JP6762494B2 - エクソソームの形状分布の解析装置、がん検査装置、エクソソームの形状分布の解析方法、及びがん検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、エクソソームの形状分布の解析装置、がん検査装置、エクソソームの形状分布の解析方法、及びがん検査方法に関する。

日本国において、がんは死因のトップに位置づけられる病気である。がんは、進行が進むほど治療が困難になり、死亡に至る。そのため、がん治療は、早期に患者が罹患したがんの種類を検査することが非常に重要である。

がん検査は、様々な方法が知られている。具体的には、血液・尿・便等の生体サンプルに含まれているタンパク質や核酸を調べる方法が挙げられ、例えば、前立腺がんは、血中の特定タンパク質（ＰＳＡ）や特定の核酸の発現量を調べている（特許文献１参照）。また、機器を用いて、生体外からがんの有無を検査する方法も知られており、例えば、ＰＥＴ検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、乳がん用のマンモグラフィー等が挙げられる。更に、内視鏡等の機器を生体内に挿入することで、がんの有無を直接目視し、必要に応じて生体組織を採取して検査する方法も知られている。

特開２０１５−３９３６５号公報

しかしながら、マンモグラフィー、ＰＥＴ検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、内視鏡等の機器を用いた検査は、患者が痛みや圧迫感を感じることがあり、また、ＣＴ検査やマンモグラフィーではＸ線の被ばくがある。そのため、患者への負担が非常に大きいという問題がある。

また、生体サンプルに含まれている化学物質を調べる方法は、例えば、タンパク質に特異的に結合する抗体、核酸に特異的に結合するプローブ等、がんの種類に応じて試薬を準備する必要がある。更に、がんを早期に発見するためには、１〜２年毎に検査をする必要がある。しかしながら、全てのがん検査を１〜２年毎に行うことは現実的には不可能である。そのため、患者への負担が少なく、がんの種類に応じた試薬が不要で、且つ１回の検査でがんの種類を特定できる検査装置及び検査方法が望まれるが、現在のところ、そのような検査装置及び検査方法は知られていない。

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）測定すべきエクソソームより長さが短い貫通孔にエクソソームを通過させ、エクソソームが通過する時の電流値（イオン電流）を測定し、そして、測定したイオン電流の「変化時間（ｔｄ）」及び「大きさに関する情報」をプロットすることでエクソソームの形状分布を解析できること、（２）そして、がん細胞が異なると解析したエクソソームの形状分布が異なること、を新たに見出した。

更に、予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布と、サンプル中のエクソソームを解析して得られた形状分布を比較することで、がんの種類を判別できること、も新たに見出した。

すなわち、本発明の目的は、エクソソームの形状分布の解析装置、がん検査装置、エクソソームの形状分布の解析方法、及びがん検査方法を提供することである。

本発明は、以下に示す、エクソソームの形状分布の解析装置、がん検査装置、エクソソームの形状分布の解析方法、及びがん検査方法に関する。

（１）サンプル中に含まれているエクソソームが通過する貫通孔を形成した基板、
前記基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
前記基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
前記第１チャンバーに形成された第１電極、
前記第２チャンバーに形成された第２電極、
エクソソームが、前記貫通孔を通過する時のイオン電流を測定するための電流計、及び、
前記電流計で測定したイオン電流からエクソソームの形状分布を解析する解析部、
を少なくとも含み、
前記貫通孔の長さが測定すべきエクソソームより短い、
エクソソームの形状分布の解析装置。
（２）前記貫通孔の長さが５００ｎｍ以下である、上記（１）に記載のエクソソームの形状分布の解析装置。
（３）少なくともエクソソームの形状分布を表示できる表示部、
を更に含む上記（１）又は（２）に記載のエクソソームの形状分布の解析装置。
（４）上記（１）〜（３）の何れか一に記載のエクソソームの形状分布の解析装置、
予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布を記憶する記憶部、及び、
サンプル中に含まれるエクソソームが前記貫通孔を通過した時のイオン電流から解析した形状分布を、前記記憶部に記憶されている形状分布と比較することで、がんの種類を判別する判別部、
を含むがん検査装置。
（５）サンプル中に含まれるエクソソームを基板に形成した貫通孔を通過させる工程、
前記エクソソームが前記貫通孔を通過する時のイオン電流を測定する工程、
測定したイオン電流からエクソソームの形状分布を解析する工程、
を少なくとも含み、
前記貫通孔の長さが測定すべきエクソソームより短い、
エクソソームの形状分布の解析方法。
（６）前記貫通孔の長さが５００ｎｍ以下である、上記（５）に記載のエクソソームの形状分布の解析方法。
（７）上記（５）又は（６）に記載のエクソソームの形状分布の解析方法により解析したエクソソームの形状分布を、記憶部に記憶されている予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布と比較することで、がんの種類を判別する工程、
を含むがんの検査方法。

