CN114715840B - 差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器及其制备方法和用途 - Google Patents

差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器及其制备方法和用途。该制备方法包括：在硅基底层上形成SiO2层，对硅基底层远离SiO2层的一侧进行刻蚀形成沟槽，位于沟槽区域的SiO2层悬空；在SiO2层上形成石墨烯条带单元，该单元包括两条间隔分布且同时横跨沟槽的单层石墨烯条带；沉积金属电极层，在沟槽一侧形成的电极层同时覆盖两条单层石墨烯条带，在沟槽另一侧形成的电极层包括间隔分布且各覆盖一条单层石墨烯条带的两部分；利用HF溶液刻蚀掉沟槽区域裸露出的二氧化硅层使单层石墨烯条带悬空；利用离子束在悬空的两条单层石墨烯条带中的一条上打出纳米孔。该方法可获得极高的空间分辨率，提高信号强度和信噪比，提高数据的稳定性和可重复性。

Description

差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于单分子检测与分析技术领域，具体而言，涉及差分式悬架单层石墨烯纳米 孔传感器及其制备方法和用途。
背景技术
单分子检测与分析技术的发展对疾病筛查、药物研发、个性化诊疗及生物医学研究等 领域有重大的推进作用，不仅可以应用于病毒及时筛查、胎儿重点基因筛查、DNA损伤检 测、RNA直接测序、单分子蛋白测序、重金属离子检测等诸多场景，更有助于人们从分子层面探索人体奥秘，理解人类生命进程。
其中DNA测序成为众多研究者关注的重点，测序技术经过几代变革逐渐走向成熟和商 业化应用。第一代技术基于Sanger的双脱氧链末端终止法和Gilbert的化学裂解法，使用 PCR(PCR：Polymerase Chain Reaction)扩增结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序，该技术具有较高精度但通量较低，且成本高昂，平均每个碱基的测序成本为1美元。 第二代技术主要有Solexa测序技术、SOLiD测序技术、Complete Genomics测序技术等，在扩增的基础上边合成边测序，提高测序通量和准确度的同时也大大降低了成本，成为目前市场主流方法，但单次只能读取100～800bp(bp：base pair)的DNA片段。第三代技术 主要有tSMS单分子测序技术、SMRT单分子实时技术、VisiGen测序技术等。其最大的特 点是无需PCR扩增的单分子测序，具有更高通量与更短测序时间。虽然测序长度大大延长 (可超过10kb)，但仍受聚合酶活性和荧光基团光漂白的限制。
目前最新一代测序技术为纳米孔单分子测序技术。该类技术无需对单分子进行任何化 学预处理，通过分辨DNA不同碱基对通过纳米孔时引起的电信号的变化即可进行测序。根 据其原理主要分为离子电流检测法、隧道电流检测法以及电容检测法等。而纳米孔又可分为生物纳米孔和固态纳米孔两类。Oxford Nanopore Technologies于2013年推出的MinION 是一款成熟的商用便携式生物纳米孔测序仪，通过预先在每个待测DNA片段末端连接衔接 子(Adaptor)和运动蛋白(Enzyme motor)，然后由衔接子带领待测单链DNA分子及其互 补链经运动蛋白解旋后依次通过纳米孔，检测由过孔核苷酸序列变化引起的离子电流(Ion current)变化进行DNA测序。目前该仪器的原始读取准确率(Raw read accuracy)可以达到99.3％，从单个流通池中可以获取高达50Gb的数据，最低售价仅为1000美元。虽然生 物纳米孔表现出优异的检测效果并得到商业化应用，但仍面临如下几个挑战：(1)嵌合于 磷脂双分子层中的生物膜孔的厚度(约3～8nm)远大于相邻碱基的距离(0.34nm)，所测信号是多个碱基共同作用的结果，影响单个碱基的空间分辨率；(2)磷脂双分子层缺乏耐受性和稳定性，这限制了其使用次数和使用寿命。同时其难以和其他器件集成，加大了规模生产的难度；(3)生物纳米孔恒定的孔径限制了在其他分子检测领域的推广和泛化能力。另外，目前大多数测序器件采用的离子电流检测法也存在诸多局限：(1)离子电流信号幅值不高(仅为1nA量级)，单分子检测的准确性很大程度上依赖后期的智能化信号识别和 数据处理，检测结果的可靠性和稳定性受到影响；(2)单孔离子电流测量，容易堵塞导致 整个器件失效，而纳米孔阵列化测量虽然可以解决单孔堵塞失效的问题同时提高通量，但 离子电流的阵列化设计需要将每个纳米孔间的溶液隔开，这大大增加了器件加工难度与加 工成本；(3)Branton等报道了影响离子电流信号的除了纳米孔中的碱基外，还包括纳米孔 上下两侧厚度约为其直径大小的区域内的碱基，而为了让待测DNA分子通过，孔径必须大 于约1.5nm，这意味着影响区域的长度至少为3nm(2×1.5nm)，同样远大于相邻碱基的距 离。为了克服以上缺陷，研究者们开发了以二氧化硅、氧化铝、氮化硅、二硫化钼、石墨烯等作为纳米孔薄膜材料的固态纳米孔传感器。固态纳米孔机械强度高，化学和热稳定性 好，孔径灵活可调，并容易集成到其他/纳米器件中，可以用成熟的半导体工艺进行批量生 产。
