CN103333799A - 一种纳米铁结合蛋白吸附的细胞磁性分选装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞分选技术领域。具体公开一种纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，包括纳米铁蛋白粒子和层流无菌的密封室，所述密封室内设有样品瓶及与样品瓶通过连接管依次连接的带有磁场的细胞分选槽、纳米铁粒子洗脱装置、多细胞自动培养系统、回收漂洗灌装装置、控制密闭室内温度、湿度和空气结净度的洁净度控制系统、监控和显示整个细胞分选过程的细胞分选监测系统。该分选装置分选效果好，能有效地防止患者之间的交叉污染和肿瘤细胞的混杂，达到高效率、高质量和零污染的细胞自动化分选，有利于降低医疗成本，此外，其也便于异体的细胞分选，适用于更多的疾病和更广泛的用途。

Description

一种纳米铁结合蛋白吸附的细胞磁性分选装置

技术领域

本发明属于细胞分选技术领域。特别涉及一种纳米铁结合蛋白吸附的细胞磁性分选装置。

背景技术

高剂量放化疗显著地提高了恶性肿瘤（如白血病、恶性淋巴瘤和多发性恶性黑色素瘤等）的疗效，同时也严重抑制肿瘤患者的造血和免疫功能。全球近三十年的临床研究证明造血干细胞移植和免疫细胞治疗是重建化疗后血癌患者造血和免疫能力的有效方法。

细胞分选技术是细胞治疗的关键，广泛应用于医院和研究中心。细胞移植方式有两种：异体细胞移植和自体细胞移植，与异体细胞移植比较，自体细胞移植的优点是细胞来源于自身，无需配体，利用患者本人的细胞即可再生患者的组织脏器损伤，重建造血和免疫等功能，无免疫排斥反应，不发生移植物抗宿主反应，移植并发症少，但是自体细胞移植治疗恶性肿瘤病人，最大的风险在于来源于患者自身的移植细胞含有肿瘤细胞，容易导致肿瘤复发。如血癌病人的造血干细胞移植，恶性黑色素肿瘤病人的肿瘤浸润淋巴细胞移植等。基因标记实验证实自体移植物中残留肿瘤细胞的再输入是急性髓性白血病复发的重要因素。而异体造血干细胞移植无肿瘤细胞混杂的风险，但是供者来源有限，异体移植排斥反应等并发症较多，治疗费用高昂。2010年欧洲有33，362例患者接受造血干细胞移植，其中自体造血干细胞移植20，017例，异体造血干细胞移植13，345例，自体造血干细胞移植是干细胞移植的发展趋势。

至今为止，全球普遍采用Fenwal CS3000和CobeSpectra两种成分采血机器进行单核细胞（包括造血干细胞）的采集，采血仪是通过血液中单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板不同的离心力进行血细胞的分选，分选造血干细胞的特异性低，不能排除肿瘤细胞的混杂，不适合白血病等血癌病人的自体造血干细胞移植分选。

流式细胞仪（FACS）和全自动磁性细胞分选仪（MACS）仪器可以特异性分选造血干细胞，主要应用于实验室。流式细胞仪能够分选某一细胞亚群，分选纯度80-99%，细胞活力恢复率介于60-80%，目前主要应用于实验研究。临床型CliniMACS细胞分选系统是以MACS技术为基础的临床级自动细胞分选设备，可在封闭的无菌系统内磁性富集大量目的细胞或去除非目的细胞，是世界上最早被批准应用于临床的造血干细胞分离、纯化系统，已在欧洲和其它许多国家获得可在临床应用的CE认证，在美国也已通过IDE或IND认证，处于临床研究阶段。该分选系统主要包括CliniMACS分选仪、CliniMACS管道设备、CliniMACS分选试剂、CliniMACS缓冲液，通过结合CD34抗体结合的磁珠等磁性材料，能从动员的外周血单核细胞中分离出纯度高达90%的CD34+造血干细胞，去除约3-4个对数级的肿瘤细胞以及4-5个对数级的T淋巴细胞。该系统完成一次分选需3小时左右，运行成本较高，结构复杂，价格昂贵（25-30万美元左右），分选纯度60-90%，细胞活力恢复率介于60-90%，且分选后的造血干细胞携带有CD34抗体“磁珠帽”，这些磁珠颗粒输入患者机体，有可能造成肾功能损害等医疗安全隐患。由于FACS和MACS装置应用于自体造血干细胞移植治疗血液系统恶性肿瘤病人，均不能排除肿瘤细胞混杂，依然存在残留肿瘤细胞的再输入导致肿瘤复发的风险)。因此，迫切需要新型细胞专用分选仪器去减少分选过程中的肿瘤细胞残留。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，具体公开一种纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，该分选装置分选效果好，能有效地防止患者之间的交叉污染和肿瘤细胞的混杂，达到高效率、高质量和零污染的细胞自动化分选，有利于降低医疗成本，此外，其也便于异体的细胞分选，适用于更多的疾病和更广泛的用途。

