CN112041430A - 用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法 - Google Patents

用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了一种无血清培养基，其用于培养，如培育、制备和/或产生细胞，如免疫细胞，如基因工程化细胞。还提供了一种可用于产生无血清培养基的液体基础培养基和冷冻补充剂。所提供的实施方案包括用于产生无血清培养基的方法和用于在存在无血清培养基的情况下培养细胞，如激活、转导、培育或扩增细胞的方法。

Description

用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月8日提交的标题为“用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法”的美国临时申请62/596,766的优先权，将所述申请的内容通过引用以其全文并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2018年12月7日创建的名为735042012440SeqList.txt的文件提供，其大小为50,866字节。将电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本提供了用于培养，如培育、制备和/或产生细胞(如免疫细胞，如基因工程化细胞)的无血清培养基。本公开文本还提供了可用于产生无血清培养基的液体基础培养基和冷冻补充剂。本公开文本还提供了用于产生无血清培养基的方法和用于在存在无血清培养基的情况下培养细胞，如激活、转导、培育或扩增细胞的方法。
背景技术
多种细胞疗法方法可用于治疗疾病和病症。细胞疗法方法包括涉及用重组受体(如嵌合抗原受体)基因工程化的免疫细胞(如T细胞)的方法。需要用于培育和产生此类细胞疗法的改善的方法，包括提供无血清培养基。提供了满足此类需要的组合物、方法和制品。
发明内容
本文提供了用于培养、制备和/或产生细胞的无血清培养基。在一些方面是无血清培养基，所述培养基包含(a)在基础培养基中的0.5mM至5mM二肽形式的L-谷氨酰胺；(b)0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；和(c)至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。在一些实施方案中，所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
在一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
在一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，任选地其中所述白蛋白是人血清白蛋白或重组人白蛋白，且任选地其中在所述培养基中的白蛋白的浓度为约2.5mg/mL至7.5mg/mL。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中的白蛋白的浓度为约5mg/mL。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，任选地其中所述转铁蛋白是人或重组人白蛋白，且任选地其中在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约50mg/L至200mg/L。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约100mg/L。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人或重组人胰岛素，且任选地其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约10mg/L。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述无血清培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述基础培养基包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle，BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow's Minimal Essential Medium，GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)或M199。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述基础培养基和/或所述无血清培养基不包含酚红。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述无血清培养基包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种细胞因子。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。
在本文所提供的任何无血清培养基的一些实施方案中，所述无血清培养基支持细胞的扩增。在一些实施方案中，所述细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是或包含T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞包含CD4+或CD8+ T细胞。
本文提供了包含二肽形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，其中所述基础培养基不含L-谷氨酰胺和蛋白质。在一些实施方案中，所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM,0.5mM至3mM、0.5mM至2mM,0.5mM至1mM、1mM至5mM,1mM至4mM、1mM至3mM,1mM至2mM、2mM至5mM,2mM至4mM、2mM至3mM,3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
在本文所提供的任何基础培养基的一些实施方案中，所述基础培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
在本文所提供的任何基础培养基的一些实施方案中，所述基础培养基包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基或M199。
在本文所提供的任何基础培养基的一些实施方案中，所述基础培养基不包含酚红。
在本文所提供的任何基础培养基的一些实施方案中，所述蛋白质是人源蛋白或重组蛋白或这两者。
在本文所提供的任何基础培养基的一些实施方案中，所述基础培养基是液体。
本文提供了包含至少一种蛋白质和L-谷氨酰胺的补充剂，其中与所述补充剂组合的基础细胞培养基能够支持细胞的扩增。在一些实施方案中，所述补充剂在使用前被冷冻或冷冻储存，任选地在从或从约-10℃至-30℃、任选地为或约18℃或20℃的温度下。在一些实施方案中，所述补充剂中的L-谷氨酰胺在与基础培养基组合时和/或在所述补充剂解冻或经受从或从约20℃至42℃、任选地从或从约20℃至42℃、或为或大于或约37℃的温度时不会沉淀。在一些实施方案中，在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度小于100mM。在一些实施方案中，所述补充剂中的L-谷氨酰胺是从或从约20mM至100mM。在一些实施方案中，在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。在一些实施方案中，在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，其中所述白蛋白任选地是人血清白蛋白或重组人白蛋白。
在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，其中所述转铁蛋白任选地源自人或是重组人转铁蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人胰岛素或重组人胰岛素，且其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。
在本文所提供的任何无血清培养基、基础培养基或补充剂的一些实施方案中，所述无血清培养基、所述基础培养基或所述补充剂是无菌的。
本文提供了用于制备无血清培养基的方法，所述方法包括将基础培养基与补充剂(如根据所提供的基础培养基和补充剂)组合。
本文提供了用于制备无血清培养基配制品的方法，所述方法涉及将以下各项组合：(a)包含二肽形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，其中所述无血清基础培养基是液体配制品和/或在所述组合之前未被冷冻；(b)包含L-谷氨酰胺的第一补充剂。在一些实施方案中，所述第一补充剂在所述组合之前已经冷冻，任选地其中所述方法包括在所述组合之前解冻所述第一补充剂。在一些实施方案中，在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。在一些实施方案中，在所述基础培养基配制品中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。在一些实施方案中，所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约20mM至100mM。在一些实施方案中，在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。在一些实施方案中，在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。
在一些实施方案中，所述第一补充剂(或所述补充剂)包含至少一种蛋白质，且其中存在的所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物蛋白。在一些实施方案中，所述第一补充剂中存在的所述至少一种蛋白质包括人蛋白。在一些实施方案中，所述人蛋白包括人血清白蛋白、人转铁蛋白和/或人重组胰岛素。
在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含90％至97.5％(v/v)的所述基础培养基和1.25％至5％(v/v)的所述第一补充剂。
在一些实施方案中，所述方法还包括将(c)第二补充剂组合，所述第二补充剂包含选自以下各项的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种生长因子、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。在一些实施方案中，所述第二补充剂包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含1.25％至5％(v/v)的所述第二补充剂。
本文提供了通过用于产生无血清培养基配制品的方法(如根据所提供的方法)产生的无血清培养基配制品。
本文提供了培养细胞的方法，所述方法包括在无血清培养基配制品(如根据所提供的无血清培养基配制品)中孵育包含细胞的组合物。在一些实施方案中，所述培养与选自以下各项的一个或多个步骤相结合进行：在存在刺激剂或刺激条件的情况下激活细胞；引入编码异源蛋白、任选重组受体的药剂，任选地其中所述重组受体是嵌合抗原受体；或培育或扩增所述细胞。在一些实施方案中，包含编码所述重组受体的核酸分子的药剂是病毒载体、任选慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述细胞是获自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，所述异源蛋白是重组受体。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体。
本文提供了用于产生工程化细胞的方法，其涉及：(a)使包含细胞的细胞群体与包含编码异源蛋白、任选重组受体的核酸分子的药剂在将编码所述重组受体的所述核酸引入所述群体的细胞中的条件下接触；及(b)在所述接触之前、期间和/或之后，在存在刺激条件的情况下孵育所述细胞，其中所述刺激条件诱导所述细胞的初级信号、信号传导、刺激、激活和/或扩增，其中(a)和(b)中之一或两者是在无血清培养基配制品(如根据所提供的配制品)中进行的。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞或富含T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞或所述富集的T细胞是CD4+ T细胞和/或CD8T细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在(a)之前，从生物样品分离所述细胞群体。在一些实施方案中，所述分离包括基于CD3的表面表达或基于CD4和CD8中之一或两者的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。在一些实施方案中，所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。在一些实施方案，生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。在一些实施方案中，将CD4+与CD8+ T细胞单独分离并且在所述接触或孵育之前组合，任选以1:2至2:1的CD4与CD8细胞比率组合，任选地其中所述比率为或为约1:1。在一些实施方案中，将CD4+T细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD4+细胞进行富集。在一些实施方案中，将CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD8+细胞进行富集。在一些实施方案中，将总T细胞、CD3+细胞或CD4+细胞和CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对总T细胞、CD3+细胞或CD4+和CD8+细胞进行富集。在一些实施方案中，所述富集的细胞构成大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的所述细胞。在一些实施方案中，包含编码所述重组受体的核酸分子的药剂是病毒载体、任选慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述细胞是获自受试者的原代细胞。在一些实施方案中，所述异源蛋白是重组受体。在一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体。
在用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一个或多个共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，一级药剂特异性地结合CD3和/或共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在一些实施方案中，所述一级药剂和二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物、任选珠的表面上。
在用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，在所述接触之前进行或开始对所述细胞的所述刺激，任选地在为或约37℃下持续18-24小时。
在用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，所述刺激条件包括选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
在用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，对细胞的所述刺激是在所述接触之后进行，任选地持续一段时间以达到阈值浓度。
在用于培养细胞或用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，包含编码所述重组受体的核酸分子的药剂是病毒载体、任选慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在用于培养或用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，所述方法导致与所述孵育开始时的细胞数量相比至少约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍的细胞扩增。在一些实施方案中，在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后实现所述细胞扩增。
在用于培养或用于产生工程化细胞的任何方法的一些实施方案中，所述方法导致细胞在所述孵育之后具有大于约80％、85％或90％的活力。在一些实施方案中，所述活力在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后存在。
本文提供了通过方法如根据所提供的方法产生的细胞组合物。
本文提供了制品，其涉及无血清培养基，如根据所提供的无血清培养基；基础培养基，如根据本文所提供的；或补充剂，如根据本文所提供的；及用于制造或使用所述组合物的说明书。在一些实施方案中，所述制品是容器、任选瓶子。
附图说明
图1A-图1D描绘了40种工程化CAR+ T细胞组合物的示例性表型谱，每种都来自多发性骨髓瘤患者。示出了关于CD4+群体(图1A)和CD8+群体(图1B)的CAR+ T细胞组合物中的CD45RA×CCR7表达谱。示出了关于CD4+群体(图1C)和CD8+群体(图1D)的CAR+ T细胞组合物中的CD27×CD28表达谱。由点(●)、叉(×)、菱形(◇)或三角形(Δ)示出每种CAR+ T细胞组合物。
具体实施方式
本文提供了用于培育细胞、促进细胞扩增和/或激活、和/或产生基因工程化细胞的无血清培养基。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺，如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺；游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)；和至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基支持细胞活力、扩增和/或激活。在一些实施方案中，所述无血清培养基抑制细胞凋亡。在一些实施方案中，所述无血清培养基促进基因工程化细胞的产生。本文还提供了可用于制备无血清培养基的基础培养基和补充剂。在一些实施方案中，所述基础培养基是液体，包含二肽形式的L-谷氨酰胺且不含L-谷氨酰胺，并且在一些情况下包含蛋白质。在一些实施方案中，所述补充剂是冷冻的且包含L-谷氨酰胺，并且在一些情况下包含至少一种蛋白质。在一些实施方案中，可以添加一种或多种其他补充剂(包括含有至少一种蛋白质的补充剂)以制备所述无血清培养基。在一些任何此类实施方案中，所述至少一种蛋白质是血清替代或血清替换蛋白质，如通常人蛋白或重组或合成蛋白，例如白蛋白。本文还提供了用于制备无血清培养基配制品的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含二肽形式的L-谷氨酰胺的液体无血清基础培养基与包含L-谷氨酰胺的第一补充剂组合，其中所述第一补充剂是保持冷冻的并且在组合之前解冻。本文还提供了在无血清培养基中培养细胞的方法和制品。
不同的培养基可用于培养细胞，如用作细胞疗法的原代免疫细胞和基因工程化细胞。在许多情况下，补充有约5％血清(例如人血清)的基础培养基用于培育这些细胞。然而，在一些情况下，单独批次的血清(例如人血清)在其支持细胞活力、扩增和/或激活的能力方面可以是可变的。在一些情况下，用于培养细胞的培养基(包括无血清培养基)包含L-谷氨酰胺，它是细胞培养物中用于能量产生以及蛋白质和核酸合成的必需营养素。然而，细胞培养基中的L-谷氨酰胺自发降解并生成氨作为副产物，氨可能对细胞有毒性和/或可能影响蛋白质糖基化和细胞活力，在一些情况下，氨降低蛋白质产生并改变糖基化模式。此外，L-谷氨酰胺常常以相对较高浓度(如200mM储备溶液)制造。在此类浓度下，L-谷氨酰胺可能在其解冻以供使用并且并入基础培养基中之时经常沉淀。
可利用各种其他形式的L-谷氨酰胺，如二肽形式的L-谷氨酰胺，包括L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。在一些情况下，此类二肽形式(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)在培养基中更稳定。然而，细胞将二肽形式的L-谷氨酰胺转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)以供使用是耗时和/或耗能的。此外，在一些情况下，特定的细胞群体(如免疫细胞和基因工程化细胞)可能对L-谷氨酰胺有更高的需求。在一些情况下，扩增下的细胞、激活的细胞和/或正在被基因工程化的细胞也可能对L-谷氨酰胺有更高的需求。
所提供的实施方案解决了这些问题中的一个或多个。在特定实施方案中，所提供的无血清培养基含有两种谷氨酰胺来源，具体来说，a)二肽形式的谷氨酰胺(如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)和b)游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在特定实施方案中，游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)是冷冻补充剂的组分以减少和/或延迟L-谷氨酰胺的降解。在一些实施方案中，游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)是补充剂的组分，其中在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度小于200mM(例如约80mM)，这在一些方面改善溶解度并且避免L-谷氨酰胺如当添加到基础培养基中时的沉淀。在一些方面，所提供的无血清培养基、方法和用途提供对于细胞的优势，因为同时提供两种不同的谷氨酰胺来源。在一些实施方案中，第一谷氨酰胺来源不是游离形式的谷氨酰胺而是稳定形式的谷氨酰胺。在一些实施方案中，第一谷氨酰胺来源是二肽形式的谷氨酰胺，因为它是稳定的并且可以转化为游离形式的谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二谷氨酰胺来源是游离形式的谷氨酰胺(L-谷氨酰胺)，其可以提供谷氨酰胺的快速和有效供应。
在一些方面，所提供的无血清培养基是由含有二肽形式的谷氨酰胺的基础培养基产生。在一些方面，所述基础培养基不含酚红。在一些方面，所提供的无血清培养基进一步使用含有游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的补充剂产生以通过减少添加剂的数量改善可制造性，从而产生完全培养基。在基础培养基中包含二肽形式的谷氨酰胺和/或在补充剂中包含游离形式的谷氨酰胺可以在一些方面通过减少添加剂的数量改善可制造性，从而产生完全培养基。在一些方面，所述补充剂是在L-谷氨酰胺变为补充剂的组分之后不久冷冻以改善谷氨酰胺的稳定性。在补充剂中以小于200mM(例如约或80mM)的浓度包含L-谷氨酰胺也是有益的，因为这可以改善溶解度并且可以避免沉淀问题。
在特定实施方案中，所提供的方法包括用无血清培养基培养含有细胞(如原代免疫细胞，例如T细胞)的特定的群体或细胞组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有免疫细胞或富集的免疫细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有原代免疫细胞或富集的免疫细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有T细胞或富集的T细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有CD4+ T细胞或富集的CD4+ T细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有CD8+ T细胞或富集的CD8+ T细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含有待基因工程化或正在被基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物含有基因工程化细胞或被产生以在培养期间含有基因工程化细胞。在一些实施方案中，在存在所提供的无血清培养基的情况下培养的所述细胞组合物含有细胞(如原代免疫细胞，例如用重组受体基因工程化或表达重组受体的T细胞，如嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞或富集的CAR表达T细胞)。
在特定实施方案中，所提供的方法包括与用于产生表达重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))的基因工程化细胞的方法相结合来培养细胞。在一些实施方案中，在如与免疫细胞(例如T细胞)的激活、转导、培育和/或扩增相结合的培养期间所提供的无血清培养基的存在是与其他培养基类型(如含血清的培养基)相当的，并且在一些情况下与其他培养基类型(如含血清的培养基)相比改善细胞活力、转导或扩增。
在一些方面，所提供的无血清培养基、方法和用途支持对细胞的所需效果，这些效果在一些情况下与在存在含血清的培养基的情况下的培养相比是得到改善的。例如，在一些方面，所提供的无血清培养基、方法和用途支持或促进细胞活力。在一些实施方案中，细胞在无血清培养基配制品中(如在用于培育或扩增的条件下)培养例如持续约5至6天之后具有大于约80％、85％或90％的活力。在一些情况下，活力如与在含血清的培养基中培养相比可能最初是降低的，但剩余的活细胞能够在存在无血清培养基的情况下稳健地扩增。在一些实施方案中，在存在无血清培养基的情况下培养如持续约5或6天之后，导致与用含血清的培养基培养细胞的方法相比相当的活力或改善的活力。在一些方面，在存在所提供的无血清培养基的情况下培养细胞减少细胞凋亡。在一些实施方案中，在无血清培养基配制品中培养如持续约5至6天之后，小于约20％、15％、10％或5％的细胞发生凋亡(例如，具有阳性半胱天冬酶3染色)。
在一些方面，所提供的无血清培养基、方法和用途支持或促进细胞扩增。在一些实施方案中，在存在无血清培养基的情况下，在用于培育或扩增的条件下(例如在存在一种或多种细胞因子的情况下)培养时，在无血清培养基配制品中培养之后(如在这种培养持续约5至6天之后)细胞扩增了至少约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍。在一些方面，所提供的无血清培养基导致用于产生基因工程化细胞的相当或改善的方法。在一些实施方案中，如与激活、转导或扩增相结合的用于在存在无血清培养基的情况下产生基因工程化细胞的方法导致至少约50％、55％、60％、65％或70％表达异源基因(如重组受体，例如嵌合抗原受体)的细胞。在一些方面，用于在存在无血清培养基的情况下培养细胞的方法和用途导致如下细胞组合物，所述细胞组合物与在含血清的培养基中产生的细胞相比具有相当的功能且在一些情况下改善的功能。此类功能包括细胞(包括细胞因子产生和细胞毒活性靶细胞)的改善或相当的效应子功能，如在抗原特异性刺激或与靶细胞接触之后。在一些方面，通过涉及如与细胞的激活、转导或扩增相结合的在存在无血清培养基的情况下培养的过程产生的细胞(如基因工程化细胞，例如CAR-T细胞)导致如下细胞组合物，所述细胞组合物与通过相当方法但在存在含血清的培养基的情况下产生的细胞组合物相比具有相当或改善的抗肿瘤活性。
此外，在一些实施方案中，就从不同受试者收集的样品产生工程化细胞所需的时间量而言，所提供的无血清培养基、方法和用途产生更一致和更少变化的过程。在特定实施方案中，所提供的方法能够从高比例的受试者成功地生成适合于细胞疗法的工程化T细胞。在某些实施方案中，所得细胞组合物含有高或相对较高比例的健康细胞，例如有活力和/或不表达细胞凋亡标记的细胞；高或相对较高比例的表达重组受体的细胞；和/或具有高或相对较高的响应于抗原刺激的活性(例如，细胞毒性、抗肿瘤和/或细胞因子产生)的细胞。在一些实施方案中，所提供的方法提供用于产生工程化细胞产物的过程且在一些方面具有特定的成功率，如高成功率或大于阈值率的成功率，如能够生成治疗性细胞组合物的那些，如能够针对大数量或百分比的样品(如针对各自源自不同个体受试者或患者(如有待用治疗性组合物治疗的受试者或患者)的所有或高百分比的样品)生成具有某些所需或期望特征的此类组合物(例如，在自体细胞疗法的背景下)。在一些方面，受试者或患者患有疾病或病症(如癌症，如血液或血液学癌症，如多发性骨髓瘤)。在一些方面，样品(针对其高百分比，可能由其生成治疗性细胞组合物)是患者样品，包括例如就细胞表型或其样品或细胞的其他参数而言可变的患者样品。在一些实施方案中，所提供的方法生成如下工程化T细胞组合物，所述工程化T细胞组合物如与经由其他过程生成的细胞组合物相比具有改善的或高度的细胞健康。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，并入程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.无血清培养基配制品和相关组分
本申请提供了无血清培养基，其含有合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)、游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)和至少一种蛋白质。本申请还提供了液体基础培养基，其包含至少一种合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)，其中所述基础培养基不含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)和蛋白质。本申请还提供了冷冻补充剂，其包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)，并且在一些情况下包含至少一种蛋白质，如血清替代蛋白。可以添加一种或多种其他补充剂，包括含有至少一种蛋白质(如血清替代蛋白质)或支持细胞生长和扩增的一种或多种其他组分的一种或多种补充剂。在一些实施方案中，合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM至5mM(如2mM)。在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的浓度为约0.5mM至5mM(如2mM)。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白或重组蛋白(如血清替代蛋白，例如白蛋白)。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含一种或多种细胞因子(如IL-2、IL-7或IL-15)。在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，所提供的无血清培养基是由液体基础培养基和一种或多种补充剂产生或制备的。
在一些实施方案中，提供了液体基础培养基，其含有能够在细胞培养物中转化为L-谷氨酰胺的合成氨基酸，如作为二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的合成氨基酸。在一些情况下，所述基础培养基不含L-谷氨酰胺和蛋白质。在一些实施方案中，合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM至5mM(如2mM)。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人源蛋白、重组蛋白或这两者。在一些实施方案中，所述基础培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，提供了包含至少一种蛋白质和游离形式的谷氨酰胺(例如L-谷氨酰胺)的补充剂，其中所述补充剂在L-谷氨酰胺变为其组分之后被冷冻或已被冷冻。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度小于200mM，如小于150mM、100mM或更小，如20mM至120mM、或40mM至100mM，如或约80mM。在一些实施方案中，在补充剂已经与基础培养基组合之后，L-谷氨酰胺的浓度为约0.5mM至约5mM(如2mM)。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白或人源蛋白或是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白，例如人或重组人白蛋白。
A.基础培养基
在一些实施方案中，所述基础培养基包含氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸和/或脯氨酸。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含至少一种合成氨基酸。在一些实施方案中，所述合成氨基酸能够在包含细胞的细胞培养物中转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述细胞包含人细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，所述细胞被基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是表达T细胞的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸是稳定形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在水溶液(例如基础培养基)中所述合成氨基酸比谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)更稳定。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸不产生显著量的谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述合成氨基酸不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、3、5、7、9、11、13或14天内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、2、3、4、5、6、7或8周内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少1、2、3、4或5年内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、3、5、7、9、11、13或14天内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、2、3、4、5、6、7或8周内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在基础培养基中所述合成氨基酸在至少1、2、3、4或5年内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸可溶于水溶液(例如，基础培养基)中。在一些实施方案中，在水溶液中所述合成氨基酸的溶解度高于游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸能够转运到细胞中，在所述细胞它可以转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，所述细胞被基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是表达T细胞的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是三肽。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为至少或至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为或为约2mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为至多或至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM。
在一些实施方案中，所述基础培养基不包含L-谷氨酰胺或不包含显著量的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述基础培养基包含L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，在基础培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于或小于约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于或小于约1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
在一些实施方案中，在基础培养基中提供所述一种或多种氨基酸，包括能够转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的至少一种合成氨基酸(例如二肽形式的L-谷氨酰胺，如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述基础培养基是人工或合成培养基。在一些实施方案中，所述基础培养基是平衡盐溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)。在一些实施方案中，所述基础培养基选自杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基和M199。在一些实施方案中，所述基础培养基是复合培养基(例如RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，所述基础培养基是OpTmizerTM CTSTM T细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含无机盐、糖、氨基酸的营养素混合物，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含CO3和HCO3。在一些实施方案中，所述基础培养基的CO3/HCO3含量是用气态CO2(例如5％-10％)来平衡，由此维持培养基中的最佳pH。在一些实施方案中，所述基础培养基包含两性离子HEPES。在一些实施方案中，所述基础培养基包含酚红。在一些实施方案中，所述基础培养基不包含酚红。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含无机盐。在一些实施方案中，所述无机盐促进渗透平衡。在一些实施方案中，所述无机盐通过提供钠、钾和钙离子来调节膜电位。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含一种或多种碳水化合物。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括蔗糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括半乳糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括麦芽糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物包括果糖。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含脂肪酸。在一些实施方案中，所述基础培养基包含脂质。在一些实施方案中，所述基础培养基包含维生素(例如，维生素A、维生素B7、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素E)。在一些实施方案中，所述基础培养基包含微量元素。在一些实施方案中，所述微量元素包括铜。在一些实施方案中，所述微量元素包括锌。在一些实施方案中，所述微量元素包括硒。在一些实施方案中，所述微量元素包括三羧酸中间体。
在一些实施方案中，所述基础培养基含有以下各项的混合物：无机盐、糖、氨基酸及任选维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素。除了营养素之外，所述培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，所述基础培养基的试剂支持细胞生长、增殖和/或扩增。广泛多种可商购的基础培养基是本领域技术人员熟知的，且包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯韦尔公园纪念研究所培养基(Roswell Park MemorialInstitute Medium，RPMI)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基和汉姆斯培养基(Hamsmedium)。在一些实施方案中，所述基础培养基是伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基、RPMI-1640或α-MEM。
在一些实施方案中，所述基础培养基不含蛋白质。在一些实施方案中，所述基础培养基不含人蛋白(例如，人血清蛋白)。在一些实施方案中，所述基础培养基不无血清的。在一些实施方案中，所述基础培养基不含源自人的血清。在一些实施方案中，所述基础培养基不含重组蛋白。在一些实施方案中，所述基础培养基不含人蛋白或重组蛋白。
在一些实施方案中，所述基础培养基包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白替代品。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白替代品可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
Figure BDA0002615298730000181
I和
Figure BDA0002615298730000182
II。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括转铁蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，所述蛋白质包括胎球蛋白。
在一些实施方案中，所述基础培养基(例如基础培养基)是液体配制品。在一些实施方案中，所述基础培养基(例如基础培养基)在预期用途之前未被冷冻或指示不被冷冻(例如根据其方案)。在一些实施方案中，所述基础培养基在为或约2℃至8℃下储存。在一些实施方案中，所述基础培养基在室温下储存。在一些实施方案中，所述基础培养基在2℃至8℃下储存时稳定持续至少或至少约1、2、3、4、5或6周。在一些实施方案中，所述基础培养基在2℃至8℃下储存时稳定持续至少或至少约1、2、3、4、5或6个月。
B.补充剂
在一些实施方案中，本文提供了补充剂，如包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的第一补充剂。在一些实施方案中，这种补充剂在使用和/或并入基础培养基中之前被冷冻。在一些实施方案中，所述补充剂(如本文所述的这些补充剂)旨在用作培养基补充剂(例如，用于基础培养基的培养基补充剂)。在一些实施方案中，所述第一补充剂旨在用作用于维持、扩增和/或激活细胞的补充剂。在一些实施方案中，所述第一补充剂旨在用作用于扩增细胞的补充剂。在一些实施方案中，所述第一补充剂包括冷冻补充剂，其包含至少一种蛋白质和游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)，其中补充有第一补充剂的基础细胞培养基能够支持细胞扩增。在一些实施方案中，该细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4 T细胞或CD8 T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是源自人的基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是来自人的基因工程化T细胞(例如，嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞)。
