CN109804089A - 用于评估复制型病毒存在或不存在的方法 - Google Patents

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CN109804089A CN201780058382.5A CN201780058382A CN109804089A CN 109804089 A CN109804089 A CN 109804089A CN 201780058382 A CN201780058382 A CN 201780058382A CN 109804089 A CN109804089 A CN 109804089A
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明提供了检测含有用编码重组和/或异源分子(例如异源基因产物)的病毒载体颗粒转导的细胞的样品中的复制型逆转录病毒的方法。所述方法可包括评估在逆转录病毒中表达但在病毒载体颗粒中不表达的一个或多个靶基因(比如病毒基因)的转录。如果一个或多个靶基因的RNA水平高于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在，所述参考值可以例如从含有来自对应靶基因的RNA的阳性对照样品直接或间接测得，所述靶基因处于已知水平或等于或高于测定法的检测限。

Description

用于评估复制型病毒存在或不存在的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年7月29日提交的名称为“用于评估复制型病毒存在或不存在的方法”的美国临时申请No.62/369,024和2017年1月20日提交的名称为“用于评估复制型病毒存在或不存在的方法”的美国临时申请No.62/448,954的优先权，将其内容通过提述完整并入。
通过提述并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。提供的序列表为2017年7月28日创建的名为735042005640SeqList.TXT的文件，其大小为40,464字节。将序列表电子格式信息通过提述完整并入。
技术领域
本公开涉及检测复制型逆转录病毒或证实其不存在的方法。所述方法可包括评估一个或多个靶基因的RNA水平，所述靶基因比如病毒基因，例如结构或包装基因，其基因产物在用复制型逆转录病毒比如γ-逆转录病毒或慢病毒感染的某些细胞中表达，但在用于用异源核酸转导细胞的病毒载体中不存在，并且预期在不含复制型逆转录病毒的细胞中不存在和/或不表达。如果一个或多个靶基因的RNA水平高于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在，所述参考值可以例如从含有所述靶基因的阳性对照样品直接或间接测得。
背景
逆转录病毒载体颗粒比如γ-逆转录病毒和慢病毒载体颗粒用于各种临床应用，包括将治疗基因引入细胞和/或受试者中。这样的病毒载体颗粒被工程改造为复制缺陷型，然而，在许多情况下，可能期望或甚至必须验证样品或组合物中不存在复制型病毒(例如，复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL))，所述组合物比如配制为用于给药的治疗组合物或药物组合物。例如，在某些应用中，使用所述方法来验证或证实在生成或加工步骤期间没有例如通过转移载体、包装组分和/或内源性病毒元件之间在用于产生病毒载体颗粒的细胞中的同源或非同源重组而产生RCR。有多种方法可用于这种证实和验证，比如在例如在生成和加工期间或之后，在配制的治疗组合物和/或用于施用的药物产品(比如工程化细胞)中、和/或在来自受试者的样品中验证复制型病毒的不存在，所述受试者例如那些已经接受含有用病毒载体颗粒转导的细胞的疗法的受试者。然而，现有方法可能过于耗时和/或具有假阳性结果的风险。需要改进的方法来检测RCR。
概述
本文中提供的方法包括：a)确定测试样品中参数的水平，其中所述参数或水平指示生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或与其相关联(任选地正或反相关)，所述生物样品包含至少一个含有异源核酸和/或编码异源蛋白质的核酸的细胞，其中：生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度指示生物样品(或所述生物样品所来源的样品)中复制型病毒的存在或不存在或风险；并且/或者病毒RNA是复制型病毒的复制能力所需的，或编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或其风险。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：b)将在(a)中确定的参数的水平与所述参数的第一参考值比较。在一些实施方案中，所述比较指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括确定生物样品或其部分中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险；和/或确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有存在的风险。
在一些实施方案中，当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平等于或高于第一参考值时，生物样品被认为具有、可能具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平等于或低于第一参考值时，生物样品被认为具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关；和/或当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平低于第一参考值时，生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为是RCR阴性的，或被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或不可能含有复制型病毒的存在，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平高于第一参考值时，生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或没有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关。
在一些实施方案中，即使确定生物样品中存在另一种复制能力所需的病毒RNA，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险；即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的第二测试样品中检测到或已检测到等于或高于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与所述生物样品中另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈正相关；和/或即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的另一个测试样品中检测到或已检测到等于或低于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈负相关。
在一些实施方案中，当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为具有或可能具有复制型病毒的存在或具有其风险；当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为可能具有复制型病毒的存在或具有其风险，但在没有进一步的风险指征和/或没有评估指示另一种病毒RNA的另一个参数的情况下不认为含有复制型病毒的存在；和/或如果确定生物样品中不存在病毒RNA和/或如果确定生物样品中任选地等于或低于阈值量的病毒RNA的量(或不超过该量)，任选地即使确定在生物样品中存在病毒复制能力所需的另一种RNA，所述生物样品也被认为没有或可能没有复制型病毒的存在、和/或没有其风险；和/或如果测试样品中的所述参数和/或病毒RNA不可检出或未检测到和/或确定不存在于生物样品中，则所述生物样品被认为是复制型病毒阴性的。
在一些实施方案中，第一参考值是等于或大约等于或稍高于阈值水平或最小可检测水平或与其对应的读出的值；第一参考值是在阳性对照样品中检测到的参数的值、和/或指示RNA量的参数的值；和/或所述参数的水平指示生物样品中病毒RNA的存在或不存在；和/或所述病毒RNA包括编码第一病毒基因的核酸；和/或所述异源核酸编码异源基因产物。
在一些实施方案中，在测试样品中评估的参数是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。在一些实施方案中，所述量是绝对量或相对量。在一些实施方案中，所述参数和/或水平是或包括替代或相对值，其任选地是循环阈(Ct)值。
在一些实施方案中，如果测试样品的CT值低于第一参考值(为参考Ct评分)，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。在一些实施方案中，其中测试样品是或衍生自生物样品或其部分。
本文中还提供了多种方法，其包括a)确定或评估测试样品中第一参数的第一水平，其中所述第一水平或第一参数与生物样品中第一病毒RNA和/或编码第一病毒基因(编码所述第一病毒RNA)的第一核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；b)确定或评估测试样品中第二参数的第二水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中所述第二水平或第二参数与生物样品中不同于所述第一病毒RNA的第二病毒RNA和/或编码第二和不同的病毒基因(编码所述第二病毒RNA)的第二核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；其中：生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中第一和/或第二病毒RNA或基因产物的存在、不存在、浓度或量或其风险。在一些实施方案中，所述法进一步包括c)将在(a)和/或(b)中确定的第一和/或第二参数的水平与第一和/或第二参考值比较，其中所述比较任选地指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括c)确定生物样品或其部分中第一病毒RNA或表达的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险，并且/或者确定生物样品或其部分中第二病毒RNA或表达的存在、不存在、或量或浓度或任何前述项的风险；和/或d)任选地基于c)中的确定，确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有复制型病毒存在于其中的风险。
在一些实施方案中，病毒RNA来自和/或第一病毒RNA来自和/或第一病毒基因是env、gag、pol或rev；和/或病毒RNA来自和/或第二病毒RNA来自和/或第二病毒基因是env、gag、pol或rev。
本文中还提供了多种方法，其包括a)评估测试样品中第一参数的水平，其指示生物样品中第一病毒RNA的量或存在或不存在或与之相关联(任选地正或反相关)，其中所述第一病毒RNA来自第一病毒基因(为env基因)，并且评估测试样品中第二参数的水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中第二病毒参数指示生物样品中第二病毒RNA的存在、不存在或量或与之相关联(任选地正或反相关)，其中第二病毒RNA来自选自gag、pol和rev基因的基因，其中所述生物样品包括用任选地包括异源基因产物的病毒载体颗粒转导的细胞和/或包括具有异源基因产物的细胞；其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；其中：生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
在一些实施方案中，参数是病毒RNA的存在或不存在。在一些实施方案中，所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是或对应于阈值水平或最小可检测水平。在一些实施方案中，所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是对应于或针对阳性对照测试样品中的参数的值，所述阳性对照测试样品任选地含有已知量或浓度的病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一病毒RNA。
在一些实施方案中，如果所述方法确定生物样品中第一和第二病毒RNA的存在或高于其阈值量的量，并且任选地不是如果所述方法确定第一和第二RNA中的一者但不是两者的存在或高于其阈值量的量，则所述生物样品被认为含有或有风险含有或可能含有复制型病毒；和/或如果所述方法确定生物样品中第一病毒RNA、或第二病毒RNA、和/或第一和第二病毒RNA两者的不存在、或其可检测量的不存在、或低于其阈值量的量，则所述生物样品被认为是阴性的或不含或没有风险含有或不可能含有复制型病毒。
在一些实施方案中，如果在测试样品中编码第一和第二病毒基因的病毒RNA的水平不可检出和/或未确定其在生物样品中存在或以高于阈值水平存在，则认为所述生物样品是复制型病毒阴性的。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤a)之前从生物样品或来自它的部分或衍生自所述生物样品的样品或其部分中分离RNA的步骤，其中RNA包括来自至少一个细胞中的一个或多个的RNA。
在一些实施方案中，复制型病毒是或包括逆转录病毒，并且/或者其中病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA由逆转录病毒表达。在一些实施方案中，逆转录病毒是γ-逆转录病毒。在其他实施方案中，逆转录病毒是慢病毒。
在一些实施方案中，生物样品来自人或哺乳动物，并且/或者一个或多个细胞是原代细胞，其任选地是人或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，一个或多个细胞和/或生物样品来自主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)或细胞系或其样品。在一些实施方案中，所述至少一个细胞或生物样品是或来自用于自体细胞疗法的冷冻保存的材料(CMAT)、冷冻保存的药物产品(CDP)、或配制药物产品(FDP)或其样品。在一些实施方案中，所述至少一个细胞或生物样品是或在来自转导后经历扩增(比如离体扩增)的细胞。
在一些实施方案中，异源核酸或异源基因产物是或编码重组受体、嵌合受体、任选地嵌合抗原受体或转基因T细胞受体。
在一些实施方案中，使用对病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物进行确定或评估。在一些实施方案中，使用对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估编码第二病毒基因的病毒RNA的水平。在一些实施方案中，通过实时聚合酶链反应(PCR)评估病毒RNA的水平。在一些实施方案中，确定或评估包括进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)。
在一些实施方案中，病毒RNA和/或第一和/或第二病毒RNA和/或病毒RNA和/或基因来自逆转录病毒。在一些实施方案中，病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码任何前述项的基因)是参与病毒体复制和/或包装的基因或由其编码。在一些实施方案中，病毒RNA和/或第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码前述一项或多项的基因)不是由已经用于转导所述转导的细胞的转移载体编码的基因。在一些实施方案中，病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA编码病毒表面蛋白、包膜蛋白、组特异性抗原、病毒衍生的聚合酶、病毒衍生的逆转录酶、病毒衍生的调控元件、转录的反式激活因子或反应元件。
在一些实施方案中，gag基因选自下组，该组的组成为：鼠白血病病毒(MMLV)gag和人类免疫缺陷病毒(HIV)gag。在一些实施方案中，env基因选自GaLV env和VSVG。在一些实施方案中，对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。在一些实施方案中，对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。在一些实施方案中，对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。在一些实施方案中，对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。
在一些实施方案中，评估或确定包括使用对病毒RNA、病毒基因、第一病毒RNA或第一病毒基因、或第二病毒RNA或第二病毒基因的序列特异的水解探针。在一些实施方案中，对第一病毒基因的序列特异的水解探针包括在SEQ ID NO:6中列出的序列。在一些实施方案中，对第一病毒基因的序列特异的水解探针包括在SEQ ID NO:18、21或24中列出的序列。
在一些实施方案中，评估、确定或检测包括使用对病毒RNA、第二病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒基因中的一者或多者的序列特异的水解探针。在一些实施方案中，水解探针包括在SEQ ID NO:6中列出的序列。在一些实施方案中，对第一病毒基因的序列特异的水解探针包括在SEQ ID NO:18、21或24中列出的序列。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括评估测试样品中指示或关联编码测试样品或生物样品中的对照基因的RNA的水平或参数水平，任选地其中所述对照基因是或包括β-肌动蛋白和/或任选地其中使用对照基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估参数水平或对照基因，所述寡核苷酸引物各自任选地包括在SEQ ID NO:1或2或8-15之一中列出的一个或多个序列，任选地其中使用对照基因序列特异的水解探针评估所述水平，所述水解探针任选地包括在SEQ ID NO:3、9、12或15中列出的序列。
在一些实施方案中，所述评估或确定包括进行多重反应，其中在多重反应中评估任选地所述水平、第一水平和/或第二水平；以及任选地，指示对照基因或与其相关联的水平或参数。
在一些实施方案中，所述参数、第一参数和/或第二参数各自是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA(或第一或第二病毒RNA)的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。
在一些实施方案中，所述量是绝对量或相对量。在一些实施方案中，所述参数和/或水平是或包括循环阈(Ct)值。在一些实施方案中，如果测试样品的CT值低于第一参考值(为参考Ct评分)，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。
在一些实施方案中，生物样品和/或一个或多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述至少一个细胞包括多个细胞，并且其中：所述多个细胞和/或所述生物样品包括悬浮细胞；所述多个细胞和/或所述生物样品包括白细胞；和/或所述多个细胞和/或所述生物样品包括T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，第一测试样品和第二测试样品中的一者或两者各自衍生自生物样品或其部分或含有衍生自生物样品或其部分的RNA。在一些实施方案中，针对第一病毒RNA评估的测试样品和针对第二RNA评估的测试样品是相同的或者为同一个样品或组合物的部分。在一些实施方案中，所述多个细胞包括未分级分离的T细胞、分离的CD8+T细胞或分离的CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述至少一个细胞是人类细胞。在一些实施方案中，测试样品是生物样品或其一部分。
在一些实施方案中，设定验收标准以评估实时PCR的有效性。在一些实施方案中，验收标准包括在或在约90％和110％之间的效率百分比。在一些实施方案中，验收标准包括约为或大于或大于约0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的R2值。在一些实施方案中，所述方法进一步包括评估RNA的纯度、完整性和/或浓度。
还提供了包含寡核苷酸的引物，所述寡核苷酸包括SEQ ID NO:1-24的任一个中列出的序列。在一些实施方案中，引物包括荧光模块或标记物。
还提供了相应地包含一个或多个引物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括无核酸酶的水、逆转录酶、聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂和DNA酶中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述方法能够检测测试样品中的病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA，其中样品中为至少5个或至少10个或至少20个或至少50个或至少100个细胞，或为测试样品或生物样品中的1000万分率的细胞；和/或其中所述方法能够检测测试样品和/或生物样品中不超过或不超过约1.5pg、1pg或0.75pg或更少的病毒靶标的靶RNA的量。
详细说明
本文中提供了用于检测样品或组合物(比如含有转导细胞的治疗细胞组合物)中来自复制型逆转录病毒的病毒RNA的存在、不存在、量和/或浓度的方法和组合物。在具体的实施方案中，所述方法包括一个或多个测量或确定参数的水平或量的步骤，所述参数指示病毒RNA的存在、不存在、量和/或浓度或与之相关。在一些实施方案中，生物样品中病毒RNA的存在、不存在、量和/或浓度指示复制型逆转录病毒的存在或不存、或与其存在或不存在相关的风险。在一些实施方案中，病毒RNA是复制型病毒的复制能力所需的，或编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
包括逆转录病毒生产过程在内的病毒生产过程包括病毒包装元件的使用。对于某些示例性的基于γ-逆转录病毒的病毒，莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)gag和pol以及长臂猿白血病病毒包膜(GaLV env)的组合都在具有最小同源序列和异源启动子和增强子的单独质粒上编码，这降低了重组风险。在一些方面，使用用于病毒生产的人亲本细胞系，通过消除内源、同源逆转录病毒序列的存在进一步降低了重组风险。然而，通常在病毒制造过程中的多个点采用RCR测试，以确保不存在RCR。
目前用于检测RCR的测定法有两大类。第一类是基于PCR的快速测定法，其靶向对病毒载体特异的基因(例如，GaLV env)的DNA。第二类是基于细胞的共培养测定法，其中细胞或收获上清液首先与允许细胞系共培养几周，以允许扩增任何现有的复制病毒，随后与指示细胞系一起温育，以检测存在的任何活性病毒。尽管基于细胞的RCR共培养被广泛使用，但是该测定法是冗长且昂贵的，并且在一些情况下，可能直到施用产品的期望时间已经过去之后才可得到RCR共培养测定法的结果。相反，虽然目前基于PCR的测试更快，但这种技术容易出现假阳性。
在一些实施方案中，所提供的组合物和方法提供了能够以高灵敏度检测污染性RCR的快速且准确的测定法。例如，在一些实施方案中，本文中提供的组合物和方法快速且准确地测量样品的参数，所述样品例如可用于指示来自RCR的病毒RNA的存在或量的测试样品和/或生物样品。所提供的组合物和方法能够快速测量这样的参数而无需预先在细胞培养中扩增。此外，所提供的组合物和方法提供了比现有的基于DNA的PCR方法更高的灵敏度。
病毒载体，如包括慢病毒和γ-逆转录病毒载体在内的逆转录病毒载体，目前用于治疗开发以解决广泛的未满足的医学需求。生成了用作基因递送系统的复制缺陷型逆转录病毒，其允许感兴趣的基因的受控递送。这样的病毒载体可用于比如在基因疗法中直接递送基因，或用于将基因递送到细胞中以产生细胞疗法，例如CAR-T细胞疗法。然而，在极少数情况下，假设由于事件如位点特异性重组，在基因递送过程中可能出现复制型病毒。虽然这样的事件被认为是非常罕见和/或不大可能的，但对于例如治疗(如基因疗法或CAR-T细胞疗法)开发用于检测样品中复制型病毒的存在和/或风险的测试或其他安全防护是有利的，以便证实样品中不存在复制型病毒。
本文中提供的方法和组合物可用于灵敏且准确地检测可能在用于基因递送的病毒载体的生产过程中产生的潜在复制型病毒。在一些实施方案中，本文中提供的方法用于确定是否已经存在复制型病毒污染、起源、发生，或已经从用于转导的质粒和病毒载体无意中产生了复制型病毒。在某些实施方案中，定制和/或利用本发明的方法来测试可能已经或将会从用于基因递送的相同病毒载体衍生的复制型病毒。因此，在一些实施方案中，本文中提供的方法用于检测已用于转导和/或基因递送的病毒的复制型。在具体的实施方案中，本文中提供的方法尤其可用于检测存在于病毒的复制版本和/或其所需的病毒基因。在一些实施方案中，病毒基因存在于用于生产复制缺陷型病毒的质粒中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括测量或检测与病毒RNA(与病毒DNA相反)相关的一个或多个参数的一个或多个步骤。具体实施方案预期的是，与病毒RNA的水平或量相关或关联的参数的检测将减少或防止假阳性的情况。例如，不受理论的束缚，假阳性可能在基于DNA的PCR技术中发生，这是由于残留的病毒生产者(producer)系DNA仍然存在于用于转导的病毒载体原种中。在一些方面，与病毒RNA相关和/或关联的参数的检测使残留DNA降到最低或防止其检出，从而最小化或防止假阳性。
在一些方面，所提供的方法包括测量或检测与编码特定基因的病毒RNA的水平或量相关的参数的一个或多个步骤。在某些实施方案中，通过测量这些参数评估或检测的特定基因与正常内源人RNA序列几乎没有相似性，因此允许灵敏和/或准确地检测病毒基因。例如，在一些实施方案中，病毒基因来自长臂猿白血病病毒(GaLV)。
在一些实施方案中，本文中提供的方法可用于指示样品中RCR和/或病毒RNA的存在，其具有与替代方法至少相同或更高的灵敏度。在一些实施方案中，当RCR或RNA低于其他方法的检测阈值和/或在过程中的较早时间点可检测时，所提供的方法可以指示RCR和/或RCR的病毒RNA的存在或量。例如，在一些实施方案中，本文中提供的方法可用于检测样品中一定量或水平的RCR或其病毒RNA，所述量或水平低于基于DNA的PCR测定法的检测阈值水平。在某些实施方案中，本文中提供的方法可用于检测样品中一定量或水平的RCR或其病毒RNA，与基于细胞培养的RCR测定方案相比，可以在较早的时间评估所述量或水平。例如，在某些实施方案中，本文中提供的方法可用于检测样品中的RCR和/或病毒RNA，其测定无需在样品收集和RCR评估之间通过与允许细胞系共培养进行传代、扩增或扩大。
除非另外定义，本文中使用的所有术语、符号和其他技术和科学术语或用辞预期具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中描述了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些描述不应被解释为表示与本领域通常所理解的实质性差异。
出于所有目的将本申请中提及的所有出版物，包括专利文献、科学论文和数据库在内，通过提述完整并入本文，其程度如同每一单独的出版物通过提述单独并入一样。如果本文中阐述的定义与通过提述并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或以别的方式不一致，则本文中阐述的定义优先于通过提述并入本文的定义。
在本文中使用的章节标题仅仅是出于组织的目的，而不应当解释为限制所描述的主题。
复制型病毒的检测
本文中提供了检测样品中复制型病毒的存在、不存在或水平的方法。在一些实施方案中，本文中提供的方法包括测量、确定、评估和/或量化参数的值、量或水平。在一些实施方案中，参数的量、值和/或水平指示病毒RNA的存在、不存在和/或量或浓度或与之关联。在具体的实施方案中，生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度指示复制型病毒的存在或不存在或其风险。在某些实施方案中，病毒RNA是复制型病毒的复制能力所需的，或编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
在一些方面，所提供的方法涉及测量或评估参数以确定复制型逆转录病毒是否存在于样品中，所述样品含有或衍生自用病毒载体颗粒转导的一个或多个细胞。因此，在一些情况下，病毒载体颗粒已经用于或可用于转导细胞，随后通过所提供的方法评估所述细胞以确保用于转导的病毒未以能复制的形式存在。
在一些实施方案中，在样品中测量参数。在具体的实施方案中，样品是测试样品和/或生物样品。在某些实施方案中，测试样品是生物样品。在一些实施方案中，测试样品衍生自生物样品。在具体的实施方案中，测试样品是生物样品的一部分。在一些实施方案中，测试样品源自、衍生自和/或取自生物样品和/或与生物样品的来源相同。在具体的实施方案中，测试样品中一个或多个参数的量、水平、浓度和/或值反映生物样品中一个或多个参数的量、水平、浓度和/或值、与之关联和/或相关。在一些实施方案中，测试样品中一个或多个参数的量、水平、浓度和/或值反映生物样品中病毒RNA的存在、不存在、量、水平、浓度和/或值、与之关联和/或相关。在具体的实施方案中，测试样品中一个或多个参数的量、水平、浓度和/或值反映生物样品中的病毒例如复制型逆转录病毒的存在、不存在、量、水平和/或浓度、与之关联和/或相关。在具体的实施方案中，测试样品中一个或多个参数的量、水平、浓度和/或值反映生物样品中的病毒RNA和/或病毒例如复制型逆转录病毒存在的风险、与之关联和/或相关。
在一些实施方案中，所述方法包括评估、测量和/或检测样品的一个或多个参数，所述参数指示一个或多个靶基因(例如病毒基因)的量、水平和/或表达和/或与之关联。在具体的实施方案中，所述一个或多个参数指示复制型病毒(比如复制型逆转录病毒)的存在、不存在、量和/或水平和/或与之关联。在一些实施方案中，将一个或多个靶基因用作检测潜在复制型病毒的标志物。
在某些实施方案中，本文中提供的方法包括将参数的测量、评估、检测和/或定量与相应的参考值进行比较的一个或多个步骤。在一些实施方案中，参考值是已知的参数值。在一些实施方案中，参数与病毒RNA、编码靶基因的病毒RNA和/或复制型病毒的量、水平和/或浓度呈正相关，并且如果参数值高于参考值，则检测到复制型病毒的存在。在具体的方面，参数与病毒RNA、编码靶基因的病毒RNA和/或复制型病毒的量、水平和/或浓度呈正相关或反相关，并且如果参数值低于参考值，则认为不存在复制型病毒。
在具体的实施方案中，参数的值或测量指示靶基因(例如，病毒基因、病毒RNA和/或病毒RNA基因)的存在或不存在、和/或与之关联和/或相关。在某些实施方案中，参数的值或测量与靶基因的存在或不存在(例如，负或正)关联。在具体的实施方案中，参数的值或测量与靶基因的水平或量(例如，负或正)关联。
在一些实施方案中，参数是基因和/或基因表达产物。因此，在一些实施方案中，测量、评估、检测和/或量化参数是或包括测量、评估、检测和/或量化基因或基因表达产物的水平或量。在具体的实施方案中，基因是病毒基因。在一些实施方案中，参数是从病毒RNA(例如编码一个或多个基因的病毒RNA)产生和/或衍生的cDNA。在具体的实施方案中，基因是靶基因。在某些实施方案中，参数是蛋白质，并且测量、评估、检测和/或量化参数是或包括测量、评估、检测和/或量化蛋白质的水平或量。在一些实施方案中，蛋白质是病毒蛋白。在某些实施方案中，蛋白质由病毒基因例如病毒RNA基因编码。在一些实施方案中，蛋白质由靶基因编码。在某些实施方案中，当存在靶基因时，参数是存在和/或表达的蛋白质或多核苷酸。在一些实施方案中，参数是由于靶基因的存在而存在、表达、修饰、增加或减少的蛋白质和/或多核苷酸。例如，在一些实施方案中，参数是响应于靶基因的存在或刺激而由细胞表达的蛋白质。
在一些实施方案中，测量、评估、检测和/或量化病毒RNA的存在、不存在、水平、浓度和/或量，以确定病毒的存在、不存在、水平、浓度和/或量。在一些实施方案中，病毒是例如在样品中的复制型病毒。在某些实施方案中，通过测量、评估、检测和/或量化一个或多个参数(例如，测试样品的一个或多个参数)来测量、评估、检测和/或量化病毒RNA的存在、不存在、水平、浓度和/或量。在一些实施方案中，根据病毒RNA的水平、量和/或浓度确定生物样品中复制型病毒的存在或不存在。
在一些方面，所述方法包括将样品中的靶基因的核酸水平与相应的参考值比较，所述参考值为比如已知的靶基因的核酸水平和/或处于用于评估基因核酸水平的测定法的检测限的靶基因的核酸水平。在一些实施方案中，如果靶基因的核酸水平高于该靶基因的参考值，则检测到测试样品中复制型病毒的存在。在一些方面，如果靶基因的核酸水平低于参考值，则认为测试样品中不存在复制型病毒。
在一些实施方案中，病毒核酸不包含DNA或不是DNA。在一些实施方案中，病毒核酸是或包含RNA。在一些实施方案中，RNA是病毒RNA。在一些实施方案中，所述方法包括将RNA逆转录成DNA用于扩增和/或检测。
在一些实施方案中，复制型病毒是复制型逆转录病毒(RCR)。在一些实施方案中，复制型逆转录病毒是复制型γ-逆转录病毒。在一些实施方案中，复制型病毒是复制型慢病毒(RCL)。
在一些实施方案中，病毒RNA的水平指示特定病毒序列或病毒基因的表达水平。在一些实施方案中，表达包括RNA的产生。在一些实施方案中，表达不一定包括特定序列或基因到蛋白质的翻译。在一些实施方案中，病毒RNA的水平指示特定病毒序列或病毒基因的转录水平。在一些实施方案中，病毒RNA的转录指示在病毒复制期间整合的原病毒DNA转录成RNA的水平。在一些实施方案中，病毒RNA被翻译成病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒RNA是在复制期间包装成新病毒颗粒的病毒基因组。在所提供的方法的方面，测试样品含有从生物样品分离或获得的RNA，比如来自细胞或细胞群的RNA。在一些实施方案中，测试样品包含来自用于产生病毒载体颗粒的细胞的RNA。在一些实施方案中，细胞来自病毒包装细胞系。在一些实施方案中，细胞是用于瞬时产生病毒载体颗粒的包装细胞或宿主细胞。在一些实施方案中，测试样品包含来自用病毒载体颗粒基因工程改造的细胞或细胞群的RNA。在一些情况下，细胞或细胞群来源于患者。在一些实施方案中，所述细胞来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，比如先天性或适应性免疫的细胞，例如髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。在一些情况下，测试样品包含来自已经或正在用过继细胞疗法治疗的患者的细胞的RNA。
在一些情况下，细胞或细胞群被或已经用病毒载体颗粒比如编码重组和/或异源分子的病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，病毒载体颗粒包含含有编码重组或异源分子(比如重组受体，例如抗原受体，如嵌合抗原受体或转基因T细胞受体)的核酸的基因组，由此细胞转导可以产生表达重组受体(例如CAR)的细胞。在这种背景下，异源是指通常不从病毒表达和/或不由病毒基因组编码的蛋白质。在一些情况下，病毒载体颗粒被或已经用于转导细胞，比如T细胞。在一些实施方案中，所得细胞和包含这样的细胞的组合物可用于过继免疫疗法的方法中。示例性病毒载体颗粒和细胞描述如下。
在一些实施方案中，所提供的方法用于评估生物样品中复制型病毒的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，生物样品是或包括已经或将要用编码异源核酸的病毒载体颗粒工程改造的细胞，例如在生产基因工程改造细胞的制造过程的任何阶段。在一些方面，通过评估一个或多个靶基因的RNA水平来检测复制型病毒，所述靶基因比如病毒基因，例如在用于生产病毒载体颗粒的逆转录病毒中表达但在病毒载体颗粒自身中不表达的第一、第二和/或后续病毒基因，在一些情况下，所述病毒载体颗粒被或已经被设计成复制缺陷型。
在某些实施方案中，参数是靶基因的病毒RNA或编码靶基因的病毒RNA。在一些实施方案中，使用实时聚合酶链反应(qPCR)测定法评估靶基因(例如第一和/或第二病毒基因)的RNA水平。在一些情况下，逆转录酶PCR(RT-PCR)作为与qPCR相同的测定法的一部分进行(例如，在RT-qPCR测定法中)或在qPCR测定法之前进行。因此，在一些情况下，包含在测试样品中的RNA，例如从或已经从包含转导细胞的样品中提取的RNA，用作通过RT-PCR合成cDNA的模板。
在一些实施方案中，样品中RNA的量由替代读出(surrogate readout)例如参数或替代参数确定，其指示或表明样品中RNA的程度、水平或量。在一些实施方案中，替代读出是通过提供的RT-PCR方法获得的循环阈(CT)值，其是检测来自样品的信号所花费的循环数的读出。CT值与核酸例如样品中的RNA的量成反相关，由此较低的CT值指示较高的靶RNA量，而较高的CT值指示较低的靶RNA量。
在某些实施方案中，参数是替代读出。在一些实施方案中，参数是通过提供的RT-PCR方法获得的循环阈(CT)值。在具体的实施方案中，参数是CT值。
在所提供的方法中，评估一种或多种靶病毒RNA的存在、水平或量。在一些实施方案中，选择一种或多种靶RNA是因为它们能够区分含RCR或有含RCR的风险的样品和不含RCR的样品。例如，在一些实施方案中，一种或多种靶RNA存在于含RCR或有含RCR风险的样品中，并且在不含RCR的样品中不存在或基本上不存在。在一些实施方案中，含RCR或有含RCR风险的样品中靶RNA的水平或量或浓度高于不含RCR的样品。在一些实施方案中，当在本文所述的方法中使用时，一种或多种靶RNA产生高信噪比和/或低背景水平或噪声。在一些实施方案中，靶病毒RNA是GaLV。在一些实施方案中，靶病毒RNA是MMLV。在一些实施方案中，靶病毒RNA是GaLV和MMLV。
在一些方面，除靶基因外，还评估对照基因(例如肌动蛋白)作为测定法的对照。对照基因的评估例如也可以在同一个反应中进行，例如在多重反应中评估一个或多个靶基因。例如，可以在同一个反应中评估对照基因和第一病毒基因。在其他情况下，可以在同一个反应中评估对照基因和第二病毒基因。在一些方面，可以在多重反应中评估第一和第二病毒基因。在一些情况下，可以在多重反应中评估3个或更多个靶基因。在一些情况下，可以在具有第一和第二基因两者和/或具有三个或更多个靶基因的多重反应中评估对照基因。
在一些情况下，分别使用对靶基因或对照基因的序列特异的寡核苷酸引物评估靶基因(例如，第一和/或第二病毒基因)和/或对照基因。在一些实施方案中，分别使用对靶基因或对照基因特异的水解探针评估靶基因的病毒RNA水平和/或对照基因。下文论述了示例性寡核苷酸引物和水解探针。
在一些实施方案中，除了测试样品之外，还评估了一种或多种对照样品。例如，可使用质粒标准对照作为测定法的扩增部分的对照。在一些方面，可以使用无模板对照来提供关于PCR试剂污染状态的信息。在一些情况下，可以使用无逆转录酶对照来评估RNA模板的纯度和/或检测污染性DNA。在一些情况下，使用不含靶基因拷贝的阴性对照，例如来自不表达靶基因的细胞系的RNA。在一些实施方案中，比如针对例如由于在RNA分离程序过程中的可能污染所致的背景信号，使用含有未曾用编码重组和/或异源分子的病毒载体颗粒转导的来自患者匹配的材料的RNA的过程中(in-process)对照作为对照。
在RT-PCR中在RT阴性条件下检测的扩增程度可以指示污染性DNA。在一些实施方案中，进行RNA分离以使污染性DNA降到最低，例如，借助于选择已经观察到导致RT阴性样品中相对较低信号的RNA分离或制备方法。在一些实施方案中，在含有使用特定方法(在一些方面，RNeasy Plus试剂盒)分离的RNA的样品中，观察到任何污染性DNA在无RT条件下较低程度的扩增和/或较低程度的存在。在一些方面，使用具有柱上DNA酶消化的RNeasy试剂盒。
在一些实施方案中，可以使用含有已知水平的靶基因的阳性对照。靶基因的已知RNA水平可以处于或稍高于依照测定法的靶基因的检测限。在所提供方法的一些实施方案中，在含有衍生自转导细胞的RNA的测试样品中掺入阳性对照RNA。如下文进一步描述，在一些实施方案中，在一些方面，阳性对照样品中靶基因的RNA水平设定了将测试样品中靶基因的RNA水平与其比较的参考值。
在一些实施方案中，当测试样品中靶基因的RNA水平高于参考值时，可以认为测试样品存在一种或多种来自复制型病毒的RNA，并且所述RNA通常是复制型病毒或病毒复制能力所需的或被认为是其所需的。在一些实施方案中，被认为具有这样的RNA的样品被认为在测定中是阳性的，并且/或者被认为有包含复制型病毒的风险，被认为含有逆转录病毒复制所需和/或复制型病毒所需的一种或多种RNA；被认为含有推定的复制型病毒，和/或被认为可能含有复制型病毒，其中所述RNA来自复制型病毒、是复制型病毒所需、被认为是复制型病毒所需、或通常与复制型病毒相关。在一些实施方案中，除非对于多种病毒靶RNA或病毒复制能力所需的多种RNA被认为是阳性的，否则不认为样品对RCR是阳性的或可能是阳性的或有RCR的风险。
在一些实施方案中，样品在下列情况下被认为是阳性的：所述样品通过测定法被认为(i)含有靶RNA(和/或多种靶RNA中的两种或更多种)的存在，(ii)含有一定水平的通常反向指示一定量的RNA的替代读出，比如等于或低于参考水平(如参考CT值)的CT值，和/或(iii)含有一定量的等于或高于参考值的RNA或其替代读出，在每种情况下，任选地针对多种靶病毒RNA中的两种或更多种中的每一种。
在一些实施方案中，样品在下列情况下(a)被认为有包含复制型病毒的风险，(b)被认为含有逆转录病毒复制所需和/或复制型病毒所需的RNA(或任选地多种RNA和/或RNA)，(c)被认为含有推定的复制型病毒，和/或(d)被认为可能含有复制型病毒：所述样品被认为(i)含有靶RNA(和/或多种靶RNA中的两种或更多种)的存在，(ii)含有一定水平的通常反向指示一定量的RNA的替代读出，比如等于或低于参考水平(如参考CT值)的CT值，(iii)含有一定量的等于或高于参考值的RNA或其替代读出，在每种情况下，任选地针对多种靶病毒RNA中的两种或更多种中的每一种，和/或(iv)通过测定法被认为或已经被认为是阳性的。
在一些方面，如果样品已经被认为含有针对至少两种病毒RNA(比如至少第一和第二种病毒RNA)的在(i)-(iii)或(i)-(iv)的任一项中的对应读出，那么所述样品被认为含有复制型病毒或仅被认为有其风险和/或含有推定的复制型病毒、和/或可能含有复制型病毒、和/或在测定法中是阳性的。
在一些实施方案中，样品在下列情况下被认为是阴性的：所述样品在测定法中被认为(1)不含靶RNA(和/或不含多种靶RNA中的两种或更多种)的存在，或含有所述靶RNA的不存在，(2)含有一定水平的通常反向指示一定量的RNA的替代读出，比如等于或高于参考水平(如参考CT值)的CT值，和/或(3)含有一定量的等于或低于参考值的RNA或其替代读出，在每种情况下，任选地针对多种病毒RNA中的至少两种。
在一些实施方案中，样品在下列情况下(a)被认为没有包含复制型病毒的风险，(b)被认为不含逆转录病毒复制所需和/或复制型病毒所需的RNA，(c)被认为不含推定的复制型病毒，和/或(d)被认为不含复制型病毒：所述样品被认为(1)不含靶RNA(和/或多种靶RNA中的两种或更多种)的存在，(2)含有一定水平的通常反向指示一定量的RNA的替代读出，比如等于或高于参考水平(如参考CT值)的CT值，(3)含有一定量的等于或低于参考值的RNA或其替代读出，和/或(4)通过测定法被认为或已经被认为是阴性的。
在一些方面，如果样品被认为含有针对靶病毒RNA的在(1)-(4)的任一项中的对应读出，那么所述样品被认为没有复制型病毒的风险、是复制型病毒阴性的或不含复制型病毒的存在，所述靶病毒RNA比如复制型病毒或病毒复制能力所需或被认为其所需的任何一种或多种靶病毒RNA，比如第一和第二种病毒RNA的一种或多种。
在一些情况下，当靶基因的RNA水平低于参考值时，认为测试样品对于测定法、推定的复制型病毒的存在、风险或存在来说不是阳性的。在一些这样的情况下，释放样品和/或由其衍生的细胞，例如转导的细胞，例如以便进一步加工或配制和/或在治疗比如过继细胞疗法中使用或施用。在一些这样的情况下，将生物样品所来源的患者(任选地是人受试者)视为不含复制型病毒。
在一些方面，所提供的方法可用于提供或评估工程化细胞产物样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险，所述样品含有经过逆转录病毒转导的并且培养的细胞。逆转录病毒载体颗粒，比如γ-逆转录病毒和慢病毒载体颗粒，已用于将治疗基因引入细胞中的各种临床基因转移应用中，包括与制备细胞产物相结合。逆转录病毒载体颗粒通常衍生自逆转录病毒家族(逆转录病毒科)。在一些实施方案中，病毒体颗粒含有基因组RNA。进入宿主细胞后，基因组RNA被逆转录为DNA。在一些实施方案中，在一些情况下使用整合酶将DNA整合到宿主细胞的染色体DNA中，此时逆转录病毒DNA可以被称为原病毒。在一些实施方案中，宿主细胞将原病毒DNA作为其自身基因组的一部分进行处理，将整合的基因与宿主细胞自身的基因一起翻译和转录，由此产生由病毒基因组核酸编码的蛋白质。在一些情况下，需要这些蛋白质来组装病毒的新拷贝，其中任选地，病毒是复制型的和/或感染性的。
逆转录病毒可分为“简单”和“复杂”逆转录病毒。简单逆转录病毒的基因组仅编码gag、pro、pol和env基因。简单逆转录病毒的实例包括α-逆转录病毒、β-逆转录病毒和γ-逆转录病毒。相反，复杂逆转录病毒的基因组包括gag、pro、pol和env基因，以及具有多种功能的一系列调节或辅助基因。复杂逆转录病毒的实例包括δ逆转录病毒、ε逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒。辅助基因的实例包括vif、vpr、vpu、rev、vpx和nef。
在一些实施方案中，重组逆转录病毒比如γ-逆转录病毒和慢病毒的基因组或其部分能够稳定整合到宿主基因组中。在一些情况下，这样的逆转录病毒含有允许这种整合的逆转录酶和/或整合酶。在一些情况下，含有这种逆转录病毒组分的病毒载体颗粒已经用于将治疗基因引入细胞中的各种临床基因转移应用中，所述逆转录病毒例如人类免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1，长臂猿白血病病毒(GaLV)或莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。在一些情况下，逆转录病毒载体是肿瘤逆转录病毒载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)衍生的载体。在一些实施方案中，病毒载体是第二或第三代慢病毒载体。
在一些实施方案中，预期用于基因治疗或细胞(包括最终预期用于植入或施用于受试者的细胞)转导的病毒载体颗粒衍生自这样的病毒，并且可以被工程改造为复制缺陷型。在一些实施方案中，这种工程改造涉及将编码病毒蛋白和异源蛋白的核酸分离成单独的核酸序列。在一些实施方案中，这些单独的序列可称为载体序列，在一些实施方案中称为转移载体和/或转移质粒，其包含异源基因和一个或多个辅助序列，所述辅助序列包含将载体包装成感染性病毒颗粒必需的基因。例如，在一些实施方案中，一个核酸序列可包含gag/pol，另一个序列可包含env，并且另一个序列可包含异源核酸。在一些实施方案中，能够检测在生成或加工步骤过程中生成的任何复制型病毒的方法是令人希望的，所述复制型病毒比如通过例如载体和辅助序列之间的同源或非同源重组生成。在一些实施方案中，这样的方法能够证实在施用治疗组合物之前未曾发生这样的事件。
通常，复制缺陷型病毒载体缺乏编码包装、结构、调节和/或酶组分的基因。这样的组分包括gag、pro、pol和env基因。
虽然不太可能，但转移载体(比如含有编码重组和/或异源分子的序列的载体)与包装、结构、调节或酶组分(比如env、gag、pol或rev)之间可能发生重组，所述组分由引入包装细胞中的质粒编码。理论上，这样的重组事件的发生可以产生复制型病毒(例如RCR)。所提供的方法可用于证实在转移载体、包装或调节组分和样品中(比如在用于产生病毒载体颗粒的细胞中)的内源元件或引入的病毒元件之间未发生重组。在一些方面，所提供的方法可用于证实或验证某些样品中RCR的不存在，所述样品比如治疗组合物和在生产过程中产生的中间产物。
在一些方面，例如，在制造、配制、包装过程中的各个或某些步骤和/或比如在过继细胞疗法的方法中在施用于患者之前或之后，测定包含转导细胞的样品中复制型病毒或其指示物的存在或不存在。在一些方面，用于细胞疗法的细胞的工程化可包括用病毒载体颗粒转导细胞，并通常在37℃培养细胞长达14天，然后冷冻保存和/或配制。在一些方面，可以根据提供的方法评估从在转导后的任何时间获得的细胞获得的测试样品，所述时间比如通常在转导后培养至少或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天之后。在一些方面，通常在施用于受试者之前，也可以通过所提供的方法评估从转导和培养(例如用于扩增)的细胞获得的测试样品，所述细胞已被冷冻保存和/或配制为用于施用于受试者。
在一些方面，相对于用于检测样品中RCR的现有方法，所提供的方法具有优势。一些可用于RCR测试的方法，比如认可的此类方法，包括基于细胞培养的测定法。在这样的测定法中，在扩增阶段之后，从与允许细胞系(比如HEK293细胞系)共培养的细胞样品获得上清液，在扩增阶段中将细胞培养几周，通常为3至6周，以便扩增病毒颗粒供检测。可以将在扩增过程中例如在3周或6周的扩增阶段期间收集的培养上清液置于指示细胞系上，并且当发生转化时指示RCR，这通常通过噬斑形成而观察到。一种示例性测定法是S+/L-测定法，其通常涉及使用指示细胞系检测RCR(或验证其不存在)，所述指示细胞系比如PG-4细胞系，其含有鼠肉瘤病毒基因组(S+)，但缺乏鼠白血病病毒基因组(L-)。通常，在这种测定法中，只有当鼠肉瘤病毒和鼠白血病病毒两者都表达时才通过细胞产生转化的表型。.
