AT229488B - Verfahren zur Stabilisierung von Vaccinen - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Stabilisierung von Vaccinen 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von Vaccinen. 



   Eine Vaccine enthält bekanntlich inaktivierte oder abgeschwächte Krankheitserreger, z. B. Antigene aus Viren und Bakterien, die nach Einverleibung in den menschlichen oder tierischen Organismus eine Immunität gegen die injizierten Antigene verleihen. Man kennt heute in der Human-und Veterinärmedizin eine grosse Anzahl solcher Einzelvaccinen, die zur Immunisierung gegen Infektionskrankheiten verwendet werden. Besondere Bedeutung besitzen die Einzelvaccinen zur Auffrischimpfung, vornehmlich, wenn aus epidemiologischen Erwägungen schnell eine belastbare Immunität erforderlich ist. 



   Eine Erleichterung und wesentliche Vereinfachung für Arzt und Impfling bringen die Kombinationvaccinen, die Gemische aus mehreren Einzelvaccinen darstellen. Durch die kombinierten Vaccinen ist es möglich, in einem Impfgang einen gleichzeitigen Schutz gegen mehrere Krankheiten zu erlangen. 



   Wichtige Kombinationsvaccinen enthalten Komponenten gegen Poliomyelitis, Pertussis, Diphtherie und/oder Tetanus ; auch das Staupe-Virus, das Virus der Hepatitis contagiosa canis und/oder Leptospiren werden als kombinierte Vaccinen verwendet. Ferner kombiniert man die Typhus-, Paratyphus A- und Paratyphus B-Bakterien und/oder Choleraerreger ebenfalls in einer Vaccine. 



   Eine erfolgreiche Anwendung derartiger   Kombinationsvaccinen   ist daran gebunden, dass die Antigenität der Einzelvaccinen erhalten bleibt. Es ist bekannt, dass die Infektiosität lebender Viren durch Me- 
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Vaceinia-Virus(EDTA) zu versetzen. 



   Es wurde festgestellt, dass nicht nur in Einzelvaccinen, sondern auch in Kombinationsvaccinen eine Abnahme der Antigenität, insbesondere der Viruskomponenten, erfolgt. Besondere Bedeutung hat dabei das zur Zeit bei der Immun-Prophylaxe im Vordergrund des Interesses stehende Poliomyelitisvirus. Dabei genügt es nicht, der Vaccinelösung die dem quecksilberhaltigen Konservierungsmittel entsprechende stöchiometrische Menge EDTA zuzusetzen. Es wird nämlich auch im Laufe der Herstellung der Vaccine eine geringe, aber für die Antigenschädigung ausreichende Menge Schwermetallionen, z. B. durch Gefässe, Filtrationsgeräte, Chemikalien wie Puffersalz usw. eingeschleppt. In Frage kommen ausser dem bereits erwähnten Hg++ z. B. Cu++, Zn++,   Fe++,     Fe+++,   Ni++,   Crusw.   



   Man kann der Vaccine jedoch nicht wahllos grössere Mengen Chelatbildner zusetzen. Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, dass auch ein Überschuss an Chelatbildner die Antigenität, insbesondere der Viruskomponente, schädigt. 



   Es wurde nun ein Verfahren zur Stabilisierung von Vaccinen aus Virus- und Bakterien-Antigenen gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Vaccinen lösliche Chelatbildner in Mengen von 

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 0, 005 bis 0, 05 % zur Komplexbindung der Schwermetallionen hinzufügt. Vorzugsweise verwendet man als   Chelatbildner Dinatrium-dihydrogen-äthylen-diamin-N, N'-tetraacetat (EDTA).   Zweckmässig wird die zur Komplexbindung der antigenschädigenden Schwermetallionen erforderliche Menge des Chelatbildners im Endprodukt mittels komplexometrischer Titration festgestellt, u. zw. unter Berücksichtigung von in der Vaccine etwa bereits in freier oder gebundener Form vorhandenen Chelatbildnern. 



   Erfindungsgemäss stabilisierte Vaccinen zeigen gegenüber den Vaccinen, die keinen oder nicht genügend Chelatbildner enthalten, eine höhere Wirksamkeit und bessere Haltbarkeit. 



