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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen L-a-Hydrazino-P-phenylpropionsäuren und ihren Salzen. Diese neuen Verbindungen haben die allgemeine Formel
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worin
R4 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen und
RO Wasserstoff oder ein Metallkation bedeuten.
Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen sind bisher nicht bekannte, wertvolle therapeutische Mittel. Racemate von a-Hydrazino-a-substituierten-j8- (3, 4-dihydroxyphenyl)-propionsäuren und deren Estern sind bekannt und sie sind als wirksame Decarboxylase-Inhibitoren bei Säugetieren bekannt ; vgl. Sletzinger et al"Journal of Medicinal Chemistry", Bd. 6 [1963], Seite 101 und Porter et al "Biochemical Pharmacology", Bd. 11 (November 1962), Seite 1067. Diese Verbindungen fanden als Medikamente Verwendung.
Die Erfindung basiert auf der Feststellung, dass das D-Isomere des Racemats inaktiv ist und zu einem gewissen Grad sogar antagonistisch gegenüber der Wirkung der L-Form, die eine aktive Verbindung ist, wirkt. Daher schien es in einigen Versuchen, dass die L-Form der Verbindung die einzige aktive Form ist unddassdieD-Form inaktiv ist. Bei andern Versuchen zeigte sich, dass die D-Form der Wirkung der L-Form entgegenwirkt und diese beeinträchtigt. Das Ziel der Erfindung besteht daher in der Herstellung der reinen L-Form, von der festgestellt wurde, dass sie ein wirksamerer Decarboxylase-Inhibitor ist als die bisher bekannte Verbindung.
Die Inhibierung von Säugetier-Decarboxylase ist ein wichtiger Teil der physiologischen Wirkung vieler Arten von Arzneimitteln. Beispielsweise wurde in jüngster Zeit vorgeschlagen, L-Dopa zur Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit zu verwenden. L-Dopa wird jedoch sowohl im Gehirn als auch den peripheren Teilen des Körpers verbraucht, und es ist erwünscht, dass es lediglich im Gehirn verbraucht wird. Die vorliegenden Hydrazin-Verbindungen passieren nicht die Blutgehimsperre und inhibieren somit lediglich Decarboxylase in den peripheren Teilen des Körpers. Wenn also L-Dopa in Verbindung mit den Hydrazin-Verbindungen, die gemäss der Erfindung erhältlich sind, verwendet wird, wird die Decarboxylase von L-Dopa lediglich in den peripheren Teilen des Körpers inhibiert und ermöglicht somit, dass mehr davon dem Gehirn zur Verfügung steht.
Daraus ergibt sich, dass viel weniger L-Dopa für eine wirksame Medikation erforderlich ist.
Die Hemmung von Decarboxylase ist auch bei der Behandlungbestimmter Störungen des Dickdarms von Bedeutung. Bei manchen Personen entwickeln die Zellen im Darm und möglicherweise anderswo Überaktivi- tät hinsichtlich der Produktion von Serotonin aus 5-Hydroxytryptophan. Die Folge dieses Überflusses an Serotonin ergibt eine konstante Ausspülung des Dickdarms und Entleerung des Darms. Wenn dieser Zustand
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wie beispielsweise die erfindungsgemäss erhältlichen Hydrazino-Verbindungen, insbesondere solche, die keine andere physiologische Wirksamkeit besitzen, sind für diese Verwendung besonders geeignet.
Die genannten Verbindungen inhibierennichtnur Dioxyphenylalanin-Decarboxylase, sondern auch HistidinDecarboxylase. Sie sind somit auch als Antihistaminmittel brauchbar.
Besonders geeignet sind Verbindungen, die in den -Stellungen der Propionsäure Wasserstoff oder eine
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Menge zwischen 0, 05 und 100 mg/kg je Tag verabreicht werden.
Die Verbindungen können auch in Form pharmazeutisch annehmbarer Salze, wie beispielsweise Alkalioder Ammoniumsalze der Carboxygruppe, oder als Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate u. ähnl. Salze der Aminofunktion verwendet werden. Bevorzugt werden jedoch die freien Aminosäuren und nicht die Salze verwendet.
