DE10127068A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Magnetteilchen in und von flüssige biologische Dispersionen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Magnetteilchen in und von flüssige biologische Dispersionen. DOLLAR A Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzubieten, mit denen es möglich ist, bestimmte Komponenten von biologischen Dispersionen wie z. B. Blut, so magnetisch zu markieren, dass die ungestörte magnetische Markierung und die quantitative Entfernung der markierten Objekte möglich wird, ohne dass das Blut nachteilige Veränderungen erfährt. DOLLAR A Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit einer Vorrichtung zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Magnetteilchen in und von flüssige biologische Dispersionen zur Interaktion mit Komponenten der Dispersion und zur Wiederabtrennung der Magnetteilchen, gekennzeichnet durch DOLLAR A - eine Fraktioniereinheit (10), DOLLAR A - eine Wascheinheit (20), DOLLAR A - eine Mischeinheit (30), DOLLAR A - eine zweite Wascheinheit (40), DOLLAR A - einer Magnetfiltereinheit (50), DOLLAR A - einen Konzentrator (60), DOLLAR A - eine Meßeinrichtung (70) und DOLLAR A - eine Steuereinheit (80).

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Magnet­ teilchen in und von flüssige biologische Dispersionen gemäß den Oberbegriffen der Patentansprüche 1 und 9.

Gegenwärtig werden große Anstrengungen unternommen, in bio­ logischen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, dort vorhandene Zellen, Biomakromoleküle oder gezielt eingebrachte pharma­ zeutische Zubereitungen magnetisch zielgerichtet zu markie­ ren, um dann aus therapeutischen oder diagnostischen Grün­ den diese magnetisch markierten Objekte aus dieser biologi­ schen Dispersion zu entfernen. Hierbei wird die magnetisch markierte Objekte enthaltende biologische Flüssigkeit mit einem sogenannten Magnetfilter kontaktiert, um die magne­ tisch markierten Objekte mittels magnetischer Kraft aus der biologischen Dispersion zu entfernen. Diese Magnetfiltrati­ on kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich erfolgen.

In der WO 92/04961 werden Drähte oder Geflechte aus ferro­ magnetischem magnetisiertem Material in die nicht strömende biologische Flüssigkeit eingetaucht, um das in der Flüssig­ keit befindliche vorher magnetisch markierte Objekt an das magnetisierte Material zu fixieren. Diese diskontinuierlich durchgeführte Herausfilterung magnetisch markierter Objekte hat jedoch den Nachteil, dass durch die unmittelbare Berüh­ rung der biologischen Dispersion mit den magnetisierten ferromagnetischen Materialien unerwünschte Veränderungen 5 der biologischen Dispersion nicht ausgeschlossen werden können. Hinzu kommt, dass eine diskontinuierliche Magnet­ filterung von beispielsweise Blut bei einer in-vivo- Anwendung (?), insbesondere bei einer therapeutischen Be­ handlung, die auf eine Abtrennung von Krebszellen gerichtet ist, zu nachteiligen Veränderungen des Blutes führen kann.

In der DE 3522365 wird ein Trenngerät für die magnetische Abtrennung von biologischen Partikeln wie Zellen, aber auch molekularen Strukturen wie z. B. Enzyme, Antigene, Antikör­ per oder arideren biologische Substanzen beschrieben, die vorher an eine magnetisierbare Komponente wie z. B. magne­ tische Mikrospheres gebunden sind. Die Abtrennung erfolgt dabei aus flüssiger Phase in einem Durchflusssystem. Dabei werden solche Partikel, die die magnetisierbare Komponente enthalten, im Magnetfeld festgehalten, während gleichzeitig alle übrigen Bestandteile mit dem Flüssigkeitsstrom weiter­ geführt werden. Dieses Trenngerät besteht aus mindestens einem Elektromagneten, zwischen dessen Polen eine oder meh­ rere als Durchflusskanäle fungierende Kapillaren angeordnet sind, in denen aufgrund der Wirkung des äußeren Magnetfel­ des die magnetisch markierten Objekte an der Kapillarwand festgehalten werden.

Es hat sich gezeigt, dass diese Art der Einwirkung eines magnetischen Feldes auf ein strömendes Medium zu einer nicht ausreichenden Abtrennung der magnetischen Objekte führt, da bei dieser Anordnung der Magnetfelderzeuger keine ausreichende Magnetkraft auf die Dispersion wirken kann.

Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Abtrennung magnetisch markierter Objekte in Blut weitere wichtige Verfahrens­ schritte erforderlich macht, die insbesondere darauf ge­ richtet sind, eine Vorbehandlung des Blutes vorzunehmen mit dem Ziel, unbeteiligte bzw. störende Komponenten abzutren­ nen, damit anschließend Objekte gezielt magnetisch markiert und quantitativ entfernt werden können. Die bisher bekann­ ten Vorrichtungen beschreiben diese Verfahrensschritte nicht.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, eine Vor­ richtung und ein Verfahren anzubieten, mit denen es möglich ist, bestimmte Komponenten von biologischen Dispersionen wie z. B. Blut, so magnetisch zu markieren, dass die unge­ störte magnetische Markierung und die quantitative Entfer­ nung der markierten Objekte möglich wird, ohne dass das Blut nachteilige Veränderungen erfährt.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit den kennzeichnenden Tei­ len der Ansprüche 1 und 9. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispieles und einer Zeichnung näher erläutert.

Es zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemä­ ßen Vorrichtung,

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Magnetfilter­ einheit mit hintereinander geschalteten Magnet­ filtern,

Fig. 3 eine schematische Darstellung der Magnetfilter­ einheit mit zwei parallel geschalteten Magnetfil­ tern und

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer besonders vorteilhaften Ausgestaltetung der erfindungsgemä- Sen Vorrichtung.

Gemäß Fig. 1 besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung aus einer Blut-Fraktioniereinheit 10, einer Wascheinheit 20, einer Mischeinheit 30, einer zweiten Wascheinheit 40, einer Magnetfiltereinheit 50, einem Konzentrator 60, einer Me­ ßeinrichtung 70, einer Steuereinheit 80, Vorratsgefäßen 90 . . . 96, Pumpen 100 . . . 111 und Ventilen 120 . . . 134.

Die Blut-Fraktioniereinheit 10 dient zur Gewinnung eines Konzentrates von biologischen Objekten durch Abtrennung von Komponenten, die in der Folge zu Komplikationen führen könnten.

Im Falle der Behandlung von Blut könnte dieses Gerät als Leukapherese-Gerät zur Abtrennung und Konzentrierung von Leukozyten ausgelegt sein. In der Wascheinheit 20, z. B. einem einfachen Rührgefäß, erfolgt eine Verdünnung des Kon­ zentrats mit dem Arbeitspuffer aus dem Vorratsgefäß 90 über Pumpe 101 und Ventil 121. Die verdünnte Suspension wird über Pumpe 102 und Ventil 122 in die Mischeinheit 30, z. B. ebenfalls ein Rührgefäß, überführt. Dort erfolgt die Mi­ schung mit einem Überschuß von Magnetteilchen in einem strengen Zeitregime zur bevorzugten Markierung einer Ziel­ komponentengruppe, beispielsweise maligne Zellen. Die Mag­ netteilchen, die vorzugsweise als Nanoteilchensuspension vorliegen, werden über ein Magnetteilchenreservoir 91 sowie Pumpe 103 und Ventil 123 der Mischeinheit 30 zugeführt. Nach Ablauf einer vorgegebenen Inkubationszeit wird aus dem Vorratsbehälter 92 für Stoplösung über Pumpe 104 und Ventil 124 eine Stoplösung zugegeben, um eine weitere Interaktion der Magnetteilchen mit der zellulären Fraktion zu unterbin­ den. Die Suspension wird durch Pumpe 105 und Ventil 125 ei­ ner zweiten Wascheinheit 40 zugeführt, die beispielsweise eine Zentrifuge sein kann. Dort erfolgt eine Abtrennung des Überschusses von Magnetteilchen und das Waschen der mehr oder weniger stark bzw. nicht markierten biologischen Ob­ jekte durch die Zuführung einer Pufferlösung aus dem, Vor­ ratsbehältern 93 über Pumpe 106 und Ventil 126 und die Her­ stellung einer nach Volumen und Zellkonzentration geeigne­ ten Zelldispersion. Überschüssige Flüssigkeitsanteile wer­ den über Pumpe 107 und Ventil 129 dem Vorratsbehälter für Abfall 95 zugeführt. Die so vorbereitete Dispersion wird nun mittels Pumpe 107 und Ventil 127 in eine Magnetfilter­ einheit 50 überführt, in der eine magnetische Trennung der stärker markierten biologischen Objekte von schwächer mag­ netisierbaren oder unmagnetischen Objekten in einem Durch­ flussverfahren, wobei hohe Trennschärfe durch die Konkur­ renz von Schleppkräften der Strömung und Magnetkräften er­ reicht wird. Unmagnetische biologische Objekte gelangen da­ bei über das geöffnete Ventil 131 in den Konzentrator 60.

Die Magnetfiltereinheit 50 besteht im Wesentlichen aus min­ destens einem Magnetfilter 51, einem Magnetfeldgradienten­ erzeuger 52, einem Magnetfelderzeuger 54 sowie einem Durch­ strömungsbereich 53. Durch Pumpen eines Spülmediums aus dem Vorratsgefäß 94 mittels Pumpe 108, Ventil 128 und Ventil 130 kann. das Magnetfilter 51 frei gespült werden, wobei die magnetisch markierten Objekte in das Vorratsgefäß 95 für Abfall überführt werden.