为了克服上述技术目的，本发明是按以下技术方案实现的：

本发明所述的一种纳米铁结合蛋白吸附的细胞分选装置，包括纳米铁蛋白和层流无菌的密封室，所述纳米铁蛋白为纳米亚铁Fe2+、Fe3+和吸附蛋白通过鏊合或黏附作用方式形成的纳米铁蛋白粒子，,可以被磁力吸引。所述密封室内设有样品瓶及与样品瓶通过连接管依次连接的带有磁场的细胞分选槽、纳米铁粒子洗脱装置、多细胞自动培养系统、回收漂洗灌装装置、控制密闭室内温度、湿度和空气结净度的洁净度控制系统、监控和显示整个细胞分选过程的细胞分选监测系统。

作为上述技术的进一步改进，所述细胞分选槽为微型分选芯片，所述微型分选芯片包括入口管道部分、中间空腔部分及出口管道部分。

作为上述技术的更进一步改进，所述微型分选芯片的直径小于等于磁力场的直径，所述微型分选芯片适合于纳米铁蛋白吸附的细胞分选，分选芯片的直径由磁力场和纳米铁粒子决定,也就是分选芯片内腔要在磁力场范围内，磁力可控制相应大小的纳米铁粒子向特定的方向移动，当纳米铁粒子小于300nm时，分选芯片的内腔可小于等于300um。

在本发明中，所述吸附蛋白可以为非抗体结合蛋白、抗体和抗体片断，具有吸附特定细胞群的作用。

在本发明中，所述出口管道的靠近磁力场部为纳米铁粒子标记的细胞出口通道，中部为缓冲液出口通道，远离磁力场部为非标记细胞出口通道。

在本发明中，所述入口管道部分及出口管道部分均有若干管道构成，所述管道的直径范围值是10-100um。

在本发明中，所述入口管道的下部为样品入口通道，所述入口管道的周围为缓冲液入口通道。

在本发明中，所述纳米铁粒子洗脱装置包括置于微型分选芯片下方邻近微型分选芯片的磁场与微型分选芯片之间通过连接管进行连接的初步漂洗装置，以及细胞收集容器。

在本发明中，所述细胞自动培养系统包括杀伤清除肿瘤细胞的清除培养装置，和与其连接的维持或诱导效应细胞的进行内环境模拟的内环境模拟多细胞培养装置。

在本发明中，所述回收漂洗灌装装置包括漂洗瓶及与漂洗瓶连接的回收罐，所述漂洗瓶的细胞出口处设有过滤网。

本发明所述的纳米铁结合蛋白依据分选细胞的种类而不同，如应用CD34结合纳米铁结合蛋白分选造血干细胞；应用CD3纳米铁结合蛋白分选CD3阳性淋巴细胞等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明巧妙地利用了在磁力的作用下促使纳米铁结合蛋白相连的细胞向磁场方向移动，没有磁性的细胞不受磁场的作用，向零磁力方向移动,从而使细胞得以分选，具有较好的分选效果，将肿瘤等细胞完全排除掉，已取得纯化的移植细胞；

