BRPI0923057A2 - processamento de sangue - Google Patents

Abstract

PROCESSAMENTO DE SANGUE. A presente invenção refere-se a métodos (300), dispositivos e sistemas para o processamento de sangue. O método (300) compreende as etapas de: obtenção (312) de sangue de um paciente acoplado a um único dispositivo de processamento sanguíneo para formar um circuito fechado entre o paciente e o dispositivo de processamento sanguíneo, coleta (314) a granel de células sanguíneas mononucleares a partir do snague por leucaférese, implementada através do uso do sispositivo de processamento sanguíneo no circuito fechado, e enriquecer (316) simultaneamente células-alvo separadas de células não alvo no volume de células sanguíneas mononucleares usando-se o dispositivo de processamento sanguíneo no circuito fechado.

Description

- Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSA- MENTO DE SANGUE", 7 REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE PATENTE CORRELATOS Este pedido reivindica prioridade dos benefícios do pedido pro- visório US nº 61/140.196, depositado em 23 de dezembro de 2008, estando o conteúdo do mesmo aqui incorporado a título de referência, em sua totali- dade

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos e aparelhos para o processamento de sangue e, mais particularmente, a mé- todos e dispositivos para leucaférese.

ANTECEDENTES ' As células sanguíneas são produzidas continuamente ao tongo 3 da vida de um indivíduo e são derivadas de células sanguíneas mais primiti- vas,as assim chamadas células-tronco hematopoiéticas (HSC). Estas célu- las-tronco hematopoiéticas são capazes de produzir células progenitoras hematopoiéticas (HPC) e células sanguíneas de vários tipos celulares (por exemplo, eritrócitos (RBC) e leucócitos, ou glóbulos brancos (WBC)) e po- dem ser encontradas na medula óssea. Os tipos de célula sanguínea mais maduros são encontrados no sangue e no tecido linfático. Hematopoiese é a produção contínua de células sanguíneas no indivíduo a partir de células- tronco hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas. Isto faz com que o sangue periférico tenha diversos tipos diferentes de células sanguí- neas de várias linhagens mieloides e linfoides, e com vários graus de matu- ridade. Estas células sanguíneas são responsáveis por processos fisiológi- cos como transporte de oxigênio através dos eritrócitos, função imune atra- vés das células dendríticas, e linfócitos B e T, e resposta inflamatória através de granulócitos e macrófogos. A aférese é um procedimento médico em que o sangue de um indivíduo é passado através de um aparelho, produzindo um constituinte predominante (por exemplo, células mononucleares), e retornando os outros constituintes à circulação. A aférese é, em geral, um processo em três eta-

- pas que compreende: (1) retirar sangue de um indivíduo, (2) separar os componentes do sangue (por exemplo, com base na densidade), e (3) retor- 7 nar certo(s) componente(s) do sangue ao indivíduo. O sangue é normalmen- te separado em três frações: células vermelhas do sangue (cerca de 45% de todoo sangue), "creme leucocitário” (menor que 1% de todo o sangue) e plasma (cerca de 55% de todo o sangue). Diversos tipos de procedimentos de aférese podem ser usados, dependendo do componente do sangue que está sendo removido. Por exemplo, "plasmaferese" geralmente refere-se à separação e coleta de plasma sanguíneo e "trombocitaferese" refere-se à separação e coleta de plaquetas, enquanto "leucaférese" geralmente refere- se à separação e coleta de leucócitos (WBC).

Com o avanço das ciências médicas, a aférese pode ser exe- ' cutada de uma maneira conectada ao paciente, em um circuito fechado e . com fluxo contínuo. Os dispositivos usados para este propósito incluem, por exemplo, os seguintes sistemas de aférese: sistemas COBEG Spectra, Tri- ma, e Spectra Optia (todos comercializados pela Gambro BCT) e o Amicus e CS-3000+ (comercializados pela Fenwal/Baxter). Recentemente, a leucaférese também está sendo utilizada pa- ra a coleta de uma certa fração de células sanguíneas mononucleares (MNC) para o uso em transplantes de medula óssea e outras áreas de tra- tamento de doenças. Por exemplo, pacientes que foram extirpados para o tratamento de uma malignidade podem ser infundidos com uma população a granel de células mononucleares de um doador que contém células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas (estas presentes no sangue periférico, também chamadas de células progenitoras de sangue periférico, ou PBPC), para afetar a reconstituição subsequente de seu siste- ma hematopoiético. Neste caso, o creme leucocitário (contendo em sua mai- oria glóbulos brancos (granulócitos, linfócitos, monócitos), células progenito- ras de sangue periférico e algumas plaquetas) é coletado primeiro enquanto orestantedos componentes do sangue (incluindo plasma, células vermelhas do sangue, plaquetas e alguns glóbulos brancos) retorna ao indivíduo. As PBPC são então enriquecidas e isoladas, enquanto a fração restante do

- creme leucocitário (constituindo quase 99% do creme leucocitário) é descar- tada. Este processo de enriquecimento celular (isto é, isolamento e purifica- ' ção celular) é atualmente executado de uma maneira desconectada do paci- ente, com o uso de dispositivos separados daqueles das máquinas de afére- se.Os dispositivos usados para este propósito incluem, por exemplo, o Bax- ter Isolex 300i e o Miltenyi CIiniMACS, que enriquecem as células progenito- ras de sangue periférico com base em um ligante específico (CD34, ambos dispositivos e CD133 Miltenyi) na superfície das células. Outros dispositivos autônomos, como o processador de células sanguíneas Gambro COBE 2991 0ouo sistema de lavagem de células Baxter CytoMate"" são frequen- temente usados para lavar, concentrar, ou colocar as células em um meio de crescimento ou infusão adequado.

] Em uma aplicação adicional, leucaférese pode ser usada para tratar os glóbulos brancos de um indivíduo, em um processo chamado foto- ferese (Edelson et al., Yale J Biol Med., novembro-dezembro de 1989, 62(6): 565-77). Neste processo, o indivíduo primeiro recebe uma dose de substân- cia fotoativável (por exemplo, 8 metóxi-psoraleno). Então, a aférese é execu- tada onde os glóbulos brancos do indivíduo são irradiados com luz ultraviole- ta A (UVA), resultando na ativação da substância e inibição dos processos metabólicos dos glóbulos brancos. Os dispositivos usados para este propósi- to incluem, por exemplo, o sistema de fotoferese UVAR AND UVARO XTS'"“(comercializado pela Therakos). Em adição ao processo de enriquecimento descrito acima, as células progenitoras de sangue periférico coletadas podem, também, ser modificadas em processos adicionais antes da reinfusão de volta ao indiví- duo. Isto é, em geral, afetado pelo uso de uma variedade de técnicas de cul- tura celular. Basicamente, as células modificadas (por exemplo, com um fe- nótipo, genótipo ou atividade alterada) podem ser reintroduzidas no paciente para certos benefícios terapêuticos. Exemplos de processos de modificação incluem a produção de células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas contendo um gene anti-HIV (R. G. Amado. et al., "Human Gene Therapy" 15 (2004), 251 a 262) e a produção de linfócitos T citotóxicos

“educados ' para retornar e matar tumores específicos.

A figura 1 é um diagrama de blocos ilustrando os meios atuais através dos quais sangue é removido de um paciente, processado e retor- nado. Aqui, uma disposição 100 de dispositivos que pode ser usada sequen- cialmente para coleta de células empregando leucaférese e técnicas de en- riquecimento celular, como através do uso de lavagem e purificação celular. O diagrama também lista modificações celulares opcionais. Os dispositivos exemplificadores que podem ser usados neste método incluem o dispositivo Cobe Spectra. Tal dispositivo 110 para leucaférese (coleta), é usado se- quencialmente com um dispositivo de lavagem celular, como um dispositivo 120 (de enriquecimento) Baxter CytoMate, que é adicionalmente usado com um dispositivo de purificação (enriquecimento) celular 130, como um disposi- tivo Baxter Isolex 300i. Além disso, dispositivos de manipulação (modifica- ção) celular 140 podem ser empregados neste esquema e incluem, mas não se limitam a: eletroporação, lipofecção, transdução viral, luz (UVA, UVB, etc.), adição de fármacos, ativação celular, pressão, funções de aquecimen- to, etc. A bolsa 150 de células sanguíneas processadas produzida conforme a saída dos dispositivos 110, 120, 130 e 140 é fornecida ao paciente 160 para retorno do sangue processado.

A figura 2 apresenta um exemplo específico de um método 300 para coleta, enriquecimento e modificação de células. O exemplo é de um método usado para a introdução de um gene anti-HIV nas células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas CD34+, onde ao lon- go de um período de 5 dias: Na etapa 310, células mononucleares são coletadas, isto é, co- lhidas por leucaférese. Nesta etapa 310, outros componentes de célula san- guínea, isto é eritrócitos, plaquetas, plasma e células polimorfonucleares, são devolvidos ao paciente.

Na etapa 320, a fração de células mononucleares é lavada usando-se, por exemplo, uma CytoMate (mencionado acima) (dia 2), tendo como alvo células CD34+ que são enriquecidas usando-se, por exemplo, um dispositivo Isolex 300i (dia 2), e células não CD34+ são descartadas.

. Na etapa 330, as células CD34+ são cultivadas na presença de citoquinas (dia 2), e o gene anti-HIV (uma ribozima contra uma região con- 7 servada do gene tatívpr) é introduzido usando-se um retrovírus murina (dia 4). Após a etapa 330, o teste de liberação do produto é realizado (dia 5), e as células são introduzidas no mesmo indivíduo, que foi original- mente leucaferesado.

Entretanto, a aférese tem desvantagens e limitações inerentes.

Por exemplo, a aférese é apenas um procedimento de coleta de constituin- tes fluidos.

Apesar dos avanços tecnológicos, as etapas compostas de cole- ta, enriquecimento e modificação (opcional) das células sanguíneas-alvo são conduzidas usando-se dispositivos separados contínuos e descontínuos, ' conforme mencionado acima.

Destas etapas, apenas a coleta e, em alguns - casos, a coleta e a modificação (fotoferese) são atualmente conectadas ao paciente.

Estes processos descontínuos atuais são demorados e são inefici- entes quanto aos materiais, trabalho e custos (J.

Gryn et al., "Joumal of He- matotherapy & Stem Cell Research", 11 (2002), 719 a 730, KR.

Meehan et al., "Joumal of Hematotherapy & Stem Ceil Research" 9 (2000), 767 a 771). Estes processos também introduzem sérias preocupações como (1) seguran- çadevidoà contaminação microbiana potencial e (ii) cadeia de custódia (isto é, se assegurar de que as células corretas retornam ao paciente e mantém a integridade das células) devido à logística da seleção e modificação celular.

Por exemplo, hemólise é uma complicação rara devido a torções nas linhas dos kits de coleta da aférese (R.

Reddy, "Transfusion and Apheresis Scien- ce" 32(2005)63a72). Para ilustrar adicionalmente, trombocitopenia (depleção das plaquetas) é um resultado indesejado bem-conhecido da leucaférese e o efeito secundário mais frequentemente relatado da leucaférese em crianças (J.

Sevilla et al., "Transfusion and Apheresis Science", 31 (2004) 221 a 231, E Yamaguchi et al, "Joumal of Hematotherapy & Stem Cell Research", 9 (2000) 565 a 572). A trombocitopenia é importante, pois pacientes são fre- quentemente trombocitopênicos devido a suas doenças subjacentes e há

. uma perda adicional de plaquetas durante a leucaférese. Idealmente, em indivíduos com uma deficiência no número de plaquetas devido a certos es- 7 tados doentios, as plaquetas aferesadas dentro do creme leucocitário devem ser separadas e devolvidas ao indivíduo. Na realidade, entretanto, as pla- quetas aferesadas são simplesmente descartadas como dejetos. Apesar disso, a redução das plaquetas no creme leucocitário tem, também, o bene- fício adicional de aumentar a eficiência da seleção de imunoafinidade das células progenitoras CD34+ (um tipo de célula progenitora de sangue perifé- rico) através de uma dobra 1,8 (R. Moog, "Transfusion and Apheresis Scien- ce"31(2004)207a220).

Outra desvantagem do processo de leucaférese é a perda de linfócitos valiosos para alguns pacientes. Conforme discutido acima, células- ' tronco hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas (em particu- . lar células progenitoras CD34+) são frequentemente selecionadas para uso para afetar a reconstituição do sistema hematopoiético de um indivíduo. Pa- ra indivíduos infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), a seleção das células progenitoras CD34+ através do uso da leucaférese |li- vram seus corpos de linfócitos valiosos (como células CD3+ e CD4+), que frequentemente já estão em números baixos. As células progenitoras CD34+ —cercade 1,3% após mobilização — estão entre as menores frações de célu- la coletadas durante a leucaférese das células progenitoras de sangue peri- férico, considerando uma contagem de linfócitos e monócitos de até 70% dos produtos da aférese (V. Witt et at, "Joumal of Clinical Apheresis", 16 (2001), 161 a 168).

Existe a necessidade por um dispositivo que pode superar ou pelo menos melhorar uma ou mais desvantagens dos sistemas existentes, inclusive aqueles mencionados acima.