Die biologische Wirksamkeit der Verbindungen wurde an Hand folgender Versuche nachgewiesen :
Prüfung hinsichtlich der Decarboxylase- Inhibierung bei Säugetieren :
Es werden weibliche Albinomäuse mit einem jeweiligen Gewicht zwischen 18 und 22 g verwendet. Den Tieren werden 80 mg/kg L-Dopa (L-3, 4-Dihydroxyphenylalanin) in Kombination mit der angegebenen Dosis L-α-Hydrazino-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure oral in einer Lösung oder Suspension in
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Wasser verabreicht. Die Tiere werden 90 min später geköpft. Die Gehirne werden entfernt und in Gruppen von sieben zusammengeschlossen. Drei getrennte Gruppen werden für jede Arzneimittelbehandlung verwendet, und die erhaltenen Werte werden gemittelt.
Die Gehirne werden mit 0, 4n Perchlorsäure, 9 ml je g Gewebe, homogenisiert, Catecholamine und Catecholaminosäuren werden auf Aluminiumoxyd adsorbiert und dann daraus eluiert. Das Dopa und die a- Hydrazino-a-methyl- ss - (3, 4-dihydroxyphenyl) -propionsäure werden durch Chromatographie unter Verwendung einer Kolonne abgetrennt, die das Ionenaustauschharz mit einer Korngrösse von 74 bis 37 g enthielt. Das Dopaunddiea-Hydrazino-o-methyl-ss- (3, 4-dlhydroxyphenyl)-propionsäure werdendann für die fluorimetrische Bestimmung von Dopa und a-Hydrazino-a-methyl-ss- (3, 4-dlhydroxyphenyl)-propionsäure der Jodoxydation unterworfen (Porter, C. C., Totaro, J. A. und Bercin, A. J., Pharmac. Exp. Therap. Bd. 17 [1965], Seite 150).
Vergleichsgruppen von Mäusen werden mit aufgenommen, und der Durchschnittswert für jeden der drei Versuche ist in Tabelle I aufgeführt.
Tabelle I
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<tb>
<tb> Dosis <SEP> Dopa <SEP> Q'-Hydrazino-a-methylmg/kg <SEP> Mikrogramm/g <SEP> ss" <SEP> (3, <SEP> 4-dihydroxyphenyl)- <SEP>
<tb> propionsäure
<tb> Mikrogramm/g
<tb> Vergleich-0, <SEP> 05 <SEP> 1, <SEP> 30 <SEP>
<tb> Racemat <SEP> 20 <SEP> 3, <SEP> 60 <SEP> 3, <SEP> 05 <SEP>
<tb> L-Form <SEP> 10 <SEP> 2, <SEP> 85 <SEP> 2, <SEP> 68 <SEP>
<tb>
Wie sich aus der Tabelle ergibt, besitzen 10 mg der L-Verbindung die gleiche Wirksamkeit wie 20 mg der DL-Verbindung (Racemat) bei den Versuchstieren. In andern Worten, die L-Form ist praktisch zweimal so aktiv wie das Racemat in diesem Versuch.
Vergleich des Racemats, der D- und L-Isomeren von oz-Hydrazino-a-methyl-ss- (3, 4-dihydroxyphenyl)- propionsäure hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die durch L-Dopa hervorgerufene Umkehr der durch Reserpin in duzierten Unterdrückung der Locomotion und Ptosis wirksam zu machen.
Die Mäuse werden in transparenten Kunststoff-Mäusekäfigen untergebracht und während einer Nacht an ihre Umgebung akklimatisiert. Es werden verschiedene Dosierungen des Racemats, des L- oder des D-Iso-
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abreicht. L-Dopa (150 mg/kg) wird auf intraperitonealem Weg 2 h nach dem Reserpin verabreicht, und die Mäuse werden, bezogen auf eine Blindgrundlage, hinsichtlich der Unterdrückung der Locomotion und des Vorliegens von Ptosis 1 h später beobachtet. Die Unterdrückung der Locomotion wird dadurch bestimmt, dass die Mäuse einzeln 15 sec auf den Mittelpunkt eines etwa 20 x 25 cm Drahtmaschengitters gebracht werden.
