Procédé de traitement d'un mélange contenant un acide biologiquement actif, en vue de séparer cet acide des impuretés qui l'accompagnent. La présente invention se rapporte à un procédé de traitement. d'un mélange conte- nant un acide biologiquement actif clé for mule
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où R est le reste d'un ainino-acide ou d'un polypeptide, en vue de séparer l'acide biologi- quenient actif des impuretés qui l'accompa gnent et notamment de ptérines de formule autre que la formule ci-dessus.
Parmi ces acides biologiquement actifs, le plus impor tant est l'acide folique, quia une grande va leur thérapeutique grâce à sa propriété d'acti- vei- la formation d'hémoglobine et à son apti tude à combattre l'agranulocytose et d'autres maladies semblables.
lia production synthétique de l'acide foli que naturel a été dernièrement mise au point en faisant. réagir la 2, 4, 5-triamino-6-hydroxy.- pyrimidine, l'acide pai-a-amino-ben7oyl-g-luta- inique et un composé approprié contenant trois atomes de carbone et avant un groupe aldéhyde et/ou un groupe halogène, suscep tible de réagir, tel que spécialement l'aldéhyde alpha-bêta-dibromopropionique.
L'acide folique synthétique ainsi obtenu, dont le nom chimique est acide N-[4- { [ (?- amino-4-hydroxy-6-py rimido- [ 4,5-b ] -pyrazy 1) .
méthyl] - a.niino } - benzoyll - ghitamique, est communément appelé acide ptéroylglut.ami- que [voir Science , <B>103,</B> p. 669 (19.16) ]. D'autres acides étroitement apparentés et pos sédant, à un degré différent.,
une activité bio logique analogue peuvent être préparés au moyen de ce procédé en remplaçant l'acide para-aniino-benzoyl-glutamique par de l'acide para-amino-benzoïque amidé par un autre -acide que l'acide glutamique ou par <B>î</B> ainino un poly peptide de celui-ci, tel que, par exemple, l'acide glutamyl-glutamique.
Les matières premières utilisées dans le procédé de synthèse de l'acide folique et aeides analogues mentionnés ci-dessus peu vent réagir de différentes façons, et i1 fallait clone s'attendre à<B>ce</B> que clé nombreuses réac tions secondaires aient lieu pendant ou après la réaction principale, ce qui a été vé rifié par l'expérience.
Par conséquent,, le produit de la réaction contient une quantité relativement grande de substances indésirables, notamment, outre les matières premières non entrées en réaction, clés produits de condensation et clé polyméri sation, des isomères de position, des produits d'oxydation, de décomposition, d'hydrolyse, etc. Beaucoup -de ces produits, non toujours exactement identifiés, contiennent un noyau de pyramidopyrazine et peuvent. être dési gnés, en général, soirs le nom de ptérines>>.
Or, -ces ptérines formées par des réactions secondaires peuvent être nuisibles au point de vue physiologique, et comme l'acide dé siré est destiné à être employé comme agent thérapeutique, il est évident qu'elles doivent être séparées dudit acide.
Malheureusement, un grand nombre de ptérines qui accompagnent l'acide biologique- ment actif dans le produit. brut obtenu ont certaines propriétés chimiques et physiques identiques à celles de cet acide, et il a été jusqu'ici extrêmement difficile d'éliminer les impuretés sans provoquer des pertes alar mantes en produit actif. On connaît des mé thodes qui permettent d'obtenir l'acide foli que par exemple à 85-9011/o de pureté, à par tir de mélange brut, mais un plus haut de gré de pureté n'a été atteint qu'avec de très grandes pertes en corps actif.
L'invention permet d'éviter -Lui tel incon vénient. Le procédé qui en fait l'objet est ca ractérisé en ce qu'on forme., en présence d'eau, un sel de magnésium de l'acide biologi- quement actif défini ci-dessus, qu'on sépare les produits insolubles, contenant la majeure partie .des impuretés, dudit sel de magnésium, qui est soluble dans l'eau, et régénère finale ment l'acide cherché de son sel de magnésium.
