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PROCEDE DE PRODUCTION DE PREPARATIONS CRISTALLISEES A BASE D9INSULINE.
La présente invention a pour objet un procédé de production de nouvelles préparations cristallisées précieuses qui s'obtiennent à partir de l'hormone hypoglycémiante du pancréas.
Dans le brevet allemand n 727 888 est décrit un procédé de pré-- paration de substances à action ralentie,, qui s'obtiennent à partir de 1' hormone hypoglycémiante du pancréas (insuline) procédé qui consiste à faire réagir l'hormone avec des composés de la série de la quinoléine et de celle
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de l'acridineg dont les bases sont, pour des pH compris entre 6a5 et 9, insolubles dans Peau ou n2y donnent que des solutions colloidaless et à porter les solutions le cas échéante à un pH de 65 à à A Quand,, en opérant selon la méthode décrite dans ce breveta on
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établit dans la solution un pH compris entre 6s5 et 7 il se forme une sus- pension amorphe., finement répartie qui.!)
pendant 39emmagasinsgea peut avoir tendance à se rassembler et qu'on ne peut répartir à nouveau d'une façon régulière qu'avec une grande difficultés par agitation. En portant la solu- tion à un pH d'environ 3,5 on réussit à obtenir des solutions limpides qui
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possèdent également une action ralentie et qui jusqu'ici, ont donné d9ec cellents résultats cliniques.
Suivant le procédé qui fait l'objet de la présente invention,
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on fait réagir l'insuline avec des composés des séries de l'acridine et de la quinoléine, dont les bases sont.!) pour des pH compris entre 65 et 9a in- solubles dans l'eau on n8 donnent que des solutions colloîdalesp et en faisant cristalliser les produits de réaction de la manière usuelle pour l'insuline,,,
On connaît déjà plusieurs méthodes de préparation de 1?insuline
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cristallisée pure (voir BomskovD Methodik der Hormonforschung vol. 1/ 19J7, page 676.et suivb).
A cet égards est très remarquable le procédé Scott et Gerlotagh Bates9 d'après lequel on peut obtenir %bhnaà3ri±é". ;'\-1:¯::'
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cristallisée à l'aide de l'acétone ou de 1-lalcool propylique par adjonc- tion d'un tampon de phosphate et en présence de petites quantités de zinc, de cobalt.? de nickel ou de cadmium.
Il est extrêmement surprenant que les produits obtenus par la réaction de l'insuline avec les composés en question des séries de l'acri- dine et de la quinoléine se laissent amener à l'état cristallin de la mê- me manière que l'insuline pure elle-mêmeOn peut, par exemple, commencer par ajouter à une solution acide d'hormone des tampons appropriés, tels que des phosphates ou des acétates, après quoi on ajoute de petites quantités de sels de zinc$ de cadmium.) de cobalt ou de nickel, ainsi que des sissolvants organiques solubles dans l'eau, par exemple des alcools ou des cétones et, après ceux-ci, les solutions des composés d'acridine ou de quinoléine pour établir,
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enfin, dans la solution un pH compris entre 5 et 6,959 de préférence, de 6 en- viron.
Le précipité qui d'abord est amorphe, se transforme, abondonné à lui- même, mais encore mieux et plus uniformément par agitation, en de beaux cris- taux bien formés qu'on peut débarrasser,par sédimentation fractionnée,, de petites portions amorphes.!) pour les isoler ensuite. Par variation de la quan- tité du sel métallique et des composés de quinoléine et d'acridine on est à même d'influer, entre les limites relativement écartées sur la teneur des cristaux en ces substances.
Il s'est révélé que les cristaux ainsi obtenus se prêtent excel- lemment à la préparation de remèdes hormonaux à action ralentie, quand on les emploie sous la forme d'une suspension auqueuse. A l'encontre des solutions
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de 10hormone,, ces suspensions ne perdent., pendant l'emmagasinagea rien de leur activité quand elles sont neutres.Grâce à leur structure cristalline, elles n'ont pas tendance à la coagulations leur dosage est exact et simple et elles sont tolérées sans produire la moindre irritation.
Selon la teneur en métaux et en composés d'acridine ou de quinolé- ine, on obtient des préparations d'une activité plus ou moins -prolongée, de sorte qu'il est possible de satisfaire aux diverses exigences cliniques no- tamment dans des cas de diabète très graves, de sorte qu'on réussit à main- tenir,, par une seule injection,, 1?équilibre métabolique complet pour 24 heu- res.
