WO2024043706A1 - 약리 활성 물질의 신규 분자회합체 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

약리 활성 물질의 신규 분자회합체 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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WO2024043706A1
WO2024043706A1 PCT/KR2023/012518 KR2023012518W WO2024043706A1 WO 2024043706 A1 WO2024043706 A1 WO 2024043706A1 KR 2023012518 W KR2023012518 W KR 2023012518W WO 2024043706 A1 WO2024043706 A1 WO 2024043706A1
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WO
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sunitinib
pharmaceutical composition
molecular
present
pharmacologically active
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PCT/KR2023/012518
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김철환
김경희
오주영
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주식회사 스카이테라퓨틱스
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    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to a novel molecular assembly of pharmacologically active substances with improved physical properties. More specifically, the present invention relates to a novel molecular complex that has an improved therapeutic effect on posterior ocular diseases and disorders due to its high biological permeability and excellent permeability to the cornea, which is one of the biological membrane tissues, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the active pharmaceutical ingredient Due to the physicochemical properties of the active pharmaceutical ingredient (API), it is known to be highly soluble in dimethyl sulfoxide (DMSO), an organic solvent, but has low solubility in ethanol or water.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the solubility of sunitinib, one of the pharmacologically active substances, in water is about 0.364 mg/ml (pH 6; J. Med. Chem., 2003, 46, 1116-1119).
  • commercially available sunitinib products were released in malate form, a formulation that overcomes the poor solubility and low bioavailability of the drug.
  • the solubility of sunitinib malate is not completely improved in a wide range of pH aqueous solutions, and its bioavailability is also poor.
  • wet macular degeneration is a disease in which the central part of the nerve membrane is destroyed due to abnormal new blood vessel formation in the macula area of the eye.
  • the blood vessel walls of new blood vessels are fragile, which often causes bleeding or leaks of plasma and lipid components out of the blood vessels. This causes the macular area to protrude and causes edema and retinal detachment, severely impairing vision.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • CNV choroidal neovascularization
  • CNV choroidal neovascularization
  • Intraocular injection treatments used for wet macular degeneration are neutral antibodies to vascular endothelial growth factor, such as aflibercept and ranibizumab, which inhibit angiogenesis by blocking the action of vascular endothelial growth factor in tumor blood vessels.
  • VEGF receptor tyrosin kinase inhibitors that are currently approved as anticancer drugs
  • representative examples are small molecule compounds such as Sunitinib, Pazopanib, and Axitinib.
  • TKI VEGFR tyrosin kinase inhibitor
  • Eylea® aflibercept
  • Lucentis® afibizumab
  • Non-surgical/non-invasive eye treatments include eye drops, but these have the problem that the drug does not penetrate the cornea, making it difficult to reach the posterior segment of the eye.
  • multinational pharmaceutical companies conducted clinical trials on VEGFR inhibitor eye drops, but efficacy could not be confirmed because the drug was not delivered to the retina.
  • Patent Document 001 US 2015-0174096 A1
  • Patent Document 002 US 10154994 B2
  • Patent Document 003 US 2017-0273901 A1
  • the object of the present invention is to provide novel molecular complexes of pharmacologically active substances.
  • eye/corneal permeability is improved, thereby maximizing drug absorption within the eye, thereby providing a new molecular complex of active substances with an anti-angiogenic effect in eye diseases in the posterior segment.
  • the present invention provides safer and more effective therapeutic methods and pharmaceutical compositions for non-surgical/non-invasive delivery of therapeutic agents to posterior ocular tissues for the treatment of posterior ocular diseases and disorders.
  • a molecular association of a pharmacologically active substance is provided, wherein the spatial proximity distance of protons between molecules in a solution phase is within 10 ⁇ .
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing ophthalmological disorders comprising the above molecular complex is provided.
  • a pharmaceutical kit comprising a container containing a composition, wherein the container has dispensing means adapted for topical administration of the pharmaceutical composition to the eye of a patient.
  • an eye drop using a composition comprising a molecular assembly of sunitinib malate, wherein the molecular assembly has a spatial proximity distance of intermolecular protons within 10 ⁇ in a solution phase
  • the composition (Ussing) Provides an eye drop characterized in that it shows a transmittance 3.5 times higher than that of a composition containing sunitinib malate in a porcine corneal permeability test using a chamber.
  • novel molecular complex of pharmacologically active substances implemented in the present invention shows an improved angiogenesis inhibitory effect in posterior ocular diseases and disorders when used as a pharmaceutical composition due to its excellent biopenetration rate.
  • the pharmaceutical ocular composition embodied in the present invention can be used to treat posterior ocular diseases or disorders as an eye drop, which is a non-surgical/non-invasive method.
  • compositions embodying the present invention can be used to treat or prevent retinal or posterior eye diseases.
  • FIG 1 shows 1H-NMR results for the sunitinib malate product (top), which is readily available from commercial sources, and the molecular complex of sunitinib of the present invention (bottom).
  • FIG. 2 shows 2D NMR-NOESY results for sunitinib malate product readily available from commercial sources.
  • Figure 3 is a diagram showing the 2D NMR-NOESY results for the sunitinib molecular complex of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the three-dimensional structure predicted based on the 2D NMR-NOESY spectrum for the sunitinib molecular complex of the present invention.
  • Figure 5 shows a self-made Ussing Chamber used in corneal penetration experiments of sunitinib malate (API) and the molecular complex of sunitinib malate (SCAI-WP) of the present invention.
  • FIG. 6 shows fluorescein angiography (FFA) imaging images of CNV-induced mouse retina treated with a pharmaceutical composition containing a molecular complex of sunitinib malate, the present invention, and CTF (Corrected Total Fluorescence) showing fluorescein leakage from lesion blood vessels. This is a result showing the retinal lesion value of .
  • FFA fluorescein angiography
  • Figure 7 shows optical coherence tomography (OCT) images of mouse retinas with induced CNV treated with a pharmaceutical composition containing the molecular complex of sunitinib malate, the present invention, and the results showing the volume measurement values of the CNV lesion area.
  • OCT optical coherence tomography
  • Figure 8 is a result showing an electroretinogram evaluation graph of the CNV-induced mouse retina treated with a pharmaceutical composition containing the molecular complex of sunitinib malate of the present invention.
  • Figure 9 shows a mouse retinal fluorescein angiography (FFA) image of a pharmaceutical composition containing a molecular complex of sunitinib malate of the present invention and a pharmaceutical composition containing other pharmacologically active substances, and fluorescein in lesion blood vessels. This is the result of comparing the retinal lesion values of leaked CTF.
  • FFA retinal fluorescein angiography
  • Standard chemical symbols are used interchangeably with the full name represented by the symbol. For example, “hydrogen” and “H” are understood to have the same meaning. Standard techniques can be used for chemical processes, interactions between molecules, chemical analysis, formulation of compositions and testing thereof. The above techniques and procedures can generally be performed according to conventional methods well known in the art.
  • Molecular association refers to a novel molecular association of pharmacologically active substances obtained by controlling physical behavior, created using shear force considering the physical interaction between molecules existing in a solution.
  • a new molecular association created by considering physical interactions between molecules refers to a molecular association of pharmacologically active substances with improved physical properties.
  • 2D NMR-NOESY NOESY technology
  • 2D NMR-NOESY NOESY technology
  • This technique can be used to create correlations between adjacent protons.
  • This is a technique that contrasts with other 2D NMR techniques (HSQC, TOCSY) that observe the correlation between nuclei connected directly or indirectly by chemical bonds.
  • “Pharmaceutical composition” is defined as a chemical or biological compound or substance, or substance, or a mixture or combination of two or more such compounds or substances, intended for use in the medical diagnosis, cure, treatment or prevention of a disease or condition. do.
  • a pharmaceutical ocular composition which is one embodiment of the present invention, includes a molecular complex including sunitinib and a sunitinib salt.
  • Dispersion medium is named and defined as a continuous phase, interchangeable with the continuous phase that constitutes the desired final composition. That is, if the final composition is a pharmaceutical composition, the dispersion medium and continuous phase may be water, saline solution, or buffered aqueous solution, but are not limited thereto.