Il a été trouvé qu'en appliquant ce pro cédé, on peut séparer de l'acide folique, d'une pureté presque théorique, .de mélanges con tenant des ptérines et d'autres impuretés que l'on trouve dans le produit brut obtenu en préparant l'acide folique par la voie synthé tique. Ledit procédé de purification est basé sur le fait que les sels de magnésium de l'acide- ptéroyl -glutamique et des acides amino-amidés apparentés ont une solubilité gui diffère à un point-tel de celle des ptérines qui les accompagnent à titre d'impuretés, qu'ils peuvent en être séparés simplement par solution, filtration, précipitation, cristallisa tion, etc.
Quoique le procédé suivant la présente invention se rapporte spécialement à la puri fication des produits qui contiennent 80 à 901/9 d'acide folique en présence d'autres ptérines, il peut être également appliqué à la purification des produits de réaction bruts ne contenant que 10% d'acide folique propre- ment dit.
Pour obtenir de l'acide folique pur à par tir d'im mélange du type spécifié plus haut, on traite de préférence ce mélange avec de l'oxyde de magnésium, bien que d'autres com posés de magnésium, tels que le carbonate, puissent également convenir. On peut. aussi former d'abord un autre sel soluble de l'acide folique et obtenir le folate de magnésium en solution par double décomposition, comme il est exposé dans quelques exemples.
La solution du folate de magnésium est ensuite purifiée par filtration, décantation, centrifugation ou par d'autres moyens; l'acide folique purifié peut alors être obtenu par acidification de la solution, de préférence jusqu'à pn 3 environ; on récupère l'acide folique insoluble cristallisé en filtrant la solu tion. Ce traitement de purification peut être répété jusqu'à ce qu'on obtienne le produit de pureté désirée.
Pour obtenir un acide encore plus pur, on prépare une solution concentrée de folate de magnésium dans l'eau à une température de 75 à 100 C; à cette température, la solu tion est filtrée et le sel de magnésium est ré cupéré par refroidissement de la solution con centrée. Le folate de magnésium peut ensuite être recristallisé dans l'eau jusqu'à ce que le produit soit de la pureté désirée. En acidi fiant la solution finale, on obtient un préci pité cristallin d'acide folique très pur.
Voici quelques exemples de réalisation de la présente invention. Exemple <I>1:</I> 10 g de produii brut, contenant 15,7% en poids d'acide folique proprement dit, le reste consistant en ptérines apparentées et autres produits de réaction non identifiés, sont iné- langés dans un mortier avec 5 - d'oxyde de magnésium, puis triturés en présence de 500 eni:
' d'eau et chauffés jusqu'à 10" C. La solution est filtrée et le g < :teau formé sur le filtre lavé à l'eau. Le filtrat est acidifié par l'acide chlorhydrique dilué jusqu'à pü 3, le précipité rassemblé sur le filtre est lavé à l'eau et à l'alcool.
Le degré de pureté du pro- duit a augmenté jusqu'à 81%. Exemple <I>2:</I> Environ 1,6 - d'acide folique à 78% con- tenant des ptérines apparentées est dissous dans 800 cm' d'une solution N/10 d'livdroxvcle de sodium;
on v ajoute 8 g de terre cl'infu- soires, et le p,, clé la solution est amené pzir l'acide acétique jusqu'à 3 environ. Le préci pité rassemblé sur le filtre est lavé à l'eau; l(# gâteau humide sur le filtre est trituré avec 5 g d'oxyde de magnésium en présence (le 500 cm-\ d'eau; le mélange est chauffé jus qu'à 55-60"C. Les produits insolubles sont séparés par filtration, et le gâteau est lavé avec une petite quantité d'eau chaude.