De plus il s'est révélé qu'en utilisant ces préparations cris- talliséesa on n'avait besoin que d'une fraction de la teneur en composés d' acridine ou de quinoléine pour parvenir à la même action ralentie qu'avec les préparations connues.
EXEMPLE 1
On dissout 800 mg d'insulfine pure dans de l'eau, par addition de peu d'acide chlorhydrique, et l'on complète à 200 cm3. On y ajoute une so-
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lution de 36 mg de chlorhydrate de bis méthyl,.maminomquinoléyl=6=carbam:i.de dans 20 cm3 d'eau, ainsi que 2 em3 d'une solution de chlorure de zinc à 05 %, pour précipiter ensuite le complexe d'insuline, en ajoutant une solution de 2a7 g de phosphate monopotas5ique9 portée à l'aide de lessive de soude causti- que à un pH de 6,5 et complétée avec de l'eau à 220 cm3o On y ajoute tout de suite 50 cm3 d'alcool isopropylique et l'on porte ensuite la solution à un pH de 6 à 6,1 par adjonction d'acide chlorhydrique deux fois normalo On agite
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lentement à la tempéra:Í:
il1re ambiante jusqu'à, ce que le précipité se compose presque exclusivement de cristauxo On sépare les cristaux par centrifugationg on les débarrasse dans la centrifugeuse par sédimentation fractionnée de pe- tites portions amorphes et on les sèche avec de l'acétone et de 1-'éther.
On obtient environ 700 mg de cristaux uniformes contenant 2,5%
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de bisnéthyhL,.mam.noquinoléylm6arbamide Si,, au lieu de 36 mg de elorby- drate de bis méthyl,mam.i.noquixaoléyl6Cax bam3.de on ajoute 72 mg 'de ce composé on obtient des cristaux contenant,4,,5% de bis=2¯méthyl-4-aminoqui- noléyl=6-carbamide
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EXEMPLE 2 :
On dissout 5 g d'insuline dans de l'eau à 1?aide d'acide chlor-
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4tae et l'on complète à 950 eu3. On y ajoute une solution de 150 mg de chlorhydrate de bisc02=méthyl=4=aminoquinoléyl=6=cbamide dans 50 cm3 d9eau.
On ajoute 1 litre de tampon de phosphate contenant 169 g de phos- phate bisodique et 2,8 g de phosphate monopotassique et préalablement acidulé avec 80 cm3 d'acide chlorhydrique normal. On ajoute ensuite 20 cm3 de solu- tion de chlorure de zinc à 0,5 % et 200 cm3 d'acétone et l'on porte avec de
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lemmoniaque à un pH de 5e8 environ. Abandonné à lui-mêmes le précipité qui, au début est amorphese tranforme en cristaux, que l'on soumet au traitement ultérieur décrit dans l'exemple la
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On obtient un produit contenant 1>5 $ de bis=méthyla.4=aminoqui= noléyl-6 arbemideo Quand on utilise 300 mg de chlorhydrate de bis-2-méthyl- lmaminoquinoléyl6carbamide on parvient à un produit final cristallisé contenant environ z de bis-2-méthyl-4-aminoquinoléyl-6-carbamide.
On obtient un produit d'insuline cristallisé ayant la même teneur en bis4-méthfl-4oo anàno-qpinoléyloo6-carbauide> quand, à la place de la solution de chlorée de zinc à 095%, on prend une solution de chlorure de cobalt à 1%,1) en appli- quant des conditions identiques pour le reste.
EXEMPLE 3
On dissout 10 g d'insuline dans de l'eau à 1-laide d'acide chlorhy- drique et l'on complète à 1,1 litre...il. cette solution on ajoute 1,2 litre de tampon de phosphate préalablement acidifié avec 96 cm3 d'acide chlorhydri- que normal ainsi que 24 cm3 de solution de chlorure de zincà 0,5% et 240
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cm3 d9acétone on ajoute.\! enfin> une solution de 860 mg de chlorhydrate de bis méthylam.noqu.noléylm6arbamide dans 100 cm3 d'eau. On porte alors avec de l'ammoniaque à un pH de 6,3 et l'on procède au traitement ultérieur décrit dans l'exemple 1.