Wenn die Maus nicht zu oder von dem Rand des Gitters läuft (das normalerweise in weniger als 15% der mit Reserpin behandelten Mäuse eintritt), wird die Fortbewegung als unterdrückt angesehen. Nicht mit Reserpin behandelte Mäuse bewegen sich innerhalb dieses Zeitraums beständig zu oder von dem Gitter. Die Ptosis wird als positiv bewertet, wenn die Augenlider zu 50% oder mehr geschlossen sind.
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Tabelle II Vergleich der Wirkung der D- und L-Isomeren von o'-Hydrazino-a-methyl- ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure auf den L-Dopa-Antagonismus der durch Reserpin induzierten Unterdrückung der Locomotion und Ptosis
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<tb>
<tb> Vorbehandlunga <SEP> Dosis <SEP> Durch <SEP> Reserpin <SEP> Durch <SEP> Reserpin
<tb> (mg/kg <SEP> induzierte <SEP> Unter- <SEP> induzierte <SEP> Unterp.
<SEP> o.) <SEP> drückung <SEP> der <SEP> Loco- <SEP> drückung <SEP> der
<tb> motion <SEP> Ptosis
<tb> Anzahl <SEP> geschützter <SEP> Anzahl <SEP> geschützter
<tb> Mäuse <SEP> Mäuse
<tb> Anzahl <SEP> geprüfter <SEP> Anzahl <SEP> geprüfter
<tb> Mäuse <SEP> Mäuse <SEP>
<tb> SU-1/10 <SEP> 1/10 <SEP>
<tb> D-Isomeres <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 1/10 <SEP> 1/10
<tb> + <SEP> SU <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP> 2/10 <SEP> 2/10
<tb> 125,0 <SEP> 2/10 <SEP> 3/10
<tb> L-Isomeres <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 3/10 <SEP> 2/10
<tb> + <SEP> SU <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 5/10 <SEP> 7/10
<tb> 5 <SEP> :
<SEP> Ob <SEP> 8/10 <SEP> 9/10
<tb> ED50 <SEP> c <SEP> 0, <SEP> 86 <SEP> mg/kg <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP> mg/kg
<tb>
a 1 h vor dem L-Dopa 150 mg/kg i. p. b Diese Dosis an L-α-Hydrazino-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxy- phenyl)-propionsäure war als ein Reserpin-Antagonist inaktiv, wenn sie vor dem Suspendiermittel aus 1% Methylcellulose in
Wasser verabreicht wurde. c Geschätzte Dosis an α-Hydrazino-α-methyl-ss-(3,4-di-
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gegenwirkung dieser Reserpinwirkung in 50% der Mäuse notwendig ist.
SU Suspendiermittel aus 1% Methylcellulose in Wasser.
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Tabelle III Vergleich der Wirkung des Racemats und des L-Isomeren von a-Hy- drazino-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure auf den LDopa-Antagonismus der durch Reserpin induzierten Unterdrückung der Locomotion und Ptosis
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<tb>
<tb> Vorbehandlunga <SEP> Dosis <SEP> Durch <SEP> Reserpin <SEP> Durch <SEP> Reserpin
<tb> (mg/kg <SEP> induzierte <SEP> Unter- <SEP> induzierte <SEP> Unterp.