在一些实施方案中，所述第一补充剂在其预期用途前在为或约-20℃至为或约0℃下储存或建议在为或约-20℃至为或约0℃下储存。在一些实施方案中，所述补充剂在小于约0℃下储存或建议在小于约0℃下储存。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后立即或快速冷冻直至所述补充剂用于其预期用途之时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后的大部分时间内被冷冻直至所述补充剂用于其预期用途之时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后大于1、2、3、4、5、6或7天内不以液体形式保存直至所述补充剂用于其预期用途之时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之后大于或大于约4、8、12、16、20或24小时内不以液体形式保存直至所述补充剂用于其预期用途之时。在一些实施方案中，所述补充剂在游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为其组分之前和之后的大部分时间内被冷冻直至所述补充剂用于其预期用途之时。在一些实施方案中，当游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)变为所述补充剂的组分时，所述补充剂在室温下或在低于室温下(例如，补充剂的温度低于或低于约20℃、15℃、10℃、5℃或0℃下)。
在一些实施方案中，所述补充剂中的L-谷氨酰胺在补充剂解冻时不沉淀。在一些实施方案中，所述补充剂中的L-谷氨酰胺在补充剂为液体时不沉淀。在一些实施方案中，所述补充剂中的L-谷氨酰胺在补充剂在室温下解冻时不沉淀。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约或小于或小于约200mM、180mM、160mM、140mM、120mM、100mM或80mM。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约10mM至为或约30mM、为或约10mM至为或约50mM、为或约10mM至为或约70mM、为或约10mM至为或约90mM、为或约10mM至为或约110mM、为或约10mM至为或约130mM、为或约10mM至为或约150mM、为或约10mM至为或约170mM、为或约30mM至为或约50mM、为或约30mM至为或约70mM、为或约30mM至为或约90mM、为或约30mM至为或约110mM、为或约30mM至为或约130mM、为或约30mM至为或约150mM、为或约30mM至为或约170mM、为或约50mM至为或约70mM、为或约50mM至为或约90mM、为或约50mM至为或约110mM、为或约50mM至为或约130mM、为或约50mM至为或约150mM、为或约50mM至为或约170mM、为或约70mM至为或约90mM、为或约70mM至为或约110mM、为或约70mM至为或约130mM、为或约70mM至为或约150mM、为或约70mM至为或约170mM、为或约90mM至为或约110mM、为或约90mM至为或约130mM、为或约90mM至为或约150mM、为或约90mM至为或约170mM、为或约110mM至为或约130mM、为或约110mM至为或约150mM、为或约110mM至为或约170mM、为或约130mM至为或约150mM、为或约130mM至为或约170mM或为或约150mM至为或约170mM。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为约80mM。
在一些实施方案中，在补充剂中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是如下浓度，其使得补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度为至少或至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。在一些实施方案中，在基础培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度为至多或至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM。
在一些实施方案中，所述第一补充剂含有一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，提供了其他补充剂(如第二补充剂)以提供一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，将补充剂、第一补充剂及任选一种或多种其他补充剂(例如第二补充剂)与基础培养基组合以向基础培养基提供所述一种或多种另外的组分。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人或源自人的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述蛋白质是白蛋白或白蛋白替代品。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白替代品可以是任何蛋白质或多肽来源。此类蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、
Figure BDA0002615298730000221
I和
Figure BDA0002615298730000222
II。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是人白蛋白或源自人白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人血清或人血浆。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述重组白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述重组白蛋白不是源自人。在一些实施方案中，所述补充剂包含天然白蛋白。在一些实施方案中，所述天然白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述天然白蛋白不是源自人。在一些实施方案中，在补充剂中的白蛋白的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的白蛋白的浓度是为或约0mg/mL至为或约2mg/mL、为或约0mg/mL至为或约4mg/mL、为或约0mg/mL至为或约6mg/mL、为或约0mg/mL至为或约8mg/mL、为或约0mg/mL至为或约10mg/mL、为或约0mg/mL至为或约12mg/mL、为或约2mg/mL至为或约4mg/mL、为或约2mg/mL至为或约6mg/mL、为或约2mg/mL至为或约8mg/mL、为或约2mg/mL至为或约10mg/mL、为或约2mg/mL至为或约12mg/mL、为或约4mg/mL至为或约6mg/mL、为或约4mg/mL至为或约8mg/mL、为或约4mg/mL至为或约10mg/mL、为或约4mg/mL至为或约12mg/mL、为或约6mg/mL至为或约8mg/mL、为或约6mg/mL至为或约10mg/mL、为或约6mg/mL至为或约12mg/mL、为或约8mg/mL至为或约10mg/mL、为或约8mg/mL至为或约12mg/mL、为或约10mg/mL至为或约12mg/mL或为或约10mg/mL至为或约15mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，培养基中的白蛋白是为或约5mg/mL。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括转铁蛋白或转铁蛋白替代品。在一些实施方案中，转铁蛋白替代品是如下化合物，其可以替换补充剂中的转铁蛋白以给出与转铁蛋白大致相似的结果。转铁蛋白替代品的例子包括但不限于任何铁螯合化合物。可以使用的铁螯合化合物包括但不限于以下各项的铁螯合物：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去铁胺、二巯丙醇、二乙三胺-五乙酸(DTPA)和反式-l,2-二氨基环己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)，以及柠檬酸铁螯合物和硫酸亚铁螯合物。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是铁饱和转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是铁饱和人转铁蛋白。
在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白替代品是人转铁蛋白或源自人转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白替代品是源自人血清或血浆。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白替代品是重组转铁蛋白。在一些实施方案中，所述转铁蛋白的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L、为或约10mg/L至为或约750mg/L、为或约50mg/L至为或约100mg/L、为或约50mg/L至为或约150mg/L、为或约50mg/L至为或约200mg/L、为或约50mg/L至为或约250mg/L、为或约50mg/L至为或约300mg/L、为或约50mg/L至为或约350mg/L、为或约50mg/L至为或约400mg/L、为或约50mg/L至为或约450mg/L、为或约50mg/L至为或约500mg/L、为或约50mg/L至为或约550mg/L、为或约50mg/L至为或约600mg/L、为或约50mg/L至为或约650mg/L、为或约50mg/L至为或约750mg/L、为或约100mg/L至为或约150mg/L、为或约100mg/L至为或约200mg/L、为或约100mg/L至为或约250mg/L、为或约100mg/L至为或约300mg/L、为或约100mg/L至为或约350mg/L、为或约100mg/L至为或约400mg/L、为或约100mg/L至为或约450mg/L、为或约100mg/L至为或约500mg/L、为或约100mg/L至为或约550mg/L、为或约100mg/L至为或约600mg/L、为或约100mg/L至为或约650mg/L、为或约100mg/L至为或约750mg/L、为或约150mg/L至为或约200mg/L、为或约150mg/L至为或约250mg/L、为或约150mg/L至为或约300mg/L、为或约150mg/L至为或约350mg/L、为或约150mg/L至为或约400mg/L、为或约150mg/L至为或约450mg/L、为或约150mg/L至为或约500mg/L、为或约150mg/L至为或约550mg/L、为或约150mg/L至为或约600mg/L、为或约150mg/L至为或约650mg/L、为或约150mg/L至为或约750mg/L、为或约200mg/L至为或约250mg/L、为或约200mg/L至为或约300mg/L、为或约200mg/L至为或约350mg/L、为或约200mg/L至为或约400mg/L、为或约200mg/L至为或约450mg/L、为或约200mg/L至为或约500mg/L、为或约200mg/L至为或约550mg/L、为或约200mg/L至为或约600mg/L、为或约200mg/L至为或约650mg/L、为或约200mg/L至为或约750mg/L、为或约250mg/L至为或约300mg/L、为或约250mg/L至为或约350mg/L、为或约250mg/L至为或约400mg/L、为或约250mg/L至为或约450mg/L、为或约250mg/L至为或约500mg/L、为或约250mg/L至为或约550mg/L、为或约250mg/L至为或约600mg/L、为或约250mg/L至为或约650mg/L、为或约250mg/L至为或约750mg/L、为或约300mg/L至为或约350mg/L、为或约300mg/L至为或约400mg/L、为或约300mg/L至为或约450mg/L、为或约300mg/L至为或约500mg/L、为或约300mg/L至为或约550mg/L、为或约300mg/L至为或约600mg/L、为或约300mg/L至为或约650mg/L、为或约300mg/L至为或约750mg/L、为或约350mg/L至为或约400mg/L、为或约350mg/L至为或约450mg/L、为或约350mg/L至为或约500mg/L、为或约350mg/L至为或约550mg/L、为或约350mg/L至为或约600mg/L、为或约350mg/L至为或约650mg/L、为或约350mg/L至为或约750mg/L、为或约400mg/L至为或约450mg/L、为或约400mg/L至为或约500mg/L、为或约400mg/L至为或约550mg/L、为或约400mg/L至为或约600mg/L、为或约400mg/L至为或约650mg/L、为或约400mg/L至为或约750mg/L、为或约450mg/L至为或约500mg/L、为或约450mg/L至为或约550mg/L、为或约450mg/L至为或约600mg/L、为或约450mg/L至为或约650mg/L、为或约450mg/L至为或约750mg/L、为或约500mg/L至为或约550mg/L、为或约500mg/L至为或约600mg/L、为或约500mg/L至为或约650mg/L、为或约500mg/L至为或约750mg/L、为或约550mg/L至为或约600mg/L、为或约500mg/L至为或约650mg/L、为或约500mg/L至为或约750mg/L、为或约550mg/L至为或约600mg/L、为或约550mg/L至为或约650mg/L、为或约550mg/L至为或约750mg/L、为或约600mg/L至为或约650mg/L、为或约600mg/L至为或约750mg/L或为或约650mg/L至为或约750mg/L。在一些实施方案中，转铁蛋白的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约100mg/L。在一些实施方案中，转铁蛋白的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约50mg/L至为或约150mg/L。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括胰岛素或胰岛素替代品。在一些实施方案中，胰岛素替代品是含锌化合物，其可以用于代替胰岛素以给出与胰岛素大致相似的结果。胰岛素替代品的例子包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌和硫酸锌。许多胰岛素是本领域普通技术人员已知的。参见Gilman,A.G.等人编辑,The PharmacologicalBasis of Therapeutics,Pergamon Press,纽约,1990,第1463-1495页。在一些实施方案中，在补充剂和培养基中使用胰岛素而非胰岛素替代品。在一些实施方案中，所述胰岛素是锌胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是人锌胰岛素。
在一些实施方案中，所述胰岛素是人胰岛素或源自人胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组人胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素(或胰岛素替代品)的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在培养基中的胰岛素(或胰岛素替代品)的浓度是约1mg/L至为或约2.5mg/L、为或约1mg/L至为或约5mg/L、为或约1mg/L至为或约7.5mg/L、为或约1mg/L至为或约10mg/L、为或约1mg/L至为或约12.5mg/L、为或约1mg/L至为或约15mg/L、为或约1mg/L至为或约17.5mg/L、为或约1mg/L至为或约20mg/L、为或约1mg/L至为或约22.5mg/L、为或约1mg/L至为或约25mg/L、为或约1mg/L至为或约27.5mg/L、为或约1mg/L至为或约30mg/L、为或约2.5mg/L至为或约5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约7.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约10mg/L、为或约2.5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约15mg/L、为或约2.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约20mg/L、为或约2.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约25mg/L、为或约2.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约30mg/L、为或约5mg/L至为或约7.5mg/L、为或约5mg/L至为或约10mg/L、为或约5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约5mg/L至为或约15mg/L、为或约5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约5mg/L至为或约20mg/L、为或约5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约5mg/L至为或约25mg/L、为或约5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约5mg/L至为或约30mg/L、为或约7.5mg/L至为或约10mg/L、为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约15mg/L、为或约7.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约20mg/L、为或约7.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约25mg/L、为或约7.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约30mg/L、为或约10mg/L至为或约12.5mg/L、为或约10mg/L至为或约15mg/L、为或约10mg/L至为或约17.5mg/L、为或约10mg/L至为或约20mg/L、为或约10mg/L至为或约22.5mg/L、为或约10mg/L至为或约25mg/L、为或约10mg/L至为或约27.5mg/L、为或约10mg/L至为或约30mg/L、为或约12.5mg/L至为或约15mg/L、为或约12.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约20mg/L、为或约12.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约25mg/L、为或约12.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约30mg/L、为或约15mg/L至为或约17.5mg/L、为或约15mg/L至为或约20mg/L、为或约15mg/L至为或约22.5mg/L、为或约15mg/L至为或约25mg/L、为或约15mg/L至为或约27.5mg/L、为或约15mg/L至为或约30mg/L、为或约17.5mg/L至为或约20mg/L、为或约17.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约17.5mg/L至为或约25mg/L、为或约17.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约17.5mg/L至为或约30mg/L、为或约20mg/L至为或约22.5mg/L、为或约20mg/L至为或约25mg/L、为或约20mg/L至为或约27.5mg/L、为或约20mg/L至为或约30mg/L、为或约22.5mg/L至为或约25mg/L、为或约22.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约22.5mg/L至为或约30mg/L、为或约25mg/L至为或约27.5mg/L或为或约27.5mg/L至为或约30mg/L。在一些实施方案中，在培养基中的胰岛素或胰岛素替代品的浓度是为或约10mg/L。在一些实施方案中，在培养基中的胰岛素或胰岛素替代品的浓度是为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L。
在一些实施方案中，补充剂(例如第一补充剂)是通过将L-谷氨酰胺添加至含有一种或多种所需组分的现有补充剂或与含有一种或多种所需组分的现有补充剂混合来制备。在一些实施方案中，将L-谷氨酰胺添加至血清替换补充剂(例如免疫细胞血清替换品(ThermoFisher,#A2598101))或与所述血清替换补充剂混合。在一些实施方案中，将L-谷氨酰胺添加至补充剂或与补充剂混合，所述补充剂包括Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替换品。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约10mM至为或约30mM、为或约10mM至为或约50mM、为或约10mM至为或约70mM、为或约10mM至为或约90mM、为或约10mM至为或约110mM、为或约10mM至为或约130mM、为或约10mM至为或约150mM、为或约10mM至为或约170mM、为或约30mM至为或约50mM、为或约30mM至为或约70mM、为或约30mM至为或约90mM、为或约30mM至为或约110mM、为或约30mM至为或约130mM、为或约30mM至为或约150mM、为或约30mM至为或约170mM、为或约50mM至为或约70mM、为或约50mM至为或约90mM、为或约50mM至为或约110mM、为或约50mM至为或约130mM、为或约50mM至为或约150mM、为或约50mM至为或约170mM、为或约70mM至为或约90mM、为或约70mM至为或约110mM、为或约70mM至为或约130mM、为或约70mM至为或约150mM、为或约70mM至为或约170mM、为或约90mM至为或约110mM、为或约90mM至为或约130mM、为或约90mM至为或约150mM、为或约90mM至为或约170mM、为或约110mM至为或约130mM、为或约110mM至为或约150mM、为或约110mM至为或约170mM、为或约130mM至为或约150mM、为或约130mM至为或约170mM或为或约150mM至为或约170mM。在一些实施方案中，在补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约80mM。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括生长因子。在一些实施方案中，所述生长因子包括表皮生长因子(EGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括胰岛素样生长因子(IGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括神经生长因子(NGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括血小板源性生长因子(PDGF)。在一些实施方案中，所述生长因子包括转化生长因子(TGF)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括激素(例如，生长激素、胰岛素、氢化可的松、三碘甲状腺原氨酸、雌激素、雄激素、黄体酮、催乳素、促卵泡激素、胃泌素释放肽)。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括α-球蛋白或β-球蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括肽或肽级分(例如，源自动物、微生物或植物的蛋白质水解物)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括脂质。在一些实施方案中，所述脂质包括胆固醇。在一些实施方案中，所述脂质包括类固醇。在一些实施方案中，所述脂质包括脂肪酸(例如，棕榈酸酯、硬脂酸酯、油酸酯、亚油酸酯)。在一些实施方案中，所述脂质包括乙醇胺。在一些实施方案中，所述脂质包括胆碱。在一些实施方案中，所述脂质包括肌醇。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括过渡金属。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铁。在一些实施方案中，所述过渡金属包括锌。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铜。在一些实施方案中，所述过渡金属包括铬。在一些实施方案中，所述过渡金属包括碘。在一些实施方案中，所述过渡金属包括钴。在一些实施方案中，所述过渡金属包括硒。在一些实施方案中，所述过渡金属包括镁。在一些实施方案中，所述过渡金属包括钼。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括维生素。在一些实施方案中，所述维生素包括脂溶性维生素(例如，维生素A、维生素D、维生素E、维生素K)。在一些实施方案中，所述维生素包括水溶性维生素(例如，B1、B2、B6、B12、C、叶酸)。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括多胺。在一些实施方案中，所述多胺包括腐胺。在一些实施方案中，所述多胺包括亚精胺。在一些实施方案中，所述多胺包括精胺。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂包括2-巯基乙醇。在一些实施方案中，所述还原剂包括α-硫代甘油。在一些实施方案中，所述还原剂包括还原的谷胱甘肽。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括保护性添加剂。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括羧甲基纤维素。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括普朗尼克F-68。在一些实施方案中，所述保护性添加剂包括吐温80。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括粘附因子。在一些实施方案中，所述粘附因子包括纤连蛋白。在一些实施方案中，所述粘附因子包括层粘连蛋白。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分是以下各项中的一种或多种：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。在一些实施方案中，所述抗氧化剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、或D,L-生育酚乙酸酯、或其衍生物或混合物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述脂质药剂包括人
Figure BDA0002615298730000291
或乙醇胺或其衍生物和混合物。在一些实施方案中，所述胰岛素是人锌胰岛素。在一些实施方案中，转铁蛋白是人铁饱和转铁蛋白。在一些实施方案中，所述微量元素是Se4+。在一些实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一些实施方案中，所述补充剂是浓缩的。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括一种或多种抗氧化剂和选自以下各项的一种或多种成分：一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括以下各项中的一种或多种：N-乙酰基-L-半胱氨酸、人血清白蛋白、人
Figure BDA0002615298730000292
乙醇胺、人锌胰岛素、人铁饱和转铁蛋白、Se4+、氢化可的松、D,L-生育酚乙酸酯和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)。在一些实施方案中，NAC的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在基础培养基中的NAC的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L、为或约10mg/L至为或约700mg/L、为或约50mg/L至为或约100mg/L、为或约50mg/L至为或约150mg/L、为或约50mg/L至为或约200mg/L、为或约50mg/L至为或约250mg/L、为或约50mg/L至为或约300mg/L、为或约50mg/L至为或约350mg/L、为或约50mg/L至为或约400mg/L、为或约50mg/L至为或约450mg/L、为或约50mg/L至为或约500mg/L、为或约50mg/L至为或约550mg/L、为或约50mg/L至为或约600mg/L、为或约50mg/L至为或约650mg/L、为或约50mg/L至为或约700mg/L、为或约100mg/L至为或约150mg/L、为或约100mg/L至为或约200mg/L、为或约100mg/L至为或约250mg/L、为或约100mg/L至为或约300mg/L、为或约100mg/L至为或约350mg/L、为或约100mg/L至为或约400mg/L、为或约100mg/L至为或约450mg/L、为或约100mg/L至为或约500mg/L、为或约100mg/L至为或约550mg/L、为或约100mg/L至为或约600mg/L、为或约100mg/L至为或约650mg/L、为或约100mg/L至为或约700mg/L、为或约150mg/L至为或约200mg/L、为或约150mg/L至为或约250mg/L、为或约150mg/L至为或约300mg/L、为或约150mg/L至为或约350mg/L、为或约150mg/L至为或约400mg/L、为或约150mg/L至为或约450mg/L、为或约150mg/L至为或约500mg/L、为或约150mg/L至为或约550mg/L、为或约150mg/L至为或约600mg/L、为或约150mg/L至为或约650mg/L、为或约150mg/L至为或约700mg/L、为或约200mg/L至为或约250mg/L、为或约200mg/L至为或约300mg/L、为或约200mg/L至为或约350mg/L、为或约200mg/L至为或约400mg/L、为或约200mg/L至为或约450mg/L、为或约200mg/L至为或约500mg/L、为或约200mg/L至为或约550mg/L、为或约200mg/L至为或约600mg/L、为或约200mg/L至为或约650mg/L、为或约200mg/L至为或约700mg/L、为或约250mg/L至为或约300mg/L、为或约250mg/L至为或约350mg/L、为或约250mg/L至为或约400mg/L、为或约250mg/L至为或约450mg/L、为或约250mg/L至为或约500mg/L、为或约250mg/L至为或约550mg/L、为或约250mg/L至为或约600mg/L、为或约250mg/L至为或约650mg/L、为或约250mg/L至为或约700mg/L、为或约300mg/L至为或约350mg/L、为或约300mg/L至为或约400mg/L、为或约300mg/L至为或约450mg/L、为或约300mg/L至为或约500mg/L、为或约300mg/L至为或约550mg/L、为或约300mg/L至为或约600mg/L、为或约300mg/L至为或约650mg/L、为或约300mg/L至为或约700mg/L、为或约350mg/L至为或约400mg/L、为或约350mg/L至为或约450mg/L、为或约350mg/L至为或约500mg/L、为或约350mg/L至为或约550mg/L、为或约350mg/L至为或约600mg/L、为或约350mg/L至为或约650mg/L、为或约350mg/L至为或约700mg/L、为或约400mg/L至为或约450mg/L、为或约400mg/L至为或约500mg/L、为或约400mg/L至为或约550mg/L、为或约400mg/L至为或约600mg/L、为或约400mg/L至为或约650mg/L、为或约400mg/L至为或约700mg/L、为或约450mg/L至为或约500mg/L、为或约450mg/L至为或约550mg/L、为或约450mg/L至为或约600mg/L、为或约450mg/L至为或约650mg/L、为或约450mg/L至为或约700mg/L、为或约500mg/L至为或约550mg/L、为或约500mg/L至为或约600mg/L、为或约500mg/L至为或约650mg/L、为或约500mg/L至为或约700mg/L、为或约550mg/L至为或约600mg/L、为或约550mg/L至为或约650mg/L、为或约550mg/L至为或约700mg/L、为或约600mg/L至为或约650mg/L、为或约60mg/L至为或约700mg/L或为或约650mg/L至为或约700mg/L。
在一些实施方案中，在基础培养基中的NAC的浓度是为或约0mM至为或约1mM、为或约0mM至为或约2mM、为或约0mM至为或约3mM、为或约0mM至为或约4mM、为或约0mM至为或约5mM、为或约0mM至为或约6mM、为或约0mM至为或约7mM、为或约0mM至为或约8mM、为或约0mM至为或约9mM、为或约0mM至为或约10mM、为或约0mM至为或约12mM、为或约0mM至为或约14mM、为或约0mM至为或约16mM、为或约0mM至为或约18mM、为或约0mM至为或约20mM、为或约1mM至为或约2mM、为或约1mM至为或约3mM、为或约1mM至为或约4mM、为或约1mM至为或约5mM、为或约1mM至为或约6mM、为或约1mM至为或约7mM、为或约1mM至为或约8mM、为或约1mM至为或约9mM、为或约1mM至为或约10mM、为或约1mM至为或约12mM、为或约1mM至为或约14mM、为或约1mM至为或约16mM、为或约1mM至为或约18mM、为或约1mM至为或约20mM、为或约2mM至为或约3mM、为或约2mM至为或约4mM、为或约2mM至为或约5mM、为或约2mM至为或约6mM、为或约2mM至为或约7mM、为或约2mM至为或约8mM、为或约2mM至为或约9mM、为或约2mM至为或约10mM、为或约2mM至为或约12mM、为或约2mM至为或约14mM、为或约2mM至为或约16mM、为或约2mM至为或约18mM、为或约2mM至为或约20mM、为或约3mM至为或约4mM、为或约3mM至为或约5mM、为或约3mM至为或约6mM、为或约3mM至为或约7mM、为或约3mM至为或约8mM、为或约3mM至为或约9mM、为或约3mM至为或约10mM、为或约3mM至为或约12mM、为或约3mM至为或约14mM、为或约3mM至为或约16mM、为或约3mM至为或约18mM、为或约3mM至为或约20mM、为或约4mM至为或约5mM、为或约4mM至为或约6mM、为或约4mM至为或约7mM、为或约4mM至为或约8mM、为或约4mM至为或约9mM、为或约4mM至为或约10mM、为或约4mM至为或约12mM、为或约4mM至为或约14mM、为或约4mM至为或约16mM、为或约4mM至为或约18mM、为或约4mM至为或约20mM、为或约5mM至为或约6mM、为或约5mM至为或约7mM、为或约5mM至为或约8mM、为或约5mM至为或约9mM、为或约5mM至为或约10mM、为或约5mM至为或约12mM、为或约5mM至为或约14mM、为或约5mM至为或约16mM、为或约5mM至为或约18mM、为或约5mM至为或约20mM、为或约6mM至为或约7mM、为或约6mM至为或约8mM、为或约6mM至为或约9mM、为或约6mM至为或约10mM、为或约6mM至为或约12mM、为或约6mM至为或约14mM、为或约6mM至为或约16mM、为或约6mM至为或约18mM、为或约6mM至为或约20mM、为或约7mM至为或约8mM、为或约7mM至为或约9mM、为或约7mM至为或约10mM、为或约7mM至为或约12mM、为或约7mM至为或约14mM、为或约7mM至为或约16mM、为或约7mM至为或约18mM、为或约7mM至为或约20mM、为或约8mM至为或约9mM、为或约8mM至为或约10mM、为或约8mM至为或约12mM、为或约8mM至为或约14mM、为或约8mM至为或约16mM、为或约8mM至为或约18mM、为或约8mM至为或约20mM、为或约9mM至为或约10mM、为或约9mM至为或约12mM、为或约9mM至为或约14mM、为或约9mM至为或约16mM、为或约9mM至为或约18mM、为或约9mM至为或约20mM、为或约10mM至为或约12mM、为或约10mM至为或约14mM、为或约10mM至为或约16mM、为或约10mM至为或约18mM、为或约10mM至为或约20mM、为或约12mM至为或约14mM、为或约12mM至为或约16mM、为或约12mM至为或约18mM、为或约12mM至为或约20mM、为或约14mM至为或约16mM、为或约14mM至为或约18mM、为或约14mM至为或约20mM、为或约16mM至为或约18mM、为或约16mM至为或约20mM或为或约18mM至为或约20mM。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括乙醇胺。在一些实施方案中，乙醇胺的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，在基础培养基中的乙醇胺的浓度是为或约0mg/L至为或约2mg/L、为或约0mg/L至为或约4mg/L、为或约0mg/L至为或约6mg/L、为或约0mg/L至为或约8mg/L、为或约0mg/L至为或约10mg/L、为或约0mg/L至为或约12mg/L、为或约0mg/L至为或约14mg/L、为或约0mg/L至为或约16mg/L、为或约0mg/L至为或约18mg/L、为或约0mg/L至为或约20mg/L、为或约0mg/L至为或约22mg/L、为或约0mg/L至为或约24mg/L、为或约0mg/L至为或约26mg/L、为或约0mg/L至为或约28mg/L、为或约0mg/L至为或约30mg/L、为或约2mg/L至为或约4mg/L、为或约2mg/L至为或约6mg/L、为或约2mg/L至为或约8mg/L、为或约2mg/L至为或约10mg/L、为或约2mg/L至为或约12mg/L、为或约2mg/L至为或约14mg/L、为或约2mg/L至为或约16mg/L、为或约2mg/L至为或约18mg/L、为或约2mg/L至为或约20mg/L、为或约2mg/L至为或约22mg/L、为或约2mg/L至为或约24mg/L、为或约2mg/L至为或约26mg/L、为或约2mg/L至为或约28mg/L、为或约2mg/L至为或约30mg/L、为或约4mg/L至为或约6mg/L、为或约4mg/L至为或约8mg/L、为或约4mg/L至为或约10mg/L、为或约4mg/L至为或约12mg/L、为或约4mg/L至为或约14mg/L、为或约4mg/L至为或约16mg/L、为或约4mg/L至为或约18mg/L、为或约4mg/L至为或约20mg/L、为或约4mg/L至为或约22mg/L、为或约4mg/L至为或约24mg/L、为或约4mg/L至为或约26mg/L、为或约4mg/L至为或约28mg/L、为或约4mg/L至为或约30mg/L、为或约6mg/L至为或约8mg/L、为或约6mg/L至为或约10mg/L、为或约6mg/L至为或约12mg/L、为或约6mg/L至为或约14mg/L、为或约6mg/L至为或约16mg/L、为或约6mg/L至为或约18mg/L、为或约6mg/L至为或约20mg/L、为或约6mg/L至为或约22mg/L、为或约6mg/L至为或约24mg/L、为或约6mg/L至为或约26mg/L、为或约6mg/L至为或约28mg/L、为或约6mg/L至为或约30mg/L、为或约8mg/L至为或约10mg/L、为或约8mg/L至为或约12mg/L、为或约8mg/L至为或约14mg/L、为或约8mg/L至为或约16mg/L、为或约8mg/L至为或约18mg/L、为或约8mg/L至为或约20mg/L、为或约8mg/L至为或约22mg/L、为或约8mg/L至为或约24mg/L、为或约8mg/L至为或约26mg/L、为或约8mg/L至为或约28mg/L、为或约8mg/L至为或约30mg/L、为或约10mg/L至为或约12mg/L、为或约8mg/L至为或约14mg/L、为或约8mg/L至为或约16mg/L、为或约8mg/L至为或约18mg/L、为或约8mg/L至为或约20mg/L、为或约8mg/L至为或约22mg/L、为或约8mg/L至为或约24mg/L、为或约8mg/L至为或约26mg/L、为或约8mg/L至为或约28mg/L、为或约8mg/L至为或约30mg/L、为或约10mg/L至为或约12mg/L、为或约10mg/L至为或约14mg/L、为或约10mg/L至为或约16mg/L、为或约10mg/L至为或约18mg/L、为或约10mg/L至为或约20mg/L、为或约10mg/L至为或约22mg/L、为或约10mg/L至为或约24mg/L、为或约10mg/L至为或约26mg/L、为或约10mg/L至为或约28mg/L、为或约10mg/L至为或约30mg/L、为或约12mg/L至为或约14mg/L、为或约12mg/L至为或约16mg/L、为或约12mg/L至为或约18mg/L、为或约12mg/L至为或约20mg/L、为或约12mg/L至为或约22mg/L、为或约12mg/L至为或约24mg/L、为或约12mg/L至为或约26mg/L、为或约12mg/L至为或约28mg/L、为或约12mg/L至为或约30mg/L、为或约14mg/L至为或约16mg/L、为或约14mg/L至为或约18mg/L、为或约14mg/L至为或约20mg/L、为或约14mg/L至为或约22mg/L、为或约14mg/L至为或约24mg/L、为或约14mg/L至为或约26mg/L、为或约14mg/L至为或约28mg/L、为或约14mg/L至为或约30mg/L、为或约16mg/L至为或约18mg/L、为或约16mg/L至为或约20mg/L、为或约16mg/L至为或约22mg/L、为或约16mg/L至为或约24mg/L、为或约16mg/L至为或约26mg/L、为或约16mg/L至为或约28mg/L、为或约16mg/L至为或约30mg/L、为或约18mg/L至为或约20mg/L、为或约18mg/L至为或约22mg/L、为或约18mg/L至为或约24mg/L、为或约18mg/L至为或约26mg/L、为或约18mg/L至为或约28mg/L、为或约18mg/L至为或约30mg/L、为或约20mg/L至为或约22mg/L、为或约20mg/L至为或约24mg/L、为或约20mg/L至为或约26mg/L、为或约20mg/L至为或约28mg/L、为或约20mg/L至为或约30mg/L、为或约22mg/L至为或约24mg/L、为或约22mg/L至为或约26mg/L、为或约22mg/L至为或约28mg/L、为或约22mg/L至为或约30mg/L、为或约24mg/L至为或约26mg/L、为或约24mg/L至为或约28mg/L、为或约24mg/L至为或约30mg/L、为或约26mg/L至为或约28mg/L、为或约26mg/L至为或约30mg/L或为或约28mg/L至为或约30mg/L。
在一些实施方案中，所述补充剂是液体。在一些实施方案中，所述补充剂未被冷冻或不建议被冷冻用于储存。在一些实施方案中，所述补充剂包含白蛋白、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和乙醇胺。在一些实施方案中，所述补充剂包含白蛋白、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和乙醇胺，其中白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度是如下浓度，其使得在补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度与本文所述的大致相同。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自人血浆或血清的人源白蛋白。在一些实施方案中，所述补充剂是液体且不包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)或不包含显著量的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，将其他补充剂(例如第二补充剂)与基础培养基组合以提供所述一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，所述其他补充剂(例如第二补充剂)是细胞扩增补充剂。在一些实施方案中，所述其他补充剂(例如第二补充剂)是或包括