  • a pharmaceutical ocular composition which is one embodiment of the present invention, contains a novel molecular complex of sunitinib and a sunitinib salt and may further include a dispersion medium.
  • the present invention provides molecular complexes of pharmacologically active substances.
  • the molecular assembly is characterized in that the spatial proximity of protons between molecules in the solution phase is within 10 ⁇ .
  • the pharmacologically active substance is a Tyrosine Kinase Inhibitor such as Sunitinib, Axitinib, Pazopanib, Cyclosporine, It may be any one or derivatives thereof selected from the group consisting of Niclosamide, Adenosine, Deoxycholic acid, Paclitaxel, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • sunitinib or sunitinib salt can be used, but it is not necessarily limited thereto.
  • Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy used to analyze the 3D structure of small molecules, is a commonly used technique in chemistry. NMR spectroscopy allows you to study the nucleus of a molecule and obtain information about its chemical surroundings based on how the atoms are connected.
  • the 1 H and 13 C atoms are magnetically active (i.e. NMR active), and when a sample containing NMR active nuclei is placed in a magnetic environment and exposed to a specific radio frequency, the 1 H or 13 C atoms are converted into high energy states. 13 The nuclear atoms of C become excited. When excited from a low energy level to a high energy level, a spectrometer detects a change in the relaxation phenomenon of nuclear spin. This change is a change in the spin state due to nuclear magnetic resonance. Peaks located in different spectra show different positions depending on the chemical bonding environment associated around the nucleus.
  • Figure 1 is a 1D-NMR 1 H spectrum for sunitinib, one of the pharmacologically active substances, observed according to the NMR principle described above. Upon observation, it was easier to identify protons considering the position of the interatomic bond structure in the spectrum dissolved in D 2 O solution than in DMSO-d6 solution.
  • the spatial proximity of protons between molecules in a solution can be observed with 2D NMR-NOESY.
  • the 2D NMR-NOESY spectrum is an analysis method that uses the Overhauser effect and allows analysis of the spatial proximity of protons between molecules.
  • the spatial proximity of protons between molecules is up to 5 ⁇ , and inter-molecular interactions can be observed.
  • (1H,1H)-NOESY and ROESY provide information about spatial proximity of protons that are separated by up to about 5 ⁇ , (Modern Methods in Natural Products Chemistry ; Arthur S. Edison, Frank C. Schroeder, in Comprehensive Natural Products II, 2010 )
  • 1 H- 1 H coupling interaction of adjacent protons between molecules can be observed. Additionally, by integrating the cross peak volume of the 2D NMR-NOESY spectrum, information on the spatial proximity distance and degree of interaction between adjacent protons between molecules can be obtained.
  • the molecular assembly of the present invention is a molecular assembly in which the spatial proximity of protons between molecules is within 10 ⁇ , and 1 H- 1 H coupling interaction is observed when measured by 2D NMR-NOESY.
  • the pharmacologically active substance relates to sunitinib or a sunitinib salt
  • the molecular assembly may have a spectrum in which the alkyl group of the sunitinib chemical structure and the double bond or aromatic ring excluding the alkyl group form a strong intensity with each other, but is not limited thereto.
  • the pharmacologically active substance relates to sunitinib or a sunitinib salt
  • the molecular assembly may have a spectrum in which a strong peak intensity is observed at a chemical shift value ( ⁇ ) of 1.5 to 2.0 and a peak intensity of 6 to 6.5 at the off-diagonal peak position of the 2D NMR-NOESY spectrum, but is not limited thereto.
  • the pharmacologically active substance relates to sunitinib or a sunitinib salt
  • the molecular assembly may be a molecular assembly characterized by having the 2D NMR-NOESY spectrum shown in FIG. 3, but is not limited thereto.
  • the NMR spectrum located at the top of Figure 1 is the 1 H-NMR spectrum for sunitinib malate measured in D 2 O NMR solvent of sunitinib malate, a product readily available from commercial sources.
  • the NMR spectrum located at the bottom shows the 1 H-NMR spectrum for the molecular complex of sunitinib, one of the embodiments of the present invention, measured with D 2 O NMR solvent.
  • Figure 2 is a 2D NMR-NOESY spectrum for sunitinib malate, a product readily available from commercial sources, measured in D 2 O NMR solvent and corresponds to Comparative Example 1, which will be described later. .
  • 1 H- 1 H coupling interaction peaks due to intermolecular interactions are not observed at the off-diagonal peak positions of 1, 2, and 3.
  • peak intensity was observed, but the cross peak volume was observed to be relatively small.
  • Figure 3 is a 2D NMR-NOESY spectrum of Example 1, one of the embodiments of the present invention. In the case of the off-diagonal peak position of 4, it can be seen that the peak intensity is observed to be stronger.
  • the drawing located on the left of FIG. 4 is the result of predicting the three-dimensional structure of the molecular assembly of the present invention based on the 2D NMR-NOESY spectrum of FIG. 3, and the drawing located on the right of FIG. 4 is the off of 4 of FIG. 3.
  • the three-dimensional structure of the molecule of the molecular assembly of the present invention is predicted as a result of integration of the cross peak volume located at the diagonal peak position.
  • the cross peak volume located at the off-diagonal peak position of 1 in FIG. 3 can be explained as follows. It shows that the protons in the O position located in the alkyl group of the sunitinib malate molecule and the protons in the C, D, F, and G positions located in the aromatic group have strong intermolecular interactions.
  • the cross peak volume located at the off-diagonal peak position of 2 shows that the protons at the M, N, and O positions of the sunitinib malate molecule and the protons at the I, I', J, and K positions strongly interact with each other between molecules. It is being done.
  • the cross peak volume located at the off-diagonal peak position in 3 indicates that the protons at the I, I', J, and K positions and the protons at the C, D, F, and G positions are strongly intermolecular interactions.
  • the cross peak volume located at the off-diagonal peak position in 4 can be explained by the drawing located on the right side of FIG. 4.
  • the sunitinib malate molecule present in the molecular assembly of the present invention exhibits stronger intermolecular interactions due to intramolecular double bond rotation, resulting in an increase in the cross peak volume for the existing off-diagonal peak.
  • the molecular assembly of the present invention has a molecular assembly structure in which molecules are closely packed, as shown in FIG. 4.
  • the molecular assembly of the present invention is a molecular assembly in which alkyl groups and aromatic groups are closely attached to each other, forming a structure in which steric hindrance between molecules is minimized. .
  • a new molecular assembly can be obtained by adjusting the strength of the shear force in consideration of the physical interaction between molecules.
  • the number average diameter of the molecular assembly containing the pharmacologically active substance may be about 100 nm or less.
  • the number average diameter of the molecular assembly may be about 80 nm or less.
  • the number average diameter of the molecular assembly may be about 50 nm or less.
  • the number average diameter of the molecular assembly may be about 1 nm to about 20 nm.
  • the number average diameter of the molecular assembly may be about 1 nm to about 10 nm.
  • the number average diameter of the molecular assembly may be about 1 nm to about 5 nm.
  • the number average diameter of the molecular assembly can be confirmed through transmission electron microscopy (TEM) experiment results, but is not limited to this.
  • TEM transmission electron microscopy
  • the molecular assembly according to an embodiment of the present invention can be produced by applying shear stress to a solution containing a pharmacologically active substance.
  • the pharmacologically active substance is a Tyrosine Kinase Inhibitor such as Sunitinib, Axitinib, Pazopanib, Cyclosporine, It may be any one or derivatives thereof selected from the group consisting of Niclosamide, Adenosine, Deoxycholic acid, Paclitaxel, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • sunitinib or sunitinib salt can be used, but it is not necessarily limited thereto.
  • the sunitinib salt may be sunitinib malate, but is not limited thereto.
  • the method of controlling physical behavior using the shear stress may be either mechanical shear stress or ultrasonic application.
  • the mechanical shear stress may be applied by passing the solution through a column or filter paper filled with one or more selected from the group consisting of silica gel, molecular sieve, sand, paper filter, and alumina. Below, mechanical shear stress is explained in detail.
