AT140190B

AT140190B - Verfahren zur Herstellung einer für Ernährungszwecke geeigneten Provitamin-D-reichen Hefe.

Info

Publication number: AT140190B
Authority: AT
Inventors: Wilhelm Dr Halden
Original assignee: Wilhelm Dr Halden
Priority date: 1931-09-24
Filing date: 1931-09-24
Publication date: 1935-01-10

Description

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer fettreichen sowie Provitamin-D-reichen Hefe, deren Gehalt an Ergosterin gegenüber dem Ausgangsmaterial auf das Vielfache (10 bis 40fache) angereichert ist, darin bestehend, dass Kulturhefen einer Behandlung unterworfen werden, durch die ihnen der Grossteil des Wassers entzogen wird. Bekanntlich enthält Hefe kleine Mengen von Ergosterin oder Provitamin D, das durch ultraviolette Bestrahlung in das antirachitisch wirksame Vitamin D umwandelbar ist.

Bei der grossen Bedeutung, die dem Vitamin D für die richtige Ernährung von Menschen und Tieren zukommt, ist es nun eine wichtige Aufgabe, den Ergosteringehalt der Hefen, der meist nur einen kleinen Bruchteil eines Prozentes beträgt, erheblich zu steigern, da die Hefe als wichtigstes natürliches Vorkommen des Ergosterins zu betrachten ist.

Durch eingehende Untersuchungen des Anmelders ist festgestellt worden, dass der Gehalt der Hefen an Ergosterin und andern Lipoidstoffen zunimmt, wenn die normalen Lebenstätigkeiten der Hefe, wie die Sprossung und die Gärung, zurückgedrängt werden. Als Lipoide sind auf Grund der neuesten
Forschungsergebnisse biogenetisch zueinander in naher Beziehung stehende, nicht flüchtige Substanzen des tierischen oder pflanzlichen Organismus zu verstehen, die wegen ihrer Löslichkeit in Fetten und
Wachsen sowie in Fettlösungsmitteln fast immer mit den genannten Hauptgruppen in Mischung vor- kommen oder isoliert werden. Durch das vorliegende Verfahren wird insbesondere der Ergosteringehalt der Hefen vergrössert.

Da es sich herausgestellt hat, dass der wichtigste Baustoff für die Synthese der Hefelipoide der Acetaldehyd ist, muss man dafür Sorge tragen, dass für das dehydiierende Enzym in den Hefezellen, auf das die Umwandlung des Äthylalkohols in Acetaldehyd zurückzuführen ist, Bedingungen geschaffen werden, die günstiger sind als bei in Sprossung und Gärung befindlicher Hefe. Ferner dürfen die Stoffwechselprodukte der Hefe nicht sofort aus der Umgebung der Zellen weggeschafft werden ; vielmehr muss bewirkt werden, dass in der Umgebung der Hefe eine grössere Anreicherung der Stoffwechselprodukte herbeigeführt wird als bei einer in Sprossung und Gärung befindlichen Hefe, was man am leichtesten durch Verringerung des Wassergehaltes erzielt. Dies kann auch durch Anwendung wasserbindender chemischer Stoffe erfolgen.

Auf diese Weise werden die synthetischen Vorgänge innerhalb der Zellen begünstigt und gleichzeitig eine Umspülung der Hefe und die dadurch hervorgerufene unerwünschte Fortschaffung der Stoffwechselprodukte verhindert.

Aus den Angaben der Literatur und älteren Patentschriften ist der günstige Einfluss von Alkohol sowie Luftsauerstoff auf die Fettbildung in Mikroorganismen bekannt. Dagegen bestand keine einheitliche Auffassung über die Frage der Beziehungen zwischen dem Ergosterin-und dem Fettgehalt der Hefe. A. Heidusehka und H. Lindner (Zeitschrift für physiologische Chemie, Band 181, S. 15-23, 1929) haben zwar festgestellt, dass"obergärige Bierhefe in mit Sauerstoff öfters gesättigter Würze gezüchtet, um etwa 70% mehr Ergosteiin zeigte als eine in normaler Würzelösung gezüchtete" (S. 18, dritter Absatz), diese Autoren haben jedoch keinen Beweis dafür erbracht, dass parallel zur Erhöhung des Ergosteringehaltes auch eine Steigerung des Fettgehaltes eingetreten war.

