AT391143B - Verfahren zum herstellen eines klonierungsvektors fuer thiobacillus ferrooxidans - Google Patents

Claims (8)

1. Nr. 391143 Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines selektierbaren Klonierungsvektors für Thiobacillus ferrooxidans. Obwohl selektierbare Klonierungsvektoren für andere Bakterien bereits hergestellt wurden, sind derzeit keine Angaben über die Herstellung von selektierbaren Klonierungsvektoren für T. ferrooxidans, die auch in E. coli replizieren können, bekannt. Erfindungsgemäß wird ein Plasmidvektor dadurch hergestellt, daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem T. ferrooxidans-Stamm extrahiert wird, das T. fenooxidans-Plasmid und ein zweites Plasmid, welches ein Gen für Chloramphenicolresistenz enthält, mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten und die Plasmide unter Bildung eines Rekombinationsplasmids verknüpft werden. Das zweite Plasmid kann das Plasmid pBR325 sein, obwohl auch andere geeignete Plasmide anstelle von pBR325 verwendet werden können. Das resultierende Rekombinationsplasmid, pDR401, replizierte in E. coli. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das Plasmid pDR401 reisoliert und durch Spaltung mit wenigstens einem Restriktionsenzym modifiziert werden, um den E. coli-Replikationsursprung zu entfernen. Das deletierte Rekombinationsplasmid pDR412 enthält das Gen für Chloramphenicolresistenz und replizierte unter Verwendung des T. ferrooxidans-Replikationsursprunges in E. coli. Die Erfindung erstreckt sich auch auf die hier definierten Rekombinationsplasmide pDR401 und pDR412, welche neue, selektierbare Transportvektoren sind und für Gen-Manipulationsexperimente verwendet werden können, in denen T. ferrooxidans und E. coli involviert sind. So wird erfindungsgemäß ein Plasmid pDR401 vorgesehen, welches eine Größe von 17,8 kb besitzt und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb geteilt werden kann. Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Plasmid pDR412 vorgesehen, welches eine Größe von etwa 14,8 kb besitzt und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb geteilt werden kann. Im folgenden wird die Erfindung an Hand der Zeichnung beschrieben, welche Restriktionsmappen des kryptischen Plasmids und der Rekombinationsplasmide der vorliegenden Erfindung illustriert. Ein kryptisches Plasmid pTF-FC2 der Größe 12,4 Kilobasen (kb) wurde aus einem T. ferrooxidans FC-Stamm extrahiert, der aus einer sauren Laugenflüssigkeit aus der Fairview-Mine, General Mining Union Corporation Limited, Südafrika, isoliert worden war. Vom Microbiology Department der Universität von Cape Town wurde glaubhaft gemacht, daß die Mine allgemein zugänglich ist und das Isolieren des Plasmids aus der Bakterienart T. ferrooxidans wiederholbar ist. Die Restriktionsmappe von pTF-FC2 zeigt, daß dieses je eine Pstl-, Xhol-, Kpnl-, EcoRl-, Apal-, Clal-Restriktionsstelle und zwei Pvul-Restriktionsstellen besitzt (siehe die Zeichnung). Ein Rekombinationsplasmid pDR401 wurde durch Insertieren des E. coli-Plasmids pBR325 in die Pstl-Stelle von pTF-FC2 hergestellt. pBR325 enthält die Gene für Ampicillin (Ap)-, Chloramphenicol (Cm)- und Tetracyclin (Tc)-Resistenz. Das Klonieren an der Pstl-Stelle insertionsinaktivierte das ApR-Gen, und E. coli-Transformanten, nämlich Cm**, TcR und Ap*\ wurden isoliert. Das Rekombinationsplasmid pDR401 (17,8 kb) wurde aus den E. coli-Transformanten extrahiert und durch Restriktionsanalyse charakterisiert Dieses neue p p Rekombinationsplasmid enthält die Gene für Cm und Tc und kann in T. ferrooxidans und E. coli replizieren. Ein Deletionsplasmid pDR412 (14,8 kb) wurde nach Sall/Xhol-Digestion von pDR401 und Entfernung des Sall/Xhol-Fragments (etwa 3,0 kb), das den pBR325-Replikationsursprung, etwa die Hälfte des Tc-Gens und ein 0,3 kb-Stück der T. ferrooxidans pTF-FC2 DNA enthielt, hergestellt Restriktionsanalyse bestätigte, daß das Sall/Xhol 3,1 kb-Fragment im Plasmid pDR412 deletiert war. Dieses neue Rekombinationsplasmid enthält das p Gen für Cm1'· und kann in T. ferrooxidans und E. coli replizieren. Die zwei Plasmide pDR401 und pDR412 wurden durch endonukleolytische Spaltung mit einem Restriktionsenzym charakterisiert. So spaltet das Restriktionsenzym Pvul das Plasmid pDR40l in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb. Das gleiche Restriktionsenzym Pvul spaltet das Plasmid pDR412 in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb. PATENTANSPRÜCHE -2- 1 Verfahren zum Herstellen eines selektierbaren Klonierungsvektors für Thiobacillus ferrooxidans, dadurch gekennzeichnet, daß ein kryptisches DNA-Plasmid aus einem T. ferrooxidans-Stamm extrahiert wird, das Nr. 391 143 T. fenooxidans-Plasmid und ein zweites Plasmid, welches ein Gen für Chloramphenicolresistenz enthält, mit dem gleichen Restriktionsenzym gespalten und die Plasmide unter Bildung eines Rekombinationsplasmids verknüpft werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als kryptisches DNA-Plasmid pTF-FC2 mit einer Größe von 12,4 kb eingesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Plasmid pBR325 eingesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pBR325 in die Pstl-Erkennungsstelle des Plasmids pTF-FC2 insertiert wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Rekombinationsplasmid reisoliert wird und von ihm durch Spalten mit wenigstens einem Restriktionsenzym der E. coli-Replikationsursprung entfernt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß beim Spalten ein Fragment der Größe 3,0 kb, welches den Replikationsursprung des zweiten Plasmids enthält, aus dem Rekombinationsplasmid entfernt wird.
7. 7. Plasmid pDR401, welches durch eine Größe von 17,8 kb gekennzeichnet ist und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 6,2 kb bzw. 8,1 kb teilbar ist.
8. 8. Plasmid pDR412, welches durch eine Größe von 14,8 kb gekennzeichnet ist und durch das Restriktionsenzym Pvul in drei Fragmente der Größen 3,5 kb, 5,1 kb bzw. 6,2 kb teilbar ist. Hiezu 1 Blatt Zeichnung -3-