综上所述，虽然目前在单分子测序领域学者们已经取得了令人振奋的实验结果，达到 了较高的准确率，但和临床使用标准还有一定距离，面临着检测膜孔过厚，难以突出单个 碱基信号的挑战，同时检测信号的信噪比有待进一步提高。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个 目的在于提出差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器及其制备方法和用途。其中，采用该差 分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器或其制备方法可获得极高的空间分辨率，能通过检测隧道电流提高信号强度，利用差分电路进一步提高信噪比，大幅提高数据的稳定性和可重复 性，从而更有利于提高测序精度。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳 米孔传感器的制备方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)提供硅基底层，所述硅基底层一侧的表面上形成有二氧化硅层；
(2)对所述硅基底层远离所述二氧化硅层的一侧进行刻蚀，以便在所述硅基底层上形 成至少一个沟槽，使位于所述沟槽区域的所述二氧化硅层悬空；
(3)在所述二氧化硅层上远离所述硅基底的一侧形成石墨烯条带单元，所述石墨烯条 带单元包括两条间隔分布且同时横跨所述沟槽的单层石墨烯条带；
(4)在所述沟槽两侧的部分所述二氧化硅层和所述单层石墨烯条带上沉积金属电极层， 在所述沟槽一侧形成的金属电极层同时覆盖两条所述单层石墨烯条带，在所述沟槽另一侧 形成的所述金属电极层包括间隔分布的两部分，每部分覆盖一条所述单层石墨烯条带；
(5)利用氢氟酸溶液刻蚀掉所述沟槽区域裸露出的二氧化硅层，使所述沟槽区域对应 的所述单层石墨烯条带悬空；
(6)利用离子束在所述沟槽中悬空的两条所述单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳 米孔，以便得到所述传感器。
本发明上述实施例的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方 法至少具有以下有益效果：(1)该方法采用刻蚀法在硅基底上刻蚀出沟槽，不仅可以根据 需求设计任意形状的沟槽图形并控制沟槽尺寸，大大简化沟槽设计和加工的过程，还能在同一硅基底上同时制备出多个互不连通沟槽，不仅操作简便、加工精度高、尺寸可控，而 且能够一体成型，无需键合工艺，可操作性更强；(2)使用悬架单层石墨烯作为检测材料， 更易于加工更小纳米孔径的纳米孔(如10nm以下，具体可以为5nm等)，保证DNA单链碱基能够单个顺次通过；(3)单层石墨烯厚度仅为0.34nm，和DNA单链相邻碱基距离相 当，可以极大提高纳米孔的空间分辨率；(4)每个沟槽区域可以形成一个独立的检测单元，每个检测单元均包含两条单层石墨烯条带且仅其中一条石墨烯条带上具有纳米孔，由此可 以双通道采集电流信号，利用差分原理提高信噪比，大幅提高数据的稳定性和可重复性； (5)可使用面向电流测量方案，单分子过孔时面向隧道电流信号(100nA)要显著大于法 向离子电流信号(1nA)，测量信号显著增强；此外，同一检测单元可在同一待测液中完成 双通道采集电流信号，测量更方便；(6)通过控制刻蚀的沟槽数目及分布情况并结合石墨 烯条带单元，可以获得具有一个或多个独立检测单元的传感器，其中多个独立检测单元可以采用阵列化分布等布置方式，由此可以使得单个传感器测试芯片可以包括几十到上百个 相互独立的检测单元器件，可以同时采集多个分子的过孔信号，即使某个纳米孔堵塞也不 会让整个器件失效，同时显著提高数据通量；(7)该制备方法或采用该方法制得的传感器 在DNA快速测序、RNA直接测序和蛋白质单分子测序等领域有广阔的应用前景。
另外，根据本发明上述实施例的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感 器的制备方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述硅基底层上形成有多个间隔分布且不连通的所述沟槽， 一个所述沟槽构成一个子单元，所述子单元包括横跨同一所述沟槽的两条单层石墨烯条带 以及在该沟槽两侧沉积于部分所述二氧化硅层和两条所述单层石墨烯条带上的金属电极层，任意两个所述子单元之间的所述单层石墨烯条带不连通。
在本发明的一些实施例中，相邻两个所述子单元的间隔距离为50～200μm；和/或，每 个所述子单元的尺寸为(300～700)μm×(300～700)μm。
在本发明的一些实施例中，同一所述石墨烯条带单元中，两条所述单层石墨烯条带的 间距为3～5μm。
在本发明的一些实施例中，单个所述沟槽上悬空的每条单层石墨烯条带的悬空长度为 500～1500nm，悬空宽度为100～500nm。
在本发明的一些实施例中，所述纳米孔的孔径不大于10nm。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)采用如下方式实施：(2-1)在所述硅基底层远离 所述二氧化硅层的一侧形成光刻胶层，并利用电子束光刻法将所述光刻胶层显影成目标形 状，以便裸露出刻蚀窗口处的硅基底层；(2-2)利用二氟化氙气体刻蚀掉裸露出的硅基底， 使所述二氧化硅层下方形成沟槽，位于所述沟槽区域的所述二氧化硅层悬空。
在本发明的一些实施例中，所述硅基底层的厚度为200～500μm。
在本发明的一些实施例中，所述二氧化硅层的厚度为100～300nm。
在本发明的一些实施例中，所述沟槽在靠近所述二氧化硅层一侧的槽间距为10～20μm。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)中，采用光刻法和氧等离子体在所述二氧化硅层 上形成所述石墨烯条带单元。
在本发明的一些实施例中，步骤(4)中，先在所述沟槽两侧的部分所述二氧化硅层和 所述单层石墨烯条带上沉积粘附层，再在所述粘附层上沉积所述金属电极层。