本発明のエクソソームの形状分布の解析装置及びエクソソームの形状分布の解析方法により、患者への負担が少なく、がんの種類に応じた試薬が不要で、且つ１回の検査でがんの種類を特定することができる。

図１は、本発明の解析装置１の概略を示す図である。 図２は、本発明の検査装置１−１の概略を示す図である。 図３は、「変化時間（ｔｄ）」及び「大きさに関する情報」を示すための図である。 図４（Ａ）は、イオン電流の測定結果を示すチャートである。図４（Ｂ）は、エクソソームが通過した際の電流強度（Ｉｐ）をプロットしたヒストグラムである。 図５（Ａ）は、図４（Ａ）で測定した個々のエクソソームの測定値を、電流強度（Ｉｐ）から計算した粒径（ｎｍ）を横軸、「変化時間（ｔｄ）」を縦軸にしてプロットした形状分布である。図５（Ｂ）は、実施例３で解析した形状分布である。図５（Ｃ）は、実施例４で解析した形状分布である。 図６（Ａ）は参考例１で解析した形状分布である。図６（Ｂ）は実施例３で解析した形状分布である。 図７（Ａ）は、実施例５で解析した形状分布である。図７（Ｂ）は、図面代用写真で、実施例５のエクソソームのＴＥＭ写真である。図７（Ｃ）は、実施例２で解析した形状分布である。図７（Ｄ）は、図面代用写真で、実施例２のエクソソームのＴＥＭ写真である。 図８（Ａ）は比較例１で解析した形状分布である。図８（Ｂ）は比較例２で解析した形状分布である。図８（Ｃ）は比較例３で解析した形状分布である。

以下に、エクソソームの形状分布の解析装置（以下、単に「解析装置」と記載することがある。）、がん検査装置（以下、単に「検査装置」と記載することがある。）、エクソソームの形状分布の解析方法（以下、単に「解析方法」と記載することがある。）、及びがん検査方法（以下、単に「検査方法」と記載することがある。）について詳しく説明する。

図１は、本発明の解析装置１の概略を示す図である。本発明の解析装置１は、基板２、基板２に形成されサンプル中に含まれているエクソソーム３が通過できる貫通孔４、基板２の一方の面側の少なくとも貫通孔４を含む面とで電解液を充填する第１チャンバー５を形成できる第１チャンバー部材５１、基板２の他方の面側の少なくとも貫通孔４を含む面とで電解液を充填する第２チャンバー６を形成できる第２チャンバー部材６１、第１チャンバー５内の電解液と接する箇所に形成された第１電極５２、第２チャンバー６内の電解液と接する個所に形成された第２電極６２、エクソソーム３が貫通孔４を通過する時のイオン電流を測定するための電流計７、電流計７で測定したイオン電流からエクソソーム３の形状分布を解析する解析部８を少なくとも含んでいる。

また、解析装置１は、必要に応じて、解析部８が解析したエクソソーム３の形状分布を表示するための表示部９を含んでいてもよい。そして、解析装置１には、必要に応じて、予め解析部８や表示部９を機能させるためのプログラムを格納したプログラムメモリ１０、プログラムメモリ１０に格納されているこのプログラムを読み出し実行するための制御部１１を含んでいてもよい。プログラムは、予めプログラムメモリ１０に記憶しておいても良いし、記録媒体に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ１０に格納されるようにしてもよい。

図２は、本発明の検査装置１−１の概略を示す図である。検査装置１−１は、解析装置１に加え、予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソーム３が貫通孔４を通過した時のイオン電流から解析したエクソソーム３の形状分布を記憶する記憶部１２、サンプル中に含まれるエクソソーム３が貫通孔４を通過した時の形状分布を記憶部１２に記憶されている形状分布と比較することでがんの種類を判別する判別部１３を更に含んでいる。

以下に、解析装置１及び検査装置１−１の各構成について、より具体的に説明する。なお、以下の記載において、「解析装置１」及び「検査装置１−１」に共通する場合は、「装置１」と記載することもある。