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补充剂(Thermofisher，A1048503的一部分)。
在一些实施方案中，所述补充剂是为或约2至为或约100倍浓缩的。在一些实施方案中，所述补充剂是为或约40X配制品。在一些实施方案中，一升基础培养基补充有为或约20至30毫升(如25±2毫升)的至少一种补充剂(包括第一补充剂)并且在一些情况下一种或多种其他补充剂。
C.无血清培养基
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)、游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)能够在包含细胞的细胞培养物中转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)，其中所述培养基是无血清的。在一些实施方案中，所述细胞包含人细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，所述细胞被基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是表达T细胞的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含合成氨基酸，其中所述合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺，例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)能够在包含细胞的细胞培养物中转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)；游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)；和至少一种蛋白质，其中所述培养基是无血清的。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸是稳定形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在水溶液(例如无血清培养基)中所述合成氨基酸比谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)更稳定。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸不产生显著量的谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述合成氨基酸不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、3、5、7、9、11、13或14天内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7或8周内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4或5年内不产生显著量的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、3、5、7、9、11、13或14天内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7或8周内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述合成氨基酸在至少或至少约1、2、3、4或5年内不产生显著量的吡咯烷酮羧酸或氨。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸可溶于水溶液(例如，无血清培养基)中。在一些实施方案中，在水溶液中所述合成氨基酸的溶解度高于游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸能够转运到细胞中，在所述细胞它可以转化为游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，所述细胞被基因工程化以表达重组受体(例如嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述细胞是表达T细胞的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是三肽。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是至少或至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是或是为或约2mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度为至多或至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM。
在一些实施方案中，在无血清培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度为约0.5mM-5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在无血清培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是为或约5mM-7.5mM、5mM-10mM、5mM-12.5mM、5mM-15mM、5mM-17.5mM、5mM-20mM、7.5mM-10mM、7.5mM-12.5mM、7.5mM-15mM、7.5mM-17.5mM、7.5mM-20mM、10mM-12.5mM、10mM-15mM、10mM-17.5mM、10mM-20mM、12.5mM-15mM、12.5mM-17.5mM、12.5mM-20mM、15mM-17.5mM、15mM-20mM或17.5mM-20mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，在培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度是至少或至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的浓度为至多或至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM。
在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约0.5mM至为或约5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺(如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)的浓度是为或约2mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约0.5mM至为或约5mM。在一些实施方案中，在无血清培养基中的L-谷氨酰胺的浓度是为或约2mM。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人或源自人的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分包括至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人或源自人的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述白蛋白源自人血清或人血浆。在一些实施方案中，所述白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，所述重组白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述重组白蛋白不是源自人。在一些实施方案中，所述补充剂包含天然白蛋白。在一些实施方案中，所述天然白蛋白源自人。在一些实施方案中，所述天然白蛋白不是源自人。在一些实施方案中，在无血清培养基中所述白蛋白的浓度是为或约0mg/mL至为或约2mg/mL、为或约0mg/mL至为或约4mg/mL、为或约0mg/mL至为或约6mg/mL、为或约0mg/mL至为或约8mg/mL、为或约0mg/mL至为或约10mg/mL、为或约0mg/mL至为或约12mg/mL、为或约2mg/mL至为或约4mg/mL、为或约2mg/mL至为或约6mg/mL、为或约2mg/mL至为或约8mg/mL、为或约2mg/mL至为或约10mg/mL、为或约2mg/mL至为或约12mg/mL、为或约4mg/mL至为或约6mg/mL、为或约4mg/mL至为或约8mg/mL、为或约4mg/mL至为或约10mg/mL、为或约4mg/mL至为或约12mg/mL、为或约6mg/mL至为或约8mg/mL、为或约6mg/mL至为或约10mg/mL、为或约6mg/mL至为或约12mg/mL、为或约8mg/mL至为或约10mg/mL、为或约8mg/mL至为或约12mg/mL、为或约10mg/mL至为或约12mg/mL或为或约10mg/mL至为或约15mg/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述培养基中的白蛋白是为或约5mg/mL。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含转铁蛋白或转铁蛋白替代品(如本文所述的这些)。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白替代品是源自人。在一些实施方案中，所述转铁蛋白或转铁蛋白替代品是源自人血清或血浆。在一些实施方案中，在无血清培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约10mg/L至为或约50mg/L、为或约10mg/L至为或约100mg/L、为或约10mg/L至为或约150mg/L、为或约10mg/L至为或约200mg/L、为或约10mg/L至为或约250mg/L、为或约10mg/L至为或约300mg/L、为或约10mg/L至为或约350mg/L、为或约10mg/L至为或约400mg/L、为或约10mg/L至为或约450mg/L、为或约10mg/L至为或约500mg/L、为或约10mg/L至为或约550mg/L、为或约10mg/L至为或约600mg/L、为或约10mg/L至为或约650mg/L、为或约10mg/L至为或约750mg/L、为或约50mg/L至为或约100mg/L、为或约50mg/L至为或约150mg/L、为或约50mg/L至为或约200mg/L、为或约50mg/L至为或约250mg/L、为或约50mg/L至为或约300mg/L、为或约50mg/L至为或约350mg/L、为或约50mg/L至为或约400mg/L、为或约50mg/L至为或约450mg/L、为或约50mg/L至为或约500mg/L、为或约50mg/L至为或约550mg/L、为或约50mg/L至为或约600mg/L、为或约50mg/L至为或约650mg/L、为或约50mg/L至为或约750mg/L、为或约100mg/L至为或约150mg/L、为或约100mg/L至为或约200mg/L、为或约100mg/L至为或约250mg/L、为或约100mg/L至为或约300mg/L、为或约100mg/L至为或约350mg/L、为或约100mg/L至为或约400mg/L、为或约100mg/L至为或约450mg/L、为或约100mg/L至为或约500mg/L、为或约100mg/L至为或约550mg/L、为或约100mg/L至为或约600mg/L、为或约100mg/L至为或约650mg/L、为或约100mg/L至为或约750mg/L、为或约150mg/L至为或约200mg/L、为或约150mg/L至为或约250mg/L、为或约150mg/L至为或约300mg/L、为或约150mg/L至为或约350mg/L、为或约150mg/L至为或约400mg/L、为或约150mg/L至为或约450mg/L、为或约150mg/L至为或约500mg/L、为或约150mg/L至为或约550mg/L、为或约150mg/L至为或约600mg/L、为或约150mg/L至为或约650mg/L、为或约150mg/L至为或约750mg/L、为或约200mg/L至为或约250mg/L、为或约200mg/L至为或约300mg/L、为或约200mg/L至为或约350mg/L、为或约200mg/L至为或约400mg/L、为或约200mg/L至为或约450mg/L、为或约200mg/L至为或约500mg/L、为或约200mg/L至为或约550mg/L、为或约200mg/L至为或约600mg/L、为或约200mg/L至为或约650mg/L、为或约200mg/L至为或约750mg/L、为或约250mg/L至为或约300mg/L、为或约250mg/L至为或约350mg/L、为或约250mg/L至为或约400mg/L、为或约250mg/L至为或约450mg/L、为或约250mg/L至为或约500mg/L、为或约250mg/L至为或约550mg/L、为或约250mg/L至为或约600mg/L、为或约250mg/L至为或约650mg/L、为或约250mg/L至为或约750mg/L、为或约300mg/L至为或约350mg/L、为或约300mg/L至为或约400mg/L、为或约300mg/L至为或约450mg/L、为或约300mg/L至为或约500mg/L、为或约300mg/L至为或约550mg/L、为或约300mg/L至为或约600mg/L、为或约300mg/L至为或约650mg/L、为或约300mg/L至为或约750mg/L、为或约350mg/L至为或约400mg/L、为或约350mg/L至为或约450mg/L、为或约350mg/L至为或约500mg/L、为或约350mg/L至为或约550mg/L、为或约350mg/L至为或约600mg/L、为或约350mg/L至为或约650mg/L、为或约350mg/L至为或约750mg/L、为或约400mg/L至为或约450mg/L、为或约400mg/L至为或约500mg/L、为或约400mg/L至为或约550mg/L、为或约400mg/L至为或约600mg/L、为或约400mg/L至为或约650mg/L、为或约400mg/L至为或约750mg/L、为或约450mg/L至为或约500mg/L、为或约450mg/L至为或约550mg/L、为或约450mg/L至为或约600mg/L、为或约450mg/L至为或约650mg/L、为或约450mg/L至为或约750mg/L、为或约500mg/L至为或约550mg/L、为或约500mg/L至为或约600mg/L、为或约500mg/L至为或约650mg/L、为或约500mg/L至为或约750mg/L、为或约550mg/L至为或约600mg/L、为或约500mg/L至为或约650mg/L、为或约500mg/L至为或约750mg/L、为或约550mg/L至为或约600mg/L、为或约550mg/L至为或约650mg/L、为或约550mg/L至为或约750mg/L、为或约600mg/L至为或约650mg/L、为或约600mg/L至为或约750mg/L或为或约650mg/L至为或约750mg/L。在一些实施方案中，在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约100mg/L。在一些实施方案中，在无血清培养基中的转铁蛋白的浓度是为或约50mg/L至150mg/L。
在一些实施方案中，所述补充剂包含胰岛素或胰岛素替代品(如本文所述的这些)。在一些实施方案中，所述胰岛素源自人。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组胰岛素。在一些实施方案中，所述胰岛素是重组人胰岛素。在一些实施方案中，在无血清培养基中的胰岛素(或胰岛素替代品)的浓度是为或约1mg/L至为或约2.5mg/L、为或约1mg/L至为或约5mg/L、为或约1mg/L至为或约7.5mg/L、为或约1mg/L至为或约10mg/L、为或约1mg/L至为或约12.5mg/L、为或约1mg/L至为或约15mg/L、为或约1mg/L至为或约17.5mg/L、为或约1mg/L至为或约20mg/L、为或约1mg/L至为或约22.5mg/L、为或约1mg/L至为或约25mg/L、为或约1mg/L至为或约27.5mg/L、为或约1mg/L至为或约30mg/L、为或约2.5mg/L至为或约5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约7.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约10mg/L、为或约2.5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约15mg/L、为或约2.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约20mg/L、为或约2.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约25mg/L、为或约2.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约2.5mg/L至为或约30mg/L、为或约5mg/L至为或约7.5mg/L、为或约5mg/L至为或约10mg/L、为或约5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约5mg/L至为或约15mg/L、为或约5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约5mg/L至为或约20mg/L、为或约5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约5mg/L至为或约25mg/L、为或约5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约5mg/L至为或约30mg/L、为或约7.5mg/L至为或约10mg/L、为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约15mg/L、为或约7.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约20mg/L、为或约7.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约25mg/L、为或约7.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约7.5mg/L至为或约30mg/L、为或约10mg/L至为或约12.5mg/L、为或约10mg/L至为或约15mg/L、为或约10mg/L至为或约17.5mg/L、为或约10mg/L至为或约20mg/L、为或约10mg/L至为或约22.5mg/L、为或约10mg/L至为或约25mg/L、为或约10mg/L至为或约27.5mg/L、为或约10mg/L至为或约30mg/L、为或约12.5mg/L至为或约15mg/L、为或约12.5mg/L至为或约17.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约20mg/L、为或约12.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约25mg/L、为或约12.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约12.5mg/L至为或约30mg/L、为或约15mg/L至为或约17.5mg/L、为或约15mg/L至为或约20mg/L、为或约15mg/L至为或约22.5mg/L、为或约15mg/L至为或约25mg/L、为或约15mg/L至为或约27.5mg/L、为或约15mg/L至为或约30mg/L、为或约17.5mg/L至为或约20mg/L、为或约17.5mg/L至为或约22.5mg/L、为或约17.5mg/L至为或约25mg/L、为或约17.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约17.5mg/L至为或约30mg/L、为或约20mg/L至为或约22.5mg/L、为或约20mg/L至为或约25mg/L、为或约20mg/L至为或约27.5mg/L、为或约20mg/L至为或约30mg/L、为或约22.5mg/L至为或约25mg/L、为或约22.5mg/L至为或约27.5mg/L、为或约22.5mg/L至为或约30mg/L、为或约25mg/L至为或约27.5mg/L或为或约27.5mg/L至为或约30mg/L。在一些实施方案中，在无血清培养基中的胰岛素或胰岛素替代品的浓度是为或约10mg/L。在一些实施方案中，在无血清培养基中的胰岛素或胰岛素替代品的浓度是为或约7.5mg/L至为或约12.5mg/L。
在一些实施方案中，所述无血清培养基不包含酚红。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含酚红。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含无机盐、糖、氨基酸的营养素混合物，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂、脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或缓冲液。例子包括本文(如在以上章节中)所述的那些，包括无机盐、糖、氨基酸、维生素、有机酸、抗氧化剂、脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或缓冲液。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含选自以下各项中的一种或多种的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种微量元素、一种或多种糖皮质激素、一种或多种无机盐、一种或多种能量来源、一种或多种缓冲剂、一种或多种丙酮酸盐、一种或多种pH指示剂、一种或多种氨基酸及一种或多种维生素。在一些实施方案中，所述抗氧化剂选自N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、和D,L-生育酚乙酸酯、或其衍生物或混合物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，所述脂质药剂是人
Figure BDA0002615298730000442
和乙醇胺。在一些实施方案中，所述胰岛素是人锌胰岛素。在一些实施方案中，所述转铁蛋白是人铁饱和转铁蛋白。在一些实施方案中，所述糖皮质激素是氢化可的松。在一些实施方案中，无机盐成分包含选自以下各项的一种或多种无机盐：一种或多种钙盐、一种或多种钾盐、一种或多种镁盐、一种或多种钠盐、一种或多种碳酸盐及一种或多种磷酸盐。在一些实施方案中，所述能量来源是D-葡萄糖。在一些实施方案中，所述缓冲剂是HEPES。在一些实施方案中，所述丙酮酸盐是丙酮酸钠。在一些实施方案中，所述pH指示剂是酚红。在一些实施方案中，氨基酸成分包含选自以下各项的一种或多种氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸HCL、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸及其盐和衍生物。在一些实施方案中，所述维生素成分包含选自以下各项的一种或多种维生素：生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素和维生素B12及其衍生物。在一些实施方案中，成分包含N-乙酰基-L-半胱氨酸、2-巯基乙醇、人血清白蛋白、D,L-生育酚乙酸酯、人
Figure BDA0002615298730000441
乙醇胺、人锌胰岛素、铁饱和转铁蛋白、Se4+、氢化可的松、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、CO3 2-、PO4 3-、D-葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠、酚红、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸HCL、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸、生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素和维生素B2。
在一些实施方案中，提供了包含基础培养基和至少一种补充剂的无血清培养基，。在本文中(如在以上章节中)描述了基础培养基和补充剂的各种例子。
在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约90％至为或约97.5％(v/v)的基础培养基、为或约2.5％至为或约10％(v/v)的补充剂，例如第一补充剂和/或第二补充剂。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约90％至为或约97.5％(v/v)的基础培养基、为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第一补充剂和为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第二补充剂。
在一些实施方案中，提供了包含基础培养基、第一补充剂和第二补充剂的无血清培养基。在一些实施方案中，所述基础培养基包含液体，所述液体包含合成氨基酸(例如，二肽形式的L-谷氨酰胺,例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)，并且其中所述基础培养基不含或基本上不含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)和/或蛋白质。在一些实施方案中，所述第一补充剂包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)，其中所述第一补充剂在谷氨酰胺变为其组分之后且在预期用途(例如，用作基础培养基的补充剂)之前的大部分时间内在低于室温(例如低于或低于约20℃、10℃、15℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃或-20℃)的温度下被冷冻或储存。在一些实施方案中，所述第一补充剂包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)，其中第一补充剂在紧接着与培养基(例如基础培养基)组合之前在低于室温(例如低于或低于约20℃、10℃、15℃、5℃、0℃、-5℃、-10℃、-15℃或-20℃)的温度下被冷冻或储存。在一些实施方案中，所述第二补充剂包含白蛋白、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和/或乙醇胺。在一些实施方案中，所述第二补充剂包含选自以下各项的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。在一些实施方案中，所述细胞因子包含IL-2。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。
在一些实施方案中，细胞因子的浓度是约在为或约1IU/ml与为或约2,000IU/ml之间、在为或约10IU/ml与为或约100IU/ml之间、在为或约50IU/ml与为或约500IU/ml之间、在为或约100IU/ml与为或约200IU/ml之间、在为或约500IU/ml与为或约1400IU/ml之间、在为或约250IU/ml与为或约500IU/ml之间或在为或约500IU/ml与为或约2,500IU/ml之间。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含IL-2。在一些实施方案中，IL-2(例如人重组IL-2)的浓度是在为或约2IU/ml与为或约500IU/ml之间、在为或约10IU/ml与为或约250IU/ml之间、在为或约100IU/ml与为或约500IU/ml之间或在为或约100IU/ml与为或约400IU/ml之间。在特定实施方案中，IL-2的浓度是为或为约50IU/ml、75IU/ml、100IU/ml、125IU/ml、150IU/ml、175IU/ml、200IU/ml、225IU/ml、250IU/ml、300IU/ml或400IU/ml。在一些实施方案中，IL-2的浓度是为或约200IU/ml。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含IL-7。在一些实施方案中，IL-7(例如人重组IL-7)的浓度是约在为或约10IU/ml与为或约5,000IU/ml之间、在为或约500IU/ml与为或约2,000IU/ml之间、在为或约600IU/ml与为或约1,500IU/ml之间、在为或约500IU/ml与为或约2,500IU/ml之间、在为或约750IU/ml与为或约1,500IU/ml之间或在为或约1,000IU/ml与为或约2,000IU/ml之间。在特定实施方案中，IL-7的浓度是为或为约100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml、400IU/ml、500IU/ml、600IU/ml、700IU/ml、800IU/ml、900IU/ml、1,000IU/ml、1,200IU/ml、1,400IU/ml或1,600IU/ml。在一些实施方案中，IL-7的浓度是为约1,200IU/ml。
在一些实施方案中，所述无血清培养基包含IL-15。在一些实施方案中，IL-15(例如人重组IL-15)的浓度是在为或约0.1IU/ml与为或约200IU/ml之间、在为或约1IU/ml与为或约50IU/ml之间、在为或约5IU/ml与为或约25IU/ml之间、在为或约25IU/ml与为或约50IU/ml之间、在为或约5IU/ml与为或约15IU/ml之间或在为或约10IU/ml与为或约50IU/ml之间。在特定实施方案中，IL-15的浓度是为或为约1IU/ml、2IU/ml、3IU/ml、4IU/ml、5IU/ml、6IU/ml、7IU/ml、8IU/ml、9IU/ml、10IU/ml、11IU/ml、12IU/ml、13IU/ml、14IU/ml、15IU/ml、20IU/ml、25IU/ml、30IU/ml、40IU/ml、50IU/ml、100IU/ml或200IU/ml。在特定实施方案中，IL-15的浓度为约20IU/ml。
在一些实施方案中，所述无血清培养基是浓缩的培养基配制品。在一些实施方案中，所述无血清培养基不是浓缩的培养基配制品。在一些实施方案中，所述无血清培养基是从为或约2X至为或约100X浓缩的。在一些实施方案中，所述无血清培养基是为或约10X配制品。在一些实施方案中，所述无血清培养基可以在为或约2℃至8℃下储存。
在一些实施方案中，所述培养基能够在没有L-谷氨酰胺、二肽形式的谷氨酰胺或其他形式的谷氨酰胺的另外的补充剂的情况下培育细胞至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更长时间。
在一些实施方案中，所述无血清培养基能够在没有L-谷氨酰胺、二肽形式的谷氨酰胺或其他形式的谷氨酰胺的另外的补充剂的情况下促进细胞扩增至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更长时间。
在一些实施方案中，所述无血清培养基支持或促进细胞扩增。在一些实施方案中，所述培养基支持或促进细胞活力。在一些实施方案中，所述培养基支持或促进细胞的激活。
在一些实施方案中，所述细胞包含免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含原代免疫细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含基因工程化细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含T细胞。在一些实施方案中，所述原代免疫细胞包含CD4和/或CD8T细胞。在一些实施方案中，所述CD4和/或CD8 T细胞是基因工程化T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞被基因工程化以表达重组受体(例如，嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，所述T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞。
在一些实施方案中，所述无血清培养基支持或促进细胞的活力、扩增和/或激活，其中用无血清培养基培养的细胞实现与用含血清的培养基(如含有约5％-10％(v/v)人血清的培养基)培养的细胞相当的功能特性(例如，活力、扩增和一种或多种细胞因子的产生)。
D.制备无血清培养基的方法
在一些实施方案中，提供了用于制备无血清培养基配制品的方法，所述方法包括将以下各项组合：(a)包含合成氨基酸的基础培养基，所述合成氨基酸能够在细胞培养物中转化为游离形式的谷氨酰胺(例如L-谷氨酰胺)；(b)包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)的第一补充剂，其中所述第一补充剂在L-谷氨酰胺变为其组分之后且在组合之前的至少一段时间内被冷冻。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽形式的L-谷氨酰胺(例如L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述基础培养基是无血清的。在一些实施方案中，所述基础培养基是液体配制品和/或在组合之前未被冷冻和/或在商业方案中不建议在保持储存时被冷冻。在一些实施方案中，所述第一补充剂在L-谷氨酰胺变为其组分之后且在与基础培养基组合之前的大部分时间内被冷冻。在一些实施方案中，所述第一补充剂被冷冻且在组合之前被解冻。
在一些实施方案中，所述第一补充剂在与基础培养基组合之前不超过或不超过约一周，如不超过或不超过约6、5、4、3、2或1天，通常不超过或不超过约12小时、6小时、2小时、1小时或30分钟被解冻为液体配制品。在一些实施方案中，含有L-谷氨酰胺的第一补充剂在组合之前不久(如在6、12、16、24、36、48小时内)或紧接在组合之前保持冷冻。在一些实施方案中，含有L-谷氨酰胺的第一补充剂在与基础培养基组合之前小于或小于约48、24、16、12、8、4或2小时内是液体配制品。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是二肽形式的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述合成氨基酸是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约90％至98.75％(v/v)的基础培养基和为或约1.25％至10％(v/v)的第一补充剂。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约90％至97.5％(v/v)的基础培养基和为或约1.25％至5％(v/v)的第一补充剂。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约95％(v/v)的基础培养基和为或约2.5％±0.2％(v/v)(如为或约2.5％(v/v))的第一补充剂。在一些实施方案中，一升的基础培养基补充有为或约25毫升的第一补充剂。
在一些实施方案中，所述方法还包括组合第二补充剂。在一些实施方案中，所述第二补充剂包含一种或多种另外的组分，如以上所述的任何组分，包括一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。第二补充剂的示例性组分如上所述。
在一些实施方案中，所述第二补充剂包含白蛋白、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和乙醇胺。在一些实施方案中，所述第二补充剂包含白蛋白、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和乙醇胺，其中白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度是如下浓度，其使得在第二补充剂与基础培养基(如本文所述的这些)组合之后，白蛋白、NAC和/或乙醇胺的浓度与本文所述的大致相同。在一些实施方案中，所述白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是来自人血浆或血清的人源白蛋白。在一些实施方案中，所述第二补充剂是液体且不包含游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)或不包含显著量的游离形式的谷氨酰胺(即L-谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，所述第二补充剂包括
Figure BDA0002615298730000491
补充剂(Thermofisher,A1048503的一部分)。
在一些实施方案中，所述第二补充剂是液体。在一些实施方案中，所述第二补充剂未被冷冻或不建议被冷冻用于储存。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约1.25％至为或约5％(v/v)(如为或约2.5％±0.2％、如为或约2.5％或为或约2.6％)的第二补充剂。在一些实施方案中，一升的基础培养基补充有约26毫升的第二补充剂。
在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约90％至为或约97.5％(v/v)的基础培养基、为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第一补充剂及为或约1.25％至为或约5％(v/v)的第二补充剂。在一些实施方案中，所述无血清培养基配制品包含为或约95％(v/v)的基础培养基、为或约2.5％±0.2％(v/v)的第一补充剂及为或约2.5％±0.2％(v/v)的第二补充剂。
II.用于产生和制备细胞组合物的方法
在一些实施方案中，所提供的无血清培养基可以用于如与细胞(包括免疫细胞，如T细胞)的激活、转导、扩增、培育或增殖中的一种或多种相结合来培养细胞的方法中。在一些实施方案中，所提供的用于在存在无血清培养基的情况下培养细胞的方法可以作为用于生成或产生基因工程化细胞(如基因工程化T细胞)的过程的一部分进行。在一些实施方案中，将细胞用所提供的无血清培养基培养至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在一些实施方案中，将细胞培养约2-3天、3-4天、4-5天、5-6天、6-7天、7-8天、8-9天、9-10天、10-11天、11-12天、12-13天、13-14天、14-15天、15-16天、16-17天、17-18天、18-19天或19-20天，每个都包含端值。在一些实施方案中，将细胞在约37℃下培养。在一些实施方案中，将细胞在5％CO2/95％空气气氛中培养。在一些实施方案中，所述培养可以在培养细胞时不更换培养基的情况下进行大于或大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在一些实施方案中，灌注(如半连续灌注)方法可以与培养细胞相结合使用。
在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞或富集的免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞或富含T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4+ T细胞或富集的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD8+ T细胞或富集的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含基因工程化细胞或富集的基因工程化细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞包含有待基因工程化或正在被基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含有待基因工程化或正在被基因工程化的富集的细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞包含基因工程化的T细胞或富集的基因工程化的T细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞包含嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞或富集的CAR表达T细胞。在一些实施方案中，所述细胞先前已被低温保存。在一些实施方案中，所述细胞已在无血清培养基中培养并且在培养之后被低温保存。在一些实施方案中，所述细胞特异性地靶向肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于培养细胞，如用于细胞的培育、扩增或增殖的方法。在一些实施方案中，进行所述方法，从而如在存在无血清培养基的情况下(任选地使用一种或多种其他细胞因子或试剂)培养为或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天之后扩增细胞至少或至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或更多倍。在一些实施方案中，在无血清培养基配制品中培养约5至6天之后，细胞扩增至少约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍。在一些实施方案中，如在培养为或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天之后，所述扩增与在相同条件下用含血清的培养基的培养相比是相当的或改善的。
在一些实施方案中，与所提供的用于培养的方法相结合，如与细胞的激活、转导、培育、扩增或增殖相结合，所述无血清培养基还含有一种或多种细胞因子和/或在所述培养是在存在一种或多种细胞因子的情况下进行的。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IL-7和IL-15。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是基因工程化T细胞。
在一些实施方案中，所提供的方法与涉及所述制造、生成或产生细胞疗法的一个或多个步骤或过程相结合使用。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括用重组受体(如嵌合抗原受体)工程化的细胞，如T细胞，例如CAR T细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个步骤包括细胞的分离、分开(separation)、选择、激活或刺激、转导、培育、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制。在一些实施方案中，生成或产生细胞疗法的方法包括从受试者分离细胞，在一种或多种刺激条件下制备、加工、培养细胞。在一些实施方案中，所述方法包括按以下顺序进行的加工步骤，其中：首先将细胞(例如原代细胞)从生物样品分离(如选择或分开)；将选择的细胞与病毒载体颗粒一起孵育用于转导，任选地在存在刺激试剂的情况下刺激所分离的细胞的步骤之后；培养所转导的细胞，例如以扩增细胞；将所转导的细胞配制在组合物中并将组合物引入生物医学材料器皿中。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将生成的工程化细胞重新引入同一受试者中。在一些实施方案中，任何一个或多个上述步骤可以在存在无血清培养基的情况下进行。