其他基于细胞培养的测定法包括标志物拯救测定，其中可以使用包含带有标志物的逆转录病毒载体的允许细胞系，所述标志物比如标志物转基因，其可以在任何潜在RCR扩增(比如3周或6周扩增)后在上清液中被鉴定。通常，如果存在RCR，则RCR基因组将被包装，并且标志物转基因被拯救并因此在转导到幼稚细胞系中时被表达。
在一些方面，某些基于细胞培养的测定法可能并不完全是最佳的，例如因为它们耗时和/或劳动强度大和/或需要大体积或量的样品用于测试和/或导致实际上不含RCR的组合物的假阳性RCR结果，和/或不能在足以用于某些特定目的的时间范围内提供信息。某些基于细胞培养的测定法也可能导致实际上含有RCR的组合物的假阴性结果。在载体暴露后不久的时间点使用某些细胞培养测定法评估的样品中，可能更频繁地发生假阴性结果，因此限制了这样的测定法用于提供快速结果的用途。某些常见的细胞培养测定法通常需要花费长达六周或更长时间才能完成。某些方法可能不适合与在使用前或在该方法完成的时间段期间不能冷冻保存的细胞一起使用。
基于某些细胞培养物的测定法的示例性替代可包括涉及聚合酶链反应(PCR)测定的测定法。这样的PCR测定法的局限性可包括，例如由于与实际RCR无关的残留DNA，例如由于载体生产者系DNA和/或其他残留DNA的存在(这些DNA在允许的基于DNA的PCR条件下可以检出)，基于DNA模板的PCR测定法虽然敏感，但可能容易产生假阳性。在载体暴露后不久的时间点评估的样品中，可能更频繁地发生这样的假阳性结果，因此限制了这样的测定法用于提供快速结果的用途。
在一些实施方案中，所提供的方法、组合物和系统在各个方面都是有利的。与现有方法相比，所提供的方法表现出相似或改进的灵敏度、特异性和/或准确性。然而，所提供的方法被实施和/或能够例如在数天或数小时的过程中快速检测样品中复制型病毒的存在或不存在，这与涉及数周培养的细胞培养测定法相反。在一些方面，例如与其中通过转导方法工程改造自体或同种异体细胞的过继细胞治疗方法相结合，其更有效地获得结果的能力是理想的。
在一些方面，所提供的方法更灵敏，使得可以在转导后的较早时间点获得的测试样品上和/或根据相比于现有方法特别是共培养方法更少的总样品进行该测定法。
在一些实施方案中，所述方法和系统是有利的，因为它们产生比某些可用的基于PCR的方法更少的假阳性结果，例如，在相同组合物或样品的测试中，所述基于PCR的方法可能受到其污染检测的限制，比如所述污染来自生产细胞或质粒DNA。在一些方面，与某些可用的基于细胞培养的PCR方法相比，本方法的优点涉及通过本方法的RNA(比如来自测试样品的RNA，与来自基于细胞培养的方法中的样品的上清液相反)的使用(或检测其存在或不存在或水平)，这与以DNA为模板的PCR相反。在一些这样的方面，所提供的实施方案的有利之处在于在对样品实施确实含有RCR的方法的情况下其检出取样的细胞活跃地转录病毒基因的能力。因此，与使用DNA模板的某些PCR测定法相比，通过当前方法在包含RNA的测试样品中检出的复制型病毒的存在可以是复制型病毒的更特异的指示物，并且/或者当前方法可能不太容易产生假阳性，同时保持高水平的灵敏度和可靠性。在一些方面，所提供的方法可以比某些可用的基于细胞培养的方法更灵敏和可靠，从而允许减少假阴性结果。
在一些实施方案中，将本文中公开的测定法的性能与作为基准的其他测定法进行比较。在一些实施方案中，一般而言，本文中公开的测定法至少与S+/L-测定法、标志物拯救测定法和/或基于模板的RCR PCR测定法(比如本文所述的那些)一样敏感。例如，在一些实施方案中，相比于其他测定法，本文中公开的测定法可用于在较早时间点检测在含有较低数量RCR的样品中的RCR，其使用较小的样品，使用较少的细胞，或使用较低的体积。在一些实施方案中，本文中公开的测定法可以比S+/L-测定法更快地进行，同时保持相同或更高的灵敏度。例如，在一些实施方案中，可以在生成测试样品的数小时或数天内进行测定。在一些实施方案中，本文中公开的测定法具有比其他测定法更低的假阳性率，其他测定法包括例如S+/L-测定法、标志物拯救测定法和/或基于模板的RCR/RCL PCR测定法。在一些实施方案中，本文中公开的提供的测定法可具有低假阴性率，比如其假阴性率低于给定的参考测定法。在一些实施方案中，本文中公开的提供的测定法可以并行地运行，从而比其他参考测定法同时检测来自更多数量的样品、病症或对照的RCR。
所提供的章节描述了所提供方法的示例性方面。
用于检测测试样品中复制型逆转录病毒的方法
本文中提供了检测样品中复制型病毒的存在、不存在或水平(比如证实其不存在)的方法，所述样品如含有来自样品(例如生物样品)的RNA的测试样品，其可以是可能含有复制型病毒、或者其中期望和/或需要最终证实复制型病毒不存在的样品。在一些实施方案中，测试样品获自例如作为生物样品和/或生物样品的来源的样品，其包含已使用编码重组和/或异源分子的复制缺陷型病毒载体颗粒用核酸转导的细胞。在一些方面，在理论上可能的是，在验证或测定之前，可能已经例如通过重组生成了复制型病毒，并且例如通过提供的方法验证这样的样品不含诸如RCR的复制型病毒。
在一些实施方案中，所提供的方法可用于检测样品例如测试样品或生物样品中的复制型逆转录病毒，比如复制型γ-逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)。在具体的实施方案中，所提供的方法可用于检测源自病毒载体的复制型逆转录病毒和/或由其生成的复制型逆转录病毒，所述病毒载体用于转导样品(例如生物样品)的细胞。在某些实施方案中，所提供的方法可用于检测病毒载体中复制能力所需的病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述病毒载体用于转导样品中的细胞。
在一些实施方案中，样品包含用一个或多个原病毒质粒转染的细胞。在一些实施方案中，样品包含经转染的和/或包含生成感染性病毒颗粒所必需的一个或多个核酸的细胞。在一些实施方案中，所述方法包括评估病毒RNA水平，所述病毒RNA比如包含转导细胞的样品中的一个或多个靶基因(例如病毒基因)的病毒RNA。在一些方面，所述方法包括将测试样品中的一个或多个靶基因的RNA水平与对应的参考值比较。在一些情况下，基于每个靶基因与其参考值的比较，检测样品比如包含转导细胞的样品中复制型病毒的存在。在一些实施方案中，如果靶基因的病毒RNA水平高于其对应的参考值，则复制型病毒存在于包含转导细胞的样品中。在一些实施方案中，复制型病毒是复制型逆转录病毒(RCR)。在一些实施方案中，复制型逆转录病毒是复制型γ-逆转录病毒。在一些实施方案中，复制型病毒是慢病毒(RCL)。
靶基因和对照基因
在一些方面提供了用于检测或验证或证实复制型病毒不存在的方法。这样的方法可包括评估一个或多个病毒序列或一个或多个病毒靶基因(例如病毒基因)的(或由其编码的)病毒RNA的水平。在一些实施方案中，一个或多个靶基因包括第一病毒基因。在一些情况下，一个或多个靶基因包括第一和第二病毒基因。在一些实施方案中，第一和第二病毒基因不相同。在一些实施方案中，一个或多个靶基因包括三个或更多个病毒基因。在一些方面，一个或多个靶基因来自逆转录病毒，如γ-逆转录病毒或慢病毒。在一些实施方案中，除了评估靶基因之外，还评估对照基因的RNA水平，例如，以证实测定法的有效性或灵敏度和/或特异性。
靶基因
在一些实施方案中，所述方法提供了用于测量、检测、评估和/或量化与靶基因或靶基因的基因表达产物的量、水平和/或浓度正或负相关和/或关联的参数的步骤。在一些实施方案中，所述参数是由靶基因编码的蛋白质，并且所述蛋白质的水平、量或浓度与靶基因的存在或不存在、和/或量、水平或浓度正相关。在某些实施方案中，所述参数是编码靶基因的病毒RNA，并且所述病毒RNA的水平、量或浓度与靶基因的存在或不存在、和/或量、水平或浓度正相关。
在一些实施方案中，所述参数是受到靶基因负调控的蛋白质，并且所述蛋白质的水平、量或浓度与靶基因的存在或不存在、和/或量、水平或浓度负相关。在具体的实施方案中，所述参数是受到靶基因负调控的多核苷酸，并且所述多核苷酸的水平、量或浓度与靶基因的存在或不存在、和/或量、水平或浓度负相关。
在一些实施方案中，所述参数是编码靶基因的病毒RNA、和/或衍生自编码靶基因的病毒RNA的cDNA。在具体的实施方案中，测量、检测、评估和/或量化参数是或包括测量、检测、评估和/或量化编码靶基因的病毒RNA和/或衍生自编码靶基因的病毒RNA的cDNA的水平和/或量。在具体的实施方案中，用PCR(例如RT-PCR)测量、评估、检测和/或量化对照参数。
通常，一个或多个靶基因或序列是不由用来产生用于转导细胞的病毒载体颗粒的转移载体编码的病毒基因或序列。在一些实施方案中，所述病毒序列或基因由野生型病毒编码。在一些实施方案中，所述病毒序列或基因是重组序列或基因。在一些实施方案中，所述病毒序列或基因是病毒复制必需的。在一些实施方案中，所述病毒序列或基因编码病毒的包装、结构、调节或酶组分或其部分序列。
在具体的实施方案中，所述一个或多个靶基因或序列是用于产生复制缺陷型病毒载体颗粒的病毒基因或序列。在某些实施方案中，所述一个或多个靶基因或序列用于产生逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述一个或多个靶基因用于产生第IV节中描述的一个或多个病毒载体。在具体的实施方案中，病毒载体用于基因递送，例如编码CAR的基因。在某些实施方案中，所述一个或多个靶基因或序列用于产生逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒。在具体的实施方案中，逆转录病毒载体是γ-逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。
在一些实施方案中，所述一个或多个靶基因属于或衍生自不同的病毒，例如不同的病毒物种或同种型，而不是逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒载体。在某些实施方案中，所述一个或多个靶基因属于或衍生自不同的病毒，例如不同的病毒物种或同种型，而不是逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒载体。
在一些情况下，所述一个或多个靶基因，例如第一和/或第二病毒基因，包括env、gag、pol或rev基因。另外的靶基因可包括与毒力相关的那些(例如HIV的主要反式激活因子)和/或是辅助基因。在一些实施方案中，env、gag、pol或rev基因中的一个或多个用于产生逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒。在具体的实施方案中，env、gag、pol或rev基因中的一个或多个用于产生γ-逆转录病毒载体。在具体的实施方案中，env、gag、pol或rev基因中的一个或多个用于产生慢病毒载体。在一些实施方案中，env、gag、pol或rev基因中的一个或多个属于或衍生自不同的病毒，例如不同的病毒物种或同种型，而不是逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒载体。在某些实施方案中，env、gag、pol或rev基因中的一个或多个属于或衍生自不同的病毒，例如不同的病毒物种或同种型，而不是逆转录病毒载体，例如用于基因递送的复制缺陷型逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，所述一个或多个靶基因包括第一病毒基因和第二病毒基因。在具体的实施方案中，所述一个或多个靶基因是或包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个和/或十个病毒基因。在具体的实施方案中，第一病毒基因是env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在一些实施方案中，第二病毒基因是env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在具体的实施方案中，第一和/或第二病毒基因是env、gag、pol或rev基因。在一些情况下，第一病毒基因是env基因。在一些实施方案中，第二病毒基因是gag、pol或rev基因。在一些情况下，第一病毒基因是gag、pol或rev基因。在一些实施方案中，第二病毒基因是env基因。在一些实施方案中，第一或第二病毒基因是pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx和/或Tat基因。
在某些实施方案中，所提供的方法用于确定在样品中例如在测试样品、生物样品和/或生物和/或测试样品的来源中是否存在复制型病毒。在一些实施方案中，样品含有或衍生自已经用病毒载体转导的细胞。在一些实施方案中，已经用逆转录病毒载体转导细胞。在一些实施方案中，已经用γ-逆转录病毒载体转导细胞。在具体的实施方案中，已经用慢病毒载体转导细胞。
在一些实施方案中，用病毒载体例如逆转录病毒载体转导细胞。在具体的实施方案中，用复制缺陷型病毒载体转导细胞。在某些实施方案中，通过瞬时产生方法产生复制缺陷型病毒载体颗粒，其包括将编码载体基因组和包装构建体的多个质粒共转染到宿主细胞中，例如来自病毒包装细胞系(VPC)的细胞。在一些实施方案中，病毒载体是例如复制缺陷型逆转录病毒载体。在一些实施方案中，用于产生和/或掺入病毒载体的质粒和/或基因含有来自多于一种病毒(例如病毒种类或同种型)的基因。例如，在一些实施方案中，逆转录病毒载体含有一个或多个不是源自或衍生自逆转录病毒的基因。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体含有一个或多个不是源自和/或衍生自逆转录病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。在具体的实施方案中，γ-逆转录病毒载体含有一个或多个不是源自和/或衍生自γ-逆转录病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。在具体的实施方案中，慢病毒载体含有一个或多个不是源自和/或衍生自慢病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。
在一些实施方案中，复制型逆转录病毒含有一个或多个不是源自和/或衍生自逆转录病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。在具体的实施方案中，复制型γ-逆转录病毒(例如RCR)含有一个或多个不是源自和/或衍生自γ-逆转录病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。在具体的实施方案中，复制型慢病毒载体(例如RCL)含有一个或多个不是源自和/或衍生自慢病毒的病毒基因和/或多核苷酸序列。
在某些实施方案中，病毒载体是假型化的，例如，与外源病毒基因和/或蛋白质组合，例如用于改变宿主向性和/或增加或降低病毒载体的稳定性。在某些实施方案中，复制型病毒(例如RCR或RCL)的检测、评估和/或测量是或包括不是源自和/或衍生自该病毒的病毒基因和/或与所述病毒基因相关或关联的参数的评估、测量和/或检测。
在一些实施方案中，复制型病毒(例如RCR或RCL)的检测、评估和/或测量是或包括用于产生病毒载体的病毒基因的检测评估、测量和/或检测。在一些实施方案中，通过检测用于假型化病毒载体的病毒基因或多核苷酸序列来检测、测量或评估复制型逆转录病毒、慢病毒和/或γ-逆转录病毒。
在一些实施方案中，靶基因，例如病毒基因(比如第一、第二或另外的病毒基因)可以衍生自任何适当的病毒，比如逆转录病毒，例如γ-逆转录病毒或慢病毒。在一些实施方案中，靶基因是逆转录病毒衍生的基因，其来自病毒，包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。在一些实施方案中，靶基因可以是来自其他病毒比如水泡性口炎病毒(VSV)、肝炎病毒或流感病毒的靶基因。
在一些实施方案中，靶基因来自长臂猿白血病病毒(GaLV)。在一些方面，靶基因，例如病毒基因(比如第一、第二或另外的病毒基因)来自莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。在一些实施方案中，靶基因，例如病毒基因(比如第一、第二或另外的病毒基因)来自水泡性口炎病毒(VSV)。
在一些实施方案中，测量、评估、量化和/或确定靶基因以评估复制型逆转录病毒的存在、不存在、量、水平和/或浓度。在具体的实施方案中，复制型逆转录病毒是复制型γ-逆转录病毒(RCR)。在一些实施方案中，通过测量衍生自和/或源自γ-逆转录病毒的靶基因来检测复制型γ-逆转录病毒。在一些实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自γ-逆转录病毒的env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在具体的实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自γ-逆转录病毒的env、gag、pol或rev。在一些实施方案中，靶基因用于质粒/或包含在质粒上，或在用于产生γ-逆转录病毒载体的细胞中表达，并且源自和/或衍生自不是γ-逆转录病毒的病毒。在一些实施方案中，靶基因是非衍生自γ-逆转录病毒的env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在一些实施方案中，靶基因是假型化基因。在具体的实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自非γ-逆转录病毒的病毒例如VSV的env。示例性γ-逆转录病毒包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、艾贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒。
在一些实施方案中，靶基因是逆转录病毒gag基因。在一些实施方案中，gag基因是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)gag基因或人类免疫缺陷病毒(HIV)gag基因。在一些实施方案中，gag基因编码存在于复制型病毒中的病毒蛋白，但该基因在包含重组和/或异源分子的非复制型病毒载体颗粒中不存在。在一些实施方案中，gag基因编码包含病毒基质、衣壳和核衣壳蛋白的多蛋白。示例性蛋白质包括p17、p24、p9和p6。在一些实施方案中，包含复制型病毒的转导细胞将转录在病毒载体颗粒中不存在的各种病毒基因，包括MMLV或HIV gag基因。在一些实施方案中，MMLV gag基因包含在SEQ ID NO:27中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，HIV gag基因包含在SEQ ID NO:31中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，靶基因是逆转录病毒pol基因。在一些实施方案中，pol基因是MLV pol基因或HIV pol基因。在一些实施方案中，pol基因编码蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(IN)等蛋白质。在一些实施方案中，pol基因编码存在于复制型病毒中的病毒蛋白，但该基因在包含重组和/或异源分子的非复制型病毒载体颗粒中不存在。通常，包含复制型病毒的转导细胞将转录在病毒载体颗粒中不存在的各种病毒基因，包括pol基因。在一些实施方案中，pol基因包含在SEQ ID NO:29中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，pol基因包含在SEQ ID NO:32中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，靶基因是逆转录病毒env基因。在一些情况下，env基因是长臂猿白血病病毒(GaLV)env基因。在一些实施方案中，GaLV env基因编码存在于复制型逆转录病毒中的病毒包膜蛋白，但该基因在编码重组和/或异源分子的非复制型病毒载体颗粒中不存在。通常，包含复制型病毒的转导细胞将转录在病毒载体颗粒中不存在的各种病毒基因，包括GaLV env基因。在一些实施方案中，GaLV env基因包含在SEQ ID NO:25中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，测量、评估、量化和/或确定靶基因以评估复制型慢病毒(RCL)的存在、不存在、量、水平和/或浓度。在一些实施方案中，通过测量衍生自和/或源自慢病毒的靶基因来检测RCL。在一些实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自慢病毒的env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在具体的实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自慢病毒的env、gag、pol或rev。在一些实施方案中，靶基因用于质粒/或包含在质粒上，或在用于产生γ-逆转录病毒载体的细胞中表达，并且源自和/或衍生自不是慢病毒的病毒。在一些实施方案中，靶基因是非衍生自慢病毒的env、gag、pol、rev、pro、vpr、vif、vpu、nef、vpx或Tat基因。在一些实施方案中，靶基因是假型化基因。在具体的实施方案中，靶基因是源自和/或衍生自非慢病毒的病毒例如VSV的env。
在一些实施方案中，慢病毒包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、羊慢病毒组和灵长类慢病毒组的成员。适合于基因递送的慢病毒载体的设计和使用描述于，例如，2001年3月27日发布的美国专利No.6,207,455，和2000年12月26日发布的美国专利No.6,165,782。慢病毒的实例包括但不限于HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型、HIV-1/SIV、FIV、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒和牛免疫缺陷病毒。在一些实施方案中，慢病毒载体包括但不限于衍生自HIV-1、SIVmnd1、SIVlst、SIVsun、SIVolc或SIVwrc慢病毒的载体。
在一些实施方案中，靶基因是慢病毒rev基因。在一些实施方案中，rev基因是人类免疫缺陷病毒(HIV)rev基因。在一些实施方案中，rev基因编码反式激活蛋白。在一些实施方案中，rev基因编码存在于复制型病毒中的病毒蛋白，但该基因在包含重组和/或异源分子的非复制型病毒载体颗粒中不存在。通常，包含复制型病毒的转导细胞将转录在病毒载体颗粒中不存在的各种病毒基因，包括rev基因。在一些实施方案中，rev基因包含在SEQ IDNO:33中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，靶基因是假型化基因和/或是源自和/或衍生自非逆转录病毒的病毒的env。在一些方面，env基因是水泡性口炎病毒env基因(例如VSVG)。在一些实施方案中，VSV env基因编码存在于复制型病毒中的病毒包膜蛋白，但该基因在编码重组和/或异源分子的非复制型病毒载体颗粒中不存在。通常，包含复制型病毒的转导细胞将转录在病毒载体颗粒中不存在的各种病毒基因，包括VSVG env基因。在一些实施方案中，VSVG env基因包含在SEQ ID NO:26中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在具体的实施方案中，所述方法包括检测样品中例如测试样品和/或生物样品中RCR的一个或多个步骤。在具体的实施方案中，本文中提供的方法包括检测、测量、评估和/或量化一个或多个靶基因的一个或多个步骤，所述靶基因为γ-逆转录病毒基因和/或为用于生成γ-逆转录病毒载体(比如用于基因递送的复制缺陷型γ-逆转录病毒载体)的基因。在具体的实施方案中，所述方法包括检测、测量、评估和/或量化一个或多个对照基因的一个或多个步骤。在一些实施方案中，对照基因是肌动蛋白。在具体的实施方案中，靶基因是GaLV env。在某些实施方案中，靶基因是MMLV gag。在一些实施方案中，靶基因是GaLV env和MMLV gag。
在具体的实施方案中，所述方法包括检测样品中例如测试样品和/或生物样品中RCL的一个或多个步骤。在具体的实施方案中，本文中提供的方法包括检测、测量、评估和/或量化一个或多个靶基因的一个或多个步骤，所述靶基因为慢病毒基因和/或为用于生成慢病毒载体(比如用于基因递送的复制缺陷型慢病毒载体)的基因。在具体的实施方案中，所述方法包括检测、测量、评估和/或量化一个或多个对照基因的一个或多个步骤。在一些实施方案中，对照基因是肌动蛋白。在具体的实施方案中，靶基因是rev，例如HIV rev。在某些实施方案中，靶基因是VSV-G。在一些实施方案中，靶基因是rev和VSV-G。
对照基因
在一些实施方案中，除了测量、检测、评估和/或量化所述参数之外，还测量、检测、评估和/或量化对照参数的量、水平和/或浓度。在具体的实施方案中，对照参数的值或测量与对照基因或基因表达产物的量、水平和/或浓度关联和/或相关。在一些实施方案中，所述参数和对照参数都是基因或基因表达产物，例如蛋白质。在某些实施方案中，所述参数和对照参数都是基因、RNA多核苷酸和/或衍生自RNA多核苷酸的DNA多核苷酸。在某些实施方案中，对照参数的值或测量与对照基因或基因表达产物的水平、浓度和/或量关联(例如负或正)。在一些实施方案中，基因表达产物是mRNA。在具体的实施方案中，对照基因表达产物是非病毒RNA，例如人mRNA。
在一些实施方案中，对照参数是RNA。在具体的实施方案中，测量、检测、评估和/或量化对照参数是或包括测量、检测、评估和/或量化RNA的水平和/或量。在具体的实施方案中，用PCR(例如RT-PCR)测量、评估、检测和/或量化对照参数。
在一些实施方案中，除了评估靶基因的病毒RNA水平之外，还评估了对照基因的RNA水平。在一些情况下，对照基因是其RNA水平和/或转录被认为不受复制型病毒存在的影响或随其变化的基因。在一些实施方案中，对照基因是管家基因，例如：β肌动蛋白(ACTB；β-肌动蛋白)、β微管蛋白(β-微管蛋白；TUBB)、泛素、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)、核糖体RNA(例如28s或18s)和/或甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。在一些方面，将对照基因的评估与靶基因一起多重化。在一些情况下，对照基因的评估控制测定法中的RNA质量。在一些实施方案中，反应(例如孔)中对照基因的存在证实RNA是存在的，并且其质量足以能够经历逆转录和PCR扩增。
在一些实施方案中，对照基因是已知用作RT-PCR和/或qPCR测定法的对照基因的许多基因或多核苷酸或其部分中的任一者。
在一些实施方案中，对照基因是或包括肌动蛋白，比如人beta肌动蛋白(β-肌动蛋白)。在一些方面，肌动蛋白基因包含在SEQ ID NO:28中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
测定准备、方案和分析
在某些实施方案中，进行一种或多种测定法以检测、测量、评估和/或量化参数。在一些实施方案中，检测、测量、评估和/或量化参数是或包括检测、测量、评估和/或量化多核苷酸的水平，所述多核苷酸例如病毒RNA多核苷酸和/或衍生自RNA多核苷酸的DNA多核苷酸。在某些实施方案中，检测、测量、评估和/或量化参数是或包括检测、测量、评估和/或量化蛋白质(例如病毒蛋白)的水平。
在一些实施方案中，所述参数是或包括多核苷酸的水平或量。在具体的实施方案中，可以通过任何适合的手段评估、测量、确定和/或量化样品中多核苷酸的量或水平。例如，在一些实施方案中，可以通过下列方法评估、测量、确定和/或量化多核苷酸的量或水平：聚合酶链反应(PCR)，包括逆转录酶(rt)PCR、微滴式数字PCR、实时和定量PCR方法(包括例如分子信标、LIGHTUPTM、SCORPIONTM、参见，例如，美国专利No.5,538,848；5,925,517；6,174,670；6,329,144；6,326,145和6,635,427)；Northern印迹；Southern印迹，例如逆转录产物和衍生物的Southern印迹；基于阵列的方法，包括印迹阵列、微阵列或原位合成阵列；和测序法，例如，边合成边测序、焦磷酸测序、双脱氧测序、或边连接边测序，或本领域已知的任何其他方法，例如论述于Shendure等人，Nat.Rev.Genet.5:335-44(2004)或Nowrousian,Eukaryotic Cell 9(9):1300-1310(2010)，包括特定的平台，比如454、 和测序。在具体的实施方案中，通过qRT-PCR测量多核苷酸的水平。在一些实施方案中，qRT-PCR对每个基因使用三个核酸组，其中所述三个核酸包括引物对以及探针，所述探针结合在引物所结合的靶核酸区之间。
在一些实施方案中，通过将一个或多个多核苷酸测序来测量、评估、检测和/或量化一个或多个参数。在一些实施方案中，通过非Sanger测序方法和/或下一代测序(NGS)技术进行测序。下一代测序技术的实例包括但不限于大规模平行签名测序(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)、焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、单分子实时(RNAP)测序和纳米孔DNA测序。在一些实施方案中，NGS技术是RNA测序(RNA-Seq)。RNA测序方法已经适用于最常见的DNA测序平台[HiSeq系统(Illumina)、454Genome Sequencer FLX系统(Roche)、Applied Biosystems SOLiD(Life Technologies)、IonTorrent(LifeTechnologies)]。这些平台通常需要将RNA初始逆转录成cDNA。相反，单分子测序仪HeliScope(Helicos BioSciences)能够使用RNA作为测序模板。还证明了在PacBio RS平台上的直接RNA测序的原理验证(Pacific Bioscience)。在一些实施方案中，通过RNA-seq评估、测量、确定和/或量化一种或多种RNA基因产物。
在一些实施方案中，所述参数是或包括蛋白质的水平或量。在一些实施方案中，通过适合的手段测量、评估、检测和/或量化一种或多种蛋白质。适合的方法包括但不限于免疫细胞化学或免疫组织化学、ELISA(包括直接、间接、夹心、竞争、多重和便携式ELISA(参见，例如，美国专利No.7,510,687)、Western印迹(包括一维、二维或更高维度的印迹或其他色谱方法，任选地包括肽测序)、RIA(放射免疫测定)、SPR(表面等离子体共振)、基于核酸或基于蛋白质的适体技术、HPLC(高精度液相色谱)、肽测序(比如Edman降解测序或质谱(例如MS/MS)，任选地与HPLC偶联)，以及任何前述项的微阵列适应性修改(包括核酸、抗体或蛋白质-蛋白质(即，非抗体)阵列)。
在一些实施方案中，所述参数是靶基因的RNA水平或量。在一些实施方案中，通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和/或实时PCR(qPCR)评估靶基因(例如第一或第二病毒基因)和/或对照基因的RNA水平。在一些方面，在同一个测定法中，例如在一步测定法(RT-qPCR)中进行RT-PCR和qPCR。在一些实施方案中，使用一个或多个寡核苷酸引物评估靶基因的RNA水平，所述寡核苷酸引物例如对靶基因的一个或多个序列特异的正向和反向引物。在一些实施方案中，使用一个或多个寡核苷酸引物评估对照基因的RNA水平，所述寡核苷酸引物例如对于对照基因的一个或多个序列特异的正向和反向引物。在一些情况下，分别使用对靶基因或对照基因的序列特异的寡核苷酸探针评估靶基因或对照基因的RNA水平。
在一些实施方案中，在测试样品中，例如，在来自包含异源核酸的细胞的RNA中评估靶基因和/或对照基因的RNA水平。在一些情况下，通过分别确定测试样品中存在的靶RNA和对照RNA的相对量来评估靶基因和对照基因的RNA水平。
在一些情况下，从样品比如从转导的细胞中提取RNA。在一些实施方案中，在RNA提取之前将细胞裂解。因此，在某些情况下，从细胞裂解物中提取RNA。可以使用本领域技术人员已知的试剂和方法分离RNA。
在一些实施方案中，在测试样品中，例如，在来自包含异源核酸的细胞的RNA中评估靶基因和/或对照基因的RNA水平。在一些情况下，通过分别确定测试样品中存在的靶RNA和对照RNA的相对量来评估靶基因和对照基因的RNA水平。
在一些情况下，从样品比如从转导的细胞中提取RNA。在一些实施方案中，在RNA提取之前将细胞裂解。因此，在某些情况下，从细胞裂解物中提取RNA。可以使用本领域技术人员已知的试剂和方法分离RNA。
在一些方面，评估RNA的纯度、完整性和/或浓度。在一些情况下，如果RNA具有高于2的A260/280值，比如在2.000和2.100之间，则认为RNA具有可接受的纯度，例如，没有实质性污染(比如DNA)。
在一些实施方案中，使用来自测试样品的RNA合成cDNA，作为逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)的模板。可以使用许多已知的RT-PCR试剂中的任何一种。
在一些实施方案中，通过实时聚合酶链反应(qPCR)评估一个或多个靶基因的RNA水平。在一些情况下，在qPCR测定法之前，用来自测试样品的RNA作为模板通过RT-PCR合成cDNA。在一些情况下，在一步反应(RT-qPCR)中进行RT-PCR和qPCR。
在一些实施方案中，将对照样品和测试样品分配至多孔格式板(如96孔板)的一个或多个孔中。在一些情况下，各自在多孔板的单个孔中测定对照和/或测试样品。在一些情况下，对照样品和/或测试样品以重复方式运行，比如一式三份。
在一些实施方案中，将对照样品和/或测试样品与一个或多个对于对照基因和/或靶基因的序列特异的寡核苷酸引物混合，所述引物比如正向和反向引物，比如本文所述的任何引物。在一些情况下，将对于对照基因特异的水解探针和/或对靶基因特异的水解探针与测试样品和/或对照样品混合。在一些情况下，将对照样品和/或目标样品与用于进行RT-PCR和/或实时PCR测定的其他试剂如本领域已知的任何试剂混合。
在一些实施方案中，基于通过实时PCR检测和Ct值计算来确定或估计RNA的量。因此，在一些实施方案中，通过实时PCR检测对照基因和/或靶基因扩增子的存在。在一些实施方案中，针对待分析的所有反应确定或计算定义的信号阈值。在一些实施方案中，针对靶核酸，比如病毒RNA或病毒基因，以及一个或多个对照基因，确定达到该信号阈值所需的扩增循环数(阈值循环或“Ct”)。可以使用本领域已知的方法，基于针对靶核酸和对照基因获得的Ct值，确定测试样品中病毒基因或对照基因的存在或量，比如绝对量或相对量(Gibson等人，Genome Research 6:995-1001；Bieche等人，Cancer Research 59:2759-2765,1999；WO97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。
在一些实施方案中，以多重反应方式进行测定法。例如，在一些情况下，靶基因和对照基因的RNA水平的评估在多重反应中进行。同时评估靶基因和对照基因的优点包括，可以证实测定法中的RNA质量，并且将其在各个孔和测定板上标准化。在一些实施方案中，反应(例如孔)中对照基因的存在证实RNA是存在的，并且其质量足以能够经历逆转录和PCR扩增，并且这可以防止由于RNA质量差所致的假阴性检测或反应条件受损。
在一些方面，可以在测定法中将两个或更多个靶基因(例如第一、第二或另外的病毒基因)多重化。在一些情况下，将两个或更多个靶基因与一个或多个对照基因多重化。在一些方面，在多重反应中评估两个或更多个靶基因的优点包括，基因的RNA水平将决定于相同的起始材料，例如具有相同质量的相同量的RNA。在一些实施方案中，评估与靶基因在同一个孔中的一个或多个对照基因可能是有利的，因为对照基因的存在或检测在经历与靶基因相同的反应条件的同一个孔中提供了阳性对照。
在一些实施方案中，所提供的方法包括将测试样品中的病毒RNA水平与已评估的每个病毒基因的参考值或水平比较，并基于所述比较确定测试样品中是否存在复制型病毒。在一些实施方案中，可以直接或间接测量测试样品和/或参考值。
样品制备
a.测试样品
在一些实施方案中，测试样品含有与病毒RNA水平相关、关联和/或预测病毒RNA水平的一个或多个参数。在具体的实施方案中，所述一个或多个参数与生物样品中的病毒RNA水平相关、关联和/或预测所述病毒RNA水平。
在某些实施方案中，测试样品含有一个或多个细胞。在一些实施方案中，细胞源自和/或衍生自生物样品和/或与生物样品相同的来源。在具体的实施方案中，测试样品含有多肽和/或多核苷酸，所述多肽和/或多核苷酸衍生自生物样品的细胞或来自与生物样品相同的来源。在一些实施方案中，测试样品含有RNA。在某些实施方案中，测试样品含有衍生自病毒RNA的DNA，例如cDNA。在一些实施方案中，测试样品含有蛋白质。
在某些实施方案中，测试样品含有一种或多种基因表达产物，例如，反映基因例如靶病毒RNA基因的存在和/或活性、与之关联和/或相关的多肽和/或多核苷酸。在某些实施方案中，测试样品含有一个或多个多肽，其反映基因例如靶病毒RNA基因的存在和/或活性、与之关联和/或相关。在一些实施方案中，所述多肽是或包括经修饰的多肽，例如二甲基化、三甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化、糖基化、脂化、磺化和/或亚硝基化多肽，其反映基因例如靶病毒RNA基因的存在和/或活性、与之关联和/或相关。在具体的实施方案中，测试样品含有一个或多个多核苷酸，其反映基因例如靶病毒RNA基因的存在和/或活性、与之关联和/或相关。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸是或包括编码病毒基因例如靶病毒基因的RNA。在某些实施方案中，一个或多个多核苷酸是或包括DNA，例如cDNA，其衍生自编码病毒基因例如靶病毒基因的RNA。
在某些实施方案中，测试样品含有取自、衍生自和/或源自细胞的参数。在具体的实施方案中，细胞被包含在测试样品中。在具体的实施方案中，测试样品含有取自、源自和/或衍生自生物样品和/或与生物样品相同的来源的细胞。在某些实施方案中，细胞来自生物样品。在具体的实施方案中，细胞来自与生物样品相同的来源。在一些实施方案中，测试样品含有来自细胞的RNA。在某些实施方案中，测试样品含有DNA，例如cDNA，其衍生自来自细胞的RNA，所述细胞例如来自生物样品或与生物样品相同的来源的细胞。
在一些实施方案中，细胞，例如来自生物样品和/或来自与生物样品相同的来源的细胞，是已经与处理和制备工程化细胞相结合产生的细胞，比如用于过继细胞疗法的细胞和/或为这种用途配制的那些细胞，例如，在包含药学上可接受的赋形剂(recipient)或冷冻保存剂的药物组合物中的细胞。在一些实施方案中，通过所述方法评估的细胞，例如来自生物样品和/或来自与生物样品相同的来源的细胞，其在一些方面可以是对照细胞，其来自病毒包装细胞系(VPC)、主细胞库(MCB)或工作细胞库(WCB)。在一些实施方案中，使用被设计为合成逆转录病毒蛋白的VPC来产生病毒载体，所述逆转录病毒蛋白是产生功能性逆转录病毒载体颗粒所需的。在一些实施方案中，VPC不包括载体基因组。在一些实施方案中，MCB包含为用作包装细胞系而建立或认证的细胞，比如VPC。这样的细胞通常能够产生高滴度或高质量的病毒载体颗粒。在一些实施方案中，WCB用于制备多批或多个批次的病毒载体颗粒。在一些实施方案中，制造病毒载体批次包括：将来自工作细胞库、主细胞库或培养基中的细胞系的种子小瓶在适当条件下扩大培养。在一些实施方案中，如根据证明最大载体产率时期的初步实验确定的，持续数天收获含有载体颗粒的上清液批次。在一些情况下，可以对含有病毒载体的上清液进行有限的纯化步骤以去除细胞碎片。在一些实施方案中，作为批签发测试的一部分，测试批量收获上清液的复制型病毒。
在一些实施方案中，细胞，例如来自生物样品和/或来自与生物样品相同的来源的细胞是用于瞬时产生病毒载体颗粒的包装细胞或宿主细胞。在一些实施方案中，可以通过瞬时生产方法产生病毒载体颗粒，所述瞬时生产方法需要将编码载体基因组和包装构建体的质粒共转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，当生产慢病毒载体时，瞬时生产可能是有利的，因为部分地由于某些包装组分(例如HIV gag和VSV-G)的潜在细胞毒性作用，用于慢病毒载体的VPC并不能广泛获得。在一些实施方案中，瞬时生产方法可用于产生γ-逆转录病毒载体。在一些实施方案中，瞬时生产绕过了对VPC的需要。通常以类似于用于VPC的主细胞库和工作细胞库的那些测试的方式来扩增和表征用于瞬时病毒载体颗粒生产的细胞，以确保细胞产生高滴度、高质量的病毒载体颗粒。
在一些实施方案中，所得载体制剂具有高水平的在转染过程中使用过的污染性质粒DNA。因此，在一些实施方案中，瞬时产生的病毒载体颗粒可以经历另外的去除质粒DNA的步骤，比如DNA酶消化，然后进行随后的纯化步骤。
在一些实施方案中，所得载体制剂具有可检测水平的污染性核酸，包括在转染过程中使用过的污染性质粒DNA和在病毒生产过程中产生的RNA，包括来自VPC或用于瞬时病毒载体颗粒生产的细胞的污染性RNA。因此，在一些实施方案中，经选择用于所述检测RCR的方法中的靶基因能够区分污染性核酸的背景量、水平或浓度与指示样品中RCR的存在、不存在、量、浓度或风险的病毒RNA的量、水平或浓度。
在一些实施方案中，通过所提供的方法和/或组合物评估的细胞(例如，测试样品的细胞、生物样品的细胞和/或与生物样品相同的来源的细胞)已被转导为含有异源核酸和/或编码异源蛋白质的核酸或其他核酸或多肽产物(例如人或人源重组蛋白)。在一些实施方案中，异源核酸编码结合分子，比如重组受体，比如嵌合抗原受体(CAR)或转基因T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，所述细胞构成这种细胞的群、含有这种细胞和/或富集这种细胞的组合物，例如其中表达结合分子的细胞构成组合物中的总细胞或某种类型的细胞(比如T细胞或CD8+或CD4+细胞)的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多百分比。在一些实施方案中，所述细胞是原代T细胞。其中这些组合物是药物组合物和给药制剂，比如用于过继细胞疗法。