基板２は、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている絶縁性の材料であれば特に制限は無い。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ、ＳｉＮ等が挙げられる。また、基板２は、ＳｉＮ、ＳｉＯ₂、ＨｆＯ₂等の材料を用い、固体メンブレンと呼ばれる薄膜状、または、グラフェン、酸化グラフェン、二酸化モリブデン（ＭｏＳ₂）、窒化ホウ素（ＢＮ）等の材料を用い、２次元材料と呼ばれるシート状に形成してもよい。なお、後述するとおり、貫通孔４はエクソソーム３の長さより短くする必要がある。したがって、貫通孔４を形成する基板２は薄い方が好ましく、５００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ以下がより好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましい。なお、例えば、グラフェンは１ｎｍ以下の膜厚の基板２の作製が可能である等、基板２として固体メンブレンまたは２次元材料を用いた場合は、膜厚を非常に薄くできる。したがって、貫通孔４の下限値は貫通孔４が形成できる範囲内であれば特に制限はない。しかしながら、基板２の膜厚が非常に薄いと、破損せずに取り扱うことが困難な場合がある。そのため、基板２は、上記の絶縁性の材料で形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層した積層構造としてもよい。積層構造にする場合は、貫通孔４より大きな孔を形成した支持板の上に固体メンブレンまたは２次元材料を積層し、固体メンブレンまたは２次元材料に貫通孔４を形成すればよい。

本発明の装置１で形状分布を解析するエクソソームは、エクソソームであれば特に制限はないが、がん由来のエクソソームは、がんの種類に応じて形状が異なる。そのため、同じがん由来のエクソソームが貫通孔４を通過した時のイオン電流を多数計測し、形状分布を解析することで、がんの種類を判別することができる。したがって、本発明においては、がん由来のエクソソームの解析用として好適に用いることができる。

がん由来のエクソソームは、血液、尿、唾液等の体液に含まれている。したがって、従来の装置を用いた検査方法とは異なり、非侵襲性のサンプルを使用することができる。なお、体液には、エクソソーム以外の生体成分が含まれている。それら成分は測定のノイズとなることから、例えば、後述する実施例に示すように、公知の手順によりサンプルからエクソソームを分離してもよい。

がんの種類としては、エクソソームを分泌できるがんであれば特に制限はなく、例えば、大腸がん、乳がん、肝臓がん、前立腺がん、神経膠腫、神経膠芽腫、メラノーマ、腎がん、髄芽腫等が挙げられる。がんの種類により、分泌するエクソソームの形状が変わることは、例えば、「Ｔ． Ｏｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１３，２：２０４２４」に記載されている。

また、がんのステージが進行するにつれ、エクソソームの分泌量が変わることも知られている（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｄ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ”， Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１０ （２００８） １３−２１、参照。）。したがって、本発明の装置１を用いてエクソソームの形状分布を解析する際に、単位時間あたりに貫通孔４を通過するエクソソームの数をカウントすることで、がんのステージの進行を判別することもできる。

貫通孔４は、基板２を貫通するように形成されている。イオン電流を検出する際には、貫通孔４の体積が小さいほど感度が高くなる。したがって、上記基板２を薄くする（貫通孔４の長さを短くする）とともに、貫通孔４の幅は、検出したいエクソソームの大きさよりは大きいが、大き過ぎないように適宜調整すればよく、例えば、８００ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜８００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ程度にすればよい。なお、貫通孔４の断面形状が円形の場合、貫通孔４の幅は直径を意味する。また、貫通孔４の断面形状が円形でない場合、貫通孔４の幅は断面の中心を通る任意の２点を結んだ最も短い線の長さを意味する。貫通孔４は、後述する実施例に示すとおり、エッチング等により形成すればよい。なお、本発明において「貫通孔の長さが測定すべきエクソソームより短い」とは、エクソソームの任意の２点を結んだ最も長い線の長さより貫通孔４の長さが短いことを意味する。エクソソーム３の大きさは種類により異なるが、最大で５００ｎｍ程度である。したがって、貫通孔４の長さは、５００ｎｍ以下が好ましく、１００ｎｍ以下がより好ましく、５０ｎｍ以下が特に好ましい。なお、基板２が均一の厚さの場合は、所期の貫通孔４の長さと同じ厚みの基板２を用いればよい。基板２の厚さが不均一の場合は、貫通孔４を形成する部分の厚さが所期の貫通孔４の長さとなる基板２を用いればよい。

第１チャンバー部材５１は、基板２の一方の面側の少なくとも貫通孔４を含む面とで、電解液を充填する第１チャンバー５を形成する。また、第２チャンバー部材６１は、基板２の他方の面側の少なくとも貫通孔４を含む面とで、電解液を充填する第２チャンバー６を形成する。第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は、電気的および化学的に不活性な材料で形成することが好ましく、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ₂、ＳｉＮ、Ａｌ₂Ｏ₃などが挙げられる。