Le filtrat. est traité par une solution de soude caustique jusqu'à environ pli 11,5; on ajoute l'adjuvant de filtration et la solution est filtrée. Le filtrat est chauffé à 60" C et versé dans une solution chaude contenant 25 cm' d'acide acétique dans 75 em3 d'eau, le iné- lange refroidi jusqu'à 500C est filtré et, le produit est lavé à l'eau;
l'acide folique récu péré est d'une pureté de 87,30,1o. <I>Exemple 3:</I> 1 g d'acide folique (teneur 93,1% d'acide pur), contenant des ptérines apparentées, est trituré avec 0,5 g d'oxyde de magnésium en présence de 50 cm' d'eau. Le mélange est chauffé jusqu'à ébullition et filtré. Par re froidissement de la solution filtrée, le folate de magnésium se dépose en fines aiguilles jaunes.
La solution est filtrée et le gâteau humide sur le filtre est dissous dans<B>2</B>5 cm' d'eau bouillante. Par refroidissement, ou obtient de nouveau un précipité jaune de fo- late de magnésium qui est rassemblé sur le filtre.
Le folate de nia-nésiuni est recristallisé trois fois clans l'eau, puis est ajouté lentement à. une solution chaude d'acide acétique 30%; par refroidissement, il se forme tin pré- cipité d'acide folique, qui est récupéré par filtration.
Après avoir été séché pendant trois heures et. demie à la température de 11511C sous pression de 5 mm de mercure, ce produit a été analysé, sa teneur en acide folique pur était de 98%.
<I>Exemple</I> On précipite de l'hydroxyde de niannésiuiri en faisant agir de l'ammoniaque sur une solu tion clé 30 g de lISO@ . 71=I;
0 clans un litre d'eau, le précipité d'hydroxyde de magné sium ainsi obtenu est rassemblé sur un filtre, lavé à l'eau et mélangé à 10 g d'un mélange contenant 86% d'acide folique d'après le essais chimiques et 7,
1% d'eau et des ptérines en tant qu'impuretés. De l'hydroxyde de ma gnésium obtenu en précipitant par l'hydroxyde de sodium 30 g de 11I-80, . 7 H0 en solution dans 1000 cm' d'eau est filtré, lavé à l'eau et. ajouté encore au mélange précédent. Le mi; lange est chauffé à 850 C, il donne une tache rose sur le papier indicateur à. la phénol phtaléine. Le mélange chaud est filtré, et le filtrat jaune paille est refroidi. Le gâteau jaune précipité est dissous dans 200 cm' d'eau à 850 C.
Par refroidissement, un préci pité jaune se dépose, on le rassemble sur le filtre et on le dissout ensuite dans 1.00 cm' d'eau à 850 C, on laisse refroidir lentement et reposer pendant 16 heures.
. Au fond du becher apparait un précipité orange et à la surface de celui-ci un préci pité d'un jaune clair. Le précipité jaune. clair est prélevé et déposé sur le filtre, on le dissout clans 100 cm:' d'eau chaude et on ajoute cette solution à 50 em3 dîme solution d'acide acéti- que à 30% à 850 C. Le produit cristallin est séché dans un dessiccateur à vide sur l'hy droxyde de sodium et le sulfate de calcium anhydre, pendant 21 heures,
et ensuite pen dant 5 heures à 1150 C sous une pression de 0,5 mm de mercure. Il contient. (d'après les essais chimiques) 97,8% d'acide folique pur. <I>Exemple<B>5.-</B></I> 2 g d'un produit contenant 86,0% d'acide folique et des ptérines en tant qu'impuretés sont traités dans<B>100</B> cm3 d'eau par 1 g d'hy droxyde de calcium, à 850 C.
La plus grande partie du produit solide jaune est dissoute. Les parties insolubles sont éliminées par filtration à chaud. Après l'avoir refroidie jusqu'à environ 600 C, on fait agir sur la solution filtrée une solution clé 1 g de MgS04. 7 11,0 dans une petite quantité d'eau.