在本发明的一些实施例中，所述粘附层的厚度为5～10nm，所述金属电极层的厚度为 100～150nm。
在本发明的一些实施例中，所述粘附层为铬层，所述金属电极层为金层。
在本发明的一些实施例中，步骤(6)中，采用氦离子聚焦离子束在所述沟槽中悬空的 单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳米孔。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种用于单分子检测的差分式悬架单层石墨 烯纳米孔传感器。根据本发明的实施例，该纳米孔传感器采用上述用于单分子检测的差分 式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方法制备得到。可以理解的是，针对上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方法所描述的特征及效果同样适用于 该用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器，此处不再一一赘述。
在本发明的一些实施例中，用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器包 括多个子传感器，每个子传感器包括一个子单元，所述子单元包括横跨同一沟槽的两条单 层石墨烯条带以及在该沟槽两侧沉积于部分二氧化硅层和两条所述单层石墨烯条带上的金属电极层。
在本发明的一些实施例中，多个所述子传感器阵列分布或环向分布。
根据本发明的第三个方面，本发明提出了一种采用上述用于单分子检测的差分式悬架 单层石墨烯纳米孔传感器进行单分子检测方法。与现有技术相比，该方法可以获得极高的 空间分辨率，能通过检测隧道电流提高信号强度，利用差分电路进一步提高信噪比，当将纳米孔高度阵列化时还能进一步增大检测通量，由此可以更好的克服现有纳米孔技术的瓶 颈，提高测序精度，能达到临床使用标准。可以理解的是，针对上述用于单分子检测的差 分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器所描述的特征及效果同样适用于该单分子检测方法，此 处不再一一赘述。
根据本发明的第四个方面，本发明提出了上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨 烯纳米孔传感器或上述进行单分子检测方法在DNA测序、RNA直接测序和蛋白质单分子检测领域中的用途。与现有技术相比，上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米 孔传感器或上述单分子检测方法可以获得极高的空间分辨率，能通过检测隧道电流提高信 号强度，利用差分电路进一步提高信噪比，当将纳米孔高度阵列化时还能进一步增大检测 通量，由此可以更好的克服现有纳米孔技术的瓶颈，提高测序精度，能达到临床使用标准，对促进疾病筛查、药物研发、个性化诊疗及生物医学研究等相关领域的进一步发展具有重 要意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显 和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感 器的制备方法流程图。
图2是根据本发明再一个实施例的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传 感器的制备方法流程图。
图3是根据本发明一个实施例的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器测量面向电流的 结构示意图。
图4是根据本发明的一个实施例的2×2的阵列化差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感芯 片的结构示意图。
图5是根据本发明一个实施例的采用He+聚焦离子束打孔得到的石墨烯纳米孔的离子 束显微镜照片。
图6是根据本发明一个实施例的阵列差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感芯片的连接电 路照片。
图7是根据本发明一个实施例的通过差分提高输出信噪比的示意图(其中(a)是含有纳 米孔的石墨烯条带的电流信号，(b)是不含纳米孔的石墨烯条带的电流信号，(c)是经过差分 得到的信号)。
图8是根据本发明一个实施例的阵列差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感芯片多测量单 元信号输出结果的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同 或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描 述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳 米孔传感器的制备方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
S100：提供硅基底层，硅基底层一侧的表面上形成有二氧化硅层
根据本发明的实施例，可以对硅基底一侧的表面进行热氧化或化学气相沉积，以便形 成SiO2层，其中，可以通过改变对硅基底进行热氧化的时间或控制化学气相沉积的参数条 件来控制SiO2层的厚度。