第１チャンバー５及び第２チャンバー６は、貫通孔４を挟むように形成され、第１チャンバー５に投入したエクソソームが、貫通孔４を通り第２チャンバー６に移動できるように形成されていれば特に制限はない。例えば、図１及び２に示すように、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１を別々に作成し、基板２に液密となるように接着すればよい。又は、１つの面が解放状態の略直方体の箱部材を形成し、箱の中央に基板２を挿入・固定し、その後、解放状態の面を同一の材料で液密に封止してもよい。その場合、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１は別々の部材を意味するのではなく、基板２を境に分けた箱部材の一部を意味する。また、第１チャンバー部材５１及び第２チャンバー部材６１には、電解液及びサンプル液を充填・排出、電極及び／又はリードを挿入するための孔を必要に応じて形成してもよい。

第１電極５２及び第２電極６２は、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の導電性金属で形成することができる。第１電極５２及び第２電極６２は、貫通孔４を挟むように形成し、直流電流を印加することで電解液中のイオンを輸送する。したがって、第１電極５２は、第１チャンバー５内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第１チャンバー部材５１の内面、又は第１チャンバー５内の空間にリード５３を介して配置すればよい。第２電極６２も第１電極５１と同様に、第２チャンバー６内の電解液に接する場所に形成されていればよく、基板２の面上、第２チャンバー部材６１の内面、又は第２チャンバー６内の空間にリード６３を介して配置すればよい。

第１電極５２は、リード５３を介して電源５４、アース５５に接続している。第２電極６２は、リード６３を介して電流計７、アース６４に接続している。なお、図１及び図２に示す例では、電源５４は第１電極５２側に、電流計７は第２電極６２側に接続しているが、電源５４と電流計７は、同じ電極側に設けてもよい。

電源５４は、第１電極５２及び第２電極６２に直流電流を通電できるものであれば特に制限はない。電流計７は、第１電極５２及び第２電極６２に通電した際に、発生するイオン電流を経時的に測定できるものであれば特に制限はない。なお、図１及び２には図示していないが、必要に応じてノイズ除去回路や電圧安定化回路等を設けてもよい。

本発明の装置１の貫通孔４にエクソソーム３が通過すると、貫通孔４を流れているイオン電流がエクソソーム３により遮断され、イオン電流が減少する。このイオン電流の減少量が貫通孔４内のエクソソームの体積に比例する。例えば、図１及び２に示すエクソソーム３ａと３ｂが貫通孔４を通過する時、エクソソーム３ｂは中央がくびれた形状であることから、貫通孔４内の経時的なエクソソーム３ａ及び３ｂの体積変化は異なる。したがって、エクソソーム３が貫通孔４内を通過する際の連続的な断面積の情報がイオン電流に反映される。

なお、貫通孔４が非常に大きく、エクソソーム３全体が貫通孔４の中に入ってしまうと、貫通孔４内のエクソソーム３の体積変化は起こらなくなる。また、同じ形状のエクソソーム（３、３ａ）であっても、図１及び２に示すように、貫通孔４を通過する際のエクソソームの向きによっては、エクソソーム３が貫通孔４の中に全て入り込んでしまう場合もある。したがって、貫通孔４の長さは、上記のとおり、エクソソーム３の任意の２点を結んだ最も長い線の長さより貫通孔４の長さが短いことが望ましいが、エクソソーム３の中心を通る任意の２点を結んだ最も短い線より貫通孔４の長さが短い方がより好ましい。

解析部８は、電流計７で測定した多数のエクソソーム３のイオン電流の値を、「変化時間（ｔｄ）」と「大きさに関する情報」でプロットすることで、エクソソームの形状分布を解析する。なお、「変化時間（ｔｄ）」とは、図３に示すように、貫通孔４にエクソソーム３が入ってから出るまでの時間、つまり、測定したイオン電流が定常値から変化し再び定常値に戻るまでの時間を意味する。また、「大きさに関する情報」とは、図３に示す電流強度（Ｉｐ；イオン電流の変化量）、又は電流強度（Ｉｐ）から得られたエクソソームの粒径を意味する。

上記のとおり、貫通孔４を通過する時のエクソソームの向きは必ずしも同じではない。したがって、同じ種類のがん由来で形状も同じであるエクソソームであっても、貫通孔４を通過する向きによっては測定したイオン電流の波形は異なる。したがって、単一のエクソソームのイオン電流の変化を比較しても、エクソソームの種類を判別することは困難である。しかしながら、本発明者らは、同じ種類のがんから分泌されたエクソソーム３が貫通孔４を通過した時のイオン電流の変化を多数測定し、それらの測定結果を「変化時間（ｔｄ）」と「大きさに関する情報」でプロットした形状分布を解析した。そして、形状分布で比較した場合、がんの種類が異なれば解析した形状分布が異なり、がんの種類を判別できることは、本発明者らが新たに発見したものである。