Le précipité qui se forme en petite quantité est éliminé par filtration, et le filtrat. est dilué avec un volume égal d'alcool éthylique; il se forme un volun-ineux précipité jaune que l'on rassemble sur le filtre; ce produit est dissous dans l'eau chaude, et la solution purifiée est ajoutée à une solution de 50 ems d'acide acé tique à 50% à la température de 800 C envi ron. Après refroidissement, le produit préci pité est rassemblé sur le filtre et séché à l'air à 600 C.
On obtient ainsi<B>1,127</B> g de produit contenant 86,9% d'acide folique et 8,1% d'eau.
<I>Exemple<B>6</B>:</I> On triture à 80-85 C, en présence de 50 cm3 d'eau, 1 g d'hydroxyde de calcium avec 1 g d'un produit contenant 86,01/o d'acide folique, 7,1% d'eau et des ptérines en tant qu'impuretés; le mélange est filtré à chaud, on fait agir sur la solution filtrée 0,3 g de sulfate de magnésium contenant sept. molécules d'eau de cristallisation, dissous dans une petite quantité d'eau.
Le produit précipité est éliminé par filtration et la so lution filtrée est additionnée d'une. solution d'acide acétique dilué chaud en excès (50 cm:' d'une solution à 50%). Après refroidissement, le précipité jaune est rassemblé sur le filtre, lavé à l'eau et l'acétone et séché à 600 C.
Le produit qui en résulte contient 90,0% d'acide folique et 7,7% d'eau.
Process for the treatment of a mixture containing a biologically active acid, with a view to separating this acid from the impurities which accompany it. The present invention relates to a method of treatment. of a mixture containing a biologically active acid key formula
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where R is the residue of an amino acid or of a polypeptide, in order to separate the biologically active acid from the impurities which accompany it and in particular from pterins of formula other than the formula above.
Among these biologically active acids, the most important is folic acid, which is of great therapeutic value due to its property of activating the formation of hemoglobin and its ability to combat agranulocytosis and agranulocytosis. other similar illnesses.
The synthetic production of natural foli acid has lately been developed by doing. react 2, 4, 5-triamino-6-hydroxy-pyrimidine, pai-a-amino-ben7oyl-g-lutanic acid and a suitable compound containing three carbon atoms and before an aldehyde group and / or a halogen group, capable of reacting, such as especially alpha-beta-dibromopropionic aldehyde.
The synthetic folic acid thus obtained, the chemical name of which is N- [4- {[(? - amino-4-hydroxy-6-py rimido- [4,5-b] -pyrazy 1).
methyl] - a.niino} - benzoyll - ghitamic acid, is commonly referred to as pteroylglutamic acid [see Science, <B> 103, </B> p. 669 (19.16)]. Other closely related acids and pos sedating, to a different degree.,
analogous biological activity can be prepared by means of this process by replacing para-aniino-benzoyl-glutamic acid by para-amino-benzoic acid amidated by an acid other than glutamic acid or by <B Ainino polypeptide thereof, such as, for example, glutamyl-glutamic acid.
The raw materials used in the process of synthesizing folic acid and the like mentioned above can react in different ways, and many side reactions were to be expected. take place during or after the main reaction, which has been verified by experience.
Therefore, the reaction product contains a relatively large amount of undesirable substances, in particular, in addition to the raw materials not reacted, key products of condensation and polymerization, positional isomers, oxidation products, decomposition, hydrolysis, etc. Many of these products, not always exactly identified, contain a pyramidopyrazine core and can. to be designated, in general, evenings by the name of pterines >>.
Now, these pterins formed by side reactions can be harmful from a physiological point of view, and as the desired acid is intended to be used as a therapeutic agent, it is obvious that they must be separated from said acid.
