ITTO20060226A1 - Metodo ed apparato per il processamento e o l'analisi e o la selezione di particelle, in particolare particelle biologiche - Google Patents

Metodo ed apparato per il processamento e o l'analisi e o la selezione di particelle, in particolare particelle biologiche Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
di Brevetto per Invenzione Industriale
Campo della tecnica
La presente invenzione riguarda dei metodi ed apparati miniaturizzati per il processamento/manipolazione di particelle. L'invenzione trova applicazione principalmente nella implementazione di protocolli biologici su campioni di cellule in volumi ridotti, come spesso richiesto da un approccio di analisi miniaturizzato .
Stato dell'arte
In biologia, la centrifuga è uno degli strumenti più utilizzati per il processamento di campioni di cellule, in particolare in riferimento ad alcuni passi di processo quali il lavaggio delle cellule. Questo si rende necessario per esempio quando si parte da una coltura, per cui è desiderabile rimuovere il terreno di coltura e ri-sospendere le cellule in soluzione salina, o quando, dopo una fase di incubazione con anticorpi e/o altri reagenti, si desidera lavare via gli anticorpi in eccesso e risospendere le cellule in un buffer salino etc.. Il potenziale vantaggio che la riduzione dei volumi in gioco può comportare ha portato alla miniaturizzazione di questi passi di processo, il che ha stimolato lo sviluppo di diversi metodi di processamento/manipolazione .
In Seger et al. Celi immersion and celi dipping in microfluidic devices, LabChip, 2004, 4, 148-151, flussi di liquido comandati da pressione sono usati per scambiare cellule da un buffer di sospensione ad un altro (lavaggio), o per immergere cellule originariamente presenti in un primo buffer in un secondo buffer per un tempo controllato (incubazione o reagent-sampling) . Lo svantaggio di questo approccio è che è necessario mantenere un flusso controllato dei vari liquidi in gioco. Questo implica un maggiore consumo di reagenti ed una maggiore complessità del sistema, legata alla necessità di produrre una pressione per flussare (movimentare) i liquidi.
Un approccio simile è utilizzato da EVOTEC per sottoporre delle singole cellule intrappolate in gabbie di dielettroforesi a dei reagenti particolari, ma anche qui è necessario disporre di flussi controllati di reagenti .
La domanda di brevetto PCT/WO 00/69565 a G. Medoro descrive un apparato e metodo per la manipolazione ed individuazione di particelle tramite l'utilizzo di gabbie di potenziale dielettroforetico chiuse. Il metodo descritto insegna come controllare la posizione di ciascuna particella indipendentemente da tutte le altre in uno spazio bidimensionale. La forza utilizzata per intrappolare in sospensione le particelle è la dielettroforesi negativa. Il controllo individuale sulle operazioni di manipolazione avviene tramite la programmazione di elementi di memoria e circuiti associati a ciascun elemento di una schiera di elettrodi e sensori integrati in uno stesso substrato. Il brevetto US 6,294,063 Becker et al. descrive un metodo ed apparato per la manipolazione di pacchetti dì materiale biologico solido, liquido o gassoso mediante una distribuzione di forze programmabili.
Nella domanda di brevetto italiano B02005A000481, Medoro et al., sono riportati alcuni metodi per manipolare particelle con schiere di elettrodi, e alcuni metodi ed apparati per la loro individuazione, i quali sono tuttavia simili a queli del già citato brevetto PCT/WO 00/69565.
Pur senza consentire un controllo preciso sulla posizione delle particelle, è possibile inoltre utilizzare la dielettroforesi con Traveling Waves per spostare delle particelle.
In altri casi non sono necessari elettrodi per manipolare particelle poste all'interno di microcamere. Sono poi noti molti metodi per generare trappole ottiche (optical traps, optical tweezers), che si basano sulle differenze dell'indice di rifrazione delle particelle rispetto al mezzo di sospensione (es. A. Ashkin et al,Optical trapping and manipulation of single living cells using infrared laser beams, Nature, 330(6150) (1987) 769.)
In questo caso le particelle sono tipicamente intrappolate in massimi di intensità ottica generati per esempio focalizzando un fascio laser attraverso l'obiettivo di un microscopio. La manipolazione di una molteplicità di particelle può essere ottenuta con diversi metodi ottici nell'arte nota, basati su principi analoghi, per esempio utilizzando delle schiere di VCSEL (Vertical Cavity Surface Emitting Laser), o utilizzando trappole ottiche olografiche (holographic optical traps).
Sono note altre tecniche, che combinano proiezione di immagini con gradienti di intensità luminosa, l'utilizzo di un campo elettrico nel liquido e un dispositivo con un substrato foto-sensibile, per creare delle gabbie cosidette Opto-Elettroniche (per es. brevetto US 6,387,707B1 a Seul et Al., oppure Pei Yu Chiou et al, "Massively parallel manipulation of single cells and microparticles using optical images", Nature Voi 436, 21 July 2005, pp 370-372). In pratica si realizza un campo dielettroforetico, controllato non dalla forma degli elettrodi ma dall'immagine proiettata sul substrato foto-sensibile. In questo modo è dunque possibile manipolare le particelle presenti nel liquido.
Sono note infine altre tecniche per muovere particelle. In S. Gaugiran, et al., "Optical manipulation of microparticles and cells on Silicon nitride waveguides," Opt. Express 13, 6956-6963 (2005), delle particelle (artificiali o biologiche quali lieviti e cellule) sono spinte lungo guide d'onda dalla pressione di radiazione del campo evanescente di un laser che si propaga all'interno della guida stessa.
La domanda internazionale di brevetto a nome della stessa Richiedente depositata in data 22 Marzo 2006 è relativa ad un metodo ed un apparato per effettuare la caratterizzazione e/o il conteggio di particelle di qualsiasi tipo, ad esempio particelle biologiche quali cellule o loro parti, in cui si agisce sul controllo della posizione di ciascuna particella presente in un campione, al fine di spostare tali particelle in modo deterministico o statistico, per rilevarne la presenza e/o caratterizzarne il tipo con sensori ottici e/o impedenziometrici integrati. In particolare vengono utilizzati campi di forza non uniformi, tempo variabili e sensori ottici od impedenziometrici disposti sotto o in prossimità di una schiera di elettrodi, integrati con essi in un unico chip. I campi di forza possono essere di dielettroforesi positiva o negativa, elettroforesi o moti elettro-idrodinamici , caratterizzati da un insieme di punti di equilibrio stabili.