Der Zusammenhang von Fett-und Sterinbildung bei Mikroorganismen wird von andern Autoren geleugnet (Terroine, Bonnet, Kopp und
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der Angaben von A. Heiduschka und H. Lindner in neuester Zeit durch Charles Pontillon bestätigt : Revue générale botanique Bd. 44, S. 417,465, 526, Bd. 45, S. 20, 1932-1933, sowie Tèhse Paris 1932).

Es war daher ein wichtiger Fortschritt, dass vom Anmelder auf Grund zahlreicher vergleichender Analysen des Ergosterin-und des Fettgehaltes verschiedener Hefen ein biogenetischer Zusammenhang dieser beiden Arten lipoider Stoffe erkannt wurde. Für die Praxis der Lipoidanreicherung in Hefezellen war die Erkenntnis der physiologischen Grundlagen bedeutungsvoll, ohne die eine technisch geregelte Arbeitsweise bei lebendem Zellmaterial nicht möglich ist. Diese Grundlagen sind einerseits die Herabsetzung des Wassergehaltes der Hefe1.. ùturen auf zirka 80% (Näheres hierüber ist aus Beispiel 2 zu ersehen) sowie Massnahmen, die eine Berührung sämtlicher oder wenigstens des allergrössten Teiles der Zellen mit der umgebenden Atmosphäre ermöglichen.

Durch die bisher vorgeschlagenen Verfahren zur Fettanreicherung von Mikroorganismen wurde dies nicht erreicht. Es gelang stets nur, einen sehr kleinen Anteil der Kulturen mit der wirksamen Umgebung in Berührung zu bringen. Da aber zur Bildung lipoider Zellbestandteile die Zufuhr von Energie unerlässlich ist und diese nur durch Atmung erfolgen kann, so muss bei grösseren Zellanhäuftmgen jeder Einzelzelle Sauerstoff zur Verfügung gestellt werden, was am besten durch ein intermittierendes Evakuieren der Kulturen bewirkt werden kann. Durch diese Massnahme ergibt sich als wesentlicher Vorteil auch eine leichte Dosierbarkeit der zur Anwendung gelangenden Dämpfe sowie die Möglichkeit einer automatischen Sterilhaltung der Hefekulturen während ihrer Behandlung in geschlossenen, evakuierbaren Systemen.

Breitet man z. B. untergärige Brauereihefen in einer dickflüssigen, wässerigen Aufschlemmung auf festen, gasdurchlässigen Unterlagen in einem evakuierbaren Gefäss aus, so gelingt es, den Ergosterin- gehalt in wenigen Tagen um 1000-4000% zu erhöhen, wenn durch abwechselndes Absaugen und Wieder- zuführen von steriler sauerstoffhaltiger Luft die Hefezellensehichten aufgelockert und dadurch dem
Einfluss der umgebenden, alkoholhaltigen Atmosphäre ausgesetzt werden. Während bisher in keinem Fall höhere Ergosteringehalte als zirka 1'5% festgestellt wurden, kann man auf Grund des neuen Verfahrens nach zehntägiger Behandlung eine Anreicherung von Ergosterin in untergärigen Brauereihefen bis zu 8% (gegenüber einem Ursprungswert von 0'2%) erzielen.

Zusammenfassend ergeben sich folgende neue Merkmale für das Verfahren der Erhöhung des Provitamin-D-Gehaltes in Hefen :
1. Erhöhung des Ergosteringehaltes um 1000-4000%.

2. Wasserentzug als Voraussetzung der Ergosterinbildung.

3. Unterdrückung von Sprossung und Gärung als wichtige Bedingungen für die Lipoidanreicherung.

4. Anwendung eines intermittierenden Vakuums zur Versorgung sämtlicher oder jedenfalls der allermeisten Hefezellen mit den die Lipoidbildung befördernden Dämpfen.

5. Ermöglichung einer leichten Dosierung der zur Anwendung gelangenden Dämpfe durch Eva- kuieren geschlossener Reaktionsräume.

6. Automatische Sterilhaltung der Hefekulturen bei Behandlung in geschlossenen, evakuierbaren Systemen.

Beispiel 1 : Grosse, keimfreie Petrischalen oder andere Kulturgefässe werden mit gründlich sterilisierter warmer Agarlösung so beschickt, dass der Boden eben bedeckt ist. Die Grundschalen werden zur Erleichterung der Gaszirkulation mit einigen seitlichen : Einkerbungen versehen. Zum Zwecke der
Abkühlung werden dann die Kulturgefässe unter eine evakuierbare Glasglocke gestellt, die durch Abreiben mit etwas Alkohol entkeimt ist.

