CN108593728B - 一种单分子水平同时区分单碱基错配的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸分子单碱基错配的识别领域，公开了一种单分子水平同时区分单个碱基错配的方法。单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括：结合纳米孔电化学技术确定非标记的共臂型改良分子信标；依据分子信标引起的单个目标分子穿孔行为的特征阻断时间，发展单分子策略同时区分完全互补和单碱基错配的序列。本发明结合纳米孔电化学技术，设计了一种非标记的共臂型改良分子信标，其在识别靶序列时表现出较高的信背比(～104)，较高的热力学稳定性以及较快的杂化速率。这种免标记的单分子策略实现了在单分子水平同时区分完全互补和单碱基错配的序列，本发明在快速检测、精准识别、以及早期临床诊断等领域具有潜在的应用价值。

Description

一种单分子水平同时区分单碱基错配的方法
技术领域
本发明属于核酸碱基错配的识别领域，尤其涉及一种单分子水平同时区分单个碱基错配的方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：单个碱基突变与人类疾病密切相关，单个碱基错配的识别对于早期疾病诊断，药物遗传学和种群遗传学具有重要意义。测序是一种足以识别单个碱基错配的有力技术，但是需要时间成本(2～3周)、昂贵的仪器以及熟练的实验技能。近年来提出的聚合酶链式反应(PCR)，是一种非常灵敏的单个碱基错配检测技术，但需要酶反应和对靶标进行放大，增加了实验复杂性及成本，这些限制了其实际应用。其他基于杂交的比色、荧光和电化学方法对单个碱基错配的响应都非常灵敏，但存在特异性相对较低、假阳性率相对较高、需要繁琐的标记程序和化学修饰等缺点。
综上所述，现有技术存在的问题是：
操作复杂、耗时及需要贵重的仪器、假阳性高，特别是只有唯一的特征信号，无法实现同时区分。
解决上述技术问题的难度和意义：
完全互补和单碱基错配序列差异非常小，要实现在一次实验中同时区分单个碱基错配序列，就要求发展多个特征信号的检测策略。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种单分子水平同时区分单碱基错配的方法。
本发明是这样实现的，单分子水平同时区分单个碱基错配的方法，所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括：结合纳米孔电化学技术确定非标记的共臂型改良分子信标，其茎部的“两臂”既参与发夹的形成又参与目标分子的杂化；依据分子信标引起的单个目标分子穿孔行为的特征阻断时间，发展单分子策略同时区分完全互补和单碱基错配的序列。
进一步，所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括以下步骤：
步骤一，结合纳米孔电化学技术，确定非标记的共臂型改良分子信标：纳米孔电化学技术依据分析物穿过纳米孔的特征电流阻断信号而对分析物的结构特征进行分析，无需对探针或目标分子进行标记或化学修饰，且能发展多个特征信号的检测策略；设计茎部长度为3个碱基对的分子信标，其茎部的“两臂”既参与发夹的形成又参与目标分子的杂化，这种共臂型分子信标能提高分子信标与目标分子的杂化亲和性，从而提高其杂化信背比及杂化速率；在3'末端增加9个寡聚核苷酸链引导分子信标的穿孔并增加穿孔事件的频率；
步骤二，分子信标加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号；电压驱动下分子信标穿过纳米孔，产生阻断时间极短(～1.5ms)的电流阻断信号；
步骤三，将完全互补和单碱基错配的序列同时加入含有共臂分子信标的溶液中混合杂化后加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号；
步骤四，在电压驱动下穿过纳米孔时产生阻断时间相差约6倍的两种明显延长的电流阻断信号，其中，阻断时间较长的(～15s)对应于完全互补的双链体；阻断时间较短的(～2.5s)对应于含单碱基错配的双链体。
本发明的目的在于提供一种由所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法得到的非标记的共臂型改良分子信标，所述非标记的共臂型改良分子信标在识别靶序列时信背比约为104。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法的疾病诊断系统。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明结合纳米孔电化学技术，设计了一种非标记的共臂型改良分子信标。与常规的分子信标相比，该分子信标无需繁琐的标记和化学修饰，且在识别目标分子时表现出较高的信背比(～104)，较高的热力学稳定性以及较快的杂化速率。与其他只有唯一特征信号的技术如荧光相比，纳米孔电化学技术发展了多个特征信号的检测策略，基于一次实验中完全互补和单碱基错配序列纳米孔电信号阻断时间的差异，实现在单分子水平同时区分完全互补和单碱基错配的序列。本发明操作简单、省时节力、成本低廉，发展的单碱基错配同时识别策略在快速检测、精准识别、以及早期临床诊断等领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的单分子水平同时区分单碱基错配的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的单分子水平同时区分单碱基错配原理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的单分子水平同时区分单碱基错配的方法，包括以下步骤：
S101：结合纳米孔电化学技术，设计了一种非标记的共臂型改良分子信标；
S102：依据分子信标引起的单个目标分子穿孔行为的特征阻断时间，发展单分子策略同时区分完全互补和单碱基错配的序列。
本发明结合纳米孔电化学技术，设计了一种非标记的共臂型改良分子信标，其“两臂”既参与茎部的形成又参与目标分子的杂化。将单独的分子信标加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号。在电压驱动下分子信标穿过纳米孔，产生阻断时间极短的电流阻断信号。再将完全互补和单碱基错配的序列同时加入含有共臂分子信标的溶液中混合杂化后加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号。在电压驱动下穿过纳米孔时产生阻断时间明显延长的两种不同阻断信号，阻断时间较长的对应于完全互补的双链体；阻断时间较短的对应于含单碱基错配的双链体。基于纳米孔电信号阻断时间的差异，实现完全互补和单碱基错配序列在一次实验中的同时区分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种单分子水平同时区分单个碱基错配的方法，其特征在于，所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括：结合纳米孔电化学技术确定非标记的共臂型分子信标；依据分子信标引起的单个目标分子穿孔行为的特征阻断时间，发展单分子策略同时区分完全互补和单碱基错配的序列；
所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法包括以下步骤：
步骤一，结合纳米孔电化学技术，确定非标记的共臂型分子信标；设计茎部长度为3个碱基对的分子信标，其茎部的两臂既参与发夹的形成又参与目标分子的杂化；在3'末端增加9个寡聚核苷酸链引导分子信标的穿孔并增加穿孔事件的频率；
步骤二，分子信标加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号；电压驱动下分子信标穿过纳米孔，产生阻断时间极短的电流阻断信号；
步骤三，将完全互补和单碱基错配的序列同时加入含有共臂分子信标的溶液中混合杂化后加入纳米孔cis端溶液中，记录单通道电流信号；
步骤四，在电压驱动下穿过纳米孔时产生阻断时间明显延长的两种不同阻断信号，阻断时间相对较长，对应于完全互补的双链体；阻断时间相对较短，对应于含单碱基错配的双链体；
所述单分子水平同时区分单个碱基错配的方法得到的非标记的共臂型分子信标在识别靶序列时信背比～104。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2003089666A2 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 University Of Saskatchewan Technologies Inc. Methods and apparatus for molecular data storage, retrieval and analysis
CN102630304A (zh) * 2009-09-18 2012-08-08 哈佛大学校长及研究员协会 可实现高灵敏度分子检测和分析的具有纳米孔的裸露的单层石墨烯膜

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