SUMÁRIO De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um apare- lhoparao processamento de sangue. O aparelho compreende: uma interfa- ce de entrada para acoplamento com um paciente para receber sangue dire- tamente da circulação do paciente, um módulo de leucaférese acoplado à

. interface de entrada para coleta a grane! de células sanguíneas mononucle- ares do sangue recebido, um módulo de enriquecimento acoplado ao módu- " lo de leucaférese para enriquecer simultaneamente células-alvo separadas de células não alvo no volume de células sanguíneas mononucleares, uma interface de saída acoplada a pelo menos um dentre o módulo de leucafére- se e o módulo de enriquecimento, para acoplamento com o paciente para devolver células-alvo enriquecidas à circulação do paciente, o aparelho e o paciente formando um circuito fechado quando acoplados juntos, e um con- trolador para controle automatizado da operação das interfaces de entrada e saída, do módulo de leucaférese, e do módulo de enriquecimento.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é apresentado um método de processamento de sangue. O método compreende as etapas ] de: obtenção de sangue de um paciente acoplado a um único dispositivo de . processamento sanguíneo para formar um circuito fechado entre o paciente eodispositivo de processamento sanguíneo, coleta a granel de células san- guineas mononucleares a partir do sangue por leucaférese, implementada através do uso do dispositivo de processamento sanguíneo no circuito fe- chado, e enriquecer simultaneamente células-alvo separadas de células não alvo no volume de células sanguíneas mononucleares usando-se o dispositi- vode processamento sanguíneo no circuito fechado.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um sistema para processamento de sangue. O sistema compreende: um mecanismo para obtenção de sangue a partir de um paciente e compreende um único dispositivo de processamento sanguíneo acoplado aos meios de obtençãoe ao paciente, para formar um circuito fechado entre o paciente e o dispositivo de processamento sanguíneo. O dispositivo de processamento sanguíneo compreende: um módulo para coleta a granel de células sanguíi- neas mononucleares a partir do sangue por leucaférese, implementada u- sando-se o dispositivo de processamento sanguíneo no circuito fechado, e um módulo para enriquecer simultaneamente células-alvo separadas de cé- lulas não alvo no volume de células sanguíneas mononucleares, usando-se o dispositivo de processamento sanguíneo no circuito fechado.

. Estes e outros aspectos da invenção são demonstrados em maiores detalhes deste ponto em diante no presente documento. 1 BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As modalidades da invenção são descritas deste ponto em di- anteno presente documento com referência aos desenhos, onde:

a figura 1 é um diagrama de blocos de dispositivos para coleta de células por leucaférese e enriquecimento usando-se lavagem e purifica- ção de células,

a figura 2 é um diagrama esquemático representando um e-

xemplo específico de um método atual para coleta, enriquecimento e modifi- cação de células,

a figura 3 é um diagrama de fluxo de um método de processa-

' mento de células sanguíneas de acordo com uma modalidade da invenção, - a figura 4 é um diagrama esquemático representando coleta, enriquecimento das células-alvo e retorno das células não alvo concomitan- tes,

a figura 5 é um diagrama esquemático representando coleta, enriquecimento das células-alvo e retorno das células-alvo concomitantes,

A figura 6 é um diagrama esquemático representando um mé-

todode coleta a partir de um paciente, enriquecimento das células-alvo, mo- dificação das células-alvo, e retorno das células-alvo ao paciente concomi- tantes,

A figura 7 é um diagrama esquemático de um dispositivo reali- zando a coleta e o enriquecimento, de acordo com uma modalidade da pre-

sente invenção.

Os símbolos representam os seguintes componentes: bolsa de solução salina, D, bomba peristáltica, “O, garra, I , detector de ar, = medidor de pressão, 3), garra, OO,

a figura 8 é um diagrama esquemático de um dispositivo reali-

zando a coleta, enriquecimento e modificação, de acordo com outra modali-

dadeda presente invenção.

Os símbolos representam os seguintes compo- nentes: bolsa de solução salina, O, bomba peristáltica, “O, garra, I , de- tector de ar, =, medidor de pressão, [—), garra, &,

. a figura 9 é uma vista em perspectiva dos elementos do dispo- sitivo de processamento de sangue que compreende unidades ou módulos ] de coleta, enriquecimento e modificação (opcional), a figura 10 é uma vista em perspectiva dos elementos do dis- positivo de processamento de sangue, segundo o dispositivo da figura 9, mas destacando o módulo/processo de enriquecimento celular, a figura 11 é uma vista em perspectiva dos elementos do dis- positivo de processamento de sangue, segundo o disposítivo da figura 9 ou 10, mas destacando a etapa de modificação celular opcional dentro do dis- positivo,e a figura 12 é um diagrama esquemático de um disposiítivo reali- zando a coleta e enriquecimento, de acordo com mais uma outra modalidade : da presente invenção. Os símbolos representam os seguintes componentes: - bolsa de solução salina, O, bomba peristáltica, “OQ, garra, I , detector de ar, em, medidor de pressão, El, garra, ÉS, ima, EEE.

DESCRIÇÃO DETALHADA Métodos, aparelhos e sistemas para o processamento de célu- las sanguíneas são descritos deste ponto em diante no presente documento. Em particular, métodos, aparelhos e sistemas são apresentados para leuca- férese, que permite que a coleta e enriquecimento concomitantes de células- alvo específicas do sangue periférico de um indivíduo e o restante dos com- ponentes do sangue são devolvidos ao indivíduo. Adicionalmente, as célu- las-alvo coletadas podem ser modificadas e devolvidas ao indivíduo durante o processo de aférese, ou podem ser devolvidas ao indivíduo mais tarde. As modalidades da invenção referem-se a um dispositivo de circuito fechado que permite a coleta e enriquecimento concomitantes de células-alvo especí- ficas a partir do sangue periférico de um indivíduo e devolução de células não alvo ao indivíduo. As células-alvo podem ser modificadas para alterar seu fenótipo, genótipo ou atividade e, em uma extensão do circuito fechado, devolvidas ao indivíduo. As modalidades da invenção executam eficiente- mente o processo de aférese de uma maneira conectada ao paciente, em circuito fechado e de fluxo contínuo, de modo que apenas componentes-alvo

. do sangue (por exemplo, células progenitoras CD34+) são enriquecidos en- quanto todos os outros componentes restantes são devolvidos ao paciente. ' Adicionalmente, certas outras funções podem ser executadas nas células- alvo (por exemplo, modificação do fenótipo) com a opção de retorno das cé- lulas modificadas ao paciente. A produção de tal dispositivo pode reduzir significativamente os custos operacionais (nenhuma necessidade de múlti- plos aparelhos e consumíveis) e assegura uma consistência do produto. Permitindo que o procedimento de aférese ocorra em um único local, em um único dispositivo, também reduz o risco de dano ou perda do produto.

Entretanto, a partir desta descrição, ficará evidente aos versa- dos na técnica que modificações e/ou substituições podem ser feitas sem se desviar do escopo e do espírito da invenção.

' Definições : [Temo = eeinição = | Volume de Célula Mononuclear | A população a granel de células mononuclea- res, coletada por leucaférese. Também cha- mado de Volume da População de Célula Mo- nonuclear.

Captura O isolamento de um tipo ou tipos celulares específicos, a partir de uma mistura de células através de uma interação específica (por e- xemplo, física ou química) (por exemplo, anti- corpo-antígeno ou outras interações conforme descrito na presente invenção). Isto pode ser feito através de um sistema de captura de cé- lula.

Processamento Celular Todas as etapas (algumas das quais podendo ser opcionais) que envolvem coleta, enrique- cimento, modificação e armazenamento de células. As células podem ser usadas fora da estrutura para pesquisa, monitoramento ou descarte, ou elas podem ser posteriormente infundidas a um indivíduo(s).

Circuito fechado Pelo menos uma subseção de células é man- tida em um sistema que é contínuo, de tal mo- do que as células são derivadas do paciente e podem retornar ao paciente sem serem movi- das fora de linha.

o ema petição Cluster de Designação (CD) Sistema de classificação para anticorpos mo- . noclonais gerados por laboratórios no mundo todo contra, inicialmente, moléculas de super- fície celular em leucócitos, e agora também antígenos de outros tipos de célula.

Concomitantes Partes do mesmo processo em tempo real, ocorrendo em tempo real, elas podem ser se- quenciais ou simultâneas.

Parte de um circuito fechado.

Fluxo contínuo O fluxo de sangue do paciente ao dispositivo e de volta ao paciente, onde células não alvo geralmente retomam ao paciente, desde que células-alvo possam ser coletadas, possam fluir através de um sistema de enriquecimento 1 no dispositivo, possam ser modificadas por um sistema de modificação no dispositivo e, en- . tão, retornar ao paciente, tudo de uma maneira conectada ao paciente, em circuito fechado e em tempo real.

Sistema de Fluxo Contínuo A trajetória do fluido e os controles de enge- nharia que permitem um fluxo contínuo.

Centrifugação Diferencial Centrifugação usada para separar uma popu- lação a granel de células com base no tama- nho e densidade.

Que não é parte de um circuito fechado.

Enriquecer A concentração do tipo de célula-alvo através de meios físicos ou químicos, isto pode abran- ger lavagem, isolamento ou purificação.

Uma parte/requisito importante. O processo de extração (por exemplo, por captura) de um tipo ou tipos de célula específi- cos a partir de uma mistura de células.

Leucaférese Um processo de fluxo contínuo onde sangue é retirado de um doador e uma população a gra- nel de células mononucleares é coletada, e o restante dos componentes do sangue (plasma, plaquetas, eritrócitos e células polimorfonucle- ares) é devolvido ao doador.

rem petição Ligante Qualquer molécula (por exemplo, um anticor- . po) que se liga à outra (por exemplo, um re- ceptor). Determinação de parâmetros de processo (por exemplo, em tempo real ou posterior) por e- xemplo, medição do número de um tipo celular específico (por exemplo, CD34) sendo captu- rado. Células não alvo Estas são as células restantes após o enrique- cimento das células-alvo da coleta a granel de células mononucieares, que foram coletadas por leucaférese. Modificação A alteração do fenótipo, genótipo ou atividade da célula, também chamado, em alguns casos, ' de manipulação. Conectado ao paciente Isto refere-se a quando o dispositivo está co- ' nectado ao paciente. O paciente pode estar conectado ao dispositivo durante todo o perío- do de coleta de células sanguíneas e enrique- ! cimento, e moditicação celular em potencia. C ' fluxo de sangue vai do paciente ao dispositivc ' 1 e de volta ao paciente, onde células não alvc ' geralmente retomam ao paciente, desde que ! f células-alvo possam ser coletadas, possam ' fluir através de um sistema de enriquecimentc , no dispositivo, possam ser modificadas por um . ' sistema de modificação no dispositivo e, en ' tão, retornar ao paciente, tudo dentro de um circuito fechado.

Desconectado do Paciente Etapas do processamento celular que ocorrem quando o paciente está desconectado do dis- positivo.

' Pureza A porcentagem de um tipo celular específicc na população celular.

Tempo Real Conforme está ocorrendo.

' Monitoramento em Tempo Real | Determinação dos parâmetros de processc ' conforme eles ocorrem, por exemplo, mediçãc ' do número de um tipo celular específico (poi exemplo, CD34) sendo capturado.

o remo peinição = === | Liberação O processo de separação (por exemplo, física . ou química) da célula do sistema de captura.

Dispositivo igual Um dispositivo em que múltiplas funções po- dem ser realizadas.

Célula-Alvo O tipo ou tipos de célula enriquecidos a partir da população a granel de células mononuclea- res coletada pela leucaférese. O tipo (ou tipos) de célula-alvo é enriquecido para subsequente descarte ou para uso subsequente, o que po- de incluir modificação e reinfusão no indivíduo. Entende-se que o tipo de célula sanguínea- alvo que é enriquecido pode abranger um ou mais tipos de célula. Também chamado aqui de Tipo de Célula-Alvo ou População de Célu- - la-Alvo. Dispositivos multifuncionais e métodos de uso dos mesmos, Ú que estão em circuito fechado, podem ser conectados ao paciente e com- preender os seguintes aspectos: a) Coleta: realização da coleta por leucaférese de uma popula- çãoa granel de células sanguíneas mononucleares, que contém a popula- ção de células-alvo de interesse, e concomitantemente b) Enriquecimento: enriquecer uma população de células-alvo a partir da população a granel de células sanguíneas mononucleares A população de células-alvo enriquecida é ou devolvida ao pa- ciente, ou removida para uso subsequente fora de linha, incluindo modifica- ções que podem envolver a infusão subsequente de células modificadas ao paciente. O uso fora de linha da população de células-alvo pode incluir uso para pesquisa e monitoramento. A população de células não alvo pode ser devolvida concomitantemente ao paciente, removida fora de linha para uso, ou opcionalmente descartada. O método pode, adicionalmente, em uma ex- tensão do processo em circuito fechado, modificar a população de células sanguíneas-alvo antes do retorno da população de células sanguíneas-alvo modificadas ao paciente. A figura 3 representa, em um nível alto, um método 300 de processamento de sangue que compreende as etapas 310-316 e 330 (indi-

. cadas por caixas contendo linhas contínuas). Embora não representado na figura 3, as etapas 312-316 podem ser executadas repetidamente. O método ' 300 pode, opcionalmente, compreender uma ou mais das etapas 320-326 (indicadas por caixas tendo linhas tracejadas na figura 3). De modo seme- lhante, uma ou mais destas etapas 320-326 podem ser realizadas repetida- mente (não mostrado na figura 3). Enquanto as etapas do método 300 são mostradas como sendo realizadas sequencialmente e em uma ordem em particular, o método 300 não se limita a uma sequência, processamento se- quencial, ou todas as etapas, algumas das quais sendo opcionais, em parti- cular sendo realizadas. Os versados na técnica compreenderão que à luz desta descrição a ordem das etapas pode ser alterada. Adicionalmente, uma ou mais etapas podem ser realizadas em paralelo. Por exemplo, as etapas ] 312 a 316 podem ser realizadas em paralelo. Ainda mais adicionalmente, a , etapa 326 pode ser realizada em paralelo com as etapas 314 e 316. O mé- todo 300 de processamento de sangue é descrito em maiores detalhes deste ponto em diante no presente documento.

O processamento começa na etapa 310. Na etapa 312, sangue é obtido a partir de um paciente acoplado a um único dispositivo de proces- samento de sangue, para formar um circuito fechado entre o paciente e o dispositivo de processamento sanguíneo.

Na etapa 314, células sanguíneas mononucleares a granel são coletadas do sangue por leucaférese, implementada usando-se o dispositivo de processamento de sangue no circuito fechado. A etapa de coleta 314 compreende adicionalmente o uso de centrifugação diferencial para coletar as células sanguíneas mononucleares. A centrifugação diferencial pode ser conduzida por um sistema de fluxo contínuo.

