ES2640216T3

ES2640216T3 - Sistemas y métodos para procesamiento de células

Info

Publication number: ES2640216T3
Application number: ES11193362.8T
Authority: ES
Inventors: Stefan Miltenyi; Winfried Schimmelpfennig; Holger Lantow; Elmar Niklas NEUSCHÄFER; Martin Biehl; Jürgen Schulz; Eiad Kabaha
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-12-08
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2028-12-08
Also published as: EP3338895B1; JP5456689B2; US20160216270A1; US20200141942A1; US10620212B2; US9714945B2; WO2009072006A2; US20110003380A1; US20180010087A1; US11499976B2; US20140370592A1; JP2014100588A; ATE528077T1; EP2227334B1; JP5670197B2; EP2227334A2; US20220326248A1; WO2009072003A2; JP2016153124A; ES2660180T3

Abstract

Un instrumento de procesamiento de células (100) que comprende: - una carcasa (105), - al menos una unidad de magneto para una cámara de separación magnética (106), - al menos una unidad para una centrífuga (104) y para una cámara de cultivo (104), y - válvulas de pinza (1-11; 12, 14, 15, 16; 17; 18; 19; 110; 310, 311; 424, 425; 427, 428, 429) para montar un conjunto de tubos desechables dentro del instrumento (100), caracterizado porque una cámara de centrífuga (128) se ubica en un área de temperatura controlada, y en donde el instrumento de procesamiento de células (100) comprende un sistema de detección óptica (132) para la centrífuga (104) para medir las densidades ópticas en diferentes posiciones en la cámara de cultivo (104).

Description

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DESCRIPCION

Sistemas y metodos para procesamiento de celulas Antecedentes de la invencion

Actualmente, una variedad de enfermedades humanas no pueden tratarse de manera satisfactoria con los productos farmaceuticos estandar, por lo que se propone el uso de celulas humanas primarias como una alternativa u opcion adicional para el tratamiento de diversas enfermedades. Tales procedimientos de terapia celular requieren usualmente una manipulacion significativa y el procesamiento de los productos celulares para separar las funciones deseadas de las no deseadas, por ejemplo, la reduccion de celulas en una reaccion del hospedero no deseada y potencialmente peligrosa para la vida en el rechazo al trasplante, o el enriquecimiento de las celulas implicadas en los efectos deseados del trasplante contra la leucemia/tumor.

Los metodos conocidos en la tecnica requieren de una infraestructura inmensa en los hospitales para cumplir con los requerimientos regulatorios y de seguridad, lo que incluye los procedimientos de buenas practicas de manufactura compatibles con habitaciones limpias y el personal para el mantenimiento de las habitaciones, instrumentos, production, control de calidad, y procedimientos para el aseguramiento de la calidad. Usualmente, los productos celulares se procesan mediante el uso de una combination de diversos dispositivos y material desechable con la transferencia manual de muestras entre esos sistemas.

La presente invencion integra diversas etapas para el procesamiento de celulas en un dispositivo unico y desechable, controlado en un proceso totalmente automatizado, que elimina los requerimientos de la transferencia manual de las celulas, los controles durante el proceso, los riesgos relacionados a los productos celulares, y medidas de reduccion de riesgo, y por tanto, proporciona un dispositivo y metodo para la obtencion de productos de terapia celular que estan listos para el uso directo. Los productos celulares que se obtienen mediante el uso del sistema de la presente invencion tlpicamente estaran listos para transferirse directamente al paciente.

Generalmente, la presente invencion se refiere al procesamiento de materiales biologicos. Mas especlficamente, la presente invencion proporciona sistemas, dispositivos, y metodos para el procesamiento de materiales biologicos para cultivar y/o separar los componentes de una muestra biologica, y para posteriormente separar los componentes de la muestra mediante tecnicas de separation, que incluye la aplicacion de la separation magnetica.

Se conocen diversas tecnicas para la separacion de los componentes de una muestra o material biologico, que usan las tecnicas de separacion. Tales tecnicas incluyen pero no se limitan a la separacion por cribado, separacion magnetica, centrifugation, filtration, separacion por inmunoafinidad, separacion por gravitation, separacion por gradiente de densidad, y elutriacion.

Los metodos de inmunoafinidad pueden incluir el marcado selectivo de ciertos componentes de una muestra (por ejemplo, marcado con anticuerpos) y la separacion de los compuestos marcados y no marcados. Los metodos de separacion magnetica tlpicamente incluyen el paso de una muestra a traves de una columna de separacion.

La separacion magnetica es un procedimiento para retener selectivamente los materiales magneticos en una camara o columna dispuesta en un campo magnetico. Una sustancia diana, que incluye materiales biologicos, puede marcarse magneticamente mediante la union a una partlcula magnetica por medio de un accesorio de union especlfico, que se conjuga a la partlcula. Despues, una suspension de la sustancia diana marcada se aplica a la camara. La sustancia diana se retiene en la camara en presencia de un campo magnetico. Despues, la sustancia diana retenida puede eluirse mediante el cambio de la fuerza, o por la elimination del campo magnetico.

Una matriz de material de susceptibilidad magnetica adecuada puede colocarse en la camara, de manera que cuando un campo magnetico se aplica a la camara un alto gradiente de campo magnetico se induce localmente cerca de la superficie de la matriz. Esto permite la retention de las partlculas magnetizadas debilmente y el procedimiento es referido como separacion magnetica de alto gradiente (HGMS).

El uso de HGMS en las separaciones biologicas requiere que las condiciones proporcionen un alto rendimiento con una pureza sustancial. En consecuencia, serla conveniente proporcionar separadores magneticos de alto gradiente, dispositivos y metodos que sean relativamente faciles para construir y usar, y aun as! proporcionar gradientes de campo magnetico maximos y uniformes y caracterlsticas de flujo durante su uso. Serla mas ventajoso si tales separadores magneticos, dispositivos y metodos pudieran usarse para realizar una diversidad de clasificaciones celulares o procedimientos de ensayo con la selection del miembro de union especlfico apropiado, para el cual la sustancia diana se marcara magneticamente.

En tales ejemplos, las metodologlas de separacion deben realizarse bajo condiciones que aseguren que no se contamina la muestra o que mantiene su esterilidad. Por ejemplo, en muchas cllnicas comunes los sistemas de separacion de celulas necesitan operarse en habitaciones limpias de alta calidad para mantener la esterilidad de las muestras. Con frecuencia, asegurar la no contamination es diflcil, costoso y requiere facilidades separadas y personal,

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as! como tambien procedimientos complejos que requieren esfuerzos inmensos para mantener la reproducibilidad y la esterilidad. Adicionalmente, numerosos procesos y etapas de manipulacion (por ejemplo, lavados, disminucion del volumen, etc.) deben realizarse separados de los sistemas de separacion con la subsiguiente introduccion en los sistemas de las muestras procesadas, as! como tambien la union de fluidos de y reactivos, lo cual complica, adicionalmente, la observacion de la esterilidad. Como tal, se necesitan metodos y sistemas mejorados para asegurar la no contamination de las muestras y/o disminuir la complejidad y los costos del procesamiento de muestra.

Breve resumen de la invention

La presente invencion proporciona un sistema de separacion y procesamiento de muestra que incluye una unidad de procesamiento de muestra y una unidad de separacion de muestra. El alcance de la invencion y las modalidades es limitado solamente por las reivindicaciones.

En una modalidad, la invencion proporciona mejoras en los dispositivos de separacion magnetica de alto gradiente, aparatos y metodos para la separacion de materiales biologicos. Los dispositivos, aparatos y metodos en cuestion permiten una mayor especificidad y eficiencia en el aislamiento de celulas particulares, protelnas, polisacaridos, y otros materiales biologicos, u otros materiales que son magneticos o son capaces de una interaction de union especlfica con un miembro de union marcado magneticamente.

Se proporciona una columna de separacion magnetica que tiene una carcasa no magnetica que define una camara de separacion, y una matriz permeable a llquidos de, por ejemplo, esferas metalicas dentro de la camara. Las esferas forman un entramado apilado apretadamente, que crea canales sustancialmente uniformes para el flujo homogeneo durante las separaciones. La columna de separacion puede usar un dispositivo de separacion magnetica junto con un dispositivo prefiltro. El dispositivo puede usarse en un instrumento que tiene un magneto permanente o electromagneto para usar durante las separaciones, con un brazo retractil opcional para mover el magneto, bombear los medios para los lavados y separar el material diana, y un microprocesador para controlar el flujo del fluido de separacion.

En una modalidad, el sistema comprende a) una unidad de procesamiento de muestra que comprende un puerto de entrada y un puerto de salida acoplado a un contenedor rotatorio (o camara de centrifugation) que tiene al menos una camara de muestra, en donde la unidad de procesamiento de muestra se configura para proporcionar una primera etapa de procesamiento a una muestra o para rotar el contenedor de manera que se aplica una fuerza centrlfuga a una muestra depositada en la camara y se separa al menos un primer componente y un segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad de separacion de muestra acoplada al puerto de salida de la unidad de procesamiento de muestra, la unidad de separacion de muestra comprende una agarradera de la columna de separacion, una bomba, y una pluralidad de valvulas configuradas para, al menos parcialmente, controlar el flujo del fluido a traves de un circuito de llquidos y una columna de separacion ubicada en la agarradera, en donde la columna de separacion se configura para separar los componentes marcados de los no marcados de la muestra que fluye a traves de la columna.

Se prefiere que el contenedor rotatorio comprenda un medio para la detection del progreso de la separacion del al menos primer componente y el segundo componente de la muestra depositada en el contenedor rotatorio.

Los medios para la deteccion del progreso de la separacion pueden ubicarse de manera que la luz de una fuente de luz pueda al menos parcialmente penetrar a traves de al menos una parte de la muestra que se esta separando, y la luz que pasa a traves de al menos una parte de la muestra pueda detectarse mediante un detector de luz.

Preferentemente, los medios para la deteccion del progreso de la separacion pueden ubicarse en el contenedor rotatorio, esencialmente perpendicular al eje de rotation del contenedor rotatorio.

Se prefiere, ademas, que el medio para la deteccion del progreso de la separacion se ubique en el contenedor rotatorio, que alcance esencialmente desde un area adyacente al eje de rotacion del contenedor rotatorio hasta un area adyacente al perlmetro del contenedor rotatorio.

Los medios para la deteccion del progreso de la separacion en el contenedor rotatorio pueden ser una ventana, un prisma, o un espejo. La ventana, prisma, o espejo pueden ubicarse para cubrir un canal formado en la tapa o en el fondo del contenedor rotatorio, en donde el canal se configura de manera que al menos una parte de la muestra pueda fluir dentro del canal durante la centrifugacion. Ademas, puede usarse una ventana sin un canal, es decir, la separacion de la muestra se detecta despues a traves de una ventana en la tapa o en la parte inferior de la camara que rota.

Preferentemente, el contenedor rotatorio se configura de manera que pueda emplearse para celulas en cultivo. En ese caso, el contenedor rotatorio, preferentemente, comprende al menos una capa para las celulas que crecen de esta manera. La al menos una capa puede ubicarse perpendicularmente al eje de rotacion. Se prefiere disponer una pluralidad de capas para las celulas que crecen de esta manera en el contenedor rotatorio.

El contenedor rotatorio puede fabricarse en forma desechable. Se prefiere, ademas, que el contenedor rotatorio pueda esterilizarse para permitir el procesamiento de las celulas sin contaminacion.

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En particular, el contenedor rotatorio comprende o puede hacerse de un material que se escoge a partir del grupo que consiste en: plasticos, poliestirol (PS), poliestereno, polivinilcloruro, policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA), tereftalato de polietileno (PET), politetrafluoretileno (PTFE), poliuretano termoplastico (TPU), silicona. La camara puede hacerse, ademas, de polietileno (PE), colageno, quitina, alginato, derivados de acido hialuronico, poliactido (PLA), poliglicolido (PGA) y sus copollmeros, poliestirol (PS), poliestireno, policarbonato, poliacrilato, ceramicas, materiales de vidrio, como hidroxilapatita (HA), y fosfato de calcio, y composiciones que comprenden uno o mas de los materiales mencionados anteriormente.

Tlpicamente, los puertos de entrada y salida comprenden al menos un filtro esteril.

Ademas, se describe un metodo que comprende o contiene las siguientes etapas:

a) proporcionar un sistema como se describe anteriormente y en la presente descripcion; b) realizar una primera etapa de procesamiento para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra; y c) realizar una etapa de separacion de una muestra a un componente procesado de la muestra, la separacion comprende separar los componentes marcados y no marcados a partir del componente procesado de la muestra. La etapa de procesamiento puede realizarse, ademas, despues de la etapa de separacion.

Debido a la presencia de la camara que rota en el sistema, como se describio anteriormente y en la presente descripcion, se prefiere que el metodo comprenda detectar el progreso de la separacion, en particular mediante la deteccion de la formacion de capas de la muestra, el cambio del valor del pH, y/o el cambio en la temperatura.

El metodo puede realizarse, preferentemente, cuando la muestra es una muestra biologica, en particular, sangre o medula osea.

Ademas, se describe un programa de ordenador, en particular, cuando se ejecuta sobre un ordenador, para controlar un sistema como se describio anteriormente y en la presente descripcion, en particular para realizar un metodo como se describio anteriormente y en la presente descripcion. El programa de ordenador puede almacenarse en un medio de almacenamiento, tal como un disco de ordenador.

La invencion se refiere, ademas, a un instrumento integrado para el procesamiento de celulas que comprende una carcasa, al menos un magneto para la camara de separacion magnetica desechable, al menos un espacio para una centrlfuga/camara de cultivo desechables, diversas valvulas de pinza dispuestas de manera que diferentes arreglos de un conjunto de tubos desechables puedan montarse en el instrumento. Ademas, el instrumento puede comprender una interface con el usuario con un monitor y/o un ordenador integrados para almacenar y realizar diversas operaciones en el procesamiento de celulas. Para este proposito, al menos un controlador de bomba puede operarse mediante el uso del ordenador. Puede estar presente un sistema de deteccion optico para una centrlfuga, para medir las densidades opticas en diversas posiciones en la camara. La camara centrlfuga puede ser desechable y ubicarse en un area de temperatura controlada. Pueden presentarse medios para el control de la temperatura del fluido que se mueve hacia la camara (calentador o enfriador). Una camara de cultivo celular puede ubicarse en el contenedor rotatorio, preferentemente, ubicada en la parte inferior, posiblemente con los medios para ajustar el foco de la camara.

La invencion se refiere, ademas, a un conjunto de tubos esteriles desechables para el procesamiento esteril de las celulas para usar con el sistema de la invencion. Tlpicamente, se proporciona una bolsa o puerto para las celulas iniciales. La tuberla y/o el sistema pueden configurarse para permitir la transferencia directa de las celulas del paciente a una bolsa para la muestra. Ademas, los siguientes pueden ser parte de la tuberla y/o el sistema: un puerto de entrada diferente para el medio de cultivo celular tampon, al menos un puerto de entrada para los reactivos del marcado magnetico, los puertos de entrada, tlpicamente, con filtros esteriles, un puerto de salida para desechos, y/o un puerto de salida para las celulas. El puerto de salida puede conectarse directamente con la bolsa de celulas para congelar. Ademas, un puerto de salida puede conectarse directamente con un contenedor para transfusion y/o inyeccion.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquematico de una columna de separacion o prefiltracion ilustrativa de la presente invencion.

La Figura 2 representa columnas de separacion y prefiltracion, junto con los contenedores de muestra y de recoleccion, interconectados mediante una serie de vlas para llquidos o circuitos de llquidos. La figura muestra, ademas, la posicion de las valvulas y una bomba peristaltica que se usa en la modalidad preferida del sistema de separacion.

La Figura 3 representa una unidad controlada por ordenador en la que se anaden columnas esteriles, tuberla desechable, y contenedores para almacenamiento y recoleccion, como se ilustra en la figura 2. En una modalidad preferida, la unidad controlada por ordenador contiene un magneto, valvulas y bomba peristaltica.

La Figura 4 representa el canal de flujo que se forma entre tres esferas adyacentes.

De la Figura 5 hasta la 7 se ilustran un sistema de conformidad con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 8 ilustra una camara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 9 ilustra una camara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con otra modalidad de la presente invencion.

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La Figura 9A ilustra una camara de un sistema de procesamiento, de acuerdo con una modalidad de la presente invention.

La Figura 10 muestra una vista en section transversal de una camara de procesamiento, de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 10A ilustra una vista en planta superior de una camara de procesamiento, de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 11 muestra una vista en seccion transversal de una camara de procesamiento, de acuerdo con otra modalidad de la presente invencion.

La Figura 11A ilustra una vista enfocada de una portion de una camara de procesamiento como se muestra en la figura 11.

La Figura 12 muestra una vista en seccion transversal de una camara de procesamiento, de acuerdo con aun otra modalidad de la presente invencion.

La Figura 12A muestra una vista sobre la parte inferior de la camara de procesos con una abertura para el suministro de gas y una membrana hidrofobica unida.

La Figura 12B muestra la parte inferior de la camara con canales espirales para la aireacion a traves de la membrana unida a la parte inferior de la camara.

La Figura 13 ilustra un sistema de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

De la Figura 14A hasta la 14N se ilustra un metodo de procesamiento de muestra representativo de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 15 ilustra un dispositivo de aireacion que puede ser parte del sistema de acuerdo a la invencion.

La Figura 16A muestra una camara para mezcla de gases que puede ser parte del sistema de acuerdo a la invencion.

La Figura 16B muestra la parte inferior de la camara para la mezcla de gases que puede ser parte del sistema de acuerdo a la invencion.

La Figura 17 muestra una vista del interior de una tapa para la camara que rota con un canal o brecha en el cual la muestra fluye durante la centrifugation, con un medio en la forma de un prisma para detectar el progreso de la separation de la muestra.