根据本发明的实施例，硅基底和SiO2层主要起到支撑作用，硅基底层的厚度可以为 200～500μm，例如可以为250μm、300μm、350μm、400μm或450μm等；SiO2层的厚度可 以为100～300nm，例如可以为150nm、200nm或250nm等，发明人发现，若硅基底和SiO2层的厚度过薄，器件的整体支撑强度不够，影响器件的成品率和使用寿命，而若硅基底和 SiO2层的厚度过厚，又会导致后续刻蚀深度过大，不仅影响刻蚀/制备效率，还可能影响尺 寸控制的精准度，本发明中通过控制硅基底和SiO2层为上述厚度范围，可以更好的兼顾器 件的整体支撑强度和生产效率，提高器件的成品率、生产效率及品质等综合性能。
S200：对硅基底层远离二氧化硅层的一侧进行刻蚀，在硅基底层上形成至少一个沟槽， 使位于沟槽区域的二氧化硅层悬空
根据本发明的实施例，参考图2中(1)理解，可以在硅基底层远离SiO2层的一侧形成第一光刻胶层，并利用电子束光刻法将第一光刻胶层显影成目标形状，以便裸露出刻蚀窗口处的硅基底层；之后将得到的产品放置于二氟化氙(XeF2)气体反应器中，利用二氟 化氙气体刻蚀掉裸露出的硅基底，使SiO2层下方形成沟槽，位于沟槽区域的SiO2层悬空， 得到如图2中(1)所述的产品结构。可以理解的是，由于远离SiO2层一侧的硅基底与二 氟化氙气体接触的时间相对更长，所以刻蚀得到的沟槽在硅基底靠近SiO2层一侧的方向上， 其尺寸在整体上是逐渐变小的。
根据本发明的实施例，沟槽在靠近二氧化硅层一侧的槽间距可以为10～20μm，即沟槽 的最小槽间距可以为10～20μm，例如可以为12μm、14μm、16μm或18μm等，其中，控制 沟槽为上述尺寸范围，不仅可以满足单分子检测所需的器件尺寸要求，还更有利于将后续 在沟槽对应区域形成的悬空单层石墨烯条带的长度及宽度范围控制在纳米尺度内，从而能够有效避因单层石墨烯条带悬空尺寸过大而导致断裂问题的发生。
S300：在二氧化硅层上远离硅基底的一侧形成石墨烯条带单元，石墨烯条带单元包括 两条间隔分布且同时横跨沟槽的单层石墨烯条带
根据本发明的实施例，可以预先利用化学气相沉积法在铜箔上形成单层石墨烯；再在 单层石墨烯上形成PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)支撑层；之后采用铜刻蚀液刻蚀掉铜箔，利用支撑层将单层石墨烯转移至SiO2层上并去除支撑层，参考图2中(2)所示。进一步 地，可以采用光刻法和氧等离子体在二氧化硅层上形成石墨烯条带单元，参考图2中(3) 所示，可以先在单层石墨烯上旋涂一层厚度为250～350nm厚的电子束光刻胶层(即第二光 刻胶层)，再使用电子束光刻技术在第二光刻胶层上曝光显影形成亚微米宽的光刻胶条带， 其中，电子束光刻胶可以采用ZEP520A(下方所述的光刻胶层也可以均采用此型号的光刻胶)，光刻胶层经电子束光刻后的区域将溶于显影液。进一步，结合图2中(4)理解，可 以将经过电子束光刻得到的产品曝露于氧气等离子体环境，未被光刻胶覆盖的单层石墨烯将被刻蚀掉，从而形成石墨烯条带单元。其中，发明人发现，由于单层石墨烯具有原子级 厚度，与DNA单链中两相邻碱基间距离相当，可以大大提高检测精度。
根据本发明的实施例，同一石墨烯条带单元中，两条单层石墨烯条带的间距可以为 3～5μm，例如可以为3.5μm、4μm或4.5μm等，其中，同一石墨烯条带单元中的两条石墨 烯条带用于形成两个独立地测量通路(参考图3理解)，形成差分电路，通过控制两条单层 石墨烯条带的间距为上述范围，既可以避免两个测量通路相互影响，又可以保证二者处于 非常相近的溶液测量环境中，从而可以得到更可靠的差分效果，更有利于提高测量精度。其中，由于待测液流动等原因可能造成电测信号的整体偏移，若选用带纳米孔和未带纳米 孔的差分式测量通路的检测信号进行相减校正，可以消除环境因素对电测信号的不利影响，从而显著提高信噪比。
S400：在沟槽两侧的部分二氧化硅层和单层石墨烯条带上沉积金属电极层，在沟槽一 侧形成的金属电极层同时覆盖两条单层石墨烯条带，在沟槽另一侧形成的金属电极层包括 间隔分布的两部分，每部分覆盖一条单层石墨烯条带
根据本发明的实施例，同一沟槽结合一个石墨烯条带单元可以形成一个检测单元，一 个检测单元包括形成差分电路的两条测量通路(如图3所示)，对应同一检测单元的单层石 墨烯条带的长度是大于沟槽尺寸的，包括与沟槽区域对应的部分和位于沟槽相对两侧的部 分(参考图2中(4)所示)。参考图2中(5)和(6)、以及图3所示，在形成金属电极层时，可以在单层石墨烯条带上方和单层石墨烯条带未覆盖的区域形成第三光刻胶层，利用电子束光刻法将第三光刻胶层形成为与目标电极匹配的裸露图案，采用电子束物理气相沉积法在裸露图案上形成金属电极层，并去除第三光刻胶层，其中，形成的金属电极层一部分与单层石墨烯条带相连，另一部分与二氧化硅层相连，由此既可以获得检测电路，还可以实现单层石墨烯层与二氧化硅层和硅基底层的固定连接。
根据本发明的实施例，在单层石墨烯条带上方和单层石墨烯条带未覆盖的区域形成第 三光刻胶层时，既可以直接在步骤S300中形成的光刻胶条带上和单层石墨烯条带未覆盖的 部分SiO2层区域形成第三光刻胶层，也可以预先去除步骤S300中形成的光刻胶条带，再 在单层石墨烯条带上和单层石墨烯条带未覆盖的部分SiO2层区域形成第三光刻胶层，如图 2中(5)所示。其中，第三光刻胶层的厚度可以为250～350nn，直接在光刻胶条带上和单 层石墨烯条带未覆盖的SiO2层区域形成第三光刻胶层时，两部分区域形成的光刻胶层的厚 度可以相同也可以不同，发明人发现，在纳米级光刻胶厚度范围内，位于光刻胶条带上和 单层石墨烯条带未覆盖的SiO2层区域的光刻胶层即便存在纳米级的厚度差，也不影响刻蚀 效果。
