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PROCEDE D'OBTENTION DE PENICILLINES STABLES CONVENANT PARTICULIEREMENT BIEN
A LA THERAPIE ORALE.
Des procédés de préparation par biosynthèse de pénicillines qui se distinguent par la nature de la chaîne latérale des pénicillines G, X, F et K normales, étudiées et appliquées en clinique, ont déjà été mis au point en grand nombre. On effectue l'introduction des radicaux désirés dans la molécule de pénicilline par exemple comme décrit dans le brevet anglais 6430514, par addition à la fermentation de composés chimiques, dénommés "précurseurs"o La structure de la pénicilline ainsi obtenue peut être exprimée par la formule cgH10o3NS-NHCO-R dans la- quelle R représente les différents radicaux introduits.
Or, on a découvert que les pénicillines qui correspondent à la formule générale C8H10O3 NS-NHCO-(R1X)n -R2 où R1 représente un radical aliphatique bivalent, éventuellement substitué, X de l'oxygène, du soufre ou le groupe NH, n un nombre entier de 1à 5 et R2 un radical ali- phatique, araliphatique et/ou aromatique,éventuellement substitué, se distinguent typiquement des pénicillines normales G, X, F et K au point de vue de leurs propriétés.
On a établi que, contrairement aux pénicillines normales, les pénicillines de cette formule possèdent une stabilité absolument inattendue et élevée dans différentes conditions, et avant tout à Inaction des acideso Il a été constaté que des pénicillines ayant la structure indiquée ci-dessus n'accusent absolument aucune réduction de leur activité au cours de 48 heures à un pH de 1 à 2 et à 24 c alors que par exemple la pénicilline G pure a une durée de demi-vie de 18 minutes seulement à un pH de 2,1 et à 24 C.
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Basé sur ces nouvelles découvertes,le procédé conformeà l'invention consiste essentiellement en ce que, en partant des solutions brutes obtenues par fermentation ou des solutions aqueuses résultant du traitement ultérieur des solutions brutes, qui contiennent des pénicillines avant la formule générale C8H1003 NS-NHCO-(R1X)n-R2où R1 représente un radical aliphatique bivalent, éventuellement substitué, X de l'oxygène, du soufre ou un groupe -NH, n.
un nombre entier compris entre l et 5 et R2 un radi- cal aliphatique, araliphatique ou aromatique, pouvant éventuellement être substitué, on sépare ces pénicillines sous forme d'acides libres, par exemple en les préparant à partir des solutions aqueuses (solution brute ou échelons d'extraction aqueuse) par précipitation par des acides ou en les transformant en solutions dans des solvants organiques en présence d' acides et en les isolant par évaporation du solvant. La séparation des pénicillines désignées ci-dessus sous forme de leurs acides libres peut être suivie d'une nouvelle purification dans le but de séparer les acides "précurseurs" qui les accompagnent, par exemple par lavage à l'eau, reprécipitation, etc.
Mais on peut également purifier des solutions avant de séparer les acides libres de pénicilline par élimination d'impuretés, en particulier des quantités d'acides "précurseurs"o Suivant le procédé de 1' invention, on arrive pour la première fois à obtenir des pénicillines sous forme d'acides libres de forme cristalline bien définie. Les acides séparés possèdent par conséquent des points de fusion nets; ils ne sont que peu solubles dans l'eau, mais se dissolvent facilement dans des solutions tampons à un pH de 7,2, par exemple, en formant des sels.
Le procédé conforme à l'invention s'est montré particulièrement approprié à l'obtention de phénoxyméthylpénicilline C8H1003NSNHCO-CH2OC6H5 qui se forme en utilisant du bêta-phénoxyéthanol ou de l'acide phénoxyacétique comme "précurseur", les acides libres séparés par le procédé conforme à l'invention ayant un point de fusion de 120 à 128 C. On peut également obtenir de cette façon sous forme d'acide cristallisé la p-oxy-phénoxyméthyl- pénicilline en utilisant comme "précurseur" du p-oxy-bêta-phénoxyéthanol ou de l'acide p-oxyphénoxyacétique.
Pour l'exécution du procédé conforme à l'invention, on sépare par exemple sous forme cristallisée insoluble les pénicillines de la formule citée ci-dessus à partir des solutions aqueuses brutes ou des échelons d'extraction aqueuse en utilisant des "précurseurs", au cours de la fermentation, par acidification au moyen d'acides minéraux à un pH inférieur à 2, par exemple à un pH compris entre 1,5 et 1,8 et on les purifie en outre par lavage à l'eau, de manière à éliminer en même temps les acides "précurseurs" présents ou leurs sels. L'application d'une précipitation acide de ce genre à la pénicilline G aboutirait à une destruction complète et à la formation de produits de décomposition inactifs au point de vue biologique.