Tuttavia, tra i metodi riportati nelle suddette invenzioni relative a micromanipolatori di cellule/particelle basati su dielettroforesi o altre tecniche ottiche o opto-elettroniche, pur non essendo necessario un flusso, non è previsto un metodo per consentire quelle tipiche operazioni come lavaggio e/o incubazione delle cellule o particelle, come necessario in molti protocolli biologici.
Sommario dell'Invenzione
Scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo ed un apparato per effettuare molteplici operazioni tipicamente svolte, fino ad ora, su scala macroscopica con provette e centrifughe, effettuandole invece in modo miniaturizzato e/o con un minore consumo di reagenti e/o una maggiore delicatezza di azione sulle cellule/particelle e/o una maggiore efficienza di recupero delle cellule processate e/o un maggiore controllo sul tempo di incubazione/lavaggio e/o una maggiore automazione e/o l'estrazione di informazioni particolari sulle singole cellule.
Qui e nel seguito, con i termini "particelle" o "particella" si vogliono indicare entità micrometriche o nanometriche, naturali o artificiali, quali cellule, componenti subcellulari, virus, liposomi, niosomi, microbiglie (microsfere) e nanobiglie, o anche entità più piccole quali macro-molecole, proteine, DNA, RNA, eccetera, così come gocce di un fluido immiscibile in un mezzo di sospensione, ad esempio olio in acqua, o acqua in olio, o anche gocce di liquido in un gas (quali acqua in aria) o, ancora, bollicine di gas in un liquido (quali aria in acqua).
A volte sarà usato il termine cellula, ma ove non altrimenti specificato, esso dovrà essere inteso come esempio non limitativo di "particelle" intese nel senso più ampio sopra descritto.
In base alla presente invenzione vengono dunque forniti un metodo ed un apparato per realizzare lavaggio, incubazione, ed operazioni complesse (quali ad esempio marcatura di cellule con anticorpi e/o microsfere) come definiti nelle rivendicazioni 1, 5, 9, 15, 16
In particolare, vengono utilizzati campi di forza non uniformi, tempo variabili ed opzionalmente dei sensori integrati, preferibilmente di tipo ottico.
I campi di forza possono essere, per esempio, di dielettroforesi positiva o negativa, elettroforesi o moti elettro-idrodinamici, caratterizzati da un insieme di punti di equilibrio stabile per le particelle (solide, liquide o gassose);
In questo modo le limitazioni dell'arte nota sono superate dalla presente invenzione.
L'implementazione del metodo secondo l'invenzione non necessità di pompe o flussi di liquido altrimenti generati .
Al contrario delle centrifughe, le cellule sono sottoposte a minori stress legati alla pressione esercitata dalle altre cellule nel pellet, o ad attriti con le pareti della provetta.
Il metodo può essere realizzato con sistemi miniaturizzati e si può ridurre drasticamente il consumo di reagenti, anche perché non è necessario sostenere un flusso dei medesimi.
Infine, al contrario degli approcci che fanno uso di flussi per muovere le particelle, utilizzando un campo di forza controllato per muovere le particelle da un buffer all'altro si può controllare con precisione, particella per particella, il tempo per cui ciascuna di queste rimane esposta a ciascun reagente.
L'apparato realizzato secondo il trovato permette infine di implementare il metodo dell'invenzione in modo particolarmente vantaggioso.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione appariranno chiari dalla descrizione che segue di alcuni suoi esempi di attuazione non limitativi, effettuata con riferimento alle figure dei disegni annessi .
Breve descrizione delle figure
Fig. 1 mostra una realizzazione di un metodo di lavaggio realizzato secondo il trovato compatibile con l'utilizzo di forze che agiscono sulle particelle in una sola direzione;
Fig. 2 mostra una realizzazione di un metodo di lavaggio secondo il trovato che richiede la manipolazione delle particelle in due dimensioni;
Fig. 3 mostra una realizzazione di un metodo di incubazione di particelle che richiede la manipolazione delle particelle in due dimensioni;
Fig. 4 mostra un primo apparato realizzato secondo la presente invenzione;
Fig. 5 mostra un secondo apparato realizzato in base alla presente invenzione.
Descrizione dettagliata
La presente invenzione ha come scopo quello di fornire un metodo ed un apparato per effettuare molteplici operazioni tipicamente svolte su scala macroscopica con provette e centrifughe, ma effettuandole in modo da avere uno o più dei seguenti vantaggi:
o miniaturizzazione;
o minore consumo di reagenti;
o maggiore delicatezza sulle cellule/particelle; o maggiore efficienza di recupero delle cellule processate;
o maggiore controllo sul tempo di incubazione/lavaggio;
o maggiore automazione;
o integrazione di vari passi di processo in un unico dispositivo integrato
o estrazione di informazioni particolari caratterizzanti sulle singole cellule (es dinamica di uptake di reagenti, variazioni di volume, lisi) impossibili con altri metodi.
Il metodo dell'invenzione si basa sull'utilizzo di un campo di forza (F) non uniforme tramite il quale attrarre singole particelle o gruppi di particelle (BEAD) verso posizioni di equilibrio stabile (CAGE). Tale campo può essere, come esempio illustrativo ma non limitativo, un campo di dielettroforesi (DEP) negativa (NDEP) o positiva (PDEP), o un campo elettroforetico (EF), un campo optoforetico etc..
L'individuazione degli effetti sulla particella conseguenti l'immersione della stessa in un secondo buffer può riguardare uno dei seguenti aspetti, o combinazioni degli stessi:
o l'individuazione della fluorescenza
o l'individuazione dell'assorbanza, trasmittanza o altre proprietà ottiche;
o l'individuazione di variazioni di volume o altre proprietà fisiche;
o l'individuazione di proprietà impedenziometriche; o l'individuazione della lisi della particella.
