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" Procédé de fabrication de préparations à base d'insuline Il.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication de préparations à base de l'hormone hypoglyoémiante du pancréas, connue sous le nom d'insuline, laquelle est un produit parfaitement défini au point de vue chimique.
On connaît déjà des prooédés visant à prolonger l'action hypoglycémiante de l'hormone du pancréas dénommée insuline, procédés qui consistent à transformer l'hormone en un composé difficilement soluble dans le suc des tissus organiques et à provoquer, de cette manière, une résorption plus
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lente de l'hormone. Dans ce but, on a, par exemple, fait ré- agir l'insuline avec des protamines et des histones ; enpro- cédant ainsi on a obtenu des composés qu'on précipite par addition de substances tampons, composés qui sont connus sous le nom de protamine-insulines.
On sait encore qu'on peut augmenter sensiblement l'action retardatrice des substances ainsi obtenues, par exemple des protamine-insulines, si l'on fait appel à des préparations d'insuline contenant du zinc, soit qu'on se serve à titre de matière de départ, de la zino-insuline obtenue à partir de l'hormone avec des sels de zinc, soit qu'on incorpore encore à ces substances davantage de sels de zinc. Dans la littérature spéciale, on a aussi décrit les composés de l'insuline contenant de l'aluminium et du calcium soit avec des protamines, soit sans protamines.
Ces composés ainsi que d'autres composés métalliques de l'insuline n'ont pas été appliqués en pratique, tandis que les composés oorrespondants de protamine-zinc sont parvenus à une importance croissante au point de vue clinique, quoique les composés cités en dernier lieu laissent encore quelque peu à désirer en ce qui concerne leur toléranoe par l'organisme.
Or, la Demanderesse a trouvé qu'on peut faire réagir l'insuline de même qu'avec les sels de zinc, de calcium et d'autres sels métalliques, également avec les sels de magnésium ; en procédant de cette manière, on obtient des substances qui présentent une action retardatrice, telle que celle de l'insuline-zinc connue. La Demanderesse a trouvé encore que les composés de magnésium et d'insuline ainsi obtenue sont susceptibles de réagir avec les substances les plus diverses qui se prêtent à la fabrication de préparations d'insuline à action retardatrice telles que par exemple la protamine, l'histone etc... Dans tous ces cas, on obtient des substances à action retardatrice et dont la tolérance par l'or-
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ganisme dépasse, en partie, de beaucoup celle des composés de zinc correspondants.
On peut mettre en oeuvre le procédé de la façon suivante : on additionne l'insuline de sels de magnésium, par exemple de sulfate de magnésium, de ohlorure de magnésium, d' aoétate de magnésium et on ajoute aux solutions obtenues le corps aminogène correspondant ( protamine, histone etc...); on obtient les nouveaux composés en précipitant à l'aide d'un tampon. On peut également mettre en oeuvre le procédé, avec des résultats semblables, en faisant réagir des sels de magnésium avec les protamine-insulines exemptes de magnésium et en effectuant ensuite la précipitation à l'aide d'une solution tampon.
On peut faire appel au procédé décrit ci-dessus pour les modifications les plus diverses de l'insuline, tout particulièrement on peut l'appliquer aux protamines qui contiennent déjà une addition provoquant une résorption plus lente de l'hormone, par exemple à l'insuline-protamines ou à l'insuline-histone. On peut aussi utiliser des composés de l'insuline avec des protones ou des hydrolysats d'histone. Enfin, on peut appliquer ce procédé aussi aux composés de l'insuline avec des bases organiques à poids moléculaire élevé selon le brevet belge N 430.582 de la même demanderesse, en date du 11 ootobre 1938, intitulé Il Procédé de fabrication de préparations à base de l'hormone du pancréas abaissant le taux du sucre dans le sang ( Insuline ) ".
Dans tous les cas précités on peut faire agir les sels de magnésium sur l'insuline à un stade quelconque du procédé. On peut appliquer ce procédé non seulement à l'insuline amorphe mais aussi à sa forme cristalline oontenant des quantités minimes de zinc.
Les divers composés de l'insuline qu'on obtient selon le procédé décrit ci-dessus, présentent une action retarda-
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trice prononcée tout en étant parfaitement bien tolérés.
EXEMPLE 1 :
On dissout 182 milligrammes d'insuline dans 1,4 cm3 d' acide chlorhydrique 1/10 normal ; ensuite on ajoute à la solution d'insuline 30 milligrammes de protamine dissoute dans une petite quantité d'eau et 62 milligrammes de sulfate de magnésium ( avec 7 H2O ). On étend alors le volume à 70 om, on ajoute 2,0 grammes d'urée. Ensuite, on règle la solution à une valeur de pH de 6,5 au moyen de phosphate de sodium secondaire. Le dépôt qui s'est formé représente la protaminemagnésium-insuline, à action retardatrice.