Na etapa 316, as células-alvo separadas de células não alvo no volume de células sanguíneas mononucleares são enriquecidas concomi- tantemente, usando-se o dispositivo de processamento de sangue no circui- tofechado. As células-alvo podem ser células B, células T, células dendríti- cas, monócitos, neutrófilos, células assassinas naturais (NK), células T regu- ladoras, células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos (CTLs), células-tronco

- hematopoiéticas (HSCs), células progenitoras hematopoiéticas, células en- doteliais, células epiteliais, células mesenquimatosas, linfócitos, células as- ' sassinas ativadas por linfocina (LAKs), ou linfócitos infiltrantes de tumores (TILs). As células T podem ser enriquecidas.

As células T podem ser CD8+ ou CD4+. As células progenitoras hematopoiéticas e as células-tronco he- matopoiéticas podem ser enriquecidas.

As células-tronco hematopoiéticas e as células progenitoras hematopoiéticas podem ser positivas para um ou mais dentre CD34, CD133 e CD143. Alternativamente, as células-alvo po- dem ser pelo menos uma dentre células malignas do sangue, células malig- nas do tecido, células infectadas com vírus, células infectadas com bacté- rias, pelo menos um vírus, pelo menos uma bactéria, um parasita, células fetais, e células efetoras patogênicas. : A etapa de enriquecimento 316 compreende adicionalmente - captura de um ligante para enriquecer as células-alvo.

O ligante pode ser um anticorpo específico para um ligante de superfície celular.

O ligante de su- perfície celular pode ser uma molécula de adesão de célula epitelial (Ep- CAM), uma selectina, um receptor de molécula de adesão, um receptor de retorno, um receptor de citocina, um receptor de quimiocina, ou uma enzima.

O ligante de superfície celular pode ser um antígeno de cluster de designa- ção (CD) O antígeno de CD pode ser CD1a, CD4, CD8, CD14, CD25, CD34, CD133, ou CD143. O enriquecimento da célula-alvo na etapa 316 pode ser afetado por pelo menos um dentre magnéticos, separação de célu- la ativada por fluorescentes, microfluídicas, suporte sólido, acústicas, biolu- minescência, classificação de anticorpos, e substrato enzimático.

O suporte sólido compreende adicionalmente uma partícula.

A partícula pode ser pelo menos uma dentre uma partícula magnética e uma partícula de densidade modificada.

As etapas de coleta e enriquecimento 314, 316 podem ser rea- lizadas em seções diferentes do dispositivo de processamento de sangue.

Na etapa 320, as células-alvo enriquecidas podem ser modifi- cadas.

A etapa de modificação 320 pode envolver modificação, que compre- ende um ou mais dentre ativação, expansão, indução de apoptose, modifi-

- cação de genes, e indução de especificidade antígeno. A etapa de modifica- ção 320 pode envolver modificação, que é afetada por pelo menos um den- : tre receptores de superfície celular reticulados, irradiação, e tratamento com pelo menos um dentre citocinas, quimiocina, estimulação antígeno, hormô- mnios, fármacos, pressão, e aquecimento. A irradiação pode ser pelo menos uma dentre gama, beta, alfa e radiação de luz. A radiação de luz pode ser pelo menos uma dentre ultravioleta A (UVA), ultravioleta B (UVB), e luz visí- vel. Alternativamente, a etapa de modificação 320 pode envolver modifica- ção genética, que é afetada por transfecção e transdução do material gené- tico em pelo menos uma porção das células-alvo. A transfecção do material genético pode ser feita por meio de eletroporação e lipofecção. A transdução do material genético pode ser feita através de transdução por vetor viral. Em ainda outra alternativa, a etapa de modificação 320 pode envolver uma mo- . dificação que compreende pelo menos uma dentre ativação por linfócito T citotóxico (CTL), ativação por célula reguladora T (Treg), e células sanguí- neas geneticamente modificadas protegidas do vírus da imunodeficiência humana (HIV).

Na etapa 322, células não alvo podem ser modificadas. Adicio- nalmente, na etapa 324, as células não alvo podem ser devolvidas ao paci- ente As células não alvo podem ser devolvidas ao paciente conectado ao circuito fechado, ou desconectado do circuito fechado. Ainda mais adicio- nalmente, as células não alvo podem ser descartadas.

Na etapa 326, as etapas de coleta e enriquecimento podem ser monitoradas concomitantemente para um número celular. Isto permitiria que a coletafosse completada tão logo células suficientes tivessem sido coleta- das e enriquecidas, permitindo que a coleta fosse ajustada ao paciente.

O método compreende adicionalmente manutenção de uma conexão contínua do paciente ao circuito fechado, durante o processamento das células-alvo, ou desconexão do paciente do circuito fechado por um in- tervalo de tempo durante o processamento das células-alvo. O processa- mento termina (Fim) na etapa 330. Estes e outros aspectos são descritos com mais detalhes deste ponto em diante no presente documento.

. Coleta e Enriquecimento Celular Concomitantes de Células-Alvo para Uso Fora de Linha Incluindo Modificação ou para Descarte : A figura 4 representa, em um nível alto, um método 400 de co- leta de células 410 do paciente 450, enriquecimento das células-alvo 420 e retorno das células não alvo 452 concomitantes (todos mostrados dentro do círculo 402). As células-alvo enriquecidas 430 podem ser usadas fora de linha para pesquisa/teste 462, 470 ou descarte 482. Alternativamente, as células-alvo enriquecidas 430, 462 são modificadas para infusão 464 das células-alvo no paciente 450 em um momento subsequente. Este aspecto abrange coleta de células 410, enriquecimento das células-alvo 420 e retor- no 452 das células não alvo ao paciente 450 concomitantes, em um circuito fechado. A etapa de coleta por leucaférese 410 produz uma população de Ú células mononucleares. Uma etapa de enriquecimento em linha 420 das cé- - lulas-alvo é realizada. As células não alvo são devolvidas 452 ao paciente

450. As células-alvo enriquecidas 430 podem ser usadas fora de linha e po- dem, opcionalmente, ser modificadas para pesquisa, teste, etc 470, ou infu- são 464 das células-alvo no paciente 450 em um momento posterior. As cé- lulas-alvo 462 podem ser usadas com ou sem modificação. As células po- dem, também, ser descartadas 482. Numa situação onde as células-alvo são modificadas e devolvidas 464 ao paciente, as células não alvo 452 podem não ser necessariamente devolvidas ao paciente 450. O processo 400 de coleta de célula 410, enriquecimento das células-alvo 420 e modificação ce- lular fora de linha concomitantes pode ser repetido quantas vezes for neces- sário, por exemplo, para se alcançar um certo número de células-alvo. O enriquecimento das células-alvo 420 pode ser para um ou vários tipos de célula. A modificação das células-alvo pode ser para um ou vários tipos de célula. O circuito fechado está conectado ao paciente 450 nos momentos de coleta das células 410 e retorno das células 452. Coleta de Células e Enriquecimento de Células-Alvo Concomitantes para Retorno com células não alvo Usadas Fora de Linha ou Descartadas A figura 5 representa, em um nível alto, um método 500 de co- leta de células 510 de um paciente 550, enriquecimento das células-alvo 520

. e retorno das células-alvo 552 ao paciente 550 concomitantes.

As células não alvo enriquecidas 530 são então usadas fora de linha, com ou sem mo- ' dificação, para pesquisa/teste 562, 570 ou são descartadas 582. Novamen- te, a etapa de coleta por leucaférese 510 produz uma população de células mononucleares.

A etapa de enriquecimento em linha 520 das células-alvo é realizada.

As células-alvo 552 são devolvidas ao paciente 550. Este aspecto abrange coleta de células 510, enriquecimento 520 das células-alvo e retor- no 552 das células-alvo ao paciente 550 concomitantes.

As células não alvo 562 podem ser usadas fora de linha para pesquisa, teste, etc 570 (ou com ousem uma etapa de modificação) ou são descartadas 582. O circuito fe- chado está conectado ao paciente 550 nos momentos de coleta das células 510 e retorno das células 552. Coleta de Células, Enriquecimento e Modificação das Células-Alvo Concomi- - tantes A figura 6 representa, em um nível alto, um método 600 de co- leta de células 610 de um paciente 650, enriquecimento 620 das células- alvo, modificação 660 das células-alvo 630, e retorno das células-alvo modi- ficadas 670 ao paciente 650 concomitantes.

As células não alvo 652 podem, também, ser devolvidas ao paciente 650. Este aspecto circunda coleta de células610, enriquecimento 620 das células-alvo, modificação 660 das célu- las-alvo e retorno das células-alvo 670 ao paciente 650 concomitantes, em um procedimento de circuito fechado.

As células não alvo 652 podem, op- cionalmente, ser devolvidas ao paciente.

O circuito fechado está conectado ao paciente 650 nos momentos de coleta das células 610 e retorno das célu- las652,670. Coleta de Células Uma modalidade da invenção compreende coleta de células e enriquecimento celular concomitantes.

A coleta é a coleta por leucaférese de células sanguíneas mononucleares a granel, as células a partir das quais células sanguíneas-alvo são enriquecidas.

Esta etapa pode empregar qual- quer método conhecido na técnica para a obtenção de células mononuclea- res de um paciente, incluindo, sem limitação, o uso de centrifugação diferen-

. cial.

Dispositivos para este propósito incluem os sistemas COBEG Spectra e Trima Spectra Optia (todos comercializados pela Gambro BCT) e o Amicus 7 ou o CS-300 (comercializados pela Fenwal/Baxter) Gambro Cobe Spectra ou Optia, Fenwal Amicus ou CS-3000. De preferência, a centrifugação diferen- cialé conduzida por um sistema de fluxo contínuo.

Em uma modalidade pre- ferencial, esta coleta de células sanguíneas a granel usa a tecnologia Thera- kos CellEx, devido à sua eficiência de coleta superior e baixo volume extra- corpóreo, em comparação com outros dispositivos, que inclui os dispositivos mencionados acima.

Durante a leucaférese, a população de células não mo-

—nonucleares é reinfundida no indivíduo.

A figura 9 ilustra o dispositivo de processamento de sangue, de acordo com uma modalidade da invenção.

O paciente 940 é acoplado ao ' dispositivo 900 para formar um circuito fechado com um cateter de entrada . 950 acoplado ao paciente 950, para fornecer sangue à entrada do dispositi- vo900e um cateter de saída 952 como uma trajetória de retorno do disposi- tivo 900 ao paciente.

O dispositivo 900 tem uma interface de entrada para receber sangue diretamente da circulação do paciente.

O dispositivo 900 tem, também, uma interface de saída para devolver as células-alvo e/ou cé- lulas não alvo enriquecidas à circulação do paciente.

O dispositivo 900 e o paciente formam um circuito fechado quando acoplados juntos.

O dispositivo 900 inclui uma unidade de coleta por leucaférese 910 e uma unidade de en- riquecimento 920. A unidade ou módulo de coleta (por leucaférese) 910 cole- ta células sanguíneas mononucleares a granel a partir do sangue recebido.

A unidade ou módulo de enriquecimento 920 enriquece concomitantemente as células-alvo separadas das células não alvo no volume de células san- guíneas mononucleares.

O dispositivo 900 tem uma interface de operação 960 para recepção de entradas e para fornecer saídas para um operador (não mostrado). O dispositivo 900 compreende, também, um console de bombas / válvulas 964. O dispositivo 900 pode, também, compreender uma unidade de modificação opcional 930. O dispositivo 900 compreende uma centrífuga 962 para o processamento de células sanguíneas, conforme ex- plicado deste ponto em diante no presente documento.

Um controlador (não

- mostrado) é acoplado à interface de operação 960 e aos outros módulos para controle automatizado da operação do dispositivo 900. 7 No sistema Therakos CellEx, uma cuba de centrífuga, como, por exemplo, uma cuba Latham, conforme mostrado na patente U.S. nº

4.303.193, concedida a Latham, Jr em 1 de dezembro de 1981 e intitulada "Apparatus for separating blood into components thereof', que é aqui incor- porada, por referência, em sua totalidade, separa o sangue em eritrócitos e "creme leucocitário”. A cuba Latham é um componente separador de sangue que tem sido usado por algum tempo no mercado de leucaférese médica, bem como em terapias médicas como fotoferese extracorpórea (ECP). À patente U.S. nº 5984887, "Photopheresis treatment of leukocyte", fornece descrições de fotoferese extracorpórea e seu método de separação e centri- Ú fugação de células.

. A figura 7 é um diagrama esquemático mais detalhado do dis- positivo de processamento de sangue representado na figura 9 (bem como o sistema da figura 10 descrito deste ponto em diante no presente documen- to). O dispositivo de processamento de sangue 700 é mostrado acoplado a um paciente 736 na figura 7. Um nódulo de coleta 702 e um nódulo de retor- no 756 são conectados ao paciente da forma mostrada na figura 9. O nódulo de coleta702 faz parte de uma interface de entrada, incluindo um cateter 704 que está, por sua vez, conectado a um sensor de pressão ("coleta") 720. Em sequência, o sensor de pressão de coleta 720 é acoplado a um detector de ar 722, que está acoplado a uma válvula de coleta 724. A válvula de cole- ta 724 está acoplada a uma bomba peristáltica de "coleta" 726 que, por sua vez, está acoplada ao sensor de pressão da cuba 728. O sensor de pressão 720 afeta a operação da bomba de coleta 726. O sensor de pressão da cuba 728 está acoplado à cuba da centrífuga 730. Uma saída da cuba da centri- fuga 730 está acoplada a uma bomba de eritrócitos (RBC) 732 e um cateter 734 que, por sua vez, está acoplado a uma trajetória de retorno, descrita em maiores detalhes deste ponto em diante no presente documento. Uma bolsa de anticoagulante (AC) 710 é acoplada a uma bom- ba peristáltica de anticoagulante 712 e um cateter adequado. A bomba 712

- está, por sua vez, acoplada a uma válvula 714 que, por sua vez, está aco- plada a um detector de ar 716. O detector de ar 716 está acoplado, através 7 de um cateter adequado, ao cateter de entrada 704 e ao sensor de pressão de coleta 720. Esta disposição permite que um anticoagulante seja aplicado parafornecer sangue ao dispositivo 700 a partir do paciente 736. Outro cateter 770 fornece uma saída da cuba de centrífuga 730 e está acoplado a uma válvula 772. Também acoplado ao cateter 770 está um cateter 782 acoplado a uma válvula 784. Por sua vez, a válvula 784 está acoplada a uma bolsa de retorno 740. A bolsa de retorno 740 está acoplada aum detector de ar 742 que, por sua vez, está acoplado a uma válvula 744. A válvula 744 está, por sua vez, acoplada a uma válvula 798, uma válvula de solução salina 760 que, por sua vez, está acoplada a uma bolsa de solução : salina 762, um cateter 734 e uma bomba de retorno 746. A bolsa de retorno . 740, o detector de ar 742 e a válvula 744 formam uma trajetória de retorno coma bomba de retomo 746. A bomba 746 está acoplada à válvula de re- torno 748, que está acoplada a um detector de ar 750. O detector de ar 750 está acoplado ao sensor de pressão de retorno 752, que está acoplado ao cateter 754 e ao nódulo de retorno 756. A válvula 772 está acoplada a um sensor 788 capaz de detec- tar eritrócitos.