La Figura 18 muestra el curso de la luz a traves de la muestra por medio de un prisma. El prisma (prisma doble) se configura de manera que la luz a partir de una fuente de luz pueda penetrar, al menos parcialmente, a traves de, al menos una parte, de la muestra que se separa a traves de la centrifugacion, y la luz que pasa a traves de al menos una parte de la muestra puede detectarse mediante un detector de luz.

La Figura 19 muestra un prisma doble que es parte de una nervadura ubicada en la tapa de la camara que rota.

De la Figura 20 a la 29 se muestran los resultados de experimentos realizados con un sistema de acuerdo con la

presente invencion, mediante el uso de un metodo de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 20 muestra medula osea sin procesar (A, C) y celulas CD133 seleccionadas (B, D).

La Figura 21 muestra productos de aferesis sin procesar (A, B) y productos enriquecidos en CD14 (C, D).

La Figura 22 muestra la recoleccion de aferesis sin procesar (izquierda) y enriquecido en PDC (derecha).

La Figura 23 muestra la selection de CD4 mediante el uso de la presente invencion, la capa leucocitaria sin procesar (izquierda), celulas diana enriquecidas en CD4 (derecha).

La Figura 24 muestra la capa leucocitaria antes (izquierda) y despues (derecha) de la reduction de CD8 mediante el uso de la presente invencion.

La Figura 25 muestra el crecimiento de la llnea celular K562 en la camara de la centrlfuga.

La Figura 26 muestra medula osea sin procesar (izquierda) y celulas seleccionadas CD34 o CD133 despues de la elucion directa en 20 ml (derecha).

La Figura 27 muestra medula osea sin procesar (izquierda) y celulas seleccionadas CD34 o CD133 despues de la elucion directa en un volumen pequeno de 6 ml (derecha).

La Figura 28 muestra medula osea sin procesar (izquierda) y celulas seleccionadas CD34 o CD133 despues de la reduccion del volumen final por filtracion (derecha).

La Figura 29 muestra medula osea sin procesar (izquierda) y celulas seleccionadas CD34 o CD133 despues de la elucion directa en 20 ml (medio) y despues de la reduccion del volumen final por columna AutoMACS.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona un sistema de procesamiento de muestra que integra ambos, el sistema de separacion y las tecnicas de procesamiento de muestra. Un sistema puede incluir una unidad de procesamiento de muestra configurada para realizar ciertas etapas de procesamiento antes de los metodos de separacion, tales como separacion magnetica, cultivo de celulas o manipulation de las celulas. Como tal, la presente invencion puede incluir un sistema de procesamiento de muestra y un sistema de separacion de muestra combinados. Los sistemas o unidades de procesamiento de muestra pueden proporcionar los procesamientos de la muestra tales como cultivo de celulas, lavados, preparation, incubation, marcado, y lo similar. Adicionalmente, la unidad/sistema de procesamiento de muestra puede incluir las tecnicas basadas en la separacion por centrifugacion, donde una fuerza centrlfuga se aplica a la muestra para separar al menos un primer componente y un segundo componente de una muestra.

Por tanto, un sistema de la presente invencion tlpicamente incluira ambos, una unidad de procesamiento de muestra y una unidad de separacion de muestra. El sistema puede comprender o contener, ademas, una pluralidad de unidades de procesamiento de muestra y/o una pluralidad de unidades de separacion de muestra. El sistema combinado de procesamiento/separacion de la invencion puede incluir un sistema cerrado que puede programarse para realizar

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automaticamente una diversidad de etapas complejas de procesamiento de celulas, que incluye la separacion basada en la densidad, la separacion por inmunoafinidad, la separacion magnetica que incluye las inmunomagneticas, cultivo/estimulacion/activacion de celulas, lavados o etapas de formulacion final. Para este proposito el sistema puede controlarse por un programa de ordenador que puede ejecutarse en un ordenador. Las etapas del procesamiento de celulas pueden incluir, ademas, el suministro a las celulas de ciertas sustancias, que incluyen citocinas, materiales geneticos como ADN, ARN, virus, factores de transcripcion, antlgenos u otras sustancias qulmicas.

La invencion proporciona un sistema que minimiza los errores del usuario, mantiene la esterilidad, realiza etapas complejas de procesamiento de celulas que requieren poca o ninguna interaction manual, y minimiza la exposition del operario cuando se procesa un material infeccioso. Es posible el procesamiento en la cabecera de un enfermo o en un salon quirurgico. El dispositivo puede operarse mientras esta conectado a un paciente del cual se obtiene una muestra o al cual se le administra una muestra procesada o fracciones de esta. Por ejemplo, la medula osea que se obtiene de un paciente puede procesarse directamente dentro de una bolsa de entrada del conjunto de tubos. Desde ahl, el ejemplo de la medula osea puede procesarse, es decir, separarse en al menos dos componentes. Al menos uno de esos componentes puede administrarse al paciente, posiblemente despues de procesar el componente en una forma adecuada.

Los procesos de separacion realizados en base a la densidad con la unidad de procesamiento de muestra del sistema de la invencion incluyen, sin limitation, lavado de celulas, generation de la capa leucocitaria, separacion basada en la densidad mediante el uso de medios, por ejemplo, Ficoll™, Percoll™ (GE Healthcare), separacion basada en la densidad del marcado (por ejemplo, Rosettesep (tecnologlas de Celulas Madre), u otros procedimientos de densidad del marcado), separacion por la velocidad de sedimentation, por ejemplo, la elimination de trombocitos, elutriacion, adhesion celular y lo similar. Las tecnicas/etapas de procesamiento adicionales que pueden realizarse con una unidad de procesamiento de muestra del sistema de la invencion incluyen el cultivo de celulas, que incluye la expansion, estimulacion, diferenciacion, nueva diferenciacion, cargar antlgenos, transfection, transduction, cultivos, de celulas adherentes o en suspension, capas multiples de varios tipos celulares o mixtos, cultivos estacionarios o con fuerzas de cizallamiento o combinaciones. Los materiales de partida incluyen pero no se limitan a sangre, leucaferesis, medula osea, liposuction, leche, cualquier fluido corporal, celulas de tejidos, por ejemplo, celulas de diversos organos, celulas tumorales, celulas unicas, grupos celulares, aglomeraciones celulares, tejido disecado mecanicamente o junto con enzimas.

Como se declaro anteriormente, un sistema de la invencion incluira, tlpicamente, una unidad/sistema de procesamiento de muestra y una unidad/sistema de separacion de muestra. Los sistemas de separacion incluiran, tlpicamente, sistemas de separacion basados en magnetismo. Uno de tales sistemas de separacion basados en magnetismo que puede incluirse en el sistema de la presente invencion incluye los sistemas/procesos de separacion magnetica descritos, por ejemplo, en la amplia red mundial en el enlace "MiltenyiBiotec.com", y puede usarse para casi cualquier tipo celular. Los sistemas de separacion magnetica ilustrativos, que se describen en parte, mas abajo, se describen ademas, por ejemplo, en la description de la patente Europea Ep 0 869 838 B1 y en la patente de los Estados Unidos num. 5,691,208, WO02/094351.

Los metodos, dispositivos, y separadores magneticos mejorados para los procedimientos de separacion magnetica se proporcionan y se describen en EP 0 869 838 B1, los cuales pueden incluirse en un sistema de la presente invencion. Las matrices de los separadores magneticos proporcionan poros o canales uniformes que reducen el atrapamiento de aire o de sustancias no deseadas, disminuyen las perdidas de las sustancias diana debido a la disruption mecanica.

Las sustancias biologicas, tales como las celulas diana de diversos sistemas y organos, se marcan magneticamente con un miembro de union especlfico adecuado, y se alslan mediante el uso de dispositivos de la presente invencion. Es de particular interes el aislamiento de celulas multipotentes tales como las celulas madre hematopoyeticas o progenitoras. Mientras que la separacion de celulas hematopoyeticas se usa en la presente descripcion para proporcionar ejemplos de los procedimientos de separacion de celulas, la presente invencion puede aplicarse en una gama amplia de tipos celulares u otras sustancias biologicas.

Las celulas procesadas mediante el uso de la presente invencion pueden usarse para diversos propositos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades, mediante el uso de su potencial para proliferar y para diferenciarse as! como tambien sus funciones biologicas en organismos vivos, por ejemplo, sangre o tejidos.

Las aplicaciones de las celulas que pueden procesarse mediante el uso de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a

- ingenierla de trasplante, por ejemplo, junto con el trasplante de celulas madre

- trasplante de organos

- el tratamiento del cancer que incluye, pero no se limita a leucemia, que incluye la leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide cronica, y tumores solidos tales como el carcinoma de celulas renales, cancer de mama, melanoma, cancer de pancreas

- el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias refractarias tales como el lupus eritematoso sistemico o esclerodermia sistemica, Diabetes tipo 1, esclerosis multiple

- la terapia celular incluye pero no se limita al uso directamente de celulas efectoras

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- el tratamiento de enfermedades infecciosas

- la regeneracion de tejidos que incluye, pero no se limita a infarto del miocardio, dano del hlgado, o enfermedades neurodegenerativas, y

- la induccion de tolerancia que incluye pero no se limita a enfermedades autoinmunitarias o por rechazo al trasplante.

Los metodos de procesamiento que usa la presente invencion pueden combinarse a partir de diversas operaciones basicas que incluyen el lavado de celulas, cambio de medio, concentration de celulas, incubation de las celulas con diversas sustancias (que incluyen anticuerpos, citocinas, reactivos para la separation magnetica, medios), separation magnetica de las celulas, filtration y cultivo de celulas.

Los metodos de separacion magnetica pueden comprender ambos procedimientos, de enriquecimiento y de reduction (Bosio y otros. in "Engineering of Stem Cells", Springer 03/2009). Si las celulas diana pueden identificarse en base a protelnas de superficie, las celulas diana pueden enriquecerse con alta pureza. En algunas situaciones, las celulas no deseadas pueden identificarse en base a sus caracterlsticas funcionales no deseadas dentro de un contexto cllnico especlfico. Estas celulas no deseadas pueden eliminarse a partir del producto celular, que resulta en una mezcla heterogenea de diferentes celulas diana.

Los productos celulares procesados mediante la presente invencion para los procedimientos de ingenierla de trasplante pueden enriquecerse para CD34, CD133 o reducirse para CD3, CD3 y CD19, CD6, CD4 y CD8, el receptor alfa/beta de celulas T (TCR alfa/beta) o CD3/CD19/CD16/CD14, lo que resulta en, ya sean preparaciones celulares enriquecidas en celulas madre o celulas madre suplementadas con otras celulas inmunitarias tales como las celulas asesinas naturales y las celulas dendrlticas.

Los productos celulares procesados mediante la presente invencion para procedimientos de terapia celular pueden enriquecerse, por ejemplo, para CD14 (monocitos), CD56 (celulas naturales asesinas), CD335 (celulas naturales asesinas, NKp46), CD4 (celulas T auxiliadoras), CD8 (celulas T citotoxicas), CD1c (subconjunto de celulas dendrlticas de la sangre, BDCA-1), CD303 (BDCA-2), Cd304 (subconjunto de celulas dendrlticas de la sangre, BDCA-4), NKp80 (celulas T naturales asesinas gamma/delta, celulas T efectoras/memoria), "6B 11" (celulas T naturales asesinas invariantes, Va24/Vb11), CD137 (celulas T activadas), CD25 (celulas T reguladoras) o reducirse para CD138 (celulas plasmaticas), CD4, cD8, CD19, CD25, CD45RA, CD45RO. Las celulas asesinas naturales, celulas T asesinas naturales, celulas T y sus subgrupos pueden usarse como celulas efectoras en los procedimientos de infusion linfocitaria de donantes para eliminar celulas infectadas por virus, celulas tumorales o bacterias. Las celulas dendrlticas, ya sea generadas a partir de monocitos en cultivos celulares o aisladas directamente, pueden usarse para "vacunar" a los pacientes para promover la inmunidad con especificidad antigenica y natural contra celulas infectadas con virus, celulas tumorales, hongos y/o bacterias.

Ventajosamente, la presente invencion permite la obtencion de productos celulares mediante la clasificacion para dos o mas parametros que puede realizarse en un solo conjunto de tubos sin necesidad de transferir la suspension celular de uno de los tubos del conjunto de tubos que se usa a otro, por tanto se evita el dano potencial al producto celular (infection, contamination, aumento de la temperatura). Dos aplicaciones de clasificacion de parametros incluyen la generation de celulas T reguladoras altamente enriquecidas (primero se eliminan las celulas CD8 y/o CD19 y/o CD49d del producto celular y subsecuentemente queda enriquecido para CD25), de celulas asesinas naturales altamente enriquecidas (reducidas las CD3, enriquecidas con CD56) y de subgrupos de celulas dendrlticas de la sangre altamente enriquecidas (reducidas las CD19, enriquecido en CD1c).

Los procedimientos de regeneracion de tejido usualmente usan celulas progenitoras de la sangre, medula osea o tejidos para vascularizar nuevamente los tejidos, promover la generacion de tejido nuevo o proporcionar directamente tejido generado in vitro. Las celulas utilizadas pueden incluir productos celulares enriquecidos para CD133, CD34, CD271 (LNGFR, celulas madre mesenquimales), anti-MSCA-1 (W8B2, celulas madre mesenquimales), CD144 (celulas endoteliales).

Es una caracterizacion especlfica y novedosa de la presente invencion que la obtencion de productos celulares mediante la separacion celular y el cultivo pueda realizarse en un unico conjunto de tubos sin necesidad de transferir la suspension celular de celulas de uno de los tubos que se usa del conjunto de la tuberla a otro. En particular, la presente invencion puede usarse para obtener celulas madre, celulas T, celulas dendrlticas, celulas NK, celulas B, monocitos, celulas positivas para un marcador particular, tales como CD133, CD34, CD3, CD4, 8, 56, 19, 14, CD141 (BDCA-3), CD303 (BDCA-2), CD304 (BDCA-4), CD144, CD1c (BDCA-1), NKp46, NKp80, CD45RO, CD45RA, CD137, CD25, o CD138.

Composicion/formulacion:

Es una caracterizacion especlfica y novedosa de la presente invencion que los productos celulares que se obtienen mediante operaciones basicas como se describio anteriormente pueden componerse para uso cllnico directo. Los metodos conocidos en la tecnica requieren un procesamiento manual posterior de los productos de las celulas transformadas para adaptarlos a los requerimientos cllnicos. Con el sistema de la presente invencion, el producto celular puede formularse directamente para su uso inmediato. Las etapas de formulation incluyen: el ajuste a un volumen o

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concentracion celular deseado, el intercambio de los llquidos del procesamiento por los llquidos inyectables, la adicion de estabilizadores (tales como plasma o suero autologo, albuminas de suero, otras protelnas o pollmeros sinteticos) o de adyuvantes, la suplementacion con agentes crioprotectores tales como DMSO para el almacenamiento posterior, la extraccion de muestras de retencion para control de calidad, el suministro a combinaciones de bolsas o jeringuillas para infusion. Algunos componentes de la formulacion final, por ejemplo, plasma, plaquetas o componentes de plaquetas pueden derivarse a partir de la muestra de origen.

El sistema de separation magnetica de la presente invention puede usarse para marcar magneticamente y aislar cualquier sustancia diana deseada. De particular interes es la separacion de un componente especlfico a partir de una mezcla compleja. El sistema de separacion de la presente invencion tiene gran versatilidad, en el sentido de que casi cualquier sustancia diana puede separarse una vez que este disponible un miembro de union especlfico. La sustancia diana o analito puede ser cualquier miembro de un par de union especlfico, o una sustancia asociada con un miembro de un par de union especlfico. Como un ejemplo, puede usarse un par de union antlgeno de superficie celular y anticuerpo para aislar el propio antlgeno, las celulas que expresan el antlgeno, un organelo particular implicado en el procesamiento del antlgeno, etc. Los dispositivos y metodos de la presente invencion se aplican ventajosamente, ademas, a tecnicas de diagnostico que implican la union de un receptor y un ligando, tales como los inmunoensayos, y lo similar.

En su forma mas simple, un sistema de separacion de celulas de la presente invencion tiene dos componentes principales: un separador magnetico y un reactivo de separacion de celulas. En la figura 1 se proporciona un diagrama esquematico de un dispositivo separador magnetico. El diagrama muestra la construction general del separador y el paso uniforme del fluido que resulta del uso de una matriz de esferas metalicas. La figura 2 representa un dispositivo de separacion mas complejo, que incluye las posiciones generales del paso del fluido, los contenedores de recoleccion y almacenamiento y la columna de separacion. Los circuitos de fluido pueden construirse con valvulas integradas, o las valvulas pueden aplicarse externamente a las vlas de fluido.

Un tercer componente opcional para el sistema de separacion de celulas preferido es un instrumento de separacion de celulas. La Figura 3 representa un instrumento de separacion de celulas, preferentemente, controlado por un ordenador, que puede incorporar las valvulas junto con un magneto, bomba y teclado para el control. Un dispositivo similar al de la figura 2, que se construye sin las valvulas, puede montarse directamente sobre el instrumento de la figura 3 para usar en la separacion automatizada de celulas diana.

El reactivo de separacion de celulas, que puede, ademas, denominarse como un conjugado, reactivo de anticuerpo/partlcula magnetica o marcador magnetico, incluye un material magneticamente sensible unido a un miembro de union especlfico. Hay muchos materiales magneticamente sensibles bien conocidos usados en los metodos de separacion magnetica. La presente invencion implica el uso de partlculas o micropartlculas magneticamente sensibles. Las partlculas magneticas adecuadas se describen en Molday Patente de los Estados Unidos num. 4,452,773, y en la Especificacion de la Patente Europea EP 452342 B. Las partlculas de tamano coloidal, tales como las descritas en Owen Patente de los Estados Unidos num. 4,795,698, y Liberti y otros, Patente de los Estados Unidos num. 5,200,084, son, ademas, adecuadas.

