KR102565315B1 - 표면전하를 띤 생체입자의 정제 장치 및 이를 이용한 생체입자의 정제 방법 - Google Patents

표면전하를 띤 생체입자의 정제 장치 및 이를 이용한 생체입자의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표면전하를 띤 생체입자의 정제 장치 및 이를 이용한 생체입자의 정제 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 정제 과정에서 생체입자의 변형이나 손상을 최소화하면서 높은 정제 효율 및 속도를 구현할 수 있는 생체입자 정제 장치 및 정제 방법에 관한 것이다.

Description

표면전하를 띤 생체입자의 정제 장치 및 이를 이용한 생체입자의 정제 방법{APPARATUS FOR REFINING ORGANIC MOLECULE HAVING SURFACE CHARGE AND REFINING METHOD OF ORGANIC MOLECULE WITH THE SAME APPARATUS}
본 발명은 표면전하를 띤 생체입자의 정제 장치 및 이를 이용한 생체입자의 정제 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 정제 과정에서 생체입자의 변형이나 손상을 최소화하면서 높은 정제 효율 및 속도를 구현할 수 있는 생체입자 정제 장치 및 정제 방법에 관한 것이다.
엑소좀(exosome)은 거의 모든 진핵세포에서 분비되는 50~150㎚ 사이즈의 세포 소포체로서, 세포의 때 또는 세포의 분신(또는 아바타)이라고 불린다. 세포는 세포마다 고유의 엑소좀을 분비하고 흡수하므로 엑소좀은 세포간 정보전달 물질로 사용된다.
췌장암은 그 증상을 자각할 시점에는 전이가 많이 진행되어 생존률이 극히 낮은 경우가 많아 최악의 암이라고도 불리며, 혈관 침습이 일어나지 않더라도 전이가 일어나는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 혈관 침습 없이 전이가 일어나는 메커니즘은 엑소좀의 분비와 정보 전달력을 바탕으로 하는 것으로 알려져 있다. 역설적으로, 엑소좀에 췌장암에 치명적인 물질을 탑재한 후 암의 방어 기작을 쉽게 뚫고 들어가서, 세포 내로 약물을 침투시켜 효과적으로 작동하게 하면, 엑소좀을 췌장암을 무력화시킬 수 있는 강력한 약물 운반 수단이 될 수 있다.
엑소좀은 다양한 바이오 마커로서 진단에 사용 가능하고, 약물 운반체로서 치료에 사용이 가능하다. 엑소좀은 독성이 없고 면역 반응을 일으키지 않으므로 타인에게도 이용 가능하고, BBB(Brain Blood Barrier)를 통과할 뿐만 아니라, 신체 내 거의 모든 장기로 이동이 가능하므로 약물 운반뿐만 아니라 세포의 분신 역할을 하여, 줄기세포 치료 시 대체 치료물질로도 사용이 가능하다.
엑소좀은 인체 내에서 세포와 마찬가지의 다양한 역할을 하고 있으므로 건강한 삶을 유지하는 데 많은 영향을 미칠 수 있는 중요한 바이오 소재이지만 현재까지는 원래의 형태와 기능을 유지한 채로 대량으로 분리해 내는 데 많은 기술적 어려움이 있다.
기존에 엑소좀 정제에 사용한 기술은 UCT(UltraCentrifugation-based Techniques), SbT(Size-based Techniques), IAT(Immunoaffinity-based Techniques), MFT(MicroFluidics-based Techniques)의 4가지 기술이 주로 사용되었다. 현재까지 알려진 이들 정제방법에서는 정제 과정에서 엑소좀 샘플의 손상 또는 변형이 일어나고, 샘플의 손실률이 높으며, 분리 효율이 낮고, 과정이 복잡하며, 분리된 엑소좀의 활성도가 저하되는 문제점이 있는 것으로 보고되고 있다.
이들 가운데 현재 가장 많이 사용되는 방법은 UCT로서, 가장 높은 분리 효율을 보여준다고 알려져 있지만, 이 방법의 가장 큰 단점은 높은 원심력 값을 이용하기 때문에 샘플의 변형 및 손상이 필연적으로 발생하므로 활성도가 크게 저하된다는 것이다.
따라서, 손상과 변형 없이 원래의 기능이 유지된 채로 고순도 엑소좀을 대량으로 정제하는 신기술의 개발이 요구되고 있다.
KR 제10-1732207호 (2017.04.25. 등록)
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 생체입자가 손상 또는 변형됨 없이 대량으로 고순도로 생체입자를 정제할 수 있는 장치 및 이를 사용한 생체입자의 정제 방법을 제공하는 것이다.