En séparant les acides libres des pénicillines citées par extraction par des solvants organiques en présence d'acides-mode opératoire ne pouvant pas non plus être appliqué à des solutions de pénicilline G- on choisit de préférence comme agents d'extraction des solvants organiques qui absorbent difficilement les acides "précurseurs", mais qui en revanche absorbent très facilement la pénicilline, de sorte qu'on obtient la pénicilline sous forme d'acide à l'état libre pur après évaporation du solvant organique et lavage supplémentaire à l'eau.
Par exemple, quand on utilise comme "précurseur" du bêta-phénoxyéthanol, qui s'oxyde en acide phénoxyacétique pendant la fermentation aérobique, ou bien l'acide phénoxyacétique lui-même, on peut opérer en utilisant comme agent d'extraction du chloroforme, solvant pour lequel existent comparativement à la phase aqueuse, de grandes différences des rapports de répartition de l'acide phénoxyacétique et de la phénoxyméthylpénicilline formée. Ainsi, par exemple, 1'
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acide phénoxyacétique possède, à un pH de 2,1 et 24 C un coefficient de répartition de 0,48 pour autant qu'on utilise les phases chloroforme et eau dans le rapport 1 : 1.
(Pour un rapport de 6 parties d'eau: 1 partie de chloroforme, ce coefficient s'élève à 2,3)a En revanche, la phénoxyméthylpéicilline, d'après son insolubilité dans l'eau au pH 2,1 et sa grande solubilité dans le chloroforme, possède un coëfficient tellement faible que si on extrait la phase aqueuse par du chloroforme, la phénoxyméthylpénicilline passe dans le chloroforme tandis que l'acide phénoxy.acétique demeure en majeure partie dans la phase aqueusea Mais si on fait passer des pénicillines de ce genre en présence d'acides dans des solvants organiques qui absorbent les acides libres présents, ce qui est par exemple le cas quand on utilise du butanol pour l'extraction de la phase aqueuse, on sépare tout d'abord par distillation azéotropique le mélange butanol-eau,
puis les mélanges de butanol devenant toujours plus pauvres en eau (par exemple dans le vide) de sorte que les pénicillines actives demeurent sous forme d'acides libres, mais accompagnées des acides "précurseurs" parce que ces acides, tels que l'acide phénoxyacétique (PK=3,25) possèdent des valeurs du pK analogues à celui de la pénicilline elle-même (pK = 3,12 pour la phénoxyméthylpénicilline). Les acides de pénicilline obtenus par précipitation ou évaporation du solvant sont donc, si on le désire, purifiés par des extractions ou lavages répétés à l'eau ou analogue des aeides "précurseurs" qui les accompagnent et qui sont absorbés par l'eau, tandis que les acides des pénicillines restent pratiquement non-dissous.
On peut encore obtenir les pénicillines du genre décrit de façon connue en soi sous forme d'alcalipénicillines à partir des solutions brutes, purifier les alcalipénicillines séparées rendues impures par les sels alcalins des acides "précurseurs" et les obtenir sous forme d'acides:libres si on dissout les sels alcalins dans l'eau et si on précipite les acides de pénicilline par des acides, tels que l'acide chlorhydrique, de manière que les acides "précurseurs" demeurent en solution, en utilisant des quantités correspondantes d'eau.
On peut en outre faire passer des sels des pénicillines de la solution brute dans le chloroforme en plusieurs échelons d'extraction, éliminer par lavage à l'eau des acides "précurseurs" présents, puis transférer les pénicillines dans une solution aqueuse de tampon (pH 7,2) en présence d'acides à un pH de 1,8, par exemple dans l'acétate de butyle ou l'acétate d'amyle et obtenir les acides libres par évaporation du solvant.
En outre, les solutions brutes et les fractions d'extraction peuvent être purifiées par addition de sels alcalino-terreux, par exemple des sels de baryum, du fait que les sels de baryum des pénicillines considérées ici sont solubles dans l'eau, tandis que ceux des acides "précurseurs" sont difficilement solubles à insolubles dans l'eau (par exemple, le phénoxyacétate de baryum se dissout à raison de 1,4 gr. dans 100 cm3 d'eau à 20 C).
Enfin, on peut faire passer les pénicillines dans des solvants organiques, comme par exemple l'acétate de butyle, et les précipiter de cette solution sous forme de sels alcalins, par exemple sous forme de sels de potassium, au moyen de solution alcoolique anhydre d'acétate de potassium; les acides libres de ces pénicillines peuvent alors être précipités des solutions aqueuses des sels de potassium au moyen d'acides minéraux, comme l'acide chlorhydrique. Ce procédé peut également s'appliquer sans précipitation préalable des acides présents par des sels alcalino-terreux, de façon générale à la purification des solutions des sels de pénicilline ou des acides libres de pénicilline dans des solvants organiques.
Les pénicillines obtenues sous forme d'acides libres, peuvent ensuite, si on le désire, être transformées également en sels alcalins
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ou alcalino-terreux,par exemple par dissolution dans une quantité équivalente de lessive et séchage lyophile ou précipitation des pénicillines dissoutes dans des solvants organiques, par exemple l'acétate de butyle, par des sels alcalins d'acides organiques, par exemple par l'acétate de potassium en présence d'un solvant polaire anhydre, par exemple l'éthanol.