El termino "miembro de union especlfico" como se usa en la presente description se refiere a un miembro de un par de union especlfica, es decir, dos moleculas, usualmente dos moleculas diferentes, donde una de las moleculas se une especlficamente a la otra molecula a traves de medios qulmicos o flsicos. Los miembros complementarios de un par de union especlfica se denominan a veces como un ligando y receptor. Ademas de los pares antlgeno y anticuerpo con especificidad de union, los pares de receptor de celulas T y antlgeno peptldico en el MHC; los pares con especificidad de union alternativos de interes incluyen biotina y avidina o estreptavidina; carbohidratos y lectinas; las secuencias de nucleotidos complementarias (que incluye secuencias de acido nucleico usadas como sondas y agentes de captura en ensayos de hibridacion de ADN); ligandos peptldicos y receptor; moleculas efectoras y receptoras; hormonas y protelnas de union a hormonas; cofactores de enzimas y enzimas; inhibidores enzimaticos y enzimas; marcadores de secretion, tal como se describe en la solicitud Internacional PCT/US93/10126, anticuerpos monoclonales autologos, y lo similar. Los pares con especificidad de union pueden incluir analogos, derivados y fragmentos del miembro de union especlfico original. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido a un antlgeno proteico puede reconocer, ademas, fragmentos peptldicos, mimeticos peptldicos sintetizados qulmicamente, protelna marcada, protelna derivatizada, etc. siempre que haya un epltopo presente.

Los pares inmunologicos con especificidad de union incluyen antlgenos y anticuerpos con especificidad antigenica o antlgenos de receptores de celulas T. Los antlgenos adecuados pueden ser haptenos, protelnas, peptidos, carbohidratos, etc. Pueden usarse metodos de ADN recombinante o slntesis de peptidos para producir analogos quimericos, truncados o de cadena sencilla de cualquiera de los miembros del par de union, donde las protelnas quimericas pueden proporcionar mezcla(s) o fragmento(s) de estos, o una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de union especlficos. Los anticuerpos y receptores de celulas T pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden producirse mediante animales transgenicos, animales inmunizados, celulas B humanas o de animales inmortalizadas, celulas transfectadas con vectores de ADN que codifican el anticuerpo o el receptor de celulas T, etc. Los detalles de la preparation de anticuerpos y su adecuacion para usar como miembros de union especlficos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

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En aras de la brevedad, el sistema de separacion se describira principalmente en terminos de su capacidad para seleccionar y separar especificamente una poblacion definida de celulas (celulas diana) a partir de una poblacion heterogenea de celulas, tales como sangre periferica, medula osea, sangre del cordon umbilical o placenta, sangre fetal o un producto de leucaferesis. Ademas, se apreciara que algunos tejidos pueden fragmentarse hasta una celula unica o suspension monodispersa para permitir el aislamiento de un subgrupo celular particular, tal como la separacion de los linfocitos infiltrantes del tumor en una masa tumoral, la separacion de islotes celulares a partir del tejido renal, etc. Por ejemplo, diversos tipos celulares pueden marcarse con un anticuerpo especifico para permitir la depuracion celular y/o el enriquecimiento celular. La poblacion de celulas diana se identifica generalmente mediante un miembro de union especifico, como se describio anteriormente, que se une selectivamente a un antigeno de superficie celular presente en las celulas diana. Sin embargo, debe entenderse, que el presente aparato y metodo no se limita a tales usos.

Por simplicidad, el miembro de union especifica se ejemplificara en la presente descripcion por un anticuerpo. El anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a una particula magnetica. Si el anticuerpo se une directamente a la particula magnetica, entonces la poblacion de celulas diana se marca magneticamente cuando el anticuerpo se une al antigeno de superficie celular. Si el anticuerpo se une indirectamente a la particula magnetica, entonces la poblacion de celulas diana es susceptible al marcado magnetico cuando el anticuerpo se une a las celulas diana. La poblacion de celulas unidas a anticuerpos se marca realmente por medio de un contacto ulterior de las celulas con un miembro de union especifico para el anticuerpo, donde ese miembro de union especifico se une por si mismo a una particula magnetica. Despues, las celulas diana, identificadas mediante tal marcado magnetico, se separan de otras celulas por medio de un campo magnetico. Por ejemplo, un miembro de union especifico tal como la avidina puede conjugarse a una particula magnetica donde la avidina se une a un anticuerpo biotinilado que a su vez se une especificamente a las celulas diana.

El miembro de union especifico puede unirse directamente a la particula magnetica. Esto puede lograrse por medio de grupos reactivos sobre el miembro de union especifico y la particula magnetica propiamente dicha. Alternativamente, el miembro de union especifico y la particula magnetica pueden unirse por medio de un agente de acoplamiento o un enlazador. Los terminos "agente de acoplamiento" o "enlazador", como se usan en la presente descripcion, incluyen diversos agentes bifuncionales formadores de uniones cruzadas o de acoplamiento, es decir, moleculas que contienen dos grupos reactivos o "extremos", que pueden separarse por un espaciador.

Las matrices convencionales de separacion magnetica de alto gradiente se preparan, tipicamente, a partir de materiales tales como alambres, fibra revestida con metal o lana de acero. En el dispositivo de separacion magnetica mejorado de la presente invencion, la matriz intensificadora de gradiente del separador magnetico de alto gradiente se forma a partir de esferas pequenas de material ferromagnetico o magneticamente susceptible. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a hierro, acero, niquel de cobalto y otros metales ferromagneticos de tierras raras o aleaciones de estos. Por ejemplo, el material de matriz puede incluir esferas metalicas ferromagneticas tales como esferas de hierro (por ejemplo, MARABU Balls, Kugelfabrik Schulte & Co., Wermelskirchen, Alemania). Se conocen muchos metodos diferentes de fabrication de esferas. Usualmente las esferas tienen un diametro promedio que varia de aproximadamente 0,2 a 1,5 mm para la separacion de celulas grandes o complejos celulares y de aproximadamente 0,05 a 0,2 mm de diametro para material subcelular. Preferentemente, las esferas tienen un diametro promedio que varia de aproximadamente 0,2 a 0,5 mm, y mas preferentemente, las esferas se seleccionan para tener un diametro promedio que varia de aproximadamente 0,2 a 0,3 mm. Es deseable que el tamano de las esferas sea relativamente homogeneo, que usualmente no varie mas de aproximadamente 15 % del tamano promedio, mas usualmente, por no mas de aproximadamente 10 % y, preferentemente, por no mas de aproximadamente 5 %.

La forma esferica sustancialmente simetrica y el tamano sustancialmente uniforme de las esferas son deseables para la construction de una matriz separadora magnetica, ya que las esferas pueden asumir una configuration entramada en donde las brechas entre las esferas forman canales o poros regulares en la matriz. La configuracion entramada es una estructura modelada de esferas que forma canales de tamano regular entre las esferas adyacentes y a lo largo de la matriz. Despues de la aplicacion de un campo magnetico al separador, se crean gradientes de campo magnetico en las brechas entre las esferas. El tamano uniforme, y por tanto el espaciado, de las esferas proporciona un gradiente magnetico sustancialmente uniforme a lo largo de la matriz, y caracteristicas de flujo de fluido sustancialmente uniformes. En la figura 4 se representa un canal de flujo. Las dimensiones del canal pueden describirse por la bola o particula de tamano maximo que encajaria entre las esferas de la matriz. Con respecto a la figura 4, la relation geometrica es r = aproximadamente 0,155 R. Se apreciara a partir de las ensenanzas de la presente invencion que el tamano del canal puede ajustarse a un diametro promedio optimo para el proceso de separacion deseado mediante la variation del tamano de las esferas que se usan para formar la matriz.

La forma esferica proporciona la formation de una estructura de matriz sustancialmente estable cuando las esferas se empaquetan dentro de una carcasa que define una camara de separacion. Como se describe con detalle mas abajo, la matriz se reviste, ademas, con un material sustancialmente impermeable a los fluidos tal como un polimero plastico. Cuando se aplica un recubrimiento de polimero plastico, se cierran las brechas estrechas entre las esferas, lo que resulta en una matriz hidrodinamicamente optimizada. La matriz ferromagnetica resultante usualmente ocupara entre 60 % a 75 % del volumen total de la camara de separacion y sera permeable a los fluidos. El recubrimiento impermeable ocupara aproximadamente de 1 a 5 % del volumen total. El volumen libre variara de aproximadamente el 20 % al 40 %

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del volumen total de la camara de separacion. En una modalidad preferida, la matriz total ocupara aproximadamente 75 % a 80 % del volumen total de la camara de separacion.

La Figura 1 presenta un esquema de una columna de separacion ilustrativa. Las esferas no se representan a escala, sino para representar mejor la formacion de una matriz tridimensional permeable al fluido 6. Las esferas se empaquetan en una carcasa 4 que se hace de un material no magnetico. La carcasa del separador magnetico sirve como el cuerpo de la columna de separacion, y el interior de la carcasa define una camara de separacion. Las carcasas de varias longitudes, formas y diametros se hacen ventajosamente de plastico. Los materiales no magneticos adecuados para la construccion de una carcasa del separador magnetico incluyen acero inoxidable, vidrio, plastico, etc.

En una modalidad preferida, la carcasa del separador magnetico es un plastico al que se adherira el recubrimiento de matriz, lo que permite propiedades hidrodinamicas mejoradas en el llmite de la matriz y la carcasa. Se apreciara que el material de recubrimiento y el material de la carcasa se seleccionaran por su compatibilidad entre si, por ejemplo, debe seleccionarse un recubrimiento de barniz que no resulte en la acumulacion de residuos plasticos no adherentes en la columna. Se conocen diversos mecanismos mediante los cuales los materiales se adhieren entre si y pueden explotarse para este proposito. Convenientemente, la seleccion para la compatibilidad puede hacerse en base al disolvente que se usa junto con el barniz. El disolvente sera ligeramente reactivo con la carcasa de plastico, de manera que el barniz se adhiera en el disolvente, pero no tan reactiva que se vea comprometida la integridad estructural de la columna durante el proceso de curado del barniz. Por ejemplo, el material de recubrimiento puede seleccionarse para incluir un disolvente que provoque una ligera disolucion del interior de la carcasa de plastico. Despues del curado, el material plastico se endurece y por consiguiente une o sella entre si al material de recubrimiento y al material de la carcasa. Un experto en la tecnica apreciara que la informacion relativa a tal reactividad es disponible generalmente. Un ejemplo de una combinacion adecuada de una carcasa y un disolvente es metiletilcetona y el plastico ULTEM® (General Electric).

Preferentemente, cada uno de los materiales seleccionados para la construccion de la columna de separacion 2 sera compatible, ademas, con los procedimientos de esterilizacion. Preferentemente, la carcasa tiene forma cillndrica para facilitar el flujo de la muestra a traves de la camara de separacion, as! como tambien, la formacion de la matriz tridimensional 6 dentro de la carcasa. Las paredes de la carcasa tienen, preferentemente, un grosor de aproximadamente 1 a 3 mm. La columna de separacion tiene puertos de entrada 12 y salida 14 para la introduccion y descarga de fluidos. Generalmente, los puertos de entrada y salida son estructuras estrechas con relacion al cuerpo principal de la carcasa. Esto facilita la union del separador a los circuitos de fluido adicionales en un sistema de separacion y mantiene el dispositivo, ventajosamente, como un sistema cerrado. Los puertos de entrada y de salida pueden ubicarse en sitios diferentes de los representados en la figura 1, pero se apreciara que la estructura global del separador proporcionara, preferentemente, una camara de separacion que tenga el menor numero de curvas o esquinas que podrlan de cualquier otra manera retardar el flujo del fluido o crear espacios donde la muestra podrla acumularse.

En la entrada y salida de la columna, la columna se construye para tener un mecanismo de alimentacion que asegure una distribucion homogenea optima y un flujo a traves de la matriz. El mecanismo de distribution se comprende por el volumen delante de la capa de la tapa 8 y la propia capa de tapa, que sirve como resistencia de flujo. El volumen de distribucion (en mililitros) puede definirse con relacion al ancho de la columna (en millmetros), que usualmente tiene una relacion de aproximadamente 0,1 a 10. El volumen de la camara delante de la capa base 10, as! como la propia capa de base, sirven, ademas, como mecanismos de alimentacion para fluidos que pasan a la camara a traves del orificio de salida.

Es preferible tener dimensiones de columna donde la relacion de diametro con respecto a la longitud es al menos 0,2 a 1. Las dimensiones reales de la columna dependeran del material que se va a separar, y del flujo deseado para la separacion. Las dimensiones de la columna proporcionaran una camara que aceptara una matriz que tenga un area superficial adecuada para crear gradientes de campo magnetico suficientes en la camara de separacion y que permita una retention eficaz del material marcado magneticamente. El volumen necesario para una separacion dada puede determinarse emplricamente y variara con el tamano, la densidad del antlgeno en la superficie celular, la afinidad de anticuerpos, etc. Como un ejemplo, un area local de 3 cm2 permite un flujo de 5 a 40 ml/minuto. La capacidad de union de una matriz de 2 x 4 cm es de aproximadamente 109 celulas marcadas.

Para facilitar la fabrication de la columna de separacion, la capa de base 10 de material poroso no magnetico se coloca en la carcasa de manera que cuando las esferas ferromagneticas se colocan en la camara no pasan a traves del puerto de salida 14. Los materiales porosos adecuados para la formacion de la capa base incluyen, pero no se limitan a, plastico poroso, metales sinterizados o vidrio, rejillas, etc. Por ejemplo, pueden usarse diversos sinterizados porosos disponibles de Porex Singwitz, Alemania. Usualmente, el material poroso tendra un tamano de poro de aproximadamente 20 a 200 pm, preferentemente de 50 a 150 pm. Se seleccionara un tamano de poro adecuado de acuerdo con las dimensiones de la sustancia diana y la composition del material de muestra. Ademas, el tamano de poro no sera tan grande como para permitir que las esferas llenen las aberturas porosas del material de la capa. Despues de la insertion de las esferas en la camara, la carcasa puede sacudirse o vibrarse para facilitar el asentamiento de las esferas en una configuration mas uniforme. Opcionalmente, la capa de tapa 8 de material poroso no magnetico se coloca en la carcasa sobre la matriz para mantener la configuracion uniforme de la matriz durante el almacenamiento, la manipulation y el uso. Ademas, puede aplicarse presion a la capa de tapa 8 para empacar mas firmemente las esferas dentro de la camara. La parte superior 16 de la columna de separacion, que incluye el puerto de

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entrada 12 en esta modalidad, se coloca entonces en la parte superior de la carcasa 4 y se une a la carcasa. Por ejemplo, cuando se usan materiales plasticos, la parte superior l6 puede pegarse o soldarse ultrasonicamente a la carcasa 4 para completar la formacion de la columna de separacion. Despues de completar la carcasa, se recubre la matriz.

Con respecto a la Figura 1, se aplica un recubrimiento a la matriz permeable al fluido descrita anteriormente. El recubrimiento se selecciona para ser sustancialmente impermeable a los iones, y por tanto protege el material de la matriz metalica de la corrosion as! como tambien inhibe el escape de los cationes de la matriz, los que podrlan danar las celulas. Ademas de la formacion de una capa protectora impermeable sobre el material de la matriz, un recubrimiento completo de la matriz cierra las brechas entre las esferas, lo que proporciona tanto la estabilidad mecanica de la matriz, como una matriz optimizada hidrodinamicamente. Dicha estabilidad mecanica es particularmente ventajosa cuando la matriz se forma a partir de pequenas esferas de metal, susceptibles o sensibles magneticamente, como se describio anteriormente. Un material de recubrimiento tal como un recubrimiento de barniz puede fluir hacia el puerto de entrada 12 de la columna de separacion. El barniz fluye a traves de la capa de tapa 8, matriz 6 y capa de base 10, y por consiguiente recubre la superficie porosa de cada componente. El exceso de barniz se deja pasar desde el puerto de salida 14 de la camara. La columna de separacion revestida puede centrifugarse para expulsar, adicionalmente, el exceso de material de recubrimiento de la camara. Despues, se deja secar el recubrimiento. La columna de separacion puede calentarse para promover, adicionalmente, el secado del recubrimiento. Por ejemplo, la columna de separacion recubierta puede colocarse en un horno a 110 oC durante cuatro a cinco horas seguido de secado continuo a temperatura ambiente durante tres a siete dlas.

Al secarse, el recubrimiento se endurece, y por consiguiente le proporciona un soporte mecanico a la matriz. Este soporte mecanico no solo ayuda a mantener la integridad de la matriz durante el almacenamiento y manipulacion de la columna de separacion, sino que, ademas, le proporciona a la matriz una estructura rlgida que no presenta una elasticidad significativa. Esta rigidez es ventajosa porque de otra manera la matriz podrla deformarse tras la aplicacion de un campo magnetico externo a la columna de separacion. La fuerza del campo magnetico aplicada de los medios magneticos externos esta, tlpicamente, dentro de un intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.5 Tesla, y mas preferentemente, entre aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.8 Tesla. El campo debe ser lo suficientemente grande y la distancia entre el magneto y la columna de separacion debe ser lo suficientemente pequena como para inducir gradientes intensificados del campo magnetico dentro de la matriz. Para mantener gradientes magneticos uniformes en el separador, el material de la matriz debe moverse o desplazarse en la camara tras la aplicacion del campo magnetico. Los componentes metalicos esfericos, la carcasa y el recubrimiento se combinan ventajosamente en la presente invencion para proporcionar una matriz mejorada con suficiente rigidez para resistir una deformacion sustancial cuando la columna de separacion se coloca dentro de un campo magnetico.