  • the mechanical shear stress may be applied by passing a solution containing a pharmacologically active material through a column filled with silica, etc.
  • a solution containing the pharmacologically active material passes through a column filled with silica or the like, the pharmacologically active material undergoes a very high shear stress as it passes through a physically narrow area.
  • the silica may be spherical or prismatic, but its shape is not limited.
  • the size of the silica may be 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.1 to 10 ⁇ m, and more preferably 2.5 to 3.7 ⁇ m. When the size of the silica is less than 0.01 ⁇ m or more than 100 ⁇ m, even if the solution containing sunitinib passes through a column filled with silica, shear stress is not applied and there may be no change in the structure.
  • a negative pressure of 0.1 bar to 1.0 bar or 0.2 bar to 0.9 bar can be applied to the bottom of the column filled with silica.
  • the negative pressure applied to the bottom of the column filled with silica is less than 0.1 bar, the time required for the solution containing the pharmacologically active material to pass through the column increases, thereby reducing the production time of the new molecular assembly according to the present invention. There may be a delay.
  • the negative pressure applied to the bottom of the column filled with silica is more than 1.0 bar, the time required for the solution containing the pharmacologically active material to pass through the column is reduced, thereby reducing the time required for the solution containing the pharmacologically active material to pass through the column. Manufacturing time may be shortened, but manufacturing costs may increase because additional pump equipment is required.
  • the mechanical shear stress may be applied by passing a solution containing the pharmacologically active material through one or more filter papers.
  • the pharmacologically active material undergoes a very high shear stress by passing through a physically narrow area.
  • the filter paper may be one filter paper or two or more filter papers.
  • the filter paper may be stacked and arranged.
  • the filter paper is a plurality of two or more filter papers, a higher shear stress can be provided than a single filter paper.
  • the pore size of the filter paper may be 0.1 to 5.0 microns or 0.3 to 4.5 microns. If the pore size of the filter paper is less than 0.1 micron, the amount of the solution containing the pharmacologically active material passing through or filtering through the filter paper is too small, and the production rate of the new molecular assembly according to the present invention may be reduced. If the pore size of the filter paper is greater than 5.0 microns, the solution containing the pharmacologically active material may simply pass through the filter paper and shear stress may not be effectively applied.
  • the shear stress may be applied using ultrasonic waves.
  • the application of ultrasonic waves will be described in detail below.
  • the shear stress may be applied by applying ultrasound to a solution containing the pharmacologically active material.
  • the intensity of the applied ultrasound may be 200 J/sec to 800 J/sec or 400 J/sec to 600 J/sec.
  • the energy applied per volume of the applied ultrasound can be calculated as the intensity of the ultrasound (J/sec) x the applied time (sec)/measured volume (ml).
  • the energy applied per volume of ultrasound applied to the solution containing the pharmacologically active material may be 100 J/ml to 90 kJ/ml. If the energy of the ultrasound is less than 100 J/ml, sufficient shear stress is not applied to the solution containing the pharmacologically active material, making it difficult to form the structure. Additionally, when the energy of the ultrasound is greater than 90 kJ/ml, excessive heat may be applied to the solution containing the pharmacologically active material, making it difficult to form the structure.
  • the ultrasound may be applied at 10°C to 80°C for 10 seconds to 60 minutes.
  • the ultrasound is applied at a temperature of less than 10°C, there is no change in the solution containing the pharmacologically active material, and when it is applied at a temperature of more than 80°C, a phase change occurs in the solution containing the pharmacologically active material, thereby forming the present invention.
  • the formation of new molecular associations may be difficult.
  • the ultrasound is applied for less than 10 seconds, there is no change in the solution containing the pharmacologically active material, and when applied for a time exceeding 60 minutes, the structure in the solution containing the pharmacologically active material is deformed, It is not possible to form a pharmacologically active substance according to the invention.
  • a column filled with silica can be combined with an ultrasonic generator by applying the shear stress.
  • the silica-filled column may be placed inside an ultrasonic generator, or the silica-filled column and the ultrasonic generator may be separated and placed continuously.
  • the column may be placed in an ultrasonic generator to apply ultrasonic waves. Additionally, after applying ultrasound to a solution containing the pharmacologically active material, the solution may be passed through a column filled with silica.
  • a step of reacting the pharmacologically active material in an organic solvent may be performed prior to applying the shear stress.
  • the organic solvent any polar solvent can be used without particular limitation. Specifically, a solvent containing an OH group can be used, and alcohols such as ethanol can be preferably used.
  • filtering and drying steps can be additionally performed to remove residual solvent.
  • filtration and drying methods used in the industry can be used without particular restrictions as long as they do not affect the molecular assembly.
  • the solution phase Before shear stress is applied, the solution phase can be in any state such as supersaturated, saturated, and unsaturated.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for treating or preventing ophthalmological disorders containing the above molecular complex.
  • the pharmaceutical composition may be administered in any one dosage form selected from the group consisting of powder, granule, tablet, capsule, and liquid form, but is not necessarily limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may include at least one pharmaceutically acceptable vehicle or at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the mediator and additives may include commonly used mediators or additives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain, in addition to the molecular complex of the present invention, one or more mediators or additives selected from the group consisting of buffering agents, viscosity modifiers, isotonic agents, antioxidants, chelating agents, and pH adjusters. .
  • pharmaceutically acceptable vehicles suitable for use in the pharmaceutical composition are those commonly used in ophthalmic preparations, such as cyclodextrin, methylcellulose (MC), and hydroxyethyl.
  • Cellulosic polymers such as cellulose (HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), hydroxypropyl-methylcellulose (HPMC), and sodium carboxymethylcellulose (NaCMC) and polyvinyl alcohol (PVA) can be used, but are limited to these. I never do that.
  • pharmaceutically acceptable additives suitable for use in the pharmaceutical composition include polymer-based carriers such as stabilizers, surfactants, gelling agents, organic co-emulsions, pH active components, osmotic agents.
  • active ingredients and preservatives include, but are not limited to:
  • the pharmaceutical composition can be used as an ophthalmological eye drop.
  • the pharmaceutical composition may refer to an aqueous ophthalmological preparation for topical administration to the eye.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a dispersion medium, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition which is one of the embodiments of the present invention, has the effect of being stably dispersed in a dispersion medium.
  • the dispersion medium may be water, a saline solution, or a buffered aqueous solution as previously described in terms and definitions, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as an eye drop as a non-invasive treatment method.
  • a typical method of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is eye drop delivery.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can treat or prevent ophthalmological disorders.
  • the present invention can provide a method of treating or preventing ophthalmological disorders by administering a composition containing the above molecular complex to the eye.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a treatment for posterior ocular diseases and disorders.
  • the posterior eye diseases and disorders are diseases related to inflammatory reactions, proliferation, and angiogenesis in the posterior region of the eye. Representative examples include age-related macular degeneration (AMD), choroidal neovascularization (CNV), and chorionic neovascular membrane (CNVM). ), retinal retina (ERM) and macular holes, myopia-associated neovascularization of the choroid, retinal detachment, diabetic retinopathy, diabetic macular edema (DME), atrophic changes in the reticular pigment epithelium (RPE), reticularis.
  • AMD age-related macular degeneration
  • CNV choroidal neovascularization
  • CNVM chorionic neovascular membrane
  • ECM retinal retina
  • macular holes myopia-associated neovascularization of the choroid
  • retinal detachment diabetic retinopathy
  • Hypertrophic changes in the pigment epithelium RPE
  • retinal vein occlusion chorionic retinal vein occlusion
  • retinitis pigmentosa Stargardt's disease
  • glaucoma inflammatory diseases
  • cataracts refractory anomalies
  • keratoconus prematurity.
  • the disease may include, but is not limited to, retinopathy, keratitis, corneal vascularization, corneal migration or corneal molding, corneal vascularization due to hypoxemia (wearing wide-area contact lenses), pterygium conjunctiva, fundus edema, and intraretinal edema.
