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PROCEDE DE PRODUCTION DE PREPARATIONS CRISTALLISEES A BASE D'INSULINE.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de production de préparations cristallisées à base d'insuline.
Dans le brevet belge n 502332 du 3 avril 1951 au non de la demanderesse,pour "Procédé de production de préparations cristallisées à base d'insuline", il est décrit un procédé de production de préparations cristallisées à base d'insuline qui est caractérisé par la conduite de la cristallisation de l'hormone en présente de composés appartenant à la série de l'acridine et à celle de la quinoléine et dont les bases sont insolubles ou ne donnent que des solutions colloïdales à des pH compris 6,5 et 9. Les cristaux ainsi obtenus, qui représentent des composés d'insuline contenant des quantités variables des bases respectives, se prêtent excellemment à la production de préparations à base d'insuline à action fortement ralentie.
En poursuivant les recherches sur ce domaine, la demanderesse a trouvé un procédé nouveau et particulièrement simple pour obtenir ces composés d'insuline cristallisés. Il s'est révélé, chose surprenante, qu'on pouvait préparer, à partir des cristaux d'insuline ordinaires, sans changement de la grandeur ou de la forme des cristaux, des composés de l'insuline et des bases citées, en agitant ces cristaux avec ces bases en solution aqueuse à réaction à peu près neutre et en veillant, par addition, d'alcali, à ce que la valeur du pH reste inchangée.
Dame ces conditions, les bases sant quantitativement absorbées par les cristaux en quelques heures et l'on obtient des produits à action aussi fortement ralentie que celle des cristaux préparés d'après la demande de brevet mentionnée ci-dessus et qu'on peut employer de la même manière pour la production de préparations-dépôts.
Le nouveau procédé offre plusieurs avantages D'une part, il est possible d'utiliser dorénavant, pour l'obtention des produits nouveaux, des cristaux d'une grandeur uniforme, qu'on obtient en quantité abondante au cours de la production de 1-'insuline, et de garantir,;par conséquent,
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la régularité de fabrication des produitso D'autre part, on obtient, des produits finals qui, de prime abord, sont exempts de particules amorphes.
Ainsi, on peut renoncer à un traitement ultérieur par sédimentation fractionnée ou quand on a opéré, dès le début, dans des conditions stériles, oh peut même renoncer à l'isolement des cristaux, de sorte qu'on peut directement préparer des suspensions prêtes à l'usage.
En outre, la demanderesse a trouvé qu'on pouvait obtenir des produits exerçant une action ralentie similaire en utilisant, à la place des dérivés d'acridine ou de quinoléine décrits, des protéines basiques ou leurs produits de dégradation, telles que la globuline, les histones, les protamines et leurs produits de dégradation.
On effectue la réaction dans les mêmes conditions que lors de l'utilisation des dérivés d'acridine ou de quinoléine. Les protéines sont absorbées par les'cristaux d'insuline aussi complètement que les acridines et les quinoléines.
Le nouveau procédé est illustré par les exemples suivants : EXEMPLE I:
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On dissout 40 mg de chlorhydrate de bis-(2-méthyl-4-amino-qui- noléyl-6)-carbamide dans 500 cm3 d'eau et l'on porte le pH à 7,2 avec 0,7cm3 de solution de soude caustique décinormale. Dans cette solution, on introduit, en agitant, 1 g d'insuline cristallisée et, en continuant l'agitation et en ajoutant de la solution de soude caustique décinormale, on maintient le pH à 7,2. Après 24 heures d'agitation, 1,95 cm3 de la lessive de soude
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caustique décinormale a été consommé et toute la bis-(2 méthyl-4-amino-qui- noléyl-6)-carbamide a été absorbée par lescristaux d'insuline.
On sépare les cristaux dans la centrifugeuse, on lave deux fois à l'eau et on sèche à l'éther et à l'acétoneo On obtient 0,97 g de cristaux
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d'insuline renfermant 4% de b,is-(2-méthyl-4-amino-quinoléyl-6)-carbamide (calculés sur le chlorhydrate).
EXEMPLE 2 :
On dissout 5 g d'insuline dans 225 cm3 d'eau et dans 25 cm3 d'acide acétique glacial, on passe la solution à travers un filtre de stérilisation, on complète jusqu'à 1,3 litre et l'on ajoute 150 cm3 d'acétone et 160 cm3 de solution de chlorure de zinc à 0,5%, En suite, on porte le pH à 5,5 avec de l'ammoniaque en maintenant des conditions stériles, après quoi on obtient, tout en agitant et en peu de temps, des cristaux d'insuline uniformes dont les arêtes ont une longueur de 1/200 mm.
