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PROCEDE DE PREPARATION D'INSULINE CRISTALLISEE.
L'insuline a été préparée pour la première fois sous forme cristalline par Abel, voir par exemple Proco Nat. Acad. Scie 12.132 (1926), en utilisant un mélange d'acétate d'ammonium? de brucine et de pyridine comme milieu de cristallisation et, plus tard, en 1929, par Harrington et Scott, voir Biochem. J., 230384 (1929), à partir d'insuline amorphe en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium contenant de la saponine, la valeur du pH de la solution d'insuline dans les deux cas étant changée pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insuline en vue de produire la cristallisation..
Ces méthodes de cristallisation? qui donnent des rendements assez modestes de cristaux relativement impurs, ont été abandonnées par la suite en faveur de la méthode de cristallisation mise au point par Scott, voir Biochem, J. 28, 1952 (1934) et le brevet américain ? 2014305900
La méthode de cristallisation de Scott repose sur l'observation surprenante qu'il est nécessaire, en vue d'obtenir une cristallisation absolument reproductible et des rendements élevés, qu'une certaine quantité d'un des métaux zinc, cadmium, cobalt et nickel soit présente dans le milieu de cristallisationo Lorsqu'on réussissait autrefois à faire cristalliser l'insuline, la raison en était que le milieu de cristallisation contenait par nature du zinc,
et Scott a trouvé qu'il était requis préalablement pour la cristallisation que le milieu de cristallisation contienne A x 0,007 g d'un des métaux mentionnés par 100 g d'insuline sèche,, "A" représentant le poids atomique du métalo
La présente invention, se rapportant à un procédé du type dans lequel on fait cristalliser de l'insuline à partir d'un milieu contenant des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, en changeant la valeur du pH du milieu pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insuline, repose sur l'observation que le zinc, le cadmium, le cobalt et le nickel ne sont pas les seuls métaux dont la présence est
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préalablement nécessaire pour la cristallisation de l'insuline, mais qu'ega- lement les métaux cuivre,
manganèse et fer possèdent cette propriété, lorsqu'ils sont présents sous la forme divalente.
Le procédé de l'invention est donc caractérisé en ce qu'on emploie des ions cuivriques, des ions manganeux ou des ions ferreux, ou des mélanges de tels ions, comme cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisationo
Alors que jusqu'à présent il était nécessaire de faire cristalliser l'insuline au moyen des métaux mentionnés par Scott, pratiquement au moyen de zinc exlusivement ,la présente invention permet d'effectuer la cristallisation avec d'autres métaux, ce qui augmente les possibilités dans ce domaine
Comme cela est bien connu, les métaux mentionnés par Scott sont fixés par les cristaux d'insuline qui sont donc ainsi amenés à contenir du zinc, du cadmium, du cobalt ou du nickelo De manière correspondante, les cristaux d'insuline préparés conformément à l'invention seront amenés à contenir du cuivre,
du manganèse ou du fer, et, à partir de ces nouveaux cristaux, il est possible de produire des préparations d'insuline avec une activité thérapeutique modifiéeo
A la condition que la solution d'insuline employée ne contienne pas à l'avance des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, par exemple du zinc qui, comme cela est bien connu, est présent dans le pancréas, à partir duquel on retire l'insuline, les ions métalliques employés conformément à l'invention doivent être présents dans le milieu de cristallisation en quantités dépassant 0,5 % du poids de l'insulineo Cependant, au voisinage de cette limite inférieure la cristallisation s'effectue comparativement lentement,
tandis que le rendement en cristaux est également moins satisfaisante D'où il est préférable en pratique d'employer des quantités de métaux considérablement plus grandeso
Si la cristallisation se fait exclusivement en se basant sur du cuivre, le milieu de cristallisation doit montrer une concentration en ions cuivriques d'au moins 0,01 %. Le chiffre correspondant pour les ions manganeux est de 0,1 % et pour les ions ferreux de 0,05 %
Cependant, les meilleurs résultats s'obtiennent avec des quantités de métal un peu plus grandes, c'est-à-dire 0,05-0,1 % de cuivre, 0,1- 0,2 % de fer et 0,2-0,5 % de manganèse, respectivement.. Les concentrations d'ions métalliques qui sont deux à trois fois plus grandes que celles qui viennent d'être mentionnées, sont en général désavantageuses.