상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 다수의 나노공극을 포함하는 제1 나노필터; 상기 제1 나노필터보다 작은 크기의 다수의 나노공극을 포함하는 제2 나노필터; 상기 제1 나노필터의 일면에 형성되는 제1 공간부;
상기 제1 나노필터의 타면에 형성되는 제2 공간부; 상기 제2 공간부와 연결되고 상기 제2 나노필터의 일면에 형성되는 제3 공간부; 및 상기 제2 나노필터의 타면에 형성되는 제4 공간부;를 포함하며,
상기 제1 공간부, 제2 공간부, 제3 공간부 및 제4 공간부는 각각 일측에 용액이 주입되는 유입구를 포함하고, 각각 상기 유입구로부터 이격된 타측에 용액이 배출되는 배출구를 포함하되, 상기 제2 공간부의 배출구와 상기 제3 공간부의 유입구는 서로 연결되어 용액이 흐를 수 있으며,
상기 제1 공간부에는 생체입자를 함유하는 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 공간부 및 제4 공간부에는 제2 용액이 주입되며, 상기 제1 공간부의 유입구로 주입되는 제1 용액은 상기 제1 공간부의 유입구로부터 제1 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며, 상기 제2 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제2 공간부의 유입구로부터 제2 공간부의 배출구, 제3 공간부의 유입구 및 제3 공간부의 배출구 순서의 방향으로 흐름성을 가지며, 상기 제4 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제4 공간부의 유입구로부터 제4 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제1 나노필터를 사이에 두고 상기 제1 공간부에는 제1 음극이, 상기 제2 공간부에는 제1 양극이 대향되게 배치되어 상기 제1 음극과 제1 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있으며, 상기 제2 나노필터를 사이에 두고 상기 제3 공간부에는 제2 음극이, 상기 제4 공간부에는 제2 양극이 대향되게 배치되어 상기 제2 음극과 제2 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있는 생체입자 정제 장치를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제1 공간부의 양 말단에 배치되고, 상기 제2 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제2 공간부의 양 말단에 배치되고, 상기 제3 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제3 공간부의 양 말단에 배치되고, 상기 제4 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제4 공간부의 양 말단에 배치되어 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터의 일면 상에서의 상기 제1 공간부 내의 용액의 흐름과 상기 제1 나노필터의 타면 상에서의 상기 제2 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제1 나노필터의 표면에 접하는 방향이며,
상기 제2 나노필터의 일면 상에서의 상기 제3 공간부 내의 용액의 흐름과 상기 제2 나노필터의 타면 상에서의 상기 제4 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제2 나노필터의 표면에 접하는 방향일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터에 포함된 나노공극은 120~200㎚의 평균 크기를 갖고, 상기 제2 나노필터에 포함된 나노공극은 30~70㎚의 평균 크기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터와 제2 나노필터는 각각 독립적으로 200~800㎚의 두께를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 일실시예에 따른 정제 장치를 이용하여 생체입자를 정제하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법은 상기 제1 용액에 50~150㎚의 크기를 갖는 생체입자가 함유된 용액을 공급하고 상기 제2 용액에 생체입자가 함유되지 않은 버퍼 용액(buffer solution)을 공급하며,
동시에 상기 제1 음극과 제1 양극 사이 및 제2 음극과 제2 양극 사이에 전압을 가하여 전기 영동(electrophoresis)을 수행하여 상기 제3 공간부의 배출구로 정제된 생체입자를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 생체입자는 엑소좀(exosome)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 음극과 제1 양극 사이에는 20mV~6V의 전압을 가하고, 상기 제2 음극과 제2 양극 사이에는 40mV~10V의 전압을 가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 용액과 제2 용액의 용매는 동일한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 정제 방법에는 상기 제3 공간부의 배출구에서 수득된 정제된 생체입자를 포함한 용액을 다시 제1 공간부의 유입구로 주입하여 정제를 추가적으로 수행하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 다수의 나노공극을 포함하는 제1 나노필터; 상기 제1 나노필터보다 작은 다수의 나노공극을 포함하는 제2 나노필터; 상기 제1 나노필터의 일면에 형성되는 제1 공간부; 상기 제1 나노필터의 타면과 상기 제2 나노필터의 일면 사이에 배치되게 형성되는 제2 공간부; 및 상기 제2 나노필터의 타면에 형성되는 제3 공간부;를 포함하며,
상기 제1 공간부, 제2 공간부 및 제3 공간부는 각각 일측에 용액이 주입되는 유입구를 포함하고, 각각 상기 유입구로부터 이격된 타측에 용액이 배출되는 배출구를 포함하며,
상기 제1 공간부에는 엑소좀을 포함하는 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 공간부 및 제3 공간부에는 제2 용액이 주입되며,
상기 제1 공간부의 유입구로 주입되는 제1 용액은 상기 제1 공간부의 유입구로부터 제1 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며, 상기 제2 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제2 공간부의 유입구로부터 제2 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며, 상기 제3 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제3 공간부의 유입구로부터 제3 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제1 나노필터 및 제2 나노필터를 사이에 두고 상기 제1 공간부에는 음극이, 상기 제3 공간부에는 양극이 대향되게 배치되어, 상기 음극과 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있는 생체입자 정제 장치를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제1 공간부의 양 말단에 배치되고, 상기 제2 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제2 공간부의 양 말단에 배치되고, 상기 제3 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제3 공간부의 양 말단에 배치될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터의 일면 상에서의 제1 공간부 내의 용액의 흐름과 제1 나노필터의 타면 상에서의 상기 제2 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제1 나노필터에 접하는 방향이며,
상기 제2 나노필터의 일면 상에서의 상기 제2 공간부 내의 용액의 흐름과 상기 제2 나노필터의 타면 상에서의 상기 제3 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제2 나노필터에 접하는 방향일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터에 포함된 나노공극은 120~200㎚의 평균 크기를 갖고, 상기 제2 나노필터에 포함된 나노공극은 30~70㎚의 평균 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터와 제2 나노필터는 각각 독립적으로 200~800㎚의 두께를 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다른 실시예에 따른 정제 장치를 이용하여 생체입자를 정제하는 방법을 제공하며,
상기 정제 방법에 있어서, 상기 제1 용액은 50~150㎚의 크기를 갖는 생체입자가 함유된 용액이고 상기 제2 용액은 생체입자가 포함되지 않는 버퍼 용액(buffer solution)이며,
동시에 상기 음극과 양극 사이에 전압을 가하여 전기 영동(electrophoresis)을 수행하여 상기 제2 공간부의 배출구로 정제된 생체입자를 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 생체입자는 엑소좀(exosome)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 음극과 양극 사이에는 200mV~10V의 전압을 가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 용액과 제2 용액의 용매는 동일한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 정제방법은 상기 B 공간부의 배출구로 수득한 정제된 생체입자를 포함하는 용액을 다시 A 공간부의 유입구로 주입하여 추가적으로 생체입자를 정제하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생체입자 정제 장치, 이를 이용한 생체입자 정제 방법에 따르면, 표면 전하를 갖고 소프트한 표면 특성을 갖는 생체입자를 형태의 손상이나 변형을 최소화하면서 정제할 수 있고, 정제 과정에서 수율이 감소하는 문제 또한 현저히 개선할 수 있어 대용량의 정제가 가능해지는 장점이 있다.