   Für das erfindungsgemässe Verfahren eignen sich als Chelatbildner ausser EDTA noch z. B. Nitrilotriessigsäure,   Diaminocyclohexantetraessigsäure,-Uramildiessigsäure,   Acetessigsäureester, 8-Hydroxychinolin, Siderophilin (Transferrin) und Aminosäuren z. B. Lactalbuminhydrolysat. 



   Die Analyse wird so geleitet, dass die durch die Kulturflüssigkeit eingebrachten, die übrigen Metallionen mengenmässig zum Teil übersteigenden   Ca++- und Mg++ -Ionen   nicht mit erfasst werden. 



   Die Analyse des EDTA-Bedarfes besteht aus zwei Teilen :
I. der Bestimmung der bereits vorhandenen EDTA-Menge und   II.   der Bestimmung der zur Abbindung der Schwermetallionen erforderlichen Menge EDTA
I. Prinzip der Methode :
Zur Bestimmung des bereits in der Vaccine-Lösung vorhandenen freien und gebundenen EDTA wird 
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2) Dimethylglyoximlösung   (1, 50 a. g   in Alkohol)
3) Diäthyldithiocarbamat-Lösung   (0, lig   in Wasser)
4) Trichloressigsäure   (lomig   in Wasser)
5) Ammoniak zig
6) Natriumsulfitlösung zig
7) Amylalkohol
Analysen-Verfahren :

  
4 ml der betreffenden Vaccine werden tropfenweise mit 2   ml   Trichloressigsäure versetzt und nach 10 min durch ein Faltenfilter filtriert. 3 ml des Filtrates werden    mit 2   ml Nickelsulfat-Lösung, nach 10 min mit 2 ml Ammoniak, 1 ml bidestilliertem Wasser und 2 ml Dimethylglyoxim-Lösung versetzt. 



  Nach   15 - 30   min ist die Fällung vollständig. Sie wird durch einen Faltenfilter filtriert. 1 ml des Filtrates wird mit 1 ml konzentrierter Schwefelsäure und konzentrierter Salpetersäure, dietropfenweisehinzu- 
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 mit 10 ml Wasser nochmals verdünnt und mit 2 ml Diäthyldithiocarbamat-Lösung und 5 ml Amylalkohol im Schütteltrichter 5 min geschüttelt. Die isolierte Amylalkoholschicht wird in einem Zentrifugengläschen abgekühlt, das noch vorhandene Wasser ausgefroren und zentrifugiert. Der Überstand wird nach 20 min bei 330   mft   im Spektralphotometer gemessen. 



   . Die Berechnung des EDTA-Gehaltes erfolgt mit einer Eichkurve, die mit bekannten Mengen Nickel bzw. mit bekannten Mengen EDTA erreicht wurde. 



   II. Zur Bestimmung des EDTA-Bedarfes für die Abbindung der Schwermetallionen ermittelt man die Gesamtmenge der für die Abbindung der Schwermetallionen erforderlichen Menge EDTA und subtrahiert die bereits in der Vaccinelösung vorhandene nach I bestimmte Menge EDTA. 



   Prinzip der Methode :
Um nur die Schwermetallionen zu erfassen, werden die   Ca++. und Mg ++-Ionen   mit Ammoniumfluorid maskiert (die ausgefallenen Fluoride stören den Titrationsverlauf nicht). 



   Man gibt darauf zu der Analysenlösung einen Überschuss von z. B. EDTA, macht ammoniakalisch, lässt die Schwermetallionen mit EDTA reagieren und bestimmt die nicht verbrauchte Menge mit vorzugsweise Zn++, indem man bis zum Umschlag des Indikators vorzugsweise Eriochromschwarz T. (SchultzFarbstofftabellen, 7. Aufl.   E 19311, Nr. 241),   von blaugrün nach rotviolett titriert. 

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   Lösungen :
1) 0, 001 m EDTA-Lösung (372, 35 mg Dinatriumsalz der Äthylendiamin-tetraessigsäure pro Liter bidestilliertem Wasser)
2) 0, 001 m Zinksulfatlösung (287,55 mg   ZnSO.   7   HO   pro Liter)
3) Indikatorlösung   0,1soigne   Lösung von Eriochromschwarz T in 2 n Ammoniak
4)   25joigne   Ammoniaklösung
5) Ammoniumfluorid,   10% igue   Lösung. 