On peut également transformer les sels alcalins par exemple en aluminiumpénicillines au moyen de sels d'aluminium en solution aqueuse.
EXEMPLES.
On utilise pour la fermentation une solution alimentaire de culture ayant la composition suivante : 0,01 % FeSO . 7 H 0
4 2 0,4 % H PO
3 4
0,025% MnSO .H 0
4 2 0,01 % C aCl
2 3.0 % lactose 1,0 % glucose
On opère dans un ballon à aération de 5 litres, dans lequel on introduit 2 litres de solution de culture. Celle-ci se compose de la solution de culture d'origine et de sources d'azote variant suivant les exemples individuels, ainsi que de différents "précurseurs .La quantité d'air s'élève à environ 1 litre par minute et par litre de solution de culture.
Solution de culture 1.-
1700 cm3 de solution de culture d'origine
300 cm3 d'autolysat de levure pressée ( à 10 gr/N/litre) 0.075% bêta-phénoxyéthanol
Durée de fermentation: 7 jours température de fermentation : 24 C
Teneur en pénicilline obtenue : 2200 O.E/cm3 (essai biolo- gique)
1466 O.E./Cm3 (par iodomé- trie).
Solution de culture 2.-
1850 cm3 de solution de culture d'origine
150 cm3 de liqueur d'imbitition de grain ( à 40 gr. azote/ litre)
0,05% p-oxy-bêta-phénoxyéthanol durée de fermentation : 7 jours
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Température de fermentation 24 C
Teneur en pénicilline obtenue :1660 O.E./cm3 (essai biologique) Solution de culture 3.-
1800 cm3 de solution de culture d'origine
200 cm3 autolysat de levure de bière (à 20 gr. azote/litre)
0,2 % d'acide phénoxyacétique.
Durée de fermentation 7 jours
Température de fermentation : 24 C
Teneur en pénicilline obtenue :2150 O.E/cm3 (essai biologique
1432 O.E/cm3 (par iodométrie) Solution de culture 4.-
1750 cm3 de solution de culture d'origine.
280 cm3 autolysat de levure pressée 0.08 % bêta-phénoxyéthanol
Durée de fermentation : 6 jours
Température de fermentation : 24 C
Teneur en pénicilline obtenue 2800 O.E/Cm3 (essai biologique)
1853 O.E./cm3 (par iodométrie) Solution de culture 5.-
1750 cm3 de solution de culture d'origine
300 cm3 autolysat de levure de bière
EMI5.1
0,076 % bêta-phénoxyéthanoi.
Durée de fermentation 7 jours
Température de fermentation : 24 C
Teneur en pénicilline obtenue2500 O.E./cm3 (essai biologique)
1704 O.E./cm3 (par iodométrie) Solution de culture 60-
1800 cm3 de solution de culture d'origine
200 cm3 autolysat de levure de bière 0,2 % d'acide phénoxyacétique
Durée de fermentation :7 jours
Température de fermentation :24 C
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Teneur en pénicilline obtenue : 2150 O.E/cm3 (essai biologique)
1432 O.E/cm3 (par iodométrie).
En utilisant les mêmes solutions de culture mais sans employer l'acide phénoxyacétique comme "précurseur" dans les mêmes conditions de fermentation, on n'obtient que des teneurs en pénicillines de 400 à 500 O. E./mc3.
Des essais en grand, dans des appareils de fermentation normaux, aboutissent à des résultats analogues, pour des durées de fermentation notablement plus courtes et pratiquement égales à celles de la production normale de pénicilline en grand (3 à 4 jours). Suivant la présente invention, on peut extraire comme suit les acides libres à partir des solutions brutes produites après la fermentation, en utilisant les solutions de culture citées ci-dessus ou des solutions de cultures analogues, au moyen de "précurseurs" du type COOH-(R1X)n-R2 ou respectivement CH2OH-(R1X)n -R2, où R1' X, R2 et n ont la signification donnée au début, comme par exemple l'acide phénoxyacétique, l'acide phénoxymercapoacétique C6H5SCH2COOh, l'acide p-oxyphénoxyacétique (HOC6H4(OCH2)COOH), l'acide p-nitrophénoxyacétique (NO2C6H4OCH2COOH) ou respectivement le phénoxyéthanol et analogues:
I. - Précipitation des acides de pénicilline libres de solutions aqueuses par des acides minéraux.
On acidifie 600 cm3 de phase aqueuse de pénicilline à 47.000 O.E./cm3 (déterminés par iodométrie) à un pH de 1,5 dans un rapport d'acide de 1 : 0,9.On filtre la pénicilline libre séparée, on la lave à l'eau et on la sèche.
Productions: 15,24 gr. de phénoxyméthylpénicilline à 1673 O.E/mg ou respectivement 14,78 gr p-oxyphénoxyméthyl-pénicilline à 1600 O.E/mg (essai iodométrique).