Es preferible recubrir la matriz mientras que los componentes metalicos esfericos estan dentro de la columna de separacion en la carcasa. El recubrimiento de la matriz dentro de la carcasa evita la interrupcion de la matriz despues que se aplica el recubrimiento. Ademas, la matriz dentro de la carcasa sirve para llenar o sellar pequenos espacios huecos, hendiduras intersticiales formadas cerca de los puntos de contacto entre las esferas, as! como tambien entre las esferas y la carcasa, mientras que simultaneamente proporciona una superficie uniforme a los canales o formada por los puntos separados de las esferas. Estos canales o poros resultan en la permeabilidad de la matriz. Al sellar los espacios vaclos, hay una disminucion en las areas donde las celulas u otros componentes solidos de la muestra pueden formar una cuna o quedar atrapadas flsicamente, incluso en ausencia de un campo magnetico.

En la columna de separacion terminada, la seleccion de materiales de recubrimiento de la matriz resultara, preferentemente, en canales o vlas a traves de la matriz permeable que tienen un diametro promedio que varla de 20 a 60 pm y una ocupacion de aproximadamente 60 % a 80 % del volumen total de la camara de separacion. Por ejemplo, una columna de separacion para la separacion de las celulas de la sangre puede tener un tamano de canal recubierto final con un promedio de 20 pm, con la matriz que ocupa aproximadamente el 80 % del volumen total de la camara.

Despues de la preparacion del recubrimiento sustancialmente impermeable, la matriz y otras superficies interiores de la camara de separacion se tratan adicionalmente, preferentemente, mediante la adicion de un material hidrofilo tal como polividona (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Otros materiales de recubrimiento hidrofilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polivinilpirrolidina, polietilenglicol, hidroxietilalmidon, y recubrimientos hidrofilos, tales como acrilamidas, surfactantes o agentes humectantes de tipo detergente, y material biologico que incluye, pero no se limita a, heparina y albumina de suero humano. La superficie interior de la camara de separacion puede, ademas, hacerse hidrofila mediante plasma o grabado en corona de la superficie. El recubrimiento hidrofilo proporciona al interior de la columna de separacion y la matriz permeable a los fluidos con una superficie facilmente humectable. Mediante la mejora de la humectabilidad de estas superficies, la introduction de fluido en la columna de separacion producira un frente de fluido uniforme cuando este pase a traves de la camara. Esto facilita la elimination de burbujas de aire de la matriz permeable y otros espacios vaclos en la camara de separacion. Es deseable mantener la columna de separacion y otros componentes del dispositivo como un sistema cerrado sustancialmente libre de aire durante el proceso de separacion. La presencia de aire en el sistema durante la separacion de las celulas diana afecta las tensiones superficiales interiores y las areas no ventiladas, lo que puede conducir a la destruction celular.

Con respecto a la Figura 2, que representa un dispositivo de separacion, la columna de separacion 40 puede

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precederse por un dispositivo de prefiltracion. La figura representa el dispositivo de prefiltracion como una columna 30, sin embargo, debe entenderse que pueden usarse otras configuraciones, tales como el prefiltro. Generalmente, la columna de prefiltracion es una estructura tridimensional que puede ser sustancialmente identica a la columna de separacion en terminos de su composicion estructural. Sin embargo, la columna de prefiltracion puede tener dimensiones diferentes, la matriz puede hacerse de esferas que tienen una composicion diferente, por ejemplo, un material no ferromagnetico o la matriz puede hacerse de esferas que tienen un diametro diferente al que se usa en la columna de separacion, lo que proporciona de esta manera un tamano de poro o canal diferente del que se encuentra en la columna de separacion. En una modalidad, la columna de prefiltracion es identica a la columna de separacion. El paso de la muestra a traves de la columna de prefiltracion sirve para atrapar y eliminar los componentes del fluido que no se desean en el producto de separacion final. Por ejemplo, en las separaciones de celulas de la sangre, las celulas "pegajosas" tales como monocitos, granulocitos y plaquetas pueden eliminarse de la suspension celular mediante la columna de prefiltracion. Alternativamente, la columna de prefiltracion puede construirse para tener un tamano de poro promedio que es menor que el que se encuentra en la columna de separacion. Por ejemplo, el tamano de poro de la matriz permeable puede seleccionarse para eliminar celulas tumorales grandes de la muestra antes del paso del fluido a traves de la columna de separacion. El paso de fluido de la muestra a traves de la columna de prefiltracion puede servir, ademas, para separar agregados, tales como agregados celulares, que pueden existir en el fluido. Ademas, debido a que la columna de prefiltracion contiene materiales sustancialmente identicos a los de la columna de separacion, los componentes de la muestra que podrlan unirse no especlficamente a la columna de separacion son atraldos ventajosamente por la columna de prefiltracion. Por tanto, la columna de prefiltracion reduce la posibilidad de ensuciar la columna de separacion durante el proceso de separacion, y esto reduce la recoleccion de celulas o componentes del fluido no deseados en el producto de separacion final.

Con respecto a la Figura 2, se representa una modalidad preferida del dispositivo de separacion 25. El contenedor de muestra 81 se conecta a un filtro de suspension opcional 35. El filtro de suspension puede usarse para eliminar las partlculas componentes no deseadas del fluido de la muestra y se selecciona para tener un tamano de poro suficiente para eliminar partlculas por encima de un cierto tamano. Por ejemplo, el filtro de suspension puede ser un filtro Pall (Pall SQ40S, Pall Biomedical, Inc., Puerto Rico) que tiene un tamano de poro seleccionado para eliminar partlculas mayores de 40 pm, tales como coagulos y conglomerados de celulas en muestras de celulas hematopoyeticas. El filtro de suspension se conecta por la via de fluido dos 12 al puerto de entrada 32 de la columna de prefiltracion 30.

El puerto de salida 34 de la columna de prefiltracion 30 se conecta por la via de fluido cinco 15 al puerto de entrada 42 de la columna de separacion 40 a la que se aplicara el campo magnetico durante el proceso de separacion. El puerto de salida 44 de la columna de separacion se conecta por la via de fluido ocho 18 al canal de distribucion 88 que conduce al contenedor de recoleccion de producto 83, al contenedor de desecho de lavado final 84 y al contenedor de muestra no marcada 85. Las vlas de fluido separadas, nueve 19, diez 20, veinte y once 21 conducen a estos contenedores, respectivamente.

Este dispositivo de separacion incluye, ademas, un contenedor 80 de lavado o tampon y un contenedor 82 de desecho del lavado inicial, los cuales se conectan por las vlas de fluido uno 16 y tres 17, respectivamente, a la via de fluido dos 12. El contenedor tampon 80 se conecta, ademas, a traves del conducto de lavado o de la llnea tampon 90 (via de fluido seis) al canal de distri bucion 88. La llnea de tampon se conecta, ademas, a la via de fluido cinco 15 por medio de la via de fluido cuatro 14. Las vlas de fluidos, contenedores, filtros y columnas pueden acoplarse entre si por medio de cualquier medio adecuado tal como espigas estandar, cerraduras Luer, conectores macho-hembra, conectores en T, conectores en Y, y conectores de 4 vlas u otros accesorios como se usan comunmente en los conjuntos de suministro de solucion intravenosa.

El flujo de fluido a traves de los circuitos de fluido del dispositivo de separacion puede controlarse por medio de valvulas ubicadas dentro de la(s) vla(s) de fluido. Las vlas de fluido del uno al once se asocian con las correspondientes valvulas de uno a once (1-11). Las valvulas pueden estar dentro de las mismas vlas o pueden ser externas a las vlas. El flujo de fluido puede controlarse, ademas, por una bomba. Por ejemplo, cuando las vlas de fluido se hacen de un material flexible, tal como un tubo flexible, las valvulas adecuadas para el control del transporte de fluido incluyen valvulas de pinza. Las valvulas de pinza cierran la via del fluido porque presionan las paredes del tubo una contra la otra. Los expertos en la tecnica apreciaran que tales valvulas de pinza se seleccionaran para acomodar el tamano de la tuberla elegida para usar como una via de fluido. Ademas, la fuerza de compresion de la valvula de pinza se seleccionara para lograr la compresion de la tuberla elegida y, de esta manera, incidir en el cierre de la via de fluido. Las especificaciones de la valvula, por tanto, se adaptaran a las especificaciones de suavidad o dureza (durometro) de la tuberla seleccionada.

Una modalidad del dispositivo de separacion incluye, ademas, el lazo de recirculacion 92 (via de fluido siete) de manera que el fluido que ya paso a traves de la columna de separacion 40 puede recircularse a traves de la columna de separacion. Tlpicamente, una bomba 64 se conectara al lazo de recirculacion para facilitar el reciclado del fluido a traves de la columna de separacion as! como tambien para controlar el flujo a traves de la columna. Los expertos en la tecnica apreciaran que puede usarse una diversidad de bombas. Una bomba ilustrativa es una bomba peristaltica que puede controlar el paso de fluido a traves del lazo de recirculacion en ambas direcciones y a velocidades variables. El dispositivo de separacion que tiene un lazo de recirculacion permite separaciones secuenciales en una columna,

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mediante un proceso de union y elucion, seguido por un segundo proceso de union y elucion. Las separaciones secuenciales proporcionan una pureza mejorada en la poblacion diana final.

La Figura 2 representa esquematicamente una modalidad preferida de un dispositivo de separacion. Sin embargo, se apreciara que puede lograrse un proceso de separacion mediante el uso de los componentes basicos del sistema, es decir, el separador magnetico mejorado y los contenedores de recoleccion.

Los expertos en la tecnica apreciaran que los medios de recirculacion y las vlas de flujo del fluido de la presente invention son adecuados, ademas, para usar en sistemas de separacion alternativos. Por ejemplo, los medios de recirculacion pueden usarse, ventajosamente, en un sistema en donde los medios de separacion implican tecnicas de centrifugation, columnas de absorcion o medios qulmicos como alternativas a los medios de separacion magnetica o electromagnetica.

En un proceso de separacion de celulas ilustrativo, las vlas de fluido y las columnas se ceban para permitir que un llquido de lavado fluya a traves de todas las vlas y columnas de fluido, preferentemente, a velocidades de flujo y presiones variables. El llquido de lavado puede contener materiales tal como una protelna fisiologicamente aceptable, tal como albumina de suero humano (HSA), que inhibe la adhesion de las celulas a las superficies interiores de los componentes plasticos del dispositivo. El llquido de lavado puede contener, ademas, pequenas cantidades de surfactantes o detergentes fisiologicamente aceptables, para mejorar la humectacion de las superficies interiores.

Se encontro que las grandes burbujas de aire en las vlas de fluido son perjudiciales para la recuperation de celulas viables. En la tecnica se conocen metodos para eliminar las burbujas de aire de las vlas de fluido, y pueden emplearse para este proposito. Un metodo de particular interes hace uso de la observation de que un sinterizado permeable, tal como los que se usan en la capa de tapa y/o la capa de base, no permitira el paso de burbujas de aire a una velocidad del flujo de los fluidos menor que aproximadamente 400 ml/minuto. Una columna puede liberarse de burbujas de aire mediante la circulation del llquido de lavado a traves de un lazo de recirculacion a velocidades de flujo menores que aproximadamente 400 ml/minuto. Las burbujas de aire se acumulan entonces fuera de la columna en las capas de base y/o tapa. Despues, se invierte la direction del flujo y las burbujas son eliminadas del sistema dentro de una bolsa de desecho adecuada. Preferentemente, la secuencia se repite para asegurar la elimination de todas las burbujas. Las burbujas existentes pueden ampliarse intencionalmente por la generation de presion negativa.

En tal proceso ilustrativo, pueden usarse anticuerpos conjugados magneticamente para dirigirse especlficamente a las celulas deseadas en una poblacion heterogenea de celulas. El reactivo magnetico se incuba con la poblacion heterogenea de celulas, despues las partlculas no unidas se eliminan por cualquier medio conveniente, por ejemplo, centrifugacion, etc. Cuando se desea la esterilidad de las celulas, las incubaciones de anticuerpos y los lavados pueden realizarse en un proceso de contenedor cerrado, donde los anticuerpos y llquidos de lavado se anaden a un contenedor esteril por medio de una jeringuilla esteril o dispositivo similar. De esta manera, se minimiza la contamination por microorganismos transmitidos por aire de las celulas deseadas. En un sistema cerrado de este tipo, particularmente cuando el contenedor es una bolsa flexible, la mezcla de celulas y anticuerpos puede mejorarse mediante la inyeccion de una pequena cantidad de aire esteril, en una relation de aproximadamente 0,5 a 2 de aire a llquido, dentro del contenedor.

La suspension de celulas incubadas, que ahora contiene celulas diana marcadas magneticamente, se pasa a traves del dispositivo de separacion. El sistema transporta las celulas a traves de un separador magnetico que se ubica dentro o adyacente a un campo magnetico. La fuente del campo magnetico puede ser un magneto permanente o un electromagneto. La columna de separacion se construye, preferentemente, para incluir una matriz ferromagnetica de esferas ferromagneticas apiladas, como se describio anteriormente. Opcionalmente, la muestra se pasa a traves de una columna de prefiltracion, que se construye, ademas, como se describio anteriormente, antes de pasarla a traves de la columna de separacion. Si la columna de separacion contiene una matriz compuesta de esferas diferentes a las ferromagneticas, entonces la muestra puede pasarse primero a traves de una columna de prefiltracion que es sustancialmente identica a esa columna de separacion.

Las celulas marcadas magneticamente se acumulan en la columna de separacion en respuesta al campo magnetico. Las celulas no marcadas y otros componentes de la suspension pasan a traves de la columna de separacion y hacia un contenedor de muestra no marcada y/o contenedor de desecho. Despues, las celulas marcadas o purificadas pueden eluirse de la columna de separacion ya sea mediante la eliminacion de la columna de separacion del campo magnetico o por la eliminacion del campo magnetico de la columna de separacion. Para lavar las celulas marcadas de la columna de separacion se pasa una solution de lavado, tal como un llquido tamponado, a traves de la columna de separacion y hacia un contenedor de recoleccion del producto. El contenedor de recoleccion puede usarse para el procesamiento ulterior de las celulas diana o la crioconservacion de las celulas diana.

En las modalidades preferidas, la columna de separacion es una columna de separacion magnetica de alto gradiente que se construye a partir de esferas ferromagneticas, como se describio anteriormente. Los contenedores referidos en la presente description son, tlpicamente, bolsas de plastico, tales como las que se usan para el almacenamiento y el suministro de fluidos intravenosos, pero puede usarse cualquiera de los contenedores adecuados. Los contenedores se seleccionaran por su volumen de almacenamiento o de recoleccion necesario, su capacidad para la esterilizacion y su

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capacidad para usarse en un sistema cerrado, es decir, un sistema de separacion del que puede eliminarse sustancialmente todo el aire antes de usar.

En otra modalidad, las celulas marcadas magneticamente se recirculan a traves de la columna de separacion para mejorar la seleccion de las celulas diana y la eliminacion de celulas u otros componentes no deseados de la suspension. Algunas modalidades preferidas incluyen, ademas, el uso de una columna de prefiltracion. Sin embargo, la columna de prefiltracion no se somete a un campo magnetico. En su lugar, el paso preliminar de la suspension de celulas a traves de la columna de prefiltracion resulta en la captura de componentes de la suspension o materiales que de cualquier otra manera podrlan unirse no especlficamente a la columna de separacion. Tales uniones no especlficas pueden provocar el bloqueo o la suciedad de la columna de separacion, lo que a su vez, podrla inhibir o reducir la separacion y recoleccion de la poblacion de celulas marcadas.

Las vlas de fluido, los contenedores de recoleccion, los filtros de la suspension, la columna de prefiltracion y la columna de separacion, pueden construirse, interconectarse y suministrarse como un dispositivo de separacion desechable. Las celulas diana se recolectan, preferentemente, en un contenedor de transferencia de sangre esteril a partir del cual las celulas pueden trasplantarse al paciente o en el que las celulas pueden almacenarse o someterse a procesamiento adicional. El dispositivo completo de separacion de celulas puede empaquetarse previamente en contenedores adecuados. El dispositivo empaquetado previamente puede esterilizarse y proporcionarse listo para usar en el proceso de separacion magnetica mejorado de la presente invencion. Los reactivos necesarios para el proceso de separacion deseado pueden proporcionarse, ademas, en forma de estuche. Por ejemplo, un conjugado especlfico para la poblacion de celulas diana u otro analito puede proporcionarse por separado o con el dispositivo. El estuche puede incluir, ademas, soluciones de lavado, por ejemplo, solucion salina esteril estandar, y/u otros llquidos tamponados, tales como solucion salina tamponada con fosfato, EDTA 1 mmol/l y albumina de suero humano al 0,5 %. Estos reactivos u otras soluciones pueden proporcionarse en contenedores tales como bolsas de plastico que pueden conectarse a los pasos de fluido apropiados del dispositivo de separacion de celulas.

El sistema de separacion mejorado de la presente invencion puede automatizarse totalmente. En el sistema automatizado, un ordenador controla el flujo de los fluidos a traves de los circuitos de fluido y la columna de separacion, controla la fuerza del campo magnetico o la colocacion del magneto y/o la columna de separacion para proporcionar la retencion y liberacion de las celulas diana o analitos marcados magneticamente, y dirige los productos de recoleccion final hacia los contenedores apropiados.

Una modalidad de un instrumento automatizado de separacion de celulas, como se representa en la figura 3, incluye componentes mecanicos, electromecanicos y magneticos. Los componentes mecanicos pueden incluir: una cubierta exterior o carcasa 15 del instrumento; soporte del contenedor ajustable 21; bomba peristaltica 64; el soporte de la columna de prefiltracion 32 y el soporte de la columna de separacion 42. Los componentes electromecanicos pueden incluir: valvulas de pinza solenoide 1-11; un motor interno (no mostrado) para accionar la bomba peristaltica 64; un motor interno (no mostrado) para mover el soporte de la columna de separacion 42 (y de esa manera mover la columna de separacion 40) dentro o fuera del campo magnetico, o para mover el magneto 50; y un detector de burbujas (sensor ultrasonico) 65, que se usa para detectar la presencia de fluido en los circuitos de fluido. Los medios magneticos pueden incluir magnetos permanentes y electromagnetos. Se apreciara que estos componentes individuales pueden seleccionarse de una serie de suplentes facilmente disponibles y pueden combinarse en una variedad de configuraciones sin apartarse de la descripcion general del sistema de separacion magnetica mejorado de la presente invencion.

