BE1029075B1 - Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans. Die durch die Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure (protolichesterinic acid) hat eine gute Wirkung bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.
Description
Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans
TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Gebiet der Medizintechnik, insbesondere eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.
STAND DER TECHNIK Candida albicans ist ein konditionell pathogener Pilz, der den menschlichen Körper besiedelt. Wenn die Immunität des Körpers nachlässt, kann es zu systemischen Pilzinfektionen in den oberflächlichen Schleimhautschichten der Haut und sogar im ganzen Körper kommen. In den letzten 30 Jahren haben aufgrund des übermäßigen Einsatzes von Breitbandantibiotika, der weit verbreiteten Anwendung von Tumorchemotherapie, Organtransplantation und anderen Behandlungsmethoden sowie der Zunahme von Patienten mit Erkrankungen des Immunsystems die klinischen Infektionen durch Pilze immer intensiver zugenommen. Mit der weit verbreiteten Verwendung klinischer Antimykotika, insbesondere antibakterieller Medikamente, hat die Resistenz gegen Pilze weiter zugenommen und wird immer ernster. Das Auftreten solcher Resistenzen führt in der Regel zu Multiresistenzen, was der Behandlung klinischer Pilzinfektionen äußerst große Schwierigkeiten und sogar Behandlungsversagen bringt. Candida ist einer der am häufigsten vorkommenden konditionell pathogenen Pilze in der Klinik, und unter Candida ist Candida albicans das am häufigsten vorkommende Infektionsmodell des pathogenen Pilzes. Candida albicans ist dimorph, und die Hyphenform ist ein wichtiger Virulenzfaktor von Candida albicans und spielt eine wichtige Rolle im Prozess der pathogenen Infektion. Aufgrund dessen sind eine eingehende Erforschung und Entwicklung von Medikamenten, die die morphologische Transformation von Pilzen hemmen oder die Pilzresistenz umkehren können, von großer Bedeutung. Die Flechte ist ein symbiotischer Komplex aus Pilzen und Algen und unterscheidet sich sowohl von Pilzen als auch von Algen unterscheidet. Nephromopsis pallescens (Schaer.) Park, auch als Baumhaut genannt, ist eine Flechtenpflanze der Gattung Nephromopsis in der Familie der Parmeliaceae. Der Flechtenkörper ist mittelgroß, blattartig, hart und weist einen Durchmesser von 7-15 cm auf, nur die Unterseite der
Mittellappen haftet lose an dem Substrat an, und der Flechtenkörper dehnt sich rosettenförmig aus; die Oberseite ist hellgelb bis gelbgrün, mit starken Falten und ohne Puderknospen und rissige Knospen; die Unterseite ist hellgelb bis gelb-braun und mit starken Falten, weiße punktförmige falsche Becher werden auf den Kämmen geboren, und die falschen Wurzeln sind spärlich, und es haftet oft an den Stämmen von Kiefern und Eichen und Totholzpfählen an.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG Die vorliegende Erfindung stellt eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans zur Verfügung.
Um das Ziel zu erreichen, verwendet die vorliegende Erfindung die folgende technische Lösung: eine Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.
Die Protolichesterinsäure wird durch die folgenden Schritte hergestellt: 1) Das Nephromopsis pallescens wird zerkleinert und passiert ein 80-mesh-Sieb, um grobes Pulver zu erhalten; Zugeben von 78% Ethanol in grobem Pulver und Tränken für mehr als 24 Stunden, Extrahieren mit Ultraschall für 30 Minuten und Filtrieren, um ein Filtrat zu erhalten; wiederholtes Tränken, Extrahieren und Filtrieren des Filterrückstandes für 2 Male, Mischen von Filtraten von den 3 Malen und Konzentrieren, bis kein Alkoholgeschmack mehr vorhanden ist, um den Extrakt von Nephromopsis pallescens zu erhalten; 2) Verwenden einer chromatographischen Kieselgelsäule mit Normaldruck, um die Kieselgelsäulen-Chromatographie-Abscheidung der Protolichesterinsäure durchzuführen, Durchführen einer Gradientenelution mit Petrolether und Aceton, um ein Eluat zu erhalten; Verfeinern des Eluats, um eine Protolichesterinsäurelösung zu erhalten; 3) Nehmen der Protolichesterinsäurelösung als Probe und Verwenden des gemischten Lösungsmittels als mobile Phase, um die Kieselgelsäulen-Chromatographie- Abscheidung durchzuführen; Verwenden der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie- Detektion, um die Fraktion der Protolichesterinsäure zu erhalten; Legen der Fraktion der Protolichesterinsäure in eine gemischte Lösung von Petrolether und Aceton und Umkristallisieren, um die Protolichesterinsäure zu erhalten.
