero de ácido metil metacrilitometilacrílico (MMA-MAA) pode ser um em material de manipulação particularmente adequado. Com uma camada de MMA-MAA no lugar da camada de grafeno, a estrutura de entrada pode ser cortada em pedaços.

[0036] As peças resultantes podem então ser processadas para remover a camada catalisadora e o material de substrato subjacente à camada de grafeno enquanto aderida à camada manipuladora. Por exemplo, dada uma camada catalisadora de Ni, uma solução de HCI pode ser empregada para gravar para longe a camada de Ni e liberar o compósito grafeno/MMA-MAA, com água destilada empregada para rinsar. O compósito grafeno/MMA-MAA, flutuando sobre a água, pode então ser capturado por, por exemplo, uma pastilha de silício revestida com uma camada de SINx. A região central da pastilha de silício pode ser gravada por KOH ou outro produto corrosivo adequado para produzir uma membrana de SIN_X livre, por exemplo, área de 50 x 50 pm². Um feixe de íons focado (FIB) ou outro processo pode então ser empregado para perfurar um furo adequado através da membrana de SINx de tal forma que ela forme um suporte para membrana de camada de grafeno. Por exemplo, uma janela quadrada de, por exemplo, 200 nm x 200 nm pode ser formada na membrana de nitreto para produzir um suporte para a membrana de grafeno.

[0037] Com esta configuração do dispositivo completa, o compósito de grafeno/MMA-MAA pode ser colocado sobre a janela quadrada na membrana de grafeno, empregando, por exemplo, o vento de nitrogênio (um jato suave de nitrogênio) para pressionar firmemente o grafeno contra o substrato. O MMA-MAA pode então ser removido, por exemplo, sob um sistema de gotejamento lento, de acetona, seguido por imersão em acetona, dicoloroetano, e isopropanol.

[0038] É preferível para remover qualquer resíduo da película de

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19/29 grafeno para reduzir a tendência das espécies a aderir ao grafeno uma vez configurado como uma membrana. Por exemplo, uma vez que o MMA-MAA é removido, a estrutura resultante, incluindo uma membrana de grafeno estendida através de uma moldura de nitreto, como na figura 1, pode ser imerso em, por exemplo, uma solução de KOH em temperatura ambiente breve, por exemplo, durante 1min e, em seguida vigorosamente lavado com, por exemplo, água, em seguida, isopropanol, e, finalmente, o etanol. Para evitar danos à membrana de grafeno, a estrutura pode ser seca no ponto crítico. Finalmente, a estrutura pode ser exposta a um ambiente selecionado, por exemplo, um processo de recozimento térmico rápido menos cerca de 450 °C em uma corrente de gás contendo 4% de He nele para, por exemplo, 20 minutos, expulsar qualquer hidrocarboneto restante. Para evitar a recontaminação, a estrutura de preferência é, então, imediatamente carregada em, por exemplo, um TEM, para processamento adicional.

[0039] Um nanoporo pode então ser formado na membrana de grafeno. Feixe de elétrons focado ou outro processo pode ser empregado para formar o nanoporo. O diâmetro do nanoporo de preferência é maior do que a espessura da membrana de grafeno, para obter os benefícios da descoberta inesperada do aumento da corrente periférica do fluxo iônico e o aumento da sensibilidade, a alteração na dimensão molecular, como descrito acima. Para a translocação de ssDNA, um diâmetro do nanoporo dentre cerca de 1 nm e cerca de 20 nm pode ser preferido, com um diâmetro dentre cerca de 1 nm e cerca de 2 nm mais preferidos. Para a translocação de dsDNA, um diâmetro do nanoporo de entre cerca de 2nm e cerca de 20nm pode ser preferido, com um diâmetro de entre cerca de 2nm e cerca de 4nm mais preferidas. Após a formação do nanoporo, é preferido manter o grafeno estrutura sob um ambiente limpo, por exemplo, um vácuo de ~10 ⁵Torr.