本発明の解析装置１を用いることで、サンプル中のエクソソーム３の形状分布を解析することができる。したがって、解析装置１で解析したエクソソームの形状分布を、予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析した形状分布と比較することで、がんの種類を判断することができる。解析装置１で解析した形状分布は、プリントアウトして既知の形状分布と比較すればよい。また、表示部９に解析した形状分布を表示することで、がんの種類を判断してもよい。表示部９は、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなど、公知の表示装置を用いればよい。

本発明の解析装置１に、予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソーム３が貫通孔４を通過した時のイオン電流から解析したエクソソーム３の形状分布を記憶する記憶部１２、及び、サンプル中に含まれるエクソソーム３が貫通孔４を通過した時のイオン電流から解析した形状分布を記憶部１２に記憶されている形状分布と比較することでがんの種類を判別する判別部１３、を更に含むことで、検査装置１−１を作製することができる。検査装置１−１は、がんの種類を自動的に判別できるので、がんの検査に有用である。なお、本発明において、記憶部に記憶する「イオン電流から作成したエクソソームの形状分布」とは、「変化時間（ｔｄ）」と「大きさに関する情報」をプロットして作成した形状分布図、及び、形状分布図を作成するために必要な「変化時間（ｔｄ）」と「大きさに関する情報」のデータを意味する。

ところで、貫通孔４のサイズが異なったり、第１電極５２及び第２電極６２に印加する電圧が異なると、「変化時間（ｔｄ）」及び「大きさに関する情報」の値が異なる恐れがある。したがって、記憶部１２には、同じ検査装置１−１を用い、同じ測定条件で得られたイオン電流の測定値から解析した形状分布であることが望ましい。また、記憶部１２に記憶する形状分布は１種類に限らず、複数種類のがん細胞由来のエクソソームを解析した形状分布であってもよい。また、がん化していない正常細胞が分泌したエクソソームから解析した形状分布と、がん化した細胞が分泌したエクソソームから解析した形状分布を併せて記憶部１２に記憶し、患者ががんに罹患しておらず、正常であることを確認できるようにしてもよい。

次に、本発明の解析装置１及び検査装置１−１を用いた解析方法及び検査方法について説明する。先ず、解析装置１を用いた解析方法は、以下の手順で行うことができる。
（１）第１チャンバー５及び第２チャンバー６に、電解液を充填する。電解液は、第１電極５２及び第２電極６２が通電できれば特に制限は無く、ＴＥバッファー、ＰＢＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＫＣｌ水溶液等を用いればよい。このとき、第１チャンバー５内と第２チャンバー６内との間は、貫通孔４を介して液絡が取れている。
（２）生体サンプルから分離したエクソソーム３を第１チャンバー５に添加する。
（３）第１電極５２及び第２電極６２に電源５４により通電する。この通電により発生するイオン電流の値を電流計７で経時的に測定する。なお、エクソソームは表面電化（基本的にマイナスチャージ）を有する。したがって、第１電極５２及び第２電極６２に通電すると、通常の拡散に加え、第１チャンバー５に添加したエクソソーム３は電気泳動により基板２に形成した貫通孔４を通過し、第２チャンバー６に移動する。エクソソーム３が貫通孔４を通過する時、電流計７で測定されるイオン電流の値はエクソソーム３の大きさおよび形状に依存して低下する。なお、必要に応じて、エクソソームが分散している溶液にポンプ等で圧力を加え、水流によってエクソソームが貫通孔を通過するようにしてもよい。
（４）測定したイオン電流に基づき、「変化時間（ｔｄ）」と「大きさに関する情報」をプロットすることで形状分布の解析を行う。

以上の手順により、エクソソームの形状分布を解析することができる。解析した形状分布は、プリントアウト又は表示部に表示し、既知のがん由来のエクソソームを同様の手順で解析した形状分布と対比することで、どの種類のがんに罹患しているのか判断することができる。

検査装置１−１を用いた検査方法の場合、上記（４）の手順の後に、
（５）検査装置１−１の記憶部に記憶されている予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布と、上記（４）で解析した形状分布を比較することで、がんの種類を判別することができる。判別した結果は、印字手段により印字してもよいし、表示部に表示してもよい。

