AT347431B - Verfahren zur herstellung von neuen delta- glutamyl-p-nitroaniliden - Google Patents

Description

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   Die Erfindungbetrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen y-Glutamyl-p-nitroaniliden der allgemeinen Formel 
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 worin
X die Carboxylgruppe oder die Sulfonsäuregruppe oder ein Salz davon bedeutet. 



   Die neuen Verbindungen eignen sich insbesondere für die Verwendung zur Aktivitätsbestimmung der   Sy-Glutamyltranspeptidase.   



   DieBestimmungder y-Glutamyltranspeptidase (y-GT) wird im klinisch-chemischen Labor in zunehmendem Masse zur Diagnostik von Lebererkrankungen durchgeführt. Nach einem bekannten Verfahren erfolgt die Bestimmung entsprechend der Reaktion : 
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 bei den erforderlichen erhöhten Temperaturen nur geringe Haltbarkeit. 



   Nach einem nicht vorveröffentlichten Verfahren werden für die genannten Aktivitätsbestimmungen der   T-Glutamyltranspeptidase   die erfindungsgemäss herstellbaren, neuen Verbindungen verwendet, welche einerseits wesentlich bessere Löslichkeitseigenschaften als das   Glutamyl-p-nitroanilid   besitzen und anderseits ein stabiles Substrat für das Enzym y-GT darstellen. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen   y-Glutamyl-p-nitroanilidderivate   ist dadurch gekennzeichnet, dass eine aktivierte Glutaminsäure, worin die Aminogruppe durch eine durch Solvolyse abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, mit einem p-Nitroanilin der allgemeinen Formel 
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 worin
X die angeführte Bedeutung hat,   umgesetzt wird, wonach aus dem entstandenen y-Glutamyl-p-nitroanilid   die Schutzgruppe durch Solvolyse abgespalten wird. 



   Als p-Nitroanilin-Ausgangsverbindungen werden nach weiteren Merkmalen der Erfindung bevorzugt   3-Carboxy-oder   3-Sulfo-4-nitroanilin eingesetzt,
Als aktivierte Glutaminsäure wird zweckmässig das entsprechende Anhydrid oder ein Halogenid, vorzugsweise ein Chlorid oder Bromid, verwendet. Das Anhydrid lässt sich beispielsweise erhalten, indem Glutaminsäure nach Einführung einer Schutzgruppe mit Essigsäureanhydrid zum entsprechenden Glutaminsäureanhydrid umgesetzt wird. Als Schutzgruppe eignen sich   z. B.   Phthaloyl, Benzyl, Carbobenzoxy, Vanillinsäure usw. 



     DieAbspaltungderSchutzgruppeerfolgtdurch Solvolyse.   Bevorzugt wird die Spaltung mit Hydrazin, falls eine Phthaloylgruppe vorliegt. An Stelle von Glutaminsäureanhydrid oder-halogenid kann auch ein anderes   aktiviertes Glutaminsäurederivat verwendet werden, welches in   der Lage ist, die Herstellung der Säureamidbindung zwischen der Carboxylgruppe der Glutaminsäure und der Aminogruppe des Anilins zu erleichtern. 



  Derartige aktivierte Derivate sind aus der Peptidchemie bekannt. 



   Die Umsetzung erfolgt zweckmässig in einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls in Anwesenheit eines Amins. Als   organisches Lösungsmittel   wird Dioxan bevorzugt. Es können aber auch andere Lösungsmittel verwendet werden, wie Tetrahydrofuran, Formamid, Dimethylformamid u. dgl. Als Amin wird ein tertiäres aliphatisches Aminbevorzugt, insbesondere ein solches mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen/Alkylgruppe. 



  Die Umsetzung mit Hydrazin erfolgt zweckmässig in einem niederen Alkohol als Lösungsmittel. 

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   Zur Reinigung der Rohprodukte bedient man sich üblicher Methoden wie Umkristallisation oder Chromatographie,   beispielsweise derAnionenaustauscherchromatographie und/oder   der Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Adsorptionsmitteln wie Kieselgel, Aluminiumhydroxyl u. dgl., wie sie sich insbesondere für die Dünnschichtchromatographie eignen, oder Umkristallisation der Ammoniumsalze aus WasserAceton-Mischung. 