도 1은 엑소좀의 내부 구조를 개략적으로 나타낸 단면도이다.
도 2는 나노필터에 공극을 형성하는 나노구체 패터닝을 각 단계별로 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 나노필터에 공극을 형성하는 나노임프린트 패터닝을 각 단계별로 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 나노필터에 공극을 형성하는 바닥층-기반 역나노구체 마스크 공법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 무수 화합물로 엑소좀의 표면 작용기를 캡핑(capping)하여 표면 전하를 조절하는 반응을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 생체입자 정제 장치의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 세포 내에서 엑소좀이 배출되는 메커니즘을 개략적으로 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 세부적인 구성을 첨부된 도면 및 실시예를 들어 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자들은 종래의 생체입자 정제장치 및 방법의 경우 분리능이나 한 번에 분리할 수 있는 용량 적고 분리된 생체입자의 인지질 이중막이 손상 또는 변형되는 등의 문제가 있어, 이를 해결하고자 연구에 매진하여 본 발명에 이르게 되었다.
이에 따라서, 본 발명은 다수의 나노공극을 포함하는 제1 나노필터;
상기 제1 나노필터보다 작은 크기의 다수의 나노공극을 포함하는 제2 나노필터; 상기 제1 나노필터의 일면에 형성되는 제1 공간부; 상기 제1 나노필터의 타면에 형성되는 제2 공간부; 상기 제2 공간부와 연결되고 상기 제2 나노필터의 일면에 형성되는 제3 공간부; 및 상기 제2 나노필터의 타면에 형성되는 제4 공간부;를 포함하며,
상기 제1 공간부, 제2 공간부, 제3 공간부 및 제4 공간부는 각각 일측에 용액이 주입되는 유입구를 포함하고, 각각 상기 유입구로부터 이격된 타측에 용액이 배출되는 배출구를 포함하되, 상기 제2 공간부의 배출구와 상기 제3 공간부의 유입구는 서로 연결되어 용액이 흐를 수 있으며,
상기 제1 공간부에는 생체입자를 함유하는 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 공간부 및 제4 공간부에는 제2 용액이 주입되며,
상기 제1 공간부의 유입구로 주입되는 제1 용액은 상기 제1 공간부의 유입구로부터 제1 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제2 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제2 공간부의 유입구로부터 제2 공간부의 배출구, 제3 공간부의 유입구 및 제3 공간부의 배출구 순서의 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제4 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제4 공간부의 유입구로부터 제4 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제1 나노필터를 사이에 두고 상기 제1 공간부에는 제1 음극이, 상기 제2 공간부에는 제1 양극이 대향되게 배치되어 상기 제1 음극과 제1 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있으며,
상기 제2 나노필터를 사이에 두고 상기 제3 공간부에는 제2 음극이, 상기 제4 공간부에는 제2 양극이 대향되게 배치되어 상기 제2 음극과 제2 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있는 생체입자 정제 장치를 제공한다.
본 발명에 따른 생체입자 정제 장치에 의하여 생체입자를 정제하는 경우, 서로 다른 크기의 나노공극을 갖는 2종의 나노필터에 의하여 생체입자보다 큰 입자 및 생체입자보다 작은 입자를 각각 분리하여 정제된 생체입자를 얻을 수 있으며, 제1 공간부, 제2 공간부, 제3 공간부 및 제4 공간부에서의 용액의 흐름이 제1 나노필터 또는 제2 나노필터 표면에 대하여 수직 방향이 아닌 접하는 방향(Tangential flow)이므로, 필터의 막힘이나 정제 과정에서 생체입자의 손상이나 변형이 줄어들 수 있다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 생체입자 정제장치의 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6을 참조하면, 상기 생체입자 정제장치(1000)에서 생체입자는 제1 나노필터(120)와 제2 나노필터(220)에 의하여 순차적으로 정제된다. 제2 나노필터(220)의 나노공극(223)은 제1 나노필터(120)의 나노 공극(123)을 가진다.
상기 제1 나노필터(120)는 일면(121)에 제1 공간부(110)를, 타면(122)에 제2 공간부(130)를 구비하고, 상기 제1 공간부(110)에는 제1 음극(113)이, 제2 공간부(130)에는 제1 양극(133)이 배치된다. 제1 음극(113)과 제1 양극(133)은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있다.