在一些实施方案中，所述一个或多个加工步骤可以包括以下各项中的一个或多个：(a)洗涤含有细胞的生物样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物)；(b)从所述样品分离(例如选择)所需的细胞子集或群体(例如，CD4+和/或CD8+ T细胞)，例如通过将细胞与用于基于免疫亲和力的分离的选择或免疫亲和试剂一起孵育来进行；c)将编码重组受体(例如CAR)的药剂引入所分离或所选择的细胞中，如通过将所分离(如所选择)的细胞与编码重组受体的病毒载体颗粒一起孵育来进行；(d)使用如所描述的方法培养、培育或扩增细胞；及(e)如在药学上可接受的缓冲液、低温保存剂或其他合适的培养基中配制所转导的细胞。在一些实施方案中，所述方法还可以包括(f)通过使细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，这可以在将细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、期间和/或之后进行。在一些实施方案中，在任何上述步骤之前或之后也可以进行洗涤或悬浮步骤的一个或多个另外的步骤，例如用于细胞的稀释、浓缩和/或缓冲液交换。在一些方面，将所得的工程化细胞组合物引入一个或多个生物医学培养器皿中。在一些实施方案中，任何一个或多个上述步骤可以在存在无血清培养基的情况下进行。
在一些实施方案中，用于制造、生成或产生细胞疗法的过程包括以下步骤：其中在进行所述过程的后续步骤之前分离或选择总T细胞，例如CD3+或CD4+/CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，用于制造、生成或产生细胞疗法的过程包括以下步骤：其中单独分离CD4+细胞与CD8+细胞，然后在将重组受体(例如CAR)引入细胞中的步骤之前将这些细胞混合在一起。在一些实施方案中，在将编码重组受体的药剂引入之前和/或用于产生基因工程化细胞的一个或多个后续步骤之前，将CD4+细胞与CD8+细胞以如下比率混合：为或约1:5至为或约5:1的CD4+与CD8+ T细胞，如为或约1:3至为或约3:1、为或约1:2至为或约2:1或为或约1:1的CD4+与CD8+细胞加工的比率。
在一些实施方案中，用于制造、生成或产生细胞疗法的过程包括以下步骤：单独分离CD4+ T细胞与CD8+ T细胞，和对所选择或所分离的CD4+ T细胞单独进行所述一个或多个后续步骤及对所选择或所分离的CD8+ T细胞单独进行所述一个或多个后续步骤。在这种实施方案的方面，所转导的细胞(如用重组受体(例如CAR)基因工程化的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)可以在配制细胞的步骤之前组合在一起作为单一组合物。在这种实施方案的其他方面，所转导的细胞(如所转导的细胞，如用重组受体(例如CAR)基因工程化的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物)是单独配制的，如用于向受试者单独给予。
在一些实施方案中，进行所提供的用于制备或产生基因工程化细胞的方法，使得在用于临床用途(例如在过继细胞疗法中)的细胞制备中的一个、多个或所有步骤是在未将所述细胞暴露于非无菌条件下且在无需使用无菌室或无菌柜的情况下进行的。在这种方法的一些实施方案中，细胞被分离、分开或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激和配制，都在封闭系统内进行。在这样的过程的一些方面，使细胞从封闭的系统中表达并将其引入一个或多个生物材料器皿中。在一些实施方案中，所述方法是以自动化方式进行的。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭的系统或装置之外进行的。
在一些实施方案中，将封闭的系统用于进行用于制造、生成或产生细胞疗法的方法的一个或多个其他加工步骤。在某些实施方案中，使用进行所述方法的分离、细胞制备、分离、加工、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、装置或设备进行分离或分离开。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每个，例如以使误差、用户操作和/或污染最小化。在一些实施方案中，加工步骤(例如，分离、选择和/或富集、加工、与转导和工程化相结合的孵育、及配制步骤)中的一个或多个或所有是使用集成或自含式系统中的系统、装置或设备进行和/或以自动化或可编程方式进行的。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、结果评估和/或调整。在一个例子中，系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003、或US 20110003380 A1中所述的系统。在一些实施方案中，所述系统或装置包括离心室，如用于进行加工细胞的一个或多个步骤。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
A.从样品分离或选择细胞
在一些实施方案中，加工步骤包括从生物样品分离细胞或其组合物，所述生物样品例如是获得自或源自受试者(如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者)的那些生物样品。在一些方面，受试者是人，如作为需要特定治疗干预(如针对其而将细胞分离、加工和/或工程化的过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，细胞包括CD4+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，细胞包括CD4+或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，核酸(如编码重组蛋白的核酸)是异源的，即通常在细胞或从所述细胞获得的样品中不存在，如从另一种生物体或细胞获得的核酸，所述核酸通常在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物体中没有发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
所述细胞通常是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴样细胞(包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞)。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导的多能干细胞(iPSC)。所述细胞通常是原代细胞，如从受试者直接分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个子集，如整个T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，如由以下所定义的那些：功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌谱和/或分化程度。关于要治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现成的技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从所述受试者分离细胞、将其制备、加工、培养和/或工程化，并在低温保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化的效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡性辅助T细胞)、α/βT细胞以及δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生出这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，如在自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，所述工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤，其中一些或所有步骤是在存在如本文所提供的无血清培养基的情况下进行的。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如，从受试者获得或衍生的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者。
样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的加工样品。
在一些方面，所述样品是血液或源自血液的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器，Baxter)根据制造商的说明书完成的。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后包括冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。然后用介质将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将所述细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，细胞或群体的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在存在一种或多种试剂的情况下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过溶解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。在一些实施方案中，选择和/或过程的其他方面如国际专利申请公开号WO/2015/164675中所述。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于所需亲和力的选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用导致被分离的细胞与特异性结合细胞上的标记的分子(例如抗体或固体表面(例如颗粒)上的其他结合配偶体)之间有利的有力相互作用的任何系统或方法来进行。在一些实施方案中，所述方法是使用包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)的颗粒(如珠，例如磁珠)来进行的。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，且细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进特别有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中全部或部分选择是在离心室的内腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，所述分离或分开是使用国际专利申请公开号WO 2009/072003或US20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在加工期间溶液的添加及其定时，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强正在加工的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，所述部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明书针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或至少约或约或10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进特别有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间是从或从约5分钟至或至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或至少约30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在存在旋转的情况下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如从或从约600rpm至或至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF是从或从约80g至100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在与所述室为整体的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品如单采术样品的预先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入所述室中和推出所述室并实现离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，在所述封闭系统中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育之后，将孵育的细胞(包括选择试剂已结合的细胞)转移到系统中以进行基于免疫亲和力的细胞分离。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记(例如，表面蛋白)、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)在细胞中的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过与和此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并将已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与尚未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未与试剂(例如抗体或结合配偶体)结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除所需群体之外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，加工步骤进一步包括如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群体，或经由阴性选择耗尽特定细胞群体来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。
所述分离不需要导致表达特定标记的特定细胞群体或细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致全部此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起孵育，所述抗体或结合配偶体各自对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，对多种细胞类型同时进行阳性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。在一些实施方案中，通过与特异性地结合至此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以如直接或间接缀合至用于实现选择的固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠。例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002615298730000611
M-450 CD3/CD28 T细胞扩增器和/或
Figure BDA0002615298730000612
珠)阳性选择CD3+、CD28+ T细胞。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+ T细胞的选择，其中保留阴性和阳性级分二者。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+ T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+ T细胞选自阴性级分。
在一些实施方案中，通过对非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)进行阴性选择，将T细胞从PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体还分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+ T细胞与CD4+ T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽，如使用抗CD8和抗CD62L抗体。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分进行基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依次进行的。在一些方面，将用于制备CD8+细胞群体或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4+细胞群体或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+细胞群体的选择和对CD8+细胞群体的选择同时进行。在一些实施方案中，CD4+细胞群体和对CD8+细胞群体的选择以任一顺序依序进行。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US20170037369中所述的那些。在一些实施方案中，所选择的CD4+细胞群体和所选择的CD8+细胞群体可以在选择之后进行组合。在一些方面，所选择的CD4+细胞群体与所选择的CD8+细胞群体可以在容器(如袋)中组合。
在特定例子中，对PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性级分二者。然后对阴性级分进行基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中以任何顺序进行阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4+ T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法来获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+ T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+且CD45RO+。在一些实施方案中，效应子CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合至固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群体(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
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Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦(Totowa,NJ))。
在一些方面，将待分离的所孵育的细胞的样品或组合物与含有小的可磁化或磁响应材料(如磁响应粒子或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或
Figure BDA0002615298730000622
珠))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与需要分离(例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群体上存在的分子(例如，表面标记)特异性地结合。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。存在许多熟知的用于磁分离方法的磁响应材料。合适的磁粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342 B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。
孵育通常在如下条件下进行，由此附着至磁粒或磁珠的抗体或结合配偶体或者与此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果在样品内的细胞上存在)特异性结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒通过对一种或多种标记具有特异性的一抗的包衣而附接至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而不是珠，然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)包被的磁粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用的。
在一些方面，分离以如下程序实现，其中将样品置于磁场中，并且附接有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)来进行的。磁激活细胞分选(MACS)(例如CliniMACS系统)能够高纯度选择具有附着其上的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，在洗脱未附接的种类时，附接至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群体中耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于随后要进行孵育、培养和/或工程化的细胞；在一些方面，所述颗粒保持附着于用于给予患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些方面，分离和/或其他步骤是使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)来进行的，例如用于在封闭且无菌的系统中以临床规模水平自动化分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的所有部件并引导系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并且与夹紧阀一起确保缓冲液在系统中的受控流动和细胞的持续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌、无热原的溶液中提供的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁粒标记细胞后，洗涤细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。管组由预装配的无菌管路(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统将细胞样品自动施加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体未被标记并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述方法一起使用的细胞群体在去除磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨识源细胞产品的宏观层来确定最佳细胞分级终点。例如，将外周血自动分离为红细胞、白细胞和血浆层。所述CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成的细胞培育室，其实现细胞培养方案，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660，Terakura等人(2012)Blood.1:72–82，和Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，经由流式细胞术收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群体，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方案中，经由制备规模(FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群体。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；及Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355–376。在两种情况下，可以用多种标记来标记细胞，从而允许以高纯度分离明确限定的T细胞子集。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记来同时进行阳性和阴性选择。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，所述一个或多个加工步骤包括刺激分离的细胞(如选择的细胞群体)的步骤。孵育可以在基因工程化之前或与基因工程化(如由上述转导方法的实施方案产生的基因工程化)相结合。在一些实施方案中，刺激导致例如在转导之前细胞的激活和/或增殖。
在一些实施方案中，加工步骤包括孵育细胞(如选择的细胞)，其中孵育步骤可以包括细胞的培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其他容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下各项中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联，所述药剂例如是适于传递初级信号以例如启动ITAM诱导的信号(如对TCR组分具有特异性的那些)的激活的药剂(例如抗CD3)，和/或促进共刺激信号(如对T细胞共刺激受体具有特异性的共刺激信号)的药剂，例如抗CD28或抗4-1BB(例如与固体支持物(如珠)结合的)和/或一种或多种细胞因子。所述刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，
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M-450 CD3/CD28 T细胞扩增剂和/或
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珠)。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-7和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82，和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方式扩增T细胞：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以阻止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括添加非分裂EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，以任何合适的量提供LCL饲养细胞，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1。
在实施方案中，抗原特异性T细胞(如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞)是通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得。例如，可以通过从感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原生成抗原特异性T细胞系或克隆。
在一些实施方案中，在存在一种或多种刺激条件或刺激剂的情况下的孵育的至少一部分是在离心室的内腔中，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或至少约或约或10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加至细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在存在旋转的情况下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如从或从约600rpm至或至约1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，例如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF是从或从约80g至100g(例如，为或约或至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，如至少或至少约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行如下时间：在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间并包含端值。
C.基因工程化
在一些实施方案中，加工步骤包括引入编码重组蛋白的核酸分子。此类重组蛋白包括重组受体，如本文所述的。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，然后转导被激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体和人免疫缺陷病毒(HIV))将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557)。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或人免疫缺陷病毒(HIV)的逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如，T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群体摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。该第二种类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间，将细胞工程化。
在一些方面，将细胞进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改善治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用来提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改善安全性的基因，例如通过使细胞对体内阴性选择易感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开案，所述公开案描述了使用通过将显性的阳性选择标记与阴性选择标记融合而获得的双功能选择融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
在一些实施方案中，引入是通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
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和
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2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和加工仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他加工步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个加工步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独的容器(如同一袋或单独的袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个容器(例如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他加工步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个加工步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如为或约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以从或从约100g至3200g(例如，为或约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为如与旋转轴相比在空间中的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与被测量RCF的物体、物质或颗粒的距离)。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到容器(如袋，例如生物反应器袋组件)中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞，如上所述。在一些实施方案中，用于培育或扩增细胞的容器是生物反应器袋，如灌注袋。
a.用于转导的病毒载体颗粒的制备
病毒载体基因组通常以可以转染到包装细胞系或生产细胞系中的质粒形式构建。在任何此类例子中，将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸插入或定位于病毒载体的区域中，例如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801 UniversityBlvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801 University Blvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒)的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5'和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于生成自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有3'长末端重复序列(LTR)中的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来改善安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列(例如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包含增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身来防止整合，例如通过使一个或两个附接位点突变或缺失，或通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束(PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传方法；这些方法包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点二者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体也可含有如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择的标记，例如抗药性。
可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括生成病毒载体颗粒所必需的结构蛋白以及酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中之一或两者时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能生成有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并由本领域技术人员使用标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒粒子，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所述方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和/或选择的细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中待转导的细胞的浓度是从或从约1.0x105个细胞/mL至1.0x108个细胞/mL，如至少或至少约或约1.0x105个细胞/mL、5x105个细胞/mL、1x106个细胞/mL、5x106个细胞/mL、1x107个细胞/mL、5x107个细胞/mL或1x108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU)与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或约或至少或至少约每个细胞0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x106IU/mL与1x108IU/mL之间，如在或在约5x106IU/mL与5x107IU/mL之间，如至少6x106IU/mL、7x106IU/mL、8x106IU/mL、9x106IU/mL、1x107IU/mL、2x107IU/mL、3x107IU/mL、4x107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100、例如通常小于60、50、40、30、20、10、5或更小的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或一起孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，如至少或至少约30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒粒子以从或从约0.5mL至500mL的体积接触，所述体积例如为或为约0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体粒子的孵育导致或产生包含用病毒载体粒子转导的细胞的输出组合物。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育工程化细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生富集T细胞的一种或多种培育组合物。
在一些实施方案中，将工程化细胞在如下容器中培养，所述容器可以例如经由补料端口用细胞培养基和/或细胞填充以用于培养添加的细胞。细胞可以来自需要细胞培养的任何细胞来源，例如以用于细胞的扩增和/或增殖。
在一些方面，培养基是支持细胞(如T细胞)的生长、培育、扩增或增殖的适应性培养基。在一些方面，培养基可以是含有盐、氨基酸、维生素、糖或其任何组合的混合物的液体。在一些实施方案中，培养基进一步含有一种或多种刺激条件或刺激剂，例如在孵育期间刺激细胞的培育、扩增或增殖。在一些实施方案中，刺激条件是或包括选自IL-2、IL-7或IL-15的一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，在培养或孵育期间在培养基中的一种或多种细胞因子的浓度独立地是从或从约1IU/mL至1500IU/mL，例如为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。
在一些方面，在转移工程化细胞和培养基之后，将细胞孵育至少一部分时间。在一些实施方案中，刺激条件通常包括适合于初级免疫细胞如人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常至少约30摄氏度，并且通常为或约37摄氏度。在一些实施方案中，在25至38摄氏度(如30至37摄氏度，例如为或约37摄氏度±2摄氏度)的温度下孵育细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，孵育进行如下时间：大于或大于约或为约或为24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在一些实施方案中，在维持细胞培养物中目标量的二氧化碳的条件下孵育细胞。在一些方面，这确保了细胞在生长期间的最佳培育、扩增和增殖。在一些方面，二氧化碳(CO2)的量在所述气体的10％与0％(v/v)之间，如在所述气体的8％与2％(v/v)之间，例如，为或约5％(v/v)CO2的量。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行培育。在特定实施方案中，所述培育是在与系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行的。在一些实施方案中，从封闭系统移取富集的T细胞的组合物，并将其置于生物反应器中和/或与生物反应器连接以进行培育。用于培育的合适生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、FinesseSmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，生物反应器用于在培育步骤的至少一部分期间灌注和/或混合细胞。在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。
在一些实施方案中，使用与生物反应器结合使用的容器(例如袋)孵育细胞。在一些情况下，生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调整摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为或为约20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间，包含端值。在摇摆运动(例如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(例如在5RPM与15RPM之间(如6RMP或10RPM)的速度))的情况下进行至少一部分的细胞培养物扩增。在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，且具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、1.5L/min或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，培育的至少一部分是在灌注下进行，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率灌注，例如，这取决于与培育开始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度。在一些实施方案中，CD4+和CD8+细胞各自单独扩增直至它们各自达到阈值量或细胞密度。