En una modalidad preferida del dispositivo de separacion, las vlas de fluido, los contenedores de solucion y de recoleccion, el filtro de suspension, la columna de prefiltracion, la columna de separacion y los conectores se proporcionan como un componente desechable preensamblado al sistema de separacion. El dispositivo de separacion se monta sobre el instrumento de separacion para realizar el proceso de separacion. Una vez completado el proceso de separacion, el contenedor de recoleccion de producto puede retirarse y los componentes restantes del dispositivo de separacion se desechan.

Preferentemente, un microprocesador incorporado (no mostrado) controla todos los componentes electromecanicos del instrumento, y el programa dirige al sistema para realizar las operaciones apropiadas en una secuencia estandar. Una pantalla 62 y el teclado del operario 60 permiten al operario supervisar el funcionamiento automatico del sistema y controlar el funcionamiento del instrumento en un modo manual. Una impresora (no mostrada) puede conectarse al microprocesador para imprimir la information de proceso, etiquetas, etc.

La Figura 3 representa un instrumento de separacion y un dispositivo de separacion montado. En esta modalidad, el dispositivo de separacion se monta o instala sobre el instrumento mediante el posicionamiento de la tuberla de las vlas de fluido en sus respectivas valvulas de pinza externas 1-11, como se describio anteriormente. La columna de prefiltracion 30 se coloca dentro del soporte 32 de la columna de prefiltracion. La columna de separacion 40 se coloca dentro del soporte de la columna de separacion 42 que se mueve con relation al magneto 50 por medio del brazo retractil 44. La manija ajustable 20 se usa para asegurar el brazo de suspension 21 en una position elevada. Hay monturas o clavijas 22 en el brazo de suspension sobre las cuales se coloca el contenedor de desecho de lavado inicial 82 y los contenedores de tampon y muestra (no mostrados) segun sea apropiado. El aparato puede incluir, ademas, el

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compartimento de almacenamiento 70 para separar el contenedor de desecho final y el contenedor de muestra no marcada del contenedor de recoleccion de producto (no mostrado).

Como se menciono anteriormente, los sistemas de separacion como se describio anteriormente pueden integrarse adicionalmente con diversos sistemas de procesamiento de muestras/celulas para realizar las etapas de preparacion de la muestra antes de la separacion del componente de la muestra mediante las tecnicas de separacion magnetica descritas. La figura 5 ilustra un sistema de acuerdo con una modalidad de la presente invencion. Como se describio anteriormente, un sistema de la presente invencion puede incluir diversos componentes mecanicos, electromecanicos y magneticos. El sistema 100 incluye una unidad de separacion 106 y una unidad de procesamiento 104 integradas en un sistema unico que contiene una cubierta exterior o carcasa 105. El sistema 100 puede incluir un sistema o unidad de separacion magnetica similar a los descritos anteriormente. El sistema 100 incluye una unidad de separacion magnetica 106 que incluye una carcasa para colocar una columna de separacion (por ejemplo, una columna de separacion magnetica como se describio anteriormente, figura 1) en la unidad de separacion magnetica 106. El sistema 100 incluye ademas una bomba 108 y una pluralidad de medios o valvulas de control del flujo de fluido, como se ilustra por medio de la valvula 110. Se observa que, mientras que solamente la valvula 110 se identifica especlficamente por un numero, el sistema 100, como se muestra en la figura 5, ilustra un numero de valvulas que son identificables al tener una estructura ilustrada identica a esa de la valvula 110. Ademas, se reconocera que, mientras que cada uno de la pluralidad de medios/valvulas de control de flujo son identicos en la figura 5 con propositos ilustrativos, los medios de control de flujo de acuerdo con la presente invencion pueden tomar una variedad de modalidades y pueden incluir uno o mas tipos diferentes de medios/valvulas en un sistema unico. Los componentes del sistema 100 (por ejemplo, valvulas, bomba, unidad de separacion, etc.) pueden acoplarse o conectarse mediante una o mas vlas de flujo para formar una serie de vlas de fluido o circuitos de fluido similares a los descritos anteriormente. El sistema incluye, ademas, un sistema de control por ordenador o unidad 112 que proporciona la supervision y/o el control de uno o mas aspectos del sistema 100.

El sistema de control por ordenador 112, tal como se describio anteriormente, puede incluir uno o mas dispositivos de entrada y/o salida, pantallas graficas, interfaces de usuario y puede permitir el control manual y/o automatico del funcionamiento y las funciones del sistema 100. El sistema de control por ordenador 112 puede incluir un modulo o sistema para procesar informacion (por ejemplo, information de flujo, etc.) dentro del sistema 100, y puede incluir una amplia variedad de ordenadors propietarias y/o disponibles comercialmente, componentes o electronicos que tienen una o mas estructuras de procesamiento y lo similar, con tales sistemas que a menudo comprenden un equipo y/o programa de procesamiento de datos configurados para implementar cualquiera o una combination de las etapas de los metodos como se describio en la presente description. El programa comprendera, tlpicamente, un codigo de instrucciones de programacion, legible por la maquina, incorporadas en un medio tangible tal como una memoria, medios de grabacion digital u opticos, senales telemetricas opticas, electricas, o inalambricas, o lo similar, y una o mas de estas estructuras pueden usarse, ademas, para emitir o transmitir datos, senales o informacion entre los componentes del sistema en cualquiera de una amplia variedad de arquitecturas de procesamiento de senales.

El sistema puede incluir, ademas, diversos soportes, sensores, carcasas, etc. para diversos componentes que pueden acoplarse con el presente sistema para realizar los metodos como se describio en la presente descripcion. El sistema 100 incluye, ademas, una o mas estructuras de soporte 114 configuradas para sostener y/o soportar diversos fluidos, reactivos, muestras de depositos de fluido, filtros y lo similar, que pueden usarse con el sistema 100 de acuerdo con la presente invencion. Las estructuras de soporte pueden incluir diversas configuraciones de gancho o suspension, o soporte (por ejemplo, soporte de filtro o carcasa) y no se limitan a ningun diseno particular. Los fluidos, tampones, reactivos, etc. colocados sobre un soporte 114 pueden acoplarse a una via de fluido o tuberla, que puede a su vez conectarse a mas o mas componentes del sistema 100. El sistema 100 puede incluir sensores para supervisar y/o controlar adicionalmente el flujo de fluido a traves del sistema. Los sensores pueden incluir, por ejemplo, sensores de llquido, que pueden incluir detectores de burbujas (detector ultrasonico), sensores de presion y lo similar. Se muestran el detector de burbujas 116 y los sensores de presion 118. Se muestra un soporte 120, que puede configurarse para contener un filtro o unidad de reduction de volumen. El area de recoleccion 122 puede soportar contenedores de recoleccion, reactivos, etc.

El sistema 100 se ilustra adicionalmente con respecto a la Figura 6. La unidad de procesamiento 104 puede incluir una carcasa o cubierta 124, que puede moverse (por ejemplo, extraerse) alrededor de una o mas bisagras. La cubierta 124 define, al menos parcialmente, un area de procesamiento 126 que puede controlarse por temperatura y acoplarse a componentes de supervision y control de temperatura que pueden alojarse dentro de la carcasa 105 del sistema 100. La unidad de procesamiento 104 incluye una camara de muestra 128 configurada para el soporte y procesamiento de una muestra (por ejemplo, centrifugation, cultivo, separacion de los componentes de muestra, etc.). La camara de muestra 128 que se muestra es una camara que rota, que se mantiene en su position alrededor de un eje, que puede incluir un bloqueo antirotacion 130. La unidad de procesamiento 104 puede incluir uno o mas sistemas de detection, tal como un detector optico 132 ubicado dentro de la cubierta 124 y configurado para detectar o supervisar el procesamiento de una muestra en la camara 128. Una o mas llneas de entrada/salida de fluido pueden acoplarse a la camara 128 y pueden mantenerse en posicion mediante un soporte 134.

La Figura 7 ilustra una vista posterior del sistema 100. La unidad de control por ordenador 112 se muestra con un componente acoplado a la carcasa del sistema 105 alrededor de un eje rotacional, y la unidad 112 que tiene una ranura

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de entrada de medios de almacenamiento (por ejemplo, tarjeta de programacion) 138. Se muestra un gancho 140, que puede proporcionar soporte para componentes externos, equipo de recoleccion, etc. El sistema 100 incluye conexion de energla y conmutador 142 y varias conexiones de interfaz 144 (por ejemplo, conexion de lector de codigo de barras, conexion de impresora, conexion de red, etc.); ventilacion 146; y el disipador de calor 148 que proporciona un componente de los sistemas de control interno de temperatura.

Los componentes de una unidad de procesamiento, que incluye una camara de muestra, se describen adicionalmente con respecto a las figuras 8 hasta la 12. Con respecto a la Figura 8, se ilustra la camara de procesamiento 150 que tiene una porcion superior 152 y una porcion de base inferior 154. La porcion superior 152 puede incluir una estructura de refuerzo o soporte 156. La camara 150 incluye, ademas, un eje 158 alrededor del cual gira la camara 150, el eje 158 tiene una cerradura rotacional y el eje 158 se extiende a traves del centro de la camara 150 y se extiende hacia fuera de la parte superior 152. Los medios de rotacion o cojinete 160 proporcionan un movimiento de rotacion de la camara 150 alrededor del eje 158. La camara 150 incluye, ademas, puertos de fluido o conexiones de llnea 162, 164 acoplados a una estructura de carcasa que rodea el eje 158, y los puertos 162, 164 conectados de manera fluida a uno o mas compartimentos internos de la camara de procesamiento 150.

Uno de los puertos puede usarse como ventilacion para intercambiar gases.

Una camara de procesamiento de acuerdo con otra modalidad de la presente invencion se describe con respecto a la figura 9. La camara 170 incluye una porcion superior 172 y una porcion inferior 174, con un eje de rotacion 176 y los puertos 178, 180 configurados de manera similar como se describio anteriormente. La porcion superior 172 incluye una estructura de soporte 182, as! como tambien la estructura 184 que incluye un canal 186 que puede incluir al menos una porcion visible a traves de una ventana o prisma 188.

El canal 186 puede acoplarse de manera fluida a un compartimiento que contiene la muestra en la camara 170 y configurarse para la supervision externa o la deteccion del procesamiento de la muestra. Por ejemplo, un componente (por ejemplo, celulas) en el fluido en el canal 186 puede separarse visiblemente durante las etapas de procesamiento, lo que indica, de esta manera, la separacion de celulas o los componentes de muestra en uno o mas compartimentos internos de la camara.

La camara 170 puede comprender, ademas, al menos una ventilacion, que comprende, preferentemente, una membrana o tapon hidrofobo esteril. Preferentemente, estas membranas o tapones pueden situarse en la parte superior o inferior de la camara. La al menos una ventilacion en la camara tiene la ventaja particular que el volumen en la camara puede cambiarse facilmente sin cambiar la presion en la camara o proporcionar puertos adicionales de entrada y/o salida para el intercambio de aire o gas.

Las centrlfugas de la presente invencion permiten una centrifugacion por lotes, as! como tambien una continua: las muestras, medios, gases y otros materiales pueden entrar y salir del sistema, por ejemplo, a traves de los puertos de entrada y salida (por ejemplo, 178 y 180 en la Fig. 1) sin necesidad de detener la rotacion de la camara de centrifugacion y rellenar la centrlfuga (centrifugacion por lotes). Esto permite una concentracion continua de la muestra y el producto puede retirarse solo una vez al final de la centrifugacion, por tanto se evita la contaminacion potencial debido a la manipulation adicional.

En la figura 9a, se muestra un contenedor rotatorio o camara de centrifugacion 500. En la parte inferior de la camara que rota 500 se coloca una zona de enfoque de microscopio 505 que comprende al menos una almohadilla de sensor 504. Debajo de la camara que rota 500 se encuentra un modulo de camara de microscopio 503 que comprende un microscopio optico 501 y un motor para accionar el microscopio 502 para enfocar la optica. El microscopio optico 501 se configura de manera que puede enfocarse automaticamente para detectar la muestra que se separa en al menos dos componentes durante la centrifugacion. De esta manera, el modulo de la camara de microscopio 503 puede usarse para detectar diferentes capas formadas por la muestra separada en la camara 500 debido a las fuerzas centrlfugas. Ademas, puede medirse el valor de pH de los componentes de la muestra. Para este proposito, se usa un indicador en la camara 500 que cambia su color en dependencia del valor de pH que esta presente. Ademas, es posible que la temperatura de la muestra en la camara se mida mediante el uso de cristales llquidos que se ubican en la camara de manera que su position pueda detectarse con un modulo de camara de microscopio 503 desde el exterior. De esta manera, puede determinarse la temperatura en la camara 500.

El modulo de camara de microscopio 503 puede montarse de forma movil, de manera que el modulo 503 puede dirigirse con su microscopio optico 501 a diferentes sensores de almohadilla 504 ubicados en la pared de la camara 500. Esto facilita la deteccion de varias capas formadas en la camara 500 o la deteccion del pH o la temperatura en diferentes posiciones dentro de la camara 500.

La Figura 10 ilustra una vista en section transversal de una camara de procesamiento de muestras de acuerdo con una modalidad de la presente invencion. La camara 190 incluye una porcion superior 192 y una porcion de base 194, y uno o mas compartimentos internos. La camara 190 se configura para girar alrededor de un eje para aplicar una fuerza centrlfuga a una muestra dispuesta en uno o mas compartimentos en la camara, de esta manera, se separan al menos dos componentes de la muestra. La camara incluye la llnea central 196 conectada de manera fluida a al menos un

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compartimento de la camara. Los componentes de la camara 190 incluyen, ademas, la llnea externa 198; el cojinete giratorio 200, las juntas rotativas 202, 204, 206; la llnea de entrada exterior a la camara 205; el canal radial inferior 208; la llnea de entrada interior 210 a un compartimento de la camara; inclinacion 212 y deflector 214. El retenedor de camara 216 se incluye y configura para un posicionamiento/acoplamiento seguro de la camara 190 con los otros componentes de un sistema de la invencion.

La camara de centrifugacion 190 comprende, preferentemente, una junta giratoria, opcionalmente con dos llneas de fluido, preferentemente, con dos llneas de fluido. Las llneas de fluido pueden entrar en la camara 190 en diferente posicion. Por ejemplo, es posible colocar una primera llnea de fluido en el perlmetro exterior de la parte superior 192 (tapa). Una segunda llnea de fluido podrla situarse mas hacia adentro, por ejemplo, de 2 mm a 20 mm mas hacia el centro de la camara 190. Opcionalmente, una ventilacion puede situarse en la porcion superior 192, por ejemplo, en forma de una membrana.

Generalmente, la posicion de las aberturas tales como puertos o entradas de llnea en la camara de centrifugacion puede configurarse de manera que sean las mas adecuadas para la centrifugacion de una muestra particular. En dependencia de los componentes de una muestra particular, y del volumen relativo de cada componente en la muestra, las aberturas pueden posicionarse de manera que pueda lograrse la elimination y/o la detection de un componente particular.

La Figura 10A ilustra una vista en planta superior de una camara 201. La camara 201 incluye una llnea interna 203, un canal radial inferior 205, una entrada de la llnea interior 207 a la camara, opcionalmente un deflector 209, una inclinacion 211 y un paso de luz 209.

La Figura 11 ilustra una vista en section transversal de una camara de acuerdo con otra modalidad de la presente invention. La camara 220 incluye un eje alrededor del cual la camara rota, una conexion de llnea central 222 y una conexion de llnea exterior 224, y uno o mas compartimentos internos. Se ilustran ademas, el cojinete rotacional 226, as! como tambien el sello rotacional 228, 230, 232; el canal interior 234, el canal de deteccion optica 236 (de manera similar a lo que se describio anteriormente); la llnea de entrada interior 238 a la camara; la llnea interior 240, y el canal radial inferior 242. Ademas, la camara incluye un refuerzo interior 246 y un retenedor de la camara 248. La Figura 11A ilustra una vista enfocada de la porcion de una camara 220 descrita anteriormente. Se muestran un canal de deteccion optico 236, un prisma 237, y un paso de luz 239 (que se indica adicionalmente por flechas).

En otra modalidad de la presente invencion, la parte inferior de la camara puede tener una o mas aberturas (Fig. 12A, 291) cubiertas con una membrana hidrofoba 292. Estas aberturas pueden usarse para suministrar gases dentro o eliminarlos de la camara, por ejemplo, para los procesos de cultivos de celulas. La membrana puede pegarse, termicamente, ultrasonicamente o unirse por otros medios a la parte inferior de la camara en una forma que asegure la conexion esteril con la camara.

En otra modalidad de la presente invencion (Fig. 12B), la camara puede tener un sistema de canales para el flujo de gases, por ejemplo, canales ensamblados como un sistema espiral 293, que garantiza un area de contacto extensa entre los gases y la membrana unida sobre los canales (no mostrado). Estos canales pueden ubicarse en la parte inferior o en la parte superior de la camara. El sistema de canales tiene al menos una entrada (abertura) 294 y una salida opcional (abertura) 295 para los gases.

Las entradas o puertos de los canales de las Fig. 8-11A pueden variar en numero y ubicacion dentro del canal.