Ciascuno di questi rilevamenti può essere effettuato opzionalmente a livello di singola cellula, e con risoluzione temporale tale da apprezzare la dinamica di variazione dei parametri studiati.
Inoltre, tale informazione può servire non solo per caratterizzare gli effetti del buffer sulle particelle ma per effettuare un recupero selettivo delle particelle con determinate caratteristiche.
A tale proposito si sfrutta principalmente la misura della variazione di impedenza e/o la misura della variazione di intensità luminosa, trasmessa, diffusa o emessa in fluorescenza.
Generazione delle forze
Esistono diversi metodi per la generazione di forze per spostare particelle, come descritto precedentemente nello stato dell'arte.
Per semplicità, nel seguito si considera a titolo puramente esemplificativo, e pertanto non limitativo ai fini della presente invenzione, l'uso di gabbie chiuse di dielettroforesi negativa come forza di attuazione per la descrizione dei metodi ed apparati (per questo è necessario usare un coperchio che funga da elettrodo) dell'invenzione. Agli esperti del settore con ordinarie capacità è evidente come sia possibile generalizzare i metodi ed apparati descritti in seguito per l'impiego di diverse forze di attuazione, e diversi tipi di particelle.
La caratteristica comune delle forze che consentono di manipolare le particelle secondo la presente invenzione, è legata al fatto che queste forze agiscono principalmente sulla particella, muovendo questa ma non -o in modo molto limitato - il liquido nel quale è immersa.
L'utilizzo dell'ima o dell'altra forza è relativamente indifferente, a meno che non siano coinvolti dei marcatori fluorescenti. In questi casi risulta preferibile utilizzare forze basate solamente su campi elettrici, in modo da non causare il photo-bleaching dei fluorofori, cosa che potrebbe avvenire applicando l'illuminazione altrimenti necessaria per l'attuazione con metodi ottici o elettro-ottici.
Sensori impiegati
Sempre per semplicità si farà nel seguito riferimento solamente al caso dei sensori ottici, che consentono di rilevare la potenza ottica incidente su un fotodiodo integrato con gli elettrodi. Agli esperti del settore con ordinarie capacità è evidente come sia possibile generalizzare, nei vari casi, i metodi ed apparati descritti in seguito anche per l'impiego, alternativo o combinato, di sensori impedenziometrici integrati.
E' altresì evidente all'esperto del settore con ordinarie capacità in quali casi si tragga giovamento dai sensori integrati e in quali casi essi non siano necessari.
Metodo per il lavaggio di particelle
Si faccia riferimento a Fig. 1. e Fig. 2.
Il metodo sfrutta il fatto che introducendo due liquidi (L1, L2), anche di tipo generalmente miscibili tra loro, in almeno una microcamera (ad esempio CHI, Fig.
1), in modo tale da realizzare un flusso laminare per ciascun liquido durante la fase di introduzione dello stesso in una regione prefissata della microcamera, i due liquidi non si mescolano, a parte il del tutto trascurabile, ai fini del trovato, mescolamento dovuto al lento processo di diffusione, processo che in ogni caso inizia solamente a riempimento della microcamera CHI avvenuto e al raggiungimento di una condizione di stato stazionario nei due liquidi stessi.
Secondo quanto illustrato in Fig. 1 si utilizza un apparato includente una unica microcamera CHI avente un orifizio di ingresso o input II ed un orifizio di uscita o output 01 disposti in corrispondenza di estremità opposte della microcamera CHI, il cui pavimento o base, parallelo al piano del foglio in Fig. 1, è costituito da un substrato (chip) provvisto di una schiera di elettrodi, eventualmente sensorizzati.
Energizzando gli elettrodi ed attivando quindi la forza (F) che agisce solo sulle particelle (BEAD) presenti in sospensione nel primo liquido ma lascia sostanzialmente immobile sia primo che il secondo liquido, si trasferiscono (Fig. ld) le particelle (BEAD) dal primo liquido (Li) al secondo (L2).
Per esempio il primo liquido potrebbe essere un terreno di coltura, e il secondo soluzione fisiologica.
L'operazione può essere ripetuta iterativamente portando le particelle in ulteriori liquidi (L3, ... LN) in modo corrispondente ad un lavaggio multiplo come di solito effettuato con provette e centrifughe.
Con le centrìfughe però il buffer di partenza viene diluito nel buffer di destinazione, motivo per cui è necessario spesso operare due o tre lavaggi per ottenere una relativa assenza del liquido originario. Nella presente invenzione, la contaminazione del buffer di destinazione (L2, ...Ln) può essere di gran lunga limitata se la movimentazione delle particelle (BEAD) è relativamente rapida rispetto ai tempi di diffusione delle molecole tra i buffer iniziale e di destinazione. Questi tempi di diffusione possono essere resi relativamente lunghi con opportuni accorgimenti, come ad esempio quello illustrato in Fig. 2, che mostra l'utilizzo per l'esecuzione del metodo dell'invenzione di un apparato includente due microcamere CHI, CH2 ciascuna provvista di un pavimento dotato di una schiera di elettrodi energizzabili selettivamente e collegate idraulicamente tra loro da una restrizione o orifizio Gl,2 e ciascuna delle quali include un orifizio di ingresso o alimentazione 11,12, ed un orifizio di uscita o scarico 01,02, disposti ad estremità opposte di ciascuna microcamera CH1,CH2 e secondo una direzione perpendicolare a quella di passaggio attraverso l'orifizio Gl,2.