Im Schritt 1) beträgt die verwendete Menge vom Ethanol das 20-fache des Gewichts des groben Pulvers.
Im Schritt 2) beträgt während der Gradientenelution vom Petrolether und Aceton der Gradientenbereich des Volumenanteils vom Aceton 0-100%. Im Schritt 2) wird beim Verfeinern des Eluats das Eluat bei einer Temperatur von 55°C und dem Vakuumgrad von 0,08-0,09 MPa unter reduziertem Druck konzentriert. Im Schritt 3) beträgt der Durchmesser der Kieselgelsäule 30 mm, wobei die Kieselgelsäule mit 480 mL Kieselgel von 300-400 mesh gefüllt ist. Im Schritt 3) wird das gemischte Lösungsmittel aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 9:1:0,01 hergestellt. Im Schritt 3) wird während der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Detektion der Entwickler aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 7:3:0,1 hergestellt; wobei der Farbentwickler 15% konzentrierte Schwefelsäure-Ethanol- Lösung ist. Im Schritt 3) beträgt das Volumenverhältnis vom Petrolether und Aceton 7:3. Durch die vorliegende Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure hat eine Molekularformel von C19H3204 und ein Molekulargewicht von 324, wobei ihre Strukturformel wie folgt ist: Die vorliegende Erfindung hat folgende Vorteile: Die durch die Erfindung hergestellte Protolichesterinsäure (protolichesterinic acid) hat eine gute Wirkung bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans. Für spezifische Wirkungen wird Bezug auf Ausführungsbeispiele und Aktivitätsexperimente genommen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG Figur 1 zeigt ein 'H-NMR-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 2 zeigt ein ‘“C-NMR-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 3 zeigt ein ESI-MS-Spektrogramm der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 4 zeigt ein Diagramm der Prüfung der Reinheit der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure. Figur 5 zeigt ein Vergleichsdiagramm der Hemmwirkung der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellter Protolichesterinsäure auf die Wachstumsaktivität der Hyphe von Candida albicans.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG Im Zusammenhang mit Ausführungsbeispielen wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, dabei sollte es darauf hingewiesen werden, dass die folgende Beschreibung nur die vorliegende Erfindung erläutert, statt deren Inhalt zu beschränken.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Nephromopsis pallescens (Chuxiong, Provinz Yunnan, China) wurde freundlicherweise von Lisong Wang, einem leitenden Ingenieur vom Kunming Pflanzenforschungsinstitut der chinesischen Akademie der Wissenschaften bereitgestellt.
Ausführungsbeispiel 1 Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.
Die Protolichesterinsäure wird durch die folgenden Schritte hergestellt: Zerkleinern von 150 g Nephromopsis pallescens, die in Chuxiong, Provinz Yunnan, China, gesammelt wurden, anschließendes Passieren eines 80-mesh-Siebs, um grobes Pulver zu erhalten; Zugeben von 3L 78% Ethanol (Volumenfraktion, Ethanol-Wasser) in grobem Pulver und Tränken für mehr als 24 Stunden bei 25°C, Extrahieren mit Ultraschall für 30 Minuten und Filtrieren unter Normaldruck, um ein Filtrat zu erhalten; wiederholtes Extrahieren des Filterrückstandes für 2 Male mit 3L 78% Ethanol, Mischen von Filtraten von den 3 Malen und Konzentrieren, bis kein Alkoholgeschmack mehr vorhanden ist, um 70 g Extrakt von Nephromopsis pallescens zu erhalten; der Extrakt von Nephromopsis pallescens wird mit Kieselgel von 100-200 mesh gemischt und einer chromatographischen Abscheidung über eine Kieselgelchromatographiesäule (100-200 mesh Kieselgel, 60 x 600 mm) beim Normaldruck unterzogen, Durchführen einer Gradientenelution mit einem gemischten Lösungsmittel aus Petrolether und Aceton (der Gradientenbereich des Volumenanteils