根据本发明的实施例，金属电极层的厚度可以为100～150nm，例如可以为100nm、110nm、 120nm、130nm、140nm或150nm等，通过控制电极层为上述厚度范围，可以保证电极层具有良好的机械强度、导电性，以及与石墨烯层的结合强度，从而提高纳米孔传感器的可靠性和实用性。进一步地，金属电极层可以优选为金层，发明人发现，相对于其它金属电 极易氧化(如银)和与石墨烯粘结性不强(如铂，在与石墨烯结合的时候容易卷曲)等的 缺点，选用金作为电极层至少具有以下优点：一是金的化学性质比较稳定，延展性也比较 好，二是金的粘附力比较强。
根据本发明的实施例，可以先在沟槽两侧的部分二氧化硅层和单层石墨烯条带上沉积 粘附层，再在粘附层上沉积金属电极层，具体可以采用电子束物理气相沉积法实现。其中， 通过预先形成粘结层再形成金属电极层可以进一步提高金属电极层与单层石墨烯条带的结合强度，具体地，粘附层可以为铬层，针对厚度为100～150nm的金属电极层，粘附层的厚 度可以为5～10nm，由此可以进一步保证金属电极层的机械强度、导电性，以及其与单层石墨烯条带以及SiO2层的结合强度，提高最终制得的传感器的可靠性和实用性。
S500：利用氢氟酸溶液刻蚀掉沟槽区域裸露出的二氧化硅层，使沟槽区域对应的单层 石墨烯条带悬空
根据本发明的实施例，参考图2中(7)，可以预先在步骤S400制得的产品上形成第四 光刻胶层，用以保护金属电极层、单层石墨烯层和二氧化硅层；再将产品浸入氢氟酸溶液 中，底部沟槽内未被光刻胶覆盖的SiO2层将被刻蚀掉，形成如图2中(8)所示的单层石墨烯层悬空结构，此时石墨烯的晶格结构不会受到刻蚀过程的影响。其中，该过程中采用的氢氟酸溶液的浓度和刻蚀时间并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如氢氟酸溶液的浓度可以为3～6wt％，具体可以为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、 5wt％、5.5wt％或6wt％等，刻蚀时间可以为1～60分钟，具体可以为5分钟、10分钟、15 分钟或30分钟等。
根据本发明的实施例，单个沟槽上悬空的每条单层石墨烯条带的悬空长度可以为500～1500nm，例如可以为600nm、800nm、1000nm、1200nm或1400nm等；悬空宽度可以 为100～500nm，例如可以为150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm等， 其中，每条单层石墨烯条带的悬空宽度可以通过控制单层石墨烯条带的宽度得到，每条单 层石墨烯条带的悬空长度可以通过控制位于单条石墨烯条带两侧金属电极层的间距得到， 发明人发现，若单层石墨烯条带的悬空尺寸过大，容易导致单层石墨烯条带断裂，通过控 制单层石墨烯条带的悬空尺寸为上述范围，更有利于保证最终制得的传感器的成品率及使用性能。
S600：利用离子束在沟槽中悬空的两条单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳米孔， 得到传感器
根据本发明的实施例，参考图2中(9)和图3理解，可以采用不同的离子对位于同一沟槽中悬空的两条单层石墨烯条带中的其中一条进行打孔，为使得纳米孔边缘更加规整且直径尽可能小以提高其灵敏度，离子可优选为分子质量较小的氦离子。打孔完成后的器件可参考图3的立体结构理解。需要说明的是，图3中所示的立体结构图中，A方向和B方向的硅基底层实际是连通不间隔设置的，位于两条单层石墨烯条带下方的硅基底层可以形 成一个密闭的空间，具体可以参考图4所示的俯视图理解。
根据本发明的实施例，纳米孔的孔径可以不大于10nm，例如可以为5～10nm等，具体 可以根据待测分子的尺寸来控制纳米孔的孔径，其中，采用氦离子聚焦离子束在沟槽中悬 空的单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳米孔可以获得孔径最小为5nm的纳米孔，更有 利于提高DNA分子片断测序的精准度。
根据本发明的实施例，结合图4理解，可以在硅基底层上形成多个间隔分布且不连通 的沟槽，一个沟槽构成一个子单元，每个子单元包括横跨同一沟槽的两条单层石墨烯条带 以及在该沟槽两侧沉积于部分二氧化硅层和两条单层石墨烯条带上的金属电极层，任意两个子单元之间的单层石墨烯条带不连通。由此，可以在硅基底上形成多个子单元，每个子 单元最终可以形成一个独立的检测单元，构成多个相互独立的检测单元可以呈环形或阵列 化等分布方式的传感器结构(每个检测单元相当于一个独立地子传感器，其中图4为2×2 阵列化分布的传感器结构)，具体地，一个硅基底上可以形成数个、几十个或上百个相互独立地检测单元，由此可以同时采集多个分子的过孔信号，大幅提高数据通量，即便一两个 纳米孔堵塞对整体器件的测试精度影响也不大。
根据本发明的实施例，结合图4理解，相邻两个子单元的间隔距离可以为50～200μm， 例如可以为100μm或150μm等，每个子单元的尺寸可以为(300～700)μm×(300～700)μm，例如可以为500μm×500μm等，其中，通过控制子单元为上述尺寸范围，不仅能满足测试需要，能够在同一硅基底上同时构成多个相互独立地检测单元，而且在检测过程中，仅需一滴待测液即可使待测液快速进入多个独立地检测单元中实现同时检测，从而不仅方便操作， 能够获得极高的空间分辨率，通过检测隧道电流提高信号强度，利用差分电路降低信噪比，还能将纳米孔高度阵列化增大检测通量，能够克服现有纳米孔技术瓶颈，再通过多次读取 提高测序精度，达到临床使用标准，更有利于促进疾病筛查、药物研发、个性化诊疗及生 物医学研究等相关领域的进一步发展。