  • the treatment effect and efficacy of wet yellow degeneration are evaluated by measuring the CNV area of the eye, that is, the degree of vascular leakage, in an animal disease model characterized by choroidal neovascularization (CNV). It may be possible, but it is not limited to this.
  • CNV choroidal neovascularization
  • the molecular complex of the pharmacologically active substance of the present invention exhibits high biological permeability. Due to the stable molecular assembly state of the present invention, the molecular assembly of the present invention exhibits a higher bio or cell penetration rate than general pharmacologically active substances.
  • the biological/cell permeability is a measure of the absorption and permeability of a substance to tissues or cell membranes in the living body, and refers to the cornea, skin, blood brain barrier, and blood retina barrier. It measures the concentration of a pharmacologically active substance that can pass through the same biological barrier in the living body.
  • in vivo tissue or cell membrane can be any cell made up of cells in the human body, and is not limited to the mentioned in vivo tissue or cell membrane.
  • the cell membrane may be at least one from the group consisting of endothelial cells, cardiac cells, immune cells, skeletal muscle cells, and brain cells, and the molecular complex of the pharmacologically active substance may be oral, transmucosal, topical, transdermal, intradermal, subcutaneous, ocular, or Cell permeation by at least one route selected from the group consisting of intravitreal, subconjunctival, intrachoroidal, intrabronchial, pulmonary, intravenous or arterial, intraduodenal, intravesical, parenteral, subarachnoid, intramuscular, and intragastric. It is possible, but is not limited to this.
  • tissues and cells that can be penetrated by the molecular complex of the pharmacologically active substance include the corneal epithelium, retinal pigment epithelium, sclera, conjunctiva, It may be at least one from the group consisting of cells or cell membranes within or around eye tissues, such as Bruch's membrane and choroid, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition containing the molecular complex of the pharmacologically active substance can easily deliver the molecular complex of the pharmacologically active substance into cells, particularly to the retina within the eye.
  • the corneal transmittance of a pharmaceutical composition containing a molecular complex of sunitinib malate, an example of a pharmacologically active substance was measured.
  • the molecular assembly of the pharmacologically active substance is unsaturated in the final dispersion medium (or the active substance content is below the saturated solubility in the final dispersion medium) (e.g., the content of the active substance and the
  • a composition which may include the composition of the dispersion medium
  • the biological barrier permeability e.g., corneal permeability, skin permeability, GI trac permeability, BBB permeability, etc.
  • the biological barrier permeability e.g., corneal permeability, skin permeability, GI trac permeability, BBB permeability, etc.
  • it can be increased by more than 1.1 times, more than 1.2 times, more than 1.5 times, more than 2 times, more than 3 times, more than 3.5 times, more than 5 times, and more than 10 times.
  • the representative animal disease model for wet macular degeneration is a disease model characterized by choroidal neovascularization.
  • a novel molecular complex containing sunitinib malate an example of a pharmacologically active substance, can inhibit neovascularization in posterior ocular diseases and disorders.
  • the novel molecular complex containing sunitinib or sunitinib malate as the pharmacologically active substance is the existing sunitinib malate in the mouse CNV model. It shows a significant effect of inhibiting blood vessel formation compared to .
  • the CNV model is one of the disease models of wet macular degeneration, and uses a laser to artificially damage the choroid of the eye to induce the formation of new blood vessels.
  • the effect of inhibiting neovascularization in the mouse eye is observed using Fundus Fluorescein angiography (FFA) and optical coherence tomography (OCT).
  • FFA Fundus Fluorescein angiography
  • OCT optical coherence tomography
  • the fluorescein angiography is an experimental technique commonly used to diagnose choroidal neovascularization by injecting a fluorescein contrast agent into the eye and then photographing and observing the leakage density of the fluorescent dye and the size of the CNV lesion. .
  • the optical coherence tomography technique is a common experimental technique that measures the volume of lesion areas in the retina and choroid using high-resolution and coherence tomography equipment.
  • an eye drop formulation containing a structure of a pharmacologically active substance can be administered to the mouse eye at different doses to evaluate the CNV lesion inhibition efficacy and dose-dependent effectiveness.
  • electroretinogram changes are measured to evaluate the effect of the pharmacologically active substance construct on retinal function in a mouse CNV model.
  • Electroretinogram is a test method that measures the electrical activity of the retina in response to light stimulation.
  • the electroretinogram change in response to a light stimulus such as a mono-flash is evaluated using the scotopic ERG (electro-retinogram) as the amplitude of the ER G graph wave.
  • scotopic ERG electro-retinogram
  • a pharmaceutical kit including a container containing the pharmaceutical composition can be provided, wherein the container has dispensing means adapted to topically administer the pharmaceutical composition to the eyes of a patient.
  • an eye drop using a composition containing a molecular assembly of sunitinib malate, wherein the molecular assembly has a spatial proximity distance of intermolecular protons within 10 ⁇ in the solution can provide an eye drop that shows a transmittance 3.5 times higher than that of a composition containing sunitinib malate in a porcine corneal permeability test using an Ussing chamber.
  • sunitinib malate solution was prepared by dissolving 0.332 g of sunitinib malate (Nanjing furuisi Pharma, China) in 100 g of purified water.
  • SYLOID 244FP (GRACE, USA) with 200 g of 94.5% ethanol, place a 0.45 ⁇ m PVDF membrane filter on a Buchner funnel with a diameter of 90 mm, and prepare it as a vacuum filtration type.
  • the SYLOID 244FP solution soaked in ethanol was poured into a Buchner funnel and packed to prepare a SYLOID 244FP column about 1 cm high.
  • the sunitinib malate solution prepared on the column was added using a vacuum pump, and 400 g of 94.5% ethanol solution containing 0.1 mL of 1M HCl and 0.2 mL of 1M NaCl was passed through the column to recover the sunitinib remaining in SYLOID 244 FP. .
  • the outflow flow rate was about 2.25 g/min and the outflow liquid was 506.83 g.
  • the concentration of sunitinib present in the effluent was analyzed using HPLC (Waters, e2695), and the amount of sunitinib obtained was 0.206 g. At this time, the recovery rate is about 82%.
  • sunitinib malate molecular assembly was obtained.
  • 35% (813.4 mg) was excipient [salt] and 65% (1510 mg) was sunitinib malate molecular assembly. It was a combination.
  • the applicant of the present invention used the expression WP for the manufactured molecular assembly.
  • a pharmaceutical composition was prepared by adding 25mM Sodium Phosphate (pH 6.3) as a pH buffer and 110mM NaCl as an isotonic agent to a 0.5 mg/ml aqueous solution of sunitinib malate molecular complex obtained in Example 1.
  • a pharmaceutical composition was prepared in the same manner as Example 2, except that sunitinib malate of Comparative Example 1 was used.
  • sunitinib malate molecular complex prepared according to Example 1 of the present invention was dissolved in 4 mL of D 2 O (deuterated water).
  • the solid content of sunitinib malate was dispersed in a D 2 O (heavy water) solvent at a concentration of about 10 mg/mL, and then sampled and analyzed in a 5 mm diameter NMR dedicated tube from Wilmad.
  • the NMR device used was Bruker's 400 MHz AVANCE III HD (magnetic field approximately 9.4 Tesla), and the pulse sequences used were "zg30" and "noesygpphpp" in the order of each experiment.
  • FIG. 3 of Example 1 shows a wider cross peak volume than FIG. 2. This is data showing that the distance between molecules is closer, and it is predicted to have a structurally new chemical entity.
  • Comparative Example 1 is expected to have a structure in which the distance between molecules in the solution phase exceeds 10 ⁇ .
  • Example 1 is predicted to have a novel structural form that is somewhat rigid in the form of a somewhat rigid structure in which the proton proximity between molecules is within 10 ⁇ in the solution phase.
  • Example 2 A corneal penetration test was performed on the sunitinib malate itself of Example 2 and Comparative Example 1, which are pharmaceutical compositions containing the sunitinib malate molecular complex in powder form prepared in Example 1.
  • the corneal penetration experiment was performed using the already published paper "Lee et. al , "Modulating the Transport Characteristics of Bruch's Membrane With Steroidal Glycosides and its Relevance to Age-Related Macular Degeneration (AMD). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015 , 56 , 8403., 2015”.