[0040] Para completar o dispositivo de detecção molecular nano

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20/29 poro da figura. 1, a membrana de grafeno montada pode ser inserida entre duas metades das células em, por exemplo, uma fita microfluídica de poliéster etercetona-(PEEK) ou outro material adequado, seladas juntas com, por exemplo, poli-dimetilsiloxano (PDMS). Pode ser preferido que o orifício de vedação seja menor do que as dimensões da membrana de grafeno para vedar completamente as extremidades da membrana de grafeno a partir das soluções.

Exemplo I [0041] Este exemplo descreve uma demonstração experimental de uma membrana de grafeno exposta camada única. Uma camada de grafeno foi sintetizada por CVD sobre uma superfície de níquel. O níquel foi fornecido como uma película por E-feixe evaporação sobre um substrato de silício revestido com uma camada de SÍO2. A camada de níquel foi termicamente recozida para gerar uma microestrutura da película de Ni com um único cristalino grão de tamanhos entre cerca de 1 pm e 20 pm. As superfícies destes grãos têm etapas e terraços planos automáticos, similares à superfície dos substratos de cristal único para o crescimento epitaxial. Com esta topologia, o crescimento do grafeno em grãos de Ni se assemelha ao crescimento do grafeno sobre a superfície de um substrato de cristal único.

[0042] Na síntese CVD, a camada de Ni foi exposta a H₂ e gases CH4, a uma temperatura de cerca de 1000 °C espectroscopia de Raman, microscopia de transmissão de elétrons e o estudo da área de difração selecionados mostrou o película de grafeno a ser de excelente qualidade e na maior parte (87%) de uma mistura de um e dois domínios de camada espessa, com tamanhos de domínio de ~ 10 pm. Regiões mais espessas de três ou mais camadas de grafeno, facilmente distinguidas pelo contraste de cores em um microscópio ótico, cobre apenas uma pequena fração da superfície total. Se as regiões mais espessas ou limites de domínio fossem encontrados, essa área

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21/29 foi descartada.

[0043] Grafeno foi transferido para um transportador de chip de Si/SiNx por primeiramente revestir o grafeno com copolímero MMAMAA (MMA-MAA (8,5) EL9, Microchem Corp) e cortar em peças de 0,5 nm x 0,5 mm. Estas peças foram imersas durante ~ 8 h em solução HCI 1N gravadas para afastar da película de Ni e liberar a membrana de grafeno / polímero, a qual foi transferida para a água destilada em que o grafeno / polímero flutuou, com lado do grafeno para baixo. Transporte do chip Si revestido com ~ 250 nm de espessura SIN_X foi utilizado para recolher do grafeno / polímero flutuante películas das peças, tendo o cuidado de que as películas de grafeno/polímero foram cada uma esticada sobre a região central de um chip. A região central do chip tinha sido microfabricada utilizando técnicas padrão anisotrópicas gravadas a deixar uma área de ~ 50 x 50 pm² do revestimento SINx como uma membrana SIN_X autônoma em que uma janela quadrada, ~ 200 nm x 200 nm, tenha sido perfurada utilizando um feixe de íons focada (FIB). Um vento de gás de nitrogênio foi utilizado para pressionar firmemente o grafeno contra a superfície do chip. Isto levou a expulsão de uma pequena quantidade de líquido de sob o grafeno, que aderiu fortemente e irreversivelmente ao chip do transportador do revestimento SIN_X. O polímero na parte superior do grafeno foi removido sob um sistema de gotejamento lento, de acetona, seguido por imersões subsequentes em acetona, dicoloroetano e, finalmente, isopropanol.

[0044] Para remover quaisquer resíduos da película de grafeno, cada chip foi em seguida imerso em solução a 33% em peso de KOH à temperatura ambiente durante 1 min e depois vigorosamente lavado com isopropanol e etanol. Para evitar danos à porção autônoma da suspensão da película de grafeno, cada chip era de seco em ponto crítico. Finalmente, os chips foram carregados em um anelar térmico

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22/29 rápido e aquecido a 450 ° C em uma corrente de gás contendo 4% H₂nele durante 20 minutos para eliminar quaisquer hidrocarbonetos restantes. Para evitar a recontaminação, os chips foram imediatamente carregados em um microscópio eletrônico de transmissão para processamento adicional.