또한, 상기 제1 음극(113)과 제1 양극(133)은 상기 제1 나노필터(120)를 사이에 두고 대향되게 배치되어 있어, 제1 공간부(110), 제2 공간부(130) 및 그 사이에 배치된 상기 제1 나노필터(120)는 전극을 전원에 연결하는 경우 상기 제1 양극(133)에서 제1 음극(113) 사이에 형성되는 전기장의 영향을 받는다. 바람직하게는 상기 제1 음극(113)과 제1 양극(133)은 평행하게 배치되어 있어, 상기 전기장은 제1 양극(133)에서 제1 음극(113) 방향의 평행한 전기장일 수 있다.
따라서, 전극에 전원을 연결하면 제1 공간부(110)에 있던 표면 음전하를 띤 생체입자가 전기동역학적 원리에 의하여 제2 공간부(130)로 이동하며 제1 나노필터(120)를 통과하게 되며, 여기서 제1 나노필터(120)의 나노공극(123)을 통하여 생체입자는 그 입자의 크기에 따라 나노공극(123)보다 큰 입자는 제1 공간부(110)에 잔류하고, 나노공극(123)보다 작은 입자는 제2 공간부(130)로 이동한다.
마찬가지로, 도 6을 참조하면, 상기 제2 나노필터(220)는 일면(221)에 제3 공간부(210)를, 타면(222)에 제4 공간부(230)를 구비한다. 또한, 상기 제3 공간부(210)에는 제2 음극(213)이, 상기 제4 공간부(230)에는 제2 양극(233)이 배치되며, 상기 제2 음극(213)과 제2 양극(233)은 동일한 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있다.
또한, 상기 제2 음극(213)과 제2 양극(233)은 상기 제2 나노필터(220)를 사이에 두고 대향되게 배치되어 있어, 제3 공간부(210)와 제4 공간부(230)는 전극을 연결하는 경우 상기 제3 공간부(210), 제4 공간부(230) 및 그 사이에 배치된 제2 나노필터(220)는 제2 양극(233)에서 제2 음극(213)을 향하는 전기장 내에 놓이게 된다. 바람직하게는 상기 제2 음극(213)과 제2 양극(233)은 평행하게 배치되어 있어 상기 전기장은 제2 양극(233)에서 제2 음극(213)을 향하는 방향의 평행한 전기장일 수 있다.
따라서, 전극을 전원에 연결하면 제3 공간부(210)에 있던 표면 음전하를 띤 생체입자가 전기동역학적 원리에 의하여 제4 공간부(230)로 이동하며 제2 나노필터를 통과하게 되며, 여기서 제2 나노필터(220)의 나노공극(223)보다 큰 입자는 제3 공간부(210)에 잔류하고, 작은 입자는 제4 공간부(230)로 이동하게 된다.
상기 제1 공간부(110), 제2 공간부(130), 제3 공간부(210) 및 제4 공간부(230)은 각각 유입구와 배출구를 포함한다. 유입구는 생체입자를 함유하는 용액 또는 버퍼 용액(buffer solution)이 각 공간부로 주입되는 부분이며, 배출구는 각 공간부로부터 생체입자를 함유하는 용액 또는 버퍼 용액이 배출되는 부분이다.
여기서 버퍼 용액(buffer solution)은 상기의 생물학적 시료인 생체입자를 함유하는 용액과 혼합되더라도 상기 생체입자의 지질막 구조에 영향을 주지 않는 것이라면 그 종류가 제한되지 않으며, 바람직하게는 상기 생체입자를 함유하는 용액의 용매와 동일한 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 버퍼 용액은 인산완충 식염수(phosphate buffer saline, PBS), 수크로오스를 포함하는 PBS 용액, 글라이신을 포함하는 PBS 용액 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 수크로오스를 포함하는 PBS 용액일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2 공간부(130)의 배출구와 상기 제3 공간부(210)의 유입구는 서로 연결되어 있어 용액이 흐를 수 있다. 즉, 용액은 제2 공간부(130)의 유입구에서 제2 공간부(130)의 배출구, 제3 공간부(210)의 유입구, 제3 공간부(210)의 배출구의 순서로 흐른다.
도 6을 참조하면 제2 공간부(130)의 배출구는 제3 공간부(210)과 연결되어 용액이 제2 공간부(130)에서 제3 공간부(210)로 흐르는 것을 확인할 수 있다.
상기 제1 공간부(110)에는 생체입자를 함유하는 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 공간부(130) 및 제4 공간부(230)에는 제2 용액이 주입된다.
상기 제2 용액은 바람직하게는 상술한 버퍼 용액일 수 있다.
상기 제1 공간부(110), 제2 공간부(130), 제3 공간부(210) 및 제4 공간부(230) 내에서의 용액은 각각의 유입구로부터 배출구 방향으로의 흐름성을 가진다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 공간부(110)의 유입구와 배출구는 상기 제1 공간부(110)의 양 말단에 배치되고, 상기 제2 공간부(130)의 유입구와 배출구는 상기 제2 공간부(130)의 양 말단에 배치되고, 상기 제3 공간부(210)의 유입구와 배출구는 상기 제3 공간부(210)의 양 말단에 배치되고, 상기 제4 공간부(230)의 유입구와 배출구는 상기 제4 공간부(230)의 양 말단에 배치되어 있을 수 있다. 이에 따라서, 제1 공간부(110), 제2 공간부(130), 제3 공간부(210) 및 제4 공간부(230)에서의 용액의 흐름은 제1 나노필터(120) 및 제2 나노필터(220)의 표면에 접한 방향일 수 있다. 즉 탄젠셜 플로우(tangential flow)이다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1 공간부(110)의 유입구에서 배출구 방향으로 향하는 용액의 흐름 방향과 상기 제2 공간부(130)의 유입구에서 배출구 방향으로 향하는 용액의 흐름 방향은 상기 제1 나노필터(120)의 양면 상에서 서로 같은 방향일 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 제1 나노필터(120)의 양면 상에서의 용액의 흐름 방향은 제1 나노필터(120)의 표면에 접하는 방향이다.