On peut effectuer la transformation ultérieure en sels de pénicillines, par exemple comme suit: a) On dissout 7,62 gr de l'acide de pénicilline obtenu à 1673 O.E/mgr dans 230 cm3 de butanol et on précipite la pénicilline par addition de 42 cm3 de solution d'acétate de potassium 0,7 molaire.
Production: 8,08 gr de phénoxyméthylpénicilline de potassium à 1500 O.E./mgr (essai iodométrique). b) On neutralise 7,62 gr d'acide de pénicilline à 1673 O.E./ mgr par de la potasse caustique 1/2 N. Par addition de 30 cm3 de solution à 10% de AlCl3 . 6 H2 0, on sépare la phénoxyméthylpéniciline d'aluminium.
Production: 6,95 gr à1600 O.E./mg (essai iodométrique).
II.- Extraction du filtrat de culture ¯par le chloroforme, en -laissant dans la phase aqueuse les composés accompagnant la pénicilline : évaporation subséquente duchloroforme.
On transfert dans 500 cm3 de chloroforme 3 1. de filtrat de cul-
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ture déprotéiné et filtré à 1200 O.E./cm3 (essai iodométrique) par acidification au pH 2,1 On effectue ensuite l'extraction par un tampon, puis de nouveau par du chloroforme, et ainsi de suite, et on obtient finalement 50 cm3 de phase chloroforme à 63a400 O.E/cm3. L'indice d'acide est de 1,21, ce qui correspond à un rapport d'acide de 1 : 0,15seulement. On obtient la pénicilline sous forme d'acide, à partir de la phase chloroforme, par évaporation du solvant. On obtient de cette manière 1,90 gr de phénoxyméthylpénicilline sous forme d'acide à 1500 O.E./mgr.
On effectue une purification supplémentaire par mise en suspension dans 100 cm3 d'eau et aspiration de la pénicilline ainsi purifiée.
Production: 1,75 gr d'acide de pénicilline à 1690 O.E./ mgr (essai iodométrique).
III. - Extraction et purification poussée de la phénoxyméthyl pénicilline par précipitation de l'acide phénoxyacétique. sous forme de sel de baryum.
On fait passer la pénicilline (1053 O.E./cm3, essai iodométrique) contenue dans 1450 litres de filtrat de culture déprotéiné, par extraction à contre-courant avec réduction de volume (1er étage : 1 : 4; 2ème étage : 1 : 3 ; 3ème étage : 1 : 2) dans de l'acétate de butyle au pH 2,1, puis de nouveau dans une solution tampon au pH 7,2 puis de nouveau dans 1' acétate de butyle à 2,1. On obtient 60 1. de phase acétate de butyle contenant 23,715 O.E./cm3 (essai iodométrique); indice d'acide : 2,57, ce qui correspond à un rapport d'acide de 1:5.6. On fait passer la pénicilline de la phase acétate de butyle à la phase aqueuse (pH 7,2) par NaOH; volume final 20 1.
On traite cette solution aqueuse par 1,7 Kgr de BaC12. 2H2O et le phénoxyacétate de baruym précipité. Après un repos d'une heure, on sépare le précipité par aspiration et on le lave avec 5 litres d'eau.
On traite les filtrats réunis par 35 1. d'acétate de butyle, on les porte au pH 2 par de l'acide sulfurique, et on fait ainsi passer la pénicilline dans le solvant organique. On sèche la phase acétate de butyle au moyen de sulfate de sodium, on filtre et on extrait le sulfate de sodium par lavage avec un peu d'acétate de butyle. La phase acétate de butyle a un indice d'acide de 1,00; essai iodométrique 37.700 O.E/cm3.
Volume final 37 1. Le rapport d'acide atteint par conséquent 1 : 0.58.
La réduction du rapport d'acide de 1 : 5,6 à 1 : 0,58 atteste une séparation tellement poussée de l'acide phénoxyacétique qu'on peut précipiter directement la pénicilline de la phase d'acétate de butyle par une solution d'acétate de potassium.
On obtient de cette façon 986 gr de pénicilline de potassium à 1310 unités Oxford/mg. Pour le purifier davantage, on dissout le produit dans 25 1 d' eau et on sépare l'acide libre par acidification au pH 1,5.
Production: 748 gr d'acide de pénicilline à 1685 O.E./mgr.
Les pénicillines du genre décrit, produites conformément à 1' invention pour la première fois sous forme d'acides libres cristallisés,. très stables, à propriétés définies, présentent une activité approximativement théorique. Par exemple, la phénoxyméthylpénicilline et la p-oxy- phénoxyméthylpénicilline, qui portent par conséquent sur la chaine latérale des atomes à paires d'électrons uniques ou respectivement un groupe méthylène activé, se montrent biologiquement plus actives dans un essai in vitro que la pénicilline G à 1667 O.E./mgr. Ceci se confirme du fait que les activités évaluées par essais biologiques sont la plupart du temps notablement plus élevées que les valeurs trouvées par des essais iodométriques.