综上所述，本发明上述实施例的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感 器的制备方法至少具有以下有益效果：(1)该方法采用刻蚀法在硅基底上刻蚀出沟槽，不 仅可以根据需求设计任意形状的沟槽图形并控制沟槽尺寸，大大简化沟槽设计和加工的过程，还能在同一硅基底上同时制备出多个互不连通沟槽，不仅操作简便、加工精度高、尺 寸可控，而且能够一体成型，无需键合工艺，可操作性更强；(2)使用悬架单层石墨烯作 为检测材料，更易于加工更小纳米孔径的纳米孔(如10nm以下，具体可以为5nm等)，保证DNA单链碱基能够单个顺次通过；(3)单层石墨烯厚度仅为0.34nm，和DNA单链相邻 碱基距离相当，可以极大提高纳米孔的空间分辨率；(4)每个沟槽区域可以形成一个独立 的检测单元，每个检测单元均包含两条单层石墨烯条带且仅其中一条石墨烯条带上具有纳 米孔，由此可以双通道采集电流信号，利用差分原理提高信噪比，大幅提高数据的稳定性 和可重复性；(5)可使用面向电流测量方案，单分子过孔时面向隧道电流信号(100nA)要显著大于法向离子电流信号(1nA)，测量信号显著增强；此外，同一检测单元可在同一 待测液中完成双通道采集电流信号，测量更方便；(6)通过控制刻蚀的沟槽数目及分布情 况并结合石墨烯条带单元，可以获得具有一个或多个独立检测单元的传感器，其中多个独 立检测单元可以采用阵列化分布等布置方式，由此可以使得单个传感器测试芯片可以包括 几十到上百个相互独立的检测单元器件，可以同时采集多个分子的过孔信号，即使某个纳 米孔堵塞也不会让整个器件失效，同时显著提高数据通量；(7)该制备方法或采用该方法 制得的传感器在DNA快速测序、RNA直接测序和蛋白质单分子测序等领域有广阔的应用 前景。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种用于单分子检测的差分式悬架单层石墨 烯纳米孔传感器。根据本发明的实施例，该纳米孔传感器采用上述用于单分子检测的差分 式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方法制备得到。可以理解的是，针对上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方法所描述的特征及效果同样适用于 该用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器，此处不再一一赘述。
根据本发明的实施例，参考图4理解，用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米 孔传感器可以包括多个子传感器，每个子传感器包括一个子单元，子单元包括横跨同一沟 槽的两条单层石墨烯条带以及在该沟槽两侧沉积于部分二氧化硅层和两条单层石墨烯条带上的金属电极层。其中，多个子传感器可以阵列分布或环向分布，且多个子传感器之间相 互独立互不影响。由此，可以同时采集多个分子的过孔信号，大幅提高数据通量，即便一两个纳米孔堵塞对整体器件的测试精度影响也不大。
根据本发明的第三个方面，本发明提出了一种采用上述用于单分子检测的差分式悬架 单层石墨烯纳米孔传感器进行单分子检测方法。与现有技术相比，该方法可以获得极高的 空间分辨率，能通过检测隧道电流提高信号强度，利用差分电路进一步提高信噪比，当将纳米孔高度阵列化时还能进一步增大检测通量，由此可以更好的克服现有纳米孔技术的瓶 颈，提高测序精度，能达到临床使用标准。可以理解的是，针对上述用于单分子检测的差 分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器所描述的特征及效果同样适用于该单分子检测方法，此 处不再一一赘述。
根据本发明的一个具体示例，上述进行单分子检测方法可以具体包括：(i)将用于单 分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器通过金电极与外部电路连通构成电测系统， 具体可以将传感器上的金电极与引线电路板连接，再与超低噪声电流放大器、多通道数字 采集卡等相连将测量信号传输到工程计算机上，其中所用引线电路板和外接电极如附图6 中所示。(ii)将含有待测分子的电解质溶液滴在该具有纳米孔的传感器上，在传感器法向 施加电压驱动待测分子通过纳米孔。(iii)利用搭接好的电测系统测量单层石墨烯纳米孔的 面向电流，单个测量单元需要分别测量通过有孔和无孔两条石墨烯条带的电流(如附图3 所示)，其中含有纳米孔的通道预期测量结果如附图7中(a)所示，未含纳米孔的通道预 期测量结果如附图7中(b)所示，两者相减得到该测量单元的预期最终输出结果(如附图 7中(c)所示)。(iv)附图8显示了经过差分之后的多个测量单元的预期测量结果，对测量结果进行分析即可得到测序结果。由此，既可以获得极高的空间分辨率，并提高信号强 度，还能进一步提高信噪比，同时还能进一步增大检测通量，可以更好的克服现有纳米孔 技术的瓶颈，提高测序精度，能达到临床使用标准。
根据本发明的第四个方面，本发明提出了上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨 烯纳米孔传感器或上述单分子检测方法在DNA测序、RNA直接测序和蛋白质单分子检测领域中的用途。与现有技术相比，上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传 感器或上述单分子检测方法可以获得极高的空间分辨率，能通过检测隧道电流提高信号强 度，利用差分电路进一步提高信噪比，当将纳米孔高度阵列化时还能进一步增大检测通量， 由此可以更好的克服现有纳米孔技术的瓶颈，提高测序精度，能达到临床使用标准，对促进疾病筛查、药物研发、个性化诊疗及生物医学研究等相关领域的进一步发展具有重要意 义。需要说明的是，针对上述用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器和上 述进行单分子检测方法同样适用于该用途，此处不再一一赘述。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献 所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(一)制备用于单分子检测的阵列差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器