EXEMPLE 2 :
On dissout 182 milligrammes d'insuline dans 1,4 cm3 d'acide chlorhydrique 1/10 normal, on ajoute à la solution d'insuline 7,6 milligrammes de chlorhydrate de bis-2-méthyle- 4-aminoquinolyl-6-carbamide dissous dans une petite quantité d'eau et en outre 50,8 milligrammes de ohlorure de magnésium ( avec 6 H20 ). Ensuite on porte le volume à 70 cm3, on ajou- te 2 grammes d'urée et on règle la solution à une valeur de pH de 6,5 , au moyen de phosphate de sodium seoondaire, pour étendre enfin le tout à 100 cm3 Le dépôt qui vient de se former constitue l'insuline à action retardatrice.
EXEMPLE 3 :
On dissout 182 milligrammes d'insuline dans 1,4 cm3 d'acide chlorhydrique 1/10 normal, on mélange la solution avec 50,8 milligrammes de chlorure de magnésium dissous dans une petite quantité d'eau et on ajoute enfin une solution de 7,6 milligrammes de chlorhydrate de bis-2-méthyle-4-aminoquinolyl-6-carbamide dans 5 cm3 d'eau. Ensuite, on porte le volume à l'aide d'eau à environ 70 cm3 et on règle la solution à une valeur de pH de 6,6 au moyen d'une solution de phosphate de sodium secondaire, et on étend alors le tout à
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100 cm3.On compte, pour 1 om , 40 unités d'insuline.
EXEMPLE 4 :
Immédiatement après l'abattage, on prend sur des boeufs 20 kg de pancréas, on les débarrasse de la graisse et des tissus oonjonotifs, on les coupe en petits morceaux et on les introduit enfin dans un mélange de 6 Kg de glace finement broyée, de 4 litres d'eau et de 540 cm3. d'acide chlorhydrique concentré. On remue le tout vigoureusement jusqu'à ce que la majeure partie de la glace soit fondue et on fait congeler le tout dans un mélange frigorifique. On apporte la charge à ltétat congelé à ltendroit du traitement où on l'introduit en 1 démoulant dans un mélange refroidi à 0 de 54 litres d' alcool à 99,8 pour cent et 6,5 litres d'eau. On remue le tout pendant 12 heures à une température de 0 et on le filtre.
Tout en remuant encore pendant 2 heures à environ la , on ajoute encore au résidu 40 litres d'alcool + 28 litres d'eau + 100 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on le filtre de nouveau. On refroidit les extraits à 0 , on les règle par quantités de 15 litres à une valeur de pH de 7,4 - 7,6 à l'aide d'ammoniaque concentrée et on les oentrifuge ensuite rapidement jusqu'à ce qu'ils soient clairs. On règle alors les solutions olaires chaque fois au moyen d'acide sulfurique dilué à une valeur de pH de 3. On concentre les solutions acides réunies sous pression réduite ( la température à l'intérieur s'élevant à 20 C au maximum ) à 10 litres. On règle la réaction à une valeur de pH de 2,8 et on élimine la graisse par épuisement à l'éther.
On précipite la solution claire avec 25 % de chlorure de sodium; après avoir fait reposer le précipité pendant une nuit, on le sépare par filtration, on le suspend dans 1200 cm3 d'eau et on le précipite au moyen de 15 % de ohlorure de sodium. On dissout le deuxième dépôt au chlorure de sodium dans 2 litres d'eau et on règle la
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solution à une valeur de pH de 7,2 - 7,4. On essore immédiatement le précipité floconneux, on le lave à l'eau et on le sèche à l'aide d'acétone et d'éther. En procédant de cette manière, on obtient 4 grammes d'une préparation qui contient environ 15 unités par milligramme et qui, injectée sous la forme d'une suspension aqueuse, présente une action retardatrice prononcée.
Par addition de 12,5 cm3 d'acide chlorhydrique normal, on dissout 10 grammes d'une préparation d'insuline ainsi obtenue dans 2 litres d'une solution de trichloro-butanol à 0,5 %. On y ajoute 1,3 gramme de chlorure de magnésium et 15 grammes de chlorure de sodium, ensuite on additionne le tout de 500 cm3 d'une solution contenant 14,4 grammes de phosphate de sodium secondaire + 8 cm3 de solution de soude caustique normale dans une solution de triohloro-butanol à 0,5 %. On obtient une suspension qui contient pour 1 cm3, 40 unités d'insuline et qui présente une valeur de pH d'environ 7.