En pratique, la concentration de cuivre ne doit pas dépasser 0,5 %. Le chiffre correspondant est de 0,8 % pour le manganèse et de 0,5 % pour le fera A la condition que plus d'un des métaux en question soient présents dans le milieu de cristallisation, ou que ce dernier contienne par nature ou bien, au moment de sa préparation, soit amené à contenir des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, on peut évidemment réduire de manière correspondante la quantité de chaque métal ajoutée.
La concentration d'insuline peut varier dans de larges limites, bien que cependant il soit le plus approprié d'employer une concentration d'insuline comprise entre 0,1 % et 1 %. La forme sous laquelle les métaux de l'invention sont ajoutés au milieu de cristallisation n'est'pas critique pour l'invention, pourvu seulement que les métaux soient présents sous une forme ionogène dans les conditions de cristallisationo D'habitude, il est des plus commode d'ajouter les métaux sous forme de leurs sels, tels que sulfates, nitrates, chlorures, acétates, citrates, etco Si lemilieu de cristallisation est acide au moment de 1'addition, on peut également employer les métaux sous forme de leurs hydroxydes ou autres composés à partir desquels les métaux sont libérés sous une forme ionogène dans un milieu acide.
De plus, on notera que les métaux peuvent également être présents à l'état d'ions complexes pourvu seulement que le métal puisse être retenu par l'insuline au cours de la cristallisation.
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En effectuant le procédé conformément à l'invention, la solu- tion, qui résulte de la récupération technique de l'insuline, et qui jusqu'ici a été employée pour la production d'insuline cristallisée en présence d'ions zinc, peut servir comme solution d'insuline. Toutefois, il est aussi possible de partir d'insuline amorphe, telle qu'on la trouve sur le marche ; ce cas, on dissout de la manière hacituelle l'insuline amorphe dans une solu- tion aqueuse d'un acide, par exeuple de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique ou de l'acide phosphcr@que.
Comme cela est bien connu, les solutions d'insuline technique et l'insuline amorphe produite a partir de celles-ci, contiennent de petites quantités de zinc provenant du pancréas. Par conséquente si on désire obte- nir des cristaux d'insuline exempts de zinc, on doit tout d'abord éliminer le zinc qui y est présent par nature, notamment par dialyseo
Il est préférable que la solution d'insuline employée ait une valeur de pH en-dessous du point isoélectrique de l'insuline (pH voisin de 5,5), mais on peut également employer des solutions d'insuline ayant une va- leur de pH au-dessus du point isoélectrique, par exemple un pH 8.
Les rendements obtenus par le procédé de l'invention sont fonc- tions du degré de pureté de l'insuline employéeo Les solutions d'insuline, dans lesquelles l'insuline montre une activité biologique inférieure à 15 unités internationales par mg, donnent en général un rendement:moins satis- faisant.
Les meilleurs rendements s'obtiennent lorsque l'insuline est complè- tement pure,c'est-à-dire lorsqu'elle montre une activité biologique de 22 à
23 unités internationales par mgo
Comme cela est bien connu, la cristallisation de l'insuline se fait d'habitude en présence d'une substance tampon pour maintenir la valeur de pH la plus favorable pendant la cristallisation., Il est avantageux de se servir également de substances tampons pour effectuer le procédé de l'invention Comme exemples de substances tampons utiles, on peut mentionner le tampon à l'acétate, le tampon au borate, le tampon au citrate, le tampon au barbiturate de diéthyle, le tampon au phosphate, le tampon au maléate ou des mélanges de ceux-ci.
Parmi toutes ces substances tampons, il est préférable d'employer les tampons au citrate vu qu'avec eux on obtient une cristallisation rapide et que les cristaux d'insuline se forment avec une teneur moindre en cendres et en impuretés orgàniques colorées qu'avec l'emploi des autres substances tamponso
Dans la cristallisation de l'insuline connue jusque ici on a également fait usage d'une addition de solvants organiques promoteurs de cristallisation, tels que acétone, alcool propylique, alcool butylique ou alcool amylique.