On sépare les cristaux d'insuline dans la centrifugeuse, on lave à l'eau et on agite le tout dans uns solution neutralisée de 0,3 de chlo- rhydrate de bis-(2-méthyl-4-amino-quinoléyl-6)-carbamide dans 2,5 litres d'eau renfermant 0,5 % d'alcool trichloro-butylique tertiaire. On effectue le traitement ultérieur de la manière indiquée dans l'exemple 1, en observant des conditions stériles. Au bout de 24 heures, on ajoute de la solution de chlorure de sodium en quantité telle qu'on obtienne une suspension de 1,7 mg d'insuline par cm3 dans une solution isotonique de chlorure de sodium, solution dont on remplit, en agitant, des flacons de 10 c3. On obtient ainsi une préparation d'insuline-dépôt ayant un titre de 40 unités par cm3.
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EXEJJPLE 3 : à 750 mg de chlorhydrate de bis-(2-méthyl-4-amino-quinoléyl-6)- carbamide, on ajoute de l'eau bidistillée stérile jusqu'à un volume de 750 cm3 et on porte le pH à 5,6 avec de la solution de soude caustique centinormale. Ensuite, on agite 10 g de cristaux d'insuline avec de l'eau bidistillée stérile et on les ajoute conjointement avec 500 cm3 d'eau au total à la solution mentionnée ci-dessus. En 4 heures, on porte le pH du mélange réactionnelà 7,2, en versant, peuà peu et tout en agitant, de la solution de soude caustique centinormale, qu'on introduit à travers un entonnoir compte-gouttes. On continue à agiter pendant 2 heurta, sans que le pH chane.
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On sépare dans la centrigeuse les cristaux obtenus, on lave deux fois à l'eau bidistillée stérile et on sèche à l'acétone et à l'éther, On obtient, avec un rendement pratiquement quantitatif, des cristaux inchangés du point de vue morphologique et présentant une teneur de 6,3% de bis-(2-
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méthyl-4-amino-quinoléyl-6)-aarbamide (calculs sur le chlorhydrate)
EXEMPLE 4 : On dissout 8 mg de sulfate de protamine dans de )?eau, on porte à un pH de 7,2 à l'aide de solution de soude caustique et on complète à 40 cm3.
Dans cette solution, on introdùit 80 mg d'insuline cristallisée et l'on agite pendant 24 heures, en maintenant le pH à 7,2 par addition de solution de sou- de caustique décinormale. Au bout de cette période, on ne trouve plus de protamine dans les eaux-mères. On sépare les cristaux dans la centrifugeuse, on lave à l'eau et L'on sèche. On obtient ainsi un produit qui, injecté en suspension aqueuse, présente une action forcément ralentie.
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PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CRYSTALLIZED INSULIN-BASED PREPARATIONS.
The present invention relates to a new process for the production of crystalline preparations based on insulin.
In Belgian Patent No. 502332 of April 3, 1951 in the name of the Applicant, for "Process for the production of crystallized preparations based on insulin", a process for the production of crystallized preparations based on insulin is described which is characterized by the conduct of the crystallization of the hormone presents compounds belonging to the acridine series and to that of quinoline and the bases of which are insoluble or give only colloidal solutions at pH between 6.5 and 9. The crystals thus obtained, which represent insulin compounds containing varying amounts of the respective bases, lend themselves excellently to the production of greatly slowed-acting insulin preparations.
By continuing research in this field, the Applicant has found a new and particularly simple process for obtaining these crystallized insulin compounds. It turned out, surprisingly, that one could prepare, from ordinary insulin crystals, without changing the size or shape of the crystals, the compounds of the insulin and the bases mentioned, by shaking these crystals with these bases in aqueous solution reacting almost neutral and ensuring, by addition, alkali, that the pH value remains unchanged.
Under these conditions, the bases are quantitatively absorbed by the crystals in a few hours and one obtains products with an action as strongly slowed down as that of the crystals prepared according to the patent application mentioned above and which can be used from the same way for the production of deposit preparations.