[0045] É mostrada na figura 4 uma imagem de difração de raios X de uma das membranas de grafeno, exibindo o padrão hexagonal requerido que surge a partir do empacotamento hexagonal de átomos de carbono em uma camada única de grafeno. São mostradas na figura 5 as medidas de desvio de Raman para a camada de grafeno. O pico G muito pequeno e o pico 2D muito afiado, produzindo uma razão de G/2D de menos de 1, indica uma membrana de camada única. Exemplo II [0046] Este exemplo descreve uma determinação experimental da condutividade da membrana de grafeno exposta de camada única do Exemplo I.

[0047] Um chip montado da membrana do grafeno da camada única a partir do exemplo I foi inserido entre as duas meias células de uma fita microfluídica de costume-incorporado feita de poliéster etercetona-(PEEK). Os dois lados do chip foram selados juntos com polidimetilsiloxano (PDMS). A abertura da junta que fazia pressão contra a película de grafeno sobre o chip transportador de Si/ SiN_x tinha um diâmetro interno de ~ 100 pm. Consequentemente, o furo de vedação foi menor do que as dimensões da membrana do grafeno (0,5x0,5 mm²), e completamente selada a borda da membrana de grafeno a partir do eletrólito. No lado oposto do chip, o eletrólito estava em contato com o grafeno apenas através de 200 nm da janela quadrada na membrana de SiNx. Nota-se que com esta disposição não havia uma diferença de área grande entre os dois lados da membrana de grafeno em contato com o eletrólito (uma área circular de 100 pm de diâmetro versus um

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23/29 quadrado de área 200 nm x 200 nm).

[0048] As duas metades das células foram primeiro enchidas com etanol para facilitar a molhagem da superfície do chip. A célula foi então lavada com água deionizada, seguido por solução de sal de 1M KCI com nenhum tampão. Para evitar qualquer interação potencial entre a membrana de grafeno e solutos que podem afetar as medições experimentais, todos os eletrólitos utilizados na experiência foram mantidos o mais simples possível e foram tampados. Todos os pHs da solução variaram apenas em unidades de 0,2 pH, a partir de 5,09 a 5,29, tal como medido antes e após a sua utilização nas experiências descritas.

[0049] Os eletrodos Ag/AgCI em cada metade da célula foram usadas para aplicar um potencial elétrico através da membrana de grafeno e para medir correntes iônicas. Os traços atuais foram adquiridos através de um amplificador Axopatch 200B (Instrumentos de Axon), o qual foi conectado a um filtro de baixa frequência de Bessel externo de 8-pólos (tipo 90IP-L8L, dispositivos de frequência, Inc.), operando a 50 kHz. O sinal analógico foi digitalizado utilizando uma placa NI PCI-6259 DAQ (Instrumentos Nacionais), operando em 250 kHz taxa de amostragem e resolução de 16 bits. Todos os experimentos foram controlados por meio do programa IGOR Pro.

[0050] A figura 6 é um gráfico de dados experimentalmente medidos da corrente iônica como uma função do desvio da voltagem aplicada entre 3 soluções iônicas M KCI sobre os lados cis e trans da membrana de grafeno. Aplicando a lei de Ohm's para estes dados, é encontrado que uma resistividade de corrente iônica está bem dentro da faixa de 3-4 GO, perpendicular ao plano da membrana de grafeno. Isto demonstra uma descoberta da presente invenção que a resistividade iônica perpendicular ao plano de uma membrana de grafeno é muito grande, e permite uma configuração em que um desvio elétrico

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24/29 significativo pode ser mantido através de uma membrana de grafeno exposta de camada única que separa duas voltagens enviesadas dos reservatórios cheios de soluções iônicas.

[0051] Com um desvio 100 mV aplicado entre os dois eletrodos Ag / AgCI, as medições da corrente iônica para uma variedade de eletólitos de cloreto sobre os lados cis e trans da membrana de grafeno foram conduzidas. Condutividades dos eletrólitos foram medidas usando um medidor de condutividade Accumet Research AR50, que tinha sido calibrado usando soluções padrão de condutividade (Alfa Aesar, produto # 43405, 42695, 42679). Todos os experimentos fluídicos foram realizadas sob condições de laboratório de temperatura controlada, a 24°C. A Tabela 1 mostra que a condutividade das membranas de grafeno está muito abaixo do nível nS. As maiores condutividades foram observadas para as soluções com os maiores tamanhos de cátions atômicos, Cs e Rb, correlacionada com uma camada de hidratação mínima que medeia sua interação com o grafeno. Esta condutividade foi atribuída ao transporte de íons através das estruturas de defeitos na membrana do grafeno autônoma.