vom Aceton beträgt 0-100%)}, um ein Eluat zu erhalten; Konzentrieren des Eluats bei einer Temperatur von 55°C und dem Vakuumgrad von 0,08-0,09 MPa unter reduziertem Druck, Dünnschichtchromatographie-Detektion der Hauptkomponentenflecke und Mischen der Fraktionen der Hauptkomponentenflecke, um die Protolichesterinsäurelôsung zu erhalten: Nehmen der Protolichesterinsäurelôsung als Probe und Mischen mit Kieselgel von 100-200 mesh, Verwenden des gemischten Lösungsmittels (das gemischte Lösungsmittel wird aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 9:1:0,01 hergestellt) als mobile Phase, um eine Kieselgelsäulen-Chromatographie-Abscheidung durchzuführen; wobei der Durchmesser der Kieselgelsäule 30 mm beträgt, und wobei die Kieselgelsäule mit 480 mL Kieselgel von 300-400 mesh gefüllt ist, und wobei der
Entwickler aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 7:3:0,1 hergestellt ist; und wobei der Farbentwickler 15% konzentrierte Schwefelsäure- Ethanol-Lösung ist. Die Fraktionen mit dem gleichen Verhältnisverschiebungswert werden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, um die Fraktion der 5 Protolichesterinsäure zu erhalten; die Fraktion der Protolichesterinsäure wird mit Petrolether und Aceton (das Volumenverhältnis vom Petrolether und Aceton beträgt 7:3) gelöst, Stehenlassen, bis weiße Kristalle ausfällt, und wiederholtes Durchführen der Umkristallisation für 2 Male, um 0,45 g weiße kristalline Verbindung zu erhalten. Nach der HPLC-Analyse erreicht die Reinheit 97%, wie in Figur 4 dargestellt.
Die erhaltene weiße kristalline Verbindung wird analysiert, die Silikongel- Dünnschichtchromatographie (Petrolether:Aceton = 7:3) zeigt Rf = 0,54, beim Besprühen mit 15% konzentrierter Schwefelsäure-Ethanol-Lösung wird die lila Farbe entwickelt.
MS, m/z 324 (M-+1), und die Formel ist C1 9H3204. UV(MeOH), 218 nm (3,82). 1H- NMR (400MHz, Acetone-d6):6,27 (1H, d, J=3 Hz, C5-Hb), 5,98 (1H, d, J=3 Hz, C5-Ha), 4,78 (1H, ddd, J3-4=6 Hz, J6-7=6 Hz, C4-H), 3,80 (1H, M.C3-H) , 1,75 (2H, m, C2-H), 1,29 (22H, brs, C7-8-H), 0,88 (3H, m, C19-H);13C-NMR (100MHz, Acetone-d6):171, 89 (C-1), 136,19 (C-2), 51,17 (C-3), 80,79 (C-4), 125,17 (C-5), 169,55(C-6), 37,12 (C-7), 26,53 (C-8), 30,16-31,31 (C-9-17), 24,22 (C-18), 15,25 (C-19). Es ist bekannt, dass die Verbindung die Protolichesterinsäure ist.
Die *H-NMR-, 13C-NMR- und ESI-MS-Spektrogramme, die an der Identifizierung der Verbindung beteiligt sind, sind in Figuren 1 bis 3 dargestellt.
Aktivitätsversuch
1. Experimentelle Materialien: Candida albicans-Wildtyp-Stamm YEM30, Azol- resistenter Stamm CA10, RPMI1640-Kultursubstrat.
2. Experimentelle Methode
2.1 Resistenzumkehr Der über Nacht aktivierte Candida albicans CA10-Stamm wird mit RPMI1640- Kultursubstrat auf 2x 103 Zellen pro ML eingestellt, und die verdünnte Bakterienlösung wird verwendet, um eine Arbeitslôsung von Fluconazol (FLC) und der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure mit einem 2-fachen Konzentrationsgradienten zuzubereiten. Zugeben von 50 Mikroliter der doppelt konzentrierten FLC-Arbeitslôsung jedes Konzentrationsgradienten in jede Bohrung der 96-Bohrungs-Platte in den Spalten 1-11 und Zugeben von Arbeitslôsung mit der doppelten Konzentration der Protolichesterinsäure in die AG-Reihe, um eine gemischte Verabreichung von FLC und der Protolichesterinsäure mit der Schachbrettmethode zu realisieren, Kultivieren von 48 Stunden bei 35°C.
Das FICI-Modell wird verwendet, um die Wechselwirkung zu bewerten. FICI=MICAB/MICA+MICBA/MICB Dabei sind MICA und MICB die MIC-Werte, wenn die Arzneimittel A und B allein verwendet werden, und MICAB und MICB sind die Konzentrationen von A und B, die der Mindestdosis der kombinierten Verwendung der Arzneimittel entsprechen. FICI < 0,5, die Wechselwirkung vom Arzneimittel A und Arzneimittel B ist ein synergistischer Effekt.