Mentre nel caso dell'apparato di Fig. 2 i liquidi Li e L2 possono venire introdotti in moto laminare in regioni prefissate delle microcamere CH1,CH2 fino a riempire totalmente con il liquido Li la microcamera CHI e con il liquido L2 la microcamera CH2, attivando poi gli elettrodi in modo da trasferire le particelle dal liquido Li (e dalla relativa microcamera CHI) al liquido L2 e nella relativa microcamera CH2, guidandole lungo l'orifizio Gl,2, ove è presente l'interfaccia tra i liquidi Ll,L2 che è pertanto piccola e dunque limita ad un minimo i fenomeni diffusivi, nel caso dell'apparato di Fig. 1 occorre dapprima introdurre nella microcamera CHI, operando in moto laminare, il liquido L2 attraverso l'orifizio II, senza riempire totalmente la microcamera CHI, ma solo una prima regione della stessa (ad esempio pari a circa la metà del volume della microcamera CHI) situata in prossimità di II e, successivamente, introdurre attraverso lo stesso orifizio II il liquido LI con le particelle in sospensione, operando sempre in moto laminare, in modo che il liquido LI spinga il liquido L2 ad occupare una seconda regione della microcamera CHI situata in prossimità dell'orifizio di uscita 01, andando il liquido Li (con le particelle in sospensione) ad occupare la prima regione della microcamera CHI.
In ogni caso, le particelle in sospensione nel liquido di lavaggio L2 possono poi essere recuperate estraendo il liquido L2 dalla microcamera o regione della microcamera da esso occupata, sempre operando in moto laminare, attraverso l'orifizio 01 (Fig. 1) o 02 (Fig. 2) .
In sostanza il metodo descritto prevede le fasi di: o Introdurre in regime di flusso laminare, prime particelle in sospensione in un primo fluido (ad esempio costituito da un liquido, o un semi-liquido), all'interno di una prima regione di almeno una microcamera.
o Introdurre in regime di flusso laminare almeno un secondo fluido (ad esempio un liquido o semi-liquido) in almeno una seconda regione di detta almeno una microcamera, in modo da non miscelare detto almeno un secondo fluido con detto almeno un primo fluido, o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento delle sole particelle verso detta almeno una seconda regione della detta almeno una microcamera contenente detto almeno un secondo fluido in modo da sospendere dette particelle in detto secondo fluido .
Opzionalmente (se non sono necessari altri passi di processo nel dispositivo integrato):
0 Recuperare selettivamente detto secondo fluido e dette particelle estraendo da detta almeno una microcamera detto secondo fluido recante dette particelle in sospensione.
Metodo per l'incubazione di particelle
Si faccia riferimento a Fig. 3.
Il metodo è per certi versi analogo al precedente, ma prevede anche il fatto di restituire le particelle verso il buffer di partenza o verso un terzo buffer di destinazione .
Questo è un tipico problema legato ai passi di processo necessari per esempio per marcare delle cellule con anticorpi (ad esempio per recettori di membrana) eventualmente accoppiati a microbiglie (ad esempio particelle di polistirene) così da immuno-decorare le cellule, con traccianti fluorescenti (ad esempio dye intracellulari come Calceina, FITC, acridine orange, Trypan Blue), o per fissare cellule (ad es con paraformaldeide) , o per lisare selettivamente certe cellule (ad es. esponendo le cellule ad acido acetico, che lisa 1 globuli rossi ma non i globuli bianchi).
In questi casi risulta importante non solo portare le particelle in un secondo liquido, ma anche il mantenerle in questo secondo liquido per un lasso di tempo definito per poi portarle in un terzo liquido, che potrebbe anche essere il primo (dunque eseguendo il passo di riportare le particelle nel primo liquido). Secondo la presente invenzione, è dunque possibile portare le cellule in un secondo liquido dove vengono esposte ai reagenti opportuni, e poi riportarle in un ulteriore liquido privo di reagenti.
È da notare che, a differenza di quanto è realizzabile con provette e centrifughe, è possibile, tramite il metodo dell'invenzione, esporre le particelle al reagente anche per tempi molto brevi.
In pratica, le particelle BEAD in sospensione nel primo liquido (o generico fluido) Li (Fig. 3b) vengono introdotte in moto laminare in una prima microcamera CHI di un apparato di manipolazione del tipo a due microcamere aventi il pavimento costituito da schiere di elettrodi indirizzabili e tra loro idraulicamente collegate da un orifizio Gl,2, identico all'apparato illustrato in figura 2. Successivamente (o simultaneamente) , viene introdotto, operando in condizioni di moto laminare, il generico fluido o liquido L2 nella seconda microcamera CH2 (Fig. 3c) e poi vengono attivati in modo selettivo gli elettrodi per creare un campo agente con forza F sulle particelle tale da trasferirle, attraverso l'orifizio Gl,2 dalla microcamera CHI alla microcamera CH2 senza produrre lo spostamento dei liquidi Ll,L2 (Fig. 3d), che si trovano a questo punto in condizioni stazionarie; ancora successivamente, dopo un tempo di incubazione prefissato (che può anche essere piccolo a piacere) le particelle vengono trasferite all'indietro dalla forza F nella microcamera CHI (Fig. 3e), sempre attraverso l'orifizio Gl,2, la quale microcamera CHI può sempre contenere il liquido LI di partenza, oppure un nuovo liquido (fluido) L3...Ln nel frattempo introdotto nella microcamera CHI attraverso II previo scarico del liquido LI, ad esempio attraverso 01. Le particelle possono infine venire prelevate insieme al liquido presente in CHI e nel quale si trovano in sospensione (Fig. 3f) sia attraverso 01 che II, operando sempre in moto laminare.
In sostanza il metodo descritto prevede le fasi di: o Introdurre in regime di flusso laminare, dette particelle in sospensione in un primo fluido all'interno di una prima regione di almeno una microcamera di un apparato per la manipolazione delle particelle;
o Introdurre in regime di flusso laminare almeno un secondo fluido in almeno una seconda regione di detta almeno una microcamera, in modo da non miscelare detto almeno un secondo fluido con detto almeno un primo fluido;
o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento delle sole particelle in un verso prefissato entro detta almeno una seconda regione della detta almeno una microcamera contenente detto almeno un secondo fluido, in modo da sospendere dette particelle in detto secondo fluido;
o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento in verso opposto al precedente delle sole particelle tale da riportarle all'interno di detta almeno una prima regione della detta almeno una microcamera.