(1-1)采用化学气相沉积法在长宽为15mm×15mm，厚度为500μm的Si(硅)基底的一个表面上沉积厚度为300nm的SiO2层；
(1-2)将一层厚度为300nm的电子束光刻胶(ZEP520A)旋涂于Si基底远离SiO2层一侧的表面，利用电子束光刻技术在光刻胶上曝光显影形成4个刻蚀窗口；
(1-3)将步骤(1-2)得到的基底放置在XeF2(二氟化氙)气体反应器中，刻蚀Si基底并形成沟槽，使SiO2层部分悬空(如附图2中(1)所示)；
(1-4)采用化学气相沉积方法制备单层石墨烯(SLG：Single-Layer Graphene)，然后 将其转移到芯片的SiO2层上(如附图2中(2)所示)；
(1-4)将一层厚度为300nm的电子束光刻胶(ZEP520A)旋涂于SLG表面，使用电 子束光刻技术在光刻胶上曝光显影形成亚微米宽的光刻胶条带阵列(如附图2中(3)所示)；
(1-5)将步骤(1-4)得到的产品暴露在O2(氧气)等离子体中30s(秒)，刻蚀掉未 被光刻胶覆盖的SLG(如附图2中(4)所示)；
(1-6)将另一层300nm厚的光刻胶旋涂在剩余的SLG顶部，利用电子束光刻技术形成与目标电极阵列结构匹配的图案(如附图2中(5)所示)；
(1-7)采用电子束物理气相沉积方法在与目标电极阵列结构匹配的预定区域上依次沉 积8nm厚的Gr(铬)粘附层和120nm厚的Au(金)薄膜，再将获得的产品浸入45℃的ZDMAC(二甲基乙酰胺)溶液中10min以去除非电极阵列区域的光刻胶及其上沉积的Au 层(如附图2中(6)所示)；
(1-8)将另一层300nm厚的光刻胶旋涂在电极以及未被SLG覆盖的SiO2之上作为保护层(如附图2中(7)所示)。
(1-9)将芯片放入去离子水中漂洗并将其转移到37％的氢氟酸缓冲溶液中浸泡5min 去除单层石墨烯下面的SiO2层；再将芯片转移到去离子水中，将乙醇以非常缓慢的速度滴 入水中，直到其浓度达到90％左右(这一过程大约需要12小时)。之后，再将芯片小心地 转移到100％乙醇、100％丙酮中，最后采用超临界点干燥方法(SCPD：Supercriticalpoint drying)干燥芯片，得到两端带电极的悬架单层石墨烯(如附图2中(8)所示)；
(1-10)利用氦离子聚焦离子束在芯片每个测试单元的其中一条单层石墨烯条带裸露 出的窗口中心打出直径为5nm的通过孔(如附图2中(9)所示)。
在本实施例中，我们采用Zeiss氦-氖-镓三束离子显微镜设备来对石墨烯进行He+聚焦 离子束打孔，打孔效果如图5所示。在打孔完成后，发明人的设计阵列差分结构实物图如 图4照片中石墨烯纳米孔芯片所示。
(二)进行单分子检测测试
(2-1)将(1-10)得到的产品上的金电极与引线电路板连接，再与超低噪声电流放大 器、多通道数字采集卡等相连将测量信号传输到工程计算机上，其中所用引线电路板和外 接电极如附图6中所示。
(2-2)将含有待测分子的电解质溶液滴在纳米孔传感芯片上，在传感器法向施加电压 驱动待测分子通过纳米孔。
(2-3)利用搭接好的电测系统测量单层石墨烯纳米孔的面向电流，单个测量单元需要 分别测量通过有孔和无孔两条石墨烯条带的电流(如附图3或4所示)，其中含有纳米孔的 通道预期测量结果如附图7中(a)所示，未含纳米孔的通道预期测量结果如附图7中(b) 所示，两者相减得到该测量单元的预期最终输出结果(如附图7中(c)所示)。
(2-4)附图8显示了经过差分之后的多个测量单元的预期测量结果，对测量结果进行 分析即可得到测序结果。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“内”、 “外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发 明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发 明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广 义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也 可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的 连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规 定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第 二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第 一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅 表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一 个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合 和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。