<SEP> o.) <SEP> drttckung <SEP> der <SEP> Loco- <SEP> drückung <SEP> der
<tb> motion <SEP> Ptosis
<tb> Anzahl <SEP> geschützter <SEP> Anzahl <SEP> geschützter
<tb> Mäuse <SEP> Mäuse
<tb> Anzahl <SEP> geprüfte <SEP> Anzahl <SEP> geprüfter
<tb> Mäuse <SEP> Mäuse
<tb> SU-7/70 <SEP> 8/70
<tb> L-Isomeres <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 4/30 <SEP> 5/30
<tb> + <SEP> SU <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 10/70 <SEP> 16/70
<tb> 0, <SEP> 67 <SEP> 20/70 <SEP> 23/70
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> 45/70 <SEP> 44/70
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 33/40 <SEP> 34/40
<tb> ED <SEP> b <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> mg/kg <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> mg/kg
<tb> (0, <SEP> 5-2, <SEP> 9) <SEP> (0, <SEP> 5-1, <SEP> 8) <SEP>
<tb> Racemat <SEP> 0, <SEP> 67 <SEP> 11/70 <SEP> 10/70
<tb> + <SEP> SU <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 29/70 <SEP> 30/70
<tb> 6, <SEP> 0 <SEP> 49/70 <SEP> 50/70
<tb> 18, <SEP> 0 <SEP> 63/70 <SEP> 62/70
<tb> ED50 <SEP> b <SEP> 2,
<SEP> 9 <SEP> mg/kg <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> mg/kg
<tb> (2, <SEP> 4-3, <SEP> 5) <SEP> (2, <SEP> 2-3, <SEP> 8) <SEP>
<tb>
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hpropionsäure bei Gabe in Kombination mit L-Dopa (150 mg/kg i. p.), die zur Gegenwirkung gegen die Reserpinwirkung in 50% der Mäuse notwendig ist. Die Werte in Klammern beziehen sich auf die 95% Zulässig- keitsbereiche.
SU Suspendiermittel aus 1% Methylcellulose in Wasser.
Die Tabellen n und III zeigen die Wirkungvon L-Dopa (150 mg/kg i. p.) auf die durch Reserpin induzierte Unterdrückung der Locomotion und Ptosis bei Mäusen, die mit verschiedenen Dosierungen des Racemats, der D- und der L-Isomeren von α-Hydrazino-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure vorbehandelt worden sind. Diese Dosis von L-Dopa (150 mg/kg i. p.) ist als ein Reserpin-Antagonist bei mit l% iger wäs- seriger Methylcellulose vorbehandelten Mäusen unwirksam.
Die Dosis des Racemats, der D- und L-Isome- ren von α-Hydrazino-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure, die zur Bekämpfung der Bewegungunterdrückung und Ptosiswirkungenvon Reserpin bei 50% der Mäuse notwendig ist (ego), wenn sie in Kombination mit L-Dopa (150 mg/kg) gegeben werden, werden aus den Daten zugehorenden Regressionslinien bewertet.
Das D-Isomere von α-Hydrazin-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure zeigt geringe, falls überhaupt irgendeine Fähigkeit, irgendeine dieser Wirkungen von L-Dopa bei mit Reserpin behandelten Mäusen (ED50 > 125, 0 mg/kg) wirksam zu machen. Ein Vergleich des ED50 -Wertes für das Racemat und das L-
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(3, 4-dihydroxyphenyl)-propionsäureoxyphenyl) -propionamidin10ml DMSO zugegeben. Nach Abklingen der Gasentwicklung (15 min) wird die Lösung auf 15 C gekühlt und eine Lösung aus 4,5 Mol Chloramin in 12 ml trockenem Äther wird über einen Zeitraum von 2 min zugegeben.
Nach 12-stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden einige Tropfen Essigsäure zugesetzt und das Gemisch wird im Vakuum konzentriert. Der erhaltene Sirup wird zwischen Wasser und Chloroform verteilt. Die organische Schicht wird getrocknet, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand aus Äthylacetat und Äther kristallisiert. Das so erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung in Beispiel 2 eingesetzt.
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3 : L- (a-Hydrazino) -a-methyl-ss - (3, 4-dihydroxyphenyl) -propionsäure.thyl-p- (3, 4-dimethoxyphenyl)-propionitrils In 2, 5 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wird in einem geschlossenen Rohr 1 1/2 h bei 1200C erhitzt. Nach Aufarbeiten in der im Beispiel 1 angegebenen Weise werden 50 mg der Hydrazinosäure erhalten. Fp. = 208 C (Zers.).
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Essigsäure gelöst.