Dans le procédé de la présente invention, il est également avantageux de faire une addition de 1 ou plusieurs de tels solvants organiques, de l'acétone de préférenceo
Dans la préparation de la solution d'insuline contenant un métal, on incorpore les matières premières requises à l'état solide ou dissous, tandis qu'on peut ajouter la quantité nécessaire d'une solution basique ou acide pour mettre en solution l'insuline, si on le désireo Cependant, il sera généralement des plus pratique d'employer les substances de départ à l'état dissous, du moins en ce qui concerne les métaux et les substances tampons, ce qui facilite le dosage de ces substanceso
Lorsqu'on a préparé une solution d'insuline contenant un ou plusieurs des ions métalliques mentionnés, de même que, si on le désire,
une substance tampon et un solvant organique promoteur de cristallisation, on effectue la cristallisation de l'insuline en changeant la valeur du pH de la solution pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insulineo L'intervalle des valeurs de pH dans lequel on peut faire cristalliser l'insuline est compris entre pH 5 et pH 7.
Dans le cas d'une solution d'insuline avec une valeur de pH inférieure à l'intervalle mentionné plus hauts par exemple une valeur de
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pH de 2 à 4, on accroît la valeur du pH par l'addition d'une solution aqueu- se d'une substance à réaction alcaline;; de préférence un hydroxyde, plus par- ticulièrement un hydroxyde d'un métal alcalino Dans le cas d'une solution d'insuline avec une valeur de pH supérieure à l'intervalle de pH,mentionnée plus haut, on diminue la valeur du pH de la solution par l'addition d'une so- lution acide aqueuse, par exemple in acide dilué tel que de l'acide acétique, de l'acide chlorhydrique, de 19 acide sulfurique ou de l'acide phosphorique.
Les exemples suivants d'exécution servent à expliquer de maniè- re plus détaillée le procédé conforme à l'inventiono Exemple 10 - On ajoute 300 cm3 d'une solution de chlorure cuivrique, conte- nant 1,34 g de CuCl2.2H2O, à 5 g d9insuline amorphe (approximativement à 23 unités internationales par mg), après quoi on fait entrer en solution l'in- suline par l'addition de 5 cm3 diacide chlorhydrique 1N.
On ajoute alors 150 cm3 d'acétone et 500 cm3 de tampon au citrate, contenant 10 g d'acide citri- que et 5,6 g de soude caustique, après quoi on ajuste la valeur du pH de la solution à 6,0, approximativemento Au bout de quelques heures, la cristalli- sation est terminéeOn enlève les cristaux d'insuline par succion et on les lave tout d'abord avec de Peau.9 ensuite avec de l'acétone, puis on sèche.
Les cristaux contiennent environ 0,37 % de Cu.
Exemple 2.- Le procédé est comme dans l'exemple 1 en employant 300 cm3 d'une solution de chlorure de manganèse., contenant 7,22 g de MnCl2.4H2O, au lieu de la solution de chlorure cuivriqueo Les cristaux d'insuline secs contien- nent environ 0,38 % de Mno Exemple 30 - Le procédé est le même que dans l'exemple 1, en employant tou- tefois 300 cm3 de chlorure ferreux, contenant 5,37 g de FeCl2.4H2O.
au lieu de la solution de chlorure cuivriqueo Les cristaux d9insuline secs contien- nent environ 0,30 % de fero Exemple 4.0 = On prépare les solutions de base suivantes A une solution aqueuse (pH approximatif de 6,5) d'insuline amorphe brute de pancréas de pores, contenant approximativement 7,5 g d'insuline par litre, 16-17 % d'acétone et 1,1 % d9acide citriqueo B Une solution aqueuse contenant 0,56% de NuSO4.4H2O C : Une solution aqueuse contenant 0,70 % de FeSO4.7H2O D : Une solution aqueuse contenant 0,63 % de CuSO4.5H2O.
E Une solution aqueuse contenant 4 % d'acide citrique,ajustée à un pH approximatif de 7 avec de la soude caustique.
1) On ajoute 4 cm3 d'acétone, 20 cm3 de la solution B et 7 cm3 de solution E à 50 cme de solution Ao On réduit la valeur du pH approximati- vement à 6,4 avec de l'acide chlorhydrique, et on conserve le mélange pendant 15 heures à une température voisine de 4 C.
On sépare les cristaux d'insuline formés par succion, on les lave tout d'abord à Peau ensuite à 1?acétone, puis on les sèche.