Opzionalmente, il metodo dell'invenzione può comprendere inoltre le fasi di:
o Sostituire detto primo fluido in detta almeno prima regione di detta almeno una microcamera con almeno un terzo fluido, prima di riportare dette particelle in detta almeno una prima regione di detta almeno una microcamera;
o Recuperare selettivamente dette particelle estraendo da detta almeno una microcamera il fluido nel quale le particelle si trovano in sospensione.
Metodo per l'esecuzione di protocolli complessi
Le operazioni di lavaggio e incubazione possono essere composte in sequenza realizzando protocolli complessi. Per esempio con le seguenti fasi:
1. Spostare le cellule dal liquido Li ad un liquido di destinazione differente Li+1
2. Attendere un periodo di tempo Ti+1
3. Spostare le cellule dal liquido Li+1 ad un ulteriore liquido Li+2
4. ripetere le fasi 2) e 3) precedenti fino a portare le cellule o particelle in sospensione in un liquido Li+n.
Per esempio le cellule potrebbero essere:
o introdotte sospese nel terreno di coltura,
o spostate in una regione dello spazio occupata da un liquido di lavaggio (quale soluzione fisiologica), o essere portate in una regione dello spazio contenente para-formaldeide,
o mantenute in questo reagente per il tempo necessario ad ottenere il fissaggio e la permeabilizzazione della membrana,
o lavate portandole in una ulteriore regione dello spazio contenete soluzione fisiologica,
o portate in una regione dello spazio contenente delle proteine con marker fluorescenti per riconoscere proteine potenzialmente presenti all'interno della cellula,
o lavate portandole in una ulteriore regione dello spazio contenete soluzione fisiologica,
o analizzate con sensori per riconoscere quali cellule esprimono le proteine individuate dal marcatore fluorescente.
Secondo questo aspetto del trovato viene dunque eseguito un metodo per la esecuzione di protocolli sperimentali complessi su particelle mantenute in sospensione in un fluido, comprendente le fasi di: i) Sospendere dette particelle in un primo fluido di processo (Li) confinato in una prima regione di spazio; ii) Spostare selettivamente dette particelle in un secondo fluido di processo (Li+1) confinato in una seconda regione di spazio mantenendo il primo fluido ed il secondo fluido in condizioni stazionarie, mediante applicazione a dette particelle di una forza F ottenuta attivando un campo forza agente esclusivamente su dette particelle;
iii) Ripetere un numero n di volte la fase ii) fino a portare dette particelle in sospensione in un fluido finale (Li+n), in modo da contattare con dette particelle una pluralità di fluidi di processo diversi, almeno alcuni dei quali sono capaci di interagire con dette particelle
iv) Analizzare dette particelle con sensori dislocati in una regione dello spazio contenente in modo confinato detto fluido finale.
Metodo per lo studio della dinamica di reazione di particelle con reagenti
A differenza di quanto possibile anche con tecniche basate su microsistemi a flusso come il già citato Seger et al. LabChip, il tempo di permanenza delle particelle nel reagente di incubazione non è legato alla dinamica dei flussi di campione.
Inoltre, ogni singola particella può essere esposta al reagente per tempi differenti, pur essendo manipolata all'interno del medesimo dispositivo. Infatti è sufficiente localizzare tale particella nella regione di spazio occupata dal reagente per un certo tempo Ti, e poi riportarla nel buffer di sospensione destinazione finale.
È così possibile esporre N particelle ad un reagente per Tl-TN tempi diversi.
Si possono dunque studiare dinamicamente (in funzione del tempo) delle caratteristiche, quali per esempio l'assorbimento del reagente o la variazione di caratteristiche da questi causata sulla cellula.
Questo può avvenire con sensori ottici esterni o preferibilmente, utilizzando sensori integrati nel chip definente il pavimento delle microcamere CHI,... CHn utilizzate per tenere confinati gli n liquidi di processo con i quali contattare selettivamente le particelle sotto studio. I sensori integrati possono essere preferenzialmente ottici e/o impedenziometrici. Si può per esempio:
o Misurare l'assorbimento (uptake) di un colorante (ad esempio trypan blue)
o Misurare l'assorbimento (uptake) di un fluorocromo (es FITC, acridine orange etc.)
o Misurare l'uptake di Calceina mediante l'incremento di fluorescenza di una cellula (la Calceina è fluorescente solo all'interno della cellula);
o Misurare la variazione di volume di una cellula; o Verificare la lisi di una cellula esposta ad un reagente .
Tutte queste informazioni sono infatti rilevabili in modo integrato secondo i metodi dell'arte nota o, meglio, secondo le metodologie descritte nella domanda internazionale di brevetto a nome della stessa Richiedente, precedentemente ricordata.
Questa metodologia, che rappresenta una variante di quella esposta precedentemente, prevede pertanto che le fasi ii) e iiii) descritte in precedenza vengono eseguite in modo da esporre un numero N di particelle ad almeno un reagente prefissato per T1, ...TN tempi diversi; e che la fase iv) preveda lo studio dinamico, in funzione del tempo, di caratteristiche variabili di dette particelle, quali per esempio l'assorbimento di reagente o la variazione di proprietà delle particelle legate all'assorbimento di reagente.
Metodo per lo studio della secrezione di particelle Oltre alle caratteristiche della cellula, in termini di reagenti assorbiti o variazione di proprietà fisiche, è possibile studiare la secrezione di singole cellule. Per fare questo, si muovono le cellule verso un buffer di reazione che contiene sostanze che si modificano in base alla presenza del tipo di molecole di cui si intende studiare la secrezione.
Se la dinamica di secrezione è sufficientemente rapida rispetto al coefficiente di diffusione del secreto nel liquido, analizzando con opportuni sensori (per esempio sensori ottici esterni al chip definente il pavimento delle microcamere in cui avvengono le reazioini, o integrati in tale chip, oppure sensori impedenziometrici integrati nel chip, il liquido in prossimità della cellula da analizzare, si identificano le cellule che producono in misura maggiore o minore il secreto. Dall'arte nota sono disponibili numerosi metodi per mettere in evidenza sostanze secrete. Questi metodi possono essere utilizzati con poche o nulle modifiche al fine di studiare la secrezione non di un gruppo, ma, secondo l'invenzione, di singole cellule. A titolo di esempio, non limitativo, si citano l'utilizzo di sostanze chemiluminescenti, di sostanze fluorescenti con quenching che viene inibito dalla presenza di un certo secreto, o sostanze che cambiano colore in presenza di un certo secreto.