The new process offers several advantages On the one hand, it is henceforth possible to use, for obtaining new products, crystals of a uniform size, which are obtained in abundant quantities during the production of 1- 'insulin, and to guarantee,; therefore,
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the regularity of manufacture of the products o On the other hand, end products are obtained which, at first glance, are free of amorphous particles.
Thus, one can forgo further treatment by fractional sedimentation or when one has operated, from the start, under sterile conditions, or can even forgo the isolation of crystals, so that one can directly prepare ready-to-use suspensions. use.
In addition, the Applicant has found that it is possible to obtain products exerting a similar slowed-down action by using, instead of the acridine or quinoline derivatives described, basic proteins or their degradation products, such as globulin, histones, protamines and their degradation products.
The reaction is carried out under the same conditions as when using the acridine or quinoline derivatives. Proteins are taken up by insulin crystals as completely as acridins and quinolines.
The new process is illustrated by the following examples: EXAMPLE I:
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40 mg of bis- (2-methyl-4-amino-qui-noléyl-6) -carbamide hydrochloride is dissolved in 500 cm3 of water and the pH is brought to 7.2 with 0.7 cm3 of solution of decinormal caustic soda. Into this solution is introduced, with stirring, 1 g of crystallized insulin and, by continuing to stir and adding decinormal caustic soda solution, the pH is maintained at 7.2. After 24 hours of stirring, 1.95 cm3 of the sodium hydroxide solution
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The decinormal caustic was consumed and all of the bis- (2-methyl-4-amino-qui-noleyl-6) -carbamide was taken up by the insulin crystals.
The crystals are separated in the centrifuge, washed twice with water and dried with ether and acetone. 0.97 g of crystals are obtained.
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insulin containing 4% b, is- (2-methyl-4-amino-quinolyl-6) -carbamide (calculated on the hydrochloride).
EXAMPLE 2:
5 g of insulin are dissolved in 225 cm3 of water and in 25 cm3 of glacial acetic acid, the solution is passed through a sterilization filter, made up to 1.3 liters and 150 cm3 is added. of acetone and 160 cm3 of 0.5% zinc chloride solution, Subsequently, the pH is brought to 5.5 with ammonia maintaining sterile conditions, after which one obtains, while stirring and shortly, uniform insulin crystals, the ridges of which are 1/200 mm long.
The insulin crystals are separated in the centrifuge, washed with water and stirred in a neutralized solution of 0.3 bis- (2-methyl-4-amino-quinoline-6) hydrochloride. -carbamide in 2.5 liters of water containing 0.5% tertiary trichlorobutyl alcohol. Further processing is carried out as in Example 1, under sterile conditions. After 24 hours, sodium chloride solution is added in an amount such that a suspension of 1.7 mg of insulin per cm3 is obtained in an isotonic solution of sodium chloride, solution which is filled, while stirring , vials of 10 c3. A depot insulin preparation is thus obtained having a titre of 40 units per cm3.
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EXAMPLE 3: to 750 mg of bis- (2-methyl-4-amino-quinolinyl-6) -carbamide hydrochloride, sterile double-distilled water is added to a volume of 750 cm3 and the pH is brought to 5 , 6 with centinormal caustic soda solution. Then, 10 g of insulin crystals were stirred with sterile double-distilled water and added together with 500 cm3 of water in total to the solution mentioned above. Over 4 hours, the pH of the reaction mixture is brought to 7.2, by pouring in, little by little and while stirring, the solution of centinormal caustic soda, which is introduced through a dropping funnel. Stirring is continued for 2 clashes, without the pH chain.
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The crystals obtained are separated in the centrigator, washed twice with sterile double-distilled water and dried with acetone and ether. In practically quantitative yield, crystals which are unchanged from the point of view of the morphology and having a content of 6.3% bis- (2-
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4-methyl-amino-quinolyl-6) -aarbamide (hydrochloride stones)
EXAMPLE 4 8 mg of protamine sulfate are dissolved in water, brought to a pH of 7.2 using caustic soda solution and made up to 40 cm3.
Into this solution is introduced 80 mg of crystallized insulin and stirred for 24 hours, maintaining the pH at 7.2 by adding decinormal sodium hydroxide solution. At the end of this period, there is no longer any protamine in the mother liquors. The crystals are separated in the centrifuge, washed with water and dried. A product is thus obtained which, injected in aqueous suspension, has an inevitably slowed down action.