Um cateter 774 também está acoplado à válvula 772 e, por sua vez, está conectado a uma bomba de tamponagem 776. A bomba de tamponagem 776 está acoplada a uma placa 778. A saída da placa 778 está acoplada a um cateter 797 que, por sua vez, está acoplado à válvula 798. A válvula 798 está acoplada à bomba de retorno 746. O sensor HCT 788 está acoplado a válvulas configuradas de modo paralelo 790 e 791. A válvula 790 está acoplada a uma bolsa de coleta 786. A válvula 791 está acoplada à bol- sa de tratamento 737, onde agentes para enriquecimento são adicionados.

A bolsa de tratamento 737 está acoplada à válvula 793 que, por sua vez, está acoplada ao detector de ar 794. O detector de ar 794 está acoplado à válvu- la7oB.

Uma bolsa de seleção de tampão 795 está acoplada a uma válvula 796 que, por sua vez, está acoplada ao detector de ar 794.

- Enriquecimento Celular A figura 10 mostra o dispositivo 900 da figura 9 numerado co- 7 mo dispositivo 1000. O paciente 1040 está acoplado com o dispositivo 1000 em um circuito fechado por um cateter de entrada 1050 e um cateter de saí- da 1052. Nesta modalidade, a população de células mononucleares 1010 está sujeita a enriquecimento 1020, por exemplo, pela captura de partículas revestida com anticorpos, como captura de partículas magnética. A saída de enriquecimento 1020 são as células-alvo enriquecidas 1060, que podem ser devolvidas ao paciente. Além disso, as células não alvo restantes do enri- quecimento 1020 podem ser devolvidas ao paciente 1040 através do dispo- sitivo 1000. As células são enriquecidas para propósitos específicos, que incluem, mas não se limitam a:- ' 1. Eliminação da corrente sanguínea (por exemplo, células de . linfoma, leucêmicas, de mieloma), estes tipos de célula poderiam ser sele- cionados como células a serem eliminadas do sangue e descartadas.

2. Modificação para devolução ao paciente para um benefício positivo, alguns exemplos incluem:- a. induzir uma resposta imunológica através do enriquecimen- to e modificação de células leucêmicas ou células de câncer metastático, b. modificação para gerar linfócitos T citotóxicos direcionados a um câncer específico, e c. modificação das células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas para conter um gene que pode causar um im- pacto em uma doença em progresso, por exemplo, um gene anti-HIV para impactono HIV/AIDS.

3. Uso para pesquisa, teste, etc. que pode incluir uma etapa de modificação opcional. As células-alvo são células que são enriquecidas a partir do sangue periférico após a coleta de células mononucleares a granel. Os tipos de célulasque podem ser enriquecidas a partir do produto a granel de leuca- férese incluem, mas não se limitam a, linfócitos B, linfócitos T, linfócitos T CD4 e CD8, células dendríticas, monócitos, células assassinas naturais

. (NK), células reguladoras T, células auxiliares T, linfócitos T citotóxicos (C- TLs), células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células progenitoras hemato- Í poiéticas, células endoteliais, células epiteliais, células assassinas ativadas por linfocina (LAKs), linfócitos infiltrantes de tumores (TILs), células-tronco e células epiteliais mesenquimais — vide tabela 1 (Fundamental Immunology, por William E.

Paul, 2003, Lippincott Williams &Wilkins ISBN 0781735149, Essential Haematology, por Hoffbrand, Pettit and Moss). Tabela 1 Tipos de Célula que Podem ser Isolados do Sangue Periférico (com marcadores de superfície conhecidos) m Células Progenitoras Hematopoiéticas (CD34*, CD135*) m Células Progenitoras Endoteliais (CD34*, FIk-1*, VEGRF-3", CD133”*) . m Células Estromais da Medula Óssea m Células Progenitoras de Músculos Esqueletais 7 = Células Progenitoras do Músculo Cardíaco m Células Progenitoras Hepáticas (C1g9R,' ou CD34', CD38, CD45*) m Células-Tronco Mesenquimais (CD29*, CD44", SH2*, SH3", e SH4*) m Eritrócitos (CD44, Glycophorin A) m Células Dendríticas (CD11c*, CD123*) = Células T(CD3', CD4”, CD8', CD28*) m Células NK(CD16*, CD57*, CD94', CD96*, CD122') = Células B(CD19*, CD22', CD40', CD72', CD79”) ' m Neutrófilos (CD15', CD128*) = Eosinófilos (CD116º, CD125”) m Basófilos (CD125º) m Monócitos - Macrófagos (CD14*, CD64*, CD68*, CD98*, CD115”, CD163*, FIt-1”) m Megacariócitos/Plaquetas (CD41*, CD42*, CD61*, CD109*) m Mastócitos (FceRla”) m Progenitores de Osteoblasto m Osteoclastos * Isolados do sangue periférico, mas sem marcadores de superfície celu- lar identificados até o momento.

Outros tipos de célula destinados para descarte podem ser qualquer um conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, células de cân-

- cer/leucemia do sangue ou outros tecidos, células infectadas com vírus ou bactérias, vírus ou bactérias ou parasitas, células fetais, ou células efetoras ' patogênicas. Estas células podem ser enriquecidas através do uso de antí- genos superficiais adequados. Estas células podem também ser destinadas à modificação para um propósito 2 acima, isto é, modificação das células e fornecimento das células de volta para afetar uma resposta imunológica te- rapêutica.

Durante a etapa de enriquecimento, mais de um tipo de célula- alvo pode ser enriquecido. O sistema pode enriquecer múltiplos tipos de cé- lulade várias formas, por exemplo, os tipos de célula podem ser enriqueci- dos separadamente em câmaras diferentes do dispositivo (900, 1000 das figuras 9 e 10). Os tipos de célula diferentes podem ser administrados juntos (por exemplo, todos retornam, ou são descartados, ou são modificados) ou . os tipos de célula podem ser administrados separadamente (por exemplo, um conjunto retorna, um conjunto é descartado, um conjunto é modificado ou todos os conjuntos são modificados, mas de formas diferentes) ou varia- ções do procedimento.

O enriquecimento da(s) célula(s)-alvo pode ser para eliminar a célula-alvo do sangue periférico (como em células de leucemia) ou para en- riquecer a uma porcentagem de pureza necessária para uma aplicação tera- pêutica ou para pesquisa/teste, etc.

O enriquecimento da célula-alvo pode ser através de meios químicos ou físicos, por exemplo captura, e as células-alvo são, por exem- plo, isoladas, para serem enriquecidas a partir da população de células san- guíneasa granel. O procedimento de enriquecimento pode empregar um ou mais métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, captura de antígenos, microesferas, magnéticos, separação de células ativada por fluo- rescentes, microfluídicos, suporte sólido, acústica, bioluminescência, classi- ficação de anticorpos, ou substrato enzimático. Suportes sólidos adequados incluem partículas que incluem, sem limitação, partículas ferromagnéticas e de densidade modificada. Estes podem ser obtidos, por exemplo, junto à Miltenyi Biotec and Dynal (Curr Opin Immunol., abril de 1991, 3(2):238 a

- 241). Existem métodos que podem ser usados para a liberação das células capturadas que incluem: i) competição com ligante em excesso, ii) digestão Í enzimática, iii) alteração no pH, iv) mudança na resistência iônica, v) remo- ção do campo magnético, vi) agitação física. O ligante ou ligantes específicos para a população ou popula- ções de células-alvo pode ser qualquer um conhecido na técnica e é, de pre- ferência, um anticorpo específico para um ligante de superfície celular. O ligante de superfície celular pode estar em um antígeno de cluster de desig- nação (CD) incluindo, sem limitação, CD1a, CD4, CD8, CD14, CD25, CD34 e CD133, que geralmente utilizam um anticorpo específico para captu- rar/selecionar a célula-alvo. O ligante de superfície celular pode ser, sem limitação, uma EpCAM (molécula de adesão de célula epitelial), selectina, i receptor de molécula de adesão, receptores de retorno, receptores de citoci- . na, receptores de quimiocina e enzimas incluindo aldeido desidrogenase e outras enzimas intracelulares. Vários marcadores superficiais são indicados na tabela 1.

Como um exemplo, uma forma de se enriquecer as células é através do uso de anticorpos ou aptâmeros. O termo anticorpo refere-se a uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar a um epitopo presente emum antígeno. Para uso na presente invenção, o termo anticorpo refere-se a moléculas de ligação celular. O termo tem por objetivo abranger não ape- nas moléculas de imunoglobulina intactas como anticorpos monocionais e policlonais, mas também anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos anti-idiopáticos (anti-ID), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), proteínas de fusão e quaisquer modificações dos anteriormente mencionados que compreendem um local de reconhecimento de ligante da especificidade necessária. Para uso na presente invenção, um aptâmero é um ácido nucleico ou um peptídeo que não tem ocorrência natural, que tem uma ação desejável em um alvo. Uma ação desejável inclui, mas não se limita a, ligação do alvo, alterar cata- liticamente o alvo, reagir com o alvo de uma forma que modifique/altere o alvo ou a atividade funcional do alvo, se fixar covalentemente ao alvo como

. em um inibidor suicida, facilitar a reação entre o alvo e outra molécula. As células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hema- ' topoiéticas podem ser enriquecidas através de uma variedade de métodos, incluindo uso de marcadores de superfície celular CD34 ou CD133, ou níveis elevados de álcool desidrogenase (ALDH). Em uma modalidade da presente invenção, células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéti- cas CD34+ são enriquecidas e, então, modificadas pela etapa de introdução de um gene anti-HIV. Esta introdução pode ser realizada através de uma variedade de meios, por exemplo, por transdução retroviral.

As células-alvo podem ser devolvidas ao paciente. Em certas condições médicas, pode ser vantajoso ou descartar ou reter para propósitos de diagnóstico/monitoramento as populações de células-alvo. Por exemplo, Ú no processo de diagnóstico desenvolvido pela Immunicon Inc., chamado de . CellSearch?"”, células cancerígenas raras são medidas no sangue através de um sistema de separação por microesferas magnéticas (referência). Este procedimento de coleta em maior escala poderia aumentar a sensibilidade de tal método de diagnóstico. Descartar células cancerígenas-alvo especiífi- cas ou células patogênicas como células Th17 em doenças autoimunes po- de ser benéfico (referência). Finalmente, indução de linfopenia tem sido as- sociadaa um melhor resultado para certas terapias por razões como forne- cimento de espaço para terapia celular (Dudley, ME et.al. Science., 25 de outubro de 2002, 298(5594):850 a 854., Epub 19 de setembro de 2002). As populações de células destinadas para descarte podem ser qualquer uma conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, células malignas do sangue ou outros tecidos, células infectadas com vírus ou bactérias, vírus ou bacté- rias ou parasitas, células fetais, ou células efetoras patogênicas como Th1, Th17, CTL, etc. Este enriquecimento é conduzido e a porcentagem de pure- za necessária para uma aplicação terapêutica é alcançada. Em certos ca- sos, uma porcentagem de enriquecimento específica é necessária (consulte abaixo). No caso de remoção de células patogênicas, por exemplo células de câncer/leucemia, a eficiência de limpeza do sangue é mais importante que a porcentagem de pureza real final. Estas células também podem ser

. destinadas à modificação para um propósito %2 acima.

As duas etapas de coleta e enriquecimento de células são rea- 1 lizadas em um circuito fechado, em um único dispositivo, as etapas podem ser realizadas em seções iguais ou diferentes do dispositivo.

As células não alvo podem ser devolvidas ao paciente ou descartadas, conforme terapeuti- camente recomendado, ou usadas fora de linha para pesquisa/teste.

No ca- so de condições de imunidade comprometidas ou linfopênicas, como HIV, por exemplo, as células não alvo podem ser devolvidas por um sistema em circuito fechado, permitindo o retorno de células essenciais, a perda das quais pode comprometer o paciente.

Em outros casos onde as células não alvo não precisam ser devolvidas ou onde haveria benefício das células não alvo não retornarem, as células não alvo podem ser descartadas ou usadas : fora de linha para outros propósitos.

Tal benefício pode surgir como resulta- . do, por exemplo, de tornar o paciente linfopênico, o que pode melhorar a eficáciade certas terapias celulares (Dudley, ME et.al.

Science., 25 de outu- bro de 2002, 298(5594):850 a 854., Epub 19 de setembro de 2002). Modificação Celular A figura 11 mostra o dispositivo 900 ou 1000 da figura 9 ou 10 renumerado como dispositivo 1100. O paciente 1140 está acoplado com o dispositivo 1100 em um circuito fechado por um cateter de entrada 1150 e um cateter de saída 1152. Nesta modalidade, é fornecida uma etapa de mo- dificação adicional das células-alvo de uma forma em circuito fechado, co- nectada ao paciente.

Esta etapa representa uma extensão do sistema de circuito fechado conectado ao paciente de coleta e enriquecimento de célu- las.

Uma modificação das células-alvo em um sistema de circuito fechado conectado ao paciente pode ser realizada como uma extensão do sistema de circuito fechado conectado ao paciente de coleta e enriquecimento.