Tabela I

Solução	Condutividade de Grafeno (os)	Sol. Condutividade (IO ³ Sm'¹)	Energia de Hidratação (eV)
CsCI	67±2	1,42	3,1
RbCI	70±3	1,42	3,4
KCI	64±2	1,36	3,7
NaCI	42±2	1,19	4,6
LiCI	27±3	0,95	5,7

[0052] Contribuições de correntes eletroquímicas de e para a membrana do grafeno foram excluídas por uma experiência adicional aqui, para investigar a contribuição a partir das correntes eletroquímicas (Farádica), uma grande área separada da película do grafeno (~

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2x4 milímetros2) foi transferida para uma lâmina de vidro e contactada em uma extremidade com tinta de prata ligada a um grampo metálico sobre o qual o isolamento de cera foi colocado. A extremidade exposta da película de grafeno foi imersa em eletrólito 1M KCI com um eletrodo contador de Ag/AgCI, e as curvas l-V eletroquímicas de foram medidas na faixa de voltagem mesmo que a utilizada nas experiências de eletrodos-trans. Após a normalização para a área da superfície, concluiuse que qualquer corrente eletroquímica nos dispositivos de eletrodostrans foram três ordens de magnitude demasiado pequeno para explicar as medições de correntes ~ pA através das membranas de grafeno como desenvolvido na Tabela 1. As condutividades observadas para diferentes cátions cair muito mais rapidamente do que as soluções de condutividades em curso de CsCI a LiCI, sugerindo uma influência das interações grafeno-cátion. No entanto, não pode se considerar completamente excluído o transporte iônico através do grafeno que está em contato com a superfície do chip.

Exemplo III [0053] Este exemplo descreve uma determinação experimental da condutividade da membrana do grafeno exposta de camada única do exemplo I, incluindo um nanoporo.

[0054] Um único nanoporo de tamanho nanométrico foi perfurado através de várias membranas de grafeno do exemplo I, utilizando um feixe de elétrons focalizado em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL FEG 2010 operado em voltagem de aceleração de 200kV. O diâmetro do nanoporo foi determinado por visualização EM, em um feixe de elétrons bem distribuídos de modo a manter a exposição total do elétron da membrana de grafeno a um mínimo. Um diâmetro do nanoporo de 8 nm foi determinado como a média de 4 medições ao longo de diferentes eixos do nanoporo, como determinado a partir de micrografias calibradas TE usando programa de MicrografiaDigital

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26/29 (Gatan, Inc.). Se o chip ou o titular TEM tiver qualquer resíduo orgânico contaminante, o carbono desordenado foi visto para visivelmente depositar sob o feixe de elétrons. Tais dispositivos foram descartados. Depois de perfurar o nanoporo, os chips do nanoporo de grafeno que não foram imediatamente investigados foram mantidos sob um vácuo limpo de ~ 10 ⁵ Torr.

[0055] A figura 7 mostra ambos um gráfico da corrente iônica como uma função da voltagem aplicada como dado acima no exemplo II para uma membrana de grafeno contínua, assim como para uma membrana de grafeno incluindo um nanoporo de 8 nm de largura. Estes gráficos demonstram que a condutividade iônica da membrana do grafeno é aumentada por ordens de magnitude pelo nanoporo.