在一些实施方案中，测试样品包含来自基因工程化细胞的RNA，所述细胞表达异源核酸和/或编码异源蛋白质的核酸或其他核酸或多肽产物(例如人或人源重组蛋白)。细胞通常是真核细胞，比如哺乳动物细胞，并且典型地是人细胞。在一些实施方案中，细胞，例如测试样品和/或生物样品的细胞，来源于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，比如先天性或适应性免疫的细胞，例如髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，例如多能和多能性干细胞，包括诱导的多能性干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，细胞是原代细胞，比如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞，例如来自测试样品、生物样品和/或来自与生物样品相同的来源的细胞，包含通过基因工程引入的一个或多个核酸，并由此表达这种核酸的重组或基因工程产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常在细胞或从细胞获得的样品中不存在，比如从另一生物或细胞获得的核酸，例如，通常在被工程化的细胞中和/或从中获得这种细胞的生物中未发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，比如在自然界未发现的核酸，包括编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，可以在转导细胞或工程化细胞的制备、生产或制造中的任何点评估复制型病毒的存在或不存在，所述细胞包括被转导或将要或已经被转导用于过继性细胞疗法和受试者的治疗后监测的细胞。用于处理细胞的示例性步骤包括涉及细胞的分离、分开、选择、培养(例如，刺激细胞，例如诱导其增殖和/或活化)、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤，包括已知的和/或本文所述的那些步骤。在具体的实施方案中，处理步骤包括用病毒载体颗粒转导细胞，其中与病毒载体颗粒温育的至少一部分在启动转导的封闭系统或封闭室中进行。所述方法可以进一步和/或替代地包括其他处理步骤，例如用于分离、分开、选择、培养(例如，刺激细胞，例如诱导其增殖和/或活化)、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制细胞的步骤。在一些实施方案中，测试样品从已经受转导并且然后例如在37℃下培养的细胞获得，所述培养多于或多于约1天、2天或3天，比如通常多于4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多时间。
在一些实施方案中，测试样品和/或生物样品包含来自在基因工程制造过程的任何阶段的细胞的RNA。在一些实施方案中，测试样品含有衍生自RNA的DNA，所述RNA来自在基因工程制造过程的任何阶段的细胞。例如，测试样品可包含来自已经用编码重组和/或异源分子的病毒载体颗粒转导的细胞的RNA。在一些实施方案中，测试样品可包含衍生自RNA的DNA，所述RNA来自已经用编码重组和/或异源分子的病毒载体颗粒转导的细胞。在一些实施方案中，测试样品获自含有细胞例如自体或同种异体细胞的样品(例如生物样品)，所述细胞通过用编码抗原受体(例如CAR)的异源核酸转导而被工程化并经过培养或扩增，例如以供与过继细胞疗法结合使用。在一些情况下，测试样品含有RNA或衍生自RNA的DNA，所述RNA来自这样的已经冷冻保存的转导细胞，其在一些方面被称为冷冻保存的药物产品(CDP)。在一些情况下，测试样品含有RNA或衍生自RNA的DNA，所述RNA来自这样的已经配制为用于施用于受试者的转导细胞，其在一些方面被称为配制药物产品(FDP)。在一些实施方案中，从受试者中获得测试样品，所述获得在这样的受试者接受了包含已经例如用编码重组和/或异源分子(例如CAR)的病毒载体颗粒转导的细胞的治疗之后。在一些实施方案中，作为对照，对于未经受转导和/或基因工程的患者匹配的对照样品，可以进行所提供的方法，所述对照样品可以是含有将要用于转导的选定细胞或富集细胞的样品。在一些实施方案中，这种患者匹配的对照样品可以是冷冻保存的样品，其在一些情况下被称为冷冻保存的材料(CMAT)。在一些实施方案中，从细胞中分离测试样品RNA。在一些情况下，从约1x 104个、1x105个、1x 106个、1x 107个或更多个细胞分离RNA。在一些实施方案中，从1x 106个细胞分离RNA。在一些情况下，从构成样品或其选定部分的所有或基本上所有细胞分离RNA。
在一些实施方案中，将细胞与一种或多种细胞刺激剂一起温育，所述细胞刺激剂是细胞结合剂，比如抗原结合试剂，比如抗体，其能够诱导细胞内信号转导和/或细胞增殖。在一些实施方案中，将细胞与抗CD3/抗CD28珠一起温育，包括与其混合。
b.对照样品
在一些方面，对一个或多个对照样品另外执行所提供的方法。在一些实施方案中，使用质粒标准对照作为测定法的PCR扩增部分的对照。在一些方面，质粒标准对照含有对照基因，比如管家基因。在一些实施方案中，对照基因是b-肌动蛋白。
在一些实施方案中，质粒标准对照包含编码对照基因或其部分和靶基因或其部分的核酸。示例性质粒标准对照是或包括pActin-MMLV gag(SEQ ID NO:30)或pActin-GaLV(SEQ ID NO:34)。在一些实施方案中，编码靶基因和对照基因两者的质粒能够转录编码靶基因和对照基因的相似水平的RNA。在一些实施方案中，编码对照基因的序列与编码靶基因的序列可操作连接，使得两个序列被共转录。在一些实施方案中，两个序列共转录为单个核酸。在一些实施方案中，两个序列以相似的速率共转录为单独的核酸和/或产生相似量的RNA转录物。在一些实施方案中，对照基因和靶基因的转录由同一个启动子控制。在一些实施方案中，对照基因和靶基因的转录由不同的启动子控制。在一些情况下，使用每反应(例如孔)106至101个拷贝的质粒标准对照稀释系列。
在一些实施方案中，在测定法中使用无模板对照(NTC)。在一些方面，无模板对照仅含有水和PCR试剂。在一些情况下，无模板对照提供关于PCR试剂污染状态的信息。
在一些实施方案中，使用无逆转录酶(-RT)对照。在一些方面，-RT对照包含测试样品或对照样品，但没有逆转录酶。结果，RT-PCR不产生扩增子。因此，在一些情况下，-RT样品用于评估RNA模板的纯度和/或检测污染性DNA。
在一些方面，使用不含靶基因拷贝的阴性对照。在一些实施方案中，来自不表达靶基因的细胞系的RNA用作阴性对照。在一些情况下，与测试样品相比可以相似的浓度使用阴性对照。
在一些实施方案中，针对在RNA分离程序过程中的污染，使用含有未曾用编码重组和/或异源分子的病毒载体颗粒转导的来自患者匹配的材料的RNA的过程中(in-process)对照作为对照。
在一些实施方案中，评估含有靶基因RNA(例如第一或第二病毒基因)的阳性对照。在一些方面，基于测定法的靶基因RNA水平的检测限，建立用于该测定法的阳性对照。在一些情况下，对于阳性对照，以等于或稍高于测定法检测限的量使用来自表达靶基因的细胞系的RNA。在一些方面，基于靶基因RNA的已知水平或最大可接受水平，建立用于该测定法的阳性对照。在一些情况下，对于阳性对照，以靶基因RNA的已知或最大可接受水平的量使用来自表达靶基因的细胞系的RNA。在一些实施方案中，将这个阳性对照样品的RNA水平用作参考值，用于与如下所述的测试样品比较。在一些方面，使用无RT对照来证实或评估RNA纯度。
引物和探针
在一些实施方案中，使用一个或多个寡核苷酸引物评估在测试样品和/或对照样品中的靶基因，例如第一病毒基因和/或第二病毒基因。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对靶基因的序列是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对于对照基因的序列是特异的。在一些方面，一个或多个寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物。因此，在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物包括一对引物。在一些情况下，该对引物含有正向和反向引物，每个引物对靶基因或对照基因的序列是特异的。在一些方面，正向和反向引物对相同靶基因或对照基因的不同序列是特异的。
在一些实施方案中，所提供的引物和探针可用于检测样品例如测试样品或生物样品中与复制型逆转录病毒比如复制型γ-逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)相关的靶病毒基因和/或病毒多核苷酸序列。在具体的实施方案中，所提供的探针和引物可用于检测与复制型逆转录病毒相关的靶病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述复制型逆转录病毒源自用于转导生物样品的细胞的病毒载体和/或由其产生。在某些实施方案中，所提供的引物和探针可用于检测病毒载体中复制能力所需的靶病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述病毒载体用于转导样品中的细胞。
在一些实施方案中，寡核苷酸引物对靶基因的DNA形式是特异的。在一些方面，寡核苷酸引物对靶基因的RNA形式是特异的。
在一些方面，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)。在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如病毒vpr、vif、vpu、vpx、nef和/或Tat基因的序列是特异的(例如，与之结合)。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对来自病毒的基因的一部分是特异的，所述病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。在一些实施方案中，寡核苷酸引物对来自其他病毒的基因可以是特异的，所述病毒比如水泡性口炎病毒(VSV)、肝炎病毒或流感病毒。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对GaLV env、VSVG env或MMLV gag序列的一部分是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对在SEQ ID NO:25、26或27中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分或这样的序列的一部分是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4-5、16-17、19-20或22-23中列出的一个或多个序列。
在一些情况下，对靶基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物对GaLV env基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:25中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4或5中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:4中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:5中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。因此，在一些方面，正向引物含有在SEQ ID NO:4中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:5中列出的序列。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对VSVG env基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:26中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对MMLV gag基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:27中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:16-17、19-20或22-23中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:16、19或22中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:17、20或23中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:16中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:17中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:19中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:20中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:22中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:23中列出的序列。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对rev基因序列的一部分，比如在SEQ IDNO:33中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:38-39中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:38中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ IDNO:39中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ IDNO:38中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:39中列出的序列。在一些方面，对于对照基因例如肌动蛋白特异的一个或多个寡核苷酸引物与对照基因序列的一部分结合。在一些情况下，当对照基因是肌动蛋白时，对于对照基因序列特异的寡核苷酸引物对肌动蛋白序列的一部分是特异的(例如与之结合)。在一些实施方案中，对于对照基因序列的一部分特异的一个或多个寡核苷酸引物对在SEQ ID NO:28中列出的序列的一部分是特异的。在一些情况下，对肌动蛋白特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:1-2、8、10-11或13-14中列出的一个或多个序列。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对肌动蛋白基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:28中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:1-2、7-8、10-11或13-14中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:1、7、10或13中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:2、8、11或14中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:1中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:2中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:1中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:8中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:10中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:11中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:13中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:14中列出的序列。
在一些实施方案中，使用寡核苷酸引物和荧光染料评估靶基因(例如第一病毒基因和/或第二病毒基因)和/或对照基因。示例性双链核酸特异性染料包括但不限于SYBRTMGreen I、SYBRTM Gold、溴化乙锭、溴化丙锭、Pico Green、Hoechst 33258、YO-PRO-I和YO-YO-I、Boxto、 LC GREEN和9。在一些情况下，荧光染料是SYBRTM Green。在一些实施方案中，寡核苷酸引物对靶基因序列的一部分是特异的。在一些实施方案中，寡核苷酸引物对于对照基因序列的一部分是特异的。在一些实施方案中，寡核苷酸引物对与一个或多个其他寡核苷酸引物相同的靶基因或对照基因的序列是特异的。因此，在一些情况下，对靶基因或对照基因的序列特异的寡核苷酸引物与正向引物和反向引物(例如分别对相同的靶基因或对照基因特异的引物对)一起使用。
在一些实施方案中，使用水解探针评估靶基因(例如第一病毒基因和/或第二病毒基因)和/或对照基因。在一些情况下，水解探针对靶基因序列的一部分是特异的。在一些情况下，水解探针对于对照基因序列的一部分是特异的。在一些方面，水解探针对与一个或多个寡核苷酸引物相同的靶基因或对照基因的序列是特异的。因此，在一些情况下，对靶基因或对照基因的序列特异的水解探针与正向引物和反向引物(例如分别对相同的靶基因或对照基因特异的引物对)一起使用。
在一些实施方案中，水解探针包含荧光模块或标记物。在一些实施方案中，荧光模块或标记物是荧光共振能量转移(FRET)模块或标记物(参见，例如，美国专利No.4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)。在一些实施方案中，当供体荧光模块和相应的受体荧光模块彼此位于一定的距离内时，在两个荧光模块之间发生能量转移，其可以被可视化或以其他方式被检测和/或定量。当供体被具有适合波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移给受体。受体通常以具有不同波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在一些实施方案或系统中，借助于包括基本上非荧光的供体模块的生物分子，非荧光能量可以在供体和受体模块之间转移(参见，例如，美国专利No.7,741,467)。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针可含有供体荧光模块和相应的猝灭剂，所述猝灭剂可以是或不是荧光的。在一些实施方案中，猝灭剂以不同于光的形式使转移的能量消散。在一些实施方案中，当寡核苷酸探针是完整的时，在两个荧光模块之间发生能量转移，使得来自供体荧光模块的荧光发射被猝灭。在一些实施方案中，在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的寡核苷酸探针被例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割，使得供体荧光模块的荧光发射不再被猝灭。为此目的的示例性寡核苷酸探针描述于，例如，美国专利No.5,210,015；5,994,056和6,171,785。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRATM。常用的暗猝灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)(BiosearchTechnologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)和BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。
在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的水解探针对例如病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)。在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的水解探针对例如病毒vpr、vif、vpu、vpx、nef和/或Tat基因的序列是特异的(例如，与之结合)。
在一些实施方案中，水解探针对逆转录病毒序列的一部分是特异的，所述逆转录病毒比如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。在一些实施方案中，水解探针对水泡性口炎病毒(VSV)、肝炎病毒或流感病毒的序列的一部分是特异的。
在一些情况下，水解探针对GaLV env、VSVG env或MMLV gag的序列是特异的。在一些情况下，水解探针含有在SEQ ID NO:6、18、21或24中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对GaLV env基因序列，比如在SEQ ID NO:25中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ IDNO:6中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对VSVG基因的序列或序列的一部分，比如在SEQ ID NO:26中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ ID NO:40中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对MMLV gag基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:27中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ ID NO:18、21或24中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对rev基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:33中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ IDNO:37中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对于对照基因例如肌动蛋白的序列的一部分，比如在SEQID NO:28中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。因此，在一些方面，对于对照基因序列特异的水解探针对肌动蛋白序列是特异的(例如与之结合)。在一些情况下，水解探针含有在SEQ ID NO:3、9、12或15中列出的序列。
参考水平或值
在一些实施方案中，如果一个或多个参数的量、水平或浓度高于或低于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在，所述参考值可以例如从含有靶基因的阳性对照样品直接或间接测得。在一些实施方案中，如果与一个或多个靶基因的量、水平或浓度正相关的一个或多个参数的量、水平或浓度高于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在。在具体的实施方案中，如果与一个或多个靶基因的量、水平或浓度负相关的一个或多个参数的量、水平或浓度低于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在。在一些实施方案中，参数和/或参考水平或值是和/或指示靶基因的水平或量。在一些实施方案中，参数和/或参考水平或值是和/或指示靶基因(为病毒RNA基因)的水平或量。
如果一个或多个靶基因的RNA水平高于参考值，则可确定复制型逆转录病毒的存在，所述参考值可以例如从含有靶基因和/或含有指示靶基因的量或水平的参数的阳性对照样品直接或间接测得。
在一些情况下，测试样品的复制型病毒结果报告为“检出复制型病毒RNA”。在一些情况下，测试样品的复制型病毒结果报告为“未检出复制型病毒RNA”。在一些方面，测试样品的复制型病毒结果基于靶基因的RNA水平与参考值的比较。
在一些实施方案中，参考值或水平是RNA水平或RNA水平的替代读出(例如CT值)，或基于RNA水平或RNA水平的替代读出(例如CT值)得出，其指示在样品中存在靶RNA的阈值，所述阈值指示样品中存在RCR的存在或风险。在一些实施方案中，基于在用于检测样品中靶RNA的相似测定条件下的先前测试，例如通过使用模型复制型病毒或靶基因的阳性RNA对照，可以预先确定参考值。在一些实施方案中，参考值可以基于相同测定法中的阳性对照运行。
在一些实施方案中，通过阳性对照样品建立参照值，所述阳性对照样品含有与已知水平的靶基因相关和/或指示靶基因的参数和/或含有处于约或稍高于依照测定法的参数检测限的参数。在一些实施方案中，通过使用已知浓度的阳性对照校准测定法来建立参考值，使得测定法足够灵敏以检测来自一定体积的样品(例如生物样品)或一定体积或量的细胞或总体中的含有一个或多个复制型病毒的细胞或颗粒的参数或由其产生的参数。在一些实施方案中，校准参考值以检测来自一定体积的测试样品或具有置信区间的一定体积或量的细胞中的一个复制型病毒颗粒的参数。在一些实施方案中，置信区间为50％、75％、80％、90％，并且通常为或约为或至少为或至少约为95％、96％、97％、98％或99％；在一些方面，其为至少97％。
在一些实施方案中，通过含有靶基因的阳性对照样品建立参照值，所述靶基因处于已知水平和/或处于约或稍高于依照测定法的靶基因的检测限。在一些实施方案中，通过使用已知浓度的阳性对照校准测定法来建立参考值，使得测定法足够灵敏以检测来自一定体积的测试样品或一定体积或量的细胞或总体中的含有一个或多个复制型病毒的细胞或颗粒的RNA。在一些实施方案中，校准参考值以检测来自一定体积的测试样品或具有置信区间的一定体积或量的细胞中的一个复制型病毒颗粒的RNA。在一些实施方案中，置信区间为50％、75％、80％、90％，并且通常为或约为或至少为或至少约为95％、96％、97％、98％或99％；在一些方面，其为至少97％。
在一些实施方案中，基于已知量的比如存在于阳性对照和/或参照对照样品中的病毒基因RNA计算参考值。在一些实施方案中，参考对照样品包含已知量的RNA和/或靶RNA，并且/或者可用于确定测定法的检测限和/或设定测定法的参考值。在一些实施方案中，阳性对照或参考对照样品包含来自含有复制型病毒的样品的RNA，所述复制型病毒比如对照病毒，如野生型病毒。在一些实施方案中，对照病毒包含或编码靶基因RNA序列的相同序列或反向互补序列。在一些实施方案中，对照病毒是野生型病毒，比如野生型GaLV、MMLV或本文所述的任何病毒。
在一些实施方案中，基于阳性对照中的Ct值确定RNA的参考值。因此，在一些实施方案中，可以将测试样品中靶基因的Ct值与阳性对照中靶基因的Ct值比较。在一些实施方案中，鉴定为包含或被认为含有或可能含有复制型病毒的样品的Ct值低于参考和/或阈值Ct值。在一些实施方案中，鉴定为不包含或被认为不包含复制型病毒的样品的Ct值高于参考和/或阈值Ct值。
在一些实施方案中，参考值基于含有一定量的RNA或其替代读出的阳性对照，所述替代读出比如对应于RNA(比如靶RNA，例如特定病毒基因如GaLV env的RNA)的这个量的CT值，其等于或约等于、高于或稍高于测定法的检测限。在一些实施方案中，RNA的量为或等于或约为或稍高于(或者高达或高达约)或等于或等于约0.1、0.2、0.3、0.5、0.75或1.0pg的靶RNA或与其对应的读出，比如与其对应的CT值，并且在一些方面为2、3、4、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750或1000pg的靶基因RNA。在一些实施方案中，参考值等于或大约为或稍高于0.75pg的靶基因RNA，或者是对应于这个量的CT值。在替代实施方案中，按照测试样品中给定数目的细胞，参考水平是在测试样品中给定数目的RCR+细胞(比如样品中每百万个或每1000万或每1亿个细胞中的1百万个、2百万个、3百万个、4百万个、5百万个、6百万个、7百万个、8百万个、9百万个、1000万个、1100万、1200万个、1300万个、1400万个或1500万或2000万个RCR+细胞，在一些方面1000万个或更少的RCR+细胞)中的RNA量或与其对应(比如对应于具有这样的浓度或数目或相对数的RCR+细胞的对照)的CT值。因此，在一些实施方案中，如果确定靶基因RNA的量大于参考值，则可以检出复制型病毒。
在一些实施方案中，参考值是德尔塔CT(ΔCT)值。在一些实施方案中，参考值是对照样品如阳性对照或阴性对照的ΔCT。在一些实施方案中，ΔCT值是在给定样品内相对于对照基因标准化的靶基因的CT值。在一些实施方案中，ΔCT＝给定样品内CT(靶病毒RNA)-CT(对照基因)。在一些实施方案中，将样品的ΔCT值与参考值比较，所述参考值为对照样品的ΔCT值。在一些实施方案中，将样品的ΔCT值与参考值比较，所述参考值为对照样品的ΔCT值。在一些实施方案中，将样品的ΔCT值与已知的或实验确定为ΔCT值的参考值进行比较，所述ΔCT值等于或大约等于或稍高于阈值水平或最小可检测水平或与其对应的读出；所述参考值是在阳性对照样品中检测到的参数的ΔCT值、和/或指示RNA量的参数的值；和/或所述参数的水平指示生物样品中病毒RNA的存在或不存在；和/或所述病毒RNA包括编码第一病毒基因的核酸；和/或所述异源核酸编码异源基因产物。
在一些实施方案中，ΔΔCT＝ΔCT(样品)-ΔCT(对照样品)。在一些实施方案中，依照测定法被认为具有ΔCT(样品)值的样品被认为是阳性的，所述ΔCT(样品)值指示所述样品具有与相应的ΔCT(对照样品)相同或更多的靶病毒RNA。在一些实施方案中，如果ΔΔCT指示样品中具有与对照样品中相同或更多的靶病毒RNA，则认为样品是阳性的。在一些实施方案中，使用所述方法测试多种病毒RNA中的两种或更多种。
在一些实施方案中，如果观察到在测定法中含有测试样品的孔中的Ct值(或重复的平均值)(例如对于给定靶标)大于阳性对照样品的Ct值，则测试样品中的靶基因RNA将被认为或指示低于参考值，并且包含转导细胞的样品被鉴定为“未检出复制型病毒RNA”。在一些实施方案中，将鉴定为“未检出复制型病毒RNA”的转导细胞放行(release)，例如用于进一步处理和/或用于治疗。
在一些方面，如果观察到在含有测试样品的测定法的孔中的Ct值(或重复的平均值)小于阳性对照样品的Ct值，则这种测试样品的病毒RNA将被认为高于参考值和/或这种测试样品将被鉴定为“检出复制型病毒RNA”。
在一些实施方案中，不能计算含有测试样品的测定法的孔中的Ct值(或重复的平均值)。当在孔中检测到的靶标或对照扩增的量未在规定数量的循环内达到阈值水平时，这在一些实施方案中可以发生。在一些实施方案中，这样的结果指示不存在来自测试样品中存在的复制型病毒的RNA，和/或来自测试样品中复制型病毒的RNA的量使用该测定法是不可检出的。在一些实施方案中，将这样的测试样品鉴定为“未检出复制型病毒RNA”。在一些实施方案中，将通过所提供的方式证实为不含复制型病毒RNA的转导细胞放行，例如用于进一步处理和/或用于治疗。
在一些实施方案中，在多重反应或单独的反应中评估两个或更多个靶基因时，如果所述靶基因之一的RNA高于其参考值时，则检出来自复制型病毒的RNA的存在。在一些方面，在多重反应或单独的反应中评估两个或更多个靶基因时，仅当至少两个和多达所有两个或更多个靶基因的RNA大于各自对应的参考值时，才检出来自复制型病毒的RNA的存在。例如，在一些情况下，评估两个靶基因，例如第一和第二病毒基因，并且如果第一和第二病毒基因的RNA分别大于第一和第二病毒基因的参考值，则检出来自复制型病毒的RNA的存在。在一些这样的方面，当第一或第二病毒基因中仅一个的RNA分别高于第一或第二参考值时，未检出来自复制型病毒的RNA的存在。在其他实施方案中，在评估两个或更多个靶基因时，即使仅一个(或少于全部)靶基因的RNA大于其相应的参考值，也将视为或检出来自复制型病毒的RNA的存在。
在一些实施方案中，当在测试样品中未检出来自复制型病毒的RNA时，认为在自其已经分离RNA的细胞或样品中不存在复制型病毒颗粒。
测定参数
在一些实施方案中，所述测定法是聚合酶链反应(PCR)，包括逆转录酶(rt)PCR、微滴式数字PCR、实时和定量PCR方法、Northern印迹测定法；Southern印迹测定法；基于阵列的测定法，包括印迹阵列、微阵列或原位合成阵列；或基于测序的测定法。在一些实施方案中，所述测定法是下一代测序(NGS)测定法，例如RNA-seq。在一些实施方案中，所述测定法是或包括免疫细胞化学或免疫组织化学、ELISA、Western印迹、肽测序、任选地具有HPLC的质谱法(比如MS/MS)。
在具体的实施方案中，所述测定法是RT-PCR和/或实时PCR测定法。在一些实施方案中，对样品(例如测试样品)进行RT-PCR，所述样品是或含有RNA(例如病毒RNA)或DNA(例如衍生自病毒RNA的cDNA)。
在具体的实施方案中，RNA从样品获得。用于从样品获得和纯化RNA的适合技术和方法是已知的。例如，用于从样品分离RNA的试剂和试剂盒是可商购的，包括但不限于RNeasy和RNeasy plus试剂盒(Qiagen)。
在一些实施方案中，cDNA获自RNA或衍生自RNA。通过逆转录从RNA模板合成DNA，产生互补DNA(cDNA)。逆转录酶(RT)使用RNA模板和与RNA的3'端互补的短引物来指导第一链cDNA的合成，所述第一链cDNA可以直接用作聚合酶链反应(PCR)的模板。逆转录和PCR(RT-PCR)的这种组合允许检测样品中的低丰度RNA，并产生相应的cDNA，由此促进低拷贝基因的克隆。在一些实施方案中，用于从RNA生成cDNA的适合技术和方法是已知的，例如借助于逆转录。
在一些方面，通过逆转录酶(RT)反应进行逆转录，以生成cDNA，其在一些方面进而用作例如使用引物的PCR扩增的模板，所述引物被设计为扩增靶RNA或对照RNA或由其衍生的cDNA中的一种或多种的至少一部分。在一些方面，进行一步定量RT-PCR。在一些方面，使用一步法进行RT-PCR，其中反应混合物包括逆转录酶(RT)和聚合酶(如TAQ聚合酶)和任选的RNA酶抑制剂。在一些方面，所述混合物是RNA UltraSenseTM一步定量RT-PCR系统，包括RNA UltraSenseTM酶混合物(包括III RT、Taq DNA聚合酶和RNaseOUTTM核糖核酸酶抑制剂)(ThermoFisher Scientific)。
在一些实施方案中，以一个或多个步骤进行RT-PCR。在一些实施方案中，RT-PCR包括初始变性、扩增循环和/或最终延伸步骤。在某些实施方案中，进行RT-PCR以测量、检测、评估和/或量化靶基因和对照基因。在某些实施方案中，用任何适合的试剂进行靶基因和对照基因的检测，包括但不限于来自可商购的试剂盒的试剂，例如但不限于RNA UltraSense一步定量RT-PCR酶混合物和RNA UltraSense一步定量RT-PCR 5X反应混合物(ThermoFisher Scientific)。
在一些实施方案中，在初始保持阶段或保持步骤进行RT-PCR。在一些实施方案中，保持步骤进行或持续约2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、12分钟、15分钟、20分钟或超过10分钟；或者在约10分钟至20分钟之间，包括端值。在具体的实施方案中，初始保持步骤在或在约40℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃，或在40℃至60℃之间；35℃至45℃之间，或45℃至60℃之间(包括端值)进行。在某些实施方案中，在初始保持步骤或阶段在50℃的温度下进行RT-PCR 15分钟。
在一些实施方案中，在初始变性步骤进行RT-PCR。在一些实施方案中，初始变性步骤进行或进行约15秒、30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或大于10分钟。在具体的实施方案中，初始变性步骤在或在约85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃，或在85℃至95℃之间；在90℃至96℃之间，或在94℃之99℃之间进行。在一些实施方案中，在初始变性步骤在95℃的温度下进行RT-PCR 2分钟。
在一些实施方案中，RT-PCR测定法包括两个或更多个扩增循环。在一些实施方案中，RT-PCR测定法包括2、5、10、15、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45个、或多于45个循环。在一些实施方案中，RT-PCR测定法包括35至40个之间的扩增循环，包括端值。在某些实施方案中，RT-PCR测定法包括40个循环。
在一些实施方案中，扩增循环是两步扩增循环。在一些实施方案中，两步扩增循环包括第一步和第二步。在一些实施方案中，第一步在或在约85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃，或在85℃至95℃之间；在90℃至96℃之间，或在94℃之99℃之间(包括端值)进行。在一些实施方案中，第一步进行或进行约5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒，或5秒至30秒、15秒至45秒、或30秒至120秒，包括端值。在一些实施方案中，扩增循环的第一步是温度95℃持续15秒。
在某些实施方案中，两步扩增循环的第二步在或在约55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃、或在50℃至70℃、55℃至65℃、或57℃至63℃之间(包括端值)进行。在一些实施方案中，第二步进行或进行约5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒，或5秒至30秒、15秒至45秒、或30秒至120秒，包括端值。在一些实施方案中，循环的第二步是温度60℃持续60秒。
在一些实施方案中，RT-PCR反应包括最终延伸步骤。在一些实施方案中，最终延伸步骤在50℃至75℃之间、60℃至70℃之间、65℃至70℃之间(包括端值)进行。在一些实施方案中，最终延伸步骤进行或进行约60秒、75秒、90秒、105秒、120秒、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或大于10分钟。
在一些实施方案中，扩增循环包括三个步骤。在一些实施方案中，扩增循环包括变性步骤、引物退火步骤和引物延伸步骤。在一些实施方案中，变性步骤为5秒至30秒、15秒至45秒、或30秒至120秒，包括端值。在某些实施方案中，变性步骤的温度在80℃至100℃之间。在具体的实施方案中，引物退火步骤为5秒至30秒、15秒至45秒、或30秒至120秒，包括端值。在一些实施方案中，引物退火步骤的温度在40℃至60℃之间。在某些实施方案中，引物延伸步骤为5秒至30秒、15秒至45秒、或30秒至120秒，包括端值。在一些实施方案中，引物延伸步骤的温度在60℃至80℃之间。
在一些实施方案中，进行RT-PCR测定法，其中在初始保持步骤或阶段在50℃的温度下进行15分钟，初始变性步骤在95℃的温度下进行2分钟，40个两步扩增循环包括温度95℃持续15秒的第一步和温度60℃持续60秒的第二步。
在一些实施方案中，所述方法包括评估或证实测定法整体上或在具体情况下(如RT-PCR和/或实时PCR测定法)的有效性。在一些情况下，如果满足一个或多个某些测定标准和/或范围，则认为该测定法是有效的或经证实的。在一些方面，这些对于特定的对照或靶样品和/或特定的寡核苷酸引物对是特异的。
例如，在一些情况下，当使用对照基因(例如肌动蛋白，引物组)时，可能希望在对照例比如无模板对照(NTC)样品的测定法的任何孔中未观察到Ct值。在一些实施方案中，当使用靶基因(例如第一或第二病毒基因，引物组)时，希望在无模板对照(NTC)样品的测定法的任何孔中未观察到Ct值。
在一些情况下，希望在质粒标准样品中对照基因(例如肌动蛋白)的斜率在一定的范围之间，比如在约-3.1至约-3.6之间。在一些方面，希望在质粒标准样品中对照基因的效率在或在约90％至110％之间。在一些方面，测定标准包括在质粒标准样品中对照基因的R2值为约或大于约0.90，比如大于或约为0.95、0.98或0.99。在一些实施方案中，测定标准包括在质粒标准样品中对照基因的R2值为约或大于约0.98。
在一些情况下，希望在质粒标准样品中靶基因(例如第一和/或第二病毒基因)的斜率在或在约-3.1至-3.6之间。在一些情况下，希望在质粒标准样品中靶基因的效率在或在约90％至110％之间。在一些方面，测定标准包括在质粒标准样品中靶基因的R2值为约或大于约0.90，比如大于或约为0.95、0.98或0.99。在一些情况下，测定标准包括在质粒标准样品中靶基因的R2值为约或大于或大于约0.98。
在一些实施方案中，希望针对未转导的阴性对照样品的对照基因(例如肌动蛋白，引物组)的Ct值小于或小于约22。在一些情况下，测定标准包括使用靶基因引物组在未转导的阴性对照的每个孔中不存在Ct值。在一些情况下，希望未转导的阴性对照样品的A260/280值高于或高于约2.000。在一些方面，希望未转导的阴性对照样品的A260/280值在或在约2.000至2.100之间。
在一些实施方案中，希望对照基因(例如肌动蛋白，引物组)的Ct值小于或小于约15。在一些方面，测定标准包括在测试样品中对照基因重复的Ct值的标准偏差小于或小于约1，比如小于或小于约0.75、0.5或0.25。在一些情况下，希望在测试样品中对照基因重复的Ct值的标准偏差小于或小于约0.5。在一些情况下，希望测试样品的A260/280值高于或高于约2.000。在一些方面，希望测试样品的A260/280值在或在约2.000至2.100之间。在一些实施方案中，无逆转录酶(-RT)对照样品中对照基因的Ct值比测试样品中对照基因的Ct值高约或高至少约13.2。
组合物、组合、试剂盒和制品
在一些方面提供了用于检测包含转导细胞的样品(例如生物样品)中的复制型病毒的组合物、组合和/或试剂盒。在一些实施方案中，所述组合物、组合和/或试剂盒包含用于评估参数的试剂，所述参数例如细胞(如转导细胞)中的基因RNA水平。在一些实施方案中，试剂包括用于RNA分离、RT-PCR、qPCR和/或RT-qPCR的试剂。在一些方面，所述组合物、组合和/或试剂盒包含一个或多个寡核苷酸引物、一对或多对寡核苷酸引物、和/或一个或多个水解探针。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对靶基因的序列是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对于对照基因的序列是特异的。在一些方面，一个或多个寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物。因此，在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物包括一对引物。在一些情况下，该对引物含有正向和反向引物，每个引物对靶基因或对照基因的序列是特异的。在一些方面，正向和反向引物对相同靶基因或对照基因的不同序列是特异的。
在一些实施方案中，所述组合物、组合和/或试剂盒包含一个或多个水解探针。在一些实施方案中，水解探针包含荧光模块或标记物。上文论述了示例性荧光模块和标记物。
在一些情况下，水解探针对靶基因的序列是特异的。在一些情况下，水解探针对于对照基因的序列是特异的。在一些方面，水解探针对与一个或多个寡核苷酸引物相同的靶基因或对照基因的序列是特异的。因此，在一些情况下，对靶基因或对照基因的序列特异的水解探针与正向引物和反向引物(例如分别对相同的靶基因或对照基因特异的引物对)一起使用。