Ainsi par exemple la phénoxyméthylpénicilline accuse contre le Staphylococcus aureus une activité environ 50% supérieure à celle de son activité iodométrique.
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La stabilité des acides et en général la stabilité accrue dans différentes conditions, auxquelles appartiennent également la longue stabi- lité pratiquement illimitée à l'état solide à la température ordinaire, laisse apparaître les acides de pénicilline libres obtenus conformément à l'invention comme particulièrement appropriés à la thérapie orale et à la thérapie de pénicilline de dépôt. Ils ne sont pas toxiques, et accusent une efficacité antibactérienne élevée.
Alors que les pénicillines norma- les sont détruites pour la plus grande partie dans l'estomac, et ne sont aptes à traverser l'estomac sans perte notable de leur activité qu'en ajoutant de grandes quantités de tampons, les acides de pénicilline tra- versent l'estomac et parviennent aux portions résorbantes de l'intestin sans aucune addition d'agents de stabilisation et avec une activité pra- tiquement inchangéeDe nombreux essais effectués sur des animaux et des hommes, démontrent l'efficacité de ces pénicillines en particulier pour les applications orales.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé d'obtention de pénicillines stables, convenant particulièrement bien à la thérapie orale, caractérisé en ce qu'on sé- pare ces pénicillines sous forme d'acides libres, à partir des solu- tions brutes obtenues à la fermentation ou à partir des solutions aqueu- ses obtenues à la suite du traitement ultérieur des solutions brutes, contenant des pénicillines de formule générale C8H1003 NS-NHCO-(R1X)n- R2 dans laquelle R1 représente un radical aliphatique bivalent, éven- tuellement substitué, X de l'oxygène,du soufre ou un groupe NH, n un nombre entier de 1 à 5 et R un radical aliphatique, araliphatique ou aromatique pouvant éventuellement être substitué, par exemple en produi- sant ces pénicillines à partir de solutions aqueuses (solutions brutes ou fractions d'extraction aqueuses) par précipitation par des acides,
ou en les faisant passer de ces solutions dans des solvants organiques en présence d'acides, et en les séparant par évaporation du solvant.
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PROCESS FOR OBTAINING STABLE PENICILLINS SUITABLE PARTICULARLY WELL
TO ORAL THERAPY.
Processes for the preparation by biosynthesis of penicillins which differ by the nature of the side chain of normal penicillins G, X, F and K, studied and applied in the clinic, have already been developed in large numbers. The introduction of the desired radicals into the penicillin molecule is carried out, for example as described in English patent 6430514, by addition to the fermentation of chemical compounds, called "precursors". The structure of the penicillin thus obtained can be expressed by the formula cgH10o3NS-NHCO-R in which R represents the various radicals introduced.
However, it has been discovered that the penicillins which correspond to the general formula C8H10O3 NS-NHCO- (R1X) n -R2 where R1 represents a divalent aliphatic radical, optionally substituted, X of oxygen, sulfur or the NH, n group an integer of 1 to 5 and R2 an aliphatic, araliphatic and / or aromatic radical, optionally substituted, are typically distinguished from the normal penicillins G, X, F and K from the point of view of their properties.
It has been established that, unlike normal penicillins, the penicillins of this formula possess an absolutely unexpected and high stability under different conditions, and above all against the inaction of acids. It has been found that penicillins having the structure indicated above do not exhibit absolutely no reduction in their activity over 48 hours at pH 1 to 2 and 24 c whereas for example pure penicillin G has a half-life of only 18 minutes at pH 2.1 and 24 C.
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Based on these new findings, the process according to the invention consists essentially in that, starting with crude solutions obtained by fermentation or aqueous solutions resulting from the subsequent treatment of crude solutions, which contain penicillins before the general formula C8H1003 NS-NHCO - (R1X) n-R2 where R1 represents a divalent aliphatic radical, optionally substituted, X of oxygen, sulfur or a group -NH, n.
an integer between 1 and 5 and R2 an aliphatic, araliphatic or aromatic radical which can optionally be substituted, these penicillins are separated in the form of free acids, for example by preparing them from aqueous solutions (crude solution or stages of aqueous extraction) by precipitation with acids or by transforming them into solutions in organic solvents in the presence of acids and isolating them by evaporation of the solvent. The separation of the penicillins designated above in the form of their free acids can be followed by a further purification with the aim of separating the "precursor" acids which accompany them, for example by washing with water, reprecipitation, etc.
But it is also possible to purify solutions before separating the free acids from penicillin by removing impurities, in particular quantities of "precursor" acids. According to the process of the invention, it is possible for the first time to obtain penicillins. as free acids of well-defined crystalline form. The acids separated therefore have clear melting points; they are only slightly soluble in water, but dissolve easily in buffer solutions at a pH of 7.2, for example, forming salts.