[0056] Constatou-se que as experiências com diâmetros conhecidos de nanoporos de grafeno e conhecidas condutividades das soluções iônicas permitem a dedução da espessura efetiva de isolamento da membrana de grafeno exposta de camada única. Dez membranas de grafeno separadas do exemplo I foram processadas de modo a incluir diâmetros de nanoporos variando de 5 a 23 nm. Em seguida, a condutividade iônica de cada uma das dez membranas foi medida com uma solução de 1 M de KCI fornecida para ambos os reservatórios de solução cis e trans, com uma condutividade de 11 Sm^-1. A figura 8 é um gráfico da medição da condutividade iônica como uma função do diâmetro do nanoporo para as 10 membranas. A curva sólida na figura é a condutividade modelada de uma membrana isolante de 0,6 nm de espessura, que é o melhor ajuste à condutividade da medição experimental. A condutividade modelada para uma membrana de 2 nm de espessura é mostrada como uma linha pontilhada, e a condutividade modelado para uma membrana de 10 nm de espessura é mostrada como uma linha tracejada-pontilhada, apresentadas para comparação.

[0057] A condutividade iônica, G, de um nanoporo de diâmetro, d,

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27/29 em uma membrana isolante infinitamente fina é dada por:

Gfina = o d (1) [0058] em que σ = F{p_K + pci)c é a condutividade da solução iônica, F é a Constante de Faraday, c é a concentração iônica, e Pi(c) é a mobilidade de potássio (i = K) e de cloreto de íons (i = Cl) utilizados para uma solução iônica de KCI. A dependência linear da condutividade sobre o diâmetro seguinte a partir da densidade da corrente sendo atingido acentuadamente um pico do perímetro do nanoporo para uma membrana infinitamente fina, como descrito acima. Para as membranas mais espessas do que o diâmetro da condutividade do nanoporo torna-se proporcional à área nanoporo. Para membrana finita de pequena espessura, os cálculos de computador podem prever a condutância.

[0059] Como mostraoo no gráfico da figura 8, de acordo com expressão (1), as condutividades dos nanoporos de grafeno de camada única exposta com diâmetros variando de 5 a 23 nanômetros exibiram uma dependência quase linear do diâmetro de nanoporo. A curva modelada foi produzida com base nos cálculos de condutividade iônica do nanoporo em uma membrana isolante idealmente descarregada, como uma função do diâmetro do nanoporo e espessura da membrana. Pontos nesta curva foram obtidos por resolver numericamente a equação de Laplace para a densidade da corrente iônica, com condutividade da solução apropriada e condições de contorno, e integrando através da área nanoporo para obter a condutividade. Estas simulações numéricas foram realizadas usando o resolvedor de elementos finitos de multifísica COMSOL na geometria 3-D apropriada com simetria cilíndrica ao longo do eixo do nanoporo. O conjunto completo de equações Poisson-Nerst-Planck foi resolvido no regime de estado estável. Na faixa de parâmetros físicos de interesse, alta concentração salina e pequena voltagem aplicada, a solução da simulação numérica foi en

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28/29 contrada para não diferir significativamente a partir da solução da equação de Laplace com condutividade fixada, que tem de significativamente penalidade computacional menor. A espessura da membrana, L, usada neste modelo idealizado é aqui referido como espessura do grafeno isolante, ou Lm O melhor ajuste da medição dos dados da condutividade do nanoporo na figura 8 rendimentos Lgit = 0,6 (+0,9 0,6) nm, com a incerteza determinada a partir de pelo menos uma análise de erros quadrado.

Exemplo IV [0060] Este exemplo descreve a medição experimental de translocação do DNA através de um nanoporo em uma membrana de grafeno exposta de camada única, a do exemplo I.

[0061] A célula microfluídica dos exemplos acima foi lavada com solução de sal de KCI 3M, pH 10,5, contendo 1 mM EDTA. Como explicado acima, a concentração elevada de sal e pH elevado foram encontrados para minimizar a interação do grafeno do DNA e, assim, estas condições de solução podem ser preferidas. Os fragmentos de restrição do 10 kbp de cadeia de dupla lambda da molécula do DNA foram introduzidos na câmara de cis do sistema. As moléculas do DNA carregadas negativamente foram eletroforeticamente desenhadas e conduzidas através do nanoporo pela força eletroforética aplicada de 160mV. Cada molécula de isolamento que passa através do nanoporo transitoriamente reduzida, ou bloqueada, a condutividade iônica do nanoporo de uma maneira que reflete tanto o tamanho do polímero e configuração. Como os fragmentos do DNA atravessando o nanoporo devido à força eletroforética aplicada, os eventos de translocação foram analisados com MATLAB usando uma função de encaixe que consistia de múltiplos pulsos quadrados convolutos com uma apropriada função do filtro de Bessel para imitar as condições de gravação.