   Die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Verbindungen sind bei Raumtemperatur gut löslich und erreichen mehr als 100% der Umsatzrate von y-Glutamyl-p-nitroanilid bei gleichen Bedingungen. Sie sind daher überlegene Substrate für die Bestimmung   der y-Glutamyltranspeptidase.   



   Es versteht sich, dass die erfindungsgemäss hergestellten neuen Verbindungen in ihre Salze überführbar sind, wobei insbesondere Alkali-, Erdalkali-, Ammonium- oder Aminosalze für den eingangs angeführten Verwendungszweck wertvolle Verbindungen darstellen. 



   Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens. 
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 2   hunter Rückfluss   gekocht. Nach dem Abkühlen werden dem Reaktionsgemisch 100 ml 2 N Ammoniak zugesetzt und das sich abscheidende Tributylamin wird mit Äther ausgeschüttelt. Die wässerige Lösung wird zur Trockne eingeengt, in Methanol gelöst und mit 80%igem Hydrazinhydrat auf   per   = 10 gestellt. Die Reaktionslösung bleibt etwa 20 h bei Raumtemperatur stehen. Teilweise scheidet sich dabei ein Produkt ab, das nach dem Abfiltrieren und nach dem Waschen mit Methanol verworfen wird. Das methanolische Filtrat wird bis zur Trockne konzentriert und das zurückbleibende Öl wird in etwa 300 ml dest. Wasser gelöst. 



   Diese wässerige Lösung wird über eine Säule mit 100   ml   Dowex   1 x 2   (50 bis 100 mesh) Formiat-Form, chromatographiert, mit 300ml   dest.   Wasser gewaschen und graduierend mit 2   l   Wasser gegen   2l 0, 5N Am-     moniumearbonatlösung   eluiert. Das Eluat wird in 100   ml-Fraktionen   aufgefangen und dünnschichtchromatographisch (Kieselgelplattender Fa. Riedel de Haen, Nr. 37350) im System Butanol/Eisessig/Wasser im Verhältnis 50 : 15 : 15 untersucht (Entwicklung der Chromatogramme : Im UV-Licht blaue Flecke oder nach Besprühen mit Ninhydrin und anschliessendem Erhitzen, braune Flecke der aminosäure-haltigen Zonen).

   Die Fraktionen, die das Produkt   Glutaminsäure-p-nitroanilid-3-oarbonsäure   enthalten   (Rr-Wert   = 0, 25), werden gesammelt und im Vakuum bis zur Trockne konzentriert. Das zurückbleibende Pulver wird mit absolutem Alkohol verrührt, abfiltriert und im Vakuum über Calciumchlorid getrocknet. 



   Ausbeute : 7 g   y-Glutamyl-p-nitroanilid-3-earbonsäure,   Monoammoniumsalz (58% der Theorie). 



    UV-Spektrum : A gx = 317   
E=   11,     7 [omV Mol] bei   317 nm   Beispiel 2: &gamma;-Glutamyl-4-nitroanilid-3-sulfonsäure  
115 g Anilin-4-nitro-3-sulfonsäure und 150 g Phthaloylglutaminsäureanhydrid werden in 2   l   absolutem Dimethylformamid suspendiert und anschliessend im Ölbad auf 1450C erhitzt. 



   Nach Erreichen dieser Temperatur wird 1 h bei 1450C gehalten und dann abgekühlt. Der Ansatz wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wird in Methanol gelöst und mit   80%igem Hydrazinhydroxyd   auf PH = 9 eingestellt. Nach 24 h werden die gebildeten Kristalle abgesaugt, mit wenig Methanol gewaschen und verworfen. 



   Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt und mit tiefgekühltem Aceton vorsichtig unter Kühlung versetzt. 



  Der dabei ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton gut gewaschen und der Rückstand wird in Wasser unter Rühren gelöst. Der im Wasser unlösliche Rückstand wird abfiltriert und das Filtrat wird mit Ammoniak auf   pro= 7, 5   gestellt und eingeengt. Durch Zusatz von Aceton wird das Ammoniumsalz   der y-Glu-     tamyl-4-nitroanilid-3-sulfonsäure   auskristallisiert. Das Produkt kristallisiert sehr gut in hellgelben Drusen. 