On obtient ainsi ¯,5 g de cristaux contenant 3 % environ de bis- 2-méthyl-4-aminoquinoléyl-6-carbamide. o EXEMPLE 4 :
On dissout 1,25 g d'insuline pure dans de l'eau avec adjonction de
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2p5 cm3 d'acide chlorhydrique normal et l'on complète à 125 cm3* On y ajoute un mélange composé de 150 cm3 de tampon de phosphate 12 cm3 diacide chlorhy
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drique normale 3 cm3 de solution de chlorure de zinc à 0 5 et 30 cm3 d9acé- tone. On ajoute ensuite 54 mg de lactate de éthoxym6a9mdiam.noaer.d.ne dissous dans 15 cm3 deeauo On porte la solution limpide à 1-'aide d'ammoniaque à un pH d'environ 6D8 pour l9abandoniaer ensuite à elle-même pendant trente minutes.
On amène le pH à 6,1 avec de l'acide chlorhydrique normal et l'on agite lentement à la température ambiante., jusqu'à ce que le précipité se soit transformé presque complètement en de petits cristaux arrondis. On centrifuge et on procède au traitement ultérieur décrit dans l'exemple le On obtient 1 g de cristaux de couleur jaune-citron intense qui, injectés en suspension aqueu- se.!) possèdent, en comparaison avec l'insuline cristallisée normale., une action considérablement ralentie.
EXEMPLE 5
On dissout 1,25 g d'insuline cristallisée selon la méthode décrite dans 1?exemple 4 et l'on ajoute ensuite les substances mentionnées dans
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cet exemple. Cependant au lieu de lactate de éthoxy 6a9md.3.amâ.nomacridine on ajoute une solution de 95 mg de chlorure de 3<6-diamino-iooométhyiaeridi- num dans 15 cm3 d'eauo On porte le pH de la solution à environ 6s98 on 19a- bandonne à elle-même pendant 15 minutes environ et l'on porte le pH à 6,2 environ avec de l'acide chlorhydrique.Le traitement ultérieur se fait selon les indications de l'exemple 4. On obtient 1,23 g de petits cristaux bien formés, de couleur jaune d'or brillant.
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EXEMPLE 6
On dissout 1,25 g d'insuline cristallisée selon la méthode décrite dans l'exemple 4 et on effectue les additions usuelles pour la cristallisa- tiono On ajoute, de plus 120 mg d'acétone de 2 - ss - diéthylamino-éthoxy- 6-acétamido-9-amino-acridine, dissoute dans un peu d'eau, et l'on porte avec de l'ammoniaque à un pH d'environ 6,3. Les cristaux obtenus sont soumis au traitement ultérieur usuel. On obtient 0,8 g de cristaux aciculaires de cou- leur citron qui excellent par une action particulièrement ralentie EXEMPLE 7 :
On dissout,, selon la méthode décrite dans l'exemple 4,1,25 g d'insuline cristallisée après addition de 108 mg de chlorhydrate de la diami- de N.N'-di-(2-méthyl-4-amino-quinoléyl-6)-adipique dans un peu d'eau et on fait cristalliser le produit de réaction obtenu.
On recueille 1,21 g de cu- bes arrondis qui contiennent 2% de la base.
EXEMPLE 8
On recristalliseg selon la méthode décrite dans l'exemple 7, 1,,25 g d'insuline cristallisée mais après addition de 100 mg de dichlorhydrate de la diamide N.N.'- di-(2-méthyl-4-aminoquinoléyl-6)-cyanurique. On obtient 1915 g de cubes arrondis contenant 2,6% de la base et possédant une action ralentie nettement augmentée.
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PROCESS FOR THE PRODUCTION OF INSULIN-BASED CRYSTALLIZED PREPARATIONS.
The present invention relates to a process for the production of new valuable crystalline preparations which are obtained from the hypoglycemic hormone of the pancreas.
German Patent No. 727 888 describes a process for the preparation of slow-acting substances which are obtained from the hypoglycaemic hormone of the pancreas (insulin), which consists of reacting the hormone with substances. compounds of the quinoline series and that
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acridineg whose bases are, for pH between 6a5 and 9, insoluble in water or n2y give only colloidal solutions and to bring the solutions, if necessary, to a pH of 65 to at A When ,, by operating according to the method described in this patent
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establishes a pH between 6s5 and 7 in the solution, an amorphous, finely distributed suspension forms which.!)
during storage, a tendency to congregate and which can only be distributed evenly again with great difficulty by shaking. By bringing the solution to a pH of about 3.5, it is possible to obtain clear solutions which
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also have a slowed-down action and which so far have given decent clinical results.