2.2 Hemmung der Hyphenbildung Der über Nacht aktivierte Candida albicans YEM30-Stamm wird mit RPMI1640- Kultursubstrat auf 1x 10° Zellen pro mL eingestellt und in eine sterile 96-Bohrungs-Platte gegeben. Verschiedene Dosen der im Ausführungsbeispiel 1 hergestellten Protolichesterinsäure werden in einem Gradienten zugegeben, Kultivieren im stillen Zustand bei 37°C in 3, 6, 9 und 24 Stunden, Beobachten der Form des Pilzes mit einem Mikroskop.
3. Experimentelle Ergebnisse Wie in Figur 5 gezeigt, kann das in Ausführungsbeispiel 1 hergestellte Protolichesterinsäure die Bildung der Hyphen des Candida albicans YEM30-Stamms konzentrationsabhängig hemmen, wodurch die Virulenz von Candida albicans gehemmt wird; und die Verbindung wird mit Fluconazol in Kombination verwendet, um bei 4 ug/ml den MHK-Wert der klinischen Azol-resistenten Stämme 28A und 28D von 128 ug/ml auf 2 g/ml zu senden, was einen starken Effekt der Resistenzumkehr zeigt. Bei der Bewertung mit dem FICI-Modell beträgt der FIC-Wert 0,078, was viel weniger als 0,5 ist, was zeigt, dass die Kombination von der Protolichesterinsäure und dem Fluconazol eine starke synergistische antimykotische Wirkung hat.
Claims (9)
1. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans.
2. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protolichesterinsäure durch die folgenden Schritte hergestellt wird: 1) das Nephromopsis pallescens wird zerkleinert und passiert ein 80-mesh-Sieb, um grobes Pulver zu erhalten; Zugeben von 78% Ethanol in grobem Pulver und Tränken für mehr als 24 Stunden, Extrahieren mit Ultraschall für 30 Minuten und Filtrieren, um ein Filtrat zu erhalten; wiederholtes Tränken, Extrahieren und Filtrieren des Filterrückstandes für 2 Male, Mischen von Filtraten von den 3 Malen und Konzentrieren, bis kein Alkoholgeschmack mehr vorhanden ist, um den Extrakt von Nephromopsis pallescens zu erhalten; 2) Verwenden einer chromatographischen Kieselgelsäule mit Normaldruck, um die Kieselgelsäulen-Chromatographie-Abscheidung der Protolichesterinsäure durchzuführen, Durchführen einer Gradientenelution mit Petrolether und Aceton, um ein Eluat zu erhalten; Verfeinern des Eluats, um eine Protolichesterinsäurelösung zu erhalten; 3) Nehmen der Protolichesterinsäurelösung als Probe und Verwenden des gemischten Lösungsmittels als mobile Phase, um die Kieselgelsäulen- Chromatographie-Abscheidung durchzuführen; Verwenden der Kieselgel- Dünnschichtchromatographie-Detektion, um die Fraktion der Protolichesterinsäure zu erhalten; Legen der Fraktion der Protolichesterinsäure in eine gemischte Lösung von Petrolether und Aceton und Umkristallisieren, um die Protolichesterinsäure zu erhalten.
3. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 1) die verwendete Menge vom Ethanol das 20-fache des Gewichts des groben Pulvers beträgt.
4. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 2) während der Gradientenelution vom Petrolether und Aceton der Gradientenbereich des Volumenanteils vom Aceton 0-100% beträgt.
5. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 2) beim Verfeinern des Eluats das Eluat bei einer Temperatur von 55°C und dem Vakuumgrad von 0,08-0,09 MPa unter reduziertem Druck konzentriert wird.
6. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 3) der Durchmesser der Kieselgelsäule 30 mm beträgt, wobei die Kieselgelsäule mit 480 mL Kieselgel von 300-400 mesh gefüllt ist.
7. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 3) das gemischte Lösungsmittel aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 9:1:0,01 hergestellt wird.
8. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 3) während der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Detektion der Entwickler aus Petrolether, Aceton und Ameisensäure in einem Volumenverhältnis von 7:3:0,1 hergestellt wird; wobei der Farbentwickler 15% konzentrierte Schwefelsäure-Ethanol-Lösung ist.
9. Anwendung von der Protolichesterinsäure bei der Hemmung der Bildung von Pilzhyphen und der Umkehrung der Arzneimittelresistenzaktivität von Candida albicans nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt 3) das Volumenverhältnis vom Petrolether und Aceton 7:3 beträgt.
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