2) On ajoute 4 cm3 d'acétone, 20 cm3 de solution C et 7 cm3 de solution E à 50 cm3 de solution Ao On réduit la valeur du pH de la solution à 6,05 avec de 19acide chlorhydrique et on laisse reposer la composition pen- dant 15 heures à 4 C. On sépare les cristaux d'insuline ainsi formés, on les lave tout d'abord à 1-'eau, ensuite à l'acétone puis on sècheo
3) On ajoute 4 cm3 d'acétone, 20 cm3 de solution D et 7 cm3 de solution E à 50 cm3 correspondant à la solution A, mais obtenus en partant d'insuline pure amorphe exempte de zinco On réduit la valeur du pH de la so- lution à 6,03 avec de l'acide chlorhydrique,
et laisse ensuite reposer la composition pendant 15 heures vers 4 C environo On sépare les cristaux d'in-
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,suline ainsi formés, on les lave d'abord avec de l'eau, ensuite avec de l'acétone, puis on sècheo Les cristaux d'insuline contiennent approximativement 0,34 % de cuivre, et pas de zinco Exemple 5.
On ajoute 2000 cm3 d9eau distillée et 200 cm3 diacide chlorhydrique normal à 2500 cm3 de tampon a@ phosphate, produit par dissolution de 335 g de NaHPO4,12H2O et de 55 g de Kl2PO4 dans 20 litres d'eau distillée, après quoi on ajoute 200 cm3 d'une solution d'insuline contenant 30 mg d'insuline par cm3, et 500 cm3 d'une solution de chlorure cuivrique, produite par disso- lution de 26,8 g de CuCl2.2HO dans 1 litre d'eau distillée, et 500 cm3 d'acétone. On ajuste alors la valeur du pH de la composition à 6,2 en ajoutant approximativement 230 cm3 de NHOH normale La cristallisation de l'insuline se produit au bout de quelques heures, et on sépare les cristaux après quelques jourso
REVENDICATIONS .
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1/ Procédé de préparation dinsuline cristallisée, dans lequel on fait cristalliser l'insuline à partir d'un agent contenant des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, en changeant la valeur du pH de l'agent pour atteindre approximativement le point iso- électrique de l'insuline, caractérisé en.ce qu'on utilise des ions cuivriques, des ions manganeux ou des ions ferreux ou des mélanges de tels ions comme cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation.
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PROCESS FOR PREPARING CRYSTALLIZED INSULIN.
Insulin was first prepared in crystalline form by Abel, see for example Proco Nat. Acad. Saw 12.132 (1926), using a mixture of ammonium acetate? of brucine and pyridine as the crystallization medium and, later, in 1929, by Harrington and Scott, see Biochem. J., 230384 (1929), from amorphous insulin using ammonium acetate buffer containing saponin, the pH value of the insulin solution in both cases being changed to approximately reach the point isoelectric of insulin in order to produce crystallization.
These methods of crystallization? which gave fairly modest yields of relatively impure crystals, were subsequently abandoned in favor of the crystallization method developed by Scott, see Biochem, J. 28, 1952 (1934) and US Pat. 2014305900
Scott's method of crystallization is based on the surprising observation that it is necessary, in order to obtain absolutely reproducible crystallization and high yields, that a certain amount of one of the metals zinc, cadmium, cobalt and nickel be present in the crystallization medium o When it was once successful to crystallize insulin, the reason was that the crystallization medium naturally contained zinc,
and Scott found that it was previously required for crystallization that the crystallization medium contain A x 0.007 g of one of the metals mentioned per 100 g of dry insulin, "A" representing the atomic weight of the metal.
The present invention, relating to a method of the type in which insulin is crystallized from a medium containing cations the prior presence of which is required for crystallization, by changing the pH value of the medium to approximately reach the isoelectric point of insulin, is based on the observation that zinc, cadmium, cobalt and nickel are not the only metals whose presence is
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previously necessary for the crystallization of insulin, but that also the metals copper,
manganese and iron have this property when they are present in the divalent form.
The process of the invention is therefore characterized in that cupric ions, manganous ions or ferrous ions, or mixtures of such ions, are used as cations whose prior presence is required for crystallization.
While heretofore it was necessary to crystallize insulin by means of the metals mentioned by Scott, practically by means of zinc exclusively, the present invention allows crystallization with other metals, which increases the possibilities. in this domain
As is well known, the metals mentioned by Scott are attached by the insulin crystals which are thus caused to contain zinc, cadmium, cobalt or nickelo Correspondingly, the insulin crystals prepared in accordance with l 'invention will contain copper,
manganese or iron, and from these new crystals it is possible to produce insulin preparations with altered therapeutic activity.