在一些实施方案中，在静态条件下进行至少一部分的孵育。在一些实施方案中，在灌注(例如在培养期间灌注出用过的培养基并灌注入新鲜培养基)的情况下进行至少一部分的孵育。在一些实施方案中，方法包括将新鲜培养基灌注到细胞培养物中(如通过补料端口)的步骤。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基含有所述一种或多种刺激剂，例如，一种或多种重组细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基与在静态孵育期间使用的培养基相同。
在一些实施方案中，在孵育之后，将容器(例如袋)重新连接到系统以进行用于制造、生成或产生细胞疗法的一个或多个其他加工步骤的系统上，例如重新连接到含有离心室的系统上。在一些方面，将培养的细胞从袋转移到室的内腔中用于配制培养的细胞。
在一些实施方案中，用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育之前或之后配制细胞(如配制由加工步骤产生的基因工程化细胞)和/或一个或多个如所述的其他加工步骤。在一些实施方案中，一个或多个加工步骤(包括配制细胞)可以在封闭系统中进行。在一些情况下，将细胞在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)中加工可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或一个或多个如所述的其他加工步骤之前或之后配制细胞，如配制由转导加工步骤产生的基因工程化细胞。
E.组合物和配制品
在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。此类组合物可以根据过继细胞治疗方法(包括用于预防或治疗疾病、病症和障碍的方法)使用，或者在检测、诊断和预后方法中使用。
在一些情况下，用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)可以包括在培养(例如培育和扩增)之前或之后配制细胞(如配制由所提供的转导加工步骤产生的基因工程化细胞)和/或一个或多个如所述的其他加工步骤。在一些情况下，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量配制。在一些实施方案中，提供的与细胞的配制有关的方法包括在封闭系统中加工转导的细胞，如使用上述加工步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，可以将所配制的细胞转移或引入生物医学材料器皿(例如小瓶)中。
在一些实施方案中，配制由一个或多个加工步骤生成的T细胞(如CD4+和/或CD8+ T细胞)。在一些方面，多种组合物是单独地制造、产生或生成的，各自含有来自受试者的细胞的不同群体和/或亚型，如用于任选在特定时间段内单独地或独立地给予。例如，含有不同细胞群体或细胞亚型的工程化细胞的单独配制品可以分别包含CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别包含富集CD8+和CD4+的群体，例如，CD4+和/或CD8+ T细胞，其各自单独地包括经基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，将至少一种组合物与经基因工程化以表达重组受体的CD4+ T细胞一起配制。在一些实施方案中，将至少一种组合物与经基因工程化以表达重组受体的CD8+ T细胞一起配制。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞；以及给予第二组合物，所述第二组合物包含所述剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的另一者。在一些实施方案中，包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞的第一组合物是在包含另一剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的第二组合物之前给予。在一些实施方案中，给予所述剂量包括给予包含一定剂量的CD8+ T细胞和一定剂量的CD4+ T细胞两者的组合物。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，在一些方面，所述药学上可接受的缓冲液可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，加工包括将介质交换成药学上可接受的或对于给予受试者而言所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，加工步骤可以包括洗涤转导的和/或扩增的细胞以将细胞重新置于药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式(包括药学上可接受的载体或赋形剂)的例子可以是下文结合用于将细胞和组合物给予至受试者的可接受形式所描述的任何一种。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾以及各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
所述配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物是作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物)来提供，在一些方面可以将其缓冲至选择的pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，配制品缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液(如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液)的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如至少或至少约7.5％DMSO。在一些实施方案中，所述加工步骤可以涉及洗涤经转导和/或扩增的细胞以置换低温保存溶液中的细胞。
在一些实施方案中，使用一个或多个加工步骤进行配制，所述一个或多个加工步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，加工可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包含用于以给定剂量给予的细胞数量或其级分的单位剂量形式组合物。在一些实施方案中，加工步骤可以包括减小体积从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，加工步骤可以包括增加体积从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，加工包括向转导和/或扩增的细胞添加一定体积的配制品缓冲液。在一些实施方案中，配制品缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，如至少或至少约或约或50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，在容器(例如袋或离心室)中培养(如刺激、工程化和/或培育)细胞。在一些方面，容器是第一容器并且将培养的细胞从第一容器(例如袋或离心室)挤压或转移到第二容器(如生物医学材料器皿)，所述第二容器与第一容器可操作地连接。在一些实施方案中，生物医学材料器皿被配置成与用于一个或多个先前的加工步骤的第一容器(例如袋或离心室)集成和或可操作的连接和/或进行集成或可操作地连接。在一些实施方案中，生物医学材料器皿与第一容器(例如袋或离心室)在输出管线或输出位置处连接。在一些情况下，第一容器(例如袋或离心室)与生物医学材料器皿的小瓶在入口管处连接。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类加工步骤在封闭系统中进行。此类加工步骤的例子可以使用结合与细胞加工系统有关的一个或多个系统或试剂盒的离心室(如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括与
Figure BDA0002615298730000841
or Sepax
Figure BDA0002615298730000842
细胞加工系统一起使用的那些)来进行。示例性的系统和过程描述在国际公开号WO 2016/073602中。在一些实施方案中，方法包括从离心室的内腔中挤压或转移配制的组合物，所述配制的组合物是在如上所述的实施方案中在配制品缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制得到的细胞组合物。在一些实施方案中，将所配制的组合物挤压或转移到容器(如本文所述的生物医学材料器皿)，其作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个加工步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
Figure BDA0002615298730000843
和
Figure BDA0002615298730000844
2系统。
在一些实施方案中，可以将组合物从第一容器(如离心室或细胞加工系统)经由多端口输出试剂盒转移到生物医学材料器皿，所述多端口输出试剂盒含有在管线的每一端与端口相连的多向管路歧管，可以与一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)连接以挤压配制的组合物。在一些方面，可以将所需数量的或多个此类小瓶与多端口输出的一个或多个、通常两个或更多个(如至少3、4、5、6、7、8或更多个)端口无菌地连接。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至端口，或者附接至少于所有端口。因此，在一些实施方案中，系统可以实现将输出组合物挤压到生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量挤压或转移到所述多个输出容器(例如生物医学材料器皿的小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，生物医学材料器皿的小瓶可以各自含有用于以给定剂量或其级分给予的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于给予的单个单位剂量，或可以含有所需剂量的级分，使得所述多个小瓶中的多于一个(如小瓶中的两个或小瓶中的3个)一起构成用于给予的剂量。
因此，本文所述的小瓶通常含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待给予至受试者的细胞的量或数量，或者是待给予的细胞的数量的两倍(或更多)。其可以是将给予至受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个小瓶单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或者大约或基本上相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或至少或至少约1x106、2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、1.5x108、2.5x108、3x108、4.5x108、5x108、9x108或1.2x109个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的所配制的细胞组合物的体积是为或约10mL至为或约100mL，如为或约或至少或至少约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，容器(例如袋或小瓶)中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，可以将小瓶储存在液氮中直至进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
III.重组蛋白
在一些实施方案中，通过本文提供的方法(例如，在章节I中所述的方法)处理、加工、工程化和/或产生的细胞含有或表达、或经工程化以含有或表达重组蛋白(如重组受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))。在某些实施方案中，本文提供的方法产生和/或能够产生经工程化以表达或含有重组蛋白的细胞或含有和/或富集所述细胞的群体或组合物。在一些实施方案中，处理、加工、工程化和/或产生T细胞或T细胞的群体或组合物。
在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先如通过将细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量)的刺激物组合来刺激细胞，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
受体包括抗原受体以及含有其一种或多种组分的受体。重组受体可以包括嵌合受体(如含有配体结合结构域或其结合片段和细胞内信号传导结构域或区域的那些)、功能性非TCR抗原受体、嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)(如重组或转基因TCR)、嵌合自身抗体受体(CAAR)及任何前述的组分。重组受体(如CAR)通常包括(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)与一种或多种细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。
1.嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，描述了工程化细胞(如T细胞)，其表达对特定抗原(或标记或配体)具有特异性的CAR，所述特定抗原是例如在特定细胞类型的表面上表达的抗原。在一些实施方案中，所述抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在特定实施方案中，重组受体(如嵌合受体)含有细胞内信号传导区域，所述细胞内信号传导区域包括细胞质信号传导结构域或区域(也可互换地称为细胞内信号传导结构域或区域)，例如能够在T细胞中诱导初级激活信号的细胞质(细胞内)区域，例如，T细胞受体(TCR)组分的细胞质信号传导结构域或区域(例如，CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链或其功能变体或信号传导部分的细胞质信号传导结构域或区域)；和/或所述细胞内信号传导区域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在一些实施方案中，嵌合受体还含有与配体(例如抗原)抗原特异性结合的细胞外配体结合结构域。在一些实施方案中，嵌合受体是CAR，其含有与抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述配体(如抗原)是在细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，所述肽抗原与TCR一样，在主要组织相容性复合物(MHC)分子的情况下在细胞表面上被识别。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，CAR被构建为具有对特定抗原(或标记或配体)的特异性，所述特定抗原是例如在过继疗法靶向的特定细胞类型中表达的抗原(例如，癌症标记)和/或旨在诱导衰减反应的抗原(如在正常或未患病细胞类型上表达的抗原)。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或者一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性地结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联双scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能抗体片段，在本文也称为“抗原结合片段”。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在一些情况下是已知的，是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。
下文表1列出分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。
表1.根据不同编号方案的CDR边界.
Figure BDA0002615298730000901
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州
2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定,否则给定抗体或其区域如其可变区的“CDR”或“互补决定区”或个别规定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)应理解为涵盖如通过前述任何方案或其他已知方案定义的一个(或特定)互补决定区。例如，在声明特定CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL区氨基酸序列中相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这个CDR具有可变区内相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如通过前述任何方案或其他已知方案所定义。在一些实施方案中，规定特定CDR序列。使用不同编号方案描述抗体的示例性CDR序列，但是应理解，抗体可以包含如根据前述任何其他编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案描述的CDR。
同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情况下，规定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给定CDR或FR的具体氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
CAR中所包括的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，CAR中的抗原结合结构域是或包含抗体片段，所述抗体片段含有可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。
抗体片段可以通过多种技术来制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的那些)，和/或可能并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体，其中全部或基本上全部CDR氨基酸残基源自非人CDR并且全部或基本上全部FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有展现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以模拟或接近通过天然抗原受体(如TCR)的信号，以及任选通过与共刺激受体组合的这种受体的信号。
在一些实施方案中，重组受体(如嵌合受体(例如CAR))包括与抗原(或配体)结合(如特异性地结合)的配体结合结构域。嵌合受体靶向的抗原包括在经由过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的背景下表达的那些抗原。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫系统癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，抗原(或配体)是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原(或配体)在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，CAR含有特异性识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)的抗体或抗原结合片段(例如，scFv)。
在一些实施方案中，所述抗原(或配体)是肿瘤抗原或癌症标记。在一些实施方案中，所述抗原(或配体)抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如多种已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，CAR是对BCMA(例如人BCMA)具有特异性的抗BCMA CAR。先前已经描述含有抗BCMA抗体(包括小鼠抗人BCMA抗体和人抗人抗体)的嵌合抗原受体，以及表达此类嵌合受体的细胞。参见Carpenter等人,Clin Cancer Res.,2013,19(8):2048-2060、WO2016/090320、WO 2016/090327、WO 2010104949A2和WO 2017173256。在一些实施方案中，抗BCMA CAR包含抗原结合结构域(如scFv)，所述抗原结合结构域含有源自WO 2016/090320或WO 2016090327中所述的抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:30所示的VH和SEQ ID NO:31所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:32所示的VH和SEQ ID NO:33所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:34所示的VH和SEQ ID NO:35所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:27所示的VH和SEQID NO:28所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:41所示的VH和SEQ ID NO:42所示的VL。在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ IDNO:43中所示的VH和SEQ ID NO:44中所示的VL。
在一些实施方案中，抗原结合结构域(如scFv)含有SEQ ID NO:45中所示的VH和SEQ ID NO:46中所示的VL。在一些实施方案中，VH或VL的氨基酸序列展现出与任何前述VH或VL序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，并且保留与BCMA的结合。在一些实施方案中，VH区位于VL区的氨基末端。在一些实施方案中，VH区位于VL区的羧基末端。
在一些实施方案中，CAR是对CD19(例如人CD19)具有特异性的抗CD19CAR。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US2016/0152723中所述。
在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:50、51中所示的CDR-H1和CDR-H2及SEQ ID NO:52或66中所示的CDR-H3，以及SEQ ID NO:47中所示的CDR-L1和SEQ ID NO:48或67中所示的CDR-L2和SEQ ID NO:49或68中所示的CDR-L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，svFv包含含有SEQ ID NO:47的CDR-L1序列、SEQ ID NO:48的CDR-L2序列和SEQ ID NO:49的CDR-L3序列的可变轻链，和/或含有SEQ ID NO:50的CDR-H1序列、SEQ ID NO:51的CDR-H2序列和SEQ ID NO:52的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:53中所示的可变重链区和SEQ ID NO:54中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:70中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:69至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:55至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:59-61中所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，及分别在SEQ ID NO:56-58中所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:56的CDR-L1序列、SEQ ID NO:57的CDR-L2序列和SEQ ID NO:58的CDR-L3序列的可变轻链，和/或含有SEQ ID NO:59的CDR-H1序列、SEQ ID NO:60的CDR-H2序列和SEQ ID NO:61的CDR-H3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:62中所示的可变重链区和SEQ ID NO:63中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQID NO:64中所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:65展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD20的抗体或抗体片段是作为或源自利妥昔单抗的抗体，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，所述抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD22的抗体或抗体片段是作为或源自m971的抗体，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中所示的抗体或抗体片段的VH和VL。
在一些实施方案中，抗体是抗原结合片段(如scFv)，其包含连接两个抗体结构域或区域的一个或多个接头，所述抗体结构域或区域是例如重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。接头通常是肽接头，例如柔性和/或可溶性肽接头。接头包括富含甘氨酸和丝氨酸的那些和/或在一些情况下富含苏氨酸的那些。在一些实施方案中，接头还包含可以改善溶解度的带电荷的残基(如赖氨酸和/或谷氨酸)。在一些实施方案中，接头还包含一个或多个脯氨酸。在一些方面，富含甘氨酸和丝氨酸(和/或苏氨酸)的接头包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一种或多种此类氨基酸。在一些实施方案中，所述接头包含至少或至少约50％、55％、60％、70％或75％的甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。在一些实施方案中，接头基本上完全由甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸构成。接头的长度通常在约5个与约50个氨基酸之间，通常在为或约10个与为或约30个之间，例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个，并且在一些例子中长度在10个与25个氨基酸之间。示例性接头包括具有各种数量的序列GGGGS(4GS；SEQ ID NO:36)或GGGS(3GS；SEQ ID NO:37)的重复的接头，例如在这样的序列的2个、3个、4个和5个重复之间。示例性接头包括具有如下序列或由如下序列组成的那些：SEQ ID NO:38(GGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO:39(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)或SEQ ID NO:40(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)中所示的序列。
在一些实施方案中，所述抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如特异性识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)的抗体或抗原结合片段(例如scFv)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有展现出针对肽-MHC复合物的TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈递具有T细胞上的抗原受体(如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，具有跨膜α链(在一些情况下具有三个α结构域)和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两个跨膜糖蛋白α和β构成，这两者通常跨膜。MHC分子可以包含MHC的有效部分，所述有效部分含有用于结合肽的一个或多个抗原结合位点以及由适当的抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(如通常是CD8+ T细胞，但是在一些情况下是CD4+ T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中所述肽通常由CD4+ T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也可以称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物是在细胞表面上存在或展示。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以由抗原受体(如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC II类复合物中的识别，肽的长度为从或从约9至22个氨基酸。在一些实施方案中，对于MHC I类复合物中的识别，肽的长度为从或从约8至13个氨基酸。在一些实施方案中，在识别MHC分子(例如MHC-肽复合物)情况下的肽后，抗原受体(如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，从而诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他反应。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US 20090226474；US 20090304679；和国际PCT公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够与MHC结合的抗原的表位，所述抗原是例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原以用于引发免疫反应，其中免疫原保持其三维形式持续足以引发针对所述肽在MHC分子的结合沟中的三维呈现的免疫反应的时间段。然后测定从宿主中收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目的肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所需抗体。
在一些实施方案中，与MHC-肽复合物特异性结合的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以生成突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如美国公开申请号US 20020150914、US 2014/0294841；及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
因此，在一些实施方案中，嵌合抗原受体(包括TCR样CAR)包含含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
在一些实施方案中，重组受体(如CAR，如其抗体部分)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞应答性。
在一些例子中，间隔子的长度是为或约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153，Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125–135或国际专利申请公开号WO2014031687、美国专利号8,822,647或公开的申请号US 2014/0271635。在一些实施方案中，间隔子包括免疫球蛋白铰链区、CH2区和CH3区的序列。在一些实施方案中，铰链、CH2和CH3中的一个或多个全部或部分源自IgG4或IgG2。在一些情况下，铰链、CH2和CH3源自IgG4。在一些方面，铰链、CH2和CH3中的一个或多个是嵌合的并且含有源自IgG4和IgG2的序列。在一些例子中，间隔子含有IgG4/2嵌合铰链、IgG2/4CH2区、和IgG4 CH3区。
在一些实施方案中，间隔子可以全部或部分源自IgG4和/或IgG2，并且可以含有突变，例如在一个或多个结构域中的一个或多个单氨基酸突变。在一些例子中，氨基酸修饰是在IgG4的铰链区中脯氨酸(P)对丝氨酸(S)的取代。在一些实施方案中，氨基酸修饰是用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)以降低糖基化异质性，如在全长IgG4 Fc序列的CH2区中的位置177处的N177Q突变，或者在全长IgG4 Fc序列的CH2区中的位置176处的N176Q。
在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:1所示的序列，并且由SEQ ID NO:2所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:4所示的序列。在一些实施方案中，编码的间隔子是或含有SEQID NO:29所示的序列。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4、5或29中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
抗原识别结构域通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)模拟激活和/或通过另一种细胞表面受体模拟信号的信号传导组分)连接。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导区域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，所述结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域进行连接。
细胞内信号传导区域包括通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，ROR1结合抗体与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)进一步包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区域激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区域的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号的话)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域(例如，包含一个或多个细胞内结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，在CAR中还包含用于产生次级或共刺激信号的组分。在其他实施方案中，CAR不包含用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，在同一细胞中表达另一CAR，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)以及以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分之一或两者。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ或FcRβ的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导区域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR包括信号传导区域和共刺激组分两者。
在一些实施方案中，信号传导区域包括于一种CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。
在某些实施方案中，细胞内信号传导区域包含与CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在胞质部分中涵盖一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些情况下，CAR称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括设置在细胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域，或者是包含SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:8至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，含有重组受体的部分的跨膜结构域包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:10或11至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，例如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的细胞质结构域或其功能变体或部分，例如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:12至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列或展现与SEQID NO:13、14或15至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，例如仅IgG4或IgG1的铰链，例如SEQ IDNO:1中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
2.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，工程化细胞(如T细胞)是如下那些：其表达识别靶多肽(如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施例中，“T细胞受体”或“TCR”是如下分子，该分子含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)或其抗原结合部分，并且能够特异性结合与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是小于全长TCR但是与MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合的抗原结合部分。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与对肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，它们通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经加工肽部分的相互作用最重要。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选γ和δ)的异二聚体，或者TCR可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)生成，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是可容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内或从所述一种或多种给定细胞分离的TCR编码核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过合成公众可获得的TCR DNA序列来获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式生成。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR生成的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来生成，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，TCR文库可以从CD4+或CD8+细胞生成。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，scTv文库可以从幼稚Vα和Vβ文库组装，其中经扩增的产物被克隆或组装以通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化生成。在一些方面，使TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对抗原的特定亲和力或亲合力来选择。
在一些实施方案中，所述基因工程化抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定、分离针对靶抗原(例如，癌症抗原)的高亲和力T细胞克隆，并将其引入细胞中。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中生成针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)NatBiotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经被修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来生成具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法实现，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad SciU S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作产生诱变TCR的模板，其中在CDR的一个或多个残基中发生突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原的较高亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此表示用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237 2001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，TCR在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合；和第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，在天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键二者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法生成scTCR。参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选接头序列(将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接该第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长而阻断或降低scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，接头可以含有从或从约10至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:22)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，所述共价二硫键将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键二者。