The process according to the invention has been shown to be particularly suitable for obtaining phenoxymethylpenicillin C8H1003NSNHCO-CH2OC6H5 which is formed using beta-phenoxyethanol or phenoxyacetic acid as "precursor", the free acids separated by the process according to the invention. according to the invention having a melting point of 120 to 128 C. In this way, p-oxy-phenoxymethyl-penicillin can also be obtained in the form of crystalline acid, using p-oxy-beta-phenoxyethanol as "precursor" or p-oxyphenoxyacetic acid.
For carrying out the process according to the invention, for example, the penicillins of the formula mentioned above are separated in insoluble crystalline form from the crude aqueous solutions or stages of aqueous extraction using "precursors", during fermentation, by acidification with mineral acids at a pH below 2, for example at a pH between 1.5 and 1.8 and they are further purified by washing with water, so as to at the same time remove the "precursor" acids present or their salts. Applying such an acid precipitation to penicillin G would result in complete destruction and the formation of biologically inactive decomposition products.
By separating the free acids from the penicillins mentioned by extraction with organic solvents in the presence of acids - a procedure which cannot be applied to solutions of penicillin G - either, it is preferable to choose as extraction agents organic solvents which absorb "precursor" acids with difficulty, but which, on the other hand, absorb penicillin very easily, so that penicillin is obtained in the form of acid in the pure free state after evaporation of the organic solvent and additional washing with water.
For example, when beta-phenoxyethanol, which oxidizes to phenoxyacetic acid during aerobic fermentation, or phenoxyacetic acid itself, is used as a "precursor", it is possible to operate using chloroform as an extractant. solvent for which, compared to the aqueous phase, there are large differences in the distribution ratios of phenoxyacetic acid and of the phenoxymethylpenicillin formed. So, for example, 1 '
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Phenoxyacetic acid has, at a pH of 2.1 and 24 ° C, a partition coefficient of 0.48, provided that the chloroform and water phases are used in the ratio 1: 1.
(For a ratio of 6 parts of water: 1 part of chloroform, this coefficient is 2.3) a On the other hand, phenoxymethylpeicillin, according to its insolubility in water at pH 2.1 and its high solubility in chloroform, has such a low coefficient that if the aqueous phase is extracted with chloroform, the phenoxymethylpenicillin passes into chloroform while the phenoxy.acetic acid remains for the most part in the aqueous phasea But if we pass penicillins of this kind in the presence of acids in organic solvents which absorb the free acids present, which is the case, for example, when butanol is used for the extraction of the aqueous phase, the water is first separated by azeotropic distillation. butanol-water mixture,
then the mixtures of butanol becoming increasingly poor in water (for example in a vacuum) so that the active penicillins remain in the form of free acids, but accompanied by the "precursor" acids because these acids, such as phenoxyacetic acid (PK = 3.25) have pK values analogous to that of penicillin itself (pK = 3.12 for phenoxymethylpenicillin). The penicillin acids obtained by precipitation or evaporation of the solvent are therefore, if desired, purified by repeated extractions or washings with water or the like of the "precursor" aids which accompany them and which are absorbed by water, while that the acids in penicillins remain practically undissolved.
It is also possible to obtain the penicillins of the type described in a manner known per se in the form of alkalipenicillins from crude solutions, to purify the separated alkalipenicillins rendered impure by the alkaline salts of the "precursor" acids and to obtain them in the form of: free acids if the alkali salts are dissolved in water and if the penicillin acids are precipitated by acids, such as hydrochloric acid, so that the "precursor" acids remain in solution, using corresponding amounts of water.
It is also possible to pass the salts of the penicillins from the crude solution in chloroform in several stages of extraction, to wash off the "precursor" acids present by washing with water, then to transfer the penicillins into an aqueous buffer solution (pH 7.2) in the presence of acids at a pH of 1.8, for example in butyl acetate or amyl acetate, and obtain the free acids by evaporation of the solvent.
In addition, crude solutions and extraction fractions can be purified by adding alkaline earth salts, for example barium salts, since the barium salts of the penicillins considered here are soluble in water, while those of the "precursor" acids are hardly soluble to insoluble in water (for example, barium phenoxyacetate dissolves in an amount of 1.4 g. in 100 cm3 of water at 20 ° C.).
Finally, the penicillins can be passed through organic solvents, such as for example butyl acetate, and precipitated from this solution in the form of alkali salts, for example in the form of potassium salts, by means of an anhydrous alcoholic solution of potassium acetate; the free acids of these penicillins can then be precipitated from the aqueous solutions of the potassium salts by means of mineral acids, such as hydrochloric acid. This process can also be applied without prior precipitation of the acids present by alkaline earth salts, in general for the purification of solutions of the salts of penicillin or of the free acids of penicillin in organic solvents.
The penicillins obtained in the form of free acids can then, if desired, also be converted into alkali salts
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or alkaline earth, for example by dissolving in an equivalent amount of lye and lyophilic drying or precipitation of penicillins dissolved in organic solvents, for example butyl acetate, by alkali salts of organic acids, for example by potassium acetate in the presence of an anhydrous polar solvent, for example ethanol.