La Figura 12 ilustra una vista en seccion transversal de una camara de acuerdo con otra modalidad de la presente invencion. La construction de la camara 250 es similar en muchos aspectos a las camaras que se describieron anteriormente, pero incluye, ademas, una pluralidad de estructuras estratificadas 252. Las estructuras estratificadas 252 pueden configurarse para proporcionar estructuras para cultivos de celulas o capas. Durante el uso, la muestra que incluye celulas puede introducirse en la camara y fluir sobre las capas 252. El proceso de separation puede incluir la rotation de la camara de manera que las celulas que se adhieren a las capas se separan de aquellas con menor afinidad por las capas. La rotacion y/o parada intermitente durante la rotacion pueden adicionalmente desunir las celulas cultivadas de la superficie de las estructuras estratificadas 252 para el procesamiento de separacion. Sorprendentemente, se encontro que este proceso intermitente es capaz, ademas, de suspender los aglutinamientos o el material biologico unido, como las celulas despues del cultivo. La camara incluye, ademas, la llnea central ilustrada 251, la llnea externa 253, el cojinete 255, los sellos rotacionales 257, la entrada de la llnea exterior 259 a la camara, la porcion superior 261, el canal interior 263, la porcion de la base 265, el retenedor 267, el canal radial inferior 269 y la llnea de entrada 271 a la camara.

La camara puede comprender o puede hacerse de diversos materiales. En una modalidad preferida, se usan materiales transparentes como plasticos, poliestirol (PS), poliestereno, policloruro de vinilo, policarbonato, vidrio, poliacrilato, poliacrilamida, polimetilmetacrilato (PMMA) y/o tereftalato de polietileno (PET). Politetrafluoretileno (PTFE) y/o poliuretano termoplastico (TPU), silicona o composiciones que comprenden uno o mas de los materiales mencionados anteriormente. Ademas, la camara puede hacerse de polietileno (PE). En una modalidad preferida, las capas en la camara comprenden o se hacen de derivados de colageno, quitina, alginato y/o acido hialuronico. Ademas, son posibles

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poliactida (PLA), poliglicolido (PGA) y sus copollmeros, que son biodegradables. Alternativamente, pueden usarse materiales no biodegradables, tales como poliestirol (PS), poliestereno, policarbonato, poliacrilato, polietileno (PE), polimetilmetacrilato (PMMA) y/o tereftalato de polietileno (PET). Pueden usarse, ademas, politetrafluoroetileno (PTFE) y/o poliuretano termoplastico (TPU). Otras alternativas incluyen materiales de ceramica y de vidrio, como hidroxilapatita (HA) o fosfato de calcio. Las capas en la camara pueden ser de material solido o poroso.

En una modalidad preferida, la camara tiene un tamano de 2 cm a 50 cm de diametro y una altura de 5 mm a 50 cm. La centrifugacion se realiza, preferentemente, hasta 1000 xg.

El numero de capas y la distancia entre las capas es variable.

En una modalidad preferida, la camara puede calentarse y enfriarse para proporcionar una temperatura apropiada para centrifugar la muestra. Para este proposito, se ubican en el sistema un sistema de calentamiento y/o enfriamiento.

Como se muestra en la Figura 17, la camara de centrlfuga de forma cillndrica puede limitarse en su lado superior por una tapa 800, que puede llevar una o mas nervaduras de estabilizacion 805 sobre la superficie superior plana. Al menos una de estas nervaduras radiales 805 puede cubrir una brecha estrecha o canal 801, abierto al volumen interior de la centrlfuga cuando la tapa 800 se sujeta sobre la camara de centrlfuga. La brecha 801 se extiende en direccion axial desde la superficie interior de la tapa que pasa la tapa 800 unos millmetros en la nervadura 805. Por tanto, cuando se usa material transparente puede verse desde el exterior dentro de la nervadura 805. En la extension radial, la brecha 801 alcanza desde cerca del centro hasta la pared cillndrica de la centrlfuga (Fig. 17).

Durante la centrifugacion, las mismas fuerzas surten efecto en la brecha 801 como en la camara de centrifugacion completa. Las capas de suspension en forma de anillos colindantes se extienden paralelas en la brecha 801 y se muestran como zonas delgadas en posicion colindante al eje, como una capa fina cortada en cruz, bien detectable por sensores opticos externos.

El ancho de la brecha 801 puede determinarse libremente, ademas, lo suficientemente pequeno para un analisis de la luz trasmitida por todas las areas asociadas a las capas en la brecha. De esta manera, es posible cuantificar las densidades opticas y los colores de todas las capas de la suspension en la camara de centrlfuga de una manera "sin contacto" desde el exterior a traves de mediciones de transmision optica.

Para permitir una iluminacion vertical y la posicion del sensor para observar los movimientos de las capas en la brecha, puede anadirse una ventana, un espejo o, preferentemente, un prisma sobre ambos lados de la nervadura, que puede preformarse, preferentemente, por el propio material de la carcasa transparente.

El prisma 810 refracta el haz luminoso vertical generado a traves de la brecha (horizontal) y regresa a la parte superior, de nuevo vertical (Fig. 18). Durante la centrifugacion, una posicion sincronica activa una luz de destello electronico puede transmitir luz a un lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma izquierdo, que ilumina la brecha por refraccion. El resultado de la transmision se refracta por el otro lado del prisma 810, por ejemplo, el prisma derecho, de vuelta a un sensor montado verticalmente o camara, posiblemente en la cercanla de la fuente de destello superior en la parte superior. La unidad de sensor optico resultante es facil de manejar como un sensor reflejo, pero al mismo tiempo permite realizar mediciones de transmision a escala completa.

La disposition de los angulos del prisma asegura la "reflexion total" sobre la superficie interior del prisma por los rayos de destellos que iluminan y evitan los reflejos directos sobre sus superficies exteriores entre la fuente de luz y la camara. Por tanto, no es necesario el recubrimiento de espejos y las tecnologlas de moldeo por inyeccion pueden usarse sin el remodelado de las instalaciones que se requieren (Fig. 19).

Otra modalidad de la presente invention se describe con respecto a la Figura 13. Como se ilustra, un sistema de procesamiento que incluye varios componentes acoplados, canales de flujo, tampones, reactivos, etc. Se reconocera que hay numerosas configuraciones disponibles y que la presente configuration se proporciona con propositos ilustrativos. Con respecto a la Figura 13, los componentes incluyen un sistema de tampon 300, puerto de espiga 301, filtro esteril 302, bolsa de plasma/en proceso 303, contenedor de reactivo para marcado magnetico 304, puerto de espiga 305, filtro esteril para el reactivo magnetico 306, filtro esteril 307, bolsa de medio/tampon 308, puerto para el medio de cultivo de celulas, puerto auxiliar 309, valvula de unica direccion hacia abajo 310 que posiblemente incluye un filtro, valvula de unica direccion hacia arriba 311, bolsa de muestra 312, conector de bolsa de muestras 313, filtro de muestras 314, puerto de muestra 315, filtro 316, filtro de separation previa 320, bolsa de almacenamiento en proceso 321, columna de separacion magnetica 322, bolsa de desecho 323, unidad de reduction de volumen 324, bolsa de fraction positiva 325, bolsa de fraction negativa 326, filtro de aire esteril 327, bomba 328, filtro de aire para el sensor de presion 1 329, filtro de aire para el sensor de presion 2 330, unidad de procesamiento de muestra/celulas 332.

Un uso tlpico de un sistema como el que se ilustra en la Figura 13 y se describe anteriormente, se discute con respecto a las figuras 14A a 14N. La activation de varios componentes del sistema puede seleccionarse para dirigir el flujo a lo largo de una via deseada. El flujo seleccionado se ilustra con respecto a las Figuras 14A a 14N y se muestra por vlas de flujo oscurecidas y flechas de direccion de flujo. La Figura 14A ilustra la carga de la muestra en una camara que

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rota/camara de procesamiento de la unidad de procesamiento de muestra. La muestra fluye desde la fuente de la muestra a traves de las valvulas abiertas 5, 9, 16 y a traves de la bomba y hacia la unidad de procesamiento. La Figura 14B ilustra el aclarado de las llneas/componentes del sistema, con el tampon que fluye a traves de las valvulas abiertas 1, 9, 16, bomba y hacia la unidad de procesamiento. La muestra y el tampon pueden fluir como se ilustra, se centrifuga la muestra en la unidad de procesamiento para separar los componentes y se repite el proceso de aclarado. La Figura 14C ilustra la reduccion y la eliminacion de las celulas rojas de la sangre de la muestra. Como se indico anteriormente, la muestra puede centrifugarse en la unidad de procesamiento para separar los componentes, lo que incluye la formacion de una capa leucocitaria para la separacion de las celulas rojas. Despues, el componente de celulas rojas de la sangre puede retirarse de la unidad de procesamiento y fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 17, 12 y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14D ilustra la eliminacion del plasma de la camara en la unidad de procesamiento, donde el enjuague del plasma/componente fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 16, 12 y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14E ilustra la recoleccion de plasma, cuando el plasma se elimina de la unidad de procesamiento fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 16, 9, 4 y hacia un contenedor de recoleccion de plasma. La Figura 14F ilustra la carga del reactivo en la camara y el marcado de las celulas. El reactivo (por ejemplo, el marcado magnetico) fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 2, 9, 16 y hacia la camara. Las celulas pueden procesarse (por ejemplo, agitarse, reconstituirse, mezclarse con reactivo, etc.) para la incubacion con el reactivo de marcado. La Figura 14G ilustra la adicion de plasma dentro de la camara. El plasma procedente del contenedor de plasma fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 4, 9, 16 y hacia la camara. Pueden preformarse etapas de procesamientos adicionales, aclarado, etc.(por ejemplo, como se ilustra en la figura 14B). La Figura 14H ilustra la separacion magnetica de componentes marcados y no marcados de la muestra. La muestra/celulas marcadas suspendidas fluyen a traves del sistema a traves de la valvula abierta 16, a traves de un filtro o columna previa (por ejemplo, un filtro de separacion basado en el tamano, de manera que se eliminan las aglomeraciones de celulas), valvulas abiertas 7, 11, a traves de la columna magnetica donde se unen las celulas marcadas, con celulas primariamente no marcadas que fluyen a traves de la valvula abierta 19 y hacia el contenedor para celulas no marcadas/negativas. La Figura 141 ilustra el lavado de la columna donde el tampon fluye a traves del sistema por las valvulas abiertas 1, 15, 7, 11, 19 y hacia el contenedor de celulas. Las etapas de lavado se seleccionan para lavar las celulas no marcadas de la columna de separacion magnetica/sistema. La Figura 14J ilustra la elucion de celulas de la columna y la nueva aplicacion. La aplicacion magnetica se desactiva y el fluido fluye como se ilustra a traves de las valvulas abiertas 11, 10, 14, por ejemplo, a altas velocidades, para lavar las celulas de la columna. La aplicacion del campo magnetico se vuelve a activar para volver a unir las celulas marcadas a la columna de separacion magnetica. La Figura 14K ilustra el aclarado de la columna con un tampon de elucion. El tampon fluye como se ilustra para lavar, preferentemente, las celulas no marcadas de la columna de separacion y hacia el contenedor de desecho. La Figura 14L ilustra el lavado de la columna para eliminar las celulas marcadas desde la columna y hacia la bolsa para una nueva aplicacion. Como se muestra, el campo magnetico se desactiva para liberar las celulas marcadas de la columna. La Figura 14M ilustra las etapas de reduccion de volumen. Las solucion que contiene las celulas fluye como se ilustra para pasar la solucion a traves del filtro F7. El filtro incluye un filtro de membrana que recoge las celulas a medida que fluye la solucion. La Figura 14N ilustra la elucion final y la recoleccion del producto en el contenedor de recoleccion. El plasma fluye como se ilustra, a traves de las valvulas abiertas 4, 9, 14, 18, con el fluido que pasa a traves del filtro F7 para lavar las celulas desde el filtro y hacia el contenedor de recoleccion positivo.

El conjunto de tubos de la presente invention puede usarse para la administration de medio nutriente, citocinas, factores de crecimiento, suero y otras sustancias necesarias para el cultivo de las celulas, o para extraer muestras de la camara de cultivo. El medio nutriente puede suministrarse continuamente o periodicamente dentro de la camara o retirarse de la camara a traves de los puertos 222 y 224 (Fig. 11) mediante el uso de la bomba 328 (Fig. 13) o mediante el uso de jeringuillas adicionales que se conectan al conjunto de tubos. Durante el proceso de cultivo de celulas el medio puede intercambiarse total o parcialmente con medio fresco. El medio puede enriquecerse con O2, CO2, N2, aire u otros gases necesarios para el crecimiento de las celulas. El enriquecimiento del medio puede hacerse por inyeccion directa de los gases en la camara de cultivo a traves de los puertos 222 o 224 (Fig. 11), a traves de una abertura adicional en la parte inferior de la camara de cultivo recubierta con una membrana hidrofoba (Fig. 12A y 12B) y/o mediante el uso de un dispositivo de aireacion, situado fuera de la camara de cultivo (Fig. 15).

Un ejemplo de tal dispositivo de aireacion se representa en la figura 15. Este consta de dos partes (415 y 416) hechas de, por ejemplo, policarbonato (PC) o polimetacrilato (PMMA) con canales grabados en un lado. Ambas partes se unen para formar un espacio hueco entre ellas, separado en dos o mas compartimentos por al menos una membrana (417). La membrana puede unirse a una de las partes o varias membranas pueden unirse en ambas partes. Los compartimentos contienen al menos un puerto de entrada (418) y un puerto de salida (419) para la conexion con el conjunto de tubos. El primer compartimento se usa para la mezcla de gases. El segundo compartimento se usa para el medio nutriente, que tiene que enriquecerse con los componentes de la mezcla de gases. La membrana que se ubica entre ambos compartimientos es permeable para los gases y no es permeable para los llquidos. Preferentemente, esta es una membrana hidrofoba, por ejemplo, membrana hidrofoba de nailon. Preferentemente, los poros de la membrana hidrofoba son mas pequenos que 0.2 pm, lo que asegura una conexion esteril entre el medio nutriente y la mezcla de gases. En otra modalidad del dispositivo de aireacion, una o mas membranas adicionales pueden unirse a cualquiera de las partes representadas en la figura 15, de manera que el gas fluye entre los compartimentos que contienen el medio. En este caso, la superficie de contacto entre el medio y la mezcla de gases es mayor en gran numero en dependencia del numero de membranas usadas.

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Las membranas del dispositivo de aireacion pueden unirse a las partes por medio de union termica, union ultrasonica o pegado, u otro proceso de union adecuado, que permita una conexion esteril entre las partes plasticas y la membrana.

El dispositivo de aireacion puede esterilizarse por medio de irradiacion (por ejemplo, radiacion gamma, beta), materia ionizada en estado mas tenue (por ejemplo, peroxido de hidrogeno), vapor caliente/vapor a presion (por ejemplo, autoclave) o esterilizacion con oxido de etileno (EtO). Preferentemente, el dispositivo de aireacion se usa como parte del conjunto de tubos desechables.

La composicion de gases usada para el dispositivo de aireacion se compone, preferentemente, mediante el uso de una camara de mezcla de gases. Una modalidad preferida de la camara de mezcla de gases se muestra en la figura 16 A. Esta consiste en dos partes (421 y 422), preferentemente, hechas de material plastico, por ejemplo POM (polioximetileno), que se conectan con pernos, se pegan termicamente o se unen ultrasonicamente entre si, de manera que formen un espacio hueco entre ellas. Preferentemente, una de las partes contiene un canal para un anillo de obturacion, que asegura el sellado entre ambas partes (433, figura 16B). La camara de mezcla de gases tiene al menos un puerto de entrada y al menos un puerto de salida (423). Esta comprende un puerto (430) para la conexion de un dispositivo sensor de presion para medir la presion dentro de la camara. La camara de mezcla de gases contiene, opcionalmente, otro puerto (432, Fig. 16b) para la conexion con una valvula de seguridad, que se abre automaticamente, cuando la presion en la camara sube sobre un cierto valor. La camara de mezcla de gases tiene entradas y salidas (435) para la conexion con al menos una valvula de entrada y al menos una valvula de salida, as! como tambien perforaciones roscadas (436) para la conexion de las valvulas de entrada y de salida a las paredes de la camara de mezcla de gases.

Para la reduccion del regimen de flujo de los gases en y/o fuera de la camara de mezcla de gases, las mezclas pueden incluirse, opcionalmente, en las paredes.

Principio de funcionamiento de la camara de mezcla de gases: los puertos de entrada de la camara de mezcla de gases se conectan con un suministro de gases. El suministro de los gases de entrada debe tener una presion superior a la presion atmosferica, por ejemplo, 2 bar. El operario debe proporcionar el contenido de la composicion de gases deseada mediante el uso de un programa de ordenador de medicion y automatizacion. El contenido de cada uno de los gases de la composicion deseada es dado como la presion parcial de ese gas en la mezcla de gases. El proceso de composicion de gases comienza con el primer componente de la mezcla de gases, el que se controla por la valvula de entrada 424 (Fig. 16A). La valvula de entrada se abre durante un perlodo de tiempo, por lo general entre 50 ms y 200 ms, y despues se cierra y se lee el sensor de presion. La presion que se mide en la camara es Pm. Si la presion Pm <P1, donde P1 es la presion dada por el operario, la valvula de entrada se abre otra vez. El proceso se repite hasta Pm >= P1. Despues, se abre la valvula de entrada 425 y la composicion del segundo componente de gas tiene lugar como se describio en el caso de la valvula de entrada 424. Cuando todos los gases de entrada estan compuestos en la camara de mezcla, la valvula de salida 427 se abre hasta que la presion en la camara de mezcla de gases alcanza un valor Psalida, proporcionado por el operario de manera preliminar. Psalida es siempre igual a la presion atmosferica o mas alto. El tiempo y la frecuencia de la abertura de la valvula de salida pueden proporcionarse, ademas, por el operario. Despues, el proceso de composicion de gases comienza de nuevo con la abertura de la primera valvula de entrada (424). Las valvulas de salida 428 y 429 pueden usarse opcionalmente para la aireacion de otras camaras de cultivo de celulas, bolsas u otros contenedores usados en la presente invencion.

La camara de muestras permite realizar una amplia gama de metodos de cultivo de celulas, tales como el crecimiento de celulas, la separacion, el lavado, el enriquecimiento de celulas o diferentes tipos de celulas, u otros. Ademas, el sistema de la invencion puede usarse para formular farmacos.