On condition that the insulin solution used does not contain in advance cations the prior presence of which is required for crystallization, for example zinc which, as is well known, is present in the pancreas, from which the insulin is removed, the metal ions used in accordance with the invention must be present in the crystallization medium in amounts exceeding 0.5% of the weight of the insulin o However, in the vicinity of this lower limit crystallization takes place comparatively slowly,
while the yield of crystals is also less satisfactory Hence it is preferable in practice to employ considerably larger quantities of metals.
If the crystallization is carried out exclusively on the basis of copper, the crystallization medium should show a copper ion concentration of at least 0.01%. The corresponding figure for manganous ions is 0.1% and for ferrous ions is 0.05%
However, the best results are obtained with somewhat larger amounts of metal, i.e. 0.05-0.1% copper, 0.1-0.2% iron and 0.2 -0.5% manganese, respectively. The concentrations of metal ions which are two to three times greater than those just mentioned are generally disadvantageous.
In practice, the copper concentration should not exceed 0.5%. The corresponding figure is 0.8% for manganese and 0.5% for will, provided that more than one of the metals in question is present in the crystallization medium, or that the latter contains by nature or , at the time of its preparation, is caused to contain cations the prior presence of which is required for crystallization, it is obviously possible to correspondingly reduce the amount of each metal added.
The insulin concentration can vary within wide limits, although however it is most suitable to employ an insulin concentration between 0.1% and 1%. The form in which the metals of the invention are added to the crystallization medium is not critical to the invention, provided only that the metals are present in an ionogenic form under the conditions of crystallization. Usually, it is desirable. more convenient to add the metals in the form of their salts, such as sulfates, nitrates, chlorides, acetates, citrates, etc. If the crystallization medium is acidic at the time of addition, the metals can also be employed in the form of their hydroxides or other compounds from which metals are released in an ionogenic form in an acidic medium.
In addition, it should be noted that the metals can also be present in the state of complex ions provided only that the metal can be retained by the insulin during crystallization.
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By carrying out the process according to the invention, the solution, which results from the technical recovery of insulin, and which heretofore has been employed for the production of crystallized insulin in the presence of zinc ions, can be used. as an insulin solution. However, it is also possible to start from amorphous insulin, as found in the market; In this case, amorphous insulin is dissolved in the usual way in an aqueous solution of an acid, for example hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphorous acid.
As is well known, solutions of technical insulin, and the amorphous insulin produced from them, contain small amounts of zinc from the pancreas. Consequently, if one wishes to obtain insulin crystals free of zinc, one must first of all remove the zinc which is present there by nature, in particular by dialysis.
It is preferable that the insulin solution employed has a pH value below the isoelectric point of insulin (pH around 5.5), but insulin solutions having a value of. pH above the isoelectric point, for example pH 8.
The yields obtained by the process of the invention are a function of the degree of purity of the insulin employed. Insulin solutions, in which the insulin shows a biological activity of less than 15 international units per mg, generally give a yield: less satisfactory.
The best yields are obtained when the insulin is completely pure, that is, when it shows a biological activity of 22 to
23 international units per mgo
As is well known, crystallization of insulin usually takes place in the presence of a buffer substance to maintain the most favorable pH value during crystallization., It is advantageous to also use buffer substances to effect The process of the invention As examples of useful buffering substances, there may be mentioned acetate buffer, borate buffer, citrate buffer, diethyl barbiturate buffer, phosphate buffer, maleate buffer or mixtures of these.
Among all these buffer substances, it is preferable to use citrate buffers since with them a rapid crystallization is obtained and insulin crystals are formed with a lower content of ash and colored organic impurities than with '' use of other buffer substances
In the crystallization of insulin known hitherto, use has also been made of an addition of organic solvents which promote crystallization, such as acetone, propyl alcohol, butyl alcohol or amyl alcohol.
In the process of the present invention, it is also advantageous to make an addition of 1 or more of such organic solvents, preferably acetone.
In preparing the metal-containing insulin solution, the required raw materials are incorporated in solid or dissolved state, while the necessary amount of a basic or acidic solution can be added to dissolve the insulin. , if desired, o However, it will generally be most practical to use the starting substances in the dissolved state, at least as regards metals and buffer substances, which facilitates the dosage of these substances.
When an insulin solution containing one or more of the mentioned metal ions has been prepared, as well as, if desired,
a buffer substance and an organic solvent promoting crystallization, the crystallization of insulin is carried out by changing the pH value of the solution to approximately reach the isoelectric point of insulin o The range of pH values in which one can make crystallize insulin is between pH 5 and pH 7.