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

〔解析装置１の作製〕
＜実施例１＞
１．基板２の作製
先ず、両表面に５０ｎｍの窒化シリコン膜を持つ面方位（１００）のシリコンウエハー（Ｅ＆Ｍ ＣＯ．，ＬＴＤ）を２９ｍｍ四方に切った。基板の一方の面に約５００μｍ四方の領域の孔が形成されているエッチング防止用のメタルマスクをかぶせ、ＲＩＥ装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、ＳＡＭＣＯ ＣＯ．，Ｌｔｄ）によって、孔が形成されている５００μｍ四方の領域のみ窒化シリコン膜を除去し、シリコン表面をむき出しにした。その後、むき出しにした部分のシリコンのみを選択的に水酸化カリウム水溶液（和光純薬株式会社）によって、約３時間かけて１２５℃のホットプレート（Ｈｏｔ ｐｌａｔｅ ＮＩＮＯＳ ＮＤ−１、Ａｓ Ｏｎｅ ＣＯ．，Ｌｔｄ）上でウェットエッチングを行った。この操作により、基板の他方の面の窒化シリコン膜に到達するまでシリコンをエッチングした。窒化シリコン膜に到達したシリコンの孔は約１５０μｍ四方であった。

次に、上記約１５０μｍ四方のシリコンの孔を覆っている窒化シリコン膜のほぼ中央に、電子線描画法により貫通孔４のパターンの描画を行った。次いで、像液に浸して現像を行い、ＲＩＥ装置によって反応性エッチングにより、窒化シリコン膜に直径約２００ｎｍの円筒状の貫通孔４を形成した。形成した貫通孔４のサイズは、直径約２００ｎｍ、長さ約５０ｎｍであった。

２．解析装置１の作製
次に、上記１．で作製した基板２の上下に、電極、電解液及びサンプル投入用の孔を設けたジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）製のポリマーブロック（ＴＯＲＡＹ社製）を液密に貼り付け、第１チャンバー５及び第２チャンバー６を作製した。第１チャンバー５及び第２チャンバー６の容量は、各々約１０μｌであった。第１電極５２及び第２電極６２には銀塩化銀電極を用い、ポリマーブロックに設けた孔から第１チャンバー５及び第２チャンバー６に挿入した。電源５４として電池駆動のバイアス電源（アクシスネット）を用い、リードを介して第１電極５２に接続した。電流計７には、電流アンプと１ＭＨｚの高時間分解能を持つデジタイザ（ＮＩ５９２２， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータの取得を行い、取得したデータは、ＲＡＩＤドライブＨＤＤ（ＨＤＤ−８２６３、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）に格納した。

〔エクソソームの形状分布の解析〕
＜実施例２：肝臓がん由来のエクソソーム＞
１．サンプル調整（超遠心）
（１）肝臓がん由来の細胞（ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｍｅｒｉｃａ）の培養上清液を回収し、遠心分離機を用いて３０００ｇ、４℃条件下で１５分遠心分離を行い、死細胞や細胞片を取り除いた。これを培養上清サンプルとした。
（２）培養上清サンプル２０ｍＬを超遠心機専用の遠心チューブに導入し、４℃条件下１１００００ｇで８０分間遠心処理を行った。
（３）遠心処理で外側にあたるチューブの内壁にピペットが触れないよう注意し、上澄みを取り除き、０．２２μｍのフィルターでろ過した１ｍＬのＰＢＳを用い、遠心処理で外側にあたるチューブの内壁に付着物を複数回のピペッティングにより分散させた。
（４）ＰＢＳを１９ｍＬ加え、再び４℃条件下１１００００ｇで８０分間遠心処理を行った。
（５）遠心処理で外側にあたるチューブの内壁にピペットが触れないよう注意し、上澄みを取り除き、１ｍＬのＰＢＳで付着物をよく分散させた。

２．イオン電流の測定
実施例１で作製した解析装置１の第２チャンバー６に、電解液（ＴＥバッファー：ニッポンジーン社製ＴＥ（ｐＨ ８．０））を充填した。次に、上記１．で調整したサンプルをＴＥバッファーによって１０倍に希釈した１０μｌの溶液を第１チャンバー５に加え、第１電極５２及び第２電極６２に８００ｍＶの電圧を印加し、イオン電流Ｉ_ｉｏｎを測定した。

図４（Ａ）は、イオン電流の測定結果を示すチャートである。イオン電流値が大幅に低下している部分（図中の矢印）は、エクソソームが貫通孔４を通過したことを示している。図４（Ｂ）は、エクソソームが通過した際の電流強度（Ｉｐ）をプロットしたヒストグラムである。エクソソームの大きさ（貫通孔４を通過する時の断面積のサイズ）は、電流強度（Ｉｐ）から求めることができる。図４（Ｂ）に示すとおり、実施例２で測定した肝臓がん由来のエクソソームの分布の中心は、約６２．０ｎｍであった。

