AT246935B

AT246935B - Verfahren zur Herstellung von in 1- und 4-Stellung ungesättigten Steroiden

Info

Publication number: AT246935B
Application number: AT941760A
Authority: AT
Original assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1954-10-22
Filing date: 1955-08-11
Publication date: 1966-05-10

Description

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Als geeignete Mikroorganismen zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kommen z. B. die der Gattung Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium simplex und Corynebacterium hoagii in Betracht ; auch mit Bacillus sphaericus var. fusiformis wurden gute Ergebnisse erzielt. In der Regel sind diese Mikroorganismen ausserdem befähigt, im Molekül in 21-Stellung befindliche Estergruppen zu hydro- lysieren.

Die Hydroxyl-oder 0-Acylgruppe in 3-Stellung wird durch die Einwirkung dieser Mikroorganismen gleichzeitig in eine 3-Ketogruppe umgewandelt ; dabei wird ausserdem die 5,6-Doppelbindung in Konju- gation zur 3-Ketogruppe, also in 4,5-Stellung, verschoben.

Von den genannten Mikroorganismen haben insbesondere die Stämme Corynebacterium simplex (ATCC 6946), Corynebacterium hoagii (ATCC 7005) und Bacillus sphaericus var. fusiformis (ATCC 7055) sehr befriedigende Ergebnisse geliefert. Die Kultur der dehydrierenden Mikroorganismen erfolgt in übli- cher Weise in einem Nährmedium, das ein Kohlehydrat, organischen Stickstoff, natürliche Wachstums- faktoren und anorganische Salze enthält. Dabei ist es möglich, das Kohlehydrat wegzulassen, ohne das
Wachstum der Mikroorganismen wesentlich zu beeinträchtigen. Nach entsprechend langer Kultur der Mikroorganismen wird die Zellmasse durch Zentrifugierung gesammelt, die darüber befindliche Flüssigkeit dekantiert, die Zellmasse in einer isotonischen Salzlösung suspendiert und ein bestimmtes Volumen der Zellsuspension in einem geeigneten Nährmedium ausgesät.

Die zu dehydrierende Steroidverbindungwird unter sterilen Bedingungen in fester Form oder gelöst in Äthanol, Aceton oder einem andern mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, welches das Wachstum der Mikroorganismen nicht beeinträchtigt, suspendiert, der Mikroorganismenkultur in der Nährbrühe zugegeben. Die Kultur wird dann geschüttelt, belüftet oder gleichzeitig belüftet und gerührt und so das Wachstum der Mikroorganismen sowie die biochemische Umwandlung (1, 2-Dehydrierung, Verschiebung der 5,6-Doppelbindung in die 4,5-Stellung und Bildung der 3-Ketogruppe) des Steroids beschleunigt. Man kann auch das Steroid zuerst der sterilen Nährlösung zusetzen und diese dann mit den Mikroorganismen beimpfen. In gewissen Fällen kann es günstiger sein, vor dem Zusatz des Steroids das maximale Wachstum der Mikroorganismen abzuwarten.

Wahlweise können auch in bekannter Weise erhaltene Enzymprä- parate aus Kulturen von Mikroorganismen der erforderlichen Art verwendet werden. Ein Zusatz anorganischer Salze ist erwünscht, um im Reaktionsmedium einen pH-Wert zwischen 6,8 und 7,2 aufrechtzuer- halten. Die Zugabe anorganischer Salze kann auch unterbleiben ; in diesem Fall steigt der pH-Wert der Reaktionslösung von anfangs 6,8 auf etwa 7,7 bis 8 an. Bei dem zuletzt genannten pH-Wert ist die Bildung der Endprodukte nach der Erfindung noch gut möglich. Die optimale Temperatur für das Wachstum der Mikroorganismen liegt bei etwa 370C für Corynebacterium und bei etwa 380C für Bacillus sphaericus.