在一些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测样品例如测试样品或生物样品中的复制型逆转录病毒，比如复制型γ-逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)。在具体的实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测源自病毒载体的复制型逆转录病毒和/或由其生成的复制型逆转录病毒，所述病毒载体用于转导生物样品的细胞。在某些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测病毒载体中复制能力所需的病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述病毒载体用于转导样品中的细胞。在某些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒包括对一个或多个靶基因特异的寡核苷酸引物和探针，例如水解探针。
在一些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测样品例如测试样品或生物样品中的复制型(RCR)。在具体的实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测源自γ-逆转录病毒载体的复制型逆转录病毒和/或由其生成的复制型逆转录病毒，所述γ-逆转录病毒载体用于转导生物样品的细胞。在某些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测γ-逆转录病毒载体中复制能力所需的病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述γ-逆转录病毒载体用于转导样品中的细胞。在一些方面，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)。在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如γ-逆转录病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)，并且/或者对用于生成γ-逆转录病毒载体(例如用于基因递送的复制缺陷型γ-逆转录病毒载体)的env、gag、pol或rev基因是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对GaLV env、VSVG或MMLV gag的序列是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对在SEQ ID NO:25、26或27中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分或这样的序列的一部分是特异的。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4-5、16-17、19-20或22-23中列出的一个或多个序列。
在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的水解探针对例如病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)。在一些情况下，水解探针对GaLV env、VSVG env或MMLV gag的序列是特异的。在一些情况下，水解探针含有在SEQ IDNO:6、18、21或24中列出的序列。
在一些情况下，对靶基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物对GaLV env基因序列，比如在SEQ ID NO:25中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4或5中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:4中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:5中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。因此，在一些方面，正向引物含有在SEQ ID NO:4中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:5中列出的序列。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对MMLV gag基因序列，比如在SEQ IDNO:27中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:16-17、19-20或22-23中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:16、19或22中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:17、20或23中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:16中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:17中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:19中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:20中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:22中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:23中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对MMLV gag基因的序列或序列的一部分，比如在SEQ IDNO:27中列出的序列的一部分、或与这样的序列的一部分具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ ID NO:18、21或24中列出的序列。
在一些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测样品例如测试样品或生物样品中的RCL。在具体的实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测源自γ-逆转录病毒载体的复制型逆转录病毒和/或由其生成的复制型逆转录病毒，所述γ-逆转录病毒载体用于转导生物样品的细胞。在某些实施方案中，所提供的组合物、组合和/或试剂盒可用于检测γ-逆转录病毒载体中复制能力所需的病毒基因和/或病毒多核苷酸序列，所述γ-逆转录病毒载体用于转导样品中的细胞。在一些方面，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)。在一些实施方案中，对靶基因例如第一或第二病毒基因特异的一个或多个寡核苷酸引物对例如γ-逆转录病毒env、gag、pol或rev基因的序列是特异的(例如，与之结合)，并且/或者对用于生成γ-逆转录病毒载体(例如用于基因递送的复制缺陷型γ-逆转录病毒载体)的env、gag、pol或rev基因是特异的。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对VSV-G env基因序列，比如在SEQ IDNO:26中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。
在一些情况下，水解探针对VSVG env基因的序列或序列的一部分，比如在SEQ IDNO:26中列出的序列的一部分、或与这样的序列的一部分具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列是特异的。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对rev基因序列的一部分，比如在SEQ IDNO:33中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:38-39中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:38中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ IDNO:39中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ IDNO:38中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:39中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对rev基因序列的一部分，比如在SEQ ID NO:33中列出的序列、或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的一部分是特异的。在一些这样的方面，水解探针含有在SEQ IDNO:37中列出的序列。
在一些方面，对于对照基因例如肌动蛋白特异的一个或多个寡核苷酸引物与对照基因序列结合。在一些情况下，当对照基因是肌动蛋白时，对于对照基因序列特异的寡核苷酸引物对肌动蛋白序列是特异的(例如与之结合)。在一些实施方案中，对于对照基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物对在SEQ ID NO:28中列出的序列的一部分是特异的。在一些情况下，对肌动蛋白特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:1-2、8、10-11或13-14中列出的一个或多个序列。
在一些情况下，一个或多个寡核苷酸引物对肌动蛋白基因序列，比如在SEQ IDNO:28中列出的序列的一部分、或与这样的序列的一部分具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列是特异的。在一些这样的方面，一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:1-2、8、10-11或13-14中列出的序列。在一些情况下，正向引物包含在SEQ ID NO:1、10或13中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，反向引物包含在SEQ ID NO:2、8、11或14中列出的序列或与这样的序列具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:1中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:2中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:1中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:8中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:10中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:11中列出的序列。在一些实施方案中，正向引物含有在SEQ ID NO:13中列出的序列，反向引物含有在SEQ ID NO:14中列出的序列。
在一些情况下，水解探针对于对照基因例如肌动蛋白的序列或序列的一部分，比如在SEQ ID NO:27中列出的序列的一部分、或与这样的序列的一部分具有至少或约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列是特异的。因此，在一些方面，对于对照基因序列特异的水解探针对肌动蛋白是特异的(例如与之结合)。在一些情况下，水解探针含有在SEQ ID NO:3、9、12或15中列出的序列。
在具体的实施方案中，本文中提供的试剂盒可用于检测样品中的RCR。在具体的实施方案中，试剂盒包括对靶基因特异的寡核苷酸引物和探针，所述靶基因是γ-逆转录病毒基因和/或是用于生成γ-逆转录病毒载体(比如用于基因递送的复制缺陷型γ-逆转录病毒载体)的基因。在具体的实施方案中，试剂盒包括对于对照基因特异的寡核苷酸引物和探针。在一些实施方案中，对照基因是肌动蛋白。在具体的实施方案中，靶基因是GaLV env。在某些实施方案中，靶基因是MMLV gag。在一些实施方案中，靶基因是GaLV env和MMLV gag。
在某些实施方案中，本文中提供的试剂盒可用于检测样品中的RCL。在具体的实施方案中，试剂盒包括对靶基因特异的寡核苷酸引物和探针，所述靶基因是慢病毒基因和/或是用于生成慢病毒载体(比如用于基因递送的复制缺陷型慢病毒载体)的基因。在具体的实施方案中，试剂盒包括对于对照基因特异的寡核苷酸引物和探针。在一些实施方案中，对照基因是肌动蛋白。在具体的实施方案中，靶基因是rev，例如HIV rev。在某些实施方案中，靶基因是VSV-G。在一些实施方案中，靶基因是rev和VSV-G。
病毒载体颗粒和编码的重组和/或异源分子
在一些方面，所提供的方法涉及检测与来自复制型逆转录病毒的RNA相关和/或关联的参数。在一些实施方案中，测量了在含有来自用病毒载体颗粒转导的细胞的RNA或cDNA的测试样品中的参数，所述病毒载体颗粒编码重组和/或异源分子。因此，在一些情况下，病毒载体颗粒已经用于或可用于转导细胞，随后通过所提供的方法评估所述细胞。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒(比如慢病毒或γ-逆转录病毒载体颗粒)在病毒载体的基因组中含有编码重组和/或异源分子(例如基因产物)例如重组或异源蛋白质的核酸，所述重组或异源蛋白质比如重组和/或异源受体，比如嵌合抗原受体(CAR)或其他抗原受体。这样的重组和/或异源分子可包括可溶性蛋白，例如分泌的蛋白质和/或细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述分子是或包括重组受体。这样的重组受体可包括抗原受体，比如功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)，和其他抗原结合受体，比如转基因T细胞受体(TCR)。受体还可以包括其他受体，比如其他嵌合受体，比如与特定配体结合并具有与CAR中存在的那些相似的跨膜和/或细胞内信号转导结构域的受体。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的基因组可包括除编码重组和/或异源分子的核酸以外的序列。这样的序列可包括允许将基因组包装到病毒颗粒中的序列和/或促进编码重组和/或异源分子(例如重组受体，比如CAR)的核酸表达的序列。
在一些实施方案中，核酸编码重组受体和/或嵌合受体，比如异源受体蛋白。重组受体(比如异源受体)可包括抗原受体，比如功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)，和其他抗原结合受体，比如转基因T细胞受体(TCR)。受体还可以包括其他受体，比如其他嵌合受体，比如与特定配体结合并具有与CAR中存在的那些相似的跨膜和/或细胞内信号转导结构域的受体。
在一些实施方案中，重组和/或异源分子(例如基因产物)是可溶性分子，比如免疫调节和/或免疫刺激分子，比如细胞因子，例如IL-2、IL-12、IL-6、41BBL、CD40L，和/或可溶性配体或受体，比如免疫细胞共刺激分子的可溶性配体，例如CD40L、41BBL，或可溶性抗原结合分子，比如scFv。其中所述分子还有表达或转导标志物和已知用于表达载体和/或盒的任何其他分子。
在一些实施方案中，重组抗原受体(例如CAR)与细胞或疾病上的一种或多种配体特异性结合，所述疾病比如癌症、传染性疾病、炎性或自身免疫性疾病、或其他疾病或病症，包括本文所述的那些。示例性抗原包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌-睾丸抗原、癌/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体(ephrine)A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人类高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含8个家族成员A的富含亮氨酸重复序列(LRRC8A)、Lewis Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、生存素、滋养层细胞糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、维尔姆斯瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原、或通用标签相关抗原、和/或生物素化分子，和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在一些实施方案中，受体所靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，比如许多已知的B细胞标志物的任何一种。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(例如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，抗原受体(包括CAR和重组TCR)及其生产和引入包括例如在以下文献中描述的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利No.:6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416，和/或Sadelain等人，Cancer Discov.2013April；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.,2012October；24(5):633-39；Wu等人，Cancer,2012March 18(2):160-75。
在一些实施方案中，由病毒载体颗粒内的核酸编码的重组或异源分子是或包括核酸分子，比如RNA、DNA或人工核酸序列，比如被设计用于干扰靶mRNA的表达或活性的核酸分子，比如短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微RNA(miRNA)。这样的分子可包括被设计用于干扰与促进或抑制免疫细胞活性相关的分子(比如免疫调节剂、免疫抑制分子和免疫检查点分子)的表达或活性的那些核酸分子。在一些实施方案中，核苷酸siRNA或miRNA序列(例如长度为21-25个核苷酸)可以例如通过转录短发夹RNA(shRNA)序列而从表达载体产生，所述短发夹RNA为更长的(例如60-80个核苷酸)前体序列，其随后由细胞RNAi机器加工以产生siRNA或miRNA序列。或者，核苷酸siRNA或miRNA序列(例如长度为21-25个核苷酸)可以例如化学合成。siRNA或miRNA序列的化学合成可从Dharmacon,Inc.(Lafayette,CO)、Qiagen(Valencia,CA)和Ambion(Austin,TX)等公司商购获得。RNA可以为10至30个核苷酸长，比如长度为19-25或21-25个核苷酸。例如，siRNA序列通常以精确的互补性结合靶mRNA内的独特序列，并导致靶mRNA分子的降解。siRNA序列可以结合mRNA分子内的任何位置；siRNA所靶向的序列包括表达感兴趣的多肽的基因、或这种基因的上游或下游调节剂，例如，基因的上游或下游调节剂，比如结合基因启动子的转录因子、与感兴趣的多肽相互作用的激酶或磷酸酶、以及参与能够影响该感兴趣的多肽的调节途径的多肽。miRNA序列通常以精确或较不精确的互补性结合靶mRNA内的独特序列，并导致靶mRNA分子的翻译抑制。miRNA序列可以结合mRNA序列内的任何位置，但通常结合在mRNA分子的3'非翻译区内。
嵌合抗原受体
在一些实施方案中，重组受体和/或异源分子是或包括嵌合抗原受体(CAR)。CAR通常是基因工程改造的受体，其具有与一种或多种细胞内信号转导组分连接的细胞外配体结合结构域。这样的分子通常通过天然抗原受体模拟或接近信号，和/或通过这种受体与共刺激受体联合发信号。
在一些实施方案中，构建了对特定标志物具有特异性的CAR，所述标志物比如在过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的标志物，例如癌症标志物和/或所描述的任何抗原。因此，CAR通常包括一个或多个抗原结合片段、结构域或抗体的一部分、或一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，比如可变重链(VH)或其抗原结合部分、或衍生自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
在一些实施方案中，CAR的细胞外部分，比如其抗体部分，进一步包括间隔物，比如在抗原识别组分(例如scFv)和跨膜结构域之间的间隔区。间隔物可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或修饰形式，比如铰链区，例如IgG4铰链区和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(比如IgG4或IgG1)的恒定区或部分。间隔物的长度与不存在间隔物相比可以在抗原结合后提供增加的细胞反应性。在一些实例中，间隔物的长度为或约为12个氨基酸或其长度不超过12个氨基酸。示例性间隔物包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸、或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出范围的端点之间的任何整数)的那些间隔物。在一些实施方案中，间隔区具有约12个氨基酸或更少，约119个氨基酸或更少，或约229个氨基酸或更少。示例性间隔物包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链、或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔物包括但不限于在Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO2014031687中描述的那些。
细胞外配体结合结构域，比如抗原识别结构域，通常与一种或多种细胞内信号转导组分连接，所述细胞内信号转导组分例如在CAR的情况下通过抗原受体复合物(比如TCR复合物)模拟激活和/或经由另一种细胞表面受体发信号的信号转导组分。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域和细胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，CAR包括与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与受体(例如CAR)中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而将与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
抗原特异性结合或识别组分通常与一个或多个跨膜和细胞内信号转导结构域连接。在一些实施方案中，CAR包括与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与受体(例如CAR)中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而将与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，结构域衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包含其跨膜区)的那些跨膜区。一些实施方案中的跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将见于合成跨膜结构域的每个末端。在一些实施方案中，通过接头、间隔物和/或跨膜结构域加以连接。
在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2至10个氨基酸的接头，比如含有甘氨酸和丝氨酸(例如甘氨酸-丝氨酸双联体)的接头，并且所述接头形成在CAR的跨膜结构域和细胞质信号转导结构域之间的连接。
受体(例如CAR)通常包括至少一种细胞内信号转导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，比如介导T细胞活化和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一个或多个细胞信号转导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号转导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号转导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)进一步包括一种或多种另外的分子的一部分，所述分子比如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括在CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体时，受体的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域激活细胞的正常效应子功能或应答中的至少一种，所述细胞例如免疫细胞，例如经工程化以表达CAR的T细胞。例如，在一些情况下，CAR诱导T细胞的功能，比如细胞溶解活性或T辅助活性，比如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号转导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如，条件是它转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号转导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包括在自然情况下与这样的受体协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体的那些序列、和/或这样的分子的任何衍生物或变体、和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR发信号，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成二级信号或共刺激信号的组分也包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并提供用于生成二级信号或共刺激信号的组分。
T细胞活化在一些方面被描述为由两类细胞质信号转导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级细胞质信号转导序列)，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供二级信号或共刺激信号的那些序列(二级细胞质信号转导序列)。在一些方面，CAR包括这样的信号组分中的一者或两者。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级活化的初级细胞质信号转导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号转导序列可含有信号转导基序，其被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有ITAM的初级细胞质信号转导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号转导分子含有细胞质信号转导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体的信号转导结构域和/或跨膜部分，所述共刺激受体比如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS。在一些方面，同一个CAR包括活化组分和共刺激组分两者。
在一些实施方案中，活化结构域包含在一个CAR内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一个细胞上表达的活化或刺激性CAR和共刺激CAR(参见WO2014/055668)。在一些方面，CAR是刺激性或活化性CAR；在其他方面，它是共刺激CAR。在一些实施方案中，所述细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，比如识别不同抗原的CAR，由此通过抑制性CAR与其配体的结合减少或抑制通过识别第一抗原的CAR递送的活化信号，以便例如减少脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号转导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含与CD3细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR还可包括转导标志物(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4+辅助性T细胞的细胞内信号转导结构域相同。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号转导结构域与CD4+辅助性T细胞的细胞内信号转导结构域不同。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包括一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和活化结构域，例如初级活化结构域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，由病毒载体颗粒内的核酸编码的重组和/或异源分子进一步包括一种或多种标志物，所述标志物例如为了证实表达受体的细胞转导或工程化和/或表达由该核酸编码的分子的细胞的选择和/或靶向。在一些方面，这种标志物可以由不同的核酸或多核苷酸编码，其也可以在基因工程过程中通常经由相同的方法，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导而被引入。
在一些方面，标志物(例如转导标志物)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标志物是天然存在的例如内源标志物(比如天然存在的细胞表面分子)的截短变体。在一些方面，与天然或内源细胞表面分子相比，变体具有降低的免疫原性、降低的运输功能和/或降低的信号转导功能。在一些实施方案中，标志物是细胞表面受体的截短形式，比如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标志物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标志物的核酸与编码接头序列的多核苷酸可操作连接，所述接头序列比如可切割的接头序列，例如T2A。参见WO2014031687。在一些实施方案中，标志物是非天然存在于T细胞上或非天然存在于T细胞表面上的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，所述标志物是非自身分子，例如非自身蛋白质，即未被其中有待过继转移细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
在一些实施方案中，除了用作基因工程的标志物(例如，用于选择成功工程化的细胞)之外，标志物没有治疗功能和/或不产生作用。在其他实施方案中，标志物可以是治疗分子或以别的方式发挥某一期望作用的分子，比如在体内将会遇到的细胞的配体，比如在过继转移和遇到配体后增强和/或抑制细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后单独提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，比如包括来自共刺激受体如CD28或CD137的细胞内信号转导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR在一些方面是包括不同的共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分，比如抗原结合部分(比如抗体或其片段)，并且在细胞内结构域中。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号转导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号转导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号转导结构域的跨膜结构域。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔物连接，比如本文所述的任何间隔物。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，比如在跨膜结构域和细胞内信号转导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28(登录号P10747.1)的27-氨基酸跨膜结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含人CD28或其功能变体的细胞内共刺激信号转导结构域，比如其41个氨基酸结构域和/或比如在天然CD28蛋白的位置186-187具有LL至GG取代的结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含41BB或其功能变体的细胞内共刺激信号转导结构域，比如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42-氨基酸细胞质结构域。在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含人CD3ζ刺激信号转导结构域或其功能变体，比如人CD3ζ(登录号P20963.2)的同工型3的112AA细胞质结构域或如在美国专利No.7,446,190中描述的CD3ζ信号转导结构域。在一些方面，间隔物仅含有IgG的铰链区，比如仅有IgG4或IgG1的铰链。在其他实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如，与CH2和/或CH3结构域连接的IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如，与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔物是Ig铰链，例如仅与CH3结构域连接的IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔物是或包含富含甘氨酸-丝氨酸序列或其他柔性接头，比如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，比如抗原结合部分，比如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔物，例如任何含Ig铰链的间隔物；跨膜结构域，其为CD28或其变体的一部分；细胞内信号转导结构域，其含有CD28或其功能变体的信号传导部分；和CD3ζ信号转导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，比如抗原结合部分，比如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔物，例如任何含Ig铰链的间隔物；跨膜结构域，其为CD28或其变体的一部分；细胞内信号转导结构域，其含有4-1BB或其功能变体的信号传导部分；和CD3ζ信号转导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，这样的CAR构建体进一步包括T2A核糖体跳跃元件和/或tEGFR序列，例如在CAR的下游。
T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，由病毒载体颗粒编码的重组和/或异源分子是或包括重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，重组TCR对抗原是特异的，所述抗原通常是靶细胞上存在的抗原，比如肿瘤特异性抗原、在与自身免疫或炎性疾病相关的特定细胞类型上表达的抗原、或衍生自病毒病原体或细菌病原体的抗原。
在一些实施方案中，TCR是已经从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定并且分离了针对靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中生成了针对靶抗原的TCR克隆。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169–180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799–5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390–1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349–354。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆之后，分离TCRα和β链并将其克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，编码TCR的核酸进一步包括标志物，以证实表达该受体的细胞的转导或工程化。
病毒载体颗粒
在一些实施方案中，将被检测复制型病毒的细胞用病毒载体颗粒转导，所述病毒载体颗粒包括编码重组和/或异源分子例如基因产物的核酸。在一些实施方案中，核酸(即多核苷酸)被包含在表达盒内。核酸或表达盒可以被包含在表达载体比如病毒载体中，所述病毒载体用于表达由病毒载体颗粒中的核酸编码的重组和/或异源分子。
表达盒
在一些实施方案中，表达盒可含有在启动子控制下的编码异源和/或重组分子的核酸。表达盒还可含有一种或多种其他调控元件。在一些情况下，核酸可以与其他核酸序列可操作连接，包括但不限于启动子、增强子、其他转录后调控元件、多腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点或编码区段。
a.启动子
在一些实施方案中，表达盒包括与编码重组或异源蛋白质的核酸分子可操作连接的启动子。启动子可包括用户期望的适合于表达背景的任何启动子。在一些实施方案中，启动子可以包括真核或原核起源的启动子，其可以在多种细胞类型中提供高水平的组成型表达，并且足以指导编码重组或异源蛋白质的核酸在细胞中转录。在一些实施方案中，编码重组或异源蛋白质的核酸是位于远端的序列，其是与启动子序列的5'端可操作连接的序列。启动子区还可包括增强或抑制转录的控制元件，并且可以根据用户的期望并根据上下文加以修饰。
在一些实施方案中，启动子包含用于定位RNA合成起始位点的序列。在一些实施方案中，启动子包含TATA盒。在一些实施方案中，启动子缺乏TATA盒，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子。在这样的实施方案中，启动子可以含有覆盖起始位点本身的离散元件，这有助于固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。在一些实施方案中，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管已经显示许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5'端定位在所选启动子的“下游”(即3')。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
在一些实施方案中，启动子元件之间的间隔是柔性的，使得在元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在启动子是tk启动子的一些实施方案中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至相距50bp。取决于启动子，单独的元件可以协作或独立地起作用以激活转录。在一些实施方案中，启动子可以与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
在一些实施方案中，启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。这种启动子可称为“内源的”。在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，其位于该序列的下游或上游。
或者，在一些实施方案中，编码核酸区段可以位于通常与自然环境中的编码核酸序列不相关的重组和/或异源启动子和/或增强子的控制下。这样的启动子或增强子可以包括在自然界中与衍生核酸的物种内的其他基因可操作连接的启动子或增强子，以及从其他物种分离的启动子或增强子(比如来自其他原核或真核细胞)，以及不是“天然存在的”启动子和增强子，即，其含有不同转录调控区的不同元件和/或与自然界中任何启动子或增强子中发现的那些元件相比改变表达的突变。例如，用于重组DNA构建的示例性启动子包括但不限于β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖、色氨酸(trp)、RNA聚合酶(pol)III启动子(包括人和鼠U6pol III启动子以及人和鼠H1RNA pol III启动子)；RNA聚合酶(pol)II启动子；巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)、延伸因子-1α(EF-1α)和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子(pRSV)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)结合本文中公开的组合物和方法产生序列(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，各自通过提述并入本文)。此外，在一些实施方案中，也可以采用指导在诸如线粒体、叶绿体等非核细胞器中的序列转录和/或表达的控制序列。包含启动子、增强子和其他基因座或转录控制/调节元件的控制序列也称为“转录盒”。
在一些实施方案中，启动子和/或增强子可操作连接，以有效地指导DNA区段在经过选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的用途(参见，例如Sambrook等人，1989，通过提述并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于基因治疗或诸如大规模生产重组蛋白和/或肽的应用。启动子可以是异源的或内源的。