（2）本发明基于吸附蛋白中的甘氨酸等能与Fe3+,Fe2+离子共价键螯合，形成纳米铁蛋白粒子，从而通过纳米铁蛋白粒子与特定的细胞群结合，在磁力作用下达到分选细胞目的；与纳米磁珠比较，纳米铁蛋白为机体的主要成分之一，毒性和副作用较小；

（3）本发明以共价键方式结合的纳米铁蛋白，可通过改变纳米铁粒子表面电荷裂解共价键使铁粒子得以洗脱，具有较好的分选洗脱效果；

（4）本发明通过多细胞自动培养系统及洁净度控制系统、监控和显示整个细胞分选过程的细胞分选监测系统等，以获得纯度高的造血干细胞，自动化控制操作，制作简单方便。

(5)本发明基于纳米铁结合蛋白(非抗体金属结合蛋白)较抗体有更强的结合能力、稳定性能好、不需要动物即可大规模生产等优势而研发纳米铁结合蛋白专用的细胞分选装置。该装置可依据纳米铁结合蛋白的不同，分选不同类型的细胞，如CD34非抗体结合蛋白吸附造血干细胞，CD3非抗体结合蛋白吸附CD3阳性淋巴细胞等。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明：

图1是本发明所述的纳米铁结合蛋白吸附的细胞分选装置结构示意图；

图2是本发明中微型分选芯片结构示意图。

图3是上述图2中A向端面示意图；

图4是上述图2中B向端面示意图。

具体实施方式

如图1所示，本发明所述的一种纳米铁结合蛋白吸附的细胞分选装置，包括纳米铁蛋白和层流无菌的密封室1，所述纳米铁蛋白为纳米亚铁Fe2+、Fe3+和吸附蛋白通过鏊合或黏附作用方式形成的纳米铁蛋白粒子，所述吸附蛋白可以为非抗体结合蛋白、抗体和抗体片断，具有吸附特定细胞群的作用。所述密封室1内设有样品瓶2及与样品瓶2通过连接管3依次连接的带有磁场的细胞分选槽、纳米铁粒子洗脱装置、细胞自动培养系统、回收漂洗灌装装置、控制密闭室内温度、湿度和空气结净度的洁净度控制系统、监控和显示整个细胞分选过程的细胞分选监测系统。

如图2所示，所述细胞分选槽为微型分选芯片4，所述微型分选芯片4包括入口管道部分41、中间空腔部分42及出口管道部分43；所述微型分选芯片4的直径小于等于细胞分选槽磁力场的直径，此处，所述微型分选芯片42空腔的直径小于等于300um，所述入口管道部分41及出口管道部分43均有若干管道构成，所述管道的直径范围值是10-100um。

如图3、图4所示，所述入口管道41的下部为样品入口通道411，所述入口管道41的上部为缓冲液入口通道412；所述出口管道43中有纳米铁粒子标记的细胞出口通道431，缓冲液出口通道432和非标记细胞出口通道433。

在本发明中，如图所示，所述纳米铁粒子洗脱装置包括置于微型分选芯片4下方邻近微型分选芯片的磁场5、与微型分选芯片4之间通过连接管进行连接的初步漂洗装置6，以及细胞收集容器7。

在本发明中，为了具有较好的分选纯度和培养效果，所述细胞自动培养系统包括肿瘤细胞杀伤清除作用的清除培养装置8，和与其连接的将维持或诱导效应细胞进行内环境模拟的内环境模拟多细胞培养装置9。

所述内环境模拟多细胞培养装置9包括内环境模拟室、内环境模拟室内设有相互连通的正压液体交换管91、液体交换毛细管网92和负压液体交换管93，所述清除培养装置8的成品细胞的入口端与负压液体交换管93连通，所述清除培养装置8的成品细胞的出口与正压液体交换管91连通，所述清除培养装置8与内环境模拟多细胞培养装置9的负压液体交换管93之间的管路上设有负压装置10，所述清除培养装置8与内环境模拟多细胞培养装置9的正压液体交换管91之间的管路上设有正压装置11。