  • the cell for the permeation experiment was a self-made ussing chamber, as shown in Figure 5.
  • the Wussing chamber is largely composed of three parts: a donor chamber where the drug is administered, a receiver chamber, and a membrane through which the drug permeates.
  • the drug is injected into the supply chamber of the Wussing chamber, the cornea of the pig's eye is taken in a circular shape of 8 mm in size, other tissues attached to the cornea are removed, fixed to the membrane position, and the solution that has penetrated the membrane is It was received in a receiving chamber, and stored in a constant temperature chamber set at 37°C, which is close to human body temperature, at which time diffusion occurs.
  • the solution concentration in each supply chamber and receiving chamber was measured to determine the diffusion properties of each sample.
  • the concentration after 18 hours for each sample is shown in Table 1 below.
  • the concentration was measured using a UV/VIS spectrum (Thermo, Evolution201 UV/Vis) and using a peak height of 420 nm.
  • each eye drop test group was administered twice daily for 10 days.
  • FFA fundus fluorescein angiography
  • anesthetic eye drops were instilled into the eye to provide additional local anesthesia, and mydriatic medication was administered. Induce mydriasis by instilling. Place the mouse on the sacrificial table, focus the image on the fundus with the Micron-IV imaging camera, apply lubricating gel to the eye, and then bring the Micron-IV lens into contact with the mouse's cornea.
  • test substance and PBS are instilled twice a day (8 hours apart) at a volume of 5 uL/eye from the day of CNV induction (day 0) to the morning of the day of retinal imaging evaluation (day 11).
  • aflibercept a control substance
  • a control substance is administered to both eyes at a volume of 1 uL/eye after inserting a 36G needle connected to the IO kit through scleral puncture immediately after CNV induction.
  • a drop of antibiotic eye drop is applied to the mouse's eye to prevent infection.
  • mice are general anesthetized with ketamine and then intraperitoneally injected with a fluorescent contrast agent.
  • mydriasis is induced by instilling mydriatic medication.
  • Place the mouse on the sacrificial table focus the image on the fundus with Micron-IV's imaging camera, apply lubricating gel to the eye, and then bring the OCT lens into contact with the mouse's cornea.
  • FFA/OCT imaging a drop of antibiotic eye drop is applied to the mouse eye.
  • Image analysis for FFA is performed using the ‘Image-J’ program, and analysis of OCT images is performed using the ‘InSight’ program.
  • the treatment effect of the present invention was evaluated using the Mouse CNV (choroidal neovascularization) model, which is one of the disease models for wet macular degeneration and is commonly used.
  • Mouse CNV choroidal neovascularization
  • a normal mouse (8-week-old C57BL/6 male mouse) was damaged in the choroid of both eyes using a laser to induce new blood vessel formation, then treated with drugs and performed with fundus fluorescein angiography (FFA).
  • FFA fundus fluorescein angiography
  • OCT optical coherence tomography
  • Example 2 of the present invention for suppressing CNV lesions and recovering retinal function by dose-dependent eye drops was confirmed, and the dose-dependent effectiveness was compared and evaluated. This was carried out for the purpose of Each experimental group is as follows.
  • Administered drug, dosage Mode of administration Administration group Vehicle eye drops G1 SCAI-003, 0.025% eye drops G2 SCAI-003, 0.05% eye drops G3 SCAI-003, 0.1% eye drops G4
  • anesthetic eye drops were instilled into the eyes to provide additional local anesthesia, and a mydriatic agent was instilled to induce mydriasis.
  • the mouse was placed on the sacrificial table, the image was focused on the fundus with the Micron-IV imaging camera, lubricating gel was instilled in the eye, and the Micron-IV lens was brought into contact with the mouse's cornea. Laser burns are induced according to the CNV induction conditions (wavelength 532 nm, diameter 50 uM, duration 80 mS, power level 200 mW) to destroy the Bruch membrane.
  • One drop of antibiotic eye drop was administered to the eye where CNV induction was completed.
  • mice were divided into Group 1 (Control, Vehicle), Group 2 (SCAI-003, sunitinib malate molecular complex 0.025%), Group 3 (SCAI-003, sunitinib malate molecular complex 0.05%), and Group 4. (SCAI-003, sunitinib malate molecular complex 0.1%) group.
  • Test substances and PBS were instilled twice a day (8 hours apart) at a volume of 5 uL/eye from the day of CNV induction (day 0) to the morning of the retinal imaging evaluation (day 11).
  • mice 10 days after CNV induction, mice were general anesthetized with ketamine and then intraperitoneally injected with a fluorescent contrast agent. After additional local anesthesia was administered by instilling anesthetic eye drops into the eye, mydriasis was induced by instilling a mydriatic agent.
  • the mouse was placed on the sacrificial table, the image was focused on the fundus with Micron-IV's imaging camera, lubricating gel was instilled in the eye, and the OCT lens was brought into contact with the mouse's cornea. After FFA/OCT imaging was performed, a drop of antibiotic eye drop was instilled in the mouse eye. Image analysis for FFA was performed using the ‘Image-J’ program, and analysis of OCT images was performed using the ‘InSight’ program.
  • Electroretinogram changes were measured to evaluate retinal function. Electroretinogram evaluation was performed on the scotopic ERG (electro-retinogram) on the 11th day after CNV induction by measuring the change in electroretinogram in response to mono-flash (0.9 log cds/m 2 ) stimulation with amplitude from A-wave to B-wave. was evaluated, and the results are shown in Figure 9.
  • ERG electroretinogram
  • the electroretinogram (ERG) evaluation results showed 0.025% (486.2 ⁇ 74.91 ⁇ V), 0.5% (510.0 ⁇ 67.80 ⁇ V), and 0.1% (606.6 ⁇ 119.84 ⁇ V) of SCAI-003.
  • All test groups showed a statistically significant increase compared to the excipient control group (290.9 ⁇ 68.15 ⁇ V), showing the effect of restoring retinal function or suppressing functional decline (p ⁇ 0.0001, respectively).
  • the B-wave amplitude of SCAI-003 0.1% was maintained more than twice that of the control group, and was also statistically significantly increased compared to the low-dose 0.025% eye drop group (p ⁇ 0.05).
  • SCAI-003 a composition using the sunitinib malate molecular complex of the present invention, showed CNV in a dose-dependent manner as a result of eye drop administration from 0.025% to 0.1% of SCAI-003 twice a day in a mouse CNV model.
  • the effect of improving retinal function can also be recognized by increasing B-wave amplitude in scotopic-ERG.

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Abstract

본 발명은 물성 개선된 약리 활성 물질의 신규한 분자회합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 밀착 충전된 분자회합체 형태로 존재하는 신규한 분자회합체에 관한 것이다.

Description

약리 활성 물질의 신규 분자회합체 및 이를 포함하는 약학 조성물
본 발명은 물성이 개선된 약리 활성 물질의 신규 분자회합체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 높은 생체 투과율로 인하여 생체막 조직 중 하나인 각막에 우수한 투과도를 가짐에 따라서, 후안구 질병 및 장애에 대하여 향상된 치료 효과를 가지는 신규한 분자회합체와 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
약리 활성 물질(Active pharmaceutical ingredient, API)의 물리화학적 특성상, 유기 용매 중 디메틸설폭사이드(DMSO)에는 잘 녹는 반면 에탄올이나 물에서는 용해도가 낮은 것으로 알려져 있다. 약리 활성 물질 중 하나인 수니티닙의 물에 대한 용해도는 약 0.364 mg/ml (pH 6; J. Med. Chem., 2003, 46, 1116-1119) 이다. 이러한 낮은 용해도를 개선하기 위해 시판 중인 수니티닙 제품은 말산염 (malate)의 형태로 약물의 난용성 및 생체 이용률 저하를 극복한 제형으로 출시되었다. 그러나 수니티닙 말산염은 넓은 범위의 pH 수용액에서의 용해도 개선이 완전한 수준이 아닐 뿐 더러, 생체 이용률 또한 저조한 상태이다.