在一些实施方案中，可以采用T3、T7或SP6细胞质表达系统。如果提供适当的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的基因表达构建体，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
在一些实施方案中，可以使用诱导型启动子。如本文中使用的，“诱导型启动子”是指可以响应于特异性信号而受到调控的转录控制元件。诱导型启动子在与转录激活因子结合时具有转录活性，转录激活因子进而在特定的条件集合下被激活，所述条件例如在影响转录激活因子与诱导型启动子结合/或影响转录激活因子自身的功能的化学信号的特定组合的存在下。因此，诱导型启动子是这样的启动子：或者，在不存在诱导物的情况下，其不指导与诱导型启动子可操作连接的核酸序列的表达或指导其低水平表达；抑或，在调节因子的存在下，其表现出低水平的表达，当去除调节因子时，其允许从启动子(例如tet系统)高水平表达。在诱导物的存在下，诱导型启动子以增加的水平指导转录。
在一些实施方案中，四环素-(tet)-调控系统可以被修饰以供在哺乳动物系统使用并且被用作表达盒的调控元件，所述调控系统基于大肠杆菌的tet抑制(tetr)对tet操纵子序列(TECO)的抑制作用。这些系统是本领域普通技术人员熟知的。(参见，Goshen和Badgered,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-51(1992),Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6522-26(1996),Lindemann等人，Mol.Med.3:466-76(1997))。
b.其他调控元件
在一些实施方案中，表达盒可另外包括与编码重组蛋白或异源基因产物的核酸可操作连接的增强子。
在一些实施方案中，内部核糖体结合位点(IRES)元件与表达盒可操作连接以产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5'-甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(参见Pelletier和Sonenberg,(1988)Nature.334:320–325)。IRES元件的非限制性实例包括但不限于小核糖核酸病毒科(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(参见Pelletier和Sonenberg,(1988)Nature.334:320–325)或来自哺乳动物信息的IRES(参见Macejak和Sarnow,(1991)Nature,353:90-94)。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框可以被一起转录，每个都被IRES分开，从而建立多顺反子信使。凭借IRES元件，每个开放阅读框易接近核糖体，以进行有效翻译。可以使用单个启动子/增强子转录单个信使，以有效表达多个基因。
在涉及真核基因表达的一些实施方案中，表达盒可以与多腺苷酸化信号可操作连接，以实现转录物的适当多腺苷酸化。可以采用任何这样的序列。一些实例包括SV40多腺苷酸化信号或牛生长激素多腺苷酸化信号，其便于且已知在各种靶细胞中良好地起作用。多腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或可以促进细胞质输送。
在一些实施方案中，表达盒或载体含有一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，以便在宿主细胞中增殖。复制起点是启动复制所在的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(ARS)。
在一些实施方案中，在编码重组受体(比如抗原受体，例如CAR)的病毒载体基因组中所包含的核酸序列以功能关系与其他遗传元件例如包括启动子或增强子的转录调控序列可操作连接，从而以特定的方式调控感兴趣的序列的表达。在某些情况下，这样的转录调控序列是就活性而言在时间上和/或空间上受到调控的那些序列。可用于调节组分表达的表达控制元件是已知的，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号、增强子和其他调控元件。
在一些实施方案中，编码重组受体(比如抗原受体，例如CAR)的核酸序列与内部启动子/增强子调控序列可操作连接。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达。启动子可以是异源的或内源的。在一些实施方案中，通过合成产生启动子和/或增强子。在一些实施方案中，使用重组克隆和/或核酸扩增技术产生启动子和/或增强子。
在一些实施方案中，启动子和/或增强子可以是与核酸序列天然相关的启动子和/或增强子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。或者，在一些实施方案中，编码核酸区段可以位于通常与自然环境中的编码核酸序列不相关的重组和/或异源启动子和/或增强子的控制下。例如，用于重组DNA构建的示例性启动子包括但不限于β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖、色氨酸(trp)、RNA聚合酶(pol)III启动子(包括人和鼠U6pol III启动子以及人和鼠H1RNA pol III启动子)；RNA聚合酶(pol)II启动子；巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)、延伸因子-1α(EF-1α)和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列启动子(pRSV)启动子系统。在一些实施方案中，启动子可以例如从病毒的基因组获得，所述病毒比如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)。启动子也可以是，例如，异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、热激启动子，或通常与天然序列相关的启动子，条件是这样的启动子与靶细胞相容。在一个实施方案中，启动子是在病毒表达系统中的天然存在的病毒启动子。
在一些实施方案中，启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性实例包括下列各项的启动子：泛素(美国专利No.5,510,474；WO 98/32869)、CMV(Thomsen等人，PNAS 81:659,1984；美国专利No.5,168,062)、β-肌动蛋白(Gunning等人1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831-4835)和pgk(参见，例如，Adra等人1987Gene 60:65-74；Singer-Sam等人1984Gene 32:409-417；和Dobson等人1982Nucleic Acids Res.10:2635-2637)。
在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子和/或靶细胞特异性启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以允许感兴趣的序列的诱导型表达。许多用于诱导型表达的系统是已知的，包括四环素应答系统、lac操纵子-阻遏物系统、以及响应于各种环境或生理变化的启动子，所述变化包括热休克、金属离子(比如金属硫蛋白启动子)、干扰素、缺氧、类固醇(如孕酮或糖皮质激素受体启动子)、辐射，如VEGF启动子等。在一些实施方案中，四环素-(tet)-调控系统可以被修饰以供在哺乳动物系统使用并且被用作表达盒的调控元件，所述调控系统基于大肠杆菌的tet抑制(tetr)对tet操纵子序列(TECO)的抑制作用。这些系统是熟知的。(参见，Goshen和Badgered,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-51(1992),Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6522-26(1996),Lindemann等人，Mol.Med.3:466-76(1997))。
还可使用启动子的组合以获得期望的感兴趣的基因表达。普通技术人员将能够基于在生物或感兴趣的靶细胞中的期望的基因表达模式来选择启动子。
在一些实施方案中，增强子也可以存在于病毒构建体中，以增加感兴趣的基因表达。增强子通常是顺式作用核酸元件，通常长约10至300个核苷酸，其作用于启动子以增加其转录。病毒(比如HIV或CMV)基因组中的许多增强子是已知的。例如，可以使用CMV增强子(Boshart等人，Cell,41:521,1985)。其他实例包括，例如位于复制起点晚期侧(late side)的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。在一些情况下，增强子来自哺乳动物基因，比如来自珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白或胰岛素的增强子。增强子可与异源启动子联合使用。可在编码感兴趣的基因的多核苷酸序列的5′或3′位置，但通常位于启动子的5′位点将增强子剪接到载体中。本领域普通技术人员将能够基于期望的表达模式来选择适当的增强子。
病毒载体基因组也可含有另外的遗传元件。可包括在构建体中的元件的类型不受任何方式的限制，并且可以由本领域技术人员选择。例如，可以包括促进靶细胞中病毒基因组入核的信号。
在一些情况下，可以包括编码分开的异源蛋白质的多于一个的开放阅读框。例如，在一些实施方案中，如果表达构建体中包括报告基因和/或可检测基因和/或可选择基因，则可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。通常，另外的遗传元件与独立的启动子/增强子可操作连接并受其控制。所述另外的遗传元件可以是报告基因、选择标志物或其他期望的基因。
在一些实施方案中，其他各种调控元件可包括转录起始区和/或终止区。表达载体还可含有用于终止转录和稳定mRNA的序列。这样的序列是已知的并且通常天然存在于真核生物或病毒DNA或cDNA的5′及有时的3′非翻译区中。转录终止区的实例包括但不限于多腺苷酸化信号序列。多腺苷酸化信号序列的实例包括但不限于牛生长激素(BGH)poly(A)、SV40晚期poly(A)、兔β-珠蛋白(RBG)poly(A)、胸苷激酶(TK)poly(A)序列及其任何变体。
病毒载体
在一些实施方案中，用于转导待测试细胞的病毒载体颗粒含有这样的基因组，所述基因组衍生自基于逆转录病毒基因组的载体，比如衍生自基于γ-逆转录病毒或慢病毒基因组的载体。大量的任何此类适当的载体基因组是已知的(参见，例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人，TrendsBiotechnol.2011November 29(11):550-557；Pfeifer和Verma(2001)Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.,2:177-211)。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(比如抗原受体，如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR和3'LTR序列之间。在一些实施方案中，载体基因组被称为转移载体和/或转移质粒。
示例性病毒载体包括逆转录病毒载体，例如慢病毒或γ-逆转录病毒载体，衍生自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒和腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方案中，使用逆转录病毒载体(比如慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到细胞中(参见，例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人，Trends Biotechnol.2011November 29(11):550–557。逆转录病毒可用作递送载体，因为它们能够将其基因整合到宿主基因组中，转移大量的外来遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并且被包装在特殊的细胞系中(Miller,1992)。
在一些实施方案中，通过γ-逆转录病毒载体完成基因转移。因此，在一些情况下，病毒载体基因组是γ-逆转录病毒基因组，如鼠白血病病毒(MLV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、内源性异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)或猫白血病病毒(FLV)基因组。
在一些实施方案中，通过慢病毒载体完成基因转移。在一些方面，可使用慢病毒转导某些非分裂细胞。
慢病毒载体的非限制性实例包括衍生自慢病毒的那些，比如人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马传染性贫血病毒(EIAV)。例如，通过对HIV毒力基因多次减毒生成了慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu、vpx和nef缺失，这在一些实施方案中可以使载体更安全、更被认可安全或对于治疗目的更合乎需要。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998,美国专利No.6,013,516和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择核酸和用于将核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地获自保藏或收藏机构如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209)，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒载体包括但不限于衍生自HIV-1、SIVmnd1、SIVlst、SIVsun、SIVolc或SIVwrc慢病毒的载体。
在一些实施方案中，两种组分涉及形成基于病毒的基因递送系统：首先，包装质粒，其包含结构蛋白以及生成病毒载体颗粒必需的酶，其次，病毒载体自身，即，待转移的遗传物质。可以在这些组分的一种或两种的设计中引入生物安全保护措施。在一些实施方案中，包装质粒可含有除包膜蛋白外的所有HIV-1蛋白(Naldini等人，1998)。在一些实施方案中，病毒载体可缺乏另外的病毒基因，比如与毒力相关的那些基因，例如vpr、vif、vpu、vpx和nef、和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，用于慢病毒载体比如基于HIV的慢病毒载体的包装系统包括单独的包装质粒，所述包装质粒一起仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这减少或消除了通过重组重建野生型病毒的可能性。
在所提供的方法的一些方面，编码重组蛋白的异源核酸(比如提供为在启动子控制下的含有转基因的表达盒的一部分)被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR和3'LTR序列之间，所述LTR包括野生型LTR或其部分或嵌合部分。在一些实施方案中，病毒载体基因组可含有逆转录病毒的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自逆转录病毒的5'和3'LTR的序列，特别是可含有来自逆转录病毒的5'LTR以及逆转录病毒的灭活的或自灭活3'LTR的R序列和U5序列。LTR序列可以是来自任何物种的任何逆转录病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。
载体基因组可含有灭活的或自灭活3'LTR(Zufferey等人，J Virol 72:9873,1998；Miyoshi等人，J Virol 72:8150,1998)。例如，核酸的3'LTR的U3区缺失可用于生成自灭活(SIN)载体，所述核酸用于产生病毒载体RNA。然后在逆转录过程中可以将该缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有来自3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列的缺失，所述缺失在载体整合过程中被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以废除LTR的转录活性。这可以防止在转导细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。作为自失活3'LTR的结果，在进入和逆转录后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低载体基因组动员风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不影响载体滴度或病毒载体颗粒的体外或体内性质。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以用病毒构建体中的启动子序列(比如异源启动子序列)替换。这可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包括增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个实例中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利No.5,385,839和美国专利No.5,168,062)。
在一些实施方案中，病毒载体基因组也可含有另外的遗传元件。可包括在构建体中的元件的类型不受任何方式的限制，并且可以由本领域技术人员选择。在一些实施方案中，载体基因组含有衍生自病毒基因组(例如逆转录病毒基因组)的序列，所述序列为所述基因组的非编码区，其促进DNA或RNA合成和加工或为DNA或RNA合成和加工提供识别信号。在一些实施方案中，这样的序列可包括顺式作用序列，其可参与包装或衣壳化、逆转录和转录和/或基因转移或整合。在一些实施方案中，作为病毒载体的一部分提供的顺式激活序列衍生自相同的慢病毒或逆转录病毒样生物。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体基因组可含有选自剪接供体位点(SD)、剪接受体位点(SA)和/或Rev应答元件(RRE)的元件。在一些实施方案中，提供RRE以在病毒包装过程中在作为辅助质粒的一部分提供的Rev蛋白结合之后允许病毒信使RNA从细胞核输出至胞质溶胶。在一些实施方案中，载体基因组可含有psi(ψ)包装信号，所述包装信号在一些情况下可衍生自gag ORF的N端片段。在一些实施方案中，可通过移码突变修饰psi包装信号序列，以防止gag肽的可能转录/翻译对转基因的转录/翻译的任何干扰。
在某些实施方案中，将病毒载体基因组比如γ-逆转录病毒或慢病毒载体基因组、或其他病毒基因组工程化为整合缺陷型。可以寻求多种方法来产生非整合载体基因组。在一些实施方案中，可以将突变工程化到pol基因的整合酶组分中，使其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身以通过例如突变或缺失一个或两个附着位点来防止整合，或通过缺失或修饰使3'LTR-近端多嘌呤通道(PPT)无功能。在一些实施方案中，可利用非遗传方法；这些包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学物质。这些方法不一定相互排斥；也就是说，一次可以使用它们中的多于一种。例如，整合酶和附着位点都两者都可以是非功能性的，或者整合酶和PPT位点可以是非功能性的，或者附着位点和PPT位点可以是非功能性的，或者它们全部可以是非功能性的。这些方法和病毒载体基因组是已知并可获得的(参见Philpott和Thrasher，Human Gene Therapy 18:483,2007；Engelman等人，J Virol 69:2729,1995；Brown等人，J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人，J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin J Virol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体还可含有用于在宿主细胞如原核宿主细胞中增殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有一个或多个用于在原核细胞如细菌细胞中增殖的复制起点。在一些实施方案中，包含原核复制起点的载体也可含有其表达赋予可检测或选择标志物(如抗药性标志物)的基因。
病毒载体颗粒的制备
在所提供的方法的一些实施方案中，将编码重组和/或异源分子的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，可以构建含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。当将重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列可以允许将重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，所述病毒颗粒然后可被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。
通常将病毒载体基因组构建成质粒形式，其可以转染到包装或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生病毒颗粒，所述病毒颗粒的基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分涉及形成基于病毒的基因递送系统：首先，包装质粒，其包含结构蛋白以及生成病毒载体颗粒必需的酶，其次，病毒载体自身，即，待转移的遗传物质。可以在这些组分的一种或两种的设计中引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可含有除包膜蛋白外的所有病毒蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可缺乏另外的病毒基因，比如与毒力相关的那些基因，例如vpr、vif、vpu、vpx和nef、和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。
在一些实施方案中，慢病毒载体比如基于HIV的慢病毒载体仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这减少或消除了通过重组重建野生型病毒的可能性。
如上所述，在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入到含有将病毒基因组RNA包装成病毒颗粒所需的所有组分的包装细胞系中，所述病毒基因组RNA转录自所述病毒载体基因组。或者，除了一个或多个感兴趣的序列(例如重组核酸)外，病毒载体基因组可包含一个或多个编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除并且单独提供在包装细胞系中。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成颗粒必需的组分的质粒载体转染包装细胞系。包装细胞系可以表达(或使其表达)必需的逆转录病毒基因以允许生成病毒载体颗粒。这些基因可以由几种质粒表达。在一些实施方案中，将包装细胞系用下列质粒转染：含有病毒载体基因组的质粒，所述质粒包括LTR、顺式作用包装序列和感兴趣的序列(即编码抗原受体比如CAR的核酸)；编码病毒酶组分和/或结构组分比如Gag、pol和/或rev的一种或多种辅助质粒。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些这样的实施方案中，向包装细胞提供单独的载体降低了重组事件的可能性，否则重组事件可能生成复制型病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有病毒组分的单一质粒载体。
在一些实施方案中，包装细胞系可以用下列质粒转染：含有顺式作用psi(Y)包装序列和插入在慢病毒LTR之间以允许靶细胞整合的转基因的慢病毒表达质粒；编码pol、gag、rev和/或tat病毒基因并且在一些情况下含有rev应答元件(RRE)的一种或多种包装质粒；以及假型化质粒，比如编码包膜蛋白如水泡性口炎病毒(VSV-G)包膜基因的G蛋白的质粒。
在一些实施方案中，将包装细胞系用下列质粒转染：含有病毒载体基因组的质粒，所述质粒包括LTR、顺式作用包装序列和感兴趣的序列(即编码重组蛋白(例如抗原受体，比如CAR)的核酸)；以及编码病毒酶组分和/或结构组分比如Env、Gag、pol和/或rev的几种辅助质粒。在一些实施方案中，将含有编码结构组分和酶组分的gag和pol基因的GagPol包装质粒和含有编码Rev调节蛋白的rev基因的Rev质粒单独地引入包装细胞系中。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单一质粒载体。在一些实施方案中，还可以引入编码env基因的包膜质粒，其在一些情况下可以产生用替代的Env蛋白假型化的病毒颗粒。在一些实施方案中，将病毒载体颗粒(比如γ-逆转录病毒或慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，病毒载体颗粒可以用VSV-G糖蛋白假型化，其提供了广泛的细胞宿主范围，从而扩展了可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，所述包膜比如包括异嗜性、多嗜性或双嗜性包膜，比如辛德毕斯病毒包膜、GALV或VSV-G。
env基因可以衍生自任何适当的病毒，比如逆转录病毒。在一些实施方案中，env是双嗜性包膜蛋白，其允许人和其他物种的细胞的转导。一些实施方案使用逆转录病毒衍生的env基因，所述逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。在一些实施方案中，也可以使用其他env基因，比如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSVG)、肝炎病毒和流感病毒的env基因。
在一些实施方案中，提供病毒env核酸序列的包装质粒与调控序列例如启动子或增强子相关或可操作连接。在一些实施方案中，调控序列可以是任何真核启动子或增强子，包括例如EF1α、PGK、莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件、人巨细胞病毒增强子、痘苗病毒P7.5启动子等。在一些情况下，比如在莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件的情况下，启动子-增强子元件位于LTR序列内或附近。在一些实施方案中，调控序列是对构建载体的慢病毒而言不是内源的调控序列。因此，如果载体是由SIV制成的，那么在SIV LTR中发现的SIV调控序列可以被不是源自SIV的调控元件取代。
在一些实施方案中，包装细胞系提供用于将病毒基因组RNA包装成慢病毒载体颗粒反向(in trans)需要的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达逆转录病毒蛋白并产生功能性病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，适合的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定表达病毒蛋白。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，包装细胞系可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码重组和/或异源分子的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸瞬时转染。
在一些实施方案中，通过转染或感染将病毒载体和包装和/或辅助质粒引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。转染或感染方法是熟知的。非限制性实例包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质体转染方法、电穿孔和显微注射。当将重组质粒与病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列可以允许将重组质粒的RNA转录物包装成病毒颗粒，所述病毒颗粒然后可被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基中回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法测定滴度。因此，在一些实施方案中，通过这些方法将包装质粒通常与显性选择标志物(如新霉素、DHFR、谷氨酰胺合成酶或ADA)一起引入人细胞系中，然后在适当的药物存在下进行选择，并且分离克隆。选择标志物基因可以与构建体中的包装基因物理连接。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒可以通过其中被配置为表达包装功能的稳定细胞系产生。适合的包装细胞是已知的，包括例如美国专利No.5,686,279；和Ory等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93:11400-11406。在一些情况下，其中具有掺入的病毒载体的包装细胞形成生产细胞。因此，生产细胞通常是可以产生或释放携带感兴趣的基因的病毒载体颗粒的细胞或细胞系。在一些实施方案中，这些细胞可以进一步依赖于锚定，这意味着当附着于诸如玻璃或塑料的表面时，这些细胞将最佳地生长、存活或维持功能。在一些实施方案中，生产细胞可以是瘤形成(neoplastically)转化细胞。在一些实施方案中，用于用慢病毒载体和包装质粒转染的宿主细胞包括，例如，哺乳动物原代细胞；建立的哺乳动物细胞系，如COS、CHO、HeLa、NIH3T3、293T和PC12细胞；两栖动物细胞，如非洲爪蟾胚胎和卵母细胞；其他脊椎动物细胞；昆虫细胞(例如果蝇)、酵母细胞(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母或巴斯德毕赤酵母)和原核细胞(例如大肠杆菌)。
在一些实施方案中，通过引入质粒以允许生成病毒载体颗粒，可以在包装细胞系(比如示例性HEK 293T细胞系)中产生病毒载体颗粒。在一些实施方案中，包装细胞被转染有和/或含有编码gag和pol的多核苷酸、和编码重组和/或异源分子(比如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系任选地和/或另外地转染有和/或含有编码rev蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系任选地和/或另外地转染有和/或含有编码非天然包膜糖蛋白(比如VSV-G)的多核苷酸。在一些这样的实施方案中，在转染细胞例如HEK 293T细胞之后大约两天，细胞上清液含有重组病毒载体颗粒，可以将其回收并测定滴度。如所描述的，可以使用回收的和/或产生的病毒载体颗粒转导靶细胞，比如免疫细胞，例如T细胞。在一些方面，一旦病毒RNA在靶细胞中被逆转录，其进入细胞核并稳定整合到宿主基因组中。在一些方面，在病毒RNA整合后一天或两天，可以检出重组和/或异源分子的表达。
在一些实施方案中，可通过本文所述的任何方法评估分离的病毒载体颗粒的复制型病毒。
细胞转导
在一些实施方案中，测试样品包含细胞或这样的细胞的RNA和/或来自这样的细胞的RNA，所述细胞例如免疫细胞，比如T细胞，其通过将含有这样的细胞的细胞群与病毒载体颗粒比如慢病毒或γ-逆转录病毒载体颗粒温育和/或接触而被转导或已经被转导，所述病毒载体颗粒在病毒载体的基因组中含有：编码重组和/或异源分子比如CAR或其他抗原受体的核酸。所述病毒载体颗粒，比如慢病毒或γ-逆转录病毒载体颗粒，可以是如所述的任何一种。在一些这样的实施方案中，所得的转导细胞(比如转导的T细胞)表达重组和/或异源分子比如CAR，并且可以用于过继免疫治疗方法。在一些实施方案中，可以在细胞处理的任何时间点评估复制型病毒的存在或不存在，所述细胞包括被转导或将被转导的细胞，包括用于过继细胞疗法的细胞。用于处理细胞的步骤，包括涉及细胞的分离、分开、选择、培养(例如，刺激细胞，例如诱导其增殖和/或活化)、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤，详细地描述于下文。
在一些实施方案中，可以按照以下顺序进行处理步骤，其中：首先从生物样品中分离(比如选择或分开)细胞，例如原代细胞；在刺激试剂的存在下刺激所得的分离或选择的细胞；将经过刺激的细胞与病毒载体颗粒一起温育以进行转导；并且将转导的细胞配制成组合物。在一些实施方案中，在与病毒载体颗粒温育的至少一部分过程中另外或替代地进行刺激。在一些情况下，在细胞与病毒载体颗粒温育之后另外或替代地进行刺激。在一些情况下，所述方法不包括刺激细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法可包括洗涤、悬浮、稀释和/或浓缩细胞中的一个或多个处理步骤，其可在分离(比如分开或选择)、刺激、转导、培育、培养或扩增、冷冻保存和/或配制步骤中的一个或多个之前、期间或的同时或之后进行。所提供的方法可用于确定在根据所提供的方法的任何上述步骤中收集的样品中复制型病毒的存在或不存在或风险。
a.封闭系统
可以在封闭系统中进行每个处理步骤的全部或一部分。在所述方法的多个方面，不需要在同一个封闭系统中进行所述过程，而是可以在不同的封闭系统下进行。
在一些实施方案中，转导细胞的方法包括下列步骤的一个或多个：(a)在腔室中洗涤含有细胞的生物样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级分离的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、血液成分单采术产物或白细胞单采术产物)，(b)在腔室中从样品分离(例如选择)期望的细胞亚群或群(例如CD4+或CD8+T细胞)，例如，通过将细胞与选择试剂或免疫亲和力试剂一起温育以进行基于免疫亲和力性的分离；c)根据比如上述方法将分离的(比如选择的)细胞与病毒载体颗粒一起温育，和d)将转导的细胞配制在比如药学上可接受的缓冲剂、冷冻保存剂或其他适合的介质中。在一些实施方案中，转导细胞的方法可以进一步包括(e)在腔室中通过将细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，从而诱导细胞增殖。在一些实施方案中，在将细胞与病毒载体颗粒一起温育之前、期间和/或之后进行刺激细胞的步骤。在一些实施方案中，洗涤或悬浮步骤的一个或多个其他步骤，比如细胞的稀释、浓缩和/或缓冲剂更换，也可以在任何上述步骤之前或之后进行。
因此，在一些实施方案中，转导细胞的方法包括在没有将细胞暴露于非无菌条件并且不需要使用无菌室或柜的情况下进行制备细胞的一个、多个或所有步骤，所述细胞用于临床用途，例如用于过继细胞疗法。在这个过程的一些实施方案中，细胞的分离、分开或选择、刺激、转导、洗涤和配制全都在封闭系统内进行。在一些实施方案中，以自动化方式进行转导细胞的方法。在一些实施方案中，离开封闭系统进行一个或多个步骤。
b.样品和细胞制备
在所提供的方法的一些方面，细胞群包括从受试者获得的原代细胞，比如含有T细胞的原代细胞群。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，比如灵长类动物，比如人。
在一些实施方案中，从受试者中分离或获得细胞群，然后将病毒载体与细胞群一起温育和/或接触。在一些实施方案中，这样的细胞衍生自样品，例如生物样品，比如从指定接受过继疗法的受试者或从另一受试者获得的那些样品。
在一些实施方案中，处理步骤包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品比如从受试者获得或衍生的那些，所述受试者比如具有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被施用细胞疗法的受试者。在一些方面，受试者是人，比如受试者是需要特定治疗干预的患者，所述治疗干预比如过继细胞疗法，其中细胞经过分离、处理和/或工程化。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、液体和其他样品，以及由一个或多个处理步骤产生的样品，所述处理步骤比如分离、离心、基因工程(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或温育。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，比如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括由其衍生的处理样品。
在一些方面，样品是血液或血液衍生的样品，或者是或衍生自血液成分单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官、和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法例如过继细胞疗法的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如，来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
样品通常包括T细胞。在一些实例中，样品或T细胞群包括未分级分离的T细胞、未分级分离的CD4+细胞和/或未分级分离的CD8+T细胞的群、和/或其一种或多种亚型，例如由下述项定义的那些亚型：功能、缺乏活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中存在、标志物或细胞因子分泌谱、和/或分化程度或缺乏分化。可以通过阳性或阴性选择方法选择这样的亚型。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下将细胞洗涤、离心和/或温育，例如，以去除不需要的组分，富集期望的组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质分离细胞，所述性质比如密度、粘附性质、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性。
在一些实例中，例如通过血液成分单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法包括全部或部分地在封闭系统中处理一个或多个样品。在一些实施方案中，处理步骤可以包括洗涤来自受试者的样品(例如含有血细胞的样品)，例如以去除血浆部分，并将所述细胞放回适当的缓冲剂或介质中，以备随后的处理步骤和/或进行基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆部分，并将所述细胞置于适当的缓冲剂或介质中，以备随后的处理步骤。在一些实施方案中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，使用半自动“直流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)根据制造商的说明完成洗涤步骤。在一些方面，通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于各种生物相容性缓冲剂例如不含Ca++/Mg++的PBS中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
c.基于亲和力的选择
处理步骤可包括从混合群体和/或组合物中分离细胞，例如使用各种选择步骤之一，包括基于密度或基于其他物理性质的分离方法和基于亲和力的选择。在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特异性分子(比如表面标志物，例如表面蛋白、细胞内标志物或核酸)的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于这样的标志物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的细胞表达或表达水平分离细胞和细胞群，例如通过用与这样的标志物特异性地结合的抗体或结合配偶体温育，随后通常为洗涤步骤以及将已经结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合抗体或结合配偶体的细胞分离。
这样的分离步骤可以基于其中保留已经结合试剂的细胞用于进一步使用的阳性选择、和/或其中保留未与抗体或结合配偶体结合的细胞的阴性选择。在一些实例中，两个部分都被保留以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性地鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得基于由除期望群体之外的细胞表达的标志物最佳地进行分离。
分离不必导致100％富集或去除特定细胞群或表达特定标志物的细胞。例如，特定类型的细胞(比如表达标志物的细胞)的阳性选择或富集是指增加这样的细胞的数量或百分比，但不必导致不表达所述标志物的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(比如表达标志物的细胞)的阴性选择、去除或耗竭是指减少这样的细胞的数量或百分比，但不必导致所有这样的细胞的完全去除。
在一些实例中，进行了多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一个分离步骤，比如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，比如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起温育，单个分离步骤可以同时耗竭表达多种标志物的细胞，其中每种抗体或结合配偶体对于靶向阴性选择的标志物是特异的。同样，通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起温育，可以同时进行多种细胞类型的阳性选择。