It is also possible to convert the alkali metal salts, for example into aluminum penicillins, by means of aluminum salts in aqueous solution.
EXAMPLES.
A food culture solution having the following composition is used for fermentation: 0.01% FeSO. 7:00 a.m.
4 2 0.4% H PO
3 4
0.025% MnSO .H 0
4 2 0.01% C aCl
2 3.0% lactose 1.0% glucose
The operation is carried out in a 5-liter aeration flask, into which 2 liters of culture solution are introduced. This consists of the original culture solution and nitrogen sources varying according to the individual examples, as well as various "precursors. The quantity of air amounts to approximately 1 liter per minute and per liter of culture solution.
Culture solution 1.-
1700 cm3 of original culture solution
300 cm3 of pressed yeast autolysate (at 10 gr / N / liter) 0.075% beta-phenoxyethanol
Fermentation time: 7 days fermentation temperature: 24 C
Penicillin content obtained: 2200 O.E / cm3 (biological test)
1466 O.E./Cm3 (by iodometry).
Culture solution 2.-
1850 cm3 of original culture solution
150 cm3 of grain imbitition liquor (at 40 gr. Nitrogen / liter)
0.05% p-oxy-beta-phenoxyethanol fermentation time: 7 days
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Fermentation temperature 24 C
Penicillin content obtained: 1660 O.E./cm3 (biological test) Culture solution 3.-
1800 cm3 of original culture solution
200 cm3 autolyzed brewer's yeast (at 20 gr. Nitrogen / liter)
0.2% phenoxyacetic acid.
Fermentation time 7 days
Fermentation temperature: 24 C
Penicillin content obtained: 2150 O.E / cm3 (biological test
1432 O.E / cm3 (by iodometry) Culture solution 4.-
1750 cm3 of original culture solution.
280 cm3 pressed yeast autolysate 0.08% beta-phenoxyethanol
Fermentation time: 6 days
Fermentation temperature: 24 C
Penicillin content obtained 2800 O.E / Cm3 (biological test)
1853 O.E./cm3 (by iodometry) Culture solution 5.-
1750 cm3 of original culture solution
300 cm3 autolyzed brewer's yeast
EMI5.1
0.076% beta-phenoxyethanol.
Fermentation time 7 days
Fermentation temperature: 24 C
Penicillin content obtained 2500 O.E./cm3 (biological test)
1704 O.E./cm3 (by iodometry) Culture solution 60-
1800 cm3 of original culture solution
200 cm3 autolyzed brewer's yeast 0.2% phenoxyacetic acid
Fermentation time: 7 days
Fermentation temperature: 24 C
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Penicillin content obtained: 2150 O.E / cm3 (biological test)
1432 O.E / cm3 (by iodometry).
By using the same culture solutions but without using the phenoxyacetic acid as "precursor" under the same fermentation conditions, only penicillin contents of 400 to 500 O. E./mc3 are obtained.
Large trials, in normal fermentation apparatus, give similar results, for fermentation times markedly shorter and nearly equal to those of normal production of penicillin on a large scale (3 to 4 days). According to the present invention, the free acids can be extracted as follows from the crude solutions produced after fermentation, using the culture solutions mentioned above or solutions of analogous cultures, by means of "precursors" of the COOH- type. (R1X) n-R2 or respectively CH2OH- (R1X) n -R2, where R1 'X, R2 and n have the meaning given at the start, such as for example phenoxyacetic acid, phenoxymercapoacetic acid C6H5SCH2COOh, p acid -oxyphenoxyacetic (HOC6H4 (OCH2) COOH), p-nitrophenoxyacetic acid (NO2C6H4OCH2COOH) or respectively phenoxyethanol and the like:
I. - Precipitation of free penicillin acids from aqueous solutions by mineral acids.
600 cm3 of aqueous penicillin phase is acidified at 47,000 EO / cm3 (determined by iodometry) to a pH of 1.5 in an acid ratio of 1: 0.9. The free penicillin separated is filtered off, washed with water and it is dried.
Productions: 15.24 gr. of phenoxymethylpenicillin at 1673 O.E / mg or respectively 14.78 gr p-oxyphenoxymethyl-penicillin at 1600 O.E / mg (iodometric test).
The subsequent transformation into penicillin salts can be carried out, for example as follows: a) 7.62 g of the penicillin acid obtained at 1673 EO / mgr are dissolved in 230 cm3 of butanol and the penicillin is precipitated by adding 42 cm3 of 0.7 molar potassium acetate solution.
Production: 8.08 g of potassium phenoxymethylpenicillin at 1500 O.E./mgr (iodometric test). b) 7.62 g of penicillin acid at 1673 O.E. / mgr are neutralized with 1/2 N caustic potassium hydroxide. By adding 30 cm3 of 10% AlCl3 solution. 6 H2 0, the aluminum phenoxymethylpenicilin is separated.
Production: 6.95 gr at 1600 O.E./mg (iodometric test).