在dTCR或scTCR含有引入的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于公开的国际PCT号WO 2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现出对靶抗原的亲和力，其平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方式扩增，并且将其克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术来制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对待引入载体的宿主的类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性，酌情并考虑载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，所述启动子与编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，该启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑其他已知的启动子。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因通过小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，TCR的遗传转移是通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子完成(参见例如Baum等人(2006)Molecular Therapy:The Journal of the AmericanSociety of Gene Therapy.13:1050-1063；Frecha等人(2010)Molecular Therapy:TheJournal of the American Society of Gene Therapy.18:1748-1757；和Hackett等人(2010)Molecular Therapy:The Journal of the American Society of GeneTherapy.18:674-683。
在一些实施方案中，为了生成编码TCR的载体，将α和β链从表达目的TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并且将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所生成的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
3.嵌合自身抗体受体(CAAR)
在一些实施方案中，重组受体是嵌合自身抗体受体(CAAR)。在一些实施方案中，CAAR对自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞(如工程化以表达CAAR的T细胞)可以用于特异性地结合并杀伤表达自身抗体的细胞，但不杀伤表达正常抗体的细胞。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于治疗与自身抗原的表达相关的自身免疫性疾病，如自身免疫性疾病。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以靶向最终产生自身抗体并在其细胞表面上展示自身抗体的B细胞，将这些B细胞标记为用于治疗干预的疾病特异性靶标。在一些实施方案中，表达CAAR的细胞可以用于通过使用抗原特异性嵌合自身抗体受体靶向引起疾病的B细胞，有效靶向和杀死自身免疫性疾病中的致病性B细胞。在一些实施方案中，所述重组受体是CAAR，如美国专利申请公开号US 2017/0051035中所述的任何一种。
在一些实施方案中，CAAR包含自身抗体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含次级或共刺激信号传导区域(次级细胞内信号传导区域)。
在一些实施方案中，自身抗体结合结构域包含自身抗原或其片段。自身抗原的选择可以取决于所靶向的自身抗体的类型。例如，可以因为自身抗原识别与特定疾病状态(例如自身免疫性疾病，如自身抗体介导的自身免疫性疾病)相关的靶细胞(如B细胞)上的自身抗体而选择所述自身抗原。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括寻常型天疱疮(PV)。示例性自身抗原包括桥粒芯糖蛋白1(Dsg1)和Dsg3。
4.多靶向
在一些实施方案中，所述细胞和方法包括多靶向策略，如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体，每种受体识别相同或不同的抗原，并且通常各自包括不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO2014055668 A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine，5(215)(2013年12月)(描述表达激活和抑制性CAR的细胞，例如其中激活CAR结合至同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合至仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些细胞)。
例如，在一些实施方案中，细胞包括表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其通常在与由第一受体识别的抗原(例如，第一抗原)特异性地结合后能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，细胞还包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在与由第二受体识别的第二抗原特异性地结合后能够诱导共刺激信号至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活或刺激信号至所述细胞。在一些实施方案中，所述受体包含含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，导致启动免疫应答(例如ITAM磷酸化)和/或启动ITAM介导的信号转导级联、形成免疫突触和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、激活一种或多种转录因子(例如NF-κB和/或AP-1)、和/或诱导因子(例如细胞因子)的基因表达、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体的细胞内信号传导结构域，所述共刺激受体例如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区域，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包含含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域两者。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活或刺激信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答例如为稳健且持续的免疫应答，例如增加的基因表达，细胞因子和其他因子的分泌，以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，单独第一受体的连接和单独第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一种受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接所述多种受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需反应，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或实施免疫效应子功能(如对靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导反应，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导抑制或减弱该反应的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方案中，所述表达重组受体的细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013))，如识别除了与疾病或病症相关和/或对所述疾病或病症具特异性的抗原以外的抗原的CAR，由此通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制性信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导反应，而第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该反应的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。在其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但是也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体与在正常细胞而不是疾病或病症的细胞上表达的单独抗原结合的情况下，这种策略可以用于例如降低脱靶效应的可能性。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包含减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这样的抑制性分子的信号传导结构域或源自这样的抑制性分子的信号传导结构域，使得其起到减弱细胞的应答(例如，由激活和/或共刺激性CAR诱导的应答)的作用。
在一些实施方案中，多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，通过需要连接两种分开且单独特异性的抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，所述多种抗原(例如，第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或者疾病或病症上(如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，所述多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(如正常或未患病细胞或组织)和/或工程化细胞本身上表达。在此类实施方案中，通过需要连接多种受体以实现细胞的反应，实现特异性和/或功效。
B.用于基因工程化的核酸、载体及方法
所述重组蛋白(如重组受体)是由一种或多种核酸或多核苷酸(包括载体或构建体中含有的一种或多种核酸或多核苷酸)编码的。在一些实施方案中，例如使用其中在存在所提供的无血清培养基的情况下进行一个或多个步骤的方法将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。
在一些情况下，编码重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，信号序列可以编码异源或非天然信号肽，例如SEQ ID NO:25中所示并且由SEQ ID NO:24中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:25中所示并且由SEQ ID NO:24中所示的核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:26中所示的CD8α信号肽。
在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作连接以控制重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制重组受体的表达。
在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。
在一些实施方案中，例如在多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码每条不同多肽链的编码序列可以与启动子可操作地连接，所述启动子可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如，2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，所述多肽在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被加工成单独的蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与相邻下游的下一个肽之间隔开(参见，例如，de Felipe,Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。各种2A元件是已知的。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。
本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记的核酸的下游。
在一些实施方案中，载体骨架含有编码一种或多种标记的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记是转导标记、替代标记和/或选择标记。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。可以将转导标记或替代标记用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是制备以在细胞表面上与重组受体(例如CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这样的替代标记是已经被修饰以具有极少活性或无活性的表面蛋白。在某些实施方案中，替代标记由编码重组受体的同一多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还允许促进细胞自杀。
示例性替代标记可以包括细胞表面多肽的截短形式，如如下截短形式，其是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常由细胞表面多肽的全长形式转导的信号，和/或不内化或不能内化。示例性截短的细胞表面多肽包括生长因子或其他受体的截短形式，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(EGFRt，SEQ ID NO:7或16中所示的示例性EGFRt序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。EGFRt可以含有由抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002615298730001191
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经用EGFRt构建体和重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR))工程化细胞，和/或用于消除或分离表达受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430–434。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选接头序列可以是如PCT公开号WO 2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP)、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其经修饰形式。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，要表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如，T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使遗传修饰的细胞群体摆脱初始刺激物(例如，抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原性刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间，将细胞工程化。
另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改善治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用来提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改善安全性的基因，例如通过使细胞对体内阴性选择易感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开案，所述公开案描述了使用通过将显性的阳性选择标记与阴性选择标记融合而获得的双功能选择融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177,第14-17栏。
IV.治疗方法
在一些实施方案中，含有基因工程化细胞(如在存在如本文所提供的无血清培养基的情况下制造或产生的那些)的一种或多种组合物是作为细胞疗法(例如过继细胞疗法)来给予。所述工程化细胞可用于多种治疗、诊断和预防适应症。例如，所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物可用于治疗受试者的多种疾病和障碍。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如涉及向患有疾病、病症或障碍(如肿瘤或癌症)的受试者给予所述工程化细胞或含有所述工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物是以实现所述疾病或障碍的治疗的有效量来给予。用途包括所述工程化细胞或组合物在此类方法和治疗中以及在制备药物以进行此类治疗方法中的用途在一些实施方案中，所述方法是通过向患有或怀疑患有所述疾病或病症的受试者给予所述工程化细胞或包含所述工程化细胞的组合物来进行的。在一些实施方案中，所述方法由此治疗所述受试者的所述疾病或病症或障碍。
用于过继细胞疗法的细胞的给予方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。例如，过继T细胞治疗方法描述于例如Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Rosenberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev ClinOncol.8(10):577-85)。参见，例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338。所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化相关的疾病或病症(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病、或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下各项的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。
在一些实施方案中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与所述疾病或障碍相关的抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如多种已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，疾病或病症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一些方面，疾病或病症是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些情况下，疾病或病症是NHL(例如或包括作为侵袭性NHL的NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如多种已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30，或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(CS1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR，β2-微球蛋白、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和Byrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow Research(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴样肿瘤、骨髓瘤、与AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的那些抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US 20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006099875、WO 2009080829或WO2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，所述抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中所述细胞是从要接受所述细胞疗法的受试者或者从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和加工后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者(例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上相同。在一些实施方案中，所述第一和第二受试者在遗传上相似。在一些实施方案中，所述第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
所述细胞可以通过任何合适的方式给予，例如通过推注输注，通过注射(例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、眼球后注射、眼球周注射或后近巩膜(posteriorjuxtascleral)递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内给予。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是例如在不超过3天的时间段内通过所述细胞的多次推注给予来给予，或通过所述细胞的连续输注给予来给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的给予是通过门诊递送进行的。
为了预防或治疗疾病，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、细胞是否针对预防或治疗目的而被给予、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的应答以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗给予受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。所述细胞在一些实施方案中是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，两者的时间足够接近，使得细胞群体增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述给予之前给予化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)例如以减小肿瘤负荷。
用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者在一些方面可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在起始细胞疗法之前将预调理剂给予至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在起始细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者给予预调理剂。在一些实施方案中，在起始细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者给予预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天一次给予环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或250mg/m2与350mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予环磷酰胺。在一些情形中，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间(包含端值)的剂量向受试者给予氟达拉滨。在一些情形中，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单一剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂组合，如环磷酰胺与氟达拉滨的组合。因此，药剂组合可以包含任何剂量或给予时间表(如上文所述的那些)的环磷酰胺，以及任何剂量或给予时间表(如上文所述的那些)的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在给予细胞后，工程化细胞群体的生物学活性在一些实施方案中是例如通过许多已知方法中的任一种来测量。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其是在体内例如通过成像评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)。在一些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(例如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面,所述生物活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减小)来测量。
在某些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防功效。例如，可以将所述群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践是已知的。参见，例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 11(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。所述细胞在一些实施方案中是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，两者的时间足够接近，使得细胞群体增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的药剂包括细胞因子(如IL-2)例如以增强持久性。
A.给药
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞给予受试者。在一些实施方案中，所述剂量的大小或时间安排是根据所述受试者的特定疾病或病症来确定。在一些情况下，鉴于所提供的描述，针对特定疾病的所述剂量的大小或时间安排可以凭经验来确定。
在一些实施方案中，细胞剂量包含在为或约2x105个细胞/kg与为或约2x106个细胞/kg之间，如在为或约4x105个细胞/kg与为或约1x106个细胞/kg之间或在为或约6x105个细胞/kg与为或约8x105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含不超过2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x105个细胞/kg、不超过或不超过约4x105个细胞/kg、不超过或不超过约5x105个细胞/kg、不超过或不超过约6x105个细胞/kg、不超过或不超过约7x105个细胞/kg、不超过或不超过约8x105个细胞/kg、不超过或不超过约9x105个细胞/kg、不超过或不超过约1x106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含至少或至少约或为或约2x105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约3x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约4x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约5x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约6x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约7x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约8x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约9x105个细胞/kg、至少或至少约或为或约1x106个细胞/kg、或至少或至少约或为或约2x106个细胞/kg。
在某些实施方案中，向受试者给予为或约10万至为或约1000亿个细胞和/或每公斤受试者体重该细胞量的范围的细胞或单独细胞亚型群体，如例如为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指重组受体表达细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指给予的T细胞或PBMC或总细胞的数量。
例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，则剂量包含少于约5x108个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在为或约1x106至为或约5x108个此类细胞的范围内，如为或约2x106、5x106、1x107、5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，则剂量包含多于或多于约1x106个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)且少于或少于约2x109个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在以下范围内：为或约2.5x107至为或约1.2x109个此类细胞，如为或约2.5x107、5x107、1x108、1.5x108、8x108或1.2x109个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约1x105至为或约5x108个总CAR(CAR+)表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x105至为或约1x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约1x106至为或约2.5x106个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x106至为或约5x106个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x106至为或约1x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约1x107至为或约2.5x107个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x107至为或约5x107个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞、从为或约1x108至为或约2.5x108个总CAR表达T细胞、从为或约2.5x108至为或约5x108个总CAR表达T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含从为或约2.5x107至为或约1.5x108个总CAR表达T细胞，如从为或约5x107至为或约1x108个总CAR表达T细胞。
在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x105个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x105个CAR表达细胞、至少或至少约5x105个CAR表达细胞、至少或至少约1x106个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x106个CAR表达细胞、至少或至少约5x106个CAR表达细胞、至少或至少约1x107个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x107个CAR表达细胞、至少或至少约5x107个CAR表达细胞、至少或至少约1x108个CAR表达细胞、至少或至少约1.5x108个CAR表达细胞、至少或至少约2.5x108个CAR表达细胞或至少或至少约5x108个CAR表达细胞。
在一些实施方案中，所述细胞疗法包括给予包含如下数量的细胞的剂量：从或从约1x105至或至约5x108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x105至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，或从或从约1x106至或至约1x107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含如下数量的细胞：至少或至少约1x105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少约1x106、至少或至少约1x107、至少或至少约1x108个此类细胞。在一些实施方案中，所述数量是关于CD3+或CD8+(在一些情况下也是关于重组受体(例如CAR+)表达细胞)的总数量。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括给予包含如下数量的细胞的剂量：从或从约1x105至或至约5x108个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x105至或至约1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个CD3+或CD8+总T细胞或CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述细胞疗法包括给予包含如下数量的细胞的剂量：从或从约1x105至或至约5x108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x105至或至约1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或从或从约1x106至或至约1x107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，剂量的T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或CD4+和CD8+ T细胞。
例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，则所述剂量的CD8+ T细胞(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x106与为或约5x108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如在以下范围内：从为或约5x106至为或约1x108个此类细胞，如1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108或5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者给予多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予从或从约1x107至或至约0.75x108个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约5x107个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约1x107至或至约0.25x108个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予为或约1x107、2.5x107、5x107、7.5x107、1x108、1.5x108、2.5x108或5x108个总重组受体表达CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的所述剂量作为单一剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在过继细胞疗法的情况下，给予给定“剂量”涵盖给予作为单一组合物和/或单次不间断给予(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)给予在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是在单一时间点给予或起始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段内以多次注射或输注(如每天一次，持续三天或两天)来给予，或者是在一天的时间段中通过多次输注来给予。
因此，在一些方面，所述细胞剂量以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物给予。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指被分割使得在多于一天中给予的剂量。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单一剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量给予，例如随时间给予的分割剂量。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以在2天内或在3天内给予所述受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予所述剂量的10％，在第二天给予所述剂量的30％，并且在第三天给予所述剂量的60％。在一些实施方案中，分割剂量持续不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多种组合物或溶液(如第一和第二，任选地更多)来给予，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，单独地或独立地给予各自含有不同的细胞群体和/或细胞亚型的多种组合物。例如，细胞群体或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+ T细胞，和/或分别包含富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+ T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+ T细胞或一定剂量的CD4+ T细胞；以及给予第二组合物，所述第二组合物包含所述剂量的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中的另一者。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的给予(例如，所述多种细胞组合物的给予)涉及分开给予所述细胞组合物。在一些方面，所述单独给予是同时或以任何顺序依序进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且第一组合物和第二组合物的给予相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的给予的开始和第二组合物的给予的开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的给予的开始和/或完成和第二组合物的给予的完成和/或开始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD4+T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如，所述剂量的第一组合物)包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予的。