Gegebenenfalls können die Temperaturen zwischen 25 und 37 C und sogar zwischen 20 und 400C variiert werden. Die Umsetzungsdauer liegt zwischen 3 und 96 h, je nachdem, welches Steroid als Ausgangsmaterial und welche Mikroorganismen verwendet werden. Im Verlauf des Dehydrierungsprozesses, der von einer teilweisen oder vollständigen Hydrolyse der in 21-Stellung vorhandenen Estergruppe begleitet sein kann, können die Reaktionsprodukte aus der Mischung durch Extraktion mit einem geeigneten mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, durch Filtration, durch Adsorption an einem geeigneten Adsorptionsmittel oder durch beliebige andere, allgemein in solchen Fällen benutzte Methoden gewonnen werden.

Als Extraktionsmittel sind z. B. chlorierte, niedere Kohlenwasserstoffe, Ketone oder Alkohole geeignet, wie Chloroform, Methylenchlorid, Trichloräthan, Äthylendichlorid, Butanol oder Diäthylketon. Vorzugsweise eignet sich zur Isolierung der Steroide die Extraktion. Im Anschluss an diese können die Endprodukte durch Einengen der Extrakte, gegebenenfalls bis zur Trockne, isoliert werden. Die Reinigung der erhaltenen Rohprodukte kann durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch, wie Aceton, Methylenchlorid, Äthanol, Aceton/Hexan, Methylenchlorid/Hexan usw., durchgeführt werden. Die 1, 4-Pregnadienderivate werden dabei in ausgezeichneter Ausbeute und hohem Reinheitsgrad erhalten.

An Stelle der genannten in 1, 2-Stellung dehydrierend wirkenden Mikroorganismen können auch deren Mutanten benutzt werden.

Nach der Erfindung können als Ausgangsmaterial z. B. die folgenden Steroide verwendet werden : 5-Pregnen-3, 17ct, 21-triol-11, 20-dion, 5- Preien-3, 17ct, 21-triol-ll, 20-dion-3-acylat, 5-Pregnen-
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17a, 21-triol-11,nen-3, llss, 17K, 21-tetrol-20-on, 9a-Fluor-5-pregnen-3, 1lss, 17a, 21-tetrol-20-on-3-acylat, 9ct-Fluor- - 5-pregnen-3, llss, 17a, 21-tetrol-20-on-21-acylat und 9a-Fluor-5-pregnen-3, Ilss, 17a, 21-tetrol-20- - on-3, 21-diacylat.

Je nachdem, welche Reaktionsbedingungen und insbesondere welche Steroide angewendet werden, können bei der mikrobiologischen 1, 2-Dehydrierung in 21-Stellung vorhandene Estergruppen gleichzeitig hydrolysiert werden.
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Nach der Erfindung ist es ferner möglich, Endprodukte der Formel II, worin X = H, OH ta oder ss) und W = H sind und R die angegebene Bedeutung hat, durch Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel, vorzugsweise durch Einwirkung von Chromsäureanhydrid, in eine Verbindung der Formel II, worin X = 0 und W = H sind und R die angegebene Bedeutung hat, zu überführen. Man kann also auf diese Art 1, 4-Pregnadien-3, 20-dion-ll, 17a, 21-triol sowie dessen 21-Acylate in 1, 4-Pregnadien-3, 11, 20- - trion-17a, 21-diol und dessen 21-Acylate umwandeln.

Zur Herstellung von Endprodukten mit guter Wasserlöslichkeit und/oder erhöhter Wirkungsdauer kann die 21-Hydroxylgruppe in Verbindungen der Formel II (R = H) verestert werden. Die Veresterung kann mit einer organischen oder einer anorganischen Säure oder einem zur Veresterung geeigneten Derivat einer solchen Säure vorgenommen werden.