Im Konzentrator 60, der beispielsweise als Zentrifuge aus­ gebildet sein kann, wird ein gewaschenes Konzentrat der üb­ rig bleibenden unmagnetischen biologischen Objekte durch Abtrennung beispielsweise überschüssiger isotoner Lösung hergestellt, die über Pumpe 109 und Ventil 132 in das Vor­ ratsgefäß für Abfall 95 überführt wird. Danach wird über Pumpe 110 und Ventil 133 aus dem Vorratsbehälter für human­ verträgliche Lösung das Konzentrat in eine humanverträgli­ che Form gebracht. Nach dem Konzentrator 60 schließt sich eine Messeinheit 70 an, mit dessen Hilfe die Qualität der quantitativen Entfernung von Magnetteilchen bzw. magnetisch markierter Objekte überprüft wird sowie die Funktionsfähig­ keit aller Anlagenteile. Die Messeinheit kann beispielswei­ se optische und magnetische Sensoren enthalten.

Das humanverträgliche Konzentrat wird über Ventil 134 und Pumpe 111 mit den zu Beginn abgetrennten Bestandteilen zwecks Rückführung zu einem Patienten vereinigt. Eine Steu­ ereinheit 80 übernimmt die Steuerung aller Pumpen, Ventile, der beiden Wascheinheiten, des Konzentrators sowie der Mag­ netfiltereinheit.

In Fig. 2. sind innerhalb der Magnetfiltereinheit 50 zwei Magnetfilter 51 und 55 strömungsmäßig hintereinander ge­ schaltet, um die Wirksamkeit der magnetischen Abtrennung zu erhöhen.

In Fig. 3 sind zwei Magnetfilter 51 und 55 strömungsmäßig parallel innerhalb der Magnetfiltereinheit 50 angeordnet. Während der Filter 51 eingeschaltet ist, wird er mittels der Pumpe 107 über das Ventil 127a mit biologischen Objek­ ten beaufschlagt, deren unmagnetischer Anteil über das Ven­ til 131a in den Konzentrator gelangt. Der Magnetfilter 55 ist durch Abschalten der Stromversorgung oder Entfernung der Dauermagnete ausgeschaltet. Er wird über die Pumpe 108 und das geöffnete Ventil 128b mit Spülmedium beaufschlagt, wodurch vorher abgelagerte magnetisch markierte Objekte ausgespült werden und über das geöffnete Ventil 130b in das Vorratsgefäß für Abfall 95 gelangen.

In Fig. 4 ist schematisch eine kompakte Version der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Die erfindungsgemäße Ausführung besteht aus einer Kombination einer Zentrifuge, einer Schlauchpumpe, einem Ventilsystem sowie Vorratsgefäße und mindestens einem Magnetfilter.

Hierbei übernimmt die Zentrifuge die Funktion der beiden Wascheinheiten, der Mischeinheit und des Konzentrators, wo­ zu ihre Betriebsweise der gewünschten Funktion z. B. durch Änderung der Drehzahl angepaßt wird. Durch eine angepaßte Leitungsführung und die Möglichkeit, die Förderrichtung der Pumpe zu ändern, können die erfindungsgemäßen Verfahrens­ schritte mit nur einer Pumpe verwirklicht werden.

Die Vorrichtung wird in ihrem Funktionsablauf im Folgenden beschrieben:

• 1. Vorspülen (Füllen) des gesamten Systemes
  • - P1 saugt ca. 600 ml "Arbeitspuffer" über V9 durch lau­ fende Zentrifuge und pumpt weiter durch Magnetfilter über V2 in "kranke Zellen".
• 2. waschen der zellulären Fraktion sowie Magnetfilter- Reinigung
  • - P1 saugt (25-50 ml) "zelluläre Fraktion" über V5 in laufende Zentrifuge. [Wascheinheit]
  • - P1 saugt ca. 250 ml "Arbeitspuffer" über V9 durch laufende Zentrifuge und pumpt weiter durch Magnetfil­ ter über V2 in "kranke Zellen".
• 3. Magnetteilchenzugabe, Inkubation und Stopplösungszugabe
  • - P1 saugt ca. 50 ml "Magnetteilchen-Lösung" über V8 in laufende Zentrifuge. [Mischeinheit]
  • - P1 saugt ca. 50 ml "Stopplösung" über V7 in laufender Zentrifuge.
• 4. Magnetfiltration
  • - Zentrifuge stoppt, somit verteilt sich die zelluläre Fraktion in der Zentrifuge.
  • - {Magnetfeld einschalten}
  • - P1 pumpt Zentrifugeninhalt über V4 durch [Magnetfil­ ter] und Zentrifuge im Kreis.
• 5. Konzentration und Aufreinigung gesunder Zellen sowie Magnetfilter-Reinigung
  • - Zentrifuge startet, somit sammelt sich die zelluläre Fraktion in der Zentrifuge. [Konzentrator]
  • - {Magnetfeld ausschalten}
  • - P1 saugt ca. 125 ml "Arbeitspuffer" über V9 durch laufende Zentrifuge und pumpt weiter durch Magnetfil­ ter über V2 in "kranke Zellen".
  • - Zentrifuge bremst langsam ab (geringe Vermischung).
  • - P1 drückt (5-30 ml) zelluläre Fraktion aus Zentri­ fuge über V6 in "gesunde Zellen".