According to the method which is the subject of the present invention,
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insulin is reacted with compounds of the acridine and quinoline series, the bases of which are.!) for pH between 65 and 9a insoluble in water, only colloidal solutions are given and by crystallizing the reaction products in the usual manner for insulin ,,,
Several methods of preparing insulin are already known.
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pure crystallized (see BomskovD Methodik der Hormonforschung vol. 1/19J7, page 676. et seq.).
In this respect, the Scott and Gerlotagh Bates9 method is very remarkable, according to which we can obtain% bhnaà3ri ± é ".; '\ - 1: ¯ ::'
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crystallized with acetone or 1-propyl alcohol by addition of phosphate buffer and in the presence of small amounts of zinc, cobalt. nickel or cadmium.
It is extremely surprising that the products obtained by the reaction of insulin with the compounds in question of the acridine and quinoline series can be brought to the crystalline state in the same way as insulin. pure itself One can, for example, start by adding to an acidic hormone solution suitable buffers, such as phosphates or acetates, after which small amounts of zinc salts (cadmium)) of cobalt or of nickel, as well as organic solvents soluble in water, for example alcohols or ketones and, after these, solutions of acridine or quinoline compounds to establish,
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finally, in the solution, a pH of between 5 and 6.959, preferably of about 6.
The precipitate, which at first is amorphous, is transformed, left to itself, but still better and more uniformly by agitation, into beautiful well-formed crystals which can be freed, by fractional sedimentation, from small amorphous portions. .!) to isolate them afterwards. By varying the amount of the metal salt and of the quinoline and acridine compounds it is possible to influence, between the relatively wide limits, the content of the crystals in these substances.
It has been found that the crystals thus obtained lend themselves excellently to the preparation of slow-acting hormonal remedies when used in the form of an aqueous suspension. Against the solutions
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of 10hormone, these suspensions lose nothing of their activity during storage when they are neutral. Thanks to their crystalline structure, they do not tend to coagulate their dosage is exact and simple and they are tolerated without producing the slightest irritation.
Depending on the content of metals and acridine or quinoline compounds, preparations are obtained with a more or less prolonged activity, so that it is possible to satisfy various clinical requirements, especially in cases with very severe diabetes, so that complete metabolic balance for 24 hours can be maintained with a single injection.
In addition, it has been found that using these crystallized preparations only a fraction of the content of acridine or quinoline compounds is required to achieve the same slowed action as with known preparations. .
EXAMPLE 1
800 mg of pure insulfine are dissolved in water by adding a little hydrochloric acid, and the mixture is made up to 200 cm3. We add a so-
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lution of 36 mg of bis methyl hydrochloride, .maminomquinolyl = 6 = carbam: i.de in 20 cm3 of water, as well as 2 em3 of a solution of zinc chloride at 05%, to then precipitate the complex of insulin, by adding a solution of 2a7 g of monopotas5ique9 phosphate brought to the aid of caustic soda lye to a pH of 6.5 and made up with water at 220 cm3o. 50 cm3 of water are immediately added to it. 'isopropyl alcohol and the solution is then brought to a pH of 6 to 6.1 by adding twice normal hydrochloric acid.
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slowly at room temperature: Í:
At room temperature until the precipitate consists almost exclusively of crystals The crystals are separated by centrifugation, freed in the centrifuge by fractional sedimentation of small amorphous portions and dried with acetone and 1- 'ether.
About 700 mg of uniform crystals are obtained containing 2.5%
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of bisnethyhL, .mam.noquinoléylm6arbamide Si ,, instead of 36 mg of bis-methyl elorbidrate, mam.i.noquixaoléyl6Cax bam3. 72 mg of this compound are added to give crystals containing, 4.5% de bis = 2¯methyl-4-aminoquinolyl = 6-carbamide
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EXAMPLE 2:
5 g of insulin are dissolved in water with chlorine acid.
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4tae and one completes to 950 eu3. To this is added a solution of 150 mg of bisc02 hydrochloride = methyl = 4 = aminoquinolyl = 6 = cbamide in 50 cm3 of water.