La obtencion de preparaciones celulares necesarias para la terapia celular puede incluir diversas combinaciones de operaciones basicas para obtener un producto celular definido con caracterlsticas definidas. Es unico en la invencion que todas estas operaciones basicas pueden realizarse en un unico conjunto de tubos cerrados, lo que elimina los riesgos de las etapas manuales para la transferencia de muestras, requeridas de cualquier otra manera.

Las condiciones de cultivo de celulas para los ejemplos son conocidas en la tecnica.

Las caracterlsticas descritas en la presente descripcion pueden ser de relevancia para la realizacion de la presente invencion en cualquier combinacion.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitan la invencion.

Ejemplo 1: Obtencion de celulas madre y progenitoras de la sangre del cordon para injerto.

La sangre del cordon humano se diluye con tampon CliniMACS PBS/EDTA, mediante centrifugacion se ajusta el volumen de marcado definido, se anade el Reactivo CD34 o CD133 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de

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celulas durante el tiempo de marcado especificado, el reactivo de acceso se elimina mediante lavado en la camara de centrifugacion, las celulas CD34 o CD133 positivas se enriquecen a partir de la suspension celular y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular, y se transfieren a la camara de cultivo de celulas. Los suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las celulas madre enriquecidas o aisladas se cultivan hasta por tres semanas. El medio de cultivo de celulas suplementado se anade intermitentemente. Las celulas de la sangre de cordon expandidas se lavan por centrifugacion para eliminar el medio de cultivo celular y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina) suplementada con albumina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla).

Ejemplo 2: Obtencion de vacuna de celulas dendrlticas

La cosecha de sangre entera humana o aferesis se diluye con tampon CliniMACS PBS/EDTA, se ajusta el volumen de marcado definido mediante centrifugacion, se anade el reactivo CD14 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, los monocitos CD14 positivos se enriquecen a partir de la suspension celular y se eluyen de la columna MACS directamente con el medio de cultivo celular y se transfieren a la camara de cultivo de celulas. Los suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Los monocitos enriquecidos o aislados se cultivan encima de celulas dendrlticas inmaduras derivadas de monocitos. Los medios se intercambian por centrifugacion y se anaden automaticamente suplementos adicionales desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las celulas se cultivan y despues de la maduracion se anaden automaticamente antlgenos (protelna recombinante, peptidos, lisados celulares, ADN) desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las celulas dendrlticas derivadas de monocitos se cultivan para el procesamiento de antlgenos. El medio de cultivo celular se elimina mediante centrifugacion y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina) suplementada con albumina de suero humano y se transfieren al contenedor de producto final (bolsa de infusion o jeringuilla).

Ejemplo 3: Obtencion de una vacuna de celulas dendrlticas de la sangre mDC y pDC

La cosecha de la aferesis se diluye automaticamente con tampon CliniMACS PBS/EDTA, se reducen las CD19 y subsecuentemente se enriquece para CD304 (BDCA-4, CD1c, Neurofilina-1) o CD1c (BDCA-1) a traves de la columna MACS. Las DC se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfieren a la camara de cultivo de celulas. Los suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas, componentes activadores como protelna recombinante, peptidos, lisados celulares, ADN) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos y las celulas se cultivan durante 24 horas para lograr una maduracion y activacion optimas. El medio de cultivo celular se elimina mediante centrifugacion y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina), opcionalmente suplementada con albumina de suero humano, y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla). El contenedor del producto se elimina del conjunto de tubos de la invencion para usar posteriormente.

Ejemplo 4: Obtencion de celulas T con especificidad antigenica

La cosecha de sangre entera humana o aferesis se lava y se diluye con medio de cultivo celular y se transfiere a la camara de cultivo celular. El antlgeno (protelna recombinante, conjunto de peptidos o lisado de celulas tumorales) y suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas) se anaden automaticamente desde los contenedores unidos al conjunto de tubos. Las celulas y el antlgeno se cultivan durante 3-16 horas para estimular nuevamente a las celulas T con especificidad antigenica. El volumen de la suspension de celulas definido para el marcado se ajusta mediante centrifugacion, se anade el reactivo IFN-gamma Catchmatrix de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado y el reactivo de acceso se elimina mediante lavado en la camara de centrifugacion. Las celulas se transfieren hacia contenedor de cultivo de celulas y se incuban para la liberacion de citocinas. El volumen de la suspension de celulas definido para el marcado se ajusta mediante centrifugacion, se anade el Reactivo de Enriquecimiento IFN-gamma de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo especificado para el marcado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, las celulas con especificidad antigenica se enriquecen magneticamente a partir de la suspension de celulas, y se concentran hasta un pequeno volumen inyectable por elucion directa de la columna MACS mediante el uso de una solucion de infusion suplementada, y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla).

Ejemplo 5: Obtencion de celulas asesinas naturales activadas

La cosecha de sangre entera o aferesis se diluye con tampon PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugacion, se anade el Reactivo CD3 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, las celulas CD3 positivas se eliminan de la suspension de celulas. Las celulas diana negativas de CD3 se ajustan al volumen de marcado, se anade el Reactivo CD56 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, se enriquecen las celulas CD56 positivas y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfiere a la camara de cultivo celular. Los suplementos de medios (albumina de suero humano,

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citocinas tales como IL-2 y/o IL-15) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las celulas NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante 8-48 horas. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugacion y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina) suplementada con albumina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla).

Ejemplo 6: Obtencion de celulas naturales asesinas expandidas

La cosecha de sangre entera o aferesis se diluye con tampon PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugacion, se anade el Reactivo CD3 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, las celulas CD3 positivas se eliminan de la suspension de celulas. Las celulas diana negativas de CD3 se ajustan al volumen de marcado, se anade el Reactivo CD56 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se elimina el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, se enriquecen las celulas CD56 positivas y se eluyen directamente de la columna MACS con el medio de cultivo celular y se transfiere a la camara de cultivo celular. Los suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las Perlas para la Expansion Celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2 y CD335 (NKp46) o CD314 (NKG2D) y CD335 (NKp46) se transfieren desde el contenedor al compartimiento de cultivo celular. Las celulas NK enriquecidas o aisladas se cultivan durante una semana, se comienza el dla 7, el medio de cultivo celular suplementado se anade cada 3 dlas en una relacion de 1:1 y las celulas se cultivan hasta el dla 14-21.

Las celulas NK expandidas se pasan por la columna MACS para eliminar las perlas de expansion celular. Opcionalmente, las celulas NK expandidas se purifican adicionalmente por reduccion de CD3 o enriquecimiento de CD56 (ver mas arriba). El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugacion y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina) suplementada con albumina de suero humano y se transfieren al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla).

Ejemplo 7: Obtencion de celulas T auxiliadoras expandidas

La cosecha de sangre entera o aferesis se diluye con tampon PBS/EDTA de CliniMACS, se ajusta al volumen de marcado definido mediante centrifugacion, se anade el Reactivo CD4 de CliniMACS y se deja incubar con la muestra de celulas durante el tiempo de marcado especificado, se retira el reactivo de acceso mediante lavado en la camara de centrifugacion, las celulas CD4 positivas se enriquecen y se eluyen directamente de la columna MACS con medio de cultivo celular y se trasfieren hacia la camara de cultivo de celulas. Los suplementos de medios (albumina de suero humano, citocinas) se anaden automaticamente desde el contenedor unido al conjunto de tubos. Las Perlas para la Expansion Celular cargadas con anticuerpos dirigidos contra CD2, CD3 y CD28 o alternativamente CD3 y cD28 se transfieren desde el contenedor al compartimiento de cultivo de celulas. Las celulas T auxiliadoras aisladas se cultivan, se comienza el dla 3, se anade medio de cultivo celular suplementado cada 2 dlas en una relacion 1:1 y las celulas se cultivan hasta el dla 14. Las celulas T expandidas se pasan por la columna MACS para eliminar las perlas de expansion celular. El medio de cultivo celular se elimina del producto celular mediante centrifugacion y las celulas se suspenden en solucion de infusion (solucion salina) opcionalmente suplementada con albumina de suero humano y se transfiere al contenedor del producto final (bolsa de infusion o jeringuilla). El contenedor del producto se elimina del conjunto de tubos de la invention para usar posteriormente.

Ejemplo: 10 Selection de celulas madre CD133 positivas

El antlgeno CD133 es un marcador de celulas madre y se expresa especlficamente en un subgrupo de celulas CD34+ inmaduras, en celulas progenitoras endoteliales circulantes y en un subgrupo de celulas madre CD34- (De Wynter y otros, 1998). Las celulas CD133 positivas enriquecidas o aisladas mediante el uso del sistema CliniMACS para CD133 se usan para la expansion ex vivo de celulas progenitoras hematopoyeticas de sangre del cordon, y en trasplantes autologos (Pasino y otros, 2000) y alogenicos (Kohl y otros, 2002).

Las celulas madre CD133+ pueden usarse en aplicaciones no hematologicas para medicina regenerativa. Las celulas CD133 seleccionadas de la medula osea han devenido en foco de atencion, por ejemplo, con respecto al tratamiento de las enfermedades cardiacas isquemicas (Stamm y otros, 2003).

El enriquecimiento o el aislamiento de celulas CD133+ resulta en una elimination de celulas no deseadas de mas del 99.4 % (2.2 log). Ver Tabla 1.

Tabla 1: Las celulas CD133 positivas se aislaron a partir de medula osea mediante el uso de la presente invencion:

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Volumen inicial [ml]: Frecuencia inicial de CD133+ Pureza final de CD133+ reduction log de CD133" Numero final de celulas CD133+ Rendimiento de CD133+

17: 0,51 % 56,54 % 2,2 5,5E5 60.89 %

42: 0,26 % 51,15 % 2,5 1,3E6 87.32 %

53: 0,62 % 66,16 % 2,7 2,5E6 56.65 %

34: 0,26 % 48,89 % 2,3 8,4E5 77.96 %

62: 0,55 % 60,51 % 2,7 1,8E6 54.04 %

(* calculado en relation a las celulas CD133+ recuperadas en todas las bolsas)

Para las comparaciones, todos los productos de medula osea se procesaron, ademas, mediante el uso del Sistema CliniMACS® CD133 con resultados similares.

Los diagramas de puntos en la Figura 20 muestran las caracterlsticas de la muestra antes (izquierda) y despues (derecha) del procesamiento automatizado mediante el uso de la presente invencion.

Ejemplo 11: Seleccion de Celulas CD14 Positivas

El antlgeno CD14 pertenece al complejo del receptor de LPS y los monocitos expresan fuertemente el antlgeno. Los monocitos CD14 seleccionados pueden usarse para la generation subsiguiente de celulas dendrlticas derivadas de monocitos humanos (MoDCs; Campbell y otros, 2005). Las celulas dendrlticas tienen un gran potencial como vacunas celulares para diversas enfermedades, que incluyen tumores solidos, neoplasias malignas hematologicas, infecciones virales y enfermedades autoinmunitarias.

Se aislaron monocitos a partir de la cosecha de dos leucaferesis mediante el uso de la presente invencion y el Reactivo CD14 de CliniMACS. Los monocitos se enriquecieron de 19,.7 % / 31,8% (cosechas sin procesar) al 98,2% / 99,7% (producto celular final) con un rendimiento del 58 % / 21 % (ver la Figura 21)

Las MoDC se generaron a partir de monocitos aislados mediante el uso de la presente invencion y mostraron caracterlsticas identicas a las MoDC generadas a partir de monocitos aislados con CliniMACS.

Los monocitos se aislaron, ademas, a partir de la capa leucocitaria de sangre entera humana mediante el uso de la presente invencion y pudieron enriquecerse de 9.8 % (capa leucocitaria no procesada) hasta 98,9 % de pureza (producto celular final) con un rendimiento de monocitos del 64 %.

Ejemplo 12: Seleccion de CD304

En la sangre periferica CD304 (BDCA-4, Neurofilina-1) se expresa en celulas dendrlticas plasmacitoide humanas (PDC). Las PDC son las celulas productoras mas potentes de Interferon Tipo I (Dzionek y otros, 2002). El CD304 puede usarse directamente para enriquecer o aislar celulas dendrlticas de sangre periferica sin un perlodo de cultivo (como para MoDC).

El enriquecimiento o el aislamiento de celulas diana CD304 positivas requiere etapas prolongadas de lavado las que consumen tiempo mediante el uso del procedimiento de preparation de muestras CliniMACS en una centrlfuga de bolsa de sangre. El procesamiento automatizado de muestras facilitara el uso de celulas CD304 aisladas en ensayos de vacunacion.

Se aislaron o se enriquecieron celulas CD304 positivas a partir de la cosecha de dos leucaferesis mediante el uso de la presente invencion y el reactivo CD304 de CliniMACS. Las PDC se enriquecieron de 0,29 % a 34,4 % con un rendimiento de 30 % y de 0,43 % a 80,5 % con un rendimiento del 39 %.

Las Celulas Dendrlticas Plasmacitoide del segundo procedimiento se cultivaron durante 24 horas con CPG C (ODN2395) e IL-3 o solamente con IL-3 para inducir la maduracion. Las celulas cultivadas se analizaron para determinar los marcadores de maduracion CD40 y CD80 y el perfil de marcadores fue identico a las PDC CD304 positivas aisladas mediante el uso del sistema CliniMACS para CD304 tras el cultivo.

Ejemplo 13: Seleccion de celulas CD4 positivas

CD4 es una molecula accesoria en el reconocimiento de antlgenos extranos por las celulas T en asociacion con los antlgenos del MHC clase II. Las celulas T auxiliadoras y en un menor grado los monocitos y las celulas dendrlticas expresan CD4.

Para ciertos contextos oncologicos, los datos preliminares sugieren que las celulas T en un injerto o como infusion de linfocitos donantes pueden ser beneficiosas (Falkenburg y otros, 1999). En estos contextos puede desearse una

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seleccion de CD4 o reduccion de CD8 (ver el ejemplo 5) en el ajuste de trasplante alogenico. Las celulas T auxiliadoras pueden ser capaces de generar respuestas antitumorales, reducir el riesgo de Enfermedad Injerto contra Huesped (Alyea y otros. 1998), y reconstituir el sistema inmune del receptor (Bellucci y otros, 2002).

Las celulas T auxiliadoras CD4 positivas desempenan, ademas, un papel significativo en la infeccion y progresion del HIV. Las celulas T auxiliadoras seleccionadas (potencialmente despues de una modificacion genetica) pueden desearse para el tratamiento de las complicaciones del hIv.

Se aislaron o se enriquecieron celulas CD4 positivas a partir de tres productos de capa leucocitaria de sangre entera humana mediante el uso de la presente invencion y el Reactivo CD4 de CliniMACS. Las celulas T auxiliadoras se enriquecieron de 27 % / 8,.6 % / 15,9 % a 90 % / 80 % / 81,3 % de pureza con un rendimiento de 93 % / 98 % / 51 %. Estos resultados estan muy dentro del intervalo de los resultados que se obtienen mediante el uso del Sistema CliniMACS para CD4.

Ejemplo 14: Reduccion de Celulas CD8 Positivas

El antlgeno CD8, un correceptor para las moleculas del MHC de clase I, se expresa en celulas T citotoxicas y debilmente en un subgrupo de las celulas NK.

En el contexto de trasplante alogenico, las celulas T CD8 pueden eliminarse de una infusion de linfocitos de injerto o donante con el objetivo de prevenir la Enfermedad Injerto contra Huesped a la vez que se mantienen los efectos del Injerto contra la Leucemia (Meyer y otros. 2007).

Las celulas T citotoxicas CD8 positivas se redujeron de tres productos de capa leucocitaria mediante el uso de la presente invencion y el Reactivo CD8 de CliniMACS. Las celulas T citotoxicas se redujeron de 11,5 % / 8 % / 12 % a

0. 005.% / 0,004 % / 0,002 %, respectivamente. Esto representa una reduccion de > 99,97 % (> 3,5 log) de celulas no deseadas. Las celulas diana CD8 negativas se recuperaron casi completamente (85,1 % / 90,9 % / 94,4 %).

Ejemplo 15: Preparation de celulas mononucleares de sangre periferica mediante centrifugation con gradiente de densidad

El Ficoll-Paque™ es un medio de densidad esteril para el aislamiento de celulas mononucleares a partir de medula osea, sangre periferica y sangre del cordon. Es una solution acuosa de densidad 1,077 g/ml, que consiste en Ficoll PM400 (un polisacarido altamente ramificado, de alta masa, hidrofilo), diatrizoato de sodio y EDTA disodico de calcio. Los eritrocitos y los granulocitos tienen una densidad mayor que 1,077 g/ml, mientras que los linfocitos y los monocitos tienen una densidad mas baja. Cuando la sangre humana se estratifica en la parte superior del Ficoll-Paque, los linfocitos y monocitos pueden separarse de los eritrocitos y granulocitos bajo la fuerza centrlfuga.

La presente invencion se ha usado para la preparacion de celulas mononucleares de sangre periferica mediante centrifugacion en gradiente de densidad. La capa leucocitaria de sangre entera humana se estratifico sobre un anillo de Ficoll-Paque al mismo tiempo que la camara de centrifugacion giraba. La velocidad de rotation se ajusto a 2,900 rondas por minuto y se mantuvo durante 20 minutos. Pudo detectarse un anillo externo de eritrocitos y granulocitos, un anillo de Ficoll-Paque, un anillo de celulas diana (celulas mononucleares de sangre periferica, es decir, linfocitos y monocitos) y un anillo interno de plaquetas que contenla plasma sangulneo y tampon PBS. Las diferentes capas se eliminaron de la camara de centrifugacion de la presente invencion a traves de los puertos luer y se analizaron para determinar el contenido de las diferentes celulas. Se recupero el 70 % de las PBMC del producto sangulneo original a partir de la capa de PBMC. Esta suspension celular contenla solamente el 1,1 % de las celulas rojas originales de la sangre. Por tanto, la presente invencion puede usarse para la preparacion automatizada de celulas mononucleares de sangre periferica (segundo anillo) o plasma rico en plaquetas (anillo interno).