습성 황반변성 (wet AMD) 은 안구의 황반 (macula) 부위에 비정상적인 신생 혈관 생성으로 인해 신경막의 중심부분이 파괴되는 질환이다. 신생혈관의 혈관벽은 연약하여 흔히 출혈을 일으키거나 혈장, 지질 성분을 혈관 밖으로 누출시키게 된다. 이는 황반 부위를 돌출시키고 부종 및 망막박리를 초래하여 시력을 심하게 저해시킨다. 안구내의 혈관내피세포성장인자 (혈관생성을 촉진하는 인자, vascular endothelial growth factor VEGF)가 증가함에 따라 맥락막 신생혈관 (Choroidal Neovascularization, CNV)의 발생, 성장 및 이의 대한 합병증 (황반부종, 출혈 등)이 발생한다.
염증성 반응, 증식 및 혈관 신생과 관련된 질환은 장기간의 약물학적 치료가 요구되는데, 바늘 및 주사기를 이용해 후안부로 직접 약물을 주입하여 전달하는 방법을 통상적으로 이용하고 있다. 습성 황반변성에서 사용되는 안구내 주사 치료제는 aflibercept 와 ranibizumab 같은 혈관내피세포성장인자의 중성항체로 종양 혈관의 혈관내피세포성장인자의 작용을 차단시켜 혈관 신생을 억제시킨다.
VEGF를 표적으로 하는 다른 활성물질로는 현재 항암제로 승인받은 VEGF receptor tyrosin kinase inhibitor들이 있으며, 대표적인 예로는 Sunitinib, Pazopanib, Axitinib과 같은 저분자 화합물이다.
현재는 바이오벤처들에서 VEGFR tyrosin kinase inhibitor (TKI)의 약물을 microparticle의 형태로 만들어 6개월에 한 번 안구 주사하는 형태의 제형을 개발 중에 있다.
이렇듯, 후안 영역에서 염증성 및 증식성 안구 질병에서는 후안부로의 약물 전달이 극도로 어렵다. 기존의 안구내로 주사하는 외과적 방법은 전문적인 훈련이 요구되며, 안전에 대한 주의가 필요하다. 현재 습성 황반변성 치료제로 널리 쓰여지는 Eylea® (aflibercept) 와 Lucentis® (ranibizumab) 도 안구 내 주사 방식으로써 여전히 환자의 순응도 및 주사로 인한 각종 부작용 우려를 해결하지 못하고 있다.
비외과적/비침습적 안과 치료제로는 안약 점안제의 형태가 있지만, 이는 약물이 각막을 투과하지 못해 후안부 영역까지 도달하기 어려운 문제점이 있다. 2010년대에 다국적 제약사들이 VEGFR inhibitor 점안제에 대한 임상을 진행한 적 있으나, 약물이 망막까지 전달되지 않아 효능을 확인하지 못했다.
따라서, 후안구 질병 및 장애를 치료하기 위해 후안부 조직까지 약물을 전달하는 더욱 안전하고 효과적인 방법과 치료제를 개발해야 되는 문제점은 여전히 존재한다.
[특허문헌]
(특허문헌 001) US 2015-0174096 A1
(특허문헌 002) US 10154994 B2
(특허문헌 003) US 2017-0273901 A1
본 발명의 목적은, 약리 활성 물질의 신규 분자회합체를 제공한다. 또한, 궁극적으로 약학 조성물로 사용시 안구/각막 투과도가 향상되어 안구 내 약물 흡수율을 극대화시켜 후안부 영역의 안구 질환에서 혈관 생성 억제 효능을 갖는 활성 물질의 신규 분자회합체를 제공한다.
본 발명은 후안구 질병 및 장애를 치료하기 위해 후안부 조직으로 치료제를 비외과적/비침습적 방법으로 전달하기 위한 더욱 안전하고 효과적인 치료 방법 및 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 약리 활성 물질의 분자회합체로서, 상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내인, 분자회합체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 분자회합체를 포함하는 안과학적 장애의 치료 또는 방지용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 조성물을 수용하는 용기를 포함하는 약학 키트로서, 상기 용기가 환자의 눈에 약학 조성물을 국소 투여하도록 맞춰진 분배 수단을 가지는 약학 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 조성물을 사용하는 안구 점안제로서, 상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내이고, 상기 조성물은 우싱(Ussing) 챔버를 이용한 돼지 각막 투과도 실험에서 수니티닙 말레이트를 포함하는 조성물보다 3.5배 이상의 투과율을 보여주는 것을 특징으로 하는, 안구 점안제를 제공한다.
본 발명으로 구현된 약리 활성 물질의 신규 분자회합체는 우수한 생체 투과율로 인해 약학 조성물로 사용 시, 후안구 질병 및 장애에서 향상된 혈관 생성 억제 효과를 보여준다.
본 발명으로 구현된 약학 안구 조성물은 비외과적/비침습적 방법인 안구 점안제로 후안구 질환 또는 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 구현된 약학 안구 조성물은 망막 또는 후안구 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다.
상술한 효과와 더불어 본 발명의 구체적인 효과는 이하 발명을 실시하기 위한 구체적인 사항을 설명하면서 함께 기술한다.
도 1은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능한 수니티닙 말레이트 제품(상단)과 본 발명의 수니티닙의 분자회합체(하단)에 대한 1H-NMR 결과를 나타낸 도이다.
도 2은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능한 수니티닙 말레이트 제품에 대한 2D NMR-NOESY 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 수니티닙 분자회합체에 대한 2D NMR-NOESY 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 수니티닙 분자회합체에 대한 2D NMR-NOESY 스펙트럼을 기반으로 예측한 3차원 구조를 나타낸 도이다.
도 5는 수니티닙 말레이트 (API) 및 본 발명의 수니티닙 말레이트의 분자회합체 (SCAI-WP)의 각막 투과실험에 사용된 자체 제작된 우싱 챔버 (Ussing Chamber)이다.
도 6은 본 발명인 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 약학적 조성물이 처리된 CNV 유도된 마우스 망막 형광안저조영술 (FFA) 영상 이미지와 병변 혈관에서의 fluorescein leakage 된 CTF (Corrected Total Fluorescence)의 망막병변 값을 보여주는 결과다.
도 7는 본 발명인 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 약학적 조성물이 처리된 CNV가 유도된 마우스 망막의 빛간섭단층촬영술 (OCT) 이미지와 CNV 병변 부위의 부피 측정 값을 보여주는 결과이다
도 8은 본 발명인 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 약학적 조성물이 처리된 CNV가 유도된 마우스 망막의 망막 전위도 평가 그래프를 보여주는 결과이다.
도 9은 본 발명인 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 약학적 조성물과 다른 약리 활성 물질을 포함하는 약학적 조성물들과의 마우스 망막 형광안저조영술 (FFA)영상 이미지와 병변 혈관에서의 fluorescein leakage 된 CTF 의 망막병변 값을 비교한 결과이다.
용어 및 정의
구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 물리/유기/분석 화학과 관련한 명명법, 실험 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려진 것이다. 표준 화학 기호는 기호로 표시되는 전체 이름과 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, "수소" 및 "H"는 동일 의미로 이해된다. 표준 기술은 화학 공정, 분자 간의 상호작용, 화학 분석, 조성물 제형화 및 그의 시험에 사용될 수 있다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다.
상기 일반적 설명 및 그 후의 상세한 설명 모두 단지 예시적 및 설명적이며 청구된 발명을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 단수형의 사용은 다르게 구체적으로 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 본원에 사용된 문단의 제목은 오직 구성 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 여겨지면 안 된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "또는"은 다르게 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한 용어 "포함하는" 뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함된다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이 아니다.
"분자회합체"는 용액상에 존재하는 분자간의 물리적 상호작용을 고려한 전단력을 이용하여 만든 것으로, 물리적 거동을 조절해서 얻은 약리 활성 물질의 신규한 분자회합체를 의미한다. 분자간의 물리적 상호작용을 고려하여 만든 신규 분자회합체는 물성이 개선된 약리 활성 물질의 분자회합체를 의미한다.