Claims (18)

1.一种用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器的制备方法，其特征在于，包括：
（1）提供硅基底层，所述硅基底层一侧的表面上形成有二氧化硅层；
（2）对所述硅基底层远离所述二氧化硅层的一侧进行刻蚀，以便在所述硅基底层上形成至少一个沟槽，使位于所述沟槽所在区域的所述二氧化硅层悬空；
（3）在所述二氧化硅层上远离所述硅基底层的一侧形成石墨烯条带单元，所述石墨烯条带单元包括两条间隔分布且同时横跨所述沟槽的单层石墨烯条带；
（4）在所述沟槽两侧的部分所述二氧化硅层和所述单层石墨烯条带上沉积金属电极层，在所述沟槽一侧形成的金属电极层同时覆盖两条所述单层石墨烯条带，在所述沟槽另一侧形成的所述金属电极层包括间隔分布的两部分，每部分覆盖一条所述单层石墨烯条带；
（5）利用氢氟酸溶液刻蚀掉所述沟槽所在区域裸露出的二氧化硅层，使所述沟槽所在区域对应的所述单层石墨烯条带悬空；
（6）利用离子束在所述沟槽中悬空的两条所述单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳米孔，以便得到所述传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅基底层上形成有多个间隔分布且不连通的所述沟槽，一个所述沟槽构成一个子单元，所述子单元包括横跨同一所述沟槽的两条单层石墨烯条带以及在该沟槽两侧沉积于部分所述二氧化硅层和两条所述单层石墨烯条带上的金属电极层，任意两个所述子单元之间的所述单层石墨烯条带不连通。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，相邻两个所述子单元的间隔距离为50~200μm；和/或，
每个所述子单元的尺寸为（300~700）μm×（300~700）μm。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的制备方法，其特征在于，满足以下条件中的至少之一：
同一所述石墨烯条带单元中，两条所述单层石墨烯条带的间距为3~5μm；
单个所述沟槽上悬空的每条单层石墨烯条带的悬空长度为500~1500nm，悬空宽度为100~500nm；
所述纳米孔的孔径不大于10nm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）采用如下方式实施：
（2-1）在所述硅基底层远离所述二氧化硅层的一侧形成光刻胶层，并利用电子束光刻法将所述光刻胶层显影成目标形状，以便裸露出刻蚀窗口处的硅基底层；
（2-2）利用二氟化氙气体刻蚀掉裸露出的硅基底层，使所述二氧化硅层下方形成沟槽，位于所述沟槽所在区域的所述二氧化硅层悬空。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅基底层的厚度为200~500μm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅层的厚度为100~300nm。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述沟槽在靠近所述二氧化硅层一侧的槽间距为10~20μm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，采用光刻法和氧等离子体在所述二氧化硅层上形成所述石墨烯条带单元。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，先在所述沟槽两侧的部分所述二氧化硅层和所述单层石墨烯条带上沉积粘附层，再在所述粘附层上沉积所述金属电极层。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述粘附层的厚度为5~10nm，所述金属电极层的厚度为100~150nm。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于，所述粘附层为铬层，所述金属电极层为金层。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，采用氦离子聚焦离子束在所述沟槽中悬空的单层石墨烯条带中的其中一条上打出纳米孔。
14.一种采用权利要求1~8中任一项所述的制备方法制得的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器。
15.根据权利要求14所述的传感器，其特征在于，包括多个子传感器，每个子传感器包括一个子单元，所述子单元包括横跨同一沟槽的两条单层石墨烯条带以及在该沟槽两侧沉积于部分二氧化硅层和两条所述单层石墨烯条带上的金属电极层。
16.根据权利要求15所述的传感器，其特征在于，多个所述子传感器阵列分布或环向分布。
17.一种采用权利要求14~16中任一项所述的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器进行单分子检测方法。
18.权利要求14~16中任一项所述的用于单分子检测的差分式悬架单层石墨烯纳米孔传感器或权利要求17所述的进行单分子检测方法在DNA测序、RNA直接测序和蛋白质单分子检测领域中的用途。
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