In Betracht kommen die folgenden Säuren oder deren zur Veresterung geeignete Derivate : Alkancarbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Cyclohexancarbonsäure, 4-Methylcyclohexancarbonsäure, 3-Athylcyclohexylessigsäure, Cyclohexylpropionsäure, Cyclopentylpropionsäure, Phenylessigsäure, Trimethylessigsäure, tert.-Butylessigsäure, Butoxybuttersäure, Äthoxycarbonsäure, Methylthiovaleriansäure, Isopropylthioessigsäure, Capronsäure, Isobuttersäure, Önanthsäure, Isocaprylsäure, Cyclohexylcapronsäure, Undecylensäure, 2-Äthylbuttersäure, Orthophosphorsäure, Polyphosphorsäure, Schwefelsäure oder mehrbasische Säuren, wie z. B. Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Phthalsäure oder Hexahydrophthalsäure.

Vorzugsweise erfolgt die Veresterung durch Umsetzung eines 21-Hydroxysteroids der Formel Imit einem Säureanhydrid oder Säurechlorid, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base. Man kann die Veresterung auch durch Umsetzung des 21-Hydroxysteroids mit einer freien Säure in Gegenwart eines sauren Katalysators unter dehydratisierenden Bedingungen durchführen.

Derartige Veresterungen werden nach an sich bekannten Methoden durchgeführt.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können in üblicher Weise zu Arzneipräparaten verarbeitet werden.

Beispiel 1 : Aus einer Lösung von 30 g Hefeextrakt ("Difco") in 3,0 l Leitungswasser, die 13,2 g Kaliumdihydrogenphosphat und 26, 4 g Dinatriumhydrogenphosphat (PH der Lösung 6,9) enthält, werden 27 Teile von je 100 ml entnommen, in Erlenmeyerkolben von 300 ml Inhalt gebracht und im Autoklav 15 min lang bei 776 Torr Dampfdruck (1200 C) sterilisiert. Nach Abkühlung wird jeder Kolben mit 1 ml einer Suspension von Corynebacterium simplex (ATCC 6946) beimpft und auf einem Schütteltisch bei 220 Stössen pro min und 280C 24 h lang geschüttelt.

In weitere 27 Erlenmeyerkolben werden je 150 mg 5-Pregnen-3, 17cl, 21-triol-11, 20-dion-21-acetat gebracht. Anschliessend wird 15 min bei 776 Torr Dampfdruck (120 C) sterilisiert. Jedem Kolben werden dann 5, 0ml Äthanol zugegeben. Die 24-h-Bakterienkulturen werden hierauf aseptisch übertragen und die entstehenden Suspensionen auf einem Schütteltisch bei 220 Stössen'pro min und 280 C 48 h geschüttelt. Der pH-Wert beträgt am Ende 7,2. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 9,0 l Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zu einem Rückstand konzentriert, der aus Aceton-Hexan kristallisiert. Man erhält 1- Dehydro-cortisor.. Fp. = 210 bis
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hydrid zugefügt.

Man lässt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und verdünnt sie dann mit Eis und Wasser. Die entstehende Fällung wird filtriert und aus Aceton-Hexan umkristallisiert. Es werden 0,35 g von 1-Dehydro-cortison-21-acetat erhalten. Fp. = 227 - 2280C. Nach verschie-
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meyerkolben, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Der pH-Wert am Ende des Schüttelvorganges beträgt 7, 0. Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 9,0 l Chloroform in

drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden dann zu einem Rückstand eingeengt.

Der Schmelzpunkt des Rückstandes ist 227-232 C. Nach dem Aufschlämmen mit 50 ml Aceton und Abkühlung wird aus diesem Rohmaterial nach Filtration 1-Dehydro-cortisol vom Fp. = 237 - 2390C gewon- nen. Weiteres Produkt kann aus der Mutterlösung gewonnen werden. Durch Umkristallisation aus Aceton
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C (Zersetzung) ; [cx] (Methanol).

Einer Lösung von 0,85 g von 1-Dehydro-cortisol in 5 ml Pyridin werden 3 ml Essigsäureanhydrid zugefügt. Man lässt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und verdünnt sie dann mit Eiswasser. Die entstehende Fällung wird aus der Mischung abfiltriert und aus Aceton-Hexan umkristallisiert. Es wird 0, 45 g von 1, 4-Pregnadien-llss, 17ot, 21-triol-3, 20-dion-21-acetat (l-Dehydro-cor- tisol-21-acetat) gewonnen. Fp. = 235 - 2390 C. Bei der Umkristallisation steigt der Schmelzpunkt auf
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Beispiel 3 : Je 150mg 5-Pregnen-3, 11a, 17a, 21-tetrol-20-on-3, 21-diacetat werden in 27 Erlenmeyerkolben, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Der pH-Wert am Ende des Schüttelvorganges beträgt 7, 0.