다시 말해서, 용액의 흐름 방향은 제1 나노필터(120)를 통과하는 수직 방향이 아닌 나노필터에 접하는 방향으로, 이를 탄젠셜 플로우(tangential flow)라고 한다. 탄젠셜 플로우와 전기영동법을 결합함으로써 나노필터에 여과되는 입자가 막힘 등을 유발하는 현상이 억제되어 더 빠른 속도로, 대용량으로 생체입자의 정제가 가능해지는 장점이 있으며, 정제 과정에서의 생체입자의 변형이나 손상을 최소화할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제3 공간부(210)의 유입구에서 배출구 방향으로 향하는 용액의 흐름 방향은 상기 제2 나노필터(220)의 양면 상에서 서로 같은 방향일 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 제2 나노필터(220)의 양면 상에서의 용액의 흐름 방향은 제2 나노필터(220)의 표면에 접하는 방향이다.
제1 나노필터(120)에서와 마찬가지로, 용액의 흐름 방향은 제2 나노필터(220)를 통과하는 수직방향이 아닌 나노필터에 접하는 방향으로서, 탄젠셜 플로우를 갖는다. 탄젠셜 플로우와 전기영동법을 결합함으로써 나노필터의 막힘이나 생체입자의 변형 및 손상을 최소화할 수 있는 점은 제1 나노필터(120)에서 설명한 바와 같다.
상기 제1 나노필터(120)와 제2 나노필터(220)는 SiNx 단층박막 대신에 SiNx/SiO2/고분자, SiNx/SiO2/SAMs 및 SiNx/SiO2/SAMs-고분자 하이브리드의 다층 구조를 갖는 나노필터를 사용할 수 있다. 그러나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며 생체입자 분리/정제 기술에서 사용되는 다른 나노필터 소재 중에서도 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 나노필터에 포함된 나노공극은 120~200㎚의 평균 크기를 갖고, 상기 제2 나노필터에 포함된 나노공극은 30~70㎚의 평균 크기를 갖는 것일 수 있다.
따라서 제1 나노필터(120)에 의하여 정제하려는 생체입자보다 큰 크기의 입자를 분리하고, 제2 나노필터(220)에 의하여 정제하려는 생체입자보다 작은 크기의 입자를 분리할 수 있다.
상술한 나노공극은 바람직하게는 나노구체(nanosphere) 패터닝 기술 또는 나노 임프린팅(nanoimprinting) 패터닝 기술로 형성할 수 있다. 그러나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도 2 및 도 3에는 제1 나노필터 또는 제2 나노필터에 나노공극을 형성하는 과정이 개략적으로 나타나 있다. 도 2는 나노구체 패터닝에 의하여 나노공극을 형성하는 방법을 도시하고 있으며, 도 3은 나노 임프린팅 패터닝에 의하여 나노공극을 형성하는 방법을 도시하고 있다.
나노구체 패터닝의 경우 나노구체의 이중층이 발생하거나 공극의 크기가 불규칙해지는 단점이 있을 수 있다. 이를 해결하기 위하여 도 4에 도시된 바닥층기반 역나노구체 마스크 공법을 도입할 수 있다. 즉, 기판 상에 나노구체를 도포한 후, 스핀코팅에 의하여 불규칙성이 해소된 마스크의 제작이 가능해진다.
바람직하게는, 상기 제1 나노필터와 제2 나노필터는 각각 독립적으로 200~800㎚의 두께를 갖는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 제1 나노필터(120)와 제2 나노필터(220)는 각각 독립적으로 300~600㎚의 두께를 갖는 것일 수 있다. 만일 나노필터의 두께가 200㎚ 미만인 경우, 필터의 내구력이 약해져 수명이 감소하게 될 수 있고, 800㎚를 초과하는 경우에는 나노공극의 막힘 발생이 증가하고 정제 속도가 느려지게 되는 단점이 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1 공간부의 용액이 흐르는 방향에 수직한 단면과 제2 공간부의 용액이 흐르는 방향에 수직한 단면의 제1 나노필터를 사이에 두고 대응되는 위치에서의 면적비는 1:1.2 ~ 1:10이며,
상기 제3 공간부의 용액이 흐르는 방향에 수직한 단면과 제4 공간부의 용액이 흐르는 방향에 수직한 단면의 제2 나노필터를 사이에 두고 대응되는 위치에서의 면적비는 1:1.2 ~ 1:10일 수 있다.
유체의 연속 방정식에 의하여 동일한 유속으로 유체를 관에 주입하였을 때, 단면적이 변화하면 속도는 그에 반비례하게 변화하게 된다(아래 수학식 1)
[수학식 1]
A1v1=A2v2
상기 수학식 1에서, A1과 A2는 1 지점과 2지점에서의 단면적, v1과 v2는 각각 1지점과 2지점에서의 유속을 나타낸다.