EXEMPLE 5 :
On dissout dans 1/2 litre d'eau acidulée, 5 grammes d'une préparation d'insuline exempte de zinc, contenant environ 10 unités par milligramme. On additionne la solution d'un demi litre de phosphate-tampon ( 167,5 grammes de phosphate de sodium secondaire, 27,5 grammes de phosphate de potassium primaire selon Soerensen, pour 10 litres d'eau distillée ) + 40 cm d'acide chlorhydrique normal + 25 cm3 d'une solution de chlorure de magnésium à 1 % + 100 cm3 d' acétone et on règle le tout à une valeur de pH de 7 au moyen d'ammoniaque normale. On essore la floculation qui s'est formée pendant ce procédé et on règle la solution claire à une valeur de pH de 6.
Si l'on fait reposer cette solution pendant une nuit dans une machine frigorifique, l'insuline
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se précipite sous forme micro-cristalline; on essore l'insuline et on la sèche à l'aide d'acétone et d'éther.
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"Process for the manufacture of preparations based on insulin II.
The present invention relates to a process for the manufacture of preparations based on the hypoglyoemic hormone of the pancreas, known under the name of insulin, which is a product which is perfectly defined from the chemical point of view.
Prooédés are already known aimed at prolonging the hypoglycaemic action of the pancreatic hormone called insulin, processes which consist in transforming the hormone into a compound which is hardly soluble in the juice of organic tissues and in this way causing resorption. more
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slow hormone. For this purpose, for example, insulin has been reacted with protamines and histones; By doing so, compounds have been obtained which are precipitated by the addition of buffer substances, which compounds are known as protamine-insulins.
It is also known that the retarding action of the substances thus obtained, for example protamine-insulins, can be considerably increased, if insulin preparations containing zinc are used, or if they are used as a starting material, zino-insulin obtained from the hormone with zinc salts, or that these substances still incorporate more zinc salts. In the special literature, insulin compounds containing aluminum and calcium have also been described either with protamines or without protamines.
These and other metal compounds of insulin have not been applied in practice, while the corresponding protamine-zinc compounds have come of increasing clinical importance, although the latter compounds still leave something to be desired with regard to their toleranoe by the organism.
Now, the Applicant has found that insulin can be made to react as well as with salts of zinc, calcium and other metal salts, also with magnesium salts; by proceeding in this way, substances are obtained which exhibit a retarding action, such as that of known insulin-zinc. The Applicant has also found that the magnesium and insulin compounds thus obtained are capable of reacting with the most diverse substances which lend themselves to the manufacture of insulin preparations with retarding action such as for example protamine, histone. etc ... In all these cases, substances with a retarding action are obtained, the tolerance of which by gold
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In part, it greatly exceeds that of the corresponding zinc compounds.
The process can be carried out as follows: the insulin of magnesium salts, for example of magnesium sulfate, of magnesium ohloride, of magnesium aoetate, is added and the corresponding aminogenic body is added to the solutions obtained ( protamine, histone etc ...); the new compounds are obtained by precipitating with the aid of a buffer. The process can also be carried out, with similar results, by reacting magnesium salts with the magnesium-free protamine-insulins and then carrying out the precipitation using a buffer solution.
The method described above can be used for the most diverse modifications of insulin, in particular it can be applied to protamines which already contain an addition causing a slower resorption of the hormone, for example to insulin-protamines or insulin-histone. Insulin compounds can also be used with protones or histone hydrolysates. Finally, this process can also be applied to insulin compounds with high molecular weight organic bases according to Belgian patent No. 430,582 by the same applicant, dated October 11, 1938, entitled Il Process for the manufacture of preparations based on the hormone of the pancreas lowering the level of sugar in the blood (Insulin) ".
In all of the above cases, the magnesium salts can be made to act on the insulin at any stage of the process. This process can be applied not only to amorphous insulin but also to its crystalline form containing minimal amounts of zinc.
The various insulin compounds which are obtained according to the process described above exhibit a retardation action.
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pronounced while being perfectly well tolerated.
EXAMPLE 1:
182 milligrams of insulin are dissolved in 1.4 cm3 of normal 1/10 hydrochloric acid; then 30 milligrams of protamine dissolved in a small amount of water and 62 milligrams of magnesium sulfate (with 7 H2O) are added to the insulin solution. The volume is then extended to 70 µm, 2.0 grams of urea are added. Then the solution is adjusted to a pH value of 6.5 using secondary sodium phosphate. The deposit which formed represents protaminemagnesium-insulin, with retarding action.