Con- forme mostrado na figura 11, as células-alvo enriquecidas 1160 são modifi- cadas em um recipiente 1170 para fornecer células-alvo modificadas 1180. À modificação opcional pode ser qualquer um ou mais dentre eletroporação, lipofecção, transdução viral, luz (ultravioleta A (UVA), ultravioleta B (UVB), etc), adição de fármacos, ativação celular, pressão, aquecimento, etc.

. A figura 8 é um diagrama esquemático mais detalhado do dis- positivo de processamento de sangue representado na figura 11. O disposi- ] tivo de processamento de sangue 800 é mostrado acoplado a um paciente 836 na figura 8. Elementos do dispositivo 700 mostrados na figura 7 que são iguais no dispositivo 800 da figura 8 têm os mesmos números de referência correspondentes, exceto pelo fato de que o primeiro dígito é alterado para corresponder com o número da figura (7XX e 8XX), portanto o nódulo de coleta 702 de figura 7 é o nódulo de coleta 802 da figura 8. Apenas por moti- vos de concisão, a descrição das características correspondentes não serão repetidas na descrição da figura 8, uma vez que os elementos da figura 7 que são iguais na figura 8 têm a mesma função e configuração. Ao invés disso, apenas as diferenças entre as figuras 7 e 8 são descritas deste ponto ] em diante no presente documento. A bolsa de coleta 886 está acoplada a - uma bomba de modificação 831 que, por sua vez, está acoplada a uma uni- dade ou módulo de modificação 833. O módulo de modificação 833 está, por Sua vez, acoplado a uma bolsa de células modificadas 835. A configuração do dispositivo 800 da figura 8 é, de outro modo, igual aquela da figura 7.

A modificação pode, também, ser realizada como uma modifi- cação celular ex vivo descontínua, para alterar o fenótipo, genótipo ou ativi- dadeda célula. Isto pode ser alcançado pela adição de citocinas, receptores reticulados específicos, adição de antígenos, transfecção de DNA, RNA ou proteínas, indução de células apoptóticas, ou incorporação de genes incluin- do transdução viral. Nesta modalidade, a população de células-alvo enrique- cidas 1160 é removida para uma etapa de modificação separada desconti- nua,para alterar o fenótipo/genótipo/atividade da célula. As células modifi- cadas podem ser, então, usadas para pesquisa ou para aplicação terapêuti- ca através de infusão de volta no paciente. O grau de enriquecimento é ne- cessário para propósitos de pesquisa/teste ou para a aplicação terapêutica. A população de células-alvo enriquecidas pode ser modificada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, ativa- ção, expansão, indução de apoptose, manipulação genética, indução de es- pecificidade antígeno, etc. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela adição

. de citocinas, receptores reticulados específicos, adição de antígenos, intro- dução de DNA, RNA ou proteínas, transdução viral, eletroporação, lipofecção, ' tratamento com vários comprimentos de onda de luz, adição de fármacos, cap- tura de células ou componentes de células, pressão, aquecimento, etc.

As células podem ser modificadas através de uma variedade de meios que são, em todos os casos, mas um de fotoferese (consulte abai- xo), conduzidos em um processo desconectado do paciente através de um processo ou dispositivo autônomo. Existem muitos exemplos atuais de pro- cedimentos desconectados do paciente que envolvem modificação celular ex vivopara alterar o fenótipo/genótipo/atividade da célula, isto pode ser execu- tado, por exemplo, pela adição de citocinas, receptores reticulados específi- cos, adição de antígenos, transfecção de DNA ou RNA, introdução de prote- ' Ínas, indução de células apoptóticas, ou incorporação de genes através de, - por exemplo, transdução viral. Os meios para se fazer isso incluem, mas não selimitam a eletroporação, lipofecção, transdução viral, irradiação, incuba- ção com fármacos, captura de células, ativação celular, pressão, aquecimen- to, reticulação dos receptores de superfície celular, tratamento com citoci- nas, quimiocinas, hormônios, etc. Por exemplo, eletroporação, ou eletroper- meabilização, é um método usado para introduzir compostos extracelulares como material genético (DNA ou RNA) em uma célula mediante o aumento da permeabilidade da membrana celular causado por um campo elétrico a- plicado externamente. Esta técnica é agora usada de modo geral para pro- pósitos de pesquisa, e testes clínicos foram recentemente conduzidos mos- trando sua utilidade em potencial em terapia humana.

Células destinadas à modificação incluem, mas não se limitam a linfócitos B, linfócitos T, linfócitos T CD4 e CD8, células dendríticas, monó- citos, células assassinas naturais (NK), células reguladoras T, células auxili- ares T, linfócitos T citotóxicos (CTLs), células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células progenitoras hematopoiéticas, células endoteliais, células epiteliais, células assassinas ativadas por linfocina (LAKSs), linfócitos infiltran- tes de tumores (TILs), e células epiteliais — vide tabela 1. (Fundamental Im- munology, por William E. Paul, 2003, Lippincott Williams & Wilkins ISBN

. 0781735149, Essential Haematology, por Hoffbrand, Pettit e Moss). Estas células modificadas são úteis para o tratamento de uma ' variedade de doenças e condições.

Por exemplo, terapia por células T adoti- vas é descrita por C.H.

June. em J.

Clin.

Invest., 117, (2007) 1466 a 1476. Neste exemplo, linfócitos do sangue periférico são coletados de um pacien- te, enriquecidos em uma etapa separada e incubados com sistemas de ati- vação para aumentar a atividade antitumoral dos CTL.

Células-tronco hema- topoiéticas têm sido usadas em transplantes de medula óssea por diversos anos e são cada vez mais usadas em outras aplicações como terapia cardi- —ovasculare cura de ferimentos.

As modificações podem ser afetadas através do uso de qual- quer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, transfecção ou Ú transdução de material genético em pelo menos uma porção da população - de cêlulas-alvo, reticulação de receptores específicos ou tratamento com citocinas.

Transfecção ou transdução de material genético pode ser qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, por transdução veto- rial, eletroporação ou lipofecção.

A modificação pode ser qualquer uma co- nhecida na técnica, incluindo, sem limitação, ativação de linfócitos T citotóxi- cos (CTL), ativação de células reguladoras T (Treg), indução de apoptose ou modificação genética das células sanguíneas para proteção contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tratamento do HIV com células progenitoras/células-tronco hematopoiéticas geneticamente modificadas é descrito em Amado et al (2004), publicação de patente (PCT) Internacional nº WO 03/006691. Neste sistema, as células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoié- ticas são coletadas do paciente como parte da fração de célutas mononucle- ares por leucaférese, enriquecidas por um dispositivo Baxter separado, transduzidas e incubadas antes da infusão no paciente (vide figura 2). Nas modalidades da invenção, os pacientes são leucaferisados por um tempo mais curto, as células serão seguramente enriquecidas em um circuito fe- chado e, mais importante ainda, as células não alvo podem ser devolvidas a estes pacientes que são linfopênicos (vide figura 4).

. Existem muitas outras células-alvo que podem ser enriquecidas pelo dispositivo e usadas para terapia, e alguns exemplos são mostrados 7 aqui. Células dendríticas são usadas no tratamento de câncer, doenças in- fecciosas e doenças de imunodeficiência (Nature. 27 de setembro de 2007, 449(7161):419a426. Review). Células NK são usadas para o tratamento de câncer. Células reguladoras T estão sendo testadas para o tratamento de doenças de enxerto-contra-hospedeiro (GvHD) (Semin Immunol. abril de 2006, 18(2): 78 a 88), doenças de imunodeficiência, dermatite atópica e as- ma (Curr Opin Allergy Clin Immunol. Fevereiro de 2006, 6(1):12-6. Review). CTLs são usados no tratamento de câncer, doenças infecciosas e alergias. Células endoteliais são usadas em terapias de regeneração celular da bexi- ga, vasculatura, etc. ' Em uma modalidade que combina todas as três etapas de cole- BR ta, enriquecimento e modificação em um circuito fechado conectado ao paci- ente, o grau de enriquecimento e modificação são determinados pelos valo- res necessários para a aplicação terapêutica. Por exemplo, em uma terapia gênica contra o HIV, um enriquecimento das células-tronco hematopoiéti- cas/células progenitoras hematopoiéticas de até >20% é necessário, e com mais preferência de até> 80%, de modo que um alto número de células- tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas possa ser transduzido com a construção do gene anti-HIV. As necessidades de trans- dução podem ser otimizadas de modo que um alto número de células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas geneticamente modi- ficadas seja reinfundido no paciente. O supracitado é fornecido apenas a títulodeexemplo.

Em outro exemplo, células reguladoras T podem ser enriqueci- das e, então, expandidas, a pureza geralmente necessária é de >75% e, de preferência, >90%, para limitar o crescimento excessivo de células T efeto- ras durante a etapa de modificação/estímulo. Portanto, os parâmetros de enriquecimento e modificação variam dependendo da doença e da necessi- dade médica. Novamente, o supracitado é fornecido apenas a título de e- xemplo.

. Em uma outra modalidade, as modalidades da invenção permi- tem o monitoramento das etapas conforme as etapas ocorrem, ou seja, em 7 tempo real como a medição de hematócritos, número de células, fenótipo celular, ativação celular, tamanho da célula, etc.

No caso de, por exemplo, enriquecimento e modificação de células-tronco hematopoiéticas/células progenitoras hematopoiéticas, isto permite determinar os parâmetros do pro- cesso conforme ele está ocorrendo, por exemplo, medição do número de células CD34+ e do número de células CD34+ transduzidas.

Todas as referências citadas na presente invenção estão aqui incorporadas, por referência.

Estas incluem as patentes US nº 7211037 ("Apparatus for the continuous separation of biological fluids into components and methods of using same”) concedida a Briggs, et al. em 1 de maio de Ú 2007, e 7186230 ("Method and apparatus for the continuous separation of . biological fluids into components") concedida a Briggs, et al. em 6 de março de2007.O seguinte exemplo é fornecido ilustrar, mas não limitar, as moda- lidades da invenção.

Exemplo 1. Coleta de células mononucleares a partir de sangue periférico e enriquecimento de linfócitos T CD4+ Uma bolsa de sangue periférico foi preparada para representar um paciente falso.

Quatro (4) unidades de sangue integral ABO combinado de doadores saudáveis foram coletadas em um anticoagulante ACD-A, 1-2 dias antes do uso.

As unidades de sangue foram esgotadas de leucócitos por filtração através de um filtro de leucorredução Sepacell, e agrupadas em uma bolsa de sangue de 2 L.

Um creme leucocitário LeukoPak foi adiciona- do, para trazer a contagem de leucócitos a concentrações fisiológicas, e a bolsa de paciente falso foi mantida à temperatura ambiente em uma plata- forma de agitação para assegurar uma suspensão de células homogênea.

Uma amostra de 10 mL foi retirada da bolsa de paciente falso e a composi- ção celular básica foi determinada por contagem eletrônica de células e dife- rencial automatizado em um contador Beckman Coulter AcT, e seu imunofe- nótipo foi avaliado através de citometria de fluxo usando-se um painel de anticorpos monocilonais incluindo CD45-FITC, CD3-PECy7, CD4-APC, CD8-

. PECy5, CD14-PECy7, CD15-PE, CD20-APC, e CD34-PE.

Um exemplo da composição celular dentro de uma bolsa de " paciente falso é: Contagem Celular Sangue integral do paciente falso Glóbulos Brancos (x10º6) 5,1 Linfócitos (x10º6) 1,85 Monócitos (x10"º6) 0,4 Neutrófilos (x10º6) 2,85 Células Vermelhas do Sangue (x10º9) 4,35 Plaquetas (x10"6) 85,5 Hemoglobinas (g/dL) 11,4 : HCT (%) 35,8 Imunofenótipo ' CD8 (%) 65 CD4 (%) 25,9 CD14 (%) 12,3 CD15 (%) 57,7 CD20 (% 2,3 Sistema de Processamento de Sanque O sistema de fotoferese Therakos CellEx forma a base do dis- positivo de processamento de sangue.

Conforme representado na figura 9, 0 sistema 900 compreende vários componentes incluindo uma câmara centrí- fuga 962, um console de bombas 964, uma câmara de fotoativação, e um software de fácil utiização para controlar a interface de operação 960. Gar- rase bombas adicionais são adicionadas conforme necessário e um proce- dimento de fotoferese CellEx específico de um conjunto descartável de uso único foi modificado para uso neste exemplo.

No presente exemplo de coleta de células mononucleares e enriquecimento de células CD4+ a partir de sangue periférico, a câmara de fotoativação não é necessária.

O sistema de fotoferese CellEx usa uma tecnologia de centrifugação um-omega dois- omega que, em combinação com uma cuba Latham acoplada a um tubo de direcionamento de lúmen com três-portas, permite processamento contínuo

- do sangue integral. Comparado com outros dispositivos de leucaférese, a coleta de um número similar de células mononucleares pode ser alcançada ' a partir de um volume extracorpóreo reduzido. O sistema de fotoferese Cel- IEx pode ser operado em um modo de acesso de agulha única (retorno de lote) ou dupla (retorno contínuo), que fornece flexibilidade ao paciente. No presente exemplo, o modo de agulha dupla foi empregado para uma única passagem de sangue da bolsa do paciente falso para a bolsa de retorno do paciente falso.

Antes da coleta de células mononucileares, o sistema de fotofe- rese Therakos CeliEx exige o carregamento e escorvamento de um Kit de procedimento descartável. O kit era um conjunto completo descartável e de uso único, que compreende vários elementos incluindo uma cuba de centrí- ' fuga Latham, um organizador de tubulação de bomba, e um módulo de foto- - ativação. Neste exemplo, o kit de procedimento foi modificado para incluir bolsas e garras adicionais. O kit de procedimento modificado foi instalado e escorvado conforme o manual de operação do sistema de fotoferese Thera- kos CellEx. Uma vez que o kit foi carregado, o sistema realizou um procedi- mento de escorvamento automatizado de sete minutos para assegurar um carregamento adequado do kit, para testar a integridade do kit e para testar aintegridade do instrumento, bem como escorvar a rota de fluido estéril com anticoagulante. O anticoagulante usado neste exemplo foi o ACD-A.