在一些实施方案中，细胞的剂量或组合物包括表达重组受体的CD4+细胞与表达重组受体的CD8+细胞和/或CD4+细胞与CD8+细胞的定义的或目标比率，所述比率任选地为约1:1，或者在大约1:3与大约3:1之间，例如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群体(例如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1:1)的组合物或剂量的给予涉及给予含有一个所述群体的细胞组合物，和随后给予包含另一所述群体的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以目标或所需比率来进行。在一些方面，以限定比率给予细胞的剂量或组合物导致改善的T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，将两个剂量给予受试者。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天给予的。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量给予受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小是基于一个或多个标准来确定，所述标准如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的范围或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或宿主针对所给予细胞和/或重组受体的免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的给予与连续剂量的给予之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是在给予第一剂量后大于约14天且在给予第一剂量后小于约28天的时间点进行。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给予所述另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)给予所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不给予剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中之一或两者包括给予T细胞的分割剂量。
在一些实施方案中，所述细胞剂量通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，所述细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，所述细胞剂量基于单独群体中的细胞或单独细胞类型的细胞的所需总数(或每kg体重的细胞数量)。在一些实施方案中，所述剂量基于此类特征的组合，此类特征是例如所需的总细胞数、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，以所需剂量的总细胞(如所需剂量的T细胞)的耐受差异或在所述耐受差异之内给予细胞的群体或亚型如CD8+和CD4+ T细胞。在一些方面，所需剂量是所需细胞数量或被给予细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数量(例如细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数量或每单位体重的最小细胞数量。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如在这种比率的一定耐受差异或误差内。
在一些实施方案中，细胞以所需剂量的一种或多种单独细胞群体或亚型的耐受差异或在所述耐受差异之内给予，如所需剂量的CD4+细胞和/或所需剂量的CD8+细胞。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数量或所需的被给予所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数量(例如细胞/kg)。在一些方面，所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数量或每单位体重的群体或亚型的最小细胞数量。
因此，在一些实施方案中，所述剂量基于所需的总细胞的固定剂量和所需比率，和/或基于所需的一种或多种单独亚型或亚群(例如，各自)的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于所需的CD4+和/或CD8+细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，细胞在多种细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的所需输出比率的耐受范围下或耐受范围内给予。在一些方面，所需比率可以是特定比率或者可以是比率的范围。例如，在一些实施方案中，所需比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在为或约5:1与为或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在为或约1:3与为或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在为或约2:1与为或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，所述耐受差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指所给予的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，所述剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者更低，如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的给予：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
V.制品和试剂盒
本文还提供了制品，其含有无血清培养基、基础培养基或补充剂(如本文所述的那些)的组合物及任选地用于制备或使用所述组合物的说明书。所述制品可以包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。在一些实施方案中，容器容纳组合物，所述组合物自身或与另一种组合物组合地有效治疗、预防和/或诊断病症。在一些实施方案中，容器具有无菌接入端口。示例性容器包括静脉内溶液袋、小瓶(包括具有可被注射用针刺穿的塞子的那些)或用于口服给予药剂的瓶子或小瓶。标签或包装说明书可以指示组合物用于治疗疾病或病症。
在一些实施方案中，所述制品包括(a)第一容器，其含有如本文所提供的基础培养基，如含有在基础培养基中的二肽形式的L-谷氨酰胺；和(b)第二容器，其含有如本文所提供的补充剂，如含有游离形式的谷氨酰胺(例如L-谷氨酰胺)的第一补充剂。在一些实施方案中，所述制品还包括第三容器，其含有一种或多种另外的补充剂。
在一些实施方案中，所述制品包括(a)一个或多个容器，其中含有组合物，如本文所述的这些(例如，无血清培养基或用于制备各自包装在单独容器中的无血清培养基的每种组分，如基础培养基和一种或多种补充剂，例如至少第一补充剂和一种或多种其他或第二补充剂)；和(b)其他容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含有待培育和/或制备的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞或富集的免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞或富含T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD4+ T细胞或富集的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD8+ T细胞或富集的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含有待基因工程化或正在被基因工程化的细胞。在一些实施方案中，所述细胞包含有待基因工程化或正在被基因工程化的富集的细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞包含基因工程化的T细胞或富集的基因工程化的T细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞包含嵌合抗原受体(CAR)表达T细胞或富集的CAR表达T细胞。在一些实施方案中，所述细胞先前已被低温保存。在一些实施方案中，所述细胞已在无血清培养基中培养并且在培养之后低温保存。
在一些实施方案中，所述制品包括(a)第一容器，其中含有组合物，如本文所述的这些(例如，无血清培养基或用于制备各自包装在单独容器中的无血清培养基的每种组分，如基础培养基和一种或多种补充剂，例如至少第一补充剂和一种或多种其他或第二补充剂)；(b)第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含有待培育和/或制备的细胞；(c)包含基因(例如，编码重组蛋白的基因)的载体。在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述基因编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含与肿瘤细胞特异性结合的抗原结合结构域。
VI.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物。例如，“一种/一个”(“a”)或“一种/一个”(“an”)意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“本质上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，呈范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述的范围包括所述限值中之一或两者时，不包括那些所包括限值中的任一者或两者的范围也被包括在所要求保护的主题之内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文提及“约”某一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，叙述核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置(例如序列表中所述)是指，在使用标准比对算法(例如GAP算法)与所公开序列比对以使同一性最大化之后，所鉴定的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同的氨基酸残基作为指导，鉴定相应的残基。一般来说，为了鉴定对应位置，将氨基酸序列比对以使得获得最高阶匹配(参见例如：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton Press,纽约,1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所述载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
如本文所用，细胞或细胞群体针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下可通过流式细胞术检测，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术所检测的表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色在如下水平下通过流式细胞术没有被检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比基本上相似。
如本文所用，在关于氨基酸序列(参考多肽序列)使用时，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同一性百分比”定义为，在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视作序列同一性的一部分之后，候选序列(例如，主题抗体或片段)中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域熟知的多种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可以包括用另一种氨基酸替代多肽中的一个氨基酸。所述取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。可以将氨基酸取代引入目的结合分子(例如抗体)、和针对所希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选的产物中。
通常可以根据以下常见的侧链特性将氨基酸进行分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
在一些实施方案中，保守取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为同一类别的另一个成员。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代可能涉及将这些类别之一的成员交换为另一个类别。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
VII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种无血清培养基，其包含：
在基础培养基中的0.5mM至5mM二肽形式的L-谷氨酰胺；
0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；和
至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。
2.根据实施方案1所述的无血清培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的无血清培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质是人蛋白。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质是重组的。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，任选地其中所述白蛋白是人血清白蛋白或重组人白蛋白，且任选地其中在所述培养基中的白蛋白的浓度为约2.5mg/mL至7.5mg/mL。
14.根据实施方案13所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的白蛋白的浓度为约5mg/mL。
15.根据实施方案12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，任选地其中所述转铁蛋白是人或重组人白蛋白，且任选地其中在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约50mg/L至200mg/L。
16.根据实施方案15所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约100mg/L。
17.根据实施方案12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人或重组人胰岛素，且任选地其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。
18.根据实施方案17所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约10mg/L。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的无血清培养基，其中所述基础培养基包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基或M199。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的无血清培养基，其中所述基础培养基和/或所述无血清培养基不包含酚红。
22.根据实施方案1-22中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含一种或多种细胞因子。
24.根据实施方案23所述的无血清培养基，其中所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。
25.根据实施方案1-22中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基支持细胞的扩增。
26.根据实施方案25所述的无血清培养基，其中细胞是原代免疫细胞。
27.根据实施方案25或实施方案26所述的无血清培养基，其中细胞是或包含T细胞。
28.根据实施方案27所述的无血清培养基，其中所述T细胞包含CD4+或CD8+ T细胞。
29.一种基础培养基，其包含二肽形式的L-谷氨酰胺，其中所述基础培养基不含L-谷氨酰胺和蛋白质。
30.根据实施方案29所述的基础培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
31.根据实施方案29或实施方案30所述的基础培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
32.根据实施方案29-31中任一项所述的基础培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
33.根据实施方案29-32中任一项所述的基础培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
34.根据实施方案29-33中任一项所述的基础培养基，其中所述基础培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
35.根据实施方案29-34中任一项所述的基础培养基，其包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基或M199。
36.根据实施方案29-35中任一项所述的基础培养基，其中所述基础培养基不包含酚红。
37.根据实施方案29-36中任一项所述的基础培养基，其中所述蛋白质是人源蛋白或重组蛋白或这两者。
38.根据实施方案29-37中任一项所述的基础培养基，其为液体。
39.一种补充剂，其包含至少一种蛋白质和L-谷氨酰胺，其中与所述补充剂组合的基础细胞培养基能够支持细胞的扩增。
40.根据实施方案39所述的补充剂，其中所述补充剂在使用前被冷冻或冷冻储存，任选地在从或从约-10℃至-30℃、任选地为或约18℃或20℃的温度下。
41.根据实施方案39或实施方案40所述的补充剂，其中所述补充剂中的L-谷氨酰胺在与基础培养基组合时和/或在所述补充剂解冻或经受从或从约20℃至42℃、任选地从或从约20℃至42℃、或为或大于或约37℃的温度时不会沉淀。
42.根据实施方案39-41中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度小于100mM。
43.根据实施方案39-42中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约20mM至100mM。
44.根据实施方案39-43中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。
45.根据实施方案39-44中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。
46.根据实施方案39-45中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。
47.根据实施方案39-46中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质是人蛋白。
48.根据实施方案39-47中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质是重组的。
49.根据实施方案39-48中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
50.根据实施方案49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，其中任选地其中所述白蛋白是人血清白蛋白或重组人白蛋白。
51.根据实施方案49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，其中任选地其中所述转铁蛋白源自人或是重组人转铁蛋白。
52.根据实施方案49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人胰岛素或重组人胰岛素，且其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。
53.所述无血清培养基、基础培养基或补充剂是无菌的。
54.一种用于制备无血清培养基的方法，所述方法包括将根据实施方案29-38或53中任一项所述的基础培养基与根据实施方案39-53中任一项所述的补充剂组合。
55.一种用于制备无血清培养基配制品的方法，所述方法包括将以下各项组合：
(a)包含二肽形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，其中所述无血清基础培养基是液体配制品和/或在所述组合之前未被冷冻；
(b)包含L-谷氨酰胺的第一补充剂。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述第一补充剂在所述组合之前已经冷冻，任选地其中所述方法包括在所述组合之前解冻所述第一补充剂。
57.根据实施方案55或56所述的方法，其中在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
58.根据实施方案55-57中任一项所述的方法，其中在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
59.根据实施方案55-58中任一项所述的方法，其中在所述基础培养基配制品中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
60.根据实施方案55-59中任一项所述的方法，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
61.根据实施方案55-60中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约20mM至100mM。
62.根据实施方案55-61中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。
63.根据实施方案55-62中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。
64.根据实施方案55-63中任一项所述的方法，其中所述第一补充剂包含至少一种蛋白质，且其中存在的所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物蛋白。
65.根据实施方案55-64中任一项所述的方法，其中所述第一补充剂中存在的所述至少一种蛋白质包括人蛋白。
66.根据实施方案65所述的方法，其中所述人蛋白包括人血清白蛋白、人转铁蛋白和/或人重组胰岛素。
67.根据实施方案54-66中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基配制品包含90％至97.5％(v/v)的所述基础培养基和1.25％至5％(v/v)的所述第一补充剂。
68.根据实施方案54-67中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将以下项组合：(c)第二补充剂，所述第二补充剂包含选自以下各项的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种生长因子、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。
69.根据实施方案68所述的方法，其中所述第二补充剂包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。
70.根据实施方案68或实施方案69所述的方法，其中所述无血清培养基配制品包含1.25％至5％(v/v)的所述第二补充剂。
71.一种无血清培养基配制品，其是通过根据实施方案54-70中任一项所述的方法产生的。
72.一种培养细胞的方法，所述方法包括将包含细胞的组合物在根据实施方案1-28、53和实施方案71中任一项所述的无血清培养基配制品中孵育。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述培养与选自以下各项的一个或多个步骤相结合进行：在存在刺激剂或刺激条件的情况下激活细胞；引入编码异源蛋白、任选重组受体的药剂，任选地其中所述重组受体是嵌合抗原受体；或培育或扩增所述细胞。
74.一种用于产生工程化细胞的方法，所述方法包括：
(a)使包含细胞的细胞群体与包含编码异源蛋白、任选重组受体的核酸分子的药剂在将编码所述重组受体的所述核酸引入所述群体的细胞中的条件下接触；及
(b)在所述接触之前、期间和/或之后，在存在刺激条件的情况下孵育所述细胞，其中所述刺激条件诱导所述细胞的初级信号、信号传导、刺激、激活和/或扩增，
其中(a)和(b)中之一或两者是在根据实施方案1-28、53和实施方案71中任一项所述的无血清培养基配制品中进行的。
75.根据实施方案72-74中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
76.根据实施方案72-75中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
77.根据实施方案72-76中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞或富含T细胞。
78.根据实施方案77中任一项所述的方法，其中所述T细胞或所述富集的T细胞是CD4+ T细胞和/或CD8 T细胞。
79.根据实施方案74-78中任一项所述的方法，所述方法还包括在(a)之前，从生物样品分离所述细胞群体。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述分离包括基于CD3的表面表达或基于CD4和CD8中之一或两者的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
81.根据实施方案79或实施方案80所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
82.根据实施方案79-81中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
83.根据实施方案79-82中任一项所述的方法，其中将CD4+与CD8+ T细胞单独分离并且在所述接触或孵育之前组合，任选以1:2至2:1的CD4与CD8比率组合，任选地其中所述比率为或为约1:1。
84.根据实施方案79-82中任一项所述的方法，其中将CD4+ T细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD4+细胞进行富集。
85.根据实施方案79-83中任一项所述的方法，其中将CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD8+细胞进行富集。
86.根据实施方案79-83中任一项所述的方法，其中将总T细胞、CD3+细胞或CD4+细胞和CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对总T细胞、CD3+细胞或CD4+和CD8+细胞进行富集。
87.根据实施方案79-86中任一项所述的方法，其中所述富集的细胞构成大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的所述细胞。
88.根据实施方案72-87中任一项所述的方法，其中所述细胞是获自受试者的原代细胞。
89.根据实施方案79-88中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
90.根据实施方案89所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。
91.根据实施方案89或实施方案90所述的方法，其中所述一级药剂与CD3特异性地结合，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
92.根据实施方案90或实施方案91所述的方法，其中所述一级药剂和二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物、任选珠的表面上。
93.根据实施方案79-92中任一项所述的方法，其中在所述接触之前进行或开始对所述细胞的所述刺激，任选地在为或约37℃下持续18-24小时。
94.根据实施方案79-93中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
95.根据实施方案79-94中任一项所述的方法，其中所述刺激细胞是在所述接触之后进行，任选地持续一段时间以达到阈值浓度。
96.根据实施方案73-95中任一项所述的方法，其中包含编码所述重组受体的核酸分子的所述药剂是病毒载体、任选慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
97.根据实施方案73-96中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白是重组受体。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体。
99.根据实施方案72-98中任一项所述的方法，其中所述方法导致与所述孵育开始时的细胞数量相比至少约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍的细胞扩增。
100.根据实施方案99所述的方法，其中在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后实现细胞扩增。
101.根据实施方案72-100中任一项所述的方法，其中所述方法导致细胞在所述孵育之后具有大于约80％、85％或90％的活力。
102.根据实施方案101所述的方法，其中所述活力在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后存在。
103.一种通过根据实施方案72-102中任一项所述的方法产生的细胞组合物。
104.一种制品，其包含根据实施方案1-28、53和71中任一项所述的无血清培养基；根据实施方案29-38和53中任一项所述的基础培养基；或根据实施方案39-53中任一项所述的补充剂；及用于制备或使用所述组合物的说明书。
105.根据实施方案104所述的制品，其为容器、任选瓶子。
VIII.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范围。实施例1： 在存在无血清培养基配制品的情况下产生表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞.
表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化人T细胞是在存在无血清培养基配制品的情况下产生的。含有表达抗BCMA嵌合抗原受体(CAR)的CD4+和CD8+ T细胞的原代T细胞的工程化组合物是通过包括如下步骤的示例性过程产生的：从样品单独选择CD4+和CD8+ T细胞，然后以所定义的比率组合所选择的细胞，以用于后续加工步骤，包括激活、转导和培育以扩增细胞。CAR含有对BCMA具特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区域、4-1BB共刺激信号传导区域和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。
在所述方法中，激活、转导和培育以扩增细胞是在由如下各项制备的无血清培养基中进行的：(1)液体基础培养基，其含有约2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(GlutaMax)；(2)第一补充剂，其含有80mM谷氨酰胺和血清替代蛋白，所述第一补充剂在使用前保持冷冻；及(3)以液体溶液形式提供的第二补充剂，例如OpTmizerTM T细胞扩增补充剂。所述基础培养基含有营养素混合物和缓冲液并且不含酚红。在解冻所述冷冻补充剂之后，将组分以约95.0％+/-0.2％(v/v)的基础培养基、约2.5％+/-0.2％(v/v)的第一补充剂和约2.5％+/-0.2％(v/v)的第二补充剂组合，由此生成示例性无血清细胞生长培养基(命名为“SFM-A”)L-谷氨酰胺在冷冻补充剂中的存在确保了其在添加到基础培养基中之前的稳定性，以使可能由于L-谷氨酰胺的不稳定而出现的在无血清培养基配制品中的可变的谷氨酰胺浓度和/或渐增的氨浓度最小化。L-谷氨酰胺由于L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺的存在而在第一补充剂中保持可溶。培养基另外补充有细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。
从分离自人白细胞单采术样品(包括来自患有多发性骨髓瘤(MM)的受试者)的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且将所选择的细胞组合物低温冷冻。随后将所选择的CD4+和CD8+ T细胞组合物解冻并以1:1的活CD4+ T细胞与活CD8+ T细胞的比率混合，然后进行刺激、转导和扩增的步骤。
将密度为3x106个细胞/mL的来自混合细胞组合物的大约300x106个T细胞(150x106个CD4+ T细胞和150x106个CD8+ T细胞)在示例性无血清培养基中在存在附着有抗CD3和抗CD28抗体的经聚苯乙烯包被的顺磁珠的情况下以1:1的珠与细胞比率进行刺激(参见例如实施例3)。培养基还含有重组IL-2、IL-7和IL-15。通过孵育将刺激进行18至30小时。
孵育之后，将来自所刺激的细胞组合物的大约100x106个活细胞洗涤并重悬于含有重组IL-2、IL-7和IL-15的示例性无血清培养基中。不添加转导佐剂。将细胞通过旋转接种用编码抗BCMA CAR的慢病毒载体转导60分钟，接着在约37℃下孵育约18至30小时。旋转接种后的细胞密度为约1x106个细胞/mL。CAR含有对BCMA具特异性的scFv抗原结合结构域、CD28跨膜区域、4-1BB共刺激信号传导区域和CD3-ζ来源的细胞内信号传导结构域。
然后，通过转移到生物反应器(例如摇摆运动生物反应器)中的约500mL示例性无血清培养基中来培育所转导的细胞以进行扩增，所述无血清培养基含有两倍于在孵育和转导步骤期间所用的浓度的IL-2、IL-7和IL-15。在此示例性过程中，示例性培养基不含有泊洛沙姆。在达到大于或约0.6x106个细胞/mL的阈值细胞密度之后，通过定期(如在约2与约15分钟之间)添加几次(shot)新鲜培养基来逐步添加培养基直至1000mL的体积，并且在稳定摇摆条件(非灌注)下培育细胞直至达到大于或约0.6x106个细胞/mL的阈值活细胞密度。如果活细胞密度大于0.8x106个细胞/mL，则开始组合填充/灌注步骤，其中以如上所示的逐步方式添加第一培养基，直至1000mL的目标体积，然后如下所述开始灌注。然后通过伴随连续混合的半连续灌注来更换培养基。灌注速率和/或摇摆速度在扩增阶段随着细胞密度的增加提高了至少一倍。灌注速率在扩增阶段随着细胞密度的增加提高了至少一倍。将培养基以逐步方式添加到培养物中，其中每天的总体积由活细胞密度决定(一旦达到特定密度后，速率会更高)，直到一定速率，所述速率例如导致每天向培养物中添加大约750mL或1500mL的总新鲜培养基(当达到更高细胞浓度时，速率会更高)，在一整天中定期(如在约每0.5小时与约每1.5或2小时之间)添加几次新鲜培养基。在有核细胞(TNC)的总数量已达到至少或至少约3500x106个之后且在TNC数量已达到至少或至少约5500x106个总有核细胞之时，一天收获一次细胞。收获之后，将抗CD3和抗CD28抗体缀合的珠通过暴露于磁场从细胞组合物去除。然后配制细胞并将其低温冷冻。
由以上所述的示例性过程产生七十九个单独的工程化T细胞组合物。观察到在培育期间的稳健扩增，如通过来自79个制造轮次中每个的活细胞(包括源自健康供体和多发性骨髓瘤患者的那些)的总数量所确定。所有轮次均能够在开始培育的6天内产生具有超过5.5x109个细胞/mL的目标阈值的细胞密度的细胞组合物。在开始培育的6天内，针对所有制造轮次观察到活细胞数量增加大于27倍，其中超过85％的轮次到第5天时实现这种扩增。总之，这些数据支持无血清培养基配制品在源自健康供体和患者供体的细胞之间的稳健性能。
实施例2：对通过涉及无血清培养基的过程产生的CAR+ T细胞组合物的评估.
大致如实施例1中所述，在存在示例性SFM-A的情况下产生表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化人T细胞。在此研究中，为了生成CAR表达T细胞，通过基于免疫亲和力的富集从供体白细胞单采术样品单独分离CD4+和CD8+ T细胞，以约1:1进行混合，在存在抗CD3/抗CD28磁珠的情况下激活，用实施例1中所述的编码抗BCMACAR的病毒载体转导并且通过在约37℃下孵育来培育以扩增细胞。激活、转导和培育以扩增细胞是在5％(v/v)含人血清的培养基中或在实施例1中所述的SFM-A培养基中进行的，各自都是在存在细胞因子的情况下进行。将所产生的工程化T细胞组合物的示例性特征与在存在SFM-A或含血清的培养基的情况下由同一供体生成的匹配细胞组合物进行比较。
A.活力
在如下时间评估T细胞活力：激活之后、激活和转导之后及在开始培育(天数＝0)之后的每天直至第6天。在该过程的早期至开始培育后的第2天，与含血清的培养基相比，在存在SFM-A培养基的情况下培养的细胞组合物中观察到较低的细胞数量和活力。然而，到扩增第3天时，在存在SFM-A的情况下与在存在含血清的配制品的情况下培养的细胞之间的活力是相当的。该结果与在存在无血清培养基的情况下T细胞扩增的延迟相一致，例如，由于在过程的初始阶段中细胞适应于无血清条件。与含血清培养基相比，在存在SFM-A的情况下尽管最初的细胞数量较低，但细胞培养物到第5天和第6天时产生了略微较大的活细胞数量和相当的活细胞百分比。
B.CAR-T细胞活性
在T细胞组合物中的CAR+ T细胞在扩增后的功能活性是通过监测在存在高尔基体抑制剂的情况下用佛波酯(PMA)/离子霉素刺激之后的细胞因子积累来评估的。细胞因子的多功能性积累是通过如下方法进行评估的：在细胞中针对IL-2、IFN-γ和TNF-α进行细胞内细胞因子染色(ICS)，还针对表面CD4、CD8或抗BCMA CAR进行共染色。与用含血清的培养基培养的细胞相比，在存在SFM-A的情况下培养的细胞中观察到功能性CAR+CD4+ T细胞或CAR+CD8+ T细胞的相当的百分比，如通过IL-2、IFN-γ和TNF-α的多功能性积累所测定。
在生成的抗BCMA CAR+ T细胞组合物与抗原表达细胞的共培养之后，还使用Luminex Multiplex Assay在上清液中测量细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的产生。与含血清的培养基相比，在存在SFM-A的情况下生成的培养物中炎性细胞因子(IL-2、IFN-α、GM-CSF和TNF-γ)的分泌是相当的。
C.细胞凋亡标记
抗BCMA CAR+ T细胞组合物是通过使用含血清的培养基或示例性SFM-A的过程产生，随后将其低温保存并在分析之前解冻，针对活性半胱天冬酶3的表面表达对所述细胞组合物进行评估。在存在SFM-A的情况下培养的小于5％的所生成的工程化CD3+CAR+细胞对于活性半胱天冬酶-3呈阳性。与含血清的培养基相比，在存在SFM-A的情况下培养时由示例性供体产生的匹配T细胞组合物中对于活性半胱天冬酶-3呈阳性的CD3+CAR+细胞的频率较低。
D.转导频率
通过流式细胞术测定生成的T细胞组合物的转导频率。使用CAR特异性试剂测量抗BCMA CAR的表面表达。在示例性供体匹配的T细胞组合物中，通过涉及SFM-A的过程产生的细胞展现出与通过涉及含血清培养基的过程产生的细胞相比提高的转导效率。在示例性实验中，转导效率从约53％提高至约68％。
实施例3：通过无血清培养基过程产生的CAR表达T细胞的抗肿瘤效果
大致如实施例1中所述，通过涉及示例性SFM-A的过程产生抗BCMA CAR+ T细胞组合物。作为比较，通过类似过程(不同的是使用含血清的培养基)产生来自匹配供体的T细胞组合物。在荷瘤动物模型(包括OPM2人多发性骨髓瘤播散性异种移植小鼠模型)中通过在细胞的过继转移之后监测肿瘤来评估所生成的CAR+ T组合物的抗肿瘤效果。
为了生成荷瘤小鼠，向六至八周龄的雌性NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠注射用萤火虫萤光素酶(OPM2-ffluc)转染的2x106个OPM2(多发性骨髓瘤)细胞。在第13天，使用生物发光成像监测肿瘤大小，并且在第14天向小鼠给予抗BCMA CAR+ T细胞组合物的单次静脉内(i.v.)注射，所述抗BCMA CAR+ T细胞组合物是通过包括SFM-A的过程产生或通过包括含血清的培养基的过程产生的。由同一人供体生成所评估的抗BCMA CAR+T细胞组合物。以1x106、5x105或2.5x105个CAR表达T细胞的剂量给予细胞。不表达CAR的细胞(模拟物)用作阴性对照。在给予细胞后的100天时间段内，监测小鼠的肿瘤生长和存活。
过继转移的CAR表达细胞的抗肿瘤活性是在CAR T细胞注射后的不同天数至第100天通过生物发光成像进行监测。对于生物发光成像，小鼠接受了重悬于PBS(15μg/g体重)的萤光素底物(CaliperLife Sciences,马萨诸塞州霍普金顿)的腹膜内(i.p.)注射。基本上如WO 2015/095895中所述，对小鼠进行麻醉和成像。在每个时间点确定总通量(光子/s)。对于阴性对照治疗的小鼠，由于高肿瘤负荷，在CAR-T转移之后的22天与26天之间处死动物。使用SFM-A或含血清的培养基产生的CAR表达T细胞显示肿瘤生长和延长的存活，这通常在所有评估剂量下是相当的。
实施例4：在用于生成表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化CD4+和CD8+ T细胞的双流 过程中的无血清培养基配制品的评估
在如下过程中产生表达嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化人T细胞：其中使CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物单独地经受加工步骤。从分离自人白细胞单采术样品的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物并将其低温冷冻。随后将所选择的CD4+和CD8+组合物解冻并在存在附接有抗CD3和抗CD28抗体的经聚苯乙烯包被的顺磁珠的情况下单独刺激，用编码CAR的慢病毒载体单独转导并在约37℃下培育以扩增细胞。在存在实施例1中所述的SFM-A的情况下或在含血清的培养基中进行激活、转导和培育的单独步骤中的每个。SFM-A或含血清的培养基另外补充有细胞因子。在体外功能测定中评估细胞之前以1:1混合所生成的CD4+和CD8+CAR-T细胞。将所产生的工程化T细胞组合物的示例性特征进行比较。
A.细胞凋亡标记
将如上一般所述产生的低温保存的CAR表达T细胞组合物解冻，然后培养长达48小时。通过将细胞与含有针对半胱天冬酶3/7的识别基序的底物一起孵育来进行半胱天冬酶3/7的动力学定量，所述识别基序与荧光部分融合以允许随时间对细胞凋亡的可视化和定量。
在所有条件下，与用含血清的培养基生成的T细胞组合物相比，在存在SFM-A的情况下生成的CAR-T细胞组合物在动力学评估过程中具有对于半胱天冬酶3/7的较低染色。这些结果与以下观察结果一致：用示例性SFM-A生成的T细胞组合物可以更健康且具有改善的活力。
B.细胞因子产生
为了评估所生成的CAR+ T细胞组合物的抗原依赖性活性，将所生成的T细胞组合物与用由CAR识别的抗原转导的靶细胞或不表达抗原的亲本(非转导)细胞一起共培养24小时。使用Luminex Multiplex Assay在上清液中测量细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌。与在含血清的培养基中相比，对于在SFM-A中产生的CAR表达T细胞，在抗原特异性刺激之后在上清液中测量的细胞因子的水平是相当的。在来自不表达CAR的同一供体的T细胞组合物中未观察到细胞因子产生。
C.靶细胞的杀伤.