In the case of an insulin solution with a pH value lower than the range mentioned above, for example a value of
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pH from 2 to 4, the pH value is increased by the addition of an aqueous solution of an alkaline reacting substance; preferably a hydroxide, more particularly a hydroxide of an alkaline metal. In the case of an insulin solution with a pH value greater than the pH range mentioned above, the pH value is reduced by the solution by the addition of an aqueous acidic solution, for example a dilute acid such as acetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid.
The following examples of execution serve to explain in more detail the process according to the invention: Example 10 - 300 cm3 of a solution of cupric chloride, containing 1.34 g of CuCl2.2H2O, are added to 5 g of amorphous insulin (approximately 23 international units per mg), after which the insulin is brought into solution by the addition of 5 cm 3 of 1N hydrochloric acid.
150 cm3 of acetone and 500 cm3 of citrate buffer, containing 10 g of citric acid and 5.6 g of caustic soda, are then added, after which the pH value of the solution is adjusted to 6.0, approx. After a few hours crystallization is complete. The insulin crystals are removed by suction and washed first with water, then with acetone, then dried.
The crystals contain about 0.37% Cu.
Example 2.- The process is as in Example 1 using 300 cm3 of a manganese chloride solution, containing 7.22 g of MnCl2.4H2O, instead of the cupric chloride solution o Insulin crystals Dry contain about 0.38% Mno Example 30 - The procedure is the same as in Example 1, however, using 300 cc of ferrous chloride, containing 5.37 g of FeCl2.4H2O.
instead of the cupric chloride solution The dry insulin crystals contain about 0.30% fero Example 4.0 = The following stock solutions are prepared To an aqueous solution (approximately pH 6.5) of crude amorphous insulin of pore pancreas, containing approximately 7.5 g of insulin per liter, 16-17% acetone and 1.1% citric acid o B An aqueous solution containing 0.56% NuSO4.4H2O C: An aqueous solution containing 0 , 70% FeSO4.7H2O D: An aqueous solution containing 0.63% CuSO4.5H2O.
E An aqueous solution containing 4% citric acid, adjusted to an approximate pH of 7 with caustic soda.
1) Add 4 cm3 of acetone, 20 cm3 of solution B and 7 cm3 of solution E to 50 cm3 of solution Ao. The pH value is reduced to approximately 6.4 with hydrochloric acid, and the pH value is reduced to approximately 6.4. keep the mixture for 15 hours at a temperature of around 4 C.
The insulin crystals formed are removed by suction, washed first with water, then with acetone, and then dried.
2) 4 cm3 of acetone, 20 cm3 of solution C and 7 cm3 of solution E are added to 50 cm3 of solution Ao The pH value of the solution is reduced to 6.05 with hydrochloric acid and the composition is left to stand. for 15 hours at 4 ° C. The insulin crystals thus formed are separated, washed first with water, then with acetone and then dried.
3) We add 4 cm3 of acetone, 20 cm3 of solution D and 7 cm3 of solution E at 50 cm3 corresponding to solution A, but obtained starting from pure amorphous insulin free of zinc o The pH value of the solution at 6.03 with hydrochloric acid,
and then leave the composition to stand for 15 hours at around 4 ° C. The crystals are separated off.
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, sulin thus formed, washed first with water, then with acetone, then dried. The insulin crystals contain approximately 0.34% copper, and no zinc. Example 5.
2000 cm3 of distilled water and 200 cm3 of normal hydrochloric acid are added to 2500 cm3 of phosphate buffer, produced by dissolving 335 g of NaHPO4,12H2O and 55 g of K12PO4 in 20 liters of distilled water, after which 200 is added. cm3 of an insulin solution containing 30 mg of insulin per cm3, and 500 cm3 of a solution of cupric chloride, produced by dissolving 26.8 g of CuCl2.2HO in 1 liter of distilled water, and 500 cm3 of acetone. The pH value of the composition is then adjusted to 6.2 by adding approximately 230 cc of normal NHOH Crystallization of the insulin occurs after a few hours, and the crystals are separated after a few days.
CLAIMS.
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1 / Process for the preparation of crystallized insulin, in which insulin is crystallized from an agent containing cations whose prior presence is required for crystallization, changing the pH value of the agent to approximately reach the point isoelectric of insulin, characterized in that cupric ions, manganous ions or ferrous ions or mixtures of such ions are used as cations the prior presence of which is required for crystallization.