Qualora la diffusione del secreto sia troppo rapida rispetto alla dinamica di secrezione e alla scala dei tempi per la quale si desidera analizzare le cellule è necessario adottare delle soluzioni più elaborate. Altrimenti, il segnale rappresentato dalla variazione di colore, fluorescenza, impedenza o intensità luminosa emessa non rimane confinato ad una zona circostante alla cellula e non consente di separare il segnale proveniente da cellule diverse.
In tal caso, il metodo comprende la fase di incapsulare le cellule in sostanze porose/gelatinose che trattengono più a lungo il secreto rallentandone il coefficiente di diffusione, impedendo la sovrapposizione del segnale da differenti cellule.
Questo metodo può trovare impiego per esempio nella selezione di cellule incapsulate per evitare il rigetto nel trapianto a fini terapeutici
La metodologia appena descritta prevede dunque che le fasi ii) e iii) descritte in precedenza vengano eseguite in modo da esporre un numero prefissato di particelle, singolarmente od in gruppo, ad almeno un reagente prefissato capace di interagire con sostanze eventualmente secrete da dette particelle; mentre la fase iv) prevede a questo punto l'individuazione di tale interazione tramite i sensori, integrati o meno. Inoltre, essa può opzionalmente prevedere la fase di incapsulare almeno alcune particelle in sostanze porose/gelatinose capaci di trattenere le sostanze eventualmente secrete dalle particelle o almeno da rallentarne la diffusione nel fluido in cui le particelle sono sospese in misura tale da impedire la sovrapposizione di segnali generati dai sensori in risposta alla presenza di differenti particelle.
Metodo per lo studio degli effetti dell'esposizione di particelle a reagenti
Oltre alla dinamica di reazione può essere analizzata con alta risoluzione temporale e sopratutto con un basso ritardo, anche la dinamica delle reazioni dell'esposizione di una cellula ad un determinato reagente.
Riportando le singole particelle in un buffer neutro, si possono infatti studiare, dopo un lasso di tempo variabile, le modifiche ingenerate dalla esposizione delle cellule al reagente.
Come sopra, questo può essere fatto con sensori ottici esterni, o preferibilmente con sensori integrati, ottici o impédenziometrici.
Per esempio si potrebbe voler verificare l'espressione di un gene reporter, o la differenziazione cellulare. Metodo per la selezione di particelle
Oltre ad osservare la dinamica di reazione con un reagente, e ad osservare gli effetti dell'esposizione a detto reagente, è possibile effettuare una selezione automatica delle cellule in base alla risposta delle medesime agli stimoli (sotto forma di reagenti) applicati.
Questo permette di selezionare per esempio le cellule che risentono, sotto un certo punto di vista, in modo minore o in modo maggiore ad un determinato stimolo, o serie di stimoli.
Per esempio si potrebbero voler isolare le cellule che assorbono una quantità minore di farmaci di un tipo, o le cellule che producono una maggiore quantità di una certa proteina una volta esposte ad un reagente.
Secondo questo aspetto del trovato, dunque, si prevede la fase di selezionare, in risposta ad un segnale rilevato dai sensori, le particelle cui è correlata la generazione del segnale; questa fase di selezione viene poi effettuata applicando solo alle particelle correlate alla generazione di tale segnale la forza F generata dal campo di forze generabile tramite l'attivazione selettiva della schiera di elettrodi definente il pavimento delle microcamere per trasportare tali particelle e solo esse in una regione di spazio confinata definita, ad esempio costituita da una prefissata microcamera CHn o da una prefissata regione di volume di una stessa microcamera in cui si trovano i sensori.
Metodo per la "costruzione" di particelle
Tramite le metodologie fino a qui descritte è chiaro che si può anche spostare una particella o un gruppo di particelle "seme", da un primo liquido ad almeno un secondo liquido, nel quale tale/i particella/e si modifica per esempio in uno dei seguenti modi: ricoprendosi (ad esempio con sostanze presenti nel secondo liquido o che sono il prodotto di reazione tra la particella ed un reagente contenuto nel secondo liquido) , accrescendosi (tipicamente nel caso di particelle biologiche, quali cellule, che possono ad esempio trarre nutrimento od un segnale di moltiplicazione dal secondo liquido), imbibendosi (tipicamente nel caso di particelle artificiali porose, come microsfere).
Si muove poi la particella in un eventuale terzo, quarto, n-esimo reagente, realizzando un protocollo complesso per fornire al termine particelle "prodotto" costituite per esempio da strati di dimensioni controllate di materiali differenti.
Secondo questo aspetto del trovato viene dunque fornito un metodo per realizzare particelle aventi una struttura prefissata complessa a partire da prime particelle a struttura semplice, comprendente le fasi di
i) Sospendere dette prime particelle in un primo fluido di processo (Li) confinato in una prima regione di spazio;
ii) Spostare selettivamente dette particelle a struttura semplice in un secondo fluido di processo (Li+1) confinato in una seconda regione di spazio mantenendo il primo fluido ed il secondo fluido in condizioni stazionarie, mediante applicazione a dette prime particelle di una forza F ottenuta attivando un campo forza agente esclusivamente su dette prime particelle;
iii) Ripetere un numero n di volte la fase ii) fino a portare dette prime particelle in sospensione in un fluido finale (Li+n), in modo da contattare con dette prime particelle una pluralità di fluidi di processo diversi, almeno alcuni dei quali sono capaci di interagire con dette prime particelle in uno dei modi scelti nel gruppo consistente in: ricopertura, accrescimento, imbibizione.