针对杀伤靶细胞的功能，评估在SFM-A或含血清的培养基中产生的CAR表达T细胞组合物。将抗原表达靶细胞与CAR-T细胞组合物以3:1或1:1的效应细胞与靶细胞(E:T)比率共培养。通过将荧光半胱天冬酶3/7试剂添加到共培养物中来评估细胞裂解并且通过自动化图像分析来定量靶细胞死亡。测定荧光信号的曲线下面积(AUC)。使用下式确定杀伤指数：1/AUC。与用含血清的培养基产生的CAR-T细胞相比，在3:1和1:1的E:T比率下均观察到对于用SFM-A产生的CAR-T细胞的改善的靶细胞杀伤。
D.扩增
针对响应于抗原的T细胞扩增，评估在SFM-A或含血清的培养基中产生的CAR表达T细胞组合物。将如上所述产生的低温保存的CAR表达T细胞组合物解冻，然后与抗原表达靶细胞共培养。在共培养第4天，通过计数细胞数量来评估T细胞扩增。与用含血清的培养基产生的CAR-T细胞相比，观察到对于用SFM-A产生的CAR-T细胞的改善的扩增。
实施例5对使用无血清培养基通过示例性制造过程生成的T细胞组合物的评估
在基本上如实施例1中所述的示例性方法中，含有表达抗BCMACAR的自体T细胞的50个CAR+ T细胞组合物是由收集自50个单独的人受试者的单采术(来自每个受试者的一次单采术)生成的，包括10个健康供体和40个多发性骨髓瘤患者。从单采术样品选择CD4+和CD8+ T细胞并将其单独低温保存。然后将细胞解冻，并且将CD4+ T细胞和CD8+ T细胞以活CD4+与CD8+细胞的1:1比率进行组合。基本上如实施例1中所述将组合的CD4+和CD8+ T细胞激活，用编码CAR的载体转导，扩增并通过低温保存来冷冻。
在示例性替代过程中，治疗性T细胞组合物是通过如下过程生成的，所述过程包括从来自55个单独的人癌症患者的白细胞单采术样品对T细胞进行基于免疫亲和力的选择。使大量T细胞经受激活以及用编码CAR的病毒载体转导、扩增和低温保存。
将在冷冻组合物中的细胞解冻并通过流式细胞术评估活力，细胞凋亡标记(如活性半胱天冬酶3(CAS))的表达，CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7和CD45RA的表面表达，及CAR。测定CD3+细胞的百分比、组合物中的CD3+CAR+细胞中的CAR+细胞凋亡标记阴性细胞的百分比、及在组合物中的中央记忆CD4+CAR+细胞和中央记忆CD8+CAR+细胞的百分比。评估通过制造过程生成的细胞组合物的细胞表型，并且在一些方面，将其与通过替代过程生成的细胞组合物的细胞表型相比较。
该实施例的制造过程导致了在进行所述制造过程的100％人生物样品中满足某些预先确定的特征(包括在给予至患者的细胞组合物中表达CAR的细胞的阈值数量)的工程化细胞组合物。图1A和图1B示出了对于从来自40个多发性骨髓瘤患者的样品组单独生成的组合物，分别在组合物的CD4+CAR+细胞(图1A)中和CD8+CAR+细胞(图1B)中的所示表型(基于CD45RA和CCR7表面表达)的细胞百分比的中值(水平线)、四分位差(框)和1.5x四分位差(须)。图1C和图1D示出了对于从来自40个多发性骨髓瘤患者的样品组单独生成的组合物，分别在组合物的CD4+CAR+细胞(图1C)中和CD8+CAR+细胞(图1D)中的所示表型(基于CD27和CD28表面表达)的细胞的百分比的中值(水平线)、四分位数(框)和1.5x四分位数(须)。对于从一系列多发性骨髓瘤患者获得的单独的白细胞单采术样品，使用从此类样品生成工程化细胞组合物的该示例性方法，观察到从开始激活到收获的这部分过程的持续时间的范围是在7与10天之间，并且这些样品之间的平均持续时间为约7.5天。进一步确定，在所述过程期间，不同样品中的累积群体倍增的平均数是约7.5。
在该研究中，在通过示例性方法产生的细胞组合物中的工程化T细胞群体包括小于15％的表达细胞凋亡标记的细胞，并且与起始样品相比且与使用示例性替代过程生成的细胞组合物相比富集中央记忆表型。
本发明并不意图将范围限于具体公开的实施方案，所述具体公开的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面而提供。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002615298730001591
Figure BDA0002615298730001601
Figure BDA0002615298730001611
Figure BDA0002615298730001621
Figure BDA0002615298730001631
Figure BDA0002615298730001641
序列表
<110> 朱诺治疗学股份有限公司
P·波切斯尼
K·邱-东
I·艾芙娃
C·陈
<120> 用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法
<130> 735042012440
<140> 尚未分配
<141> 与此一起
<150> 62/596,766
<151> 2017-12-08
<160> 70
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
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Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
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Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
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<213> 人工序列
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Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
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Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
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<309> 1989-07-01
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<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> CD28
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<309> 1989-07-01
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<309> 1989-07-01
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<223> CD28
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<309> 1995-02-01
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<213> 人工序列
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305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 24
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFR α链信号序列
<400> 25
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8 α信号肽
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ser Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Arg Asp Gly Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 28
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Trp Tyr
20 25 30
Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Asp Ser
35 40 45
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
50 55 60
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Asn Thr Arg Ser Ser Thr Leu Val Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 29
<211> 228
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 肽
<222> (0)...(0)
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 30
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 32
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met
35 40 45
Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Tyr Phe Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 33
Asp Val Val Met Thr Gln Ser His Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 35
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His
20 25 30
Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 37
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 39
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 40
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 40
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 42
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 43
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 44
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变重链(VH)抗BCMA
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可变轻链(VL)抗BCMA
<400> 46
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 47
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 48
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 49
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 50
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 51
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 52
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 55
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 56
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 57
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 58
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 59
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 60
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 61
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 62
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 63
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 65
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC-CDR3
<400> 66
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR2
<400> 67
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-CDR3
<400> 68
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 69
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 70
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly

Claims (105)

1.一种无血清培养基，其包含：
在基础培养基中的0.5mM至5mM二肽形式的L-谷氨酰胺；
0.5mM至5mM L-谷氨酰胺；和
至少一种蛋白质，其中所述培养基不含血清。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的无血清培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质是人蛋白。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质是重组的。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，任选地其中所述白蛋白是人血清白蛋白或重组人白蛋白，且任选地其中在所述培养基中的白蛋白的浓度为约2.5mg/mL至7.5mg/mL。
14.根据权利要求13所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的白蛋白的浓度为约5mg/mL。
15.根据权利要求12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，任选地其中所述转铁蛋白是人或重组人转铁蛋白，且任选地其中在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约50mg/L至200mg/L。
16.根据权利要求15所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的转铁蛋白的浓度为约100mg/L。
17.根据权利要求12所述的无血清培养基，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人或重组人胰岛素，且任选地其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。
18.根据权利要求17所述的无血清培养基，其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约10mg/L。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的无血清培养基，其中所述基础培养基包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基或M199。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的无血清培养基，其中所述基础培养基和/或所述无血清培养基不包含酚红。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基包含一种或多种细胞因子。
24.根据权利要求23所述的无血清培养基，其中所述一种或多种细胞因子选自IL-2、IL-7或IL-15。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的无血清培养基，其中所述无血清培养基支持细胞扩增。
26.根据权利要求25所述的无血清培养基，其中所述细胞是原代免疫细胞。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的无血清培养基，其中所述细胞是或包含T细胞。
28.根据权利要求27所述的无血清培养基，其中所述T细胞包含CD4+或CD8+T细胞。
29.一种基础培养基，其包含二肽形式的L-谷氨酰胺，其中所述基础培养基不含L-谷氨酰胺和蛋白质。
30.根据权利要求29所述的基础培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的基础培养基，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的基础培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的基础培养基，其中在所述无血清培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
34.根据权利要求29-33中任一项所述的基础培养基，其中所述基础培养基包含以下各项中的一种或多种：无机盐、糖、氨基酸，任选地还含有维生素、有机酸、抗氧化剂和/或缓冲液。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的基础培养基，其包括杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的杜尔贝科培养基或M199。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的基础培养基，其中所述基础培养基不包含酚红。
37.根据权利要求29-36中任一项所述的基础培养基，其中所述蛋白质是人源蛋白或重组蛋白或这两者。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的基础培养基，其中所述基础培养基是液体。
39.一种补充剂，其包含至少一种蛋白质和L-谷氨酰胺，其中与所述补充剂组合的基础细胞培养基能够支持细胞的扩增。
40.根据权利要求39所述的补充剂，其中所述补充剂在使用前被冷冻或冷冻储存，任选地在从或从约-10℃至-30℃、任选地为或约18℃或20℃的温度下。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的补充剂，其中所述补充剂中的L-谷氨酰胺在与基础培养基组合时和/或在所述补充剂解冻或经受从或从约20℃至42℃、任选地从或从约20℃至42℃、或为或大于或约37℃的温度时不会沉淀。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度小于100mM。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约20mM至100mM。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的补充剂，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质是人蛋白。
48.根据权利要求39-47中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质是重组的。
49.根据权利要求39-48中任一项所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包括白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。
50.根据权利要求49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种白蛋白，其中任选地其中所述白蛋白是人血清白蛋白或重组人白蛋白。
51.根据权利要求49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种转铁蛋白，其中任选地其中所述转铁蛋白源自人或是重组人转铁蛋白。
52.根据权利要求49所述的补充剂，其中所述至少一种蛋白质包含至少一种胰岛素，任选地其中所述胰岛素是人胰岛素或重组人胰岛素，且其中在所述无血清培养基中的胰岛素的浓度为约5mg/L至20mg/L。
53.所述无血清培养基、基础培养基或补充剂是无菌的。
54.一种用于制备无血清培养基的方法，所述方法包括将根据权利要求29-38或53中任一项所述的基础培养基与根据权利要求39-53中任一项所述的补充剂组合。
55.一种用于制备无血清培养基配制品的方法，所述方法包括将以下各项组合：
(a)包含二肽形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，其中所述无血清基础培养基是液体配制品和/或在所述组合之前未被冷冻；
(b)包含L-谷氨酰胺的第一补充剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第一补充剂在所述组合之前已经冷冻，任选地其中所述方法包括在所述组合之前解冻所述第一补充剂。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度是从或从约0.5mM至5mM、0.5mM至4mM、0.5mM至3mM、0.5mM至2mM、0.5mM至1mM、1mM至5mM、1mM至4mM、1mM至3mM、1mM至2mM、2mM至5mM、2mM至4mM、2mM至3mM、3mM至5mM、3mM至4mM或4mM至5mM，每个都包含端值。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中在所述基础培养基中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中在所述基础培养基配制品中所述二肽形式的L-谷氨酰胺的浓度为或为约2mM。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，其中所述二肽形式的L-谷氨酰胺是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度是从或从约20mM至100mM。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中所述L-谷氨酰胺的浓度为至少或至少约或为或为约40mM、50mM、60mM、70mM、80mM或90mM。
63.根据权利要求55-62中任一项所述的方法，其中在所述补充剂中的L-谷氨酰胺的浓度为或为约80mM。
64.根据权利要求55-63中任一项所述的方法，其中所述第一补充剂包含至少一种蛋白质，且其中存在的所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物蛋白。
65.根据权利要求55-64中任一项所述的方法，其中在所述第一补充剂中的所述至少一种蛋白质包括人蛋白。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述人蛋白包括人血清白蛋白、人转铁蛋白和/或人重组胰岛素。
67.根据权利要求54-66中任一项所述的方法，其中所述无血清培养基配制品包含90％至97.5％(v/v)的所述基础培养基和1.25％至5％(v/v)的所述第一补充剂。
68.根据权利要求54-67中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将(c)第二补充剂组合，所述第二补充剂包含选自以下各项的一种或多种成分：一种或多种抗氧化剂、一种或多种白蛋白或白蛋白替代品、一种或多种脂质药剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代品、一种或多种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、一种或多种生长因子、一种或多种微量元素及一种或多种糖皮质激素。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第二补充剂包含脂质、生长因子、N-乙酰半胱氨酸、乙醇胺和/或白蛋白。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的方法，其中所述无血清培养基配制品包含1.25％至5％(v/v)的所述第二补充剂。
71.一种是通过根据权利要求54-70中任一项所述的方法产生的无血清培养基配制品。
72.一种培养细胞的方法，所述方法包括将包含细胞的组合物在根据权利要求1-28、53和权利要求71中任一项所述的无血清培养基配制品中孵育。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述培养与选自以下各项的一个或多个步骤相结合进行：在存在刺激剂或刺激条件的情况下激活细胞；引入编码异源蛋白、任选重组受体的药剂，任选地其中所述重组受体是嵌合抗原受体；或培育或扩增所述细胞。
74.一种用于产生工程化细胞的方法，所述方法包括：
(a)使包含细胞的细胞群体与包含编码异源蛋白、任选重组受体的核酸分子的药剂在将编码所述重组受体的所述核酸引入所述群体的细胞中的条件下接触；及
(b)在所述接触之前、期间和/或之后，在存在刺激条件的情况下孵育所述细胞，其中所述刺激条件诱导所述细胞的初级信号、信号传导、刺激、激活和/或扩增，
其中(a)和(b)中之一或两者是在根据权利要求1-28、53和权利要求71中任一项所述的无血清培养基配制品中进行的。
75.根据权利要求72-74中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
76.根据权利要求72-75中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
77.根据权利要求72-76中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞或富含T细胞。
78.根据权利要求77中任一项所述的方法，其中所述T细胞或所述富集的T细胞是CD4+T细胞和/或CD8 T细胞。
79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在(a)之前，从生物样品分离所述细胞群体。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述分离包括基于CD3的表面表达或基于CD4和CD8中之一或两者的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
81.根据权利要求79或权利要求80所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中将CD4+与CD8+T细胞单独分离并且在所述接触或孵育之前组合，任选以1:2至2:1的CD4与CD8细胞比率组合，任选地其中所述比率为或为约1:1。
84.根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中将CD4+T细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD4+细胞进行富集。
85.根据权利要求79-83中任一项所述的方法，其中将CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对CD8+细胞进行富集。
86.根据权利要求79-83中任一项所述的方法，其中将总T细胞、CD3+细胞或CD4+细胞和CD8+细胞分离和/或将所述细胞群体针对总T细胞、CD3+细胞或CD4+和CD8+细胞进行富集。
87.根据权利要求79-86中任一项所述的方法，其中所述富集的细胞构成大于或大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的所述细胞。
88.根据权利要求72-87中任一项所述的方法，其中所述细胞是获自受试者的原代细胞。
89.根据权利要求79-88中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
91.根据权利要求89或权利要求90所述的方法，其中所述一级药剂特异性地结合CD3，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
92.根据权利要求90或权利要求91所述的方法，其中所述一级药剂和二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物、任选珠的表面上。
93.根据权利要求79-92中任一项所述的方法，其中在所述接触之前进行或开始对所述细胞的所述刺激，任选地在为或约37℃下持续18-24小时。
94.根据权利要求79-93中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括选自IL-2、IL-15和IL-7的细胞因子。
95.根据权利要求79-94中任一项所述的方法，其中所述刺激细胞是在所述接触之后进行，任选地持续一段时间以达到阈值浓度。
96.根据权利要求73-95中任一项所述的方法，其中包含编码所述重组受体的核酸分子的所述药剂是病毒载体、任选慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
97.根据权利要求73-96中任一项所述的方法，其中所述异源蛋白是重组受体。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体。
99.根据权利要求72-98中任一项所述的方法，其中所述方法导致与所述孵育开始时的细胞数量相比至少约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍的细胞扩增。
100.根据权利要求99所述的方法，其中在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后实现所述细胞扩增。
101.根据权利要求72-100中任一项所述的方法，其中所述方法导致细胞在所述孵育之后具有大于约80％、85％或90％的活力。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述活力在进行所述孵育持续大于5天、任选5、6、7、8或9天之后存在。
103.一种通过根据权利要求72-102中任一项所述的方法产生的细胞组合物。
104.一种制品，其包含根据权利要求1-28、53和71中任一项所述的无血清培养基；根据权利要求29-38和53中任一项所述的基础培养基；或根据权利要求39-53中任一项所述的补充剂；及用于制备或使用所述组合物的说明书。
105.根据权利要求104所述的制品，其为容器、任选瓶子。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920995A (zh) * 2021-03-31 2021-06-08 赵峻岭 一种间充质干细胞培养血清加油包及其应用
CN113373113A (zh) * 2021-08-13 2021-09-10 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499291B (zh) * 2018-05-16 2023-11-24 上海赛比曼生物科技有限公司 无血清培养制备嵌合抗原受体t细胞的方法
EP3999081A1 (en) * 2019-07-18 2022-05-25 GPB Scientific, Inc. Ordered processing of blood products to produce therapeutically active cells
WO2021148019A1 (zh) * 2020-01-22 2021-07-29 科济生物医药（上海）有限公司 病毒载体转导细胞的方法
CN115044548B (zh) * 2022-08-11 2022-10-25 北京原生元生物科技有限公司 一种无血清培养基及其应用
CN116179475B (zh) * 2023-04-23 2023-07-28 北京国卫生物科技有限公司 一种人脐静脉血管内皮细胞的分离培养方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035631A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé de production d'une substance
CN104450614A (zh) * 2014-12-05 2015-03-25 上海安集协康生物技术有限公司 一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其使用方法
CN105316278A (zh) * 2011-12-05 2016-02-10 菲克特生物科学股份有限公司 用于转染细胞的方法和产品
CN106754670A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 湖南省生宝生物科技有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用
CN106834218A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 庞希宁 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法

Family Cites Families (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
AU4746590A (en) 1988-12-28 1990-08-01 Stefan Miltenyi Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
DE4228458A1 (de) 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO1996013593A2 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Procept, Inc. Soluble single chain t cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
US20020150914A1 (en) 1995-06-30 2002-10-17 Kobenhavns Universitet Recombinant antibodies from a phage display library, directed against a peptide-MHC complex
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
WO1997034634A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies
AU6467796A (en) 1996-04-24 1997-05-15 Claude Fell Cell separation system for biological fluids like blood
CA2305630C (en) 1997-10-02 2012-11-06 Sunol Molecular Corporation Soluble single-chain t-cell receptor proteins
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
TR200003391T2 (tr) 1998-05-19 2001-02-21 Avidex Limited Çözünür T hücresi reseptörü
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
ES2224726T3 (es) 1998-12-24 2005-03-01 Biosafe S.A. Sistema de separacion sanguinea indicado en particular para la concentracion de celulas madre hematopoyeticas.
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
AU2001297703B2 (en) 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
PL208712B1 (pl) 2001-08-31 2011-05-31 Avidex Ltd Rozpuszczalny receptor komórek T (sTCR), rozpuszczalna αβ-postać receptora komórek T (sTCR), wielowartościowy kompleks receptora komórek T (TCR), sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd, środek farmaceutyczny zawierający sTCR i/lub wielowartościowy kompleks TCR, cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarz, sposób otrzymywania całości lub części łańcucha α TCR albo całości lub części łańcucha β TCR, sposób otrzymywania rozpuszczalnego receptora komórek T (sTCR), sposób otrzymywania rozpuszczalnej αβ-postaci receptora komórek T (sTCR) oraz sposób wykrywania kompleksów MHC-peptyd
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
AU2003271904B2 (en) 2002-10-09 2009-03-05 Adaptimmune Limited Single chain recombinant T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US20050025763A1 (en) 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
CA2555185C (en) 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090226474A1 (en) 2004-05-27 2009-09-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
EP1773383B1 (en) 2004-05-27 2012-09-12 Jon A. Weidanz Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
JP5563194B2 (ja) 2004-06-29 2014-07-30 イムノコア リミテッド 改変ｔ細胞レセプターを発現する細胞
SI2567976T1 (sl) 2005-03-23 2017-11-30 Genmab A/S Protitelesa usmerjena proti cd38 za zdravljenje multiplega mieloma
KR101319135B1 (ko) 2005-03-23 2013-10-17 바이오세이프 쏘시에떼아노님 재생 의약에서 성체 줄기 세포를 비롯한 세포 부분집합의 수집, 처리, 이식을 위한 통합된 기계 장치
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
WO2008121420A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
ES2640216T3 (es) 2007-12-07 2017-11-02 Miltenyi Biotec Gmbh Sistemas y métodos para procesamiento de células
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
EP2222861B1 (en) 2007-12-11 2017-12-06 The University of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
PL2801584T3 (pl) 2007-12-26 2019-12-31 Biotest Ag Środki mające za cel CD138 i ich zastosowania
US20120164718A1 (en) 2008-05-06 2012-06-28 Innovative Micro Technology Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
ES2961498T3 (es) 2008-08-26 2024-03-12 Hope City Método y composiciones para el funcionamiento mejorado del efecto antitumoral de las células T
WO2010051391A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Facet Biotech Corporation Use of anti-cs1 antibodies for treatment of rare lymphomas
PT2406284T (pt) 2009-03-10 2016-09-29 Biogen Ma Inc Anticorpos anti-bcma
RU2587621C2 (ru) 2009-04-01 2016-06-20 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА К FcRH5, ИХ ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CA2777053A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Human single-chain t cell receptors
JP5956342B2 (ja) 2009-11-03 2016-07-27 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
BR122021026169B1 (pt) 2010-12-09 2023-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uso de uma célula
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
ES2841983T3 (es) 2011-03-23 2021-07-12 Hutchinson Fred Cancer Res Método y composiciones para inmunoterapia celular
KR20140033029A (ko) 2011-04-01 2014-03-17 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 에이치엘에이 에이2에 의해 제공된 더블유티1 펩타이드에 특이적인 티 세포 수용체 유사 항체
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
BR112014011417B1 (pt) 2011-11-11 2021-10-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Polipeptídeo isolado capaz de elicitar uma resposta de célula t antígeno-específica para ciclina a1 humana, composição imunogênica compreendendo o referido polipeptídeo, bem como método para preparar células apresentadoras de antígeno, antígeno-pulsadas,e uso destas para superexpressão de ccna1
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
KR20150009556A (ko) 2012-05-03 2015-01-26 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 증강된 친화성 t　세포 수용체 및 이의 제조 방법
WO2014031687A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Jensen, Michael Method and compositions for cellular immunotherapy
CN112430580A (zh) 2012-10-02 2021-03-02 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
CN104781789B (zh) 2012-12-20 2018-06-05 三菱电机株式会社 车载装置
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
SG10201804439PA (en) 2013-12-20 2018-06-28 Hutchinson Fred Cancer Res Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
KR20220136455A (ko) 2014-04-23 2022-10-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
US10301370B2 (en) 2014-05-02 2019-05-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of chimeric autoantibody receptor T cells
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
AU2015343121B2 (en) 2014-11-05 2020-06-18 Juno Therapeutics, Inc. Methods for transduction and cell processing
RS61781B1 (sr) 2014-12-05 2021-06-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antitela koja ciljaju antigen za sazrevanje b-ćelija i postupci upotrebe
SG11201704549UA (en) 2014-12-05 2017-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
AU2015357535B2 (en) 2014-12-05 2020-05-14 Eureka Therapeutics, Inc. Antibodies targeting G-protein coupled receptor and methods of use
SI3227339T1 (sl) 2014-12-05 2022-02-28 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Himerni antigenski receptorji, ki ciljajo na receptor, povezan z G-proteinom, in njihova uporaba
KR102584280B1 (ko) 2016-04-01 2023-10-04 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 및 t 세포 수용체 및 사용 방법
PL3372670T3 (pl) * 2017-03-09 2019-08-30 Evonik Technochemie Gmbh Pożywki hodowlane zawierające dipeptydy n-acylo-x-glutaminy

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035631A1 (fr) * 2006-09-20 2008-03-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procédé de production d'une substance
CN105316278A (zh) * 2011-12-05 2016-02-10 菲克特生物科学股份有限公司 用于转染细胞的方法和产品
CN104450614A (zh) * 2014-12-05 2015-03-25 上海安集协康生物技术有限公司 一种无动物蛋白源的免疫细胞无血清培养基及其使用方法
CN106754670A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 湖南省生宝生物科技有限公司 一种间充质干细胞无血清培养基及其配制方法和应用
CN106834218A (zh) * 2017-01-06 2017-06-13 庞希宁 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IMAMOTO Y, T，ET AL.: "Advantages of AlaGln as an additive to cell culture medium: use with anti-CD20 chimeric antibody-producing POTELLIGENT™ CHO cell lines" *
KARNIELI O, ET AL.: "A consensus introduction to serum replacements and serum-free media for cellular therapies" *
SMITH C, ET AL: "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920995A (zh) * 2021-03-31 2021-06-08 赵峻岭 一种间充质干细胞培养血清加油包及其应用
CN113373113A (zh) * 2021-08-13 2021-09-10 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021505148A (ja) 2021-02-18
US20210207080A1 (en) 2021-07-08
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