II.- Extraction of the culture filtrate ¯ by chloroform, leaving the compounds accompanying the penicillin in the aqueous phase: subsequent evaporation of the chloroform.
The mixture is transferred to 500 cm3 of 3 l chloroform.
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ture deproteinized and filtered at 1200 EO / cm3 (iodometric test) by acidification to pH 2.1 The extraction is then carried out with a buffer, then again with chloroform, and so on, and finally 50 cm3 of phase is obtained chloroform at 63a400 OE / cm3. The acid number is 1.21, which corresponds to an acid ratio of only 1: 0.15. Penicillin is obtained in the form of acid, from the chloroform phase, by evaporation of the solvent. In this way, 1.90 g of phenoxymethylpenicillin are obtained in the form of an acid at 1500 O.E./mgr.
Further purification is carried out by suspending in 100 cm3 of water and aspirating the penicillin thus purified.
Production: 1.75 gr of penicillin acid at 1690 O.E. / mgr (iodometric test).
III. - Extraction and extensive purification of phenoxymethyl penicillin by precipitation of phenoxyacetic acid. in the form of barium salt.
Penicillin (1053 EO / cm3, iodometric test) contained in 1450 liters of deproteinized culture filtrate is passed by countercurrent extraction with volume reduction (1st stage: 1: 4; 2nd stage: 1: 3; 3rd stage: 1: 2) in butyl acetate at pH 2.1, then again in buffer solution at pH 7.2 and then again in butyl acetate at 2.1. 60 l of butyl acetate phase are obtained containing 23.715 O.E./cm3 (iodometric test); acid number: 2.57, which corresponds to an acid ratio of 1: 5.6. The penicillin is passed from the butyl acetate phase to the aqueous phase (pH 7.2) with NaOH; final volume 20 1.
This aqueous solution is treated with 1.7 kg of BaC12. 2H2O and precipitated baruym phenoxyacetate. After standing for one hour, the precipitate is removed by suction and washed with 5 liters of water.
The combined filtrates are treated with 35 l of butyl acetate, brought to pH 2 with sulfuric acid, and the penicillin is thus passed through the organic solvent. The butyl acetate phase is dried with sodium sulfate, filtered and the sodium sulfate is extracted by washing with a little butyl acetate. The butyl acetate phase has an acid number of 1.00; iodometric test 37,700 O.E / cm3.
Final volume 37 1. The acid ratio therefore reaches 1: 0.58.
The reduction of the acid ratio from 1: 5.6 to 1: 0.58 attests to such a thorough separation of the phenoxyacetic acid that the penicillin can be precipitated directly from the butyl acetate phase by a solution of potassium acetate.
In this way 986 g of potassium penicillin at 1310 Oxford units / mg are obtained. To further purify it, the product is dissolved in 25 l of water and the free acid is separated by acidification to pH 1.5.
Production: 748 gr of penicillin acid at 1685 O.E./mgr.
Penicillins of the type described, produced according to the invention for the first time in the form of crystallized free acids ,. very stable, with defined properties, exhibit an approximately theoretical activity. For example, phenoxymethylpenicillin and p-oxyphenoxymethylpenicillin, which therefore carry single electron pair atoms or respectively an activated methylene group in the side chain, are shown to be biologically more active in an in vitro test than penicillin G at 1667 OE / mgr. This is confirmed by the fact that the activities evaluated by biological tests are most of the time significantly higher than the values found by iodometric tests.
Thus, for example, phenoxymethylpenicillin shows against Staphylococcus aureus an activity approximately 50% greater than that of its iodometric activity.
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The stability of acids and in general the increased stability under different conditions, to which also belong the long practically unlimited stability in the solid state at room temperature, makes the free penicillin acids obtained according to the invention appear particularly suitable. to oral therapy and depot penicillin therapy. They are not toxic, and show a high antibacterial effectiveness.
While normal penicillins are mostly destroyed in the stomach, and are only able to pass through the stomach without noticeable loss of activity by adding large amounts of buffers, penicillin acids tra- pour out the stomach and reach the resorbent portions of the intestine without any addition of stabilizing agents and with a practically unchanged activity Numerous tests carried out on animals and humans, demonstrate the effectiveness of these penicillins in particular for oral applications.
CLAIMS.
1. - Process for obtaining stable penicillins, particularly suitable for oral therapy, characterized in that these penicillins are separated in the form of free acids, from the crude solutions obtained in fermentation or in from the aqueous solutions obtained following the subsequent treatment of the crude solutions, containing penicillins of general formula C8H1003 NS-NHCO- (R1X) n- R2 in which R1 represents a divalent aliphatic radical, optionally substituted, X of oxygen, sulfur or an NH group, n an integer from 1 to 5 and R an aliphatic, araliphatic or aromatic radical which can optionally be substituted, for example by producing these penicillins from aqueous solutions (crude solutions or aqueous extraction fractions) by precipitation with acids,
or by passing them from these solutions in organic solvents in the presence of acids, and by separating them by evaporation of the solvent.