図５（Ａ）は、図４（Ａ）で測定した個々のエクソソームの測定値を、電流強度（Ｉｐ）から計算した粒径（ｎｍ）を横軸、「変化時間（ｔｄ）」を縦軸にしてプロットした形状分布である。なお、図５（Ａ）は、実施例２でエクソソームの粒径の分布を調べたため横軸を電流強度（Ｉｐ）から計算した粒径（ｎｍ）としているが、横軸を電流強度（Ｉｐ）としても同様の形状分布が得られる。

＜実施例３：乳がん由来のエクソソーム＞
肝臓がん由来の細胞に代え、乳がん由来の細胞（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（ヒト乳がん細胞）細胞株；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｍｅｒｉｃａ）を用いた以外は、実施例２と同様の手順でサンプルを調整し、形状分布の解析を行った。図５（Ｂ）は、実施例３で作成した形状分布である。なお、実施例３で測定した乳がん由来のエクソソームの分布の中心は、約５８．０ｎｍであった。

＜実施例４：大腸がん由来のエクソソーム＞
肝臓がん由来の細胞に代え、大腸がん由来の細胞（ＨＴＣ１１６（ヒト大腸がん細胞）；細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｍｅｒｉｃａ）を用いた以外は、実施例２と同様の手順でサンプルを調整し、形状分布の解析を行った。図５（Ｃ）は、実施例４で作成した形状分布である。なお、実施例４で測定した乳がん由来のエクソソームの分布の中心は、約４８．２ｎｍであった。

図５（Ａ）〜（Ｃ）から明らかなように、がんの種類が異なると、分泌されたエクソソームの形状分布は全く異なっている。実施例２の肝臓がん由来のエクソソームの分布の中心は約６２．０ｎｍで、実施例３の乳がん由来のエクソソームの分布の中心は約５８．０ｎｍであったことから、粒径のみではがんの種類の判別をすることは困難である。しかしながら、エクソソーム３が貫通孔４を通過する時のイオン電流の測定値に基づき、「変化時間（ｔｄ）」と粒径（電流強度（Ｉｐ））を指標にプロットした形状分布は、がんの種類に応じて全く異なることが明らかとなった。したがって、患者から抽出したサンプルを上記実施例２と同様の手順で形状分布の解析を行い、予め作成した各種がん由来のエクソソームから解析した形状分布と比較することで、患者のがんの種類を判別することができる。

〔正常細胞との比較〕
＜参考例１：乳腺細胞（正常細胞）由来のエクソソーム＞
実施例３の乳がん由来の細胞に代え、正常な乳腺細胞（Ｈｓ ５７８Ｂｓｔ（ヒト正常乳腺細胞）細胞株；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ａｍｅｒｉｃａ）を用いた以外は、実施例３と同様の手順でサンプルを調整し、形状分布の解析を行った。図６（Ａ）は参考例１で解析した形状分布である。なお、参考例１で測定した乳腺細胞由来のエクソソームの分布の中心は、約４５．６ｎｍであった。また、比較のため、実施例３で作成した形状分布を図６（Ｂ）に示す。

図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、がん化した細胞とがん化していない細胞由来のエクソソームから解析した形状分布は異なっていた。したがって、記憶部１２に予め作成した各種がん由来のエクソソームから解析した形状分布以外に、がん化していない正常細胞のエクソソームから解析した形状分布を記憶しておくことで、患者ががんに罹患しておらず、正常であることを確認することもできる。

〔サンプル調整方法とエクソソームの形状〕
＜実施例５＞
実施例２の超遠心によるエクソソームの調整に代え、サンプル中のエクソソームを濃縮するための濃縮試薬であるエキソクイック（ＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＬＣ））を用い、添付マニュアルにしたがってエクソソームの調整を行った以外は、実施例２と同様の手順で形状分布の解析を行った。図７（Ａ）は、実施例５で解析した形状分布で、図７（Ｂ）は、エクソソームのＴＥＭ写真である。また、比較のため、実施例２で解析した形状分布を図７（Ｃ）に、実施例２のエクソソームのＴＥＭ写真を図７（Ｄ）に示す。

図７（Ｂ）及び（Ｄ）に示すように、エクソソームの調整方法が異なると、調整後のエクソソームの形状に影響を与え、その結果、図７（Ａ）及び（Ｃ）に示すように、解析した形状分布も異なる。したがって、予め記憶部に記憶するエクソソームの形状分布の解析手順と、サンプル中のエクソソームから形状分布を解析する手順は、同じ条件で行う必要がある。