Der Inhalt aller Kolben wird vereinigt und mit einer Gesamtmenge von 9,0 r Chloroform in drei gleichen Anteilen extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden dann zu einem Rückstand eingeengt.

Der Schmelzpunkt des Rückstandes beträgt 227 - 2320 C. Nach dem Aufschlämmen mit 50 ml Aceton und Abkühlung wird aus diesem Rohmaterial nach Filtration 11-epi-1-Dehydro-cortisol in kristalliner Form isoliert. Fp. = 245 - 2460 C (Zersetzung).

Die Acetylierung von 11-epi-1-Dehydro-cortisol (1, 0 g) wird durch Lösen in 15 ml wasserfreiem Pyridin und anschliessenden Zusatz von 0,3 g Essigsäureanhydrid durchgeführt. Man lässt die Reaktionsmischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und giesst sie dann in Eiswasser. Das angefallene 11-epi-1-Dehydro-cortisol-21-acetat wird durch Filtration abgetrennt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert.

Einer Lösung von 0,4 g 11-epi-1-Dehydro-cortisol in 10 ml wasserfreiem Pyridin wird 0,11 g Essigsäureanhydrid zugesetzt. Man lässt die Reaktionsmischung bei Zimmertemperatur über Nacht stehen und trägt sie dann in eine Mischung von 0, 15 g Chromtrioxyd in 15 ml Pyridin (Chromtrioxyd-Pyridin-Reagens nach Poos und Mitarbeiter, Journ. Am. Chem. Soc., Bd. 75 [1953], S. 422) ein. Man lässt das Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur stehen und giesst es dann in 5 Volumina Wasser. Dann wird mit Methylenchlorid extrahiert und wie üblich aufgearbeitet. Die Kristallisation des 21-Acetats von 1-Dehydro-cortison. wird mit Aceton-Hexan durchgeführt und liefert 0,21 g feste Kristalle von 1-De- hydro-cortison-21-acetat.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung von in l-und 4-Stellung ungesättigten Steroiden durch mikrobiologische Dehydrierung mit Mikroorganismen, die wie Corynebacterium in 1, 2-Stellung dehydrierend wirken, aber die Seitenkette in 17-Stellung nicht abspalten, oder mit einem daraus hergestellten Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung von Steroiden der Formel II EMI4.3 worin R = H oder Acyl, und wenn W = H, X = 0 oder ssH, ctOH oder ocH, SOH, und wenn W = F, X = aH, B OH bedeuten, als Ausgangsstoff ein Steroid der Formel I <Desc/Clms Page number 5> EMI5.1 EMI5.2 bacterium simplex verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als dehydrierend wirkender Mikroorganismus Corynebacterium hoagii verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als dehydrierend wirkender Mikroorganismus Bacillus sphaericus var. fusiformis verwendet wird.

5. Weitere Ausgestaltung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich- net, dass man eine Verbindung der Formel IL worin X = H, OH und W = H bedeuten, durch Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel, vorzugsweise durch Einwirkung von Chromsäureanhydrid, in eine Verbindung der Formel II, worin X = 0 und W = H sind, überführt. EMI5.3 net, dass man eine Verbindung der Formel II, worin R = H bedeutet, mit einer organischen oder anorganischen Säure oder einem zur Veresterung geeigneten Derivat einer solchen Säure, z. B. mit einer Alkancarbonsäure, wie Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure oder mit Phosphorsäure oder Schwefelsäure verestert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die Veresterung eine mehrbasische organische Säure oder ein zur Veresterung geeignetes Derivat einer solchen Säure, z. B.

Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zitronensäure oder Weinsäure, verwendet wird.