"2D NMR-NOESY"의 NOESY 기술은 공간적으로 인접한 핵 사이의 상관관계(2D 스펙트럼의 cross peak volumn)를 관측하는 NMR 기법이다. 이 기술은 인접한 양성자(proton) 사이의 상관 관계를 생성하는데 사용될 수 있다. 이는 화학 결합에 의해 직간접적으로 연결된 핵들 간의 상관 관계를 관측하는 다른 2D NMR 기법(HSQC, TOCSY)와 대조되는 기법이다.
"약학 조성물"은, 질환 또는 병상의 의료적 진단, 치유, 치료 또는 예방에서의 사용이 의도되는, 화학적 또는 생물학적 화합물 또는 물질, 또는 물질, 또는 둘 이상의 그러한 화합물 또는 물질의 혼합물 또는 조합물로서 정의된다. 본 발명의 일구현예 중 하나인 약학적 안구 조성물은 수니티닙 및 수니티닙 염을 포함하는 분자회합체를 포함한다.
"분산매"는 목적하는 최종 조성물을 구성하는 연속상으로서 상호교환가능한 연속상으로서 명명 및 정의된다. 즉, 최종 조성물이 약학 조성물이라면 분산매 및 연속상은, 물, 식염수 (saline solution) 혹은 수용액 버퍼 (buffered aqueous solution)일 수 있지만, 이에 제한을 두지 않는다. 본 발명의 일구현예 중 하나인 약학적 안구 조성물은 수니티닙 및 수니티닙 염의 신규한 분자회합체를 포함하며 분산매를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 신규 분자회합체
본 발명은 약리 활성 물질의 분자회합체를 제공한다. 상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질은 수니티닙 (Sunitinib), 액시티닙 (Axitinib), 파조파닙 (Pazopanib) 등과 같은 티로신 키나제 억제제 (Tyrosine Kinase Inhibitor), 사이클로스포린 (Cyclosporine), 니클로사마이드 (Niclosamide), 아데노신 (Adenosine), 디옥시콜릭 산 (Deoxycholic acid), 파클리탁셀 및 이들의 약학적으로 허용되는 염(salt)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이의 유도체 (derivatives)일 수 있고, 바람직하게는 수니티닙 또는 수니티닙 염을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.
분자(small molecule)의 3D 구조 분석을 위해 이용되는 핵자기공명 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 분광법(spectroscopy)은 화학에서 일반적으로 사용되는 기법이다. NMR 분광학으로 분자의 핵을 연구할 수 있고, 원자들이 어떻게 연결되어 있는지에 따른 화학적인 주변환경에 대한 정보를 얻을 수 있다.
1H와 13C 원자들은 자기적으로 활성(즉, NMR 활성)을 띄는데, NMR 활성을 가진 핵을 포함하는 샘플을 마그네틱 환경에 위치시키고 특정 라디오 주파수에 노출시키게 되면 높은 에너지 상태로 1H 또는 13C의 핵 원자들이 들뜨게 된다. 낮은 에너지 준위에서 높은 에너지 준위로 들뜨게 되면 핵 스핀의 이완현상에 대한 변화를 분광기(spectrometer)가 감지하게 되는데, 이러한 변화는 핵자기공명에 따른 스핀 상태의 변화이다. 핵 주위에 연결된 화학적 결합 환경에 따라 다른 스펙트럼에 위치한 피크는 다른 위치를 나타낸다.
도 1은 약리 활성 물질 중 하나인 수니티닙에 대한 1D-NMR 1H 스펙트럼으로 앞서 설명한 NMR 원리에 의해 관측된 것이다. 관측 시 DMSO-d6 용액보다 D2O 용액에 녹인 스펙트럼에서 원자간 결합 구조의 위치를 고려한 양성자 규명이 더 수월했다.
도 1의 상단에 위치한 스펙트럼은 아래 실험예 중 비교예 1에 해당하는 스펙트럼이며, 하단에 위치한 스펙트럼은 아래 실시예 1에 해당하는 스펙트럼이다.
상단과 하단에 위치한 스펙트럼을 비교해보면 공정과정을 거친 하단의 실시예 1에 대한 스펙트럼의 chemical shift 값(δ)이 upfield로 이동하였고, C, D, F, G position의 peak는 크게 두곳으로 합쳐져 나타난다.
H position의 peak는 짝지음 상수 J(J-Coupling) 값이 커지고 peak의 간격이 벌어졌으며, L↔L'과 M↔N의 position의 경우 chemical shift 차이가 커지며 peak의 간격이 벌어졌다. 또한, I, I' position의 peak의 경우에는 약하게나마 triplet의 양상을 보인 반면, 공정을 거친 실시예 1의 경우에는 broad한 singlet으로 변했다.
용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리는 2D NMR-NOESY 로 관측이 가능하다. 2D NMR-NOESY 스펙트럼은 오버하우저 효과(Overhauser effect)를 이용한 분석 방법으로 분자간 양성자의 공간적 근접거리에 대한 분석이 가능하다. 2D NMR-NOESY 스펙트럼은 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 5Å까지, 분자간 상호작용(inter-molecular interaction)이 관측 가능하다. (1H,1H)-NOESY and ROESY provide information about spatial proximity of protons that are separated by up to about 5Å, (Modern Methods in Natural Products Chemistry ; Arthur S. Edison, Frank C. Schroeder, in Comprehensive Natural Products II, 2010)
즉, 분자간 인접한 양성자의 1H-1H coupling interaction을 관측할 수 있다. 또한, 2D NMR-NOESY 스펙트럼의 cross peak volume을 integration 하여 분자간 인접한 양성자 간의 공간적 근접 거리 및 interaction의 정도에 관한 정보를 얻을 수 있다.
이에 반해, 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 일정거리 이상 멀어지면 분자간 상호작용을 관측할 수 없고 이는, 일정거리 이상인 10Å을 초과하여 존재하기 때문이라 예측할 수 있다. 즉, 1H-1H coupling interaction이 관측이 되지 않거나 interaction이 줄어들어, cross peak volume에 대한 integration의 정도에 관한 정보가 줄어들거나 관측되지 않는다.
따라서, 본 발명의 분자회합체는 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내로 근접하고 있는 분자회합체이며, 2D NMR-NOESY로 측정 시 1H-1H coupling interaction이 관측된다.
반면에, 시중에서 구입 가능한 여러 약리 활성 물질을 포함하는 제품들은 이에 반대로 1H-1H coupling interaction이 본 발명의 분자회합체보다 더 적은 interaction을 보인다. 실제로 시중에서 구입한 수니티닙 말레이트 제품은 2D NMR-NOESY 스펙트럼에서는 1H-1H coupling interaction이 본 발명의 분자회합체보다 더 적은 interaction을 보인다. 이는, 분자간의 거리가 본 발명의 분자회합체 보다 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å를 초과하여 존재하기 때문이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염에 관한 것이며,
상기 분자회합체는 상기 분자회합체는 수니티닙 화학적 구조의 alkyl기와, alkyl기를 제외한 이중결합 또는 aromatic ring이 서로 강한 intensity를 형성하는 스펙트럼을 갖을 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염에 관한 것이며,
상기 분자회합체는 2D NMR-NOESY 스펙트럼의 off-diagonal peak position에서 chemical shift 값(δ) 1.5 내지 2.0와 6 내지 6.5에서의 peak 세기가 강하게 관찰되는 스펙트럼을 갖을 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염에 관한 것이며,
상기 분자회합체는 도 3의 표시된 2D NMR-NOESY 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는 분자회합체일 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.
도 1의 상단에 위치한 NMR 스펙트럼은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능한 제품의 수니티닙 말레이트의 D2O NMR solvent로 측정한 수니티닙 말레이트에 대한 1H-NMR 스펙트럼이다. 하단에 위치한 NMR 스펙트럼은 D2O NMR solvent로 측정한 본 발명의 일 구현예 중 하나인 수니티닙의 분자회합체에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능한 제품의 수니티닙 말레이트를 D2O NMR solvent로 측정한 수니티닙 말레이트 제품에 대한 2D NMR-NOESY 스펙트럼에 관한 것으로 후술할 비교예 1에 해당되는 것이다. 비교예 1의 2D NMR-NOESY 스펙트럼은, ①, ②, ③의 Off-diagonal peak position에서 분자간 상호작용에 기인하는 1H-1H coupling interaction 피크들이 관찰되지 않는다. ④의 Off-diagonal peak position 경우에는 peak의 세기가 관찰되었지만, cross peak volume은 상대적으로 작게 관찰된다.