此外，如图1所示，所述回收漂洗灌装装置包括漂洗瓶12及与漂洗瓶12连接的回收罐13，所述漂洗瓶12的细胞出口处设有过滤网121。

以下说明本发明所述的纳米铁蛋白吸附的细胞分选装置的工作原理：

使用时，将患者样本放入本装置的样品瓶2后，将自动进行细胞分选、试剂洗脱和罐装回收，整个过程历时10-30分钟、患者的细胞分选过程完全处于隔离密闭状态，可避免操作污染和病人样本间的交叉污染。

本发明中，由于设计有细胞自动培养系统，通过细胞的自动化培养，进一步减少肿瘤细胞的残留，同时，能自动检测清除培养装置8的培养箱20内的温度，温度的检测精度为：0.5度±；能自动检测培养箱20内的二氧化碳浓度，二氧化碳浓度的检测精度：±0.2%；自动检测培养箱20内溶液的PH值，检测精度：±0.02；自动检测移液、加液数量，检测精度：±2ml；并将分选环境：有消毒灭菌、空气过滤等层流系统，空气洁净度达到百级。

在本发明中，所有的移液、加液过程均在一次性塑料软管及与之连接的一次性移液、加液器和容器内完成，以保证细胞和液体在转移过程不受污染。

在本发明中，所述洁净度控制系统自动检测分选机内的温度和湿度，检测精度：0.5度±；检测移液、加液数量，检测精度：±1ml；检测分选槽和管道的压力等。

在本发明中，细胞分选监测系统自动识别样本的标识；按照预先设定条件自动控制分机的运转和移液、加液结构；自动控制箱内温度和湿度；自动控制分选细胞的清洗和包装出库；自动控制相关检测系统的动作并保存检测数据。

在本发明中，设置有安全控制装置，当装置的气压、温度、湿度、空气成分和液体流量等超过警戒值时，将启动自动报警和相应的处理程序，以确保较高的安全使用性能。

Claims (10)

1.一种纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，包括纳米铁蛋白和层流无菌的密封室，其特征在于：所述纳米铁蛋白为纳米亚铁Fe2+、Fe3+和吸附蛋白通过鏊合或黏附作用方式形成的纳米铁蛋白粒子；所述密封室内设有样品瓶及与样品瓶通过连接管依次连接的带有磁场的细胞分选槽、纳米铁粒子洗脱装置、多细胞自动培养系统、回收漂洗及灌装装置、控制密闭室内温度、湿度和空气结净度的洁净度控制系统、监控和显示整个细胞分选过程的细胞分选监测系统。

2.根据权利要求1所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述吸附蛋白可以为非抗体结合蛋白、抗体和抗体片断，具有吸附特定细胞群的作用。

3.根据权利要求1所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述细胞分选槽为微型分选芯片，所述微型分选芯片包括入口管道部分、中间空腔部分及出口管道部分。

4.根据权利要求3所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述微型分选芯片的直径小于等于细胞分选槽磁力场的直径。

5.根据权利要求3所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述出口管道的靠近磁力场部为纳米铁粒子标记的细胞出口通道，中部为缓冲液出口通道，远离磁力场部为非标记细胞出口通道。

6.根据权利要求3所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述入口管道部分及出口管道部分均有若干管道构成，所述管道的直径范围值是10-100um。

7.根据权利要求3所述的纳米铁蛋白吸附的细胞分选磁性装置，其特征在于：所述入口管道的远离磁场部为样品入口通道，所述入口管道的周围为缓冲液入口通道。

8.根据权利要求3所述的纳米铁蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述纳米铁粒子洗脱装置包括置于微型分选芯片下方邻近微型分选芯片的磁场与微型分选芯片之间通过连接管进行连接的初步漂洗装置，以及细胞收集容器。

9.根据权利要求1所述的纳米铁结合蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述细胞自动培养系统包括杀伤清除肿瘤细胞的清除培养装置，和与其连接的维持或诱导效应细胞的进行内环境模拟的内环境模拟多细胞培养装置。

10.根据权利要求1所述的纳米铁结合蛋白吸附的细胞磁性分选装置，其特征在于：所述回收漂洗灌装装置包括漂洗瓶及与漂洗瓶连接的回收罐，所述漂洗瓶的细胞出口处设有过滤网。

Images