   Fp. = 186 bis   1870C  
Spektrum zeigt Absorptionsmaximum bei 290 nm    < r=4, 57 [cm Mol]  
Ausbeute etwa 115 bis 120g, weitere 15 bis 20 g können noch aus der Kristallisationsmutterlauge erhalten werden. 



   Gesamtausbeute etwa 135 g, entspricht 70% der Theorie. 



   Beispiel 3: Verfahrensvariante zur Darstellung   von'Y-Glutamyl-p-nitroanilid-3-carbonsäure     10 mMol (5,2 g) Carbobenzoxy-L-glutaminsäure-&alpha;-tert. Butylesterdicyclohexylammoniumsalz,   hergestellt im Prinzip nach bekannten Methoden   (z. B. E. Klieger, H. Gibian, Liebigs Ann.   Chem. 655, 195   [1962])   wurden in 200ml absolutem Pyridin gelöst,   1, 85   g (10 mMol)   2-Nitro-5-aminobenzoesäure   hinzugegeben und in die gekühlte Lösung   10 mMol   (2,7 g) Diphenylphosphorsäurechlorid unter Rühren innerhalb von 10 min eingetropft. Anschliessend wurde das Gemisch auf Raumtemperatur gebracht und noch 30 min bei 450C weitergerührt.

   Nach Konzentrierung im Vakuum wurde der Rückstand mit 2 N HBr in Eisessig aufgenommen und innerhalb 30 min bei Raumtemperatur die Schutzgruppe abgespalten. Nach Einengen im Vakuum wurde der Rück- 

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 stand mit wässerigem Ammoniak auf PH 7,0   eingestellt und die LösungmitAcetonbis zur Trübung versetzt.   



   Es wurden 2, 2 g (70% der Theorie) hellgelbe Nadeln   an -y-Glutamyl-p-nitroanilid-3-carbonsäure   in chromatographisch reiner Form erhalten. 



   Beispiel 4 : Je 50 mMol Phthaloyl-L-glutaminsäure und 2-Nitro-5-aminobenzoesäure (9, 1 g) wurden in 80 ml absolutem Pyridin bei   OOC   mit 55 mMol Diphenylphosphorsäurechlorid innerhalb von 10 min versetzt, anschliessend auf Raumtemperatur gebracht und nach 30min bei   450C   weitergerührt.   Dünnschichtchro-   matographie und Elektrophorese zeigten praktisch quantitative Umsetzung zu dem gewünschten Produkt. Das Pyridin wurde anschliessend abgezogen, die Lösung mit HCl angesäuert und das angefallene Rohprodukt ohne weitere Reinigung zu der Hydrazinolyse nach Beispiel 1 eingesetzt.

   Nach der üblichen Aufarbeitung wurden   13, 4g (84% der Theorie)   in Form von hellbeige-farbenen Nädelchen erhalten, die im enzymatischen Test mit y-GT eine Genetik von 95 bis 100% des nach Beispiel 3 erhaltenen Produktes zeigen. 



     Die Aktivierung gelingt auch   mit Chlorameisensäureäthylester, Phosphoroxytrichlorid und Phosphorpentachlorid, wenngleich die Ausbeuten hiemit deutlich niedriger liegen. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1. Verfahren zur Herstellung von   neuen &gamma;-Glutamyl-p-nitroaniliden   der allgemeinen Formel 
 EMI3.1 
 worin
X die Carboxylgruppe oder die Sulfonsäuregruppe oder ein Salz davon bedeutet, dadurch gekennzeichnet,   dasseineaktivierteGlutaminsäure, worindie Aminogruppe durch eine durch   Solvolyse abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, mit einem p-Nitroanilin der allgemeinen Formel 
 EMI3.2 
 worin
X die angeführte Bedeutung hat, umgesetzt wird, wonach aus dem   entstandenen'-Glutamyl-p-nitroanilld   die Schutzgruppe durch Solvolyse abgespalten wird.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsverbindung 3-Carboxy-4-nitroanilin eingesetzt wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsverbindung 3-Sulfo- - 4-nitroanilin eingesetzt wird.