   Analysenmethode
2 ml der zu prüfenden Vaccine werden mit 25 ml bidestilliertem Wasser verdünnt. Dann werden nacheinander 1 ml der Ammoniumfluoridlösung und 5 ml der 0,001 n EDTA zugefügt. Dann werden 5,0 ml der 0,001 m EDTA-Lösung aus einer Bürette zugefügt. Nach Zusatz von 0, 1 ml Ammoniak gibt man 0,2 ml Eriochromschwarz T (vgl. oben) als Indikatorlösung hinzu und   titriert'init   der 0,001 m   ZnSO   Lösung bis zum Farbumschlag von grünblau nach rotviolett. Zur Erreichung einer schnelleren Endpunkteinstellung empfiehlt es sich, die Lösung auf etwa 400 zu erwärmen. Ein Überschuss von   ZnS04 Lö-   sung kann gegebenenfalls   zurücktitriert   werden. 
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 stellen. 



   Die zur Komplexbildung der insgesamt in der Vaccine vorhandenen Schwermetallionen erforderliche Menge EDTA berechnet sich aus der Differenz : ml zugesetztes EDTA-ml zugesetztes Zinksulfat Pro ml Differenz sind   372/-Ig EDT A   zuzusetzen. Die pro 100 ml erforderliche Menge in mg erhält man durch Multiplikation mit 50. 



   Beispiel l : In 100 ml einer   handelsüblichen Poliomyelitisvaccine   wird die nach obiger Analysenmethode bestimmte Menge EDTA zur Absättigung der in ihr enthaltenen Schwermetallionen ermittelt. Es ergibt sich ein Wert von 0, 025o EDTA (20 mg/100 ml). Diese Menge wird der Vaccine zugefügt und die erhaltene Vaccine Hühnchen injiziert. 



   Im Serum der Hühnchen werden die neutralisierenden Antikörper bestimmt. Der Neutralisationstest zeigt für die mit EDTA versetzten Vaccine einen Durchschnittstiter von 1 : 37, während die Vaccine ohne EDTA-Zusatz (= Kontrolle) einen Titer von 1 : 22 aufweist. 



   Der EDTA-Zusatz verbessert demzufolge die Wirksamkeit der Vaccine um das   l,   7fache. 



     Beispiel 2 :   Kombinationsimpfstoffe gegen Poliomyelitis, Diphtherie, Tetanus und Pertussis werden in folgender Weise zusammengestellt : 
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<tb> 
<tb> EDTA-Bedarf
<tb> Poliomyelitis <SEP> + <SEP> Diphtherie <SEP> (20 <SEP> Lf) <SEP> 20 <SEP> mg/100 <SEP> ml
<tb> Poliomyelitis <SEP> + <SEP> Tetanus <SEP> (10 <SEP> Lf) <SEP> 20
<tb> Poliomyelitis <SEP> + <SEP> Pertussis <SEP> (15 <SEP> Milliarden <SEP> Keime/ml) <SEP> 20
<tb> Poliomyelitis <SEP> + <SEP> Dipththerie <SEP> (20 <SEP> Lf) <SEP> + <SEP> Tetanus <SEP> (10 <SEP> Lf) <SEP> 20
<tb> Poliomyelitis <SEP> + <SEP> Dipththerie <SEP> (20 <SEP> Lf) <SEP> + <SEP> Tetanus
<tb> (10 <SEP> Lf) <SEP> + <SEP> Pertussis <SEP> (15 <SEP> Milliarden <SEP> Keime/ml) <SEP> 20
<tb> 
 
Für die Poliomyelitiskomponente wurde ein Titer von 1 :

   30 ermittelt, im Gegensatz zu   l :   11 in der Kontrolle. 



   Die Verbesserung der Wirksamkeit durch EDTA-Zusatz beträgt das 2, 7fache.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH : Verfahren zur Stabilisierung von Vaccinen aus Virus- und Bakterienantigenen, dadurch gekennzeichnet, dass man die zur Komplexbindung von etwa vorhandenen Schwermetallionen erforderliche Menge eines löslichen Chelatbildners, vorzugsweise Dinatrium-dihydrogen-äthylen-diamin-N,N'-tetraacetat (EDTA), mittels komplexometrischer Titration unter Berücksichtigung von in der Vaccine etwa bereits in freier oder gebundener Form vorhandenen Chelatbildnern feststellt und den Vaccinen den löslichen Chelatbildner in Mengen von 0, 005 bis 0, 05% zusetzt.