Apparato per il processamento complesso di particelle Nel caso di protocolli multi-step, che richiedono una sequenza di passi di processamento delle cellule risulta di particolare utilità la realizzazione di un apparato di manipolazione come illustrato schematicamente in Fig. 4, basato su tre microcamere CH1,CH2,CH3 disposte in sequenza e realizzate come descritto in precedenza per le microcamere CH1,CH2 di Figg. 1-3, in cui la microcamera centrale CH2 è idraulicamente connessa con le altre due attraverso due orifizi Gl,2 e G2,3 di comunicazione idraulica nella direzione della sequenza delle microcamere, i quali sono disposti non solo su lati opposti (nel senso della sequenza delle microcamere) della microcamera CH2, ma sono anche disposti tra loro sfalsati in senso trasversale, ovvero in una direzione perpendicolare alla direzione di disposizione in sequenza delle microcamere, trovandosi predisposti in prossimità l'uno dell'orifizio di ingresso 12 della microcamera CH2 e l'altro dell'orifizio di uscita 02 della microcamera CH2.
La microcamera di mezzo (CH2) serve per lavare le cellule tra il buffer contenuto nella microcamera di partenza (CHI) e la microcamera dei reagenti (CH3).
Il primo vantaggio di questo dispositivo è che la distanza tra gli orifizi di comunicazione idraulica costituenti le due porte (Gl,2) tra prima e seconda microcamera e (G2,3) tra seconda e terza microcamera, incrementa il tempo necessario alla diffusione per contaminare il primo liquido di partenza con il reagente nella terza microcamera (CH3). Inoltre, se dopo il passaggio delle cellule viene flussato costantemente del buffer di lavaggio nella seconda microcamera (CH2), si evita qualsiasi contaminazione tra reagente presente nella terza microcamera e buffer iniziale.
Preferibilmente, durante il flussaggio, gli ingressi e uscite (11,13 ed 01,03) delle altre microcamere sono tenuti chiusi, così da mantenere il flusso confinato nella seconda microcamera.
L'introduzione dei liquidi avviene preferibilmente nell 'ordine:
CHI, CH3, CH2. In questo modo, finché i menischi dei liquidi LI e L3 (ovvero quelli contenuti rispettivamente nelle m microcamere CHI e CH3) rimangono affacciati alla microcamera CH2, ma non si toccano, non si ha contaminazione tra i due dovuta alla diffusione.
Reazioni multi step arbitrariamente lunghe possono essere portate a termine anche con questo apparato rimpiazzando completamente il buffer nella prima microcamera (CHI) mentre le cellule sono nella terza (CH3) e viceversa. I reagenti vengono in questo modo "multiplexati" nello spazio.
In alternativa si può realizzare un dispositivo nel quale tutti i reagenti sono iniettati nella fase iniziale e sono già presenti all'inizio della manipolazione delle particelle. Questo apparato è mostrato in Fig. 5.
Esso comprende una prima ed una seconda microcamera terminale (CHl,CHn) ed una pluralità di microcamere intermedie (CH2,...CHn-1) disposte tra loro in sequenza tra le microcamere terminali e ciascuna delle quali è idraulicamente connessa con la microcamera immediatamente precedente ed immediatamente seguente nella direzione della sequenza delle microcamere tramite un rispettivo primo e secondo orifizio (Gl,2; Gn-1,n) di comunicazione idraulica nella direzione della sequenza delle microcamere, tra loro sfalsati in senso trasversale alla direzione di sequenza delle microcamere .
Generalizzando quanto detto in precedenza, l'apparato di Fig. 5 viene preferibilmente riempito in primo luogo riempiendo le microcamere di indice pari ed in un secondo momento le microcamere di indice dispari, così da evitare contatti e contaminazioni finché i liquidi non entrano a contatto.

Claims (19)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per effettuare il lavaggio di particelle presenti in sospensione in un primo fluido mediante un secondo fluido, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: o Introdurre in regime di flusso laminare, dette particelle in sospensione in detto primo fluido all'interno di una prima regione di almeno una microcamera di un apparato per la manipolazione delle particelle; o Introdurre in regime di flusso laminare almeno detto un secondo fluido in almeno una seconda regione di detta almeno una microcamera, in modo da non miscelare detto almeno un secondo fluido con detto almeno un primo fluido; o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento delle sole particelle verso detta almeno una seconda regione della detta almeno una microcamera contenente detto almeno un secondo fluido, in modo da sospendere dette particelle in detto secondo fluido.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di o Recuperare selettivamente detto secondo fluido e dette particelle estraendo da detta almeno una microcamera detto secondo fluido recante dette particelle in sospensione.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che vengono utilizzate una prima ed un a seconda microcamera collegate tra loro da una restrizione o orifizio di comunicazione idraulica tra le microcamere, detto primo fluido venendo introdotto nella prima microcamera e detto secondo fluido venendo introdotto nella seconda microcamera.
  4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che viene utilizzata una singola microcamera, detto secondo fluido venendo introdotto per primo nella microcamera in modo da portarlo ad occupare la detta seconda regione della microcamera solo sotto la spinta del primo fluido che viene introdotto successivamente in detta prima regione della microcamera.
  5. 5. Metodo per effettuare l'incubazione di particelle presenti in sospensione in un primo fluido contattando dette particelle con un secondo fluido, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: o Introdurre in regime di flusso laminare, dette particelle in sospensione in detto primo fluido all'interno di una prima regione di almeno una microcamera di un apparato per la manipolazione delle particelle; o Introdurre in regime di flusso laminare almeno detto un secondo fluido in almeno una seconda regione di detta almeno una microcamera, in modo da non miscelare detto almeno un secondo fluido con detto almeno un primo fluido; o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento delle sole particelle in un verso prefissato entro detta almeno una seconda regione della detta almeno una microcamera contenente detto almeno un secondo fluido, in modo da sospendere dette particelle in detto secondo fluido; o Attivare nella detta almeno una microcamera almeno un campo di forza (F) agente su dette particelle, per provocare uno spostamento in verso opposto al precedente delle sole particelle tale da riportarle all'interno di detta almeno una prima regione della detta almeno una microcamera.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di o Sostituire detto primo fluido in detta almeno prima regione di detta almeno una microcamera con almeno un terzo fluido, prima di riportare dette particelle in detta almeno una prima regione di detta almeno una microcamera.
  7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di o Recuperare selettivamente dette particelle estraendo da detta almeno una microcamera il fluido nel quale le particelle si trovano in sospensione.