1 liter of phosphate buffer containing 169 g of bisodium phosphate and 2.8 g of monopotassium phosphate and previously acidulated with 80 cm3 of normal hydrochloric acid is added. Then 20 cm3 of 0.5% zinc chloride solution and 200 cm3 of acetone are added and the mixture is made up with
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lemmonia at a pH of about 5e8. Left to itself the precipitate which, at the beginning is amorphous, transforms into crystals, which are subjected to the subsequent treatment described in Example 1
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A product containing 1> 5 $ of bis = methyla. 4 = aminoqui = 6-noléyl arbemideo is obtained. When 300 mg of bis-2-methyl-lmaminoquinoléyl6carbamide hydrochloride is used, a crystallized final product is obtained containing approximately z of bis- 2-methyl-4-aminoquinolyl-6-carbamide.
A crystallized insulin product is obtained with the same content of bis4-methfl-4oo anano-qpinoléyloo6-carbauide> when, instead of the 095% chlorine solution of zinc, a 1-to-1 solution of cobalt chloride is taken. %, 1) applying identical conditions for the rest.
EXAMPLE 3
10 g of insulin are dissolved in water containing 1-hydrochloric acid and made up to 1.1 liters ... il. to this solution are added 1.2 liters of phosphate buffer previously acidified with 96 cm3 of normal hydrochloric acid as well as 24 cm3 of 0.5% zinc chloride solution and 240
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cm3 of acetone is added. \! finally> a solution of 860 mg of bis methylam.noqu.noléylm6arbamide hydrochloride in 100 cm3 of water. The mixture is then brought to a pH of 6.3 with ammonia and the subsequent treatment described in Example 1 is carried out.
This gives ¯, 5 g of crystals containing about 3% of bis-2-methyl-4-aminoquinolyl-6-carbamide. o EXAMPLE 4:
1.25 g of pure insulin are dissolved in water with the addition of
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2p5 cm3 of normal hydrochloric acid and made up to 125 cm3 * A mixture composed of 150 cm3 of phosphate buffer 12 cm3 of hydrochloric acid is added.
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normal drique 3 cm3 of zinc chloride solution at 0 5 and 30 cm3 of acetone. Then 54 mg of ethoxym6a9mdiam.noaer.d.ne lactate dissolved in 15 cm3 of water are added. The clear ammonia solution is brought to a pH of about 6D8 and then abandoned to itself for thirty minutes .
The pH is brought to 6.1 with normal hydrochloric acid and stirred slowly at room temperature, until the precipitate has transformed almost completely into small rounded crystals. The mixture is centrifuged and the subsequent treatment described in Example 1c is obtained. 1 g of crystals of intense lemon-yellow color are obtained which, when injected in aqueous suspension.!) Have, in comparison with normal crystallized insulin, a action considerably slowed down.
EXAMPLE 5
1.25 g of crystallized insulin are dissolved according to the method described in Example 4 and the substances mentioned in
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this example. However, instead of ethoxy lactate 6a9md.3.amâ.nomacridine, a solution of 95 mg of 3 <6-diamino-iooométhyiaeridin chloride in 15 cm3 of water is added to the pH of the solution to approximately 6s98 on 19a- bandonne to itself for about 15 minutes and the pH is brought to about 6.2 with hydrochloric acid. The subsequent treatment is carried out according to the indications of Example 4. One obtains 1.23 g small, well-formed crystals of a brilliant golden yellow color.
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EXAMPLE 6
1.25 g of crystallized insulin are dissolved according to the method described in Example 4 and the usual additions for crystallization are carried out. In addition 120 mg of 2 - ss - diethylamino-ethoxy-6 acetone are added. -acetamido-9-amino-acridine, dissolved in a little water, and brought up with ammonia to a pH of about 6.3. The crystals obtained are subjected to the usual subsequent treatment. 0.8 g of acicular crystals of lemon color are obtained which excel by a particularly slowed action. EXAMPLE 7:
Is dissolved ,, according to the method described in Example 4.1.25 g of crystallized insulin after addition of 108 mg of hydrochloride diami- of N.N'-di- (2-methyl-4-amino- quinolyl-6) -adipic in a little water and the resulting reaction product is crystallized.
1.21 g of rounded tubes are collected which contain 2% of the base.
EXAMPLE 8
Recrystallized according to the method described in Example 7, 1,, 25 g of crystallized insulin but after addition of 100 mg of dihydrochloride of the diamide NN'- di- (2-methyl-4-aminoquinolyl-6) -cyanuric . 1915 g of rounded cubes are obtained containing 2.6% of the base and having a markedly increased slowed action.