EXAMPLE 2:
182 milligrams of insulin are dissolved in 1.4 cm3 of normal 1/10 hydrochloric acid, 7.6 milligrams of dissolved bis-2-methyl-4-aminoquinolyl-6-carbamide hydrochloride are added to the insulin solution in a small amount of water and additionally 50.8 milligrams of magnesium chloride (with 6 H2O). Then the volume is brought to 70 cm3, 2 grams of urea are added and the solution is adjusted to a pH value of 6.5, using secondary sodium phosphate, to finally extend the whole to 100 cm3. the deposit which has just formed constitutes the retarding insulin.
EXAMPLE 3:
182 milligrams of insulin are dissolved in 1.4 cm3 of normal 1/10 hydrochloric acid, the solution is mixed with 50.8 milligrams of magnesium chloride dissolved in a small amount of water and finally a solution of 7 , 6 milligrams of bis-2-methyl-4-aminoquinolyl-6-carbamide hydrochloride in 5 cm3 of water. Then the volume is brought with the aid of water to about 70 cm3 and the solution is adjusted to a pH value of 6.6 by means of a secondary sodium phosphate solution, and the whole is then extended to
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100 cm3. For 1 om, 40 units of insulin are counted.
EXAMPLE 4:
Immediately after slaughter, 20 kg of pancreas are taken from the oxen, freed from fat and associated tissues, cut into small pieces and finally introduced into a mixture of 6 kg of finely crushed ice. 4 liters of water and 540 cm3. concentrated hydrochloric acid. Stir vigorously until most of the ice is melted and freeze in a refrigeration mix. The charge is brought in the frozen state to the processing site where it is introduced by demolding in a cooled to 0 mixture of 54 liters of 99.8 percent alcohol and 6.5 liters of water. The whole is stirred for 12 hours at a temperature of 0 and filtered.
While stirring for a further 2 hours at about 1 a, a further 40 liters of alcohol + 28 liters of water + 100 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added to the residue and filtered again. The extracts are cooled to 0, adjusted in quantities of 15 liters to a pH value of 7.4 - 7.6 using concentrated ammonia, and then rapidly oentrifuged until they are solid. clear. The olar solutions are then adjusted each time by means of dilute sulfuric acid to a pH value of 3. The combined acid solutions are concentrated under reduced pressure (the temperature inside rising to 20 C at the most) to 10 liters. The reaction is adjusted to a pH value of 2.8 and the fat is removed by stripping with ether.
The clear solution is precipitated with 25% sodium chloride; after allowing the precipitate to stand overnight, it is filtered off, suspended in 1200 cm 3 of water and precipitated with 15% sodium chloride. The second sodium chloride deposit is dissolved in 2 liters of water and the
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solution at a pH value of 7.2 - 7.4. The fluffy precipitate is immediately filtered off, washed with water and dried with acetone and ether. Proceeding in this way, 4 grams of a preparation are obtained which contains about 15 units per milligram and which, when injected in the form of an aqueous suspension, exhibits a pronounced retarding action.
By addition of 12.5 cm3 of normal hydrochloric acid, 10 grams of an insulin preparation thus obtained are dissolved in 2 liters of a 0.5% solution of trichlorobutanol. 1.3 grams of magnesium chloride and 15 grams of sodium chloride are added to it, then the whole of 500 cm3 of a solution containing 14.4 grams of secondary sodium phosphate + 8 cm3 of normal caustic soda solution is added. in 0.5% triohlorobutanol solution. A suspension is obtained which contains 40 units of insulin per 1 cm3 and which has a pH value of approximately 7.
EXAMPLE 5:
5 grams of a zinc-free insulin preparation containing about 10 units per milligram is dissolved in 1/2 liter of acidulated water. Add the solution of half a liter of phosphate-buffer (167.5 grams of secondary sodium phosphate, 27.5 grams of primary potassium phosphate according to Soerensen, for 10 liters of distilled water) + 40 cm of acid normal hydrochloric acid + 25 cm3 of a 1% solution of magnesium chloride + 100 cm3 of acetone and the whole is adjusted to a pH value of 7 using normal ammonia. The flocculation which has formed during this process is filtered off and the clear solution is adjusted to a pH value of 6.
If this solution is left to stand overnight in a refrigeration machine, the insulin
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precipitates in microcrystalline form; the insulin is filtered off and dried with acetone and ether.