在一些实施方案中，细胞包括T细胞的一个或多个亚群或其他细胞类型，比如整个T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，比如由功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中存在、标志物或细胞因子分泌谱、和/或分化程度定义的那些。参考待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。其中这些方法包括现成的方法。在一些方面，比如对于现成技术，细胞是多能性和/或多能的，比如干细胞，比如诱导的多能性干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞，制备、加工、培养和/或工程改造它们，并在冷冻保存之前或之后和/或在测试复制型病毒之前或之后将它们重新引入到同一患者中。
其中T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群是幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，比如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，比如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，通过在非T细胞(比如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标志物的阴性选择，将T细胞从PBMC样品或其他样品分离。在一些实施方案中，可以通过阴性选择方法从细胞群中富集T细胞，以便基于标志物CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a中的一种或多种的表面表达从所述群体中选择非T细胞。在一些实施方案中，比如通过使用可商购的针对标志物混合物的全T细胞分离试剂盒(例如Miltenyi No.130-096-535)，进行全T细胞选择。对于未被选择过程中使用的抗体或其他试剂接触的T细胞群，提供了这种选择策略。
在一些方面，使用CD4+和/或CD8+选择步骤来分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，进行CD4+选择步骤。在一些实施方案中，进行CD8+选择步骤。
在一些实施方案中，通过对一个或多个幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物的阳性或阴性选择，可以将这样的CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离特定的T细胞亚群，比如对一种或多种表面标志物阳性或阴性的细胞，所述标志物例如CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO。例如，可以选择幼稚T细胞群(例如一种或多种标志物CD45RO-、CD44低、CD62L高)、记忆T细胞群(例如一种或多种标志物CD45RO+、CCR7+、CD27+、CD28+和/或CD62L+)和/或效应T细胞群(例如一种或多种标志物CD45RO+、CD62L-、CCR7-)中的一个或多个。
在一些实施方案中，所述方法不包括效应T细胞的选择和/或富集。在一些实施方案中，所述方法包括从细胞群中去除或耗竭效应T细胞。
在一些实施方案中，例如通过基于与对应的亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择，从CD8+细胞进一步富集或耗竭幼稚、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以增加效力，比如改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在这样的亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，联合富含TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞进一步增强效力。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。比如使用抗CD8和抗CD62L抗体，可以从PBMC富集或耗竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性表达或高表面表达；在一些方面，它基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗竭以及表达CD62L的细胞的阳性选择或富集，进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，以基于CD4表达选择的阴性细胞级分开始进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集，将所述阴性细胞级分进行基于CD14和CD45RA表达的阴性选择和基于CD62L的阳性选择。在一些方面，同时进行这样的选择，并且在其他方面，以任一顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性级分和阴性级分都被保留并用于这些方法的后续步骤中，任选地随后为一个或多个另外的阳性或阴性选择步骤。
在特定的实例中，对PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞选择，其中阴性级分和阳性级分两者都被保留。然后基于CD14和CD45RA或CD19的表达对阴性级分进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞的标志物特征(如CD62L或CCR7)进行阳性选择，其中以任一顺序进行阳性选择和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。可通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+的。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-的。在一些实施方案中，所述方法不包括效应CD4+T细胞的选择和/或富集。在一些实施方案中，所述方法包括从细胞群中去除或耗竭效应CD4+T细胞。
在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(比如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离用于阳性和/或阴性选择的细胞。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术(在Methods in MolecularMedicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitroand In Vivo,第17-25页，编辑：S.A.Brooks和U.SchumacherHumana Press Inc.,Totowa,NJ中综述)来分开或分离细胞和细胞群。
在一些方面，通过将样品或细胞与可磁化或磁响应材料一起温育，通过基于亲和力的选择来进行选择，所述材料比如磁响应颗粒或微粒，比如顺磁珠(例如Dynalbeads或MACS珠)。磁响应材料(例如颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如抗体)，所述结合配偶体与存在于期望分离(例如，期望被阴性或阳性选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上的分子(例如表面标志物)特异性地结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠子包含与特异性结合成员(比如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多熟知的在磁分离方法中使用的磁响应材料。适合的磁性颗粒包括在Molday的美国专利No.4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中描述的那些磁性颗粒，将其通过提述完整并入本文。胶体大小颗粒(如在Owen的美国专利No.4,795,698和Liberti等人的美国专利No.5,200,084中所述的那些)是其他的实例，同样将其通过提述完整并入本文。
温育步骤通常在这样的条件下进行，抗体、其他结合配偶体或分子(比如二级抗体或其他试剂)借此条件与细胞表面分子(如果存在于样品中的细胞上)特异性地结合，所述二级抗体或其他试剂与附着于磁性颗粒或珠子的这样的抗体或结合配偶体特异性地结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体上并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被吸引到磁体上的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在相同的选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中阳性和阴性级分被保留并进一步处理或经受进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一级抗体或其他结合配偶体、二级抗体、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对一种或多种标志物特异的一级抗体的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一级抗体或结合配偶体标记细胞而不是珠子，然后加入细胞类型特异性二级抗体包被的或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一级抗体或二级抗体结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于细胞，所述细胞随后将被温育、培养和/或工程化；在一些方面，将颗粒附着于细胞，用于施用于患者。在一些实施方案中，从细胞去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞去除可磁化颗粒的方法是已知的，包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotech,Auburn,CA)来进行。磁激活细胞分选(MACS)系统能够以高纯度选择其上具有附着的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非目标物质和目标物质。也就是说，附着在磁化颗粒上的细胞保持在适当的位置，而未附着的物质被洗脱。然后，在完成该第一个洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被免受洗脱的物质，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，将非靶细胞标记并从异质细胞群中去除。
在某些实施方案中，使用系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行分离、细胞制备、分开、处理、温育、培养和/或制剂方法步骤中的一个或多个。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如，以便将错误、用户操作和/或污染降到最低。在一个实例中，所述系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US公开号20110003380A1中描述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在一体化或自含式系统中和/或以自动或可编程方式进行制备、选择、培育、工程化和/或制剂步骤中的一个或多个(例如全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、工程化和制剂步骤的各个方面进行编程、控制、评估结果和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotic)进行分离和/或其他步骤，例如，用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。组件可包括集成微型计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制该仪器的所有组件并指导该系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制管组各处的流速，并与夹管阀一起确保缓冲剂通过该系统的流动受到控制和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用提供在无菌、无热原溶液中的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞之后，洗涤细胞以除去过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，管组进而连接到含有缓冲剂的袋和细胞收集袋。管组包括预组装的无菌管，包括预柱和分离柱，仅供一次性使用。在启动分离程序之后，系统自动将细胞样品施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，与本文所述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且未保留在柱中。在一些实施方案中，与本文所述的方法一起使用的细胞群是标记的并且保留在柱中。在一些实施方案中，在去除磁场后，将与本文所述方法一起使用的组合物从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞处理单元，其允许通过离心将细胞自动洗涤和分级分离。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞培养室，其完成细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651–660,Terakura等人(2012)Blood.1:72–82和Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过流式细胞术进行分离或选择，其中在流体流中携带针对多种细胞表面标志物染色的细胞。在一些实施方案中，通过制备规模的(FACS)-分选收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355–376。在两种情况下，可以用多种标志物标记细胞，从而允许以高纯度分离定义明确的T细胞亚群。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标志物标记抗体或结合配偶体，以促进针对阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记抗体的结合。在一些实例中，比如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括例如与流式细胞检测系统联合的制备规模FACS和/或微机电系统(MEMS)芯片，基于对一种或多种细胞表面标志物特异的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞，所述细胞表面标志物被携带在流体流中。这样的方法允许同时基于多种标志物进行阳性和阴性选择。
d.冷冻和冷冻保存
在一些实施方案中，所提供的方法包括在制备、培育和/或工程化之前或之后冷冻例如冷冻保存细胞的步骤。在一些实施方案中，将细胞冷冻，同时测试这样的细胞的样品的复制型病毒。在一些实施方案中，冷冻和随后的解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，将细胞悬浮在冷冻溶液中，例如随后为洗涤步骤以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个实例涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS或其他适合的细胞冷冻培养基。然后用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的终浓度分别为10％和4％。然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。在一些实施方案中，在评估所述细胞的复制型病毒的所述方法之前、期间或之后，将细胞冷冻，例如冷冻保存。在一些实施方案中，在所述处理方法之前、期间或之后将细胞冷冻，例如冷冻保存。
e.病毒载体颗粒与细胞温育
在一些方面，细胞(例如细胞群)，例如如所述获得和/或分离的细胞群，可以(或已经)在允许基因转移的条件下与病毒载体颗粒一起温育和/或接触。在任何这样的一些实施方案中，病毒载体颗粒细胞群在例如病毒输入的条件下与细胞群一起温育和/或接触，所述条件允许病毒颗粒转移到细胞中和/或编码重组和/或异源分子例如重组受体(比如CAR)的核酸在细胞中表达。
病毒转导比如γ-逆转录病毒或慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，细胞群可以是先前已经受冷冻保存的细胞群。
在转导步骤过程中含有细胞和病毒载体颗粒的组合物可以进一步包括一种或多种另外的药剂，例如促进转导效率的药剂，例如聚阳离子，包括鱼精蛋白(例如硫酸鱼精蛋白)、溴化己二甲铵(Abbott Laboratories Corp)和CH-296(Clontech)。在一些实施方案中，聚阳离子可以以1μg/mL至100μg/mL比如5μg/mL至50μg/mL的终浓度存在于输入组合物中。所述组合物还可以包括培养基，包括细胞培养基，包括设计用于培养待处理细胞类型的培养基，比如造血干细胞培养基，例如无血清培养基。
在一些实施方案中，可以在小于100比如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(MOI)下实现转导。
在一些实施方案中，可以或已经用编码重组受体的核酸转导和/或基因工程改造细胞，所述重组受体比如嵌合受体，比如抗原受体，例如CAR或转基因TCR。在一些方面，用核酸转导至少7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更多的T细胞。
f.培养和刺激
在一些实施方案中，细胞的刺激和/或增殖和/或扩增与基因工程相结合(或在基因工程之后)。在一些实施方案中，处理步骤包括细胞的温育，所述细胞比如选择的细胞和/或转导的细胞，其中温育步骤可包括细胞的培养、培育、刺激、活化和/或增殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下温育组合物或细胞。这样的条件包括设计诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露和/或引发细胞用于基因工程(比如用于引入重组抗原受体)的那些条件。
在一些实施方案中，刺激或激活分离的细胞，比如选择的细胞群。在一些实施方案中，处理步骤包括在刺激条件下温育含有细胞的组合物。温育可以在基因工程之前或与基因工程相结合，所述基因工程比如由上述转导方法的实施方案产生的基因工程。在一些实施方案中，例如，在转导之前，刺激导致细胞活化和/或增殖。
在一些实施方案中，在转导之后进行增殖和/或扩增，以将转导的细胞培养至足以用于临床应用的数目。在一些实施方案中，将转导的细胞在诱导扩增的条件下温育或培养至少或约至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更长时间。在一些情况下，通过培养7-10天使细胞扩增。在一些实施方案中，在一种或多种刺激剂存在下在或在约37℃±2℃进行细胞的温育或培养。
在一些实施方案中，用于刺激和/或活化的条件可包括下列一种或多种：特定的介质、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、作用剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的作用剂。
在一些实施方案中，刺激条件或作用剂包括一种或多种作用剂，例如配体，其能够激活TCR复合物的细胞内信号转导结构域。在一些方面，所述作用剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号级联。这样的作用剂可以包括抗体，比如对TCR特异的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种能够刺激共刺激受体的作用剂，例如配体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这样的作用剂和/或配体可以与固体支持物如珠子和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中加入抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤(例如，浓度至少约0.5ng/ml)。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些实施方案中，通过如下步骤扩增T细胞：向组合物添加饲养细胞(比如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群针对待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5个、10个、20个或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并且温育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可包含γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围的γ射线照射PBMC以阻止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件通常包括适合人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，通常至少约30度，并且通常为或约为37摄氏度。任选地，温育可以进一步包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围的γ射线照射LCL。在一些方面，以任何适合的量提供LCL饲养细胞，比如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比例为至少约10:1。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞而获得抗原特异性T细胞，比如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆可以通过从感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原体外刺激所述细胞而生成。
在一些实施方案中，在封闭系统中进行具有一种或多种刺激条件或刺激剂(比如上述任何一种)的温育的至少一部分。
在一些实施方案中，与刺激剂一起温育的总持续时间为或约为1小时至72小时、1小时至48小时、4小时至36小时、8小时至30小时或12小时至24小时，比如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些情况下，温育的总持续时间为或约为5分钟至约6小时，比如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，对用病毒载体颗粒转导的细胞群进行一个或多个步骤和/或选择以富集基因工程化细胞。例如，在一些方面，可以使用病毒载体内的转导标志物来证实表达受体的细胞的转导或工程化和/或表达受体的工程化细胞的选择。在一些方面，这种标志物可以由不同的核酸或多核苷酸编码，其也可以在基因工程过程中通常经由相同的方法，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导而被引入。
制剂
在一些实施方案中，所述方法步骤可包括细胞制剂，例如由所提供的转导处理步骤和/或如所述一个或多个其他处理步骤产生的基因工程化细胞的制剂。在一些实施方案中，将细胞配制为配制药物产品(FDP)。在一些实施方案中，所提供的与细胞制剂相关的方法包括在封闭系统中处理转导的细胞，比如使用上述处理步骤转导和/或扩增的细胞。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲剂中，在一些方面，所述缓冲剂可包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将培养基更换为药学上可接受或期望用于施用于受试者的培养基或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以将所述细胞放回药学上可接受的缓冲剂中，所述缓冲剂可包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。这样的包括药学上可接受的载体或赋形剂的药物形式的实例可以是下文所述的任何形式，其与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式相结合。在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(比如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
在一些实施方案中，配制缓冲剂含有冷冻保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％的DMSO溶液比如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液的冷冻保存剂溶液配制细胞。在一些实施方案中，冷冻保存溶液是或含有例如含有20％的DMSO和8％的人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他适合的细胞冷冻培养基。在一些实施方案中，冷冻保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％的DMSO。在一些实施方案中，处理步骤可涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以将所述细胞放回冷冻保存剂溶液中。
在一些实施方案中，所述处理可包括将细胞稀释或浓缩至期望的浓度或数目，比如为单位剂量形式的组合物，其包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数。在一些实施方案中，处理步骤可包括减小体积，由此根据需要增加细胞浓度。在一些实施方案中，处理步骤可包括增加体积，由此根据需要降低细胞浓度。
在一些实施方案中，所述处理包括将一定体积的配制缓冲剂添加至转导的和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，配制缓冲剂的体积为或约为10mL至1000mL，比如至少或约至少或约为或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，比如与细胞处理系统相关的封闭系统可以将处理的细胞压出(express)到期望数量的(或多个)输出容器(例如袋子)中。在一些方面，可以将细胞以剂量施用的量压出到多个输出袋中的一个或多个，比如用于单个单位剂量施用或多剂量施用。例如，在一些实施方案中，输出袋可各自含有用于以给定剂量或其部分施用的细胞数。因此，在一些方面，每个袋可含有用于施用的单个单位剂量，或者可含有期望剂量的一部分，使得多个输出袋中的多于一个，比如如输出袋中的两个或输出袋中的三个共同构成施用剂量。
因此，容器(例如袋子)通常含有待施用的细胞，例如所述细胞的一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待施用于受试者的细胞的量或数目，或者是待施用细胞的数目的两倍(或更多)。它可以是待施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋子)单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大约或基本相同数目的细胞。在一些实施方案中，单位剂量包括待治疗的受试者和/或细胞所来源的受试者每kg少于约1x 108、少于约5x 107、少于约1x 106或少于约5x 105个细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x106、2x 106、5x 106、1x 107、5x 107或1x 108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个袋中的配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，比如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。
在一些实施方案中，多个输出袋中的一个或多个可用于测试，比如用于检测复制型载体或评估转导效率。可以使用本文所述的任何方法来检测复制型载体。在一些方面，在使用所提供的方法的实施方案转导后，可以通过测量由病毒载体颗粒基因组中包含的核酸编码的重组蛋白(比如异源蛋白)的表达水平来评估转导效率。因此，在一些实施方案中，可以通过许多熟知的方法中的任何一种来评估重组分子的表达水平，比如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)进行检测，例如在细胞表面蛋白的背景下，比如通过流式细胞术进行检测。在一些方面，通过检测转导标志物和/或报告构建体，测试包含在多个容器(例如袋子)的一个或多个中的细胞的重组分子表达水平。在其他实施方案中，使用编码作为标志物包含在载体内的截短表面蛋白的核酸来评估表达。
定义
如本文中使用的术语“载体”是指能够传送与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。其中载体为病毒载体，比如逆转录病毒，例如γ-逆转录病毒和慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而无需考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。
如本文中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确规定。例如，“一个(a)”或“一个(an)”表示“至少一个”或“一个或多个”。应当理解的是，在本文中描述的方面和变体包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方面和变体。
贯穿本公开内容，将要求保护的主题的各个方面以范围格式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该陈述述范围内的任何其他陈述值或中间值都被包括在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小范围内，并且还被包括在要求保护的主题内，受制于所陈述范围内的任何特别排除的极限值。当陈述范围包括极限值之一或两者时，排除这些被包括的极限值的任一者或两者的范围也被包括在要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都是适用的。
如本文中使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的对应值的通常误差范围。在本文中提及的“大约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文中使用的，组合物是指包括细胞在内的两种或更多种产物、物质或化合物的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文中使用的，“受试者”是哺乳动物，比如人或其他动物，并且通常是人。
示例性实施方案
其中本文的实施方案为：
1.一种方法，其包括：
a)确定测试样品中参数的水平，其中所述参数或水平指示生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或与其相关联(任选地正或反相关)，所述生物样品包含至少一个含有异源核酸和/或编码异源蛋白质的核酸的细胞，其中：
生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或风险；并且/或者
病毒RNA是复制型病毒的复制能力所需的，或编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
2.实施方案1的方法，进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或其风险。
3.实施方案1或实施方案2的方法，进一步包括以下步骤：
b)将在(a)中确定的参数的水平与所述参数的第一参考值比较。
4.实施方案3的方法，其中所述比较指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
5.实施方案1-4中任一项的方法，进一步包括：
确定生物样品或其部分中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险，和/或
确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有存在的风险。
6.实施方案1-5中任一项的方法，其中：
当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平等于或高于第一参考值时，所述生物样品被认为具有、可能具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或
当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平等于或低于第一参考值时，所述生物样品被认为具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关；当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平低于第一参考值时，所述生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为是RCR阴性的，或被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或不可能含有复制型病毒的存在，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或
当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平高于第一参考值时，所述生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或没有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关。
7.实施方案4的方法，其中：
即使确定生物样品中存在另一种复制能力所需的病毒RNA，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险；
即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的第二测试样品中检测到或已检测到等于或高于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与所述生物样品中另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈正相关；和/或
即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的另一个测试样品中检测到或已检测到等于或低于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈负相关。
8.实施方案1-7中任一项的方法，其中：
当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为具有或可能具有复制型病毒的存在或具有其风险；
当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为可能具有复制型病毒的存在或具有其风险，但在没有进一步的风险指征和/或没有评估指示另一种病毒RNA的另一个参数的情况下不认为含有复制型病毒的存在；和/或
如果确定生物样品中不存在病毒RNA和/或如果确定生物样品中任选地等于或低于阈值量的病毒RNA的量(或不超过该量)，任选地即使确定在生物样品中存在病毒复制能力所需的另一种RNA，所述生物样品也被认为没有或可能没有复制型病毒的存在、和/或没有其风险；和/或
如果测试样品中的所述参数和/或病毒RNA不可检出或未检测到和/或确定不存在于生物样品中，则所述生物样品被认为是复制型病毒阴性的。
9.实施方案1-8中任一项的方法，其中
所述第一参考值是等于或大约等于或稍高于阈值水平或最小可检测水平或与其对应的读出的值；
所述第一参考值是在阳性对照样品中检测到的参数的值、和/或指示RNA量的参数的值；和/或
所述参数的水平指示生物样品中病毒RNA的存在或不存在；和/或
所述病毒RNA包括编码第一病毒基因的核酸；和/或
所述异源核酸编码异源基因产物。
10.实施方案1-9中任一项的方法，其中在测试样品中评估的参数是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。
11.实施方案10的方法，其中所述量是绝对量或相对量。
12.实施方案1-11中任一项的方法，其中所述参数和/或水平是或包括替代或相对值，其任选地是循环阈(Ct)值。
13.实施方案12的方法，其中如果测试样品的CT值低于第一参考值(为参考Ct评分)，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。
14.实施方案1-13中任一项的方法，其中所述测试样品是或衍生自生物样品或其部分。
15.一种方法，其包括：
a)确定或评估测试样品中第一参数的第一水平，其中所述第一水平或第一参数与生物样品中第一病毒RNA和/或编码第一病毒基因(编码所述第一病毒RNA)的第一核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；
b)确定或评估测试样品中第二参数的第二水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中所述第二水平或第二参数与生物样品中不同于所述第一病毒RNA的第二病毒RNA和/或编码第二和不同的病毒基因(编码所述第二病毒RNA)的第二核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；
其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；
其中：
生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或
所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
16.实施方案15或20的方法，进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中第一和/或第二病毒RNA或基因产物的存在、不存在、浓度或量或其风险。
17.实施方案16的方法，进一步包括：
c)将在(a)和/或(b)中确定的第一和/或第二参数的水平与第一和/或第二参考值比较，其中所述比较任选地指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
18.实施方案15-17和20中任一项的方法，进一步包括：
c)确定生物样品或其部分中第一病毒RNA或表达的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险，并且/或者确定生物样品或其部分中第二病毒RNA或表达的存在、不存在、或量或浓度或任何前述项的风险；和/或
d)任选地基于c)中的确定，确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有复制型病毒存在于其中的风险。
19.实施方案1-19中任一项的方法，其中所述病毒RNA来自和/或第一病毒RNA来自和/或第一病毒基因是env、gag、pol或rev；和/或
所述病毒RNA来自和/或第二病毒RNA来自和/或第二病毒基因是env、gag、pol或rev。
20.一种方法，其包括：
a)评估测试样品中第一参数的水平，其指示生物样品中第一病毒RNA的量或存在或不存在或与之相关联(任选地正或反相关)，其中所述第一病毒RNA来自第一病毒基因(为env基因)，并且评估测试样品中第二参数的水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中第二病毒参数指示生物样品中第二病毒RNA的存在、不存在或量或与之相关联(任选地正或反相关)，其中所述第二病毒RNA来自选自gag、pol和rev基因的基因，其中所述生物样品包括用任选地包括异源基因产物的病毒载体颗粒转导的细胞和/或包括具有异源基因产物的细胞；
其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；
其中：
生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或
所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
21.实施方案1-20中任一项的方法，其中所述参数是病毒RNA的存在或不存在。
22.实施方案1-21中任一项的方法，其中所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是或对应于阈值水平或最小可检测水平。
23.实施方案1-22中任一项的方法，其中所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是对应于或针对阳性对照测试样品中的参数的值，所述阳性对照测试样品任选地含有已知量或浓度的病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一病毒RNA。
24.实施方案15-23中任一项的方法，其中：
如果所述方法确定生物样品中第一和第二病毒RNA的存在或高于其阈值量的量，并且任选地不是如果所述方法确定第一和第二RNA中的一者但不是两者的存在或高于其阈值量的量，则所述生物样品被认为含有或有风险含有或可能含有复制型病毒；和/或
如果所述方法确定生物样品中第一病毒RNA、或第二病毒RNA、和/或第一和第二病毒RNA两者的不存在、或其可检测量的不存在、或低于其阈值量的量，则所述生物样品被认为是阴性的或不含或没有风险含有或不可能含有复制型病毒。
25.实施方案15-24中任一项的方法，其中如果在测试样品中编码第一和第二病毒基因的病毒RNA的水平不可检出和/或未确定其在生物样品中存在或以高于阈值水平存在，则认为所述生物样品是复制型病毒阴性的。