Após o escorvamento, o sistema estava pronto para conexão com o paciente falso. A bolsa de sangue de 2 L do paciente falso foi conec- tada à entrada ou à linha de 'acesso de coleta do kit' do sistema CellEx do kit descartável. Uma bolsa de sangue de 2 L vazia foi conectada à saída ou à linha de “acesso de retorno do Kkit' para representar o outro braço do paci- ente falso e designada como a "bolsa de retorno". Após a conexão das duas linhas de acesso de doação, o sistema CellEx foi configurado para operar em um modo de agulha dupla. Todos os outros parâmetros de sistema foram usadosem suas configurações padrão. Os parâmetros de sistema foram: 1) processamento de 1.500 mL de sangue integral, 2) taxa de coleta de sangue de 50 mL/min, e

. 3) razão de anticoagulante de 10:1. A coleta de sangue foi iniciada apertando-se o botão de início ' na interface de operação e o sistema processou automaticamente o volume de sangue integral alvo de 1.500 mL.

Conforme o sangue foi continuamente bombeado do paciente falso para a cuba Latham, eritrócitos e plasma foram continuamente removi- dos e devolvidos através de uma segunda linha intravenosa representada neste exemplo pela "bolsa de retorno". No modo de agulha única, os eritróci- tos e o plasma são devolvidos através da mesma linha em um modo por lo- te O console de bombas do sistema CellEx conduz múltiplas bombas e dire- ciona e desloca os componentes do sangue ao longo do processamento de sangue. Células mononucleares foram retidas como uma camada de glóbu- ' los brancos ou "creme leucocitário" entre os eritrócitos e o plasma na cuba.

- A posição do "creme leucocitário" foi monitorada através de um feixe de la- ser Quando 1.500 mL de sangue integral foram processados, o sis- tema CellEx entrou em modo de “coleta de creme leucocitário”. A colheita das células mononucleares foi alcançada interrompendo-se a bomba que controla o fluxo de eritrócitos até a "bolsa de retorno”. Isto permitiu que os eritrócitos entrassem na cuba e movessem o "creme leucocitário” para cima, ainda que com alguma perturbação da camada de glóbulos brancos, e para fora através da porta de plasma no topo da cuba, através de uma válvula aberta. O plasma e o "creme leucocitário" foram direcionados à "bolsa de tratamento" anteriormente escorvada com anticoagulante. Quando o sensor óticodo sistema hematócrito detectou um hematócrito de 3%, a bomba de coleta foi temporariamente parada, e a cuba foi girada para permitir que a tira de glóbulos brancos se reformasse. A coleta na bolsa de tratamento en- tão continuou até que o sensor ótico detectou um hematócrito de 24%. Isto ativou a válvula para fechar e desviar o fluido da cuba para a linha de retor- no.A "bolsa de tratamento" neste momento continha a preparação de célu- las mononucleares coletadas. A “bolsa de tratamento' consistia predominan- temente de células mononucleares, enquanto também continha plaquetas, e

. uma baixa concentração de granulócitos e eritrócitos com um hematócrito de aproximadamente 1-2%. A "bolsa de tratamento" celular foi conectada atra- ' vés de um conjunto de procedimento modificado a uma bolsa adicional! com o propósito de enriquecimento.

Um exemplo de coleta de células mononucleares a partir de

1.570 mL de sangue integral anticoagulado (paciente falso) é: Crgencam — fila am PER dopaciente falso | células mononu- | Rendimen- Contagem Celular Total de células cleares to (%) Monócitos (x1076) 628 Í jCélulas Vermelhas do Sangue) 6.822 48 Femogtomimas (dl 1 nas 1088. FETO) | se | 18 | | lmanoenio | | lebre [es TO es Enriquecimento a partir de células mononucleares coletadas de células-alvo cD4+ Após a conclusão da coleta CellEx de células mononucleares, uma fração do produto de células mononucleares foi lavada com um tampão de enriquecimento celular e microesferas de seleção de CD4+ (Dynal) foram introduzidas a uma concentração através da porta de acesso livre de agulha da “bolsa de tratamento'. A célula mononuciear e a mistura de microesferas foram incubadas durante 30 minutos com recirculação através de uma rota — sinuosa do módulo de fotoativação do kit descartável CellEx. A incubação foi terminada deslocando-se as células através de uma bomba peristáltica em uma bolsa colocada em um concentrador de partículas magnéticas. As célu-

37H47 . las-alvo CD4+ foram retidas na "bolsa de células enriquecidas" e as Dyna- beads foram removidas através da adição de Detachabeads. Ambos CD4+ ' alvo enriquecidos e frações de célula não alvo foram coletados em bolsas de coleta separadas. Amostras foram tomadas para determinar o número de células, rendimento e pureza usando-se um contador celular Coulter e uma citometria de fluxo de marcadores de superfície celular relevantes. Os números mostrados abaixo são para alíquotas pequenas de 2 mL de células mononucleares coletadas. meme — EE EE lulas mononuclea- alvo enri- res quecidas Rendimen- Contagem Celuiar CD4 to (%) GlbasErances (xo%6) — | a | 66 | os | ' Onfetos ator — | 168 | &s | 26 | Logs mt a (1049) o [Paquetas tor) — | sa | o [| o | [enem isa as [OTTO] or a es

CDIAGMOA eee o [e ar o [ensoga TR Bs Exemplo 2. Coleta de células mononucleares e enriquecimento de células CD8+ a partirdesanque periférico Visão geral A figura 12 ilustra um sistema modificado 1200 relacionado ao sistema 700 da figura 7. Por motivos de concisão apenas, as características da figura 7 que são idênticas no sistema 1200 da figura 12 retêm os mesmos números de referência (por exemplo, a bomba de anticoagulante 712 nas figuras 7 e 12). Além disso, estas características numeradas de forma idênti- ca também retêm a mesma configuração no sistema 1200 da figura 12, a não ser onde descrito explicitamente de outro modo deste ponto em diante

. no presente documento. O sistema 1200 da figura 12 é um dispositivo de processamento de sangue que envolve coleta e enriquecimento (versão 2) e ' compreende 3 novas bolsas, 6 novas garras, e 2 imãs. Um kit de procedi- mento CellEx padrão foi modificado conforme ilustrado na figura 12. A câma- rade fotoativação foi substituída por uma bolsa CLINICelI25 1278. O pacien- te 1200 é representado na figura 12 pela bolsa de paciente f1 1206 acopla- da ao nódulo de retorno 756 e por uma bolsa de paciente f2, que não é mostrada na figura 12, mas pode ser substituída pela bolsa 1206 e acoplada ao nódulo de retorno 756 em estágios diferentes do processo, para permitir a enumeração de células durante a coleta e enriquecimento. O sistema da figura 12 é modificado da seguinte forma. Um imã 1276 está disposto adjacente à placa 778 e pode ser unido a ou separa- Ú do da placa 778. Na figura 7, a saída do sensor HCT 788 está acoplada às . válvulas 790 e 791 (NEW1 e NEW2) em paralelo, que, por sua vez, estão acopladas às bolsas de coleta e tratamento 786 e 737, respectivamente. Na figura 12, esta configuração é mantida, mas rotas paralelas adicionais são adicionadas à saída do sensor HCT 788. Uma válvula (NEW6) 1240 está acoplada à saída do sensor HCT 788 e, por sua vez, a uma bolsa de descar- te 1242. Uma válvula adicional (NEWS) 1250 é acoplada à saída do HCT 788,eum cateter 1252 é acoplado entre a válvula 1250 e a válvula (NEW3) 793, e o detector de ar 794. Adicionalmente, a saída da válvula (NEW4) 796 é acoplada na figura 12 entre a válvula 793 e o detector de ar 794, ao invés de entre o detector de ar 794 e a válvula 798, conforme mostrado na figura

7. Finalmente, um ímã secundário 1254 está disposto adjacente a uma rota entrea válvula (NEW1) 790 e a bolsa de coleta 786.

Quatro unidades de sangue integral foram combinadas para criar um "paciente falso" 1204 acoplado ao nódulo de coleta 702 e uma a- mostra foi tomada para um contador Coulter e análise de citometria de fluxo. O kit modificado foi carregado em um dispositivo CellEx e as válvulas NEW1 790, NEW4 796, NEWS 1250 e NEWS 1240 foram fechadas, e as válvulas NEW? 791 e NEW3 794 foram abertas. Como um estado inicial, isto forne- ceu uma canaleta aberta para comunicação fluida através da bolsa de trata-

. mento 737. O software CellEx padrão foi usado para escovar o kit, e um software de diagnóstico sendo executado em um laptop foi conectado à por- " ta IR do CellEx para permitir uma operação adicionalmente configurada pelo usuário das bombas, válvulas e centrífuga.

Escorvamento A válvula NEW2 791 foi fechada e a válvula NEW1 790 foi a- berta para criar uma rota até a bolsa de coleta 7886, e esta linha foi escorva- da com tampão através da circulação do tampão/bomba de recirculação 776 no sentido horário. Uma vez que a linha foi escorvada, a bomba 776 foi pa- rada,a válvula NEW3 793 foi fechada, e a válvula NEVWA4 796 foi aberta para permitir que o tampão de seleção 795 fosse bombeado através do kit. À bomba de tamponagemvrecirculação 776 foi ativada em sentido anti-horário. : Após o escorvamento da linha com o tampão de seleção 795, a bomba 776 . foi parada, a válvula NEW1 790 foi fechada, e a válvula NEW6 1240 foi aber- ta. lsto abre a rota para a bolsa de descarte 1242. Pela ativação da bomba de tamponagem/recirculação 776 em uma direção em sentido horário, a li- nha até a bolsa de descarte 1242 foi escorvada. Quando esta linha até a bolsa de descarte 1242 foi escorvada, a bomba 776 foi parada, as válvulas NEWS6 1240 e NEWA4 796 foram fechadas, e a válvula NEWS 1252 foi aberta para escorvar a linha 1252 que se deriva da bolsa de tratamento 737, execu- tando-se a bomba de tamponagemirecirculação em sentido anti-horário. Uma vez que a linha 1252, 1250 foi escorvada, a bomba 776 foi parada, a válvula NEWS 1250 foi fechada, e as válvulas NEW2 791 e NEW3 793 foram abertas, o escorvamento estando completo.

Conexão do "paciente" e coleta O "paciente falso" 1204 foi conectado à linha de coleta 702, 704 e a bolsa de paciente ft1 1206 foi conectada à linha de retorno 756, 754. Um procedimento padrão de agulha dupla CellEx usando configurações pa- drão foi executado para coletar o creme leucocitário (conforme descrito no exemplo 1 acima). Imediatemente após a coleta do creme leucocitário, o bo- tão de "Parar" foi pressionado, interrompendo o software CellEx automatiza- do. As bombas CellEx, as válvulas NEW e a centrífuga foram, então, mani-

. puladas pelo operador e com o software de diagnóstico no laptop.

Enriquecimento das células-alvo ' Todas as válvulas no sistema 1200 foram fechadas, exceto as válvulas (NEW2) 791, (NEW4) 796, (Azul - Fundo de Plasma) 744, (Rosa - Topode Plasma) 784, e (Retorno) 748. Isto criou uma rota aberta para o ma- terial restante na cuba 730 e na bolsa de retomo 740 para serem bombea- dos até a bolsa de paciente ff1 1208. Isto foi alcançado habilitando-se a bomba de eritrócitos 732 para se mover em sentido horário e a bomba de retorno 746 em sentido anti-horário. Isto criou uma rota da cuba de centrífu- ga,através das bombas 732 e 746 até a bolsa de paciente f1 1206, através dos elementos 748, 750, 752, 754 e 756 e através da bolsa de retorno 740. As bombas 732, 746 foram paradas, a válvula (Azul - Fundo de Plasma) 744 : foi fechada, e a válvula de solução salina 764 foi aberta. Para lavar a cuba - 730, a bomba de eritrócitos 732 foi ativada em uma direção em sentido anti- horárioe a solução salina da bolsa de solução salina 762 foi bombeada na cuba 730. Quando a cuba 730 estava aproximadamente meio cheia, a bom- ba 732 foi parada e a válvula de solução salina 764 foi fechada. A centrífuga 730 foi, então, pulsada, e o sangue foi bombeado da bolsa de paciente f1 1206 através da bomba de eritrócitos 732 em sentido horário e da bomba de retorno 746 em sentido anti-horário. Quando a cuba 730 foi esvaziada, a bomba de eritrócitos 732 foi desativada, e a velocidade da bomba de retorno 746 foi aumentada brevemente para purgar o restante de sangue das linhas até a bolsa de paciente 41 1206. À bomba 746 foi parada, e a bolsa de paci- ente 41 1206 substituída pela bolsa de paciente 2 (não mostrada na figura 12), que foi acoplada ao nódulo de retorno 756. Uma amostra da bolsa de paciente *1 foi analisada em um contador Coulter e por citometria de fluxo para composição celular. Um total de 1.800 ml! de sangue foi processado, a uma contagem total de células nucleadas de 6,6 x 106/mL. As células CD8 compreenderam 8,1% do material de partida. Após o enriquecimento, a quantidade de tampão foi de 139 mL, com uma contagem total de células nucleadas de 24,2 x 10º/mL das quais 22,4% foram CD8 positivo. (recupera- ção = 78%)

. As células restantes na tubulação foram bombeadas até a bol- sa de tratamento 737 através da operação da bomba de tamponagem/ recir- 7 culação 776 em sentido horário, a 100 mililitros por minuto durante vários segundos.

A bomba 776 foi, então, parada, a válvula NEWA4 796 foi fechada, eaválvula NEW3 793 foi aberta, e o a granel de tampão coletado foi deter- minado em peso.

A bolsa de tratamento 737 foi agitada para misturar os conteúdos, e uma amostra foi coletada para contagem Coulter e análise de citometria de fluxo.

Neste exemplo, o número de células na bolsa de tratamento 791 foiajustado para 1x10º, que é um número que poderia de fato ser captu- rado usando-se um único frasco de 5 mL de Dynabeads.