Ejemplo 16: Cultivo de Celulas

La camara de centrifugacion de la presente invencion puede usarse para el cultivo de celulas, de manera similar a los frascos o bolsas de cultivo de celulas. A una camara de centrifugacion se aplicaron celulas de la llnea de celulas humanas K562 3.2E5/ml, en un volumen de 30 ml de medio de cultivo celular RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 %. La camara se coloco en una incubadora de CO2 a 5 % de CO2. Se retiraron allcuotas del contenido de la camara para el recuento celular y la evaluation de la viabilidad despues de 24, 48 y 70 horas. Las celulas sembradas se expandieron a 4.1 E5/ml, 6.4E5/ml y 9.2E5/ml de celulas viables a 80 %, 95 % y 95 % de viabilidad.

Ejemplo 17: Metodo para la separation de celulas CD133+ mediante el uso de un sistema de la presente invencion.

El procedimiento completo de separacion de celulas CD133+ comprende diversas etapas con las siguientes tareas:

1. Cebar el conjunto de tubos con tampon

2. Transferir la muestra de medula osea a la camara de centrifugacion

3. Preparar la muestra de medula osea en la camara de centrifugacion.

4. Realizar la separacion magnetica de las celulas CD133+

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5. Reducir el volumen final

A continuacion, se describiran en detalle diversas etapas.

1. Cebar el conjunto de tubos con tampon

En una primera etapa, el conjunto de tubos se ceba con PEB (solucion salina tamponada con fosfato suplementada con EDTA 2 mmol/l, HSA al 0,5 %).

2. Transferir la muestra de medula osea a la camara de centrifugacion

Despues de cebar el conjunto de tubos, la muestra de medula osea se transfiere desde la bolsa de muestras 312 a la camara de centrifugacion 332.

3. Preparar la muestra de medula osea en la camara de centrifugacion.

La preparacion de la muestra en la camara de centrifugacion incluye varias etapas donde el sobrenadante se elimina de la camara. Durante la eliminacion del sobrenadante solo debe transferirse el sobrenadante libre de celulas o el sobrenadante con plaquetas, en el caso del lavado de plaquetas. El objetivo de esto es evitar que las celulas blancas de la sangre (WBC), y por tanto las CD133+, se eliminen junto con el sobrenadante. La preparacion de la muestra incluye las siguientes etapas:

- generar el plasma

- reducir las plaquetas

- incubar con Microperlas CD133 (Miltenyi Biotec, Alemania)

- eliminar lo que no se une a las Microperlas CD133

Generar el plasma:

El plasma que se genera al comienzo del proceso de preparacion de la muestra cumple las dos funciones siguientes:

1. Actuar como un reactivo de bloqueo que bloquea los receptores Fc de monocitos e impide que la porcion Fc de los anticuerpos anti CD133 unidos a las microperlas se unan a los monocitos. Esto conducirla a una reduccion de la pureza del producto del proceso de separacion inmunomagnetica por monocitos, y

2. actuar como un suplemento para el tampon en el que se suspende el producto celular final. Esto proporciona un entorno mas fisiologico para el producto celular que el tampon usado solo. Para la generacion y recoleccion de plasma, la muestra se centrifuga hasta que la mayorla de los componentes celulares del material, como eritrocitos (RBC), celulas blancas (WBC) y plaquetas sedimentan y forman una bolilla. El sobrenadante libre de celulas es el que se transfiere a un contenedor (303) que actua como un deposito

Para la generacion de plasma, el material celular se centrifuga a 2000 rpm en la camara de centrifugacion hasta que todos los componentes celulares del material como WBC, RBC y las plaquetas sedimentan y forman una bolilla. La generacion de plasma requiere una centrifugacion que conduce a un sobrenadante con tan bajas concentraciones celulares como sea posible y por tanto una sedimentacion casi completa de todos los componentes celulares de la sangre. El tiempo de sedimentacion depende del volumen de la muestra que se determina automaticamente durante la transferencia de la muestra a la camara de centrifugacion. El tiempo de sedimentacion para diferentes volumenes de muestra se muestra en la tabla 2:

Tabla 2:

Tiempo de sedimentacion para diferentes volumenes de suspension en el proceso de generacion de plasma

Intervalo de Volumen: Volumen Maximo Radio de la capa llmite aire/llquido Tiempo de sedimentacion

< 100 ml: 100 ml 5,21 cm 8,01 min » 8 min

100 ml < V < 125 ml: 125 ml 4,99 cm 11,82 min » 12 min

125 ml < V < 150 ml: 150 ml 4,77 cm 15,98 min » 16 min

150 ml < V < 175 ml: 175 ml 4,53 cm 20,57 min » 21 min

175 ml < V < 200 ml: 200 ml 4,53 cm 25,69 min » 26 min

Despues de la centrifugacion a 2000 rpm, la velocidad de rotacion se redujo suavemente a 1000 rpm con una velocidad de desaceleracion de 632 rpm/min. Despues se retira el plasma con una velocidad de la bomba de 6 ml/min hasta que se bombea aire fuera de la camara. A continuacion, el sobrenadante libre de celulas se transfiere a un contenedor que actua como un deposito. Posteriormente, el plasma puede transferirse desde el contenedor al sitio en el proceso en el que se usa el flujo a traves de un filtro con 0,2 pm para eliminar todas las celulas residuales que no se eliminaron durante la centrifugacion.

Reduccion de plaquetas:

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Como la generation de plasma elimina el sobrenadante completo en la camara, un volumen residual de 70 ml esta en la camara. Se anaden 150 ml de PEB para diluir la suspension lo que resulta en un volumen total de 220 ml. Despues, el tambor se acelera hasta 2000 rpm y la sedimentation se ejecuta durante 100 segundos para sedimentar los RBC y WBC antes de que el tambor se desacelere a 1000 rpm con una velocidad de desaceleracion de 632 rpm/min. Dentro de este tiempo de sedimentacion, solo una pequena portion de las plaquetas alcanza la bolilla cuando comienza la desaceleracion de la camara. A continuation, se elimina el sobrenadante completo a una velocidad de 6 ml/min. El analisis de la muestra y del sobrenadante eliminado mostro una elimination plaquetaria determinada experimentalmente del 50.8 %. Las plaquetas restantes se eliminan mediante el uso de un filtro (310).

Incubation con Microperlas CD133

Las microperlas CD133 se proporcionan en contenedores de vidrio que tienen un tabique. Para asegurar condiciones asepticas, se integra un filtro con tamano de poro de 0,2 pm (306) dentro de la rama del conjunto de tubos conectados al contenedor. El contenedor se conecta al conjunto de tubos mediante un adaptador de contenedor ventilado (305). Cuando el reactivo se bombea a la camara, se controla la presion dentro de la parte del conjunto de tubos situada delante del tambor. Cuando el contenedor funciona vaclo, el aire se mueve al filtro. Como el filtro se humedece por el reactivo, los poros aun estan llenos de llquido cuando el aire se mueve dentro del filtro. Debido a las fuerzas capilares el aire no puede pasar la membrana del filtro. Como la bomba continua su funcionamiento, la calda de presion se detecta por el sensor de presion (329) y el programa detiene la bomba. De este modo combinado con una etapa de aclarado para eliminar el reactivo residual, el reactivo se transfiere automaticamente a la suspension celular en la camara.

Despues de la transferencia de plasma para los propositos de bloqueo, el volumen se ajusta a un volumen de marcado de 95 ml y comienza la incubacion. En el proceso de preparation de muestras convencional, la bolsa de preparation de muestras tiene que colocarse en un agitador orbital e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente. El proceso de incubacion con el sistema de la presente invention se realiza como sigue:

1. El tambor se acelera a una velocidad de 300 rpm. Esto hace que el llquido se mueva a la pared de la camara.

2. Se realiza la centrifugation durante 10 segundos.

3. Despues de esto, el tambor se detiene. El llquido retrocede y tiene una superficie alineada horizontalmente.

4. La camara continua hasta detenerse durante 50 segundos.

5. Las etapas 1 - 4 se repiten hasta que transcurre el tiempo de incubacion de 30 minutos.

Este proceso conduce a una mezcla eficaz del llquido en la camara.

Eliminacion de las microperlas anti-CD133 no unidas:

El lavado de las microperlas se realiza para eliminar el reactivo no unido despues del marcado e incubacion. En el proceso de lavado se repiten las siguientes etapas tres veces:

1. Transferir PEB a la centrlfuga para diluir la suspension, lo que resulta en un volumen total de 230 ml

2. Centrifugar a 2000 rpm durante 140 segundos para sedimentar las RBC y WBC

3. Reducir la velocidad de camara de 2000 rpm a 1000 rpm

4. Eliminar el sobrenadante completamente a una velocidad de 20 ml/min

El proceso de lavado de las perlas consistira en tres etapas de lavado y se eliminara al menos el 97.2 % del reactivo no unido.

4. Realizar la separation magnetica de las celulas CD133+

Despues del proceso de lavado de las perlas, las celulas CD133+ se separan mediante el uso de una columna de separacion magnetica (columna CliniMACS, Miltenyi Biotec GmbH, Alemania). Consiguientemente, la suspension celular se transfiere a la columna de separacion con una velocidad de carga de 5 ml/min. Las celulas marcadas magneticamente se retienen en la columna magnetizada y se separan de las celulas no marcadas mediante el aclarado de la columna con PEB. Las celulas CD133+ retenidas se eluyen mediante la eliminacion del campo magnetico de la columna. Las celulas CD133+ se bombean en un lazo del conjunto de tubos y se vuelven a cargar en la columna de separacion. Este proceso se repite una vez mas y despues del tercer proceso de recarga, las celulas CD133+ se eluyen finalmente en 20 ml de tampon de elucion (ver la tabla 3 y la Figura 26). La velocidad de elusion es 600 ml/min.

5. Reducir el volumen final

Para la terapia cardiaca con celulas madre, las celulas CD133+ deben disponerse en un pequeno volumen final de 6 ml como maximo. Normalmente, las celulas CD133+ se eluyen finalmente de la columna CliniMACS en 20 ml de tampon de elucion. Para la reduction del volumen final, son posibles tres metodos: El volumen final de celulas CD133+ aisladas o enriquecidas puede reducirse mediante 1. eluir la columna en un pequeno volumen,

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2. filtrar despues de la separacion magnetica, o

3. usar la columna AutoMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania).

Elucion de la columna en un pequeno volumen:

En lugar de la elucion en 20 ml de tampon de elucion, las celulas CD133+ pueden eluirse de la columna CliniMACS en 6 ml de tampon de elucion. La velocidad de elucion es de 600 ml/min. Este metodo se probo mediante el enriquecimiento de celulas CD133+ a partir de la medula osea. Las celulas enriquecidas se determinaron mediante analisis de FACS (ver la tabla 4 y Fig. 27).

Filtracion despues de la separacion magnetica

Despues de la elucion de la columna de separacion CliniMACS en 20 ml de tampon de elucion, las celulas CD133+ pueden transferirse sobre un filtro (Pall IV-5, 0,2 pm o RoweFil 24, 1,2 pm) a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las celulas se eluyen del filtro en 2 ml. Este metodo se probo mediante el enriquecimiento de celulas CD133+ a partir de la medula osea. Las celulas enriquecidas se determinaron por analisis de FACS (ver la tabla 5 y la Fig. 28).

Reduccion de volumen final mediante el uso de la columna AutoMACS

Despues de la elucion de la columna CliniMACS, las celulas CD133+ pueden cargarse en una columna autoMACS a una velocidad de 4 ml/min. Posteriormente, las celulas CD133+ retenidas se eluyen en 4 ml de la columna autoMACS. Este metodo se probo mediante el enriquecimiento de celulas CD133+ a partir de la medula osea. Las muestras enriquecidas se determinaron mediante analisis de FACS (ver la tabla 6 y la Fig. 29).

Tabla 3: Elucion directa de las celulas CD133+ en 20 ml.

Volumen inicial [ml]: Frecuencia inicial de CD133+ Pureza final de CD133+ reduccion log de CD 133- Numero final de celulas CD133+ Rendimiento* de CD133+

91: 0,39 % 82,95 % 3,4 2,89E6 49,57 %

86: 0,67 % 66,99 % 2,8 5,72E6 56,67 %

129: 0,31 % 82,6 % 3,4 4,11E6 43,42 %

57: 0,76 % 59,18 % 2,3 5,1E6 72,24 %

61: 0,14 % 74,72 % 3,2 4,25E5 84,32 %

114: 0,37 % 88,19 % 3,4 1,79E6 50,08 %

77: 0,74 % 83,5 % 3 2,12E6 58,56 %

Tabla 4: Elucion directa de celulas CD133+ en 6 ml.

Volumen inicial: Frecuencia inicial Pureza final Reduccion log Numero final de rendimiento* de

[ml]: de CD133+ de CD133+ de CD133- celulas CD133+ CD133+

87: 0,67 % 62,79 % 2,7 2,78E6 51,22 %

129: 0,31 % 81,12 % 3,6 1,25E6 33,6 %

128: 0,66 % 57,25 % 2,6 2,31 E6 26,86 %

Tabla 5: Concentracion de celulas CD133+ mediante filtracion despues de la separacion magnetica.

Volumen inicial / Volumen final [ml]: Frecuencia inicial de CD133+ Pureza final de CD133+ reduccion log de CD 133- Numero final de celulas CD133+ rendimiento* de CD133+

91 / 3,79: 0,39 % 66,08 % 1,2 6,27E5 25,3 %

86 / 3,67: 0,67 % 60,1 % 1,5 1,29E6 31,6 %

129 / 3,66: 0,31 % 76,04 % 1,2 8,18E5 26,6 %

Tabla 6: Concentracion de las celulas CD133+ mediante el uso de la columna AutoMACS.

Volumen inicial /: Frecuencia inicial Pureza final de reduccion log de Numero final de rendimiento* de

Volumen final [ml]: de CD133+ CD133+ CD133- celulas CD133+ CD133+

57 / 2,78: 0,76 % 71,3 % 0,9 2,35E6 25,3 %

61 / 5,68: 0,14 % 82,84 % 0,4 1,73E5 31,6 %

114 / 5,64: 0,37 % 93,57 % 0,7 8,51 E5 26,6 %

(* calculado en relacion a las celulas CD133+ recuperadas en todas las bolsas)

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Reivindicaciones

1. Un instrumento de procesamiento de celulas (100) que comprende:

- una carcasa (105),

- al menos una unidad de magneto para una camara de separacion magnetica (106),

- al menos una unidad para una centrlfuga (104) y para una camara de cultivo (104), y

- valvulas de pinza (1-11; 12, 14, 15, 16; 17; 18; 19; 110; 310, 311; 424, 425; 427, 428, 429) para montar un conjunto de tubos desechables dentro del instrumento (100),

caracterizado porque

una camara de centrlfuga (128) se ubica en un area de temperatura controlada, y en donde el instrumento de procesamiento de celulas (100) comprende un sistema de deteccion optica (132) para la centrlfuga (104) para medir las densidades opticas en diferentes posiciones en la camara de cultivo (104).
2. El instrumento (100) de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende una interfaz para el usuario con un monitor y/o ordenador integrados (112) para almacenamiento y realizacion de diferentes operaciones de procesamiento de celulas.
3. El instrumento (100) de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde la camara centrlfuga (128) es desechable.
4. El instrumento (100) de conformidad con la reivindicacion 1 a 3, que comprende una camara para el cultivo de celulas (503), ubicado en un contenedor rotatorio (500), preferentemente, ubicado en la parte inferior, opcionalmente con medios para ajustar el foco sobre la camara (503).
5. Un metodo de obtencion de productos celulares mediante el uso de un instrumento de procesamiento de celulas (100) de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4.
6. El metodo de conformidad con la reivindicacion 5, en donde la obtencion de los productos celulares se realiza en un unico conjunto de tubos.
7. El metodo de conformidad con la reivindicacion 5 o 6, en donde los productos celulares se eligen a partir de un grupo que comprende celulas madre, celulas T, celulas dendrlticas, celulas NK, celulas B, monocitos y celulas positivas para un marcador particular.
8. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde las celulas positivas para un marcador particular se eligen de un grupo que comprende: CD133, CD34, CD3, CD4, CD8, CD56, CD19, CD14, CD141 (BDCA-3), CD303 (BDCA-2), CD304 (BDCA-4), CD144, CD1c (BDCA-1), NKp46, NKp80, CD45RO, CD45RA, CD137, CD25, y CD138.
9. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtienen injertos de celulas madre y progenitoras.
10. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtiene una vacuna de celulas dendrlticas.
11. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtiene una vacuna de celulas dendrlticas de la sangre mDC y pDC.
12. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtienen celulas T con especificidad antigenica.
13. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtienen celulas asesinas naturales activadas.
14. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtienen las celulas asesinas naturales expandidas.
15. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se obtienen las celulas T auxiliadoras expandidas.
16. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se seleccionan celulas CD133 positivas o celulas madre.
17. El metodo de conformidad con la reivindicacion 16, en donde se separan las celulas CD133 positivas, que comprende las etapas

- cebar con tampon el conjunto de tubos,

- transferir una muestra de medula osea a la camara de centrifugacion (128) del instrumento (100),

28

- preparar la muestra de medula osea en la camara de centrifugacion (128), - realizar la separacion magnetica de las celulas CD133 positivas, y - reducir el volumen final.

5 18.

El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se seleccionan celulas CD14 positivas.
19.

El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se seleccionan celulas diana CD304 positivas.

10 20.

El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se seleccionan celulas CD4 positivas.
21.

El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se reducen las celulas CD8 positivas.
22. 15

El metodo de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde se preparan celulas mononucleares de sangre periferica.