26.实施方案1-25中任一项的方法，进一步包括在步骤a)之前从生物样品或来自它的部分或衍生自所述生物样品的样品或其部分中分离RNA的步骤，其中所述RNA包括来自至少一个细胞中的一个或多个的RNA。
27.实施方案1-26中任一项的方法，其中所述复制型病毒是或包括逆转录病毒，并且/或者其中病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA由逆转录病毒表达。
28.实施方案27的方法，其中所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒。
29.实施方案28的方法，其中所述逆转录病毒是慢病毒。
30.实施方案1-29中任一项的方法，其中所述生物样品来自人或哺乳动物，并且/或者一个或多个细胞是原代细胞，其任选地是人或哺乳动物细胞。
31.实施方案1-30中任一项的方法，其中所述一个或多个细胞和/或生物样品来自主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)或细胞系或其样品。
32.实施方案1-24中任一项的方法，其中所述至少一个细胞或生物样品是或来自用于自体细胞疗法的冷冻保存的材料(CMAT)、冷冻保存的药物产品(CDP)、或配制药物产品(FDP)或其样品。
33.实施方案1-32中任一项的方法，其中所述异源核酸或异源基因产物是或编码重组受体、嵌合受体、任选地嵌合抗原受体或转基因T细胞受体。
34.实施方案1-33中任一项的方法，其中使用对病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物进行确定或评估。
35.实施方案15-34中任一项的方法，其中使用对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估编码第二病毒基因的病毒RNA的水平。
36.实施方案1-35中任一项的方法，其中通过实时聚合酶链反应(PCR)评估病毒RNA的水平。
37.实施方案1-36中任一项的方法，其中所述确定或评估包括进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)。
38.实施方案1-37中任一项的方法，其中所述病毒RNA和/或第一和/或第二病毒RNA和/或病毒RNA和/或基因来自逆转录病毒。
39.实施方案1-38中任一项的方法，其中所述病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码任何前述项的基因)是参与病毒体复制和/或包装的基因或由其编码。
40.实施方案1-39中任一项的方法，其中所述病毒RNA和/或第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码前述一项或多项的基因)不是由已经用于转导所述转导的细胞的转移载体编码的基因。
41.实施方案1-40中任一项的方法，其中所述病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA编码病毒表面蛋白、包膜蛋白、组特异性抗原、病毒衍生的聚合酶、病毒衍生的逆转录酶、病毒衍生的调控元件、转录的反式激活因子或反应元件。
42.实施方案1-41中任一项的方法，其中gag基因选自下组，该组的组成为：鼠白血病病毒(MMLV)gag和人类免疫缺陷病毒(HIV)gag。
43.实施方案1-42中任一项的方法，其中env基因选自GaLV env和VSVG env。
44.实施方案34-43中任一项的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。
45.实施方案34-44中任一项的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。
46.实施方案34-45中任一项的方法，其中对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。
47.实施方案34-45中任一项的方法，其中对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包括在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。
48.实施方案1-47中任一项的方法，其中所述评估或确定包括使用对病毒RNA、病毒基因、第一病毒RNA或第一病毒基因、或第二病毒RNA或第二病毒基因的序列特异的水解探针。
49.实施方案48的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包括在SEQ IDNO:6中列出的序列。
50.实施方案49的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包括在SEQ IDNO:18、21或24中列出的序列。
51.实施方案1-50中任一项的方法，其中所述评估、确定或检测包括使用对病毒RNA、第二病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒基因中的一者或多者的序列特异的水解探针。
52.实施方案51的方法，其中所述水解探针包含在SEQ ID NO:6中列出的序列。
53.实施方案51的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包含在SEQ IDNO:18、21或24中列出的序列。
54.实施方案1-53中任一项的方法，其进一步包括评估测试样品中指示或关联编码测试样品或生物样品中的对照基因的RNA的水平或参数水平，任选地其中所述对照基因是或包含β-肌动蛋白和/或任选地其中使用对照基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估参数水平或对照基因，所述寡核苷酸引物各自任选地包含在SEQ ID NO:1或2或8-15之一中列出的一个或多个序列，任选地其中使用对照基因序列特异的水解探针评估所述水平，所述水解探针任选地包含在SEQ ID NO:3、9、12或15中列出的序列。
55.实施方案1-54中任一项的方法，其中所述评估或确定包括进行多重反应，其中在多重反应中评估任选地所述水平、第一水平和/或第二水平；以及任选地，指示对照基因或与其相关联的水平或参数。
56.实施方案1-55中任一项的方法，其中所述参数、第一参数和/或第二参数各自是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA(或第一或第二病毒RNA)的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。
57.实施方案56的方法，其中所述量是绝对量或相对量。
58.实施方案1-57中任一项的方法，其中所述参数和/或水平是或包括循环阈(Ct)值。
59.实施方案58的方法，其中如果测试样品的CT值低于第一参考值(为参考Ct评分)，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。
60.实施方案1-59中任一项的方法，其中所述生物样品和/或一个或多个细胞来自受试者。
61.实施方案1-60中任一项的方法，其中所述至少一个细胞包括多个细胞，并且其中：
所述多个细胞和/或所述生物样品包括悬浮细胞；
所述多个细胞和/或所述生物样品包括白细胞；和/或
所述多个细胞和/或所述生物样品包括T细胞或NK细胞。
62.实施方案15-61中任一项的方法，其中所述第一测试样品和第二测试样品中的一者或两者各自衍生自生物样品或其部分或含有衍生自生物样品或其部分的RNA。
63.实施方案15-61中任一项的方法，其中针对第一病毒RNA评估的测试样品和针对第二RNA评估的测试样品是相同的或者为同一个样品或组合物的部分。
64.实施方案61的方法，其中所述多个细胞包括未分级分离的T细胞、分离的CD8+T细胞或分离的CD4+T细胞。
65.实施方案1-64中任一项的方法，其中所述至少一个细胞是人类细胞。
66.实施方案29-65中任一项的方法，其中设定验收标准以评估实时PCR的有效性。
67.实施方案66的方法，其中验收标准包括在或在约90％和110％之间的效率百分比。
68.实施方案66-67中任一项的方法，其中验收标准包括约为或大于或大于约0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的R2值。
69.实施方案1-68中任一项的方法，进一步包括评估RNA的纯度、完整性和/或浓度。
70.一种包含寡核苷酸的引物，所述寡核苷酸包含在SEQ ID NO:1-24或35-41的任一个中列出的序列。
71.实施方案70的引物，进一步包含荧光模块或标记物。
72.一种试剂盒，其包含根据实施方案70和/或实施方案71的一个或多个引物。
73.实施方案71的试剂盒，进一步包含无核酸酶的水、逆转录酶、聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂和DNA酶中的一种或多种。
74.实施方案1-73中任一项的方法，其中所述测试样品是生物样品或其一部分。
75.实施方案1-69和74中任一项的方法，其中所述方法能够检测测试样品中的病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA，其中样品中为至少5个或至少10个或至少20个或至少50个或至少100个细胞，或为测试样品或生物样品中的1000万分率的细胞；和/或其中所述方法能够检测测试样品和/或生物样品中不超过或不超过约1.5pg、1pg或0.75pg或更少的病毒靶标的靶RNA的量。
76.实施方案1-69、74和75中任一项的方法，其中一个或多个细胞和/或生物样品是从其中转导的细胞已经在扩增所述细胞的条件下培养的过程中收集的，所述条件任选地在或在约37℃和/或在一种或多种刺激剂存在下。
77.实施方案76的方法，其中转导的细胞已经培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天；或为或约为2至14天、2至10天、4至14天、4至10天或7至10天。
78.一种方法，其包括：
a)评估测试样品中的病毒RNA的水平，
其中所述测试样品包含来自包含至少一个细胞的样品的RNA，所述细胞包含异源核酸；和
其中病毒RNA的水平指示所述测试样品中复制型病毒的存在、不存在或量。
79.实施方案78的方法，进一步包括以下步骤：
b)将所述测试样品中的病毒RNA水的平与第一参考值比较；和
c)确定所述测试样品中是否存在复制型病毒，
其中如果病毒RNA的量高于第一参考值，则认为所述样品是复制型病毒阳性的。
80.实施方案79的方法，其中如果病毒RNA的水平低于第一参考值，则认为测试样品细胞是RCR阴性的。
81.实施方案78-80中任一项的方法，其中如果病毒RNA的水平不可检测，则认为所述测试样品是复制型病毒阴性的。
82.实施方案78-81中任一项的方法，其中所述第一参考值是阈值水平或最小可检测水平。
83.实施方案78-82中任一项的方法，其中所述第一参考值是阳性对照。
84.实施方案78-83中任一项的方法，其中病毒RNA的水平是病毒RNA的存在或不存在。
85.实施方案78-84中任一项的方法，其中所述病毒RNA包含编码第一病毒基因的核酸。
86.实施方案78-85中任一项的方法，其中所述异源核酸编码异源基因产物。
87.一种方法，其包括：
a)评估测试样品中编码第一病毒基因的病毒RNA的水平和编码第二病毒基因的病毒RNA的水平，其中所述测试样品包含来自包含至少一个细胞的样品的RNA，所述至少一个细胞经包含异源基因产物的病毒载体颗粒转导，并且其中所述第一和第二病毒基因不相同；
b)将所述测试样品中第一和第二病毒基因的水平分别与第一和第二参考值比较；和
c)确定所述测试样品中是否存在复制型病毒，其中如果第一和/或第二病毒基因的水平分别高于第一和/或第二参考值，则认为测试样品细胞是复制型病毒阳性的。
88.实施方案85-87中任一项的方法，其中所述第一病毒基因是env、gag、pol或rev。
89.实施方案86或实施方案88的方法，其中所述第二病毒基因是env、gag、pol或rev。
90.一种方法，其包括：
a)评估测试样品中编码第一病毒基因的病毒RNA的水平，其中第一病毒基因是env基因，并评估编码第二病毒基因的病毒RNA的水平，其中第二病毒基因选自gag、pol或rev基因，其中所述测试样品包含来自包含细胞的样品的RNA，所述细胞经包含异源基因产物的病毒载体颗粒转导；
b)将所述测试样品中编码第一和第二病毒基因的病毒RNA的水平分别与第一和第二参考值比较；和
c)确定测试样品中是否存在复制型病毒，其中如果第一和/或第二病毒基因的病毒RNA水平分别高于第一和第二参考值，则存在复制型病毒。
91.实施方案78-90中任一项的方法，其中评估病毒RNA的水平或病毒基因的表达包括计算循环阈(Ct)值。
92.权利要求91的方法，其中如果Ct评分高于最大Ct值，则病毒RNA的水平或病毒基因的表达低于所述第一参考值。
实施例
下面的实施例仅仅是为了说明的目的而被包括在内，并非意在限制本发明的范围。
实施例1：评估指示病毒RNA靶标(如GaLV env和/或MMLV gag)的参数的水平的示例性 测定法
该实施例描述了用于评估测试样品中一个或多个参数的水平的示例性方法，所述参数指示生物样品中病毒RNA的存在、不存在、水平或其他读出和/或复制型逆转录病毒(RCR)的现有存在或可能存在或风险。生物样品通常包括至少一个细胞，比如包含异源核酸或编码异源基因产物的全部或部分的核酸(比如异源、外源和/或重组核酸和/或蛋白质)的细胞。在一些方面，这样的细胞已经经历了核酸或其他生物分子的引入(比如通过转导)，所述核酸或其他生物分子通常由逆转录病毒载体、逆转录病毒载体颗粒或逆转录病毒编码和/或被包含在其中。测试样品通常包含RNA或由其产生的产物(比如cDNA)，所述RNA已从生物样品中的细胞中分离或存在于所述细胞中，比如用包含异源基因产物的病毒载体颗粒转导的细胞。生物样品中的细胞可以是哺乳动物细胞，比如人类细胞。
在该方法的一个方面，参数的检测是或包括在测试样品或生物样品中的GaLV envRNA或从其转录或由其编码的核酸的存在或不存在或量或相对量，或作为替代的参数，例如其与这样的RNA反或正相关。在一些方面，这样的参数的水平用作确定样品中RCR的可能性、风险、存在或不存在的标志物。通常，GaLV env基因编码存在于复制型逆转录病毒中的病毒包膜蛋白，并且在一些方面，其对于复制型病毒或其复制能力是必需的或必要的，但不是充分的。
在该方法的一些方面，参数的水平是或包括在测试样品或生物样品中的MMLV gagRNA或从其转录或由其编码的核酸或其他产物的存在或不存在或量，或作为这样的RNA或核酸的替代的参数，例如其与这样的RNA反或正相关。在一些方面，这样的参数的水平用作确定样品中RCR的可能性、风险、存在或不存在的标志物。通常，MMLV gag基因编码包含病毒基质、衣壳和核衣壳蛋白的病毒蛋白，并且在一些方面，其对于复制型病毒或其复制能力是必需的或必要的，但不是充分的。
在一些方面，一种或多种病毒RNA中的每一种(如GaLV env RNA或MMLV gag RNA)的水平、存在、量、浓度、不存在或相对量或浓度由测试样品中相应参数的水平指示或确定，其中所述参数与例如在测试样品和/或生物样品中的对应RNA的水平、存在、量、浓度、不存在或相对量或浓度反或正相关。
通常，包含RCR的转导细胞可以转录产生感染性病毒颗粒所需的各种病毒基因，比如复制型病毒所需的那些基因。通常，在转导细胞中存在的异源或病毒衍生的核酸中，不存在这样的基因(和/或足够数量或一组这样的基因)，所述转导细胞中使用病毒载体插入了异源或重组分子。这样的基因可包括env和gag基因，比如GaLV env和/或MMLV gag。
对一个或多个测试样品进行示例性测定法(如实施例2、4或6中所述进行，以评估或证实包括测试样品或对照样品在内的特定样品中RCR的不存在)。测试样品包括一个或多个测试样品，其含有分别分离和/或衍生自一个或多个生物样品的RNA。其中生物样品通常含有一个或多个细胞，比如人类细胞或哺乳动物细胞，比如其被配制为用于细胞疗法或给药，其中期望证实不存在复制型病毒；其中生物样品或参考测试样品中也可以是那些已知含有或不含一定参考量的在测定法中被评估的病毒RNA和/或对照核酸的样品。这样的样品的组合，比如加标样品，可以用作测定法中的生物样品或测试样品。
在某些应用中，比如在实施例4或6中描述的研究中，被评估的生物样品含有使用具有编码嵌合抗原受体(CAR)的异源核酸的逆转录病毒载体转导的细胞；在测定法中使用的样品通常还包括一种或多种对照样品，比如对照生物样品和/或对照测试样品。
任选地将一个或多个生物样品比如包含转导细胞的生物样品解冻，并从样品中提取RNA以产生一个或多个测试样品。可以制备一式三份或一式两份或更多份的测试样品。使用RNA作为模板，通过逆转录生成cDNA。
可以并行地运行对照样品，包括阴性对照和/或含有已知量的一种或两种靶标/部分的那些样品。在一些方面，对照RNA是或包含至少一部分肌动蛋白，并且/或者病毒RNA包含GaLV env RNA的全部或一部分和/或MMLV gag RNA的全部或一部分。在这样的方面，在反应中使用对肌动蛋白和/或GaLV env(或MMLV gag)特异的引物和水解探针；在一些情况下，比如其中含有靶RNA和对照RNA两者的双重构建体被掺入对照样品中的那些情况，对于对照RNA和靶RNA两者特异的引物/探针被包括在同一反应中或被多重化。示例性肌动蛋白和GaLV env引物及探针显示在表1中。
表1：示例性肌动蛋白和env引物及探针序列
在一些实施方案中，例如，其中使用多重实时PCR测定法，例如针对肌动蛋白(作为对照)和MMLV gag和/或RNA序列。示例性肌动蛋白(HuActin)和MMLV gag(gag)正向(F)和反向(R)引物及水解探针的序列显示在表2中。
表2：示例性肌动蛋白和MMLV gag引物及探针序列
使用对照样品，比如对照测试样品，比如质粒标准对照作为测定法的PCR扩增部分的对照。在一个实例中，对照样品包括含有细胞并且还含有(例如，掺有)已知量或浓度(例如，参考值)的标准品的样品，所述标准品比如已知数量/浓度/量的病毒RNA或其部分、对照RNA或其部分(例如，处于质粒标准对照的形式)，任选地两者在同一个构建体上。在一些实例中，对照(或用于校准测定法的样品)包括具有已知数目或相对数目的靶阳性细胞(例如，每细胞总数的靶+细胞)的样品。
在使用质粒标准对照的一些情况下，质粒包括在相同构建体上的用于改进对照的阳性和阴性对照核酸。在该方法的多个方面，质粒标准对照包括pActin-GaLVgag构建体(SEQ ID NO:34)。在该方法的多个方面，质粒标准对照包括pActin-MMLVgag构建体(SEQ IDNO:30)。
在一个实例中，在测定法中使用的已知量或浓度是凭经验确定的，比如通过进行研究来确定测定法针对特定质粒标准品的灵敏度和/或特异性。在一个这样的实例中，使用质粒标准对照样品稀释系列，其包括各种浓度或量，比如在每反应106至101个拷贝的范围内。使用每7μL 106至101个拷贝的质粒标准对照样品稀释系列。
使用仅含有水和PCR试剂的无模板对照来提供关于例如一种或多种PCR试剂的任何潜在污染和/或污染状态的信息。使用无逆转录酶(-RT)对照来评估RNA模板的纯度并验证或证实污染性DNA的不存在和/或检测任何潜在的污染性DNA。
使用来自不表达靶病毒基因例如不表达GaLV env的细胞系的RNA作为阴性对照。与测试样品相比，以例如总RNA和/或细胞的相似浓度或量使用阴性对照。
基于参考值建立用于测定法的阳性对照，所述参考值比如示例性检测限，其在一些方面凭经验确定，例如通过选择期望的置信区间并用一系列已知数量的GaLV env RNA评估样品。
在一些实施方案中，作为阳性对照，以等于或大约为或稍高于测定法的示例性检测限或检测水平的量使用来自表达靶病毒基因比如不表达GaLV env的细胞系(例如，293Vec-GaLV)的RNA。在实施例2中进行的测定法中，阳性对照含有0.75pg的GaLV RNA。将这个阳性对照的RNA水平用作参考值，用于与测试样品比较。
在测定法的每个孔中将肌动蛋白的检测与靶病毒基因例如GaLV env的检测一起多重化。这个参数控制RNA质量。在每个孔中肌动蛋白的存在证实RNA是存在的，并且其质量足以能够经历逆转录和PCR扩增。在一些方面，未在阳性对照反应中评估肌动蛋白，因为它通常不可检出。
在一些示例性方法中，针对在RNA分离程序过程中的污染，使用未曾用包含异源基因产物的病毒载体颗粒转导的来自患者匹配的材料的RNA作为对照。
对于测试样品，测试了从10x 106个细胞分离的RNA，其中每孔使用7μL。在示例性方法中，将每个对照和测试样品分配到96孔格式的一个或多个孔中。以一式三份运行对照和测试样品。将样品与肌动蛋白及GaLV env正向和反向引物、水解探针以及用于进行RT-PCR的组分混合，所述组分由RNA UltraSense一步定量RT-PCR酶混合物和RNA UltraSense一步定量RT-PCR 5X反应混合物(ThermoFisher Scientific)提供。
在一些方面，使用可商购的一步定量RT-PCR系统进行测定法。多重实时PCR测定可以运行40个循环。通常，在扩增子生成时发生的探针水解释放荧光分子，所述荧光分子由实时PCR机检测。设定阈值水平，并获得每个测定孔的阈值循环(Ct)值。对重复的Ct值取平均值。
在一些方面，所述测定法被认为适合于特定用途和/或在某些标准的基础上有效。在一些方面，期望模板对照在每个孔中没有或具有很小的Ct值。在一些方面，质粒标准参数在所使用的检测方法的适当范围内。在一些方面，未转导的阴性对照应该在每个孔中没有Ct值，并且适当的A260/280值指示适当的RNA质量。测试样品通常同样应该具有适当的A260/280值(例如，在2-2.1之间，包括端值)、肌动蛋白的适当Ct值、以及特定测定法所需的其他对照参数。
下面列出了对具有特定条件的假设样品进行的测定法的假设结果，以说明如果所述方法用于评估衍生自确实含有复制型病毒的生物样品的测试样品可以获得的结果。在这个实施例中，通过实时PCR检测肌动蛋白和GaLV env扩增子，并且基于针对这样的测试样品检测或确定的参数(例如，Ct值或ΔCt值或ΔΔCt值)的水平与相应的参考值的比较，将测试样品的结果报告为“检出RCR相关RNA”或“未检出RCR相关RNA”，所述参考值例如针对具有已知量的靶RNA(含有例如1.5、1或0.75或0.5pg的GaLV env RNA)的阳性对照确定的这样的参数(例如，Ct值或ΔCt值或ΔΔCt)的相应水平。例如，在一些实施方案中，如果测试样品孔中的Ct值(或重复的平均值)被认为大于针对阳性对照(含有已知或预定量的GaLV envRNA)确定的Ct值，那么可以认为GaLV env RNA在作为测试样品的相应生物样品中或测试样品所来源的生物样品中不存在，并且通常将这样的测试样品鉴定为‘未检出RCR相关RNA’。在一些实例中，基于ΔCt或ΔΔCt值的比较，例如，基于针对阴性对照样品(比如已知未曾暴露于感兴趣的病毒颗粒或复制病毒的样品)获得的Ct值或ΔCT值与针对给定测试样品获得的Ct值或ΔCT值之间的差值(Δ)的程度来确定测试样品被鉴定为“检出RCR相关RNA”或“未检出RCR相关RNA”。在一些方面，测定法的阈值水平(比如高于或低于测试样品被认为是阳性或阴性和/或被认为或不被认为含有RCR相关RNA的水平)表示为阳性对照样品的这种差值或Δ的程度，所述阳性对照样品比如已知含有等于或约等于测定法的检测限(LOD)的所述病毒RNA的样品。例如，可以将阈值设定为这样的阳性对照样品的Ct值或ΔCT值与阴性对照样品的Ct值或ΔCT值之间的差值(或Δ)，或者可以将阈值设定在相对于这样的对照差值或Δ(比如其倍数)的某一点上。
在一些实施方案中，确定了在阳性对照(比如已知含有等于或约为检测限(LOD)的病毒RNA的样品)的Ct值与阴性对照样品的Ct值之间的差值，所述阴性对照样品比如已知未曾暴露于包含异源基因产物的病毒载体颗粒或任何复制病毒的样品(或从样品衍生的样品)；在一些方面，将这种差值或其倍数或倍数差设定为阈值。在一些实例中，对于给定的测试样品和/或每个测试样品，确定了在该测试样品的Ct值与阴性对照样品的Ct值之间的差值，所述阴性对照样品比如已知未曾暴露于包含异源基因产物的病毒载体颗粒或任何复制病毒的样品(或从样品衍生的样品)，并且在一些方面将所述差值与这样的阈值比较。在一些实例中，如果这样的差值等于或低于阈值，则认为给定的测试样品“检出RCR相关RNA”。
在一些实例中，如果确定测试样品孔中的Ct值(或重复的平均值)小于针对阳性对照(含有已知量的GaLV env RNA)确定的Ct值，(或在测试样品的Ct值或ΔCt值与阴性对照的Ct值或ΔCt值之间的差值-或Δ-等于或高于阈值，所述阈值等于或对应于阳性对照的Ct或ΔCt(例如，具有等于或约为LOD的病毒RNA的样品的Ct或ΔCt)与阴性对照的Ct或ΔCt值之间的差值)，那么可以认为病毒RNA可能存在或存在于测试样品和/或生物样品中，并且在该示例性测定法中，这种测试样品将被鉴定为“检出RCR相关RNA”，其在一些方面可指示存在RCR或潜在RCR的风险。
在一些这样的方面，所述方法将进一步包括另外的测定法，比如进行相似但针对不同的RCR相关RNA(比如MMLV gag)的测定法或分析其结果。
实施例2：用于检测编码长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜(env)的基因的逆转录酶PCR (RT-PCR)测定法的设计
为了进行如实施例1中所述的测定法，设计了测定法以检测编码长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜(env)的基因。选择GaLV env作为靶标，部分原因是其在转导的人细胞组合物中的存在可以指示基于转导的重组事件，而不是内源病毒序列的存在。
2.引物/探针组
生成含有GaLV env序列和人β肌动蛋白序列的片段的阳性扩增对照质粒，以提供用于RT-PCR的引物和探针组的模板。pActin-GaLV质粒的序列在SEQ ID NO:34中列出。设计了四个候选引物和探针组以扩增GaLV env序列上的不同区域，并且还设计了围绕肌动蛋白片段靶标的两个候选引物和探针组。在RT和TAQ聚合酶的存在下进行定量逆转录酶PCR(RT-PCR)。用于RT-PCR的扩增条件列于表3中。
最初使用无模板对照(阴性对照)和pActin-GaLV质粒的稀释系列作为模板来测试引物/探针组。另外，将从293Vec-GaLV病毒包装细胞系(BioVec)(稳定表达GaLV包膜和MMLVgag/pol)分离的RNA用作逆转录反应和PCR扩增步骤的阳性对照。作为进一步的对照，使用来自解冻的冷冻保存的细胞组合物(冷冻保存的材料，CMAT)的RNA，所述细胞组合物通过这样的过程而产生：其包括来自个体受试者的白细胞单采术样品的CD4+和CD8+T细胞的基于免疫亲和力的选择，然后冷冻保存分离的细胞。未经病毒载体转导并且因此未曾暴露于病毒原液的CMAT样品被用作肌动蛋白引物/探针组的阳性对照，但不应生成GaLV env引物/探针组的扩增信号。
基于表4中所示的标准曲线性能参数的验收标准，选择前两个GaLV env引物探针组。
然后将引物/探针组单独测试并组合，以验证选择的GaLV env和肌动蛋白引物/探针配对之间的多重化不影响靶标检测的扩增性能。选择表1中列出的示例性GaLV env和肌动蛋白引物/探针对并用于随后的测定法开发。
3.RNA分离和样品质量
比较了不同的方法，以获得具有最小DNA污染的高质量RNA模板的分离。从如上所述生成的CMAT样品中分离RNA。在具有逆转录酶(+RT)和无逆转录酶(-RT)的情况下(在每种情况下都存在Taq聚合酶)进行RT-PCR，以区分源自RNA模板和源自污染性DNA模板的信号。
比较肌动蛋白模板在样品中的扩增信号。低循环数的高水平扩增指示样品中存在高浓度的模板。
作为与RNA样品纯度相关的示例性标准，设定了示例性阈值≥2.0(对于在分光光度计上测量的A260/A280比值)；还基于包含靶向管家基因肌动蛋白的引物/探针组来设定阈值。设定了循环数(CT)最大阈值，其与有待在测定法中评估GaLV env靶标存在的RNA样品的浓度和质量有关。此外，还设定了在重复之间的肌动蛋白CT值的标准偏差的最小值，例如，用于证实重复之间的一致性。还设定了针对无逆转录酶对照(-RT)(指示任何DNA污染的存在)的信号的阈值。将具有(+RT)和没有(-RT)逆转录酶的循环数的差值的示例性阈值最小水平设定为≥13.2。表5总结了RNA样品阈值水平。
选择细胞对照选择使其包括在每个测定中，以确保RNA分离程序的适当性能。在一些实施方案中，包含在各个测定中的示例性细胞对照是相同细胞组合物的等分试样，将其作为单次使用的等分试样储存在液氮中，其中，在每个测定中，从相同数目的细胞例如5x106个细胞中分离RNA。在一些方面，对这样的对照设定了阈值。RNA对照的示例性标准为：预期的RNA浓度的平均值(例如，根据多个等分试样确定)±4个标准偏差。
4.通过RT-PCR检测GaLV env RNA
对从293Vec-GaLV细胞系或pActin-GaLV质粒阳性对照分离的RNA进行GaLV envRT-PCR测定法。还从冷冻保存的细胞组合物(CCC)中分离RNA，所述细胞组合物已经用使用编码GaLV env包装元件的质粒产生的γ-逆转录病毒载体转导。评估了本研究中的测定法的各个参数，包括示例性特异性、线性、范围基质干扰、精确度以及样品和质粒对照的稳定性。
将通过利用GaLV或肌动蛋白引物/探针的单重RT-PCR在pActin-GaLV质粒模板上生成的扩增子测序，其与预测的GaLV和肌动蛋白序列100％相同。在来自293Vec-GaLV细胞或CMAT对照的克隆中，大约11％(1/9)的测序扩增子含有分别相对于预测的GaLV或肌动蛋白序列的单碱基对错配，可能原因为逆转录酶错误。
在用pActin-GaLV质粒标准品稀释系列进行的RT-PCR中，该测定法可以将每反应少至10个拷贝定量；在满足该限度的100％的孔中观察到等于或高于该拷贝数的靶标的检出，其中标准偏差≤1.5。观察到在101至106个拷贝/μL的线性检测范围，其中在100％的孔中检出，并且标准偏差≤0.5，每反应10个拷贝除外。
在另一系列的实验中，对从293Vec-GaLV细胞系分离的稀释系列的RNA进行RT-PCR。大于95％的具有至少0.5至0.75pg GalV+RNA的阳性样品在测定法中检测为阳性。在另一系列的实验中，将分离自293Vec-GaLV细胞系的稀释系列的RNA掺入到分离自CCC样品的RNA中。在测定法中可检出掺入到10x106个CCC细胞中的少至10个GALV+细胞(0.001％)，其中在100％的孔中检出，其CT值≤阳性对照的CT值。
为了评估RNA在测定法中的稳定性，将293Vec-GaLV细胞掺入到CCC样品中，将样品在室温下温育0、2、6或25个小时，然后分离RNA。使用标准方法分析RNA的RNA完整数(RIN)，并评估A260/A280和降解。时间过程研究证实，RNA在室温下保持稳定长达25小时(例如，这在某些情况下可能是期望的，例如考虑到操作者在样品处理中的可变性)。虽然在一直到25小时时仍观察到高质量的RNA，但在25小时时间点观察到RNA浓度降低，而在较早时间点是相当的。RIN仅在25小时时间点从10降低至9。确定GaLV检测在室温下在时间过程中是稳定的，而肌动蛋白检测在室温下随时间过程降低。
这些结果证明，GaLV RT-PCR测定法能够在1000万个CCC细胞的基质中检出10个加标的GaLV阳性细胞，并且足够稳健以至于在室温下放置一直到25个小时的应激样品中仍可检出GaLV信号。在这些研究中，观察到可接受水平的批间和批内变异。
实施例3：用GaLV env和MMLV gag双靶标测定法评估指示样品中复制型逆转录病毒或 与其相关或其所需的病毒RNA靶标
在一些实施方案中，使用示例的双靶标方法来评估转导细胞或其他细胞中复制型逆转录病毒(RCR)的不存在或存在。基本上如实施例1中所述进行该测定法，其中评估的靶RNA包括GaLV env RNA和MMLV gag RNA，各自在测试样品中被评估，其中使用各自的对应病毒RNA-肌动蛋白质粒标准品，使得在每个测定中使用相同的对照RNA，这样可以提供改进的对照。在一些方面，仅当通过该方法确定GaLV env和MMLV gag RNA两者都存在于样品中或高于参考量时，才能鉴定生物样品中的RCR风险。在一些方面，在确定RNA之一存在或高于参考之后，进行进一步的测定法，之后证实样品为阴性。
实施例4：用GaLV env靶标测定法评估指示样品中复制型逆转录病毒或与其相关或其 所需的病毒RNA靶标
通过该方法评估用逆转录病毒载体转导并处理的T细胞，以证实不存在RCR相关RNA。基本上如实施例1中所述，制备样品并进行基于RT-PCR的RCR检测方法。简言之，从一式三份包含转导细胞的生物样品中分离RNA。使用A260/280测量结果，分析所得的含RNA测试样品的RNA质量，使用分光光度计以及“无逆转录酶”对照PCR测试污染性DNA。确定所有样品都具有功能性99.999％纯的RNA。使用来自-GaLV细胞系(对于GaLV env)和转导细胞样品(对于肌动蛋白)的阳性对照RNA，验证在测定法中使用的RNA模板的线性。
使用具有衍生自转导细胞的RNA的样品，确定评估参数的参考值，所述转导细胞掺有每反应已知量(例如，大约0.75pg)的质粒对照(pActin-GaLV；SEQ ID NO:34)。
基本上如实施例2中所述，使用GaLV/肌动蛋白RT-PCR方法，与加标样品平行地评估未加标的转导细胞RNA样品(三个样品，一式三份)。在含有来自包含转导细胞的生物样品的RNA的每个测试样品中，观察到的Ct值指示生物样品中不存在靶RNA，正因如此，所评估的转导细胞样品没有一个被确定为RCR阳性。测试所有样品均为肌动蛋白阳性。阳性对照细胞衍生的样品的结果证实了该测定法的灵敏度和功能。
实施例5：过程中的测试
在示例性过程中，在整个产品制造过程的多个阶段进行RCR测试，所述产品制造过程通过用编码异源基因产物的病毒载体颗粒转导而将细胞工程化。在将细胞工程化的示例性方法中，进行白细胞单采术来收获外周血单核细胞(PBMC)，洗涤细胞，并通过基于免疫亲和力的富集进一步富集T细胞。任选地，将分离的细胞冷冻保存，随后解冻。在抗CD3/抗CD28珠子的存在下培养细胞(例如解冻的细胞)，随后用编码异源基因产物比如嵌合抗原受体(CAR)的GaLV假型化的逆转录病毒载体转导。转导后，将细胞在培养基中扩增一段时间，比如长达10天。任选地，通过冷冻保存将转导的细胞冷冻。将任选地解冻的扩增且转导的细胞进一步配制为用于施用于受试者。
比如进行如上述实施例中所述的测定法，例如以评估一种或多种以下生物样品：分离的病毒载体颗粒、载体上清液、载体生产细胞的主细胞库、生产终止细胞(EOPC)、最终载体转导的细胞(包括在离体扩增的不同时期和/或经历一段离体扩增期间的细胞)、冷冻保存的材料(CMAT)、冷冻保存的药物产品(CDP)和配制药物产品(FDP)。此外，生物样品还可以包括衍生自施用配制药物产品之后的受试者的样品。在产品制造过程的各个阶段，使用实施例1-3中任何一个或多个的测定法来检测包含转导细胞的样品中的RCR。
实施例6：掺有模型病毒的T细胞中的复制型病毒的检测
使用实施例1、2和4中描述的基于RT-PCR的方法，检测从T细胞样品获得的测试样品中GaLV病毒RNA的存在或不存在，所述T细胞样品掺有不同数量感染单位的复制野生型GaLV并且经受过体外处理。基于三位不同的人受试者的人外周血单核细胞(PBMC)的白细胞单采术，通过基于免疫亲和力的富集分离CD3+T细胞。然后将来自每位受试者的分离的T细胞冷冻保存。
在涉及CD3+T细胞的培养和扩增的离体过程期间，进行初步研究以评估不同已知的低量掺入的复制型逆转录病毒的复制程度或不存在。将分离的T细胞解冻，用抗CD3/抗CD28珠子活化，通过添加0、10、100或1000个感染单位(IU)的野生型GaLV复制病毒进行加标，在37℃扩增10天。作为阳性对照，并行地培养含有HEK293允许细胞的样品，其中掺入了相同IU的所述病毒。
在初始实验中，在培养开始后第4天和第10天收集上清液，并根据标准技术使用PG4S+L指示细胞系评估病毒滴度。对于测试样品，仅当将最高量(IU)的病毒(1000感染单位(IU))掺入培养物中时，才在第10天观察到复制病毒，正如通过标准PG4S+L指示细胞系噬斑测定法检出的。在其中HEK293允许细胞掺有相同病毒量的对照样品中，对于每个掺入量观察到将在上清液中检出的复制病毒，其使用PG4S+L指示细胞系噬斑测定法加以确定，进一步证实该测定法在添加每个病毒量后检测病毒复制的能力。
在进行的研究中使用相似的条件，以证实示例性的所提供的基于RT-PCR的RCR测定法在离体T细胞培养过程中检测样品中低水平的复制病毒的能力。将分离的T细胞解冻并用抗CD3/抗CD28珠子活化，并且如上所述不掺入或掺入不同量的野生型GaLV复制病毒，不同之处在于，在该过程中，使用编码基因产物(载体)的GaLV假型化的病毒载体颗粒，将一些样品的细胞用异源基因产物转导。将细胞在37℃下培养10天时间。在第4、7和10天收集来自扩增培养物的上清液，并使用如上所述的PG4S+L指示细胞系评估病毒滴度。另外，在第4、7和10天从扩增的T细胞中收获RNA，并使用示例性RT-PCR测定法评估指示复制病毒的病毒RNA的存在，基本上如实施例2中对编码GaLV病毒RNA的env所述。在RT-PCR测定法中，通过从测定法的RNA阳性对照的CT值减去各个RNA样品的GaLV CT值计算ΔCT值，将测定法的结果标准化。作为比较，通过在第4、7和10天收获T细胞并且将T细胞在扩增期与HEK293允许细胞系共培养进行RCR共培养测定法，然后使用PG4S+L指示细胞系检测共培养细胞的上清液中病毒的存在或不存在。
该研究表明，所述测定法可以检测低水平的复制病毒，与标准共培养噬斑测定法相比，具有相同或更高的灵敏度。表6中列出了每个条件的三次不同运行的结果。将PG4S+L-收获滴度包括在内，以强调PG4S+L-指示系仅能够检测一些掺有高水平GaLV病毒(1000IU)的未扩增样品中的RCR。如所示，在培养开始后第7天和第10天收集的样品中，使用示例性的所提供的RT-PCR测定法和共培养方法两者都在复制型GaLV病毒掺入后的样品中可检出复制掺入病毒的存在。在第4天收集的样品中，使用RT-PCR方法可以检出这种复制病毒的证据(在已经掺入复制型GaLV的样品中)，即使在使用共培养测定法未检出这种复制的情况下也是如此。
表6：针对相应样品的RCR共培养测定法结果与RT-PCR结果的比较
TNTC＝太多无法计数
如表6中所示，将RCR共培养测定法和RT-PCR测定法的结果进行比对，用阴影表示的四次运行除外。在这些运行之一中，RT-PCR测定法在第4天在掺有10IU GaLV病毒的样品中检出GaLV病毒RNA，但在第7天和第10天未检出，而针对这些样品的RCR共培养测定法在任何时间点都未检出GaLV RNA。不希望受理论的束缚，在第4天的阳性结果可能反映了未复制的低水平RCR或来自病毒刺突的残留RNA的检出。在第7天和第10天的阴性结果也可能反映发生在细胞培养物的培养基进料期间RCR或病毒RNA的稀释，其低于RT-PCR测定法的检测阈值。
RT-PCR和RCR共培养测定法对于掺有10IU的GaLV病毒的样品也产生不同的结果，所述样品经编码病毒载体(载体)的基因转导。RT-PCR测定法在第4天和第7天是阳性的，但第10天不是阳性的，而RCR共培养测定法的转变仅仅在第7天为阳性。不希望受理论的束缚，这些结果可能反映了样品中RCR的初始存在，但到第10天未充分复制至可被检出的程度。此外，在第4天和第7天RCR共培养测定法的不一致结果可能指示所述病毒接近该测定法的检测限。这些结果支持GaLV RT-PCR测定法的灵敏度研究结果。
在掺有100IU的GaLV病毒并且用病毒基因载体转导的样品中观察到相似的结果。RT-PCR和RCR共培养测定法两者都在第4天检出病毒，但在第7天只有GaLV RT-PCR测定法检出GaLV RNA。在第10天，两种测定法都未检出GaLV RNA。与掺有10IU的GaLV病毒并且被转导的样品一样，初始水平的GaLV病毒可能没有充分复制，以避免被细胞培养物扩增稀释。在第7天检出GaLV RNA支持RT-PCR测定法的灵敏度增加。
结果证明了RT-PCR方法能够检出在经历离体培养的T细胞样品中存在的复制型逆转录病毒，与标准共培养测定法相比具有相同或更高的灵敏度。与涉及检测GaLV病毒的多周扩增的共培养测定法相反，GaLV RT-PCR测定法能够直接实现来自细胞组合物样品的样品中RCR的检测。
实施例7：评估指示病毒RNA靶标(如VSV-G和/或rev gag)的参数的水平的示例性测定 法
如表7中所示，设计了针对存在于VSV-G假型化的复制型慢病毒(RCL)中的VSV-G和rev、以及针对β-肌动蛋白(ACTB)对照的引物和标记探针。用FAM或HEX染料标记物标记探针，并用Iowa黑色非荧光猝灭剂猝灭。
表7：示例性VSV-G、rev和肌动蛋白引物和探针序列
引物 DNA序列 SEQ ID NO
VSV-G正向引物 ATTGCCCGTCAAGCTCAGAT 35
VSV-G反向引物 GTGACTCTTGGGCATTTTGACTT 36
VSV-G探针 TGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTA 37
rev正向引物 AGCGACGAAGACCTCCTCAAG 38
rev反向引物 CTCTCCACCTTCTTCTTCTATTCCTTC 39
rev探针 CAAGTTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCC 40
ACTB正向引物 GCGAGAAGATGACCCAGATCA 41
ACTB反向引物 CCAGTGGTACGGCCAGAGG 2
ACTB探针 CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAGGC 7
对含有pol基因、rev基因和VSV-G基因的载体生产质粒进行RT-PCR运行证实，这些引物和探针可以选择性地结合和检测靶基因。还评估了从表达靶RNA的示例性细胞系中提取的RNA的RT-PCR，并证实了使用上述引物和探针的靶基因检测。
表4中描述的引物和探针用于对含有异源核酸的细胞组合物进行的RT-PCR测定法，所述异源核酸通过用表达VSV-G的慢病毒转导而引入。进行RT-PCR测定法以评估是否存在编码病毒RNA的VSV-G和rev中的一者或两者。
从细胞组合物中提取RNA，转化成互补DNA(cDNA)，并通过常规技术扩增。在示例性方法中，用Qiagen RNeasy-Plus Mini Kit提取RNA。使用表4中显示的VSV-G和/或rev和ACTB的引物和探针进行多重RT-PCR反应。将来自每个样品的分离的RNA与表4中显示的VSV-G和/或rev和ACTB的正向和反向引物和水解探针混合，并添加用于进行RT-PCR的组分。在示例性方法中，用于进行RT-PCR的组分由RNA UltraSense一步定量RT-PCR酶混合物和RNAUltraSense一步定量RT-PCR 5X反应混合物(ThermoFisher Scientific)提供。在一些情况下，针对VSV-G和rev的PCR反应在相同的PCR孔中以多重方式运行。包括用于检测ACTB的引物，其用作对照以证实RNA存在和验证RNA质量。在测定法中使用各种对照，比如基于质粒的VSV-G和/或rev的标准曲线、基于细胞培养物的VSV-G和/或rev和ACTB的RNA对照、无模板对照和无逆转录酶对照反应。RT-PCR反应的结果指示细胞组合物中是否存在可检测水平的VSV-G和/或rev。
本发明并不意图限于特定公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如用于说明本发明的各个方面。根据本文中的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施这样的变化，并且这些变化预期落入本公开的范围内。
序列
序列表
<110> 朱诺治疗公司(Juno Therapeutics, Inc.)