As Dynabeads fo- ram injetadas na bolsa de tratamento 737, e a mistura de microesfe- ' ras/células foi passada através da placa 778 e da bolsa de tratamento 737 . pela ativação da bomba de tamponagem/recirculação 776 em sentido horá- rio.

Neste modo, as válvulas 1240, 1250, 790, 796, 772 e 798 estavam fe- Chadas.

As válvulas 791 e 793 estão abertas.

Desta forma, circulação ocorre através da bolsa de tratamento 737 até a placa 778, através dos elementos 793, 794 e 780. O ímã 1276 é desconectado da placa 778. A circulação con- tinua da placa 778 através da bomba de tamponagem 776, do sensor HCT 788,eda válvua?791 até a bolsa de tratamento 737. Desta forma, neste mo- do, a circulação através desta rota está em sentido anti-horário.

Durante este período de incubação, as células que expressam um antígeno celular espe- cífico (neste exemplo, CD8) estão ligadas às Dynabeads revestidas por anti- corpos.

Esta incubação e circulação duram pelo menos 30 minutos, com mistura ou agitação da bolsa de tratamento 737 e da placa 778. Quando a etapa de circulação de antigeno/anticorpo foi com- pleta, a placa 778 foi colocada em um Dynal ClinExVivo MPC (o ímã de 8 kGauss) 1276 com o imã 1276 ligado.

A bomba de tamponagem/recir- culação 776 continuou o bombeamento durante vários minutos para remover quaisquer Dynabeads da tubulução entre a placa 778 e o topo da bolsa de tratamento 737. Uma vez que a linha entre a placa 778 e a bolsa de tratamento

. 737 está límpida, a bomba 776 foi parada, a válvula (NEW2) 791 foi fechada, a válvula (NEW6) 1240 foi aberta, e a bomba de tamponagem/recirculação ' 776 foi, então, reativada na direção em sentido horário. Isto interrompeu a comunicação fluida para dentro da bolsa de tratamento 737 através do fe- — chamento da válvula 791. A circulação fluiu da bolsa de tratamento, através dos elementos 793, 794, 780 até a placa 778, com o ímã 1276 ligado. Todas as células na bolsa de tratamento 737 foram bombeadas através da placa

778. Os complexos de célula Dynabead (CD8 positivo ou fração enriquecida) foram capturados na placa 778 pelo imã 1276. A circulação continuou da placa778, através da bomba de tamponagem 776 e do sensor HCT 788 até a bolsa de descarte 1242 conforme a válvula (NEWS6) 1240 foi aberta. Deste modo, o restante das células (fração negativa) fluiu para dentro da bolsa de descarte 1242.

. Quando a bolsa de tratamento 737 foi esvaziada, a bomba de tamponagem/recirculação 776 foi parada, a válvula (NEW3) 793 foi fechada, a válvula (NEWA4) 796 foi aberta, e a bomba 776 foi reativada na mesma di- reção para permitir que o tampão de seleção da bolsa 795 purgasse a linha de fundo da bolsa de tratamento 737, através da placa 778, e até a bolsa de descarte 1242, assegurando que a maior parte das células restantes nas linhasfosse processada. Quando as linhas foram purgadas com tampão por vários minu- tos, a bomba de tamponagem/recirculação 776 foi parada, a válvula (NEW6) 1240 foi fechada, a válvula (NEW2) 791 é aberta, e a placa 778 é removida do ímã 1276. Um tampão da bolsa 795 foi adicionado à placa 778 e a bolsa de tratamento 737 através de circulação da bomba de tampona- gem/recirculação 776 em sentido horário. Quando tampão suficiente foi adi- cionado, a bomba 776 foi parada, a válvula (NEW4) 796 foi fechada, a válvu- la (NEW3) 793 foi aberta, e a bomba 776 foi, então, reiniciada. A mistura de células-microesferas foi circulada através da placa 778 e da bolsa de trata- mento737 durante vários minutos, para ressuspender os complexos de célu- las de Dynabead. A circulação ocorre através da bolsa de tratamento 737 até a placa 778, através dos elementos 793, 794 e 780. A circulação conti-

. nua da placa 778 através da bomba de tamponagem 776, do sensor HCT 788, e da válvula 791 até a bolsa de tratamento 737. Desta forma, neste ' modo, a circulação através desta rota está em sentido anti-horário. Esta eta- pa pode ser repetida e equivale à lavagem da fração positiva para remover impurezas.

Após a lavagem, 2 ml de DETACHaBEAD Dynal foram injeta- dos na bolsa de tratamento 737 e incubados com os complexos de célula Dynabead através da ativação da bomba de tamponagem/recirculação 776 em sentido horário durante pelo menos 45 minutos. Após a incubação, a placa778 foicolocada no ímã 1276. A bomba de tamponagem/recirculação 776 foi girada em sentido horário durante vários minutos, a fim de se limpar quaisquer Dynabeads da tubulação entre a placa 778 e o topo da bolsa de ' tratamento 737. Uma vez que a linha foi limpa de Dynabeads, a bomba 776 . foi parada, a válvula (NEW2) 791 na bolsa de tratamento 737 foi fechada, a válvula (NEW1) 790 na bolsa de coleta 786 foi aberta, e a bomba de tampo- nagemv/recirculação 776 foi reativada na direção em sentido horário. A circu- lação ocorre da bolsa de tratamento 737 até a placa 778, através dos ele- mentos 793, 794 e 780. A circulação continua da placa 778 através da bom- ba de tamponagem 776, do sensor HCT 788, e da válvula 790 até a bolsa de coleta786.O ímã 1276 permaneceu ligado à placa 778.

O fluido e as células na bolsa de tratamento 737 foram bombe- ados através da placa 778 e as Dynabeads (agora desafixadas das células) foram capturadas pelo ímã 1276, enquanto as células (seleção positiva) flui- am para dentro da bolsa de coleta 786. Quaisquer Dynabeads que não fo- ram capturadas pelo ímã principal 1276 deveriam então ser capturadas pelo imã secundário 1254, antes da entrada na bolsa de coleta 786. Quando a bolsa de tratamento 786 foi esvaziada, a bomba de tamponagem/recircu- lação 776 foi parada, a válvula (NEW3) 793 foi fechada, a válvula (NEW4) 796 foi aberta, e a bomba 776 foi, então, reativada na mesma direção. O tampão a partir da bolsa de tampão de seleção 795 purgou a linha de fundo da bolsa de tratamento 737, através da placa 778, e até a bolsa de coleta 786, assegurando-se que a maior parte das células nestas linhas foi proces-

. sada. Quando as linhas foram purgadas com tampão durante vários : minutos, a bomba de tamponagem/recirculação 776 foi parada. A bolsa de descarte 1240 e a bolsa de coleta 788 foram pesadas para se determinar o volume de coleta, e a bolsa de descarte 1240 (fração negativa) foi testada para contagem Coulter, citometria de fluxo, e análise de pH. A fração enri- quecida na bolsa de coleta 786 foi concentrada e, então, testada para conta- gem Coulter, citometria de fluxo, e análise de pH. A produção de células CDB8 positivas foi de 33% e a pureza foi de 92%. Retorno das células não alvo As células na bolsa de descarte 1242 foram concentradas para retorno ao paciente, representado pela bolsa de paciente 42 (não mostrada na i figura 12, mas pode ser substituída pela bolsa 1206). Todas as válvulas no sis- , tema 1200 foram fechadas, exceto pelas válvulas (NEW5) 1250, (NEWS6) 1240, (Verde - Fundo da Tamponagem) 798, (Rosa - Topo do Plasma) 784, e (Retorno) 748, que estavam todas abertas. Isto abriu uma trajetória para transferência dos conteúdos da bolsa de descarte 1242 até a cuba 730, com a superabundância coletada na bolsa de retorno 740. Deste modo, a circula- ção da bolsa de descarte 1242 foi através das válvulas 140 e 1250, do de- tector de ar 794, da válvula 798 e da bomba 732 até a cuba de centrífuga

730. Da cuba 730, a circulação ocorreu da válvula 784 até a bolsa de retorno

740. Isto foi alcançado pela rotação da bomba de eritrócitos 732 em sentido anti-horário. Uma vez que a bolsa de descarte 1240 foi esvaziada, a bomba 732 foi parada e todas as válvulas foram fechadas, exceto pelas válvulas (Azul - Fundo de Plasma) 744, (Rosa - Topo de Plasma)784, e (Retorno)

748. Todo o ar na cuba 730 foi, então, purgado pela ativação da bomba de eritrócitos 732 em uma direção em sentido anti-horário a 20 mililitros por mi- nuto, ligando-se simultaneamente a centrífuga 730 a uma velocidade de 600-1.000 RPMs durante vários segundos e, então, desligando-se a centrí- fuga 730. Este processo de ligar e desligar a centrífuga 730 enquanto a bomba de eritrócitos 732 estava bombeando continuamente foi repetido vá-

. rias vezes até que nenhuma bolha de ar fosse vista deixando a cuba 730. Uma vez completo, a centrífuga 730 foi vagarosamente acelerada até sua 1 velocidade total, com a bomba 732 ainda ativa, e os conteúdos da cuba 730 foram deixados para se separar durante vários minutos.

Depois que a separação ocorreu, a bomba de eritrócitos 732 foi parada, as válvulas (NEW2) 791 e (Amarela - Topo de Tamponagem) 772 foram abertas, e a válvula (Rosa - Topo de Plasma) 784 foi fechada. O bom- beamento em sentido anti-horário da bomba de eritrócitos 732 foi resumida a 20 mililitros por minuto. A circulação é da bolsa de retorno 742 até a cuba de centrifuga 730 através do detector de ar 742, da válvula 774 e da bomba

732. A partir da cuba 730, a circulação continua até a bolsa de tratamento, através da válvula 772, do sensor HCT 788, e da válvula 791. Este processo Ú removeu a solução salina do topo da cuba 730 enquanto a maior parte das . células não alvo no produto sanguíneo permaneceu na cuba 730.

Quando a bolsa de retorno 740 estava vazia, a centrífuga 730 foi parada e todos os conteúdos da cuba 730 forem retornados à bolsa de paciente ft2 (não mostrada na figura 12) através da bomba de eritrócitos 732 em sentido horário e da bomba de retorno 746 em sentido anti-horário, atra- vés da válvula 748, do detector de ar 750, do sensor de pressão 752, e do nódulo de retorno 756. Quando a cuba 730 foi esvaziada, ambas as bombas 732 e 746 foram paradas, a válvula (Azul - Fundo de Plasma) 744 foi fecha- da, e a válvula de solução salina 764 foi aberta, e a bomba de retorno 7486 foi reativada em sentido anti-horário a 100 mililitros por minuto durante vários segundos para purgar o restante das células sanguíneas não alvo na bolsa de pacientet*2 (não mostrada na figura 12). A bomba 746 foi parada e a bol- sa de paciente f2 foi pesada para determinar o volume total e testada para contagem Coulter e análise de citometria de fluxo. As células não alvo conti- nham apenas 2,7% de células CD8.

Exemplo 3. Coleta de células mononucleares e enriquecimento de células CD34+a partirde sangue periférico A coleta e enriquecimento de células CD34+ podem ser condu- zidos conforme descrito nos exemplos 1 e 2, usando-se materiais que espe-

. cificamente se ligam a CD34. Enriquecimento de células CD34+ a partir de células mononucleares coleta- ' das Em uma modalidade da invenção, o sujeito pode ser mobiliza- docomG-CSF.

Ao se completar a coleta de células mononucleares CellEx padrão, o produto de céluta mononuclear é lavado com um tampão de enri- quecimento celular STF/EDTA (Miltenyi) suplementado com cápsulas de se- leção HSA e CD34+ (Miltenyi) introduzidas através da porta de acesso isen- ta de agulhas da “bolsa de coleta'. A mistura de células mononucleares e microesferas é incubada durante 30 minutos com recirculação através do módulo de captura do kit descartável CellEx modificado e terminada pelo deslocamento de células através de uma bomba peristáltica no sistema : magnético Miltenyi CIiniMACS a uma taxa de fluxo aproximadamente igual . àquela sugerida pelo fabricante.

As células-alvo CD34+ podem ser enrique- cidas a partir de células não alvo, e ambas as frações de células-alvo e não alvo podem ser coletadas em bolsas de coleta separadas e adicionalmente modificadas ou devolvidas ao paciente.

Resultados O sistema de fotoferese Therakos CellEx é capaz de coletar uma altaprodução de células mononucleares e pode ser conectada em uma única trajetória de fluido a um sistema de enriquecimento celular para o enri- quecimento adicional das células-alvo.

Aprimoramentos adicionais na cone- xão e interface entre os módulos de coleta e enriquecimento do sistema combinado podem aumentar a recuperação e produtividade da célula-alvo.

Exemplo 4. Coleta de células mononucleares, enriquecimento de células CDA4+ a partir de sangue periférico e modificação.

As células do exemplo 1 ou 2 podem ser modificadas em uma trajetória fluida conforme mostrado na figura 8. As células enriquecidas são transferidas através de uma bom- ba atéacâmarade modificação.

Um agente como um fator de crescimento (por exemplo interleucina-2), peptídeos e/ou um agente de liberação de ge- nes (por exemplo vetor viral) é introduzido e as células são mantidas a uma

' temperatura constante (cultivadas). Isto faz com que as células se alterem no fenótipo e/ou genótipo e tenham propriedades físicas e funcionais diferen- 7 tes.

As células modificadas podem ser adicionalmente cultivadas e usadas como agentes terapêuticos.

Notas de requisitos de hardware e software O console de bombas permanece virtualmente igual àquele de um CellEx existente, com uma cabeça de bomba adicional a ser adicionada — há espaço no canto do lado esquerdo inferior do console de bombas.

Se os globos e painéis usados para fotoferese são removidos do CellEx, há muito espaço para se adicionar o que é necessário para sele- ção e até mesmo modificação.

Ganchos de bolsa adicionais podem ser adi- cionados no lado esquerdo do instrumento. : Na maneira supracitada, inúmeros métodos, aparelhos e sis- . temas foram apresentados para o processamento de células sanguíneas.