또한, 베르누이의 정리(Bernoulli's principle)에 의하여 유체의 속력은 압력에 반비례하다. 따라서, 제1 공간부보다 제2 공간부의 압력이 더 적은 것은 바람직하지 않으며, 마찬가지로 제3 공간부보다 제4 공간부의 압력이 더 큰 것은 바람직하지 않다.
따라서, 제1 나노필터(120)를 사이에 두고 대향되는 위치(또는 대응되는 위치)에서 용액의 흐름에 대하여 수직인 방향으로의 단면적의 비는 6:4~4:6일 수 있다. 만일 단면적의 비가 6:4보다 제1 공간부(110) 쪽이 더 큰 경우, 생체입자를 포함하는 제1 용액의 흐름이 너무 느려져서 정제 속도가 감소할 수 있으며, 반대로 단면적의 비가 4:6보다 제2 공간부(130) 쪽이 더 큰 경우, 제1 공간부(110)의 압력보다 제2 공간부(130)의 압력이 더 커지게 되므로 입자의 전기동역학적 거동이 제한되어 정제 속도가 느려지게 되는 문제점이 있다.
마찬가지로 동일한 이유로 제3 공간부(210)와 제4 공간부(230)의 제2 나노필터(220)를 사이에 두고 대향되는 위치(또는 대응되는 위치)에서의 용액 흐름에 대하여 수직인 방향으로의 단면적의 비는 6:4~4:6인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 상술한 문제점을 해결하기 위하여 다른 일실시예로서 다수의 나노공극을 포함하는 제1 나노필터; 상기 제1 나노필터보다 작은 다수의 나노공극을 포함하는 제2 나노필터; 상기 제1 나노필터의 일면에 형성되는 A 공간부; 상기 제1 나노필터의 타면과 상기 제2 나노필터의 일면 사이에 배치되게 형성되는 B 공간부; 및 상기 제2 나노필터의 타면에 형성되는 C 공간부;를 포함하며,
상기 A 공간부, B 공간부 및 C 공간부는 각각 일측에 용액이 주입되는 유입구를 포함하고, 각각 상기 유입구로부터 이격된 타측에 용액이 배출되는 배출구를 포함하며,
상기 A 공간부에는 생체입자를 함유하는 제1 용액이 주입되고, 상기 B 공간부 및 C 공간부에는 제2 용액이 주입되며,
상기 A 공간부의 유입구로 주입되는 제1 용액은 상기 A 공간부의 유입구로부터 A 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 B 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 B 공간부의 유입구로부터 B 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 C 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 C 공간부의 유입구로부터 C 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
상기 제1 나노필터 및 제2 나노필터를 사이에 두고 상기 A 공간부에는 음극이, 상기 C 공간부에는 양극이 대향되게 배치되어, 상기 음극과 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있는 생체입자 정제 장치를 제공한다.
즉, 상술했던 본 발명의 일실시예에 따른 생체입자 정제 장치에서 제2 공간부(130)와 제3 공간부(210)가 일체화된 형태의 생체입자 정제 장치도 가능하다. 여기서 상기 A 공간부는 상술한 제1 공간부(110)에 대응하고, C 공간부는 상술한 제4 공간부(230)에 대응한다.
상기 본 발명의 다른 일실시예에 따른 생체입자 정제 장치에서 A 공간부에 대한 설명은 상술한 생체입자 정제 장치의 제1 공간부(110)에 대한 설명으로 갈음하며, C 공간부에 대한 설명은 상술한 제4 공간부(130)에 대한 설명으로 갈음한다.
또한, 제1 나노필터 및 제2 나노필터에 대한 설명은 상술한 바와 동일하므로 생략한다.
즉, A 공간부의 유입구와 배출구는 상기 A 공간부의 양 말단에 배치되고, B 공간부의 유입구와 배출구는 상기 B 공간부의 양 말단에 배치되고, C 공간부의 유입구와 배출구는 상기 C 공간부의 양 말단에 배치된다.
마찬가지로 A 공간부 내 용액의 흐름과 B 공간부 내 용액의 흐름은 제1 나노필터의 양면 상에서 같은 방향이되 상기 제1 나노필터에 접하는 방향이며,
B 공간부 내 용액의 흐름과 C 공간부 내 용액의 흐름은 제2 나노필터의 양면 상에서 같은 방향이되 상기 제2 나노필터에 접하는 방향이다. 이에 따른 효과는 상술한 바와 같이 나노필터의 막힘을 최소화하여 정제 속도를 향상시키는 것이어서 연속적으로 정제를 수행할 수 있도록 하는 것이다.
또한, 제1 나노필터를 사이에 두고 양면의 대응되는 위치에서의 A 공간부의 단면적과 B 공간부의 단면적의 비는 6:4~4:6인 것이 바람직하고, 제2 나노필터를 사이에 두고 양면의 대응되는 위치에서의 B 공간부의 단면적과 C 공간부의 단면적의 비 또한 6:4~4:6인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상술한 생체입자 정제 장치를 사용하여 생체입자를 정제하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 상기 제1 용액에 50~150㎚의 크기를 갖는 생체입자가 함유된 용액을 공급하고 상기 제2 용액에 생체입자가 함유되지 않은 버퍼 용액(buffer solution)을 공급하며,
동시에 상기 제1 음극과 제1 양극 사이 및 제2 음극과 제2 양극 사이에 전압을 가하여 전기 영동(electrophoresis)을 수행하여 상기 제3 공간부의 배출구로 정제된 생체입자를 수득하는 것을 특징으로 한다.