  8. 8. Metodo secondo una della rivendicazioni da 5 a 7, caratterizzato dal fatto che vengono utilizzate una prima ed un a seconda microcamera collegate tra loro da una restrizione o orifizio di comunicazione idraulica tra le microcamere, detto primo fluido venendo introdotto nella prima microcamera e detto secondo fluido venendo introdotto nella seconda microcamera.
  9. 9. Metodo per la esecuzione di protocolli sperimentali complessi su particelle mantenute in sospensione in un fluido, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: i) Sospendere dette particelle in un primo fluido di processo (Li) confinato in una prima regione di spazio; ii) Spostare selettivamente dette particelle in un secondo fluido di processo (Li+1) confinato in una seconda regione di spazio mantenendo il primo fluido ed il secondo fluido in condizioni stazionarie, mediante applicazione a dette particelle di una forza F ottenuta attivando un campo forza agente esclusivamente su dette particelle; iii) Ripetere un numero n di volte la fase ii) fino a portare dette particelle in sospensione in un fluido finale (Li+n), in modo da contattare con dette particelle una pluralità di fluidi di processo diversi, almeno alcuni dei quali sono capaci di interagire con dette particelle;
  10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 9 caratterizzato dal fatto di comprendere inoltre la fase di iv) Analizzare dette particelle con sensori dislocati in una regione dello spazio contenente in modo confinato detto fluido finale.
  11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che dette fasi ii) e iii) vengono eseguite in modo da esporre un numero N di particelle ad almeno un reagente prefissato per T1, ...TN tempi diversi;. detta fase iv) prevedendo lo studio dinamico, in funzione del tempo, di caratteristiche variabili di dette particelle, quali per esempio l'assorbimento di reagente o la variazione di proprietà delle particelle legate all'assorbimento di reagente.
  12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, caratterizzato dal fatto che dette fasi ii) e iii) vengono eseguite in modo da esporre un numero prefissato di particelle, singolarmente od in gruppo, ad almeno un reagente prefissato capace di interagire con sostanze eventualmente secrete da dette particelle; detta fase iv) prevedendo l'individuazione di detta interazione tramite detti sensori.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di incapsulare almeno alcune dette particelle in sostanze porose/gelatinose capaci di trattenere dette sostanze eventualmente secrete da dette particelle o almeno da rallentarne la diffusione nel fluido in cui dette particelle sono sospese in misura tale da impedire la sovrapposizione di segnali generati da detti sensori in risposta alla presenza di differenti particelle.
  14. 14. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 10 a 13, caratterizzato dal fatto di prevedere la fase di selezionare, in risposta ad un segnale rilevato da detti sensori, le particelle cui è correlata la generazione di detto segnale; detta fase di selezione venendo effettuata applicando solo alle particelle correlate alla generazione di detto segnale detta forza F generata da detto campo di forze per trasportare le medesime in una regione di spazio confinata definita.
  15. 15. Metodo per realizzare particelle aventi una struttura prefissata complessa a partire da prime particelle a struttura semplice, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: i) Sospendere dette prime particelle in un primo fluido di processo (Li) confinato in una prima regione di spazio; ii) Spostare selettivamente dette particelle a struttura semplice in un secondo fluido di processo (Li+1) confinato in una seconda regione di spazio mantenendo il primo fluido ed il secondo fluido in condizioni stazionarie, mediante applicazione a dette prime particelle di una forza F ottenuta attivando un campo forza agente esclusivamente su dette prime particelle; iii) Ripetere un numero n di volte la fase ii) fino a portare dette prime particelle in sospensione in un fluido finale (Li+n), in modo da contattare con dette prime particelle una pluralità di fluidi di processo diversi, almeno alcuni dei quali sono capaci di interagire con dette prime particelle in uno dei modi scelti nel gruppo consistente in: ricopertura, accrescimento, imbibizione.
  16. 16. Apparato per effettuare un processamento di tipo complesso di particelle, del tipo comprendente microcamere, ciascuna delle quali è delimitata da un piano o pavimento costituito da un chip, collegate idraulicamente tra loro da almeno una restrizione o orifizio e ciascuna delle quali include un orifizio di ingresso (11,12), ed un orifizio di uscita (01,02) disposti ad estremità opposte di ciascuna microcamera secondo una direzione perpendicolare a quella di collegamento idraulico tra le microcamere; caratterizzato dal fatto di comprendere una prima ed una seconda microcamera terminale (CH1,CH3) ed almeno una microcamera intermedia (CH2) disposte tra loro in sequenza, in cui detta almeno una microcamera intermedia (CH2) è connessa con le dette microcamere terminali attraverso un primo ed un secondo orifizio (Gl,2; G2,3) di comunicazione idraulica nella direzione della sequenza delle microcamere, e tra loro sfalsati in senso trasversale, in una direzione perpendicolare alla direzione di disposizione in sequenza delle microcamere, trovandosi predisposti in prossimità l'uno dell'orifizio di ingresso (12) e l'altro dell'orifizio di uscita (02) di detta almeno una microcamera intermedia (CH2).
  17. 17. Apparato secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto di comprendere una pluralità (CH2,...CHn-1) di microcamere intermedie disposte in sequenza tra dette prima e seconda microcamera terminale (CHl,CHn), ciascuna detta microcamera intermedia essendo idraulicamente connessa con la microcamera immediatamente precedente ed immediatamente seguente nella direzione della sequenza delle microcamere tramite un rispettivo primo e secondo orifizio (Gl,2; Gn-l,n) di comunicazione idraulica nella direzione della sequenza delle microcamere, tra loro sfalsati in senso trasversale alla direzione di sequenza delle microcamere.
  18. 18. Apparato secondo la rivendicazione 16 o 17, caratterizzato dal fatto che detto piano o pavimento di detto chip comprende una schiera di elettrodi selettivamente energizzabili , in grado di generare detta forza (F).
  19. 19. Apparato secondo una delle rivendicazioni da 16 a 18, caratterizzato dal fatto che detto piano o pavimento di detto chip comprende una schiera di sensori integrati.
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