Unfortunately, a large number of pterins that accompany the biologically active acid in the product. crude obtained have certain chemical and physical properties identical to those of this acid, and it has hitherto been extremely difficult to remove the impurities without causing alarming losses of active product. Methods are known which make it possible to obtain foli acid only, for example at 85-9011 / o purity, from a crude mixture, but a higher degree of purity has only been achieved with very great losses in active body.
The invention makes it possible to avoid such inconvenience. The process which is the subject thereof is characterized in that, in the presence of water, a magnesium salt of the biologically active acid defined above is formed, which separates the insoluble products, containing most of the impurities, said magnesium salt, which is soluble in water, and ultimately regenerates the desired acid from its magnesium salt.
It has been found that by applying this process it is possible to separate folic acid, of almost theoretical purity, from mixtures containing pterins and other impurities which are found in the crude product obtained. by preparing folic acid synthetically. Said purification method is based on the fact that the magnesium salts of pteroyl -glutamic acid and related amino-amid acids have a solubility which differs to such an extent from that of the pterins which accompany them as. impurities, that they can be separated from them simply by solution, filtration, precipitation, crystallization, etc.
Although the process according to the present invention relates especially to the purification of products which contain 80 to 901/9 folic acid in the presence of other pterins, it can also be applied to the purification of crude reaction products containing only 10% folic acid proper.
To obtain pure folic acid from a mixture of the type specified above, this mixture is preferably treated with magnesium oxide, although other magnesium compounds, such as carbonate, may also be suitable. We can. also first to form another soluble salt of folic acid and obtain magnesium folate in solution by double decomposition, as it is shown in some examples.
The magnesium folate solution is then purified by filtration, decantation, centrifugation or by other means; purified folic acid can then be obtained by acidification of the solution, preferably up to approximately pn 3; the insoluble crystallized folic acid is recovered by filtering the solution. This purification treatment can be repeated until the product of the desired purity is obtained.
To obtain an even purer acid, a concentrated solution of magnesium folate in water is prepared at a temperature of 75 to 100 C; at this temperature, the solution is filtered and the magnesium salt is recovered by cooling the concentrated solution. The magnesium folate can then be recrystallized from water until the product is of the desired purity. By acidifying the final solution, a crystalline precipitate of very pure folic acid is obtained.
Here are some exemplary embodiments of the present invention. Example <I> 1: </I> 10 g of crude product, containing 15.7% by weight of folic acid proper, the remainder consisting of related pterins and other unidentified reaction products, are mixed in one. mortar with 5 - magnesium oxide, then crushed in the presence of 500 eni:
'water and heated to 10 "C. The solution is filtered and the water formed on the filter washed with water. The filtrate is acidified with hydrochloric acid diluted to pü 3, precipitate collected on the filter is washed with water and alcohol.
The degree of purity of the product increased to 81%. Example <I> 2: </I> About 1.6 - 78% folic acid containing related pterins is dissolved in 800 cc of an N / 10 solution of sodium hydroxide;
8 g of infusion earth are added, and the pH of the solution is brought to the acetic acid to about 3. The precipitate collected on the filter is washed with water; l (# wet cake on the filter is triturated with 5 g of magnesium oxide in the presence (the 500 cm- \ of water; the mixture is heated to 55-60 "C. The insoluble products are separated by filtration, and the cake is washed with a small amount of hot water.
The filtrate. is treated with a solution of caustic soda to about fold 11.5; the filter aid is added and the solution is filtered. The filtrate is heated to 60 ° C. and poured into a hot solution containing 25 cm 3 of acetic acid in 75 cc of water, the mixture cooled to 500 ° C. is filtered and the product is washed with water. ;
the folic acid recovered has a purity of 87.30.1o. <I> Example 3: </I> 1 g of folic acid (content 93.1% pure acid), containing related pterins, is triturated with 0.5 g of magnesium oxide in the presence of 50 cm 'water. The mixture is heated to a boil and filtered. By cooling the filtered solution, the magnesium folate is deposited in fine yellow needles.