상기 제2 공간부와 제3 공간부가 일체로 된 실시예에 따른 경우, 용액 주입 및 전기 영동을 수행하여 배출되는 정제된 생체입자는 B 공간부의 배출구로 배출되는 것이다.
상기 생체입자는 엑소좀(exosome)일 수 있다.
엑소좀은 세포에서 분비되는 수십 나노미터 크기의 소포로서, 지질 이중층(lipid bilayer) 또는 지질 단층(lipid monolayer) 내부에 세포질 또는 세포에서 생성되는 단백질과 RNA가 포함되어 있는 구조이다. 엑소좀은 단백질 및 RNA의 교환을 통한 세포간 의사소통의 수단이며, 세포내 불필요한 물질의 배출 기능도 담당하고 있으며, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)를 포함하고 있어 암 등의 질병 조기진단과 같은 분자진단에 있어 유용한 마커로 활용 가능하다. 엑소좀은 표면 전하를 제타 퍼텐셜(zeta potential)로 측정하면 약 -15.mV 내외의 음전하 값을 보이고, 표면에 일부 존재하는 NH+ 양전하를 시트라코닉산 무수물(citraconic anhydride)로 캡핑하면 -50.0mV까지 조절이 가능하다. 또한 엑소좀은 약 50~150㎚의 직경을 갖는 것으로 알려져 있어, 본 발명에 따른 정제 장치를 사용하여 정제하는 경우 서로 다른 크기의 2종의 나노필터에 의하여 이보다 큰 입자 및 작은 크기를 갖는 입자를 효과적으로 제거하여 정제된 엑소좀을 수득할 수 있다.
바람직하게는 상기 제1 용액은 엑소좀을 포함하는 용액일 수 있고, 제2 용액은 엑소좀을 포함하지 않는 버퍼 용액일 수 있다. 제1 용액과 제2 용액은 바람직하게는 동일한 용매를 사용하는 것일 수 있다. 제1 용액은 상기 제1 공간부(또는 A 공간부)의 유입구로 주입되고, 제2 용액은 상기 제2 공간부(또는 B 공간부) 및 제4 공간부(또는 C 공간부)로 주입될 수 있다.
제1 용액과 제2 용액을 상기 공간부로 주입하여 일정 속도로 흐르게 하여 탄젠셜 플로우를 발생시키면서 각 공간부에 배치된 전극에 전압을 걸어 전기 영동을 동시에 수행하여 생체입자의 정제를 수행할 수 있다.
바람직하게는, 상기 제1 용액의 주입 속도는 0.01~1.0 ml/min이고,
상기 제2 공간부의 유입구를 통한 제2 용액의 주입 속도는 0.01~1.0 ml/min이고,
상기 제4 공간부의 유입구를 통한 제2 용액의 주입 속도는 0.01~1.0 ml/min일 수 있다.
각 용액의 주입 속도가 각각 0.01 ml/min 미만인 경우 정제 속도가 느려져 생산성이 떨어지고 나노필터의 막힘에 의하여 수명이 감소될 수 있다. 반대로, 각 용액의 주입 속도가 각각 1.0 ml/min를 초과하는 경우, 전기영동에 의한 정제가 이루어지기 전에 배출구로 생체입자가 배출되게 되어 정제의 효과가 떨어지게 되는 문제점이 있다.
바람직하게는, 상기 제1 음극과 제1 양극 사이에는 200mV~6V의 전압을 가하고, 제2 음극과 제2 양극 사이에는 400mV~10V의 전압을 가할 수 있다. 또한, 상기 제2 공간부(130)와 제3 공간부(210)가 일체형인 실시예에 있어서는 음극과 양극 사이에 200mV~10V의 전압을 가할 수 있다.
여기서 말하는 전압이란 실효 전압(Root mean square of voltage)을 의미하는 것일 수 있다.
만일 전압이 200mV 미만인 경우 분리의 효율이 저하되는 문제가 있을 수 있고, 6V를 초과하는 경우에는 나노 필터의 막힘 문제가 있을 수 있다.
이는 상기 제2 공간부(130)와 제3 공간부(210)가 일체형인 실시예에서의 음극과 양극 사이의 전압 범위에 대하여서도 동일하다. 만일 200mV 미만이면 분리의 효율이 저하되는 문제가 있을 수 있고 6V를 초과하는 경우에는 나노 필터의 막힘 문제가 있을 수 있다.
이러한 정제는 1회가 아니라 정제된 입자를 포함하는 용액을 다시 제1 공간부(또는 A 공간부)의 유입구로 주입하여 2회 이상 다시 정제를 수행하는 방식으로 하여 정제 효율을 제고할 수 있다.
본 발명에 따른 생체입자 정제 방법은 탄젠셜 플로우와 전기영동법을 동시에 적용함으로써 종래의 정제 방법에 비하여 연속적인 생체입자, 특히 엑소좀을 정제하기에 유리한 구조를 갖고 있으며, 차후 암 진단법을 위한 마커 추출 및 정제에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 전망된다.