Diese Lösung wird in einem verschlossenen Rohr 90 min bei 1200C erhitzt. Es ergibt sich eine dunkle Lösung, die zur Trockne eingedampft wird. Aus dem Rückstand wird das Produkt mit 25 ml Äthanol ausgelaugt. Die Hydrazinsäure wird nach Zugabe von 5 ml Benzol durch Diäthylamin bei pH 6, 5 ausgefällt. 1, 1 g des rohen Produktes (56%) wird mit Entfärbungskohle behandelt, filtriert und aus 50 ml siedendem Wasser, das 5 mg Tetranatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure enthält, kristallisiert, wobei L- (α-Hydrazino)-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure, Fp. = 2080C (Zers.) erhalten wird.
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=-17, 3 (o=2, CHgOH).Tetrahydrofuran werden gleichzeitig 100 g (0, 430 Mol) Menthoxyacetylchlorid und 58 ml (0, 415 Mol) Tri- äthylamin zugegeben.
Das Gemisch wird 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die ausgefällten Salze und die Lösungsmittel werden unter Zurücklassung eines öligen Gemisches entfernt. Der Rückstand wird aus Äthylacetat und Hexan kristallisiert und man erhält 66 g Produkt, das vorwiegend aus dem L1- Diastereoisomeren besteht.
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(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propionitril,geschlossenen Rohr 2 h bei 1200C erhitzt. Das erhaltene Gemisch wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und das Produkt mit Äthanol ausgelaugt. Die Hydrazinsäure wird durch Zugabe von Diäthylamin auf PH 6, 4 ausgefällt, das Gemisch filtriert und der Niederschlag mit Äthanol gewaschen und getrocknet, wobei die in der Überschrift angegebene Säure mit einem Fp. von 208 C (Zers.) erhalten wird.
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drazinhydratwird4h zum Sieden erhitzt.
Das Gemisch wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand aus Methanol/Wasser umkristallisiert, wobei Menthyloxyacetylhydrazin erhalten wird. Dieses wird ohne weitere Reinigung weiterverwendet.
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g (0, 5(0, 75 Mol) l-Menthyloxyacetylhydrazin und 32 g (0, 54 Mol) Natriumcyanid zugegeben. Das Gemisch wird 18 h bei Raumtemperatur kräftig gerührt. Das Gemisch wird im Vakuum auf etwa die Hälfte des Volumens
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126 bis 126, 50C.
Beispiel 7 : L- (α-Hydrazino)-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure, Daswienachstehend angegebenhergestellte rohe Mefhyl-L-o !- (N -acetyl-N-phthaloylhydrazino)-a !-me- thyl-(4-methoxy-3-hydroxyphenyl)-propionat wird nach der im Beispiel 6 angegebenen Verfahrensweise hydrolysiert, wobei L-(α-Hydrazino)-α-methyl-ss-(3,4-dihydroxyphenyl)-propionsäure Fp. = 20SoC (Zers.) erhalten wird.
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500 g Eis gegossen und mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wird mit Wasser, verdünnter Säure und gesättigter Salzlösung gewaschen. Nach Einengen des Gemisches im Vakuum wird der Rückstand aus Aceton/ Hexan umkristallisiert.
111, 7 g (0, 4 Mol) so erhaltenes L-O, N-Diacetyl-a-methyltyrosin werden ohne weitere Reinigung mit 11 n-Chlorwasserstoffsäure 2 h am Rückfluss gehalten. Das Gemisch wird im Vakuum zur Trocknekonzentriert.
Der Rückstand wird in Chloroform-Wasser aufgenommen und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand aus L-N-Acetyl-α-methyltyrosin wird aus Methanol-Wasser umkristallisiert.
71, 19 g (0, 3 Mol) so erhaltenes L-N-Acetyl-α-methyltyrosin werden ohne weitere Reinigung nitrosiert und mit Zink nach der im Anschluss an Beispiel 4 angegebenen Verfahrensweise reduziert, wobei L-a- (NI-
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Zu 57, 65 g (0, 2 Mol) des Lactons aus der vorangehenden Stufe und 182, 3 g (1, 32 Mol) Veratrol werden auf einmal 100 g (0, 75 Mol) Aluminiumchlorid zugegeben. Das Gemisch wird 4 h auf 800C erhitzt, über Eis gegossen und mit Äther extrahiert. Die ätherische Lösung wird dreimal mit kaltem n-Natriumhydroxyd extrahiert.