Dann evakuiert man mittels der Wasserstrahlpumpe, wobei die Luft i durch ein mit einem Dreiwegehahn versehenes Rohr streicht Danach wird das Absaugrohr verschlossen und der Dreiwegehahn in eine solche Stellung gebracht, dass er einen durch Watte filtrierten Luftstrom eintreten lässt, dem etwas Alkohol dadurch beigemischt worden ist, dass das Wattefilter mit Alkohol angefeuchtet wurde. Auf diese Weise dringt ein Luft-Alkoholgemiseh in alle Schalen und deren poröse
Böden ein. Unter sterilen Bedingungen werden dann Aufschlämmungen reingezüchteter Bierhefen auf ) die Böden aufgetragen. Die Aufschlämmung (z.

B. in verdünnter, zirka 0'15%iger Agarlösung) wird so über die Böden verteilt, dass sich dünne, einige Millimeter hohe Schichten bilden ; die Oberflächen- kulturen werden dann unter der Glasglocke sich selbst überlassen. Wichtig ist, dass stets für ausgiebige
Lüftung der Kulturen gesorgt wird. Vorteilhafterweise wird täglich ein-bis zweimal evakuiert und danach wieder frische, durch eine dicke Watteschicht filtrierte Luft eingelassen. Das Wattefilter kann hiebei mit etwas Alkohol getränkt sein.

Bei dieser Arbeitsweise und Verwendung einer untergärigen Bier- hefe, Typus Frohberg, und eines Agarbodens mit 5% Rohrzucker wurde die weiter unten angegebene
Anreicherung des Ergosterins erzielt (die Bestimmung des Ergosteringehaltes erfolgte entweder koloii- metrisch nach Heiduschka und Lindner oder gravimetrisch nach einer etwas modifizierten Digitonin- Methode).-Der Ergosteringehalt der verwendeten Hefen betrug vor der Anwendung des neuen Ver-
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Ergosteringehalt in der Trockenhefe.
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Ergosteringehalt <SEP> in <SEP> Prozenten
<tb> kolorimetrisch <SEP> bestimmt <SEP> gravimetrisch <SEP> bestimmt
<tb> 3tägige <SEP> Versuchsdauer <SEP> ...................... <SEP> 4#3%
<tb> 6teigige <SEP> Versuchsdauer <SEP> ................... <SEP> 6#2%
<tb> 10tägige <SEP> Versuchsdauer <SEP> ..................... <SEP> 7#6% <SEP> 8#7%
<tb> 17tätige <SEP> Versuchsdauer <SEP> ..................... <SEP> 7#9% <SEP> 8#9%
<tb> 20tägige <SEP> Versuchsdauer <SEP> ................... <SEP> 9'0%
<tb>

An den letzten drei Tagen dieses Versuches war, da zwischen dem 10. und 17.

Tag keine nennenswerte Erhöhung des Ergosteringehaltes mehr stattgefunden hatte, so gearbeitet worden, dass in Gegenwart von Chlorcalcium trockene, mit Alkoholdümpfen gesättigte Luft über die Hefe geleitet wurde und zwischendurch immer wieder eine Evakuierung erfolgte. Auf diese Weise konnte noch eine weitere Erhöhung des Ergosteringehaltes erzielt werden, wahrscheinlich dadurch, dass durch das Chlorealeium der die Hefekulturen bedeckende Fliissigkeitshauch entfernt wurde, der anscheinend der Lipoidbildung stark entgegen wirkt.

Die stärkste Zunahme des Ergosteringehaltes erfolgte, wie aus der vorstehenden Tabelle zu ersehen ist, innerhalb der ersten drei Tage.

Beispiel 2 : Unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 wurde auf den ebenso bereiteten Böden, jedoch ohne Zusatz eines Narkotikums und ohne Evakuierung, eine Hefeaufschlämmung ausgebreitet, deren Feuchtgewicht 9'4mal so gross war wie das Trockengewicht. Bei diesem Feuchtigkeits-
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sich selbst. Es trat keine weitere Steigerung des Ergosteringehaltes ein, was als Hinweis dafür anzusehen ist, dass die Zusammenwirkung der Faktoren : geringer Wassergehalt, reichliche Luftzufuhr und Gegenwart eines Narkotikums für den Fortschritt der Ergosterinanreicherung massgebend ist.