[0062] A figura 9 é um gráfico da medição da corrente iônica atra

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29/29 vés do nanoporo como uma função do tempo para um minuto a partir do tempo de um desvio de voltagem aplicado entre os reservatórios cis e trans. Cada queda na medição da corrente no plano corresponde a uma translocação do DNA através do nanoporo, e permite a caracterização de dois parâmetros, a saber, a queda de corrente média, ou de bloqueio, e a duração do bloqueio, que é o tempo que leva para a molécula translocar completamente através do nanoporo. Nota-se o alto número de eventos de translocação para a nanoporo de membrana de grafeno exposta no período de tempo de um minuto, indicando inibição de aderência bem sucedida o DNA para a superfície da membrana de grafeno exposta com a solução de sal de pH elevado, e a limpeza cuidadosa e manuseamento da membrana do grafeno durante a preparação para as experiências de translocação de DNA.

[0063] As figuras 10A, 10B, e 10C são gráficos de medição da corrente iônica através do nanoporo para eventos de translocação individuais. Na figura 10A é demonstrado o bloqueio do fluxo iônico atual durante uma translocação do DNA em forma de arquivo único. Na figura 10B é demonstrado o bloqueio do fluxo de corrente iônica durante a translocação do DNA que foi parcialmente dobrado. Finalmente, na figura 10C é demonstrado o bloqueio do fluxo de corrente iônica durante a translocação do DNA que foi dobrado ao meio. Estes três eventos de translocação experimentais tipificam as possíveis medições iônicas do fluxo da corrente que podem ocorrer durante a translocação de fragmentos do DNA, e demonstra que a dobragem do DNA e a configuração podem ocorrer com o nanoporo de grafeno como com mais nanoporos espessos convencionais do estado sólido.

Claims

1. Sensor de nanoporo de grafeno (10), caracterizado pelo fato de que compreende:

uma membrana de grafeno substancialmente exposta autossuportada de camada única (14) incluindo um nanoporo (12) que se estende através de uma espessura da membrana de grafeno (14) a partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície da membrana de grafeno oposta à primeira superfície da membrana de grafeno;

uma conexão a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para um primeiro reservatório para fornecer, na primeira superfície da membrana de grafeno, uma espécie (20) em uma solução iônica para o nanoporo (12);

uma conexão a partir da segunda superfície da membrana de grafeno para um segundo reservatório para recolher as espécies (20) e solução iônica após a translocação das espécies (20) e da solução iônica através do nanoporo (12) a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para a segunda superfície da membrana de grafeno, e um circuito elétrico (28) conectado nos lados opostos do nanoporo (12) para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo (12) na membrana de grafeno (14).

2. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o circuito elétrico (28) está conectado entre as primeira e segunda soluções iónicas para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo (12) na membrana de grafeno (14), ou o circuito elétrico (28) inclui um monitor de corrente elétrica conectado para medir o fluxo corrente iônica dependente do tempo através do nanoporo (12), de forma particular

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2/6 em que o monitor de corrente eléctrica está conectado para medir bloqueios de fluxo de corrente iônica dependentes do tempo indicativos de translocação de espécies através do nanoporo (12).

3. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um eletrodo (24,26) disposto em cada uma das primeira e segunda soluções iônicas para a aplicação de uma voltagem através do nanoporo (12) para causar eletroforeticamente a translocação de espécies através do nanoporo (12).

4. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (I) a solução iônica apresenta um teor de sal que é maior do que cerca de 2 M, ou (li) a solução iônica apresenta um pH que é maior do que cerca de 8, ou (iii) a solução iônica é KCI.

5. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que é maior do que uma espessura da membrana de grafeno entre as primeira e segunda superfícies da membrana do grafeno (14) através da qual o nanoporo (12) se estende.

6. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que é entre cerca de 1 nm e cerca de 10nm, ou (ii) o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que está entre cerca de 1nm e cerca de 5nm, ou (iii) o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que é menor do que cerca de 3nm, ou (iv) o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que é menor do

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3/6 que cerca de 2,5nm.

7. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (i) a membrana do grafeno (14) apresenta uma espessura que é menor do que cerca de 2nm, ou (ii) a membrana do grafeno (14) apresenta uma espessura que é menor do que cerca de 1nm, ou (iii) a membrana do grafeno (14) apresenta uma espessura que é menor do que cerca de 0,7nm.

8. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diâmetro do nanoporo (12) é adaptado para ser não mais do que cerca de 5% maior do que um diâmetro das espécies (20) no nanoporo (12).

9. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a membrana de grafeno (14) é mecanicamente suportada nas bordas da membrana (14) por uma estrutura de armação de membrana (16).

10. Método para avaliar uma molécula de polímero (20), caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer, em uma solução iônica uma molécula de polímero (20) a ser avaliada;

translocar a molécula do polímero (20) na solução iônica através de um nanoporo (12) em uma membrana de grafeno substancialmente exposta autosuportada de camada única (14) a partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície da membrana de grafeno oposta à primeira superfície do grafeno, como definido nas reivindicações 1 a 9; e monitorar o fluxo da corrente iônica através do nanoporo (12) na membrana do grafeno (14).

11. Método de de acordo com a reivindicação 10, caracteri

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4/6 zado pelo fato de que o monitoramento do fluxo da corrente iônica compreende a medição de bloqueio de fluxo de corrente iônica dependente do tempo indicativo da translocação da molécula de polímero através do nanoporo (12).

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a aplicação de uma voltagem através do nanoporo (12) para causar eletroforeticamente à molécula de polímero (20) se translocar através do nanoporo (12).

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que é maior do que uma espessura da membrana de grafeno (14) entre as primeira e segunda superfícies da membrana do grafeno (14) através da qual o nanoporo (12) se estende.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o nanoporo (12) apresenta um diâmetro que não é mais do que cerca de 5% maior do que um diâmetro da molécula do polímero (20) que se transloca através do nanoporo (12).

15. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o monitoramento do fluxo da corrente iônica compreende a medição do bloqueio do fluxo corrente iônica dependente do tempo indicativo do diâmetro da molécula de polímero (20) que se transloca através do nanoporo (12).

16. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as espécies (20) em solução iônica que se translocam através do nanoporo compreende biomoléculas, ou moléculas de DNA, moléculas de RNA, ou oligonucleotídeo, ou nucleotídeos.

17. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:

uma membrana de grafeno substancialmente exposta autossuportada de camada única (14) incluindo um nanoporo (12) que se

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5/6 estende através de uma espessura da membrana de grafeno (14) a partir de uma primeira superfície da membrana de grafeno para uma segunda superfície de membrana de grafeno oposta à primeira superfície do grafeno e que tem um diâmetro que é menor do que cerca de 3 nm e maior do que a espessura do grafeno; e um circuito elétrico (28) conectado em lados opostos do nanoporo para medir o fluxo da corrente iônica através do nanoporo (12) na membrana de grafeno (14).

18. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

uma conexão a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para um primeiro reservatório para fornecer, na primeira superfície da membrana de grafeno, as moléculas de polímero (20) em uma solução iônica para o nanoporo (12);

uma conexão a partir da segunda superfície da membrana de grafeno para um segundo reservatório para recolher as moléculas de polímero e solução iônica após a translocação das moléculas de polímero e da solução iônica através do nanoporo a partir da primeira superfície da membrana de grafeno para a segunda superfície da membrana de grafeno.

19. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o circuito elétrico (28) inclui um monitor de corrente elétrica conectado para medir bloqueios do fluxo de corrente iônica dependente do tempo indicativos da translocação da molécula de polímero (20) através do nanoporo (12); ou em que a solução iônica apresenta um teor de sal que é maior do que cerca de 2 M e um pH que é maior do que cerca de 8.

20. Sensor de nanoporo de grafeno (10) de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um eletrodo (26,28) disposto em cada uma das primeira e segunda solu

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6/6 ções iônicas para a aplicação de uma voltagem através do nanoporo (12) para causar eletroforeticamente translocação das espécies do nanoporo (12).