Die wässerige Phase wird mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure angesäuert und mit Äther extrahiert, der Ätherextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstandwird aus Methanol/Wässer kristallisiert und man erhält L-Q !- (N -Acetyl-N-phthaloyi-
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Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Methyl-L-α-(N1-acetyl-N2-phthaloylhydrazino)-α-methyl-ss-(4- methoxy-3-hydroxyphenyl)-propionat erhält man wie folgt : Zu50, 06 g (0,15 Mol) L-α-(N1-Acetyl-N2-benzylidenhydrazino)-α-methyl-ss-(4-hydroxyphenyl)-propion- säure in 150 ml Methanol und 50 ml Triäthylamin werden 33, 3 g (0, 17 Mol) Tetranitromethan in 50 ml Methanol zugegeben.
Man lässt das Gemisch 18 h bei Raumtemperatur unter Rühren stehen. Nach Einengen im Vakuum zur Trockne wird das Gemisch in Chloroform aufgenommen und mit verdünnter Essigsäure extrahiert.
Der getrocknete Extrakt (Na2 S04) wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und aus Methanol umkristallisiert, wobei L-α-(N1-Acetyl-N2-benzylidenhydrazino)-α-methyl-ss-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)-propionsäure er- halten wird.
Zu 38, 44 g (0, 1 Mol) der obigen Verbindung in 100 ml Dimethoxyäthan werden tropfenweise unter Rühren 0, 22 Mol ätherisches Diazomethan bei 0 bis 5 C zugegeben. Man lässt das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und 18 h stehen. Das Gemisch wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand aus Aceton/Hexan kristallisiert, wobei L-α-(N1-Acetyl-N2-benzylidenhydrazino)-α-methyl-ss-(4-methoxy-3-nitrophenyl)- propionsäuremethylester erhalten wird.
20, 62 g (0, 05 Mol) des Esters aus der vorangehenden Stufe in 200 ml Methanol wird über Platin (zu Beginn als 0, 100 g Oxyd) bei Raumtemperatur und 3 atm hydriert, bis die Wasserstoffaufnahme 5 Mol je Mol Ausgangsmaterial beträgt. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat eingeengt und der Rückstand aus Methanol/Wasser umkristallisiert.
ZueinemGemischaus 28, 13 g (0, 1 Mol) des erhaltenen Methyl-L-α-(N1-acetylhydrazino)-α-methyl-ss- (3-amino-4-methoxyphenyl)-propionats in 300 ml Dimethoxyäthan werden bei Raumtemperatur 14, 81 g (0, 1 Mol) Phthalsäureanhydrid in 100 ml Dimethoxyäthan zugegeben. Nach Zugabevonlg2, 4-Dinltrobenzol- sulfonsäure wird das Gemisch 5 h zum Sieden erhitzt. Das Gemisch wird gekühlt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in eiskaltem Chloroform und Wasser aufgenommen und die wässerige Schicht mit Natriumbicarbonat alkalisch gemacht. Die Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt.
Der Rückstand wird aus Methanol/Wasser kristallisiert und ergibt Methyl-L-α-(N1-acetyl-N2-phthaloylhydrazino)-α-methyl-ss-(4-methoxy-3-aminophenyl)-propionat.
Zu 20, 57 g (0, 05 Mol) des Esters aus der vorangehenden Stufe in 22 ml 50% iger Schwefelsäure werden bei 0 bis 5 C 3, 8 g (0, 55 Mol) Natriumnitrit in 15 ml Wasser zugegeben. Das Gemisch wird auf einem Eisbad 1 h gealtert, man lässt es auf Raumtemperatur erwärmen und es wird dann auf einem Dampfbad erwärmt, bis die Stickstoffentwicklung beendet ist. Das Gemisch wird gekühlt, mit Äthylacetat extrahiert, der Extrakt über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man setzt diesen Ester ohne weitere Reinigung als Ausgangsmaterial ein.