Beispiel 3 : Die Verwendung anderer Narkotika als Alkohol hat den Zweck, die Gär-und Sprosstätigkeit der Hefezellen zu unterdrücken und gleichzeitig die Sterilhaltung der Kulturen zu erleichtern. Als Lipoidbildner kommen andere Antiseptika als bestimmte Alkohole bzw. Aldehyde selbstverständlich nicht in Betracht. Der Grad der Ergosterinanreicherung, zu dem solche Mittel führen, liegt daher auch wesentlich unter dem der in Beispiel 1 angegebenen Werte.
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Antiseptikum <SEP> Versuchsdauer <SEP> Art <SEP> des <SEP> Nährbodens <SEP> % <SEP> Ergosterin <SEP> (kolorimetrisch)
<tb> Amylsalicylat <SEP> ......... <SEP> 11 <SEP> Tage <SEP> Bierwürze/Agar <SEP> 3#5%
<tb> Amylvalerianat <SEP> ........ <SEP> 12 <SEP> Tage <SEP> Bierwürze/Agar <SEP> 3#1%
<tb> Aceton <SEP> ............... <SEP> 13 <SEP> Tage <SEP> 10% <SEP> Rohrzucker/Agar <SEP> 5#1%
<tb> Diphenyläther <SEP> ......... <SEP> 17 <SEP> Tage <SEP> 10% <SEP> Rohrzucker/Agar <SEP> 5#4%
<tb> Carvacrol <SEP> ............. <SEP> 18 <SEP> Tage <SEP> 10% <SEP> Rohrzucker/Agar <SEP> 5#8%
<tb>
Beispiel 4 : Die Begünstigung der Lipoidanreicherung durch Verwendung nährstoffloser Unterlagen geht aus folgendem hervor :

Reinzuchthefen wurden in der Zentrifuge zehnmal mit der zehnfachen Menge Leitungswasser gründlich gewaschen, um auf diese Weise alle anhängenden Nährstoffe vollständig zu entfernen. Ein Teil dieser Hefen wurde nach Beispiel 1 elf Tage behandelt und ergab dann 28'1% gravimetrisch bestimmtes Gesamtlipoid. Ein anderer Teil dieser Hefe wurde ebenfalls elf Tage unter den gleichen Bedingungen auf einem bierwürzehaltigen Agarboden behandelt ; die so behandelte Hefe enthielt nur 13'4% gravimetrisch bestimmtes Gesamtlipoid. Bei der Verwendung des nährstofflosen Bodens war die Sprossung der Hefezellen fast vollständig unterdrückt worden.

PATENT-ANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung einer für Ernährungszweeke geeigneten Provitamin-D-reiehen Hefe, deren Gehalt an Ergosterin gegenüber dem Ausgangsmaterial auf das Vielfache (10-40fache) angereichert ist, dadurch gekennzeichnet, dass Kulturhefen einer Behandlung, durch die ihnen der Grossteil des Wassers entzogen wird, unterworfen werden.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wasserentzug vorzugsweise so weit getrieben wird, dass der Feuchtigkeitsgehalt der Hefe nur noch 80% oder darunter beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für das dehydrierende Enzym in den Hefezellen, auf das die Umwandlung des Äthylalkohols in Acetaldehyd zurückzuführen ist, Bedingungen geschaffen werden, die günstiger sind als bei in Sprossung und Gärung befindlicher Hefe, 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Umgebung der Hefe eine grössere Anreicherung der Stoffwechselprodukte herbeigeführt wird als bei einer in Sprossung und Gärung befindlichen Hefe.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wassergehalt der Hefe durch Anwendung wasserbindender chemischer Stoffe herabgemindert wird, die sich im Reaktionsraum ausserhalb der Hefe befinden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass stickstoffreie Böden Verwendung finden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellensehichten zwecks besserer Durchmischung mit Luft durch intermittierende Wirkung eines mässigen Vakuums aufgelockert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen der Einwirkung von Narkotika in Dampfform ausgesetzt werden.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein etwaiger Überschuss der narkotisch wirkenden Stoffe durch Evakuierung entfernt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung der Hefe an Provitamin D unter Anwendung von Reinkulturen unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.