BIANCHI, Allison Adin
BERRY, Ruth
<120> 用于评估复制型病毒存在或不存在的方法
<130> 735042005640
<140> 尚未分配
<141> 与此同时提交
<150> 62/369,024
<151> 2016-07-29
<150> 62/448,954
<151> 2017-01-20
<160> 41
<170> FastSEQ for Windows版本4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白正向引物
<400> 1
gcgagaagat gacccagatc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白反向引物
<400> 2
ccagtggtac ggccagagg 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VIC标记的肌动蛋白探针
<400> 3
ccagccatgt acgttgctat ccaggc 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GaLV env正向引物
<400> 4
tctgggatac aaaggcagtc ca 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GaLV env反向引物
<400> 5
gccaaggcac atacatcagg tt 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAM标记的GaLV env探针
<400> 6
cccttggact tggtggccca cact 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β肌动蛋白探针
<400> 7
ccagccatgt acgttgctat ccaggc 26
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白反向引物
<400> 8
ccagtggtac ggccagacc 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vic标记的肌动蛋白水解探针
<400> 9
ccagccatgt acgttgctat ccaggc 26
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白正向引物
<400> 10
aaggccaacc gcgagaag 18
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白反向引物
<400> 11
acagcctgga tagcaacgta ca 22
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEX标记的肌动蛋白水解探针
<400> 12
tgacccagat catgttt 17
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白正向引物
<400> 13
ttctacaatg agctgcgtg 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌动蛋白反向引物
<400> 14
cctggatagc aacgtacatg g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HEX标记的肌动蛋白水解探针
<400> 15
ctgaacccca aggccaaccg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag正向引物
<400> 16
actccactac ctcgcaggca t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag反向引物
<400> 17
agaggagaac ggccagtatt g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fam标记的MMLV gag水解探针
<400> 18
ccgcgcagga ggaaacggac a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag正向引物
<400> 19
ctccttctct aggcgccaaa 20
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag反向引物
<400> 20
gcggcccccc actgt 15
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fam标记的MMLV gag水解探针
<400> 21
ctaaacctca agttctttc 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag正向引物
<400> 22
ggacagaaac aggatagaca gg 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MMLV gag反向引物
<400> 23
tcgtggtttc ttgggacaat c 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fam标记的MMLV gag水解探针
<400> 24
ccagtgcccc ttttctttgc agt 23
<210> 25
<211> 2058
<212> DNA
<213> 长臂猿白血病病毒
<220>
<223> GaLV env
<300>
<308> NC_001885.2
<309> 2007-05-24
<400> 25
atggtattgc tgcctgggtc catgcttctc acctcaaacc tgcaccacct tcggcaccag 60
atgagtcctg ggagctggaa aagactgatc atcctcttaa gctgcgtatt cggcggcggc 120
gggacgagtc tgcaaaataa gaacccccac cagcccatga ccctcacttg gcaggtactg 180
tcccaaactg gagacgttgt ctgggataca aaggcagtcc agcccccttg gacttggtgg 240
cccacactta aacctgatgt atgtgccttg gcggctagtc ttgagtcctg ggatatcccg 300
ggaaccgatg tctcgtcctc taaacgagtc agacctccgg actcagacta tactgccgct 360
tataagcaaa tcacctgggg agccataggg tgcagctacc ctcgggctag gactagaatg 420
gcaagctcta ccttctacgt atgtccccgg gatggccgga ccctttcaga agctagaagg 480
tgcggggggc tagaatccct atactgtaaa gaatgggatt gtgagaccac ggggaccggt 540
tattggctat ctaaatcctc aaaagacctc ataactgtaa aatgggacca aaatagcgaa 600
tggactcaaa aatttcaaca gtgtcaccag accggctggt gtaaccccct taaaatagat 660
ttcacagaca aaggaaaatt atccaaggac tggataacgg gaaaaacctg gggattaaga 720
ttctatgtgt ctggacatcc aggcgtacag ttcaccattc gcttaaaaat caccaacatg 780
ccagctgtgg cagtaggtcc tgacctcgtc cttgtggaac aaggacctcc tagaacgtcc 840
ctcgctctcc cacctcctct tcccccaagg gaagcgccac cgccatctct ccccgactct 900
aactccacag ccctggcgac tagtgcacaa actcccacgg tgagaaaaac aattgttacc 960
ctaaacactc cgcctcccac cacaggcgac agactttttg atcttgtgca gggggccttc 1020
ctaaccttaa atgctaccaa cccaggggcc actgagtctt gctggctttg tttggccatg 1080
ggcccccctt attatgaagc aatagcctca tcaggagagg tcgcctactc caccgacctt 1140
gaccggtgcc gctgggggac ccaaggaaag ctcaccctca ctgaggtctc aggacacggg 1200
ttgtgcatag gaaaggtgcc ctttacccat cagcatctct gcaatcagac cctatccatc 1260
aattcctccg gagaccatca gtatctgctc ccctccaacc atagctggtg ggcttgcagc 1320
actggcctca ccccttgcct ctccacctca gtttttaatc agactagaga tttctgtatc 1380
caggtccagc tgattcctcg catctattac tatcctgaag aagttttgtt acaggcctat 1440
gacaattctc accccaggac taaaagagag gctgtctcac ttaccctagc tgttttactg 1500
gggttgggaa tcacggcggg aataggtact ggttcaactg ccttaattaa aggacctata 1560
gacctccagc aaggcctgac aagcctccag atcgccatag atgctgacct ccgggccctc 1620
caagactcag tcagcaagtt agaggactca ctgacttccc tgtccgaggt agtgctccaa 1680
aataggagag gccttgactt gctgtttcta aaagaaggtg gcctctgtgc ggccctaaag 1740
gaagagtgct gtttttacat agaccactca ggtgcagtac gggactccat gaaaaaactc 1800
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<210> 26
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<212> DNA
<213> 水泡性口炎病毒
<220>
<223> VSVG env
<300>
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<400> 26
aacagagatc gatctgtttc cttgacacta tgaagtgcct tttgtactta gcctttttat 60
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aaaatgttcc ttctaattac cattattgcc cgtcaagctc agatttaaat tggcataatg 180
acttaatagg cacagccata caagtcaaaa tgcccaagag tcacaaggct attcaagcag 240
acggttggat gtgtcatgct tccaaatggg tcactacttg tgatttccgc tggtatggac 300
cgaagtatat aacacagtcc atccgatcct tcactccatc tgtagaacaa tgcaaggaaa 360
gcattgaaca aacgaaacaa ggaacttggc tgaatccagg cttccctcct caaagttgtg 420
gatatgcaac tgtgacggat gccgaagcag tgattgtcca ggtgactcct caccatgtgc 480
tggttgatga atacacagga gaatgggttg attcacagtt catcaacgga aaatgcagca 540
attacatatg ccccactgtc cataactcta caacctggca ttctgactat aaggtcaaag 600
ggctatgtga ttctaacctc atttccatgg acatcacctt cttctcagag gacggagagc 660
tatcatccct gggaaaggag ggcacagggt tcagaagtaa ctactttgct tatgaaactg 720
gaggcaaggc ctgcaaaatg caatactgca agcattgggg agtcagactc ccatcaggtg 780
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aagggtcaag tatctctgct ccatctcaga cctcagtgga tgtaagtcta attcaggacg 900
ttgagaggat cttggattat tccctctgcc aagaaacctg gagcaaaatc agagcgggtc 960
ttccaatctc tccagtggat ctcagctatc ttgctcctaa aaacccagga accggtcctg 1020
ctttcaccat aatcaatggt accctaaaat actttgagac cagatacatc agagtcgata 1080
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aactgtggga tgactgggca ccatatgaag acgtggaaat tggacccaat ggagttctga 1200
ggaccagttc aggatataag tttcctttat acatgattgg acatggtatg ttggactccg 1260
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cgcaacttcc tgatgatgag agtttatttt ttggtgatac tgggctatcc aaaaatccaa 1380
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aattaaagca caccaagaaa agacagattt atacagacat agagatgaac cgacttggaa 1560
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atgctcaaag aggcctcaat tatatttgag tttttaattt ttatg 1665
<210> 27
<211> 1617
<212> DNA
<213> Moloney小鼠白血病病毒
<220>
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accgtggcca cattgtactg cgtccaccag cgcatcgaaa tcaaggatac aaaagaggcc 300
ctggataaaa tcgaagagga acagaataag agcaaaaaga aggcccaaca agccgccgct 360
gataccggcc attctaacca agtgtctcag aactatccca tcgtccaaaa tattcaaggc 420
cagatggtcc accaagctat cagcccccgg accctgaacg cctgggtgaa ggtggtggag 480
gaaaaagcct tttctcccga ggtcatccct atgttcagcg ccctgagcga gggcgctaca 540
ccccaggacc tgaatacaat gttgaatacc gtcggcggcc accaggccgc tatgcagatg 600
ctgaaggaaa caattaacga agaggccgcc gagtgggacc gggtccaccc cgtccaggct 660
ggccccatcg cacccgggca aatgcgggag ccgagaggct ccgatatcgc cggcaccacc 720
tccacattgc aagagcagat cggctggatg accaacaatc ccccaattcc cgtgggcgag 780
atctacaagc ggtggatcat tctcggcctg aacaagatcg tgcggatgta ctctcccaca 840
tctatcctcg atatccggca gggccccaaa gagcctttcc gggattacgt ggatagattt 900
tacaagacct tgcgggctga acaggccagc caagaagtga agaactggat gacggagaca 960
ctcctcgtgc agaacgccaa tcccgactgc aaaaccatcc tgaaggcctt gggcccagcc 1020
gccaccttgg aggagatgat gaccgcctgc caaggcgtgg gaggccctgg gcacaaagcc 1080
cgggtgctcg ccgaggccat gtctcaggtg accaacagcg ccacaatcat gatgcaacgg 1140
gggaacttcc gcaatcagcg gaaaatcgtg aaatgcttta actgtggcaa agaagggcac 1200
acagcccgca actgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380
gagagcttca ggtttgggga agagacaaca actccctctc agaagcagga gccgatagac 1440
aaggaactgt atcctttagc ttccctcaga tcactctttg gcagcgaccc ctcgtcacaa 1500
taa 1503
<210> 32
<211> 2739
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒
<220>
<223> HIV Pol
<400> 32
atgtcactcc ctggtcggtg gaagcctaag atgattggtg gtataggggg cttcattaag 60
gtgcggcaat acgaccaaat cttgatcgag atttgcggcc acaaggccat cggcaccgtg 120
ctggtgggcc ccacccccgt gaatatcatc ggccggaacc tcctcaccca aatcggctgt 180
accctgaact tccctatctc tcccatcgaa accgtgcccg tgaagctgaa acccggcatg 240
gacgggccca aggtgaagca gtggcccctc accgaggaga agatcaaggc cctggtggag 300
atctgcaccg aaatggagaa agagggcaag atcagcaaga tcggccccga gaacccctat 360
aacacccccg tgttcgctat caaaaagaag gattccacca agtggcggaa gctggtggac 420
tttcgggagt tgaacaaacg gacccaggat ttttgggagg tgcagctggg catcccccac 480
cctgccggcc tgaagaaaaa gaagagcgtg accgtgctcg acgtcggcga cgcctacttc 540
agcgtgcctc tggacgagga ttttcgcaaa tacaccgcct tcacaatccc ctccatcaat 600
aacgaaaccc ccggcatccg gtaccaatat aacgtcttgc cccaaggctg gaagggcagc 660
cccgccatct ttcagtcctc tatgaccaag attctggaac ccttccggaa gcagaacccc 720
gatatcgtga tttaccagta tatggacgac ctctacgtgg gcagcgatct ggagatcggc 780
caacaccgga ccaagatcga agaactccgg cagcacctcc tccgctgggg cttgacaacc 840
cccgataaga agcaccaaaa ggagcctccc tttttgtgga tgggctacga gttgcacccc 900
gacaagtgga ccgtgcaacc catcgtcctc cccgagaagg attcttggac cgtgaacgat 960
atccaaaaac tggtcggcaa gctcaactgg gcctcccaaa tctatcccgg catcaaggtg 1020
cgccagctgt gcaagttgtt gcggggcaca aaggcgttga ccgaggtgat ccccttgacc 1080
gaggaggccg aattggagct cgccgagaat cgggaaatct tgaaggagcc cgtgcacggc 1140
gtctactacg atcccagcaa ggatctgatc gccgagatcc aaaaacaagg ccaggggcag 1200
tggacctacc agatctacca ggaacccttc aagaacctca agaccggcaa gtacgcccgg 1260
atgagaggcg cccataccaa cgacgtgaag cagctgaccg aagccgtcca gaagatcaca 1320
accgagtcta tcgtgatctg gggcaaaacc cccaagttca agctccctat ccagaaggaa 1380
acgtgggaaa cctggtggac cgaatactgg caggctacat ggattcccga atgggagttc 1440
gtgaacacac cccctctggt caagctgtgg tatcaactgg aaaaggagcc tatcgtgggc 1500
gccgagacat tttacgtgga cggcgctgcc aatcgcgaaa ccaagctggg caaggccggc 1560
tacgtgacca atcggggccg ccagaaggtg gtgacattga ccgataccac caaccagaaa 1620
accgaactgc aggccatcta cttggccctc caagacagcg gcctggaggt gaatatcgtg 1680
accgatagcc agtacgccct gggcattatc caggcccagc ccgaccagtc cgagagcgaa 1740
ctggtgaacc agatcatcga acaactgatc aagaaagaga aagtgtacct cgcctgggtg 1800
cccgcccata aggggatcgg cggcaacgag caggtggaca agctggtgtc cgccggcatt 1860
cgcaaggtgt tgttcctgga cggcatcgac aaagctcagg acgagcacga aaagtaccat 1920
tccaactggc gggccatggc ctccgacttc aatttgccac ccgtggtggc caaggagatc 1980
gtggcttctt gcgacaagtg ccaattgaag ggcgaggcta tgcacggcca ggtggattgc 2040
tcccccggca tctggcagtt ggactgcacc cacctggagg gcaaggtgat tctcgtggcc 2100
gtgcacgtgg cttccggcta catcgaggct gaggtgatcc cggccgaaac cggccaagag 2160
actgcctact tcttgctgaa gctggccggc aggtggcccg taaagaccat ccacaccgat 2220
aacgggtcta actttacatc cgccaccgtg aaagctgctt gctggtgggc aggcattaaa 2280
caagagttcg gcatccctta taaccctcag tcccagggcg tggtggagag catgaacaag 2340
gagctgaaaa agatcatcgg ccaagtgcgg gaccaagccg agcacttgaa aaccgccgtg 2400
cagatggccg tgtttattca taacttcaag cggaagggcg gcatcggcgg ctattccgcc 2460
ggtgagcgga tcgtggatat catcgccacc gatatccaga ccaaggagct gcagaagcag 2520
atcaccaaga tccagaactt cagagtgtac tatcgcgatt ctcggaaccc cttgtggaag 2580
gggccagcca aattgttgtg gaagggggag ggcgccgtgg tgatccagga caactccgat 2640
atcaaggtgg tcccgcggag gaaggccaaa attatccgcg actacggcaa gcaaatggcc 2700
ggcgacgact gcgtcgcctc ccggcaagac gaggactga 2739
<210> 33
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒
<220>
<223> HIV Rev
<400> 33
gtcgagggat ctccataaga gaagagggac agctatgact gggagtagtc aggagaggag 60
gaaaaatctg gctagtaaaa catgtaagga aaattttagg gatgttaaag aaaaaaataa 120
cacaaaacaa aatataaaaa aaatctaacc tcaagtcaag gcttttctat ggaataagga 180
atggacagca gggggctgtt tcatatactg atgacctctt tatagccaac ctttgttcat 240
ggcagccagc atatgggcat atgttgccaa actctaaacc aaatactcat tctgatgttt 300
taaatgattt gccctcccat atgtccttcc gagtgagaga cacaaaaaat tccaacacac 360
tattgcaatg aaaataaatt tcctttatta gccagaagtc agatgctcaa ggggcttcat 420
gatgtcccca taatttttgg cagagggaaa aagatctgct agctatagtt ctagaggtac 480
cggttgtttc gagcttatag caaaatcctt tccaagccct gtcttattct tctaggtatg 540
tggcgaatag ctctacaagc tccttgtact acttctataa ccctatctgt cccctcagct 600
actgctatgg ctgtggcatt gagcaagcta acagcactat tctttagctc ctgactccaa 660
tattgtagga gattccacca atatttgagg gcttcccacc ccctgcgtcc cagaagttcc 720
acaatcctcg ttacaatcaa gagtaagtct ctcaagcggt ggtagctgaa gaggcacagg 780
ctccgcagat cgtcccagat aagtgccaag gatccgttca ctaatcgaat ggatctgtct 840
ctgtctctct ctccaccttc ttcttctatt ccttcgggcc tgtcgggtcc cctcggggtt 900
gggaggtggg tctgaaacga taatggtgaa tatccctgcc taactctatt cactatagaa 960
agtacagcaa aaactattct taaacctacc aagcctccta ctatcattat gaataatttt 1020
atataccaca gccaatttgt tatgttaaac caattccaca aacttgccca tttatctaat 1080
tccaataatt cttgt 1095
<210> 34
<211> 5066
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pActin-GaLV
<400> 34
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accaaatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcatcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgcaac gcgatgacga tggatagcga 420
ttcatcgatg agctgacccg atcgccgccg ccggagggtt gcgtttgaga cgggcgacag 480
atgaattcct tctacaatga gctgcgtgtg gctcccgagg agcaccccgt gctgctgacc 540
gaggcccccc tgaaccccaa ggccaaccgc gagaagatga cccagatcat gtttgagacc 600
ttcaacaccc cagccatgta cgttgctatc caggctgtgc tatccctgta cgcctctggc 660
cgtaccactg gcatcgtgat ggactccggt gacggggtca cccacactgt gcccatctgt 720
cgacgcggcc gcatggtatt gctgcctggg tccatgcttc tcacctcaaa cctgcaccac 780
cttcggcacc agatgagtcc tgggagctgg aaaagactga tcatcctctt aagctgcgta 840
ttcggcggcg gcgggacgag tctgcaaaat aagaaccccc accagcccat gaccctcact 900
tggcaggtac tgtcccaaac tggagacgtt gtctgggata caaaggcagt ccagccccct 960
tggacttggt ggcccacact taaacctgat gtatgtgcct tggcggctag tcttgagtcc 1020
tgggatatcc cgggaaccga tgtctcgtcc tctaaacgag tcagacctcc ggactcagac 1080
tatactgccg cttataagca aatcacctgg ggagccatag ggtgcagcta ccctcgggct 1140
aggactagaa tggcaagctc taccttctac gtatgtcccc gggatggccg gaccctttca 1200
gaagctagaa ggtgcggggg gctagaatcc ctatactgta aagaatggga ttgtgagacc 1260
acggggaccg gttattggct atctaaatcc tcaaaagacc tcataactgt aaaatgggac 1320
caaaatagcg aatggactca aaaatttcaa cagtgtcacc agaccggctg gtgtaacccc 1380
cttaaaatag atttcacaga caaaggaaaa ttatccaagg actggataac gggaaaaacc 1440
tggggattaa gattctatgt gtctggacat ccaggcgtac agttcaccat tcgcttaaaa 1500
atcaccaaca tgccagctgt ggcagtaggt cctgacctcg tccttgtgga acaaggacct 1560
cctagaacgt ccctcgctct cccacctcct cttcccccaa gggaagcgcc accgccatct 1620
ctccccgact ctaactccac agccctggcg actagtgcac aaactcccac ggtgagaaaa 1680
acaattgtta ccctaaacac tccgcctccc accacaggcg acagactttt tgatcttgtg 1740
cagggggcct tcctaacctt aaatgctacc aacccagggg ccactgagtc ttgctggctt 1800
tgtttggcca tgggcccccc ttattatgaa gcaatagcct catcaggaga ggtcgcctac 1860
tccaccgacc ttgaccggtg ccgctggggg acccaaggaa agctcaccct cactgaggtc 1920
tcaggacacg ggttgtgcat aggaaaggtg ccctttaccc atcagcatct ctgcaatcag 1980
accctatcca tcaattcctc cggagaccat cagtatctgc tcccctccaa ccatagctgg 2040
tgggcttgca gcactggcct caccccttgc ctctccacct cagtttttaa tcagactaga 2100
gatttctgta tccaggtcca gctgattcct cgcatctatt actatcctga agaagttttg 2160
ttacaggcct atgacaattc tcaccccagg actaaaagag aggctgtctc acttacccta 2220
gctgttttac tggggttggg aatcacggcg ggaataggta ctggttcaac tgccttaatt 2280
aaaggaccta tagacctcca gcaaggcctg acaagcctcc agatcgccat agatgctgac 2340
ctccgggccc tccaagactc agtcagcaag ttagaggact cactgacttc cctgtccgag 2400
gtagtgctcc aaaataggag aggccttgac ttgctgtttc taaaagaagg tggcctctgt 2460
gcggccctaa aggaagagtg ctgtttttac atagaccact caggtgcagt acgggactcc 2520
atgaaaaaac tcaaagaaaa actggataaa agacagttag agcgccagaa aagccaaaac 2580
tggtatgaag gatggttcaa taactcccct tggttcacta ccctgctatc aaccatcgct 2640
gggcccctat tactcctcct tctgttgctc atcctcgggc catgcatcat caataagtta 2700
gttcaattca tcaatgatag gataagtgca gttaaaattc tggtccttag acagaaatat 2760
caggccctag agaacgaagg taacctttaa aagcttatca gttctggacc agcgagctgt 2820
gctgcgactc gtggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 2880
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 2940
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 3000
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 3060
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 3120
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 3180
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 3240
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3300
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3360
cgtgcgctct cctgttccga ccctgtcgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3420
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3480
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 3540
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3600
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3660
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3720
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3780
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3840
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3900
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 3960
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 4020
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 4080
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 4140
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 4200
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 4260
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 4320
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 4380
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 4440
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 4500
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 4560
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 4620
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 4680
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 4740
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 4800
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 4860
actcatactc tacctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 4920
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 4980
ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 5040
taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 5066
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G正向引物
<400> 35
attgcccgtc aagctcagat 20
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G反向引物
<400> 36
gtgactcttg ggcattttga ctt 23
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G探针
<400> 37
tggcataatg acttaatagg cacagcctta 30
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rev正向引物
<400> 38
agcgacgaag acctcctcaa g 21
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rev反向引物
<400> 39
ctctccacct tcttcttcta ttccttc 27
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rev探针
<400> 40
caagtttctc tatcaaagca acccacctcc 30
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB正向引物
<400> 41
gcgagaagat gacccagatc a 21

Claims (77)

1.一种方法，其包括：
a)确定测试样品中参数的水平，其中所述参数或水平指示生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或与其相关联(任选地正或反相关)，所述生物样品包含至少一个含有异源核酸和/或编码异源蛋白质的核酸的细胞，其中：
生物样品中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或风险；并且/或者
病毒RNA是复制型病毒的复制能力所需的，或编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
2.权利要求1的方法，进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或其风险。
3.权利要求1或权利要求2的方法，进一步包括以下步骤：
b)将在(a)中确定的参数的水平与所述参数的第一参考值比较。
4.权利要求3的方法，其中所述比较指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
5.权利要求1-4中任一项的方法，进一步包括：
确定生物样品或其部分中病毒RNA的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险，和/或
确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有存在的风险。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中：
当并且任选地仅当在(a)中确定的参数水平等于或高于第一参考值时，所述生物样品被认为具有、可能具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或
当并且任选地仅当)在(a)中确定的参数水平等于或低于第一参考值时，所述生物样品被认为具有复制型病毒的存在或有存在的风险、和/或具有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关；当(并且任选地，仅当)在(a)中确定的参数水平低于第一参考值时，所述生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为是RCR阴性的，或被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或不可能含有复制型病毒的存在，任选地其中参数水平与生物样品中RNA的量呈正相关；和/或
当并且任选地仅当在(a)中确定的参数水平高于第一参考值时，所述生物样品和/或至少一个细胞中的一个或多个被认为没有复制型病毒的存在、或没有其存在的风险、和/或没有病毒RNA的存在或至少阈值量，任选地其中参数水平与生物样品中病毒RNA的量呈反相关。
7.权利要求4的方法，其中：
即使确定生物样品中存在另一种复制能力所需的病毒RNA，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险；
即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的第二测试样品中检测到或已检测到等于或高于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与所述生物样品中另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈正相关；和/或
即使在测试样品或来源于所述生物样品或含有来自所述生物样品的核酸的另一个测试样品中检测到或已检测到等于或低于第二参考值的第二参数的水平，所述生物样品也被认为是阴性的、没有复制型病毒或没有其风险，所述第二参数与另一种复制能力所需的病毒RNA的量呈负相关。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中：
当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为具有或可能具有复制型病毒的存在或具有其风险；
当(并且任选地仅当)确定生物样品中病毒RNA的存在时、和/或当(并且任选地仅当)确定生物样品中任选地等于或高于阈值量的病毒RNA的量时，所述生物样品才被认为可能具有复制型病毒的存在或具有其风险，但在没有进一步的风险指征和/或没有评估指示另一种病毒RNA的另一个参数的情况下不认为含有复制型病毒的存在；和/或
如果确定生物样品中不存在病毒RNA和/或如果确定生物样品中任选地等于或低于阈值量的病毒RNA的量(或不超过该量)，任选地即使确定在生物样品中存在病毒复制能力所需的另一种RNA，所述生物样品也被认为没有或可能没有复制型病毒的存在、和/或没有其风险；和/或
如果测试样品中的所述参数和/或病毒RNA不可检出或未检测到和/或确定不存在于生物样品中，则所述生物样品被认为是复制型病毒阴性的。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中
所述第一参考值是等于或大约等于或稍高于阈值水平或最小可检测水平或与其对应的读出的值；
所述第一参考值是在阳性对照样品中检测到的参数的值、和/或指示RNA量的参数的值；和/或
所述参数的水平指示生物样品中病毒RNA的存在或不存在；和/或
所述病毒RNA包括编码第一病毒基因的核酸；和/或
所述异源核酸编码异源基因产物。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中在测试样品中评估的参数是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。
11.权利要求10的方法，其中所述量是绝对量或相对量。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述参数和/或水平是或包括替代或相对值，其任选地是循环阈(Ct)值。
13.权利要求12的方法，其中如果测试样品的CT值低于第一参考值，其为参考Ct评分，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述测试样品是或衍生自生物样品或其部分。
15.一种方法，其包括：
a)确定或评估测试样品中第一参数的第一水平，其中所述第一水平或第一参数与生物样品中第一病毒RNA和/或编码第一病毒基因(编码所述第一病毒RNA)的第一核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；
b)确定或评估测试样品中第二参数的第二水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中所述第二水平或第二参数与生物样品中不同于所述第一病毒RNA的第二病毒RNA和/或编码第二和不同的病毒基因(编码所述第二病毒RNA)的第二核酸的存在、不存在、量或浓度相关联(任选地正或反相关)；
其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；
其中：
生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或
所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
16.权利要求15或20的方法，进一步包括基于如此确定的所述水平来确定生物样品中第一和/或第二病毒RNA或基因产物的存在、不存在、浓度或量或其风险。
17.权利要求16的方法，进一步包括：
c)将在(a)和/或(b)中确定的第一和/或第二参数的水平与第一和/或第二参考值比较，其中所述比较任选地指示生物样品或由其衍生的样品中病毒RNA的存在、不存在、浓度或量或任何前述项的风险。
18.权利要求15-17和20中任一项的方法，进一步包括：
c)确定生物样品或其部分中第一病毒RNA或表达的存在、不存在或量或浓度或任何前述项的风险，并且/或者确定生物样品或其部分中第二病毒RNA或表达的存在、不存在、或量或浓度或任何前述项的风险；和/或
d)任选地基于c)中的确定，确定复制型病毒是否(或可能或很可能)存在于生物样品或其部分中或有复制型病毒存在于其中的风险。
19.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述病毒RNA来自和/或第一病毒RNA来自和/或第一病毒基因是env、gag、pol或rev；和/或
所述病毒RNA来自和/或第二病毒RNA来自和/或第二病毒基因是env、gag、pol或rev。
20.一种方法，其包括：
a)评估测试样品中第一参数的水平，其指示生物样品中第一病毒RNA的量或存在或不存在或与之相关联(任选地正或反相关)，其中所述第一病毒RNA来自第一病毒基因(为env基因)，并且评估测试样品中第二参数的水平，所述测试样品任选地是同一个或不同的测试样品，其中第二病毒参数指示生物样品中第二病毒RNA的存在、不存在或量或与之相关联(任选地正或反相关)，其中所述第二病毒RNA来自选自gag、pol和rev基因的基因，其中所述生物样品包含用任选地包含异源基因产物的病毒载体颗粒转导的细胞和/或包含具有异源基因产物的细胞；
其中至少一个细胞含有异源核酸、异源基因产物和/或编码异源蛋白质的核酸和/或已经用病毒载体转导；
其中：
生物样品中第一病毒RNA或基因或第二病毒RNA或基因的存在、不存在或量或浓度、和/或第一和第二病毒RNA或基因两者的存在、不存在或量或浓度指示生物样品或所述生物样品所来源的样品中复制型病毒的存在或不存在或其风险；和/或
所述第一病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一和第二病毒RNA两者都是复制型病毒的复制能力所需的、或者编码复制型病毒的复制能力所需的基因产物或其可特异性地识别的部分。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述参数是病毒RNA的存在或不存在。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是或对应于阈值水平或最小可检测水平。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述参考值、第一参考值和/或第二参考值是对应于或针对阳性对照测试样品中的参数的值，所述阳性对照测试样品任选地含有已知量或浓度的病毒RNA、第二病毒RNA和/或第一病毒RNA。
24.权利要求15-23中任一项的方法，其中：
如果所述方法确定生物样品中第一和第二病毒RNA的存在或高于其阈值量的量，并且任选地不是如果所述方法确定第一和第二RNA中的一者但不是两者的存在或高于其阈值量的量，则所述生物样品被认为含有或有风险含有或可能含有复制型病毒；和/或
如果所述方法确定生物样品中第一病毒RNA、或第二病毒RNA、和/或第一和第二病毒RNA两者的不存在、或其可检测量的不存在、或低于其阈值量的量，则所述生物样品被认为是阴性的或不含或没有风险含有或不可能含有复制型病毒。
25.权利要求15-24中任一项的方法，其中如果在测试样品中编码第一和第二病毒基因的病毒RNA的水平不可检出和/或未确定其在生物样品中存在或以高于阈值水平存在，则认为所述生物样品是复制型病毒阴性的。
26.权利要求1-25中任一项的方法，进一步包括在步骤a)之前从生物样品或来自它的部分或衍生自所述生物样品的样品或其部分中分离RNA的步骤，其中所述RNA包括来自至少一个细胞中的一个或多个的RNA。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述复制型病毒是或包括逆转录病毒，并且/或者其中病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA由逆转录病毒表达。
28.权利要求27的方法，其中所述逆转录病毒是γ-逆转录病毒。
29.权利要求27的方法，其中所述逆转录病毒是慢病毒。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述生物样品来自人或哺乳动物，并且/或者一个或多个细胞是原代细胞，其任选地是人或哺乳动物细胞。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述一个或多个细胞和/或生物样品来自主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)或细胞系或其样品。
32.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述至少一个细胞或生物样品是或来自用于自体细胞疗法的冷冻保存的材料(CMAT)、冷冻保存的药物产品(CDP)、或配制药物产品(FDP)或其样品。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述异源核酸或异源基因产物是或编码重组受体、嵌合受体、任选地嵌合抗原受体或转基因T细胞受体。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中使用对病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物进行确定或评估。
35.权利要求15-34中任一项的方法，其中使用对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估编码第二病毒基因的病毒RNA的水平。
36.权利要求1-35中任一项的方法，其中通过实时聚合酶链反应(PCR)评估病毒RNA的水平。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述确定或评估包括进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)。
38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述病毒RNA和/或第一和/或第二病毒RNA和/或病毒RNA和/或基因来自逆转录病毒。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码任何前述项的基因)是参与病毒体复制和/或包装的基因或由其编码。
40.权利要求1-39中任一项的方法，其中所述病毒RNA和/或第一病毒RNA和/或第二病毒RNA(或编码前述一项或多项的基因)不是由已经用于转导所述转导的细胞的转移载体编码的基因。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒RNA编码病毒表面蛋白、包膜蛋白、组特异性抗原、病毒衍生的聚合酶、病毒衍生的逆转录酶、病毒衍生的调控元件、转录的反式激活因子或反应元件。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中gag基因选自下组，该组的组成为：鼠白血病病毒(MMLV)gag和人类免疫缺陷病毒(HIV)gag。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中env基因选自GaLV env和VSVG env。
44.权利要求34-43中任一项的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。
45.权利要求34-44中任一项的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。
46.权利要求34-45中任一项的方法，其中对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:4-5中列出的一个或多个序列。
47.权利要求34-45中任一项的方法，其中对第二病毒基因的序列特异的一个或多个寡核苷酸引物包含在SEQ ID NO:16-24中列出的一个或多个序列。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述评估或确定包括使用对病毒RNA、病毒基因、第一病毒RNA或第一病毒基因、或第二病毒RNA或第二病毒基因的序列特异的水解探针。
49.权利要求48的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包含在SEQ IDNO:6中列出的序列。
50.权利要求49的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包含在SEQ IDNO:18、21或24中列出的序列。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述评估、确定或检测包括使用对病毒RNA、第二病毒RNA、第一病毒RNA和/或第二病毒基因中的一者或多者的序列特异的水解探针。
52.权利要求51的方法，其中所述水解探针包含在SEQ ID NO:6中列出的序列。
53.权利要求51的方法，其中对第一病毒基因的序列特异的水解探针包含在SEQ IDNO:18、21或24中列出的序列。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其进一步包括评估测试样品中指示或关联编码测试样品或生物样品中的对照基因的RNA的水平或参数水平，任选地其中所述对照基因是或包含β-肌动蛋白和/或任选地其中使用对照基因序列特异的一个或多个寡核苷酸引物评估参数水平或对照基因，所述寡核苷酸引物各自任选地包含在SEQ ID NO:1或2或8-15之一中列出的一个或多个序列，任选地其中使用对照基因序列特异的水解探针评估所述水平，所述水解探针任选地包含在SEQ ID NO:3、9、12或15中列出的序列。
55.权利要求1-54中任一项的方法，其中所述评估或确定包括进行多重反应，其中在多重反应中评估任选地所述水平、第一水平和/或第二水平；以及任选地，指示对照基因或与其相关联的水平或参数。
56.权利要求1-55中任一项的方法，其中所述参数、第一参数和/或第二参数各自是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA的病毒基因表达的产物的量或相对量，其任选地为相对拷贝数、或相对重量，或者是或包括病毒RNA(或第一或第二病毒RNA)、或由其表达或由对应于所述RNA(或第一或第二病毒RNA)的病毒基因表达的产物的浓度或相对浓度。
57.权利要求56的方法，其中所述量是绝对量或相对量。
58.权利要求1-57中任一项的方法，其中所述参数和/或水平是或包括循环阈(Ct)值。
59.权利要求58的方法，其中如果测试样品的CT值低于第一参考值(为参考Ct评分)，则确定病毒RNA或其表达存在于生物样品中或测试样品中或有病毒RNA或其表达存在于其中的风险。
60.权利要求1-59中任一项的方法，其中所述生物样品和/或一个或多个细胞来自受试者。
61.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述至少一个细胞包括多个细胞，并且其中：
所述多个细胞和/或所述生物样品包括悬浮细胞；
所述多个细胞和/或所述生物样品包括白细胞；和/或
所述多个细胞和/或所述生物样品包括T细胞或NK细胞。
62.权利要求15-61中任一项的方法，其中所述第一测试样品和第二测试样品中的一者或两者各自衍生自生物样品或其部分或含有衍生自生物样品或其部分的RNA。
63.权利要求15-61中任一项的方法，其中针对第一病毒RNA评估的测试样品和针对第二RNA评估的测试样品是相同的或者为同一个样品或组合物的部分。
64.权利要求61的方法，其中所述多个细胞包括未分级分离的T细胞、分离的CD8+T细胞或分离的CD4+T细胞。
65.权利要求1-64中任一项的方法，其中所述至少一个细胞是人类细胞。
66.权利要求29-65中任一项的方法，其中设定验收标准以评估实时PCR的有效性。
67.权利要求66的方法，其中验收标准包括在或在约90％和110％之间的效率百分比。
68.权利要求66-67中任一项的方法，其中验收标准包括约为或大于或大于约0.95、0.96、0.97、0.98或0.99的R2值。
69.权利要求1-68中任一项的方法，进一步包括评估RNA的纯度、完整性和/或浓度。
70.一种包含寡核苷酸的引物，所述寡核苷酸包含在SEQ ID NO:1-24或35-41的任一个中列出的序列。
71.权利要求70的引物，进一步包含荧光模块或标记物。
72.一种试剂盒，其包含根据权利要求70和/或权利要求71的一个或多个引物。
73.权利要求71的试剂盒，进一步包含无核酸酶的水、逆转录酶、聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲剂和DNA酶中的一种或多种。
74.权利要求1-73中任一项的方法，其中所述测试样品是生物样品或其一部分。
75.权利要求1-69和74中任一项的方法，其中所述方法能够检测测试样品中的病毒RNA或第一和/或第二病毒RNA，其中样品中为至少5个或至少10个或至少20个或至少50个或至少100个细胞，或为测试样品或生物样品中的1000万分率的细胞；和/或其中所述方法能够检测测试样品和/或生物样品中不超过或不超过约1.5pg、1pg或0.75pg或更少的病毒靶标的靶RNA的量。
76.权利要求1-69、74和75中任一项的方法，其中一个或多个细胞和/或生物样品是从其中转导的细胞已经在扩增所述细胞的条件下培养的过程中收集的，所述条件任选地在或在约37℃和/或在一种或多种刺激剂存在下。
77.权利要求76的方法，其中转导的细胞已经培养至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天；或为或约为2至14天、2至10天、4至14天、4至10天或7至10天。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647576A (zh) * 2020-06-24 2020-09-11 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用
CN112877474A (zh) * 2021-02-19 2021-06-01 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法
CN113264989A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 吉林大学 一种h9n2亚型禽流感嵌合病毒样颗粒制备方法及应用
CN113699278A (zh) * 2021-09-17 2021-11-26 深圳因诺免疫有限公司 一种基于q-PCR法检测复制型逆转录病毒的引物、试剂盒及检测方法
CN115003818A (zh) * 2020-01-22 2022-09-02 科济生物医药（上海）有限公司 病毒载体转导细胞的方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3746569A1 (en) * 2018-01-31 2020-12-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods and reagents for assessing the presence or absence of replication competent virus
JP2021523724A (ja) 2018-05-15 2021-09-09 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド フソソーム組成物およびその使用
BR112021000145A2 (pt) 2018-07-09 2021-04-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc Composições de fusossoma e usos das mesmas
AU2019380517A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery
KR20210133948A (ko) 2018-11-14 2021-11-08 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. Cns 전달을 위한 푸소좀 조성물
AU2019378883A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for T cell delivery
CN111910015A (zh) * 2019-05-08 2020-11-10 深圳宾德生物技术有限公司 一种检测复制型慢病毒的探针、引物对、荧光定量pcr试剂盒及方法
EP4025698A1 (en) 2019-09-03 2022-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Cd24-associated particles and related methods and uses thereof
CN115852064A (zh) * 2020-09-30 2023-03-28 浙江大学 用于检测hbv基因t216c突变位点的引物和探针
AU2022206324A1 (en) 2021-01-11 2023-07-20 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd8-targeted viral vectors
TW202321457A (zh) 2021-08-04 2023-06-01 美商薩那生物科技公司 靶向ｃｄ４之病毒載體之用途
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024026377A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Sana Biotechnology, Inc. Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030175698A1 (en) * 2001-05-10 2003-09-18 Kim Jong-Mook Retrovirus-specific oligonucleotides and a method for measuring retroviral titer using same
WO2004022761A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-18 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vector and stable packaging cell lines
US6712612B1 (en) * 2000-12-12 2004-03-30 Genecure Llc Safe and stable retroviral helper cell line and related compositions and methods
US20090028836A1 (en) * 2005-06-01 2009-01-29 Kalle Christof Von Stem and progenitor cell expansion by evi, evi-like genes and setbp1
CN102154368A (zh) * 2010-02-11 2011-08-17 上海比昂生物医药科技有限公司 一种组织特异性兼可调控性慢病毒基因表达载体

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
US4996143A (en) 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
ES2060765T3 (es) 1988-05-17 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Sistema promotor de ubiquitina en plantas.
AU4746590A (en) 1988-12-28 1990-08-01 Stefan Miltenyi Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5565322A (en) 1991-11-07 1996-10-15 Nanogen, Inc. Hybridization of polynucleotides conjugated with chromophores and fluorophores to generate donor-to donor energy transfer system
WO1994019491A1 (en) 1993-02-17 1994-09-01 Genetic Therapy, Inc. Detection of replication competent viruses
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
WO1997034634A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US6174670B1 (en) 1996-06-04 2001-01-16 University Of Utah Research Foundation Monitoring amplification of DNA during PCR
ES2304573T3 (es) 1996-06-04 2008-10-16 University Of Utah Research Foundation Recipiente para llevar a cabo y controlar procesos biologicos.
EP0961830A1 (en) 1997-01-29 1999-12-08 Neurosearch A/S EXPRESSION VECTORS AND METHODS FOR $i(IN VIVO) EXPRESSION OF THERAPEUTIC POLYPEPTIDES
US6207455B1 (en) 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
US6303293B1 (en) * 1999-02-02 2001-10-16 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof
AU6076600A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Tranzyme, Inc. Retroviral recombination assays and uses thereof
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
WO2002014555A2 (en) 2000-08-11 2002-02-21 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
AU2001297703B2 (en) 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
ITCZ20020002A1 (it) 2002-04-11 2003-10-13 Parco Scient E Tecnologico Del Dispositivo e metodo per il rilevamento simultaneo di differenti anticorpi e antigeni in campioni clinici, alimentari ed ambientali
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
WO2007008309A2 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Children's Hospital Medical Center Stem and progenitor cell expansion by evi, evi-like genes and setbp1
US7741467B2 (en) 2005-10-05 2010-06-22 Roche Molecular Systems, Inc. Non-fluorescent energy transfer
WO2008121420A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
ES2640216T3 (es) 2007-12-07 2017-11-02 Miltenyi Biotec Gmbh Sistemas y métodos para procesamiento de células
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
US20120164718A1 (en) 2008-05-06 2012-06-28 Innovative Micro Technology Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
WO2010075414A2 (en) * 2008-12-23 2010-07-01 The Cleveland Clinic Foundation Method for detection of xmrv
BR122021026169B1 (pt) 2010-12-09 2023-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uso de uma célula
ES2841983T3 (es) 2011-03-23 2021-07-12 Hutchinson Fred Cancer Res Método y composiciones para inmunoterapia celular
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
BR112014011417B1 (pt) 2011-11-11 2021-10-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Polipeptídeo isolado capaz de elicitar uma resposta de célula t antígeno-específica para ciclina a1 humana, composição imunogênica compreendendo o referido polipeptídeo, bem como método para preparar células apresentadoras de antígeno, antígeno-pulsadas,e uso destas para superexpressão de ccna1
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
KR20150009556A (ko) 2012-05-03 2015-01-26 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 증강된 친화성 t　세포 수용체 및 이의 제조 방법
CA2878862C (en) 2012-07-13 2023-01-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
CN112430580A (zh) 2012-10-02 2021-03-02 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
US9944998B2 (en) 2013-07-25 2018-04-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Genetic assays
JP6412579B2 (ja) 2014-01-10 2018-10-24 シリオン・バイオテック・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 偽型レンチウイルスベクター
EP3102609A4 (en) * 2014-02-04 2017-08-23 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
EP3746569A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods and reagents for assessing the presence or absence of replication competent virus

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6712612B1 (en) * 2000-12-12 2004-03-30 Genecure Llc Safe and stable retroviral helper cell line and related compositions and methods
US20030175698A1 (en) * 2001-05-10 2003-09-18 Kim Jong-Mook Retrovirus-specific oligonucleotides and a method for measuring retroviral titer using same
WO2004022761A1 (en) * 2002-09-03 2004-03-18 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vector and stable packaging cell lines
US20090028836A1 (en) * 2005-06-01 2009-01-29 Kalle Christof Von Stem and progenitor cell expansion by evi, evi-like genes and setbp1
CN102154368A (zh) * 2010-02-11 2011-08-17 上海比昂生物医药科技有限公司 一种组织特异性兼可调控性慢病毒基因表达载体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOERI L. AERTS ET AL: "Selection of appropriate control genes to assess expression of tumor antigens using real-time RT-PCR", 《BIOTECHNIQUES》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115003818A (zh) * 2020-01-22 2022-09-02 科济生物医药（上海）有限公司 病毒载体转导细胞的方法
CN111647576A (zh) * 2020-06-24 2020-09-11 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用
CN112877474A (zh) * 2021-02-19 2021-06-01 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种检测慢病毒介导的基因修饰细胞中复制型病毒的引物组、试剂盒及方法
CN113264989A (zh) * 2021-05-17 2021-08-17 吉林大学 一种h9n2亚型禽流感嵌合病毒样颗粒制备方法及应用
CN113699278A (zh) * 2021-09-17 2021-11-26 深圳因诺免疫有限公司 一种基于q-PCR法检测复制型逆转录病毒的引物、试剂盒及检测方法

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