Ao mesmo tempo em que um pequeno número de modalidades foi apresentado, ficará evidente aos versados na técnica sob a luz desta descrição que nume- rosas alterações e substituições podem ser feitas sem se desviar do escopo e espírito da invenção.

cial.

Dispositivos para este propósito incluem os sistemas COBEGQ Spectra e Trima Spectra Optia (todos comercializados pela Gambro BCT) e o Amicus - ou o CS-300 (comercializados pela Fenwal/Baxter) Gambro Cobe Spectra ou Optia, Fenwal Amicus ou CS-3000. De preferência, a centrifugação diferen- cialé conduzida por um sistema de fluxo contínuo.

Em uma modalidade pre- - ferencial, esta coleta de células sanguíneas a granel usa a tecnologia Thera- kos CellEx, devido a sua eficiência de coleta superior e baixo volume extra- corpóreo, em compração com outros dispositivos, que inclui os dispositivos mencionados acima.

Durante a leucaférese, a população de células não mo-

— nonucleares é reinfundida no indivíduo.

A figura 9 ilustra o dispositivo de processamento de sangue, de Ú acordo com uma modalidade da invenção.

O paciente 940 é acoplado ao : dispositivo 900 para formar um circuito fechado com um cateter de entrada 950 acoplado ao paciente 950, para fornecer sangue a entrada do dispositi- vo900eum cateter de saída 952 como uma trajetória de retorno do disposi- tivo 900 ao paciente.

O dispositivo 900 tem uma interface de entrada para receber sangue diretamente da circulação do paciente.

O dispositivo 900 tem, também, uma interface de saída para devolver as células alvo e/ou cé- lulas não-alvo enriquecidas à circulação do paciente.

O dispositivo 900 e o paciente formam um circuito fechado quando acoplados juntos.

O dispositivo 900 inclui uma unidade de coleta por leucaférese 910 e uma unidade de en- riquecimento 920. A unidade ou módulo de coleta (por leucaférese) 910 cole- ta células sanguíneas mononucleares a granel a partir do sangue recebido.

A unidade ou módulo de enriquecimento 920 enriquece concomitantemente as células-alvo separadas das células não-alvo no volume de células san- guíneas mononucleares.

O dispositivo 900 tem uma interface de operação 960 para recepção de entradas e para fornecer saídas para um operador (não mostrado). O dispositivo 900 compreende, também, um console de bombas / válvulas 964. O dispositivo 900 pode, também, compreender uma unidade de modificação opcional 930. O dispositivo 900 compreende uma centrífuga 962 para o processamento de células sanguíneas, conforme ex- plicado deste ponto em diante no presente documento.

Um controlador (não mostrado) é acoplado a interface de operação 960 e aos outros módulos Ú para controle automatizado da operação do dispositivo 900. - No sistema Therakos CellEx, uma cuba de centrífuga, como, por exemplo, uma cuba Latham, conforme mostrado na patente U.S. nº

4.303.193, concedida a Latham, Jr em 1 de dezembro de 1981 e intitulada - "Apparatus for separating blood into components thereof', que é aqui incor- porada, por referência, em sua totalidade, separa o sangue em eritrócitos e "creme leucocitário”. A cuba Latham é um componente separador de sangue que têm sido usado por algum tempo no mercado de leucaférese médica, bem como em terapias médicas como fotoferese extracorpórea (ECP). A patente U.S. nº 5984887, "Photopheresis treatment of leukocyte", fornece ] descrições de fotoferese extracorpórea e seu método de separação e centri- . fugação de células.

A figura 7 é um diagrama esquemático mais detalhado do dis- positivo de processamento de sangue representado na figura 9 (bem como o sistema da figura 10 descrito deste ponto em diante no presente documen- to). O dispositivo de processamento de sangue 700 é mostrado acoplado a um paciente 736 na figura 7. Um nódulo de coleta 702 e um nódulo de retor- no 756 são conectados ao paciente da forma mostrada na figura 9. O nódulo de coleta 702 faz parte de uma interface de entrada, incluindo um cateter 704 que está, por sua vez, conectado a um sensor de pressão ("coleta") 720. Em sequência, o sensor de pressão de coleta 720 é acoplado a um detector de ar 722, que está acoplado a uma válvula de coleta 724. A válvula de cole- ta 724 está acoplada a uma bomba peristáltica de "coleta" 726 que, por sua vez, está acoplada ao sensor de pressão da cuba 728. O sensor de pressão 720 afeta a operação da bomba de coleta 726. O sensor de pressão da cuba 728 está acoplado à cuba da centrífuga 730. Uma saída da cuba da centrí- fuga 730 está acoplada a uma bomba de eritrócitos (RBC) 732 e um cateter 734 que, por sua vez, está acoplado a uma trajetória de retorno, descrita em maiores detalhes deste ponto em diante no presente documento. Uma bolsa de anticoagulante (AC) 710 é acoplada a uma bom- ba peristáltica de anticoagulante 712 e um cateter adequado. A bomba 712

Claims (41)

R REIVINDICAÇÕES

1. Aparelho para o processamento de sangue, o dito aparelho ' compreendendo: uma interface de entrada para acoplamento com um paciente parareceber sangue diretamente da circulação do dito paciente, um módulo de leucaférese acoplado à dita interface de entrada para coleta a granel de células sanguíneas mononucleares a partir do dito sangue recebido, um módulo de enriquecimento acoplado ao dito módulo de leu- caférese para enriquecer concomitantemente células-alvo separadas das células não alvo nas ditas células sanguíneas mononucleares a granel, uma interface de saída acoplada a pelo menos um dentre o dito ] módulo de leucaférese e o dito módulo de enriquecimento para acoplamento . com o dito paciente para retorno das células-alvo enriquecidas a circulação dodito paciente, o dito aparelho e o dito paciente formando um circuito fe- chado quando acoplados juntos, e um controlador para controle automatizado da operação das di- tas interfaces de entrada e saída, do dito módulo de leucaférese, e do dito módulo de enriquecimento.

2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito controlador compreende: uma memória para armazenar dados e instruções para controle automatizado da operação das ditas interfaces de entrada e saída, do dito módulo de leucaférese, e do dito módulo de enriquecimento, e um processador acoplado à dita memória, capaz de acessar os ditos dados e as ditas instruções, o dito processador adaptado para executar as ditas instruções para controle automatizado da operação das ditas inter- faces de entrada e saída, do dito módulo de leucaférese, e do dito módulo de enriquecimento.

3. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente um módulo de modificação de célula-alvo acoplado a pelo menos um dentre o dito módulo de leucaférese e o dito módulo de enrique-

. cimento, o dito módulo de modificação modificando as ditas células-alvo en- riquecidas. ' 4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, compreendendo adicionalmente meios para a devolução das ditas células-alvo modificadas aoditopaciente.

5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente um módulo de modificação de células não alvo acoplado a pelo menos um dentre o dito módulo de leucaférese e o dito módulo de enri- quecimento, o dito módulo de modificação modificando as ditas células não alvomodificadas.

6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 5, compreendendo adicionalmente meios para a devolução das ditas células não alvo modifica- ' das ao dito paciente. .

7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente pelo menos uma bomba para circulação de pelo menos uma porção do dito sangue dentro do dito aparelho.

8. Aparelho, de acordo com a reivindicação 7, compreendendo adicionalmente uma bomba e pelo menos uma válvula acoplada à dita inter- face de entrada, para fornecer o dito sangue ao dito módulo de leucaférese, eoutrabomba e pelo menos uma válvula acoplada à dita interface de saída para devolver o sangue ao dito aparelho.

9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, em que o dito módulo de leucaférese compreende uma cuba de centrífuga que usa centri- fugação diferencial para coletar as ditas células sanguíneas mononucleares.

10. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, em que a dita centrifugação diferencial é conduzida por um sistema de fluxo contínuo.

11. Método de processamento de sangue, o dito método com- preendendo as etapas de: obtenção de sangue a partir de um paciente acoplado a um ú- nico dispositivo de processamento de sangue, para formar um circuito fe- chado entre o dito paciente e o dito dispositivo de processamento sanguíi- neo,

. coleta a granel de células sanguíneas mononucleares a partir do dito sangue através de leucaférese, implementada usando-se o dito dis- ' positivo de processamento de sangue no dito circuito fechado, e enriquecer concomitantemente as células-alvo separadas das células não alvo nas ditas células sanguíneas mononucleares a granel u- sando-se o dito dispositivo de processamento de sangue no dito circuito fe- chado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente a etapa de descarte das ditas células não alvo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, compre- endendo adicionalmente manutenção de uma conexão contínua entre o dito paciente no dito circuito fechado durante o processamento das ditas células- ' alvo. .

14. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, compre- endendo adicionalmente a etapa de desconexão do dito paciente do dito cir- cuito fechado por um intervalo de tempo durante o processamento das ditas células-alvo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente a etapa de monitoramento concomitante das ditas etapas de coletae enriquecimento.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as ditas etapas de coleta e enriquecimento são realizadas em diferentes seções do dito dispositivo de processamento de sangue.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a dita etapa de coleta compreende o uso de centrifugação diferencial para coletar as ditas células sanguíneas mononucleares e a dita etapa de enriquecimento compreende o uso de captura por ligante para enriquecer as ditas células- alvo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que a dita centrifugação diferencial é conduzida por um sistema de fluxo contínuo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o dito ligante é um anticorpo específico para um ligante de superfície celular.

. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o ligan- te de superfície celular é selecionado do grupo que consiste em moléculas " de adesão de células epiteliais (EpCAM), selectinas, receptores de adesão molecular, receptores de retorno, receptores de citocina, receptores de qui- miocina,eenzimas.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o ligan- te de superfície celular é um antígeno de cluster de designação (CD).

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que o anti- geno CD é selecionado do grupo que consiste em CD1a, CDA4, CD8, CD14, CD25,CD34,CD133e CD143.

23. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as ditas células-alvo são selecionadas a partir do grupo consistindo em células B, ' células T, células dendríticas, monócitos, neutrófilos, células assassinas na- . turais (NK), células reguladoras T, células auxiliares T, linfócitos T citotóxicos (CTLs), células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células progenitoras hema- topoiéticas, células endoteliais, células epiteliais, células mesenquimatosas, linfócitos, células assassinas ativadas por linfocina (LAKs), e linfócitos infil- trantes de tumores (TILs).

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que as ditas células progenitoras hematopoiéticas e as ditas células-tronco hematopoiéti- cas são enriquecidas.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que as ditas células-tronco hematopoiéticas e as ditas células progenitoras hematopoiéti- cas são positivas para pelo menos um dentre CD34, CD133 e CD143.

26. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente a etapa de modificação das ditas células-alvo enriquecidas.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a etapa de modificação envolve uma modificação que é selecionada do grupo con- sistindo em ativação, expansão, indução de apoptose, modificação genética, eindução de antigeno-especificidade.

28. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a etapa de modificação envolve uma modificação que é afetada por pelo menos um

. dentre receptores de reticulação de superfície celular, irradiação, e tratamen- to com pelo menos um dentre citocinas, quimiocinas, estimulação de antíge- 1 nos, hormônios, fármacos, pressão, e aquecimento.

29. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que a etapa de modificação envolve modificação genética, que é afetada por uma dentre transfecção e transdução de material genético em pelo menos uma porção das ditas células-alvo.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que a trans- fecção de material genético é feita por uma dentre eletroporação ou lipofec- ção.

31. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a etapa de modificação envolve uma modificação que é selecionada do grupo con- ' sistindo em ativação por linfócito T citotóxico (CTL), ativação por célula regu- . ladora T (Treg), e células sanguíneas geneticamente modificadas protegidas dovírusda imunodeficiência humana (HIV).

32. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as ditas células-alvo são selecionadas a partir do grupo consistindo em células ma- lignas do sangue, células malignas de tecido, células infectadas com vírus, células infectadas com bactérias, pelo menos um vírus, pelo menos uma bactéria, um parasita, células fetais, e células efetoras patogênicas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente a etapa de retorno das células não alvo ao paciente conec- tado ou desconectado ao dito circuito fechado.

34. Método, de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente a etapa de modificação das células não alvo e retorno das ditas células não alvo ao paciente conectado ou desconectado ao dito circui- to fechado.

35. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o enri- quecimento das células-alvo é afetado por pelo menos um dentre ímãs, se- paração de células ativada por fluorescentes, microfluídicos, suporte sólido, acústicas, bioluminescência, classificação de anticorpos, e substrato enzimá- tico.

' 36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que a dita partícula é selecionada do grupo que consiste em uma partícula magnética e ' uma partícula de densidade modificada.

37. Sistema para o processamento de sangue, o dito sistema compreendendo: meios para se obter sangue de um paciente, e um único dispositivo de processamento de sangue acoplado aos ditos meios de obtenção e ao dito paciente, para formar um circuito fe- chado entre o dito paciente e o dito disposítivo de processamento de san- gue, ditodispositivo de processamento de sangue compreendendo: meios para coleta a granel de células sanguíneas mononuclea- res a partir do dito sangue através de leucaférese, implementada usando-se ' o dito dispositivo de processamento de sangue no dito circuito fechado, e . meios para enriquecer concomitantemente as células-alvo se- paradas das células não alvo nas ditas células sanguíneas mononucleares a granel usando-se o dito dispositivo de processamento de sangue no dito cir- cuito fechado.

38. Sistema, de acordo com a reivindicação 37, compreenden- do adicionalmente meios para descarte das ditas células não alvo.

39. Sistema, de acordo com a reivindicação 37, compreenden- do adicionalmente meios para monitorar concomitantemente a coleta e enri- quecimento dos ditos meios de coleta e enriquecimento, respectivamente.

40. Sistema, de acordo com a reivindicação 37, em que os di- tos meios de coleta usam centrifugação diferencial para coletar as ditas célu- las sanguíneas mononucleares e os ditos meios de enriquecimento usam captura por ligante para enriquecer as ditas células-alvo.

41. Sistema, de acordo com a reivindicação 40, em que o dito ligante é um anticorpo específico para um ligante de superfície celular.