The solution is filtered and the wet cake on the filter is dissolved in <B> 2 </B> 5 cm 3 of boiling water. On cooling, or again obtains a yellow precipitate of magnesium foate which collects on the filter.
The nia-neesiuni folate is recrystallized three times in water, then slowly added to. a hot 30% acetic acid solution; on cooling, a precipitated folic acid is formed, which is recovered by filtration.
After being dried for three hours and. at a temperature of 11511C under a pressure of 5 mm of mercury, this product was analyzed, its content of pure folic acid was 98%.
<I> Example </I> Niannesiuiri hydroxide is precipitated by reacting with ammonia on a key solution of 30 g of ISO®. 71 = I;
0 in one liter of water, the precipitate of magnesium hydroxide thus obtained is collected on a filter, washed with water and mixed with 10 g of a mixture containing 86% of folic acid according to the tests chemical and 7,
1% water and pterins as impurities. Magnesium hydroxide obtained by precipitating 30 g of 11I-80 with sodium hydroxide,. 7 H0 dissolved in 1000 cm 3 of water is filtered, washed with water and. added again to the previous mixture. The mi; lange is heated to 850 C, it gives a pink stain on the indicator paper to. phenol phthalein. The hot mixture is filtered, and the straw yellow filtrate is cooled. The precipitated yellow cake is dissolved in 200 cm 3 of water at 850 C.
On cooling, a yellow precipitate settles, it is collected on the filter and it is then dissolved in 1.00 cm 3 of water at 850 C, allowed to cool slowly and stand for 16 hours.
. At the bottom of the beaker appears an orange precipitate and on the surface of this a light yellow precipitate. The yellow precipitate. clear is taken and deposited on the filter, it is dissolved in 100 cm 3 of hot water and this solution is added to 50 cm 3 of a 30% acetic acid solution at 850 C. The crystalline product is dried in a vacuum desiccator on sodium hydroxide and anhydrous calcium sulfate, for 21 hours,
and then for 5 hours at 1150 C under a pressure of 0.5 mm Hg. It contains. (based on chemical testing) 97.8% pure folic acid. <I>Example<B>5.-</B> </I> 2 g of a product containing 86.0% folic acid and pterins as impurities are treated in <B> 100 </ B> cm3 of water per 1 g of calcium hydroxide, at 850 C.
Most of the yellow solid is dissolved. The insoluble parts are removed by hot filtration. After cooling it to about 600 ° C., the filtered solution is reacted with a key solution of 1 g of MgSO4. 7 11.0 in a small amount of water.
The precipitate which forms in a small quantity is removed by filtration, and the filtrate. is diluted with an equal volume of ethyl alcohol; a voluminous yellow precipitate forms which is collected on the filter; this product is dissolved in hot water, and the purified solution is added to a 50% acetic acid solution of 50% at a temperature of approximately 800 C. After cooling, the precipitated product is collected on the filter and dried in air at 600 ° C.
In this way <B> 1.127 </B> g of product containing 86.9% folic acid and 8.1% water is obtained.
<I> Example <B> 6 </B>: </I> Triturated at 80-85 C, in the presence of 50 cm3 of water, 1 g of calcium hydroxide with 1 g of a product containing 86 0.01% folic acid, 7.1% water and pterins as impurities; the mixture is filtered while hot, 0.3 g of magnesium sulphate containing seven molecules of water of crystallization, dissolved in a small quantity of water, is allowed to act on the filtered solution.
The precipitated product is removed by filtration and the filtered solution is added with. hot dilute acetic acid solution in excess (50 cm 3 of a 50% solution). After cooling, the yellow precipitate is collected on the filter, washed with water and acetone and dried at 600 ° C.
The resulting product contains 90.0% folic acid and 7.7% water.