〔貫通孔４のサイズと測定したイオン電流の関係〕
＜比較例１〜３＞
実施例１で作製した解析装置１に代え、ナノ粒子の測定装置として市販されているｑＮａｎｏ（メイワフォーシス株式会社製）を用いて、エクソソームのイオン電流を測定し、形状分布の解析を行った。なお、ｑＮａｎｏには、ＮＰ１００フィルター（貫通孔の直径約１００ｎｍ、長さ約１ｍｍ）をセットした。実施例２で用いた肝臓がん（ＨｅｐＧ２）のエクソソームの形状分布を解析したものを比較例１、実施例４の大腸がん（ＨＴＣ１１６）のエクソソームの形状分布を解析したものを比較例２、参考例１の正常な乳腺細胞（Ｈｓ ５７８Ｂｓｔ）のエクソソームの形状分布を解析したもの比較例３とした。

図８（Ａ）は比較例１の形状分布（分布の中心は約９６ｎｍ）、図８（Ｂ）は比較例２の形状分布（分布の中心は約１０７ｎｍ）、図８（Ｃ）は比較例３の形状分布（分布の中心は約１１７ｎｍ）である。図８（Ａ）〜（Ｃ）から明らかなように、エクソソームの大きさよりはるかに大きな貫通孔を通過させた時のイオン電流を解析した場合、がん細胞・正常細胞由来のエクソソームの何れも、有意な傾向は確認できなかった。

以上の結果より、従来から微小な貫通孔を粒子が通過する際のイオン電流を測定することで、粒子のサイズを測定できることは知られていた。しかしながら、貫通孔の長さをエクソソームより短くし、且つ、測定したイオン電流の結果を「変化時間（ｔｄ）」及び「電流強度（粒径）」を指標として形状分布の解析を行うことで、がんの種類を判別できることが明らかとなった。

本発明の装置１を用いることで、抗体や核酸等のがんの種類に応じた試薬を使用することなく、生体サンプルから、がんの種類を判別することができる。したがって、医療機器産業における装置の開発に有用である。

Claims (7)

1. サンプル中に含まれているエクソソームが通過する貫通孔を形成した基板、
   前記基板の一方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第１チャンバーを形成する第１チャンバー部材、
   前記基板の他方の面側の少なくとも貫通孔を含む面とで電解液を充填する第２チャンバーを形成する第２チャンバー部材、
   前記第１チャンバーに形成された第１電極、
   前記第２チャンバーに形成された第２電極、
   エクソソームが、前記貫通孔を通過する時のイオン電流を測定するための電流計、及び、
   前記電流計で測定したイオン電流からエクソソームの形状分布を解析する解析部、
   を少なくとも含み、
   前記エクソソームの形状分布が、
   測定したイオン電流が定常値から変化し再び定常値に戻るまでの時間と、
   イオン電流の変化量、または、イオン電流の変化量から得られたエクソソームの粒径と、
   から解析されたものであり、
   前記貫通孔の長さが測定すべきエクソソームより短い、
   エクソソームの形状分布の解析装置。
2. 前記貫通孔の長さが５００ｎｍ以下である、請求項１に記載のエクソソームの形状分布の解析装置。
3. 少なくともエクソソームの形状分布を表示できる表示部、
   を更に含む請求項1又は２に記載のエクソソームの形状分布の解析装置。
4. 請求項１〜３の何れか一項に記載のエクソソームの形状分布の解析装置、
   予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布を記憶する記憶部、及び、
   サンプル中に含まれるエクソソームが前記貫通孔を通過した時のイオン電流から解析した形状分布を、前記記憶部に記憶されている形状分布と比較することで、がんの種類を判別する判別部、
   を含むがん検査装置。
5. サンプル中に含まれるエクソソームを基板に形成した貫通孔を通過させる工程、
   前記エクソソームが前記貫通孔を通過する時のイオン電流を測定する工程、
   測定したイオン電流からエクソソームの形状分布を解析する工程、
   を少なくとも含み、
   前記エクソソームの形状分布が、
   測定したイオン電流が定常値から変化し再び定常値に戻るまでの時間と、
   イオン電流の変化量、または、イオン電流の変化量から得られたエクソソームの粒径と、
   から解析されたものであり、
   前記貫通孔の長さが測定すべきエクソソームより短い、
   エクソソームの形状分布の解析方法。
6. 前記貫通孔の長さが５００ｎｍ以下である、請求項５に記載のエクソソームの形状分布の解析方法。
7. 請求項５又は６に記載のエクソソームの形状分布の解析方法により解析したエクソソームの形状分布を、記憶部に記憶されている予め準備した既知のがん細胞由来のエクソソームが貫通孔を通過した時のイオン電流から解析したエクソソームの形状分布と比較することで、がんの種類を判別する工程、
   を含むがんの検査方法。