Bezugszeichenliste

10

Blut-Fraktioniereinheit.

20

Wascheinheit

30

Mischeinheit

40

zweite Wascheinheit

50

Magnetfiltereinheit

51

Magnetfilter

52

Magnetfeldgradientenerzeuger

53

Durchströmungsbereich

54

Magnetfelderzeuger

55

2

. Magnetfilter

60

Konzentrator

70

Meßeinrichtung

80

Steuereinheit

90

Vorratsgefäß für Arbeitspuffer

91

Vorratsgefäß für Magnetteilchen

92

Vorratsgefäß für Stopplösung

93

Vorratsgefäß für Arbeitspuffer

94

Vorratsgefäß für Spülmedium

95

Vorratsgefäß für Abfall

96

Vorratsgefäß für humanverträgliche Lösung

100

Pumpe zum Füllen der Wascheinheit

101

Pumpe zur Zufuhr von Arbeitspuffer

102

Pumpe zum Überführen der verdünnten Suspension

103

Pumpe zum Überführen der Magnetteilchen

104

Pumpe zum Überführen der Stopplösung

105

Pumpe zum Überführen der inkubierten Suspension

106

Pumpe zum Überführen des Arbeitspuffers

107

Pumpe zum Überführen der vorbereiteten Suspension bzw. überschüssiger Lösung

108

Pumpe zum Überführen des Spülmediums

109

Pumpe zum Überführen des Abfalls aus dem Konzentrator

110

Pumpe zum Überführen der humanverträglichen Lösung

111

Pumpe zum Überführen der humanverträglichen gereinig­ ten Zellsuspension

Claims (11)

1. Vorrichtung zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Mag­ netteilchen in und von flüssige biologische Dispersio­ nen zur Interaktion mit Komponenten der Dispersion und zur Wiederabtrennung der Magnetteilchen,
gekennzeichnet durch
eine Fraktioniereinheit (10),
eine Wascheinheit (20),
eine Mischeinheit (30),
eine zweite Wascheinheit (40),
einer Magnetfiltereinheit (50),
einen Konzentrator (60),
eine Meßeinrichtung (70) und
eine Steuereinheit (80).

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Magnetfiltereinheit (50) mindestens zwei Magnet­ filter (51) nacheinander oder parallel betreibbar ange­ ordnet sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfilter (51) austauschbar angeordnet sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfilter Magnetfelderzeuger (54) und Magnet­ feldgradientenerzeuger (52) sowie Durchströmungsberei­ che (53) aufweisen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfeldgradientenerzeuger in und/oder außerhalb der Durchströmungsbereiche (53) der Magnetfilter (51) angeordnet sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Vorratsgefäße (90 bis 96) für die benötigte Medien angeordnet sind.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Pumpen (100 bis 111) und Ventile (120 bis 131) zur Förderung der Medien angeordnet sind.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß alle Vorratsgefäße, die Reaktionseinheiten (20, 30, 40, 60) und die Magnetfiltereinheit (50) einen geschlosse­ nen sterilen Schlauch- und Beutelset bilden.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wascheinheit (20), die Mischeinheit (30), die zwei­ te Wascheinheit (40) und der Konzentrator (60) inner­ halb einer bzw. als Zentrifuge ausgebildet sind.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Pumpen und Ventile als eine Einheit ausgebildet sind.

11. Verfahren zum Inkubieren und Wiederabtrennen von Mag­ netteilchen in und von flüssige biologische Dispersio­ nen, zur Interaktion mit Komponenten der Dispersion und zur Wiederabtrennung der Magnetteilchen,
gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

• a) Vorbereitung der flüssigen biologischen Dispersion
• b) Inkubation von Magnetteilchen in die Dispersion in­ nerhalb eines festgelegten Zeitregimes
• c) Abstoppen des Inkubationszeitregimes durch Zugabe einer Stopplösung
• d) Abtrennung aller Magnetteilchen von der Dispersion durch Einwirkung eines Magnetfeldes
• e) Rückführung der biologischen Dispersion in ein bio­ logisches System.