1000: 정제 장치
110: 제1 공간부
113: 제1 음극
120: 제1 나노필터
121: 일면
122: 타면
123: 나노공극
130: 제2 공간부
133: 제1 음극
210: 제3 공간부
213: 제2 음극
220: 제2 나노필터
221: 일면
222: 타면
223: 나노공극
230: 제4 공간부
233: 제2 양극

Claims (20)

  1. 다수의 나노공극을 포함하는 제1 나노필터;
    상기 제1 나노필터보다 작은 크기의 다수의 나노공극을 포함하는 제2 나노필터;
    상기 제1 나노필터의 일면에 형성되는 제1 공간부;
    상기 제1 나노필터의 타면에 형성되는 제2 공간부;
    상기 제2 공간부와 연결되고 상기 제2 나노필터의 일면에 형성되는 제3 공간부; 및
    상기 제2 나노필터의 타면에 형성되는 제4 공간부;를 포함하되,
    상기 제1 나노필터 및 제2 나노필터는 SiNx층 및 SiO2층을 포함하는 다층 구조의 나노필터이며,
    상기 제1 공간부, 제2 공간부, 제3 공간부 및 제4 공간부는 각각 일측에 용액이 주입되는 유입구를 포함하고, 각각 상기 유입구로부터 이격된 타측에 용액이 배출되는 배출구를 포함하되, 상기 제2 공간부의 배출구와 상기 제3 공간부의 유입구는 서로 연결되어 용액이 흐를 수 있으며,
    상기 제1 공간부에는 생체입자를 함유하는 제1 용액이 주입되고, 상기 제2 공간부 및 제4 공간부에는 제2 용액이 주입되며,
    상기 제1 공간부의 유입구로 주입되는 제1 용액은 상기 제1 공간부의 유입구로부터 제1 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
    상기 제2 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제2 공간부의 유입구로부터 제2 공간부의 배출구, 제3 공간부의 유입구 및 제3 공간부의 배출구 순서의 방향으로 흐름성을 가지며,
    상기 제4 공간부의 유입구로 주입되는 제2 용액은 상기 제4 공간부의 유입구로부터 제4 공간부의 배출구 방향으로 흐름성을 가지며,
    상기 제1 나노필터를 사이에 두고 상기 제1 공간부에는 제1 음극이, 상기 제2 공간부에는 제1 양극이 대향되게 배치되어 상기 제1 음극과 제1 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있으며,
    상기 제2 나노필터를 사이에 두고 상기 제3 공간부에는 제2 음극이, 상기 제4 공간부에는 제2 양극이 대향되게 배치되어 상기 제2 음극과 제2 양극은 동일 전원에 의하여 전기적으로 연결되어 있어,
    상기 제1 음극과 제1 양극 사이 및 제2 음극과 제2 양극 사이에 전압을 가하여, 제1 공간부의 유입구로 주입된 생체입자가 전기 영동(electrophoresis)에 의하여 제3 공간부의 배출구로 정제 배출될 수 있고,
    제1 공간부와 제2 공간부는 제1 나노필터를 사이에 두고 대향되는 위치에서 용액의 흐름에 대하여 수직인 방향으로의 단면적의 비가 6:4~4:6이고,
    제3 공간부와 제4 공간부는 제2 나노필터를 사이에 두고 대향되는 위치에서 용액의 흐름에 대하여 수직인 방향으로의 단면적의 비가 6:4~4:6인,
    생체입자 정제 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제1 공간부의 양 말단에 배치되고,
    상기 제2 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제2 공간부의 양 말단에 배치되고,
    상기 제3 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제3 공간부의 양 말단에 배치되고,
    상기 제4 공간부의 유입구와 배출구는 상기 제4 공간부의 양 말단에 배치되는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 나노필터의 일면 상에서의 상기 제1 공간부 내의 용액의 흐름과 상기 제1 나노필터의 타면 상에서의 상기 제2 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제1 나노필터의 표면에 접하는 방향이며,
    상기 제2 나노필터의 일면 상에서의 상기 제3 공간부 내의 용액의 흐름과 상기 제2 나노필터의 타면 상에서의 상기 제4 공간부 내의 용액의 흐름은 같은 방향이되 상기 제2 나노필터의 표면에 접하는 방향인 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 나노필터에 포함된 나노공극은 120~200㎚의 평균 크기를 갖고,
    상기 제2 나노필터에 포함된 나노공극은 30~70㎚의 평균 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 나노필터와 제2 나노필터는 각각 독립적으로 200~800㎚의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 장치.
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  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 정제 장치를 이용하여 생체입자를 정제하는 방법에 있어서,
    상기 제1 용액에 50~150㎚의 크기를 갖는 생체입자가 함유된 용액을 공급하고 상기 제2 용액에 생체입자가 함유되지 않은 버퍼 용액(buffer solution)을 공급하며,
    동시에 상기 제1 음극과 제1 양극 사이 및 제2 음극과 제2 양극 사이에 전압을 가하여 전기 영동(electrophoresis)을 수행하여 상기 제3 공간부의 배출구로 정제된 생체입자를 수득하는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생체입자는 엑소좀(exosome)인 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제1 음극과 제1 양극 사이에는 200mV~6V의 전압을 가하고,
    상기 제2 음극과 제2 양극 사이에는 400mV~10V의 전압을 가하는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 제1 용액과 제2 용액의 용매는 동일한 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 제3 공간부의 배출구에서 수득된 정제된 생체입자를 포함한 용액을 다시 제1 공간부의 유입구로 주입하여 정제를 추가적으로 수행하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체입자 정제 방법.
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