도 3은 본 발명의 일 구현예 중 하나인 실시예 1의 2D NMR-NOESY 스펙트럼으로, ④의 Off-diagonal peak position의 경우에는 peak의 세기가 더 강하게 관찰된 것을 볼 수 있다.
도 4의 좌측에 위치한 도면은 도 3의 2D NMR-NOESY 스펙트럼을 기반으로 본 발명의 분자회합체에 대한 3차원 구조를 예측한 결과이며, 도 4의 우측에 위치한 도면은 도 3의 ④의 off-diagonal peak position에 위치한 cross peak volume의 integration 결과로 예측한 본 발명의 분자회합체의 분자에 대한 3차원 구조를 예측한 것이다.
자세히 설명하자면, 도 3의 ①의 Off-diagonal peak position에 위치한 cross peak volume은 다음과 같이 설명 가능하다. 수니티닙 말레이트 분자의 alkyl기에 위치한 O position의 양성자와 aromatic에 위치한 C, D, F, G position의 양성자가 강하게 분자간 상호작용을 하고 있다는 것을 보여준다. 또한, ②의 Off-diagonal peak position에 위치한 cross peak volume은 수니티닙 말레이트 분자의 M, N, O position의 양성자와 I, I', J, K position의 양성자가 분자간에 서로 강하게 상호작용을 하고 있다는 것이다. 또한, ③의 Off-diagonal peak position에 위치한 cross peak volume은 I, I', J, K position의 양성자와 C, D, F, G position의 양성자가 강하게 분자간 상호작용을 하고 있다는 것이다. 또한, ④의 Off-diagonal peak position에 위치한 cross peak volume은 도 4의 우측에 위치한 도면으로 설명이 가능하다. 본 발명의 분자회합체에 존재하는 수니티닙 말레이트 분자는 분자내 이중 결합 회전으로 인해 분자간 상호작용이 더 강하게 나타나, 존재하던 off-diagonal peak에 대한 cross peak volume이 증가한 것이다.
따라서, 분자간 상호작용을 고려해볼 때 도 4와 같이 본 발명의 분자회합체는 분자간에 밀착 충전된 분자회합체 구조를 가지고 있다. 이는 다시 말해, 시중 판매 제품보다 본 발명의 분자회합체는 alkyl기와 aromatic기가 인접하게 밀착된 구조의 분자회합체로 분자간의 입체장애(steric hindrance)가 최소화된 방향으로 밀착된 구조를 형성하고 있는 것이다.
용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내인 분자회합체를 얻기 위해서, 분자간의 물리적 상호작용을 고려하여 전단력의 세기를 조절함에 따라 신규한 분자회합체를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 약리 활성 물질을 포함하는 분자회합체의 수평균 직경은 약 100 nm 이하 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 분자회합체의 수평균 직경은 약 80 nm 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 분자회합체의 수평균 직경은 약 50 nm 이하일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 분자회합체의 수평균 직경은 약 1 nm 내지 약 20 nm 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 분자회합체의 수평균 직경은 약 1 nm 내지 약 10 nm 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 분자회합체의 수평균 직경은 약 1 nm 내지 약 5 nm 일 수 있다.
구체적으로는 상기 분자회합체의 수평균 직경은 투과전자현미경 (TEM) 실험 결과를 통하여 확인할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 분자회합체의 제조방법
본 발명의 일 실시예에 따른 분자회합체는, 약리 활성 물질을 포함한 용액에 전단 응력을 가하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질은 수니티닙 (Sunitinib), 액시티닙 (Axitinib), 파조파닙 (Pazopanib) 등과 같은 티로신 키나제 억제제 (Tyrosine Kinase Inhibitor), 사이클로스포린 (Cyclosporine), 니클로사마이드 (Niclosamide), 아데노신 (Adenosine), 디옥시콜릭 산 (Deoxycholic acid), 파클리탁셀 및 이들의 약학적으로 허용되는 염(salt)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이의 유도체 (derivatives)일 수 있고, 바람직하게는 수니티닙 또는 수니티닙 염을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수니티닙 염은 수니티닙 말레이트일 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
상기 전단 응력을 이용한 물리적 거동을 조절하는 방법은 기계적 전단응력 또는 초음파 인가 중 어느 하나일 수 있다.
상기 기계적 전단응력은 용액을 실리카겔(silica gel), molecular sieve, sand, 종이 필터 및 알루미나로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 충진된 컬럼 또는 필터 페이퍼를 통과시켜 가하는 것일 수 있다. 이하에서 기계적 전단응력을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 기계적 전단응력은 약리 활성 물질이 포함된 용액을 상기 실리카 등이 충진된 컬럼에 통과시켜 가하는 것일 수 있다. 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액이 실리카 등으로 충진된 컬럼을 통과하면 물리적으로 좁은 영역을 통과함으로써 상기 약리 활성 물질이 매우 높은 전단응력을 받게 된다.
상기 실리카는 구형이거나 각형일 수 있으나, 그의 형태에는 제한되지 않는다.
상기 실리카의 크기는 0.01 내지 100 μm일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10 μm 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.7 μm 일 수 있다. 상기 실리카의 크기가 0.01 μm 미만이거나 100 μm 초과인 경우, 상기 수니티닙이 포함된 용액이 실리카가 충진된 컬럼에 통과하더라도, 전단응력이 가해지지 않아 구조체의 변화가 없을 수 있다.
상기 실리카가 충진된 컬럼의 하부에는 0.1 bar 내지 1.0 bar 또는 0.2 bar 내지 0.9 bar의 음압을 걸어줄 수 있다. 상기 실리카가 충진된 컬럼의 하부에 걸리는 음압이 0.1 bar 미만인 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액이 상기 컬럼을 통과하는 데 소요 시간이 증가하여, 본 발명에 따른 신규 분자회합체의 제조 시간이 지연될 수 있다. 또한, 상기 실리카가 충진된 컬럼의 하부에 걸리는 음압이 1.0 bar 초과인 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액이 상기 컬럼을 통과하는 데 소요 시간이 감축하여, 본 발명에 따른 신규 분자회합체의 제조 시간이 단축될 수 있으나, 추가의 펌프 장비가 필요하므로, 제조 비용이 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 기계적 전단응력은 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액을 하나 이상의 필터 페이퍼에 통과시켜 가하는 것일 수 있다. 상기 하나 이상의 필터 페이퍼를 통과하면 물리적으로 좁은 영역을 통과함으로써 상기 약리 활성 물질이 매우 높은 전단응력을 받게 된다.
상기 필터 페이퍼는 하나의 필터 페이퍼이거나 둘 이상의 복수의 필터 페이퍼일 수 있다. 상기 필터 페이퍼가 둘 이상의 복수의 필터 페이퍼일 경우, 상기 필터 페이퍼를 적층하여 배치할 수 있다. 상기 필터 페이퍼가 둘 이상의 복수의 필터 페이퍼일 경우, 하나의 필터 페이퍼보다 높은 전단응력이 제공될 수 있다.
상기 필터 페이퍼의 기공의 크기는 0.1 내지 5.0 미크론 또는 0.3 내지 4.5 미크론일 수 있다. 상기 필터 페이퍼의 기공의 크기가 0.1 미크론 미만인 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액이 상기 필터 페이퍼에 통과 또는 여과되는 양이 너무 적어, 본 발명에 따른 신규 분자회합체의 제조 속도가 감소될 수 있고, 상기 필터 페이퍼의 기공의 크기가 5.0 미크론 초과인 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액이 상기 필터 페이퍼를 단순히 통과하여 전단응력이 효과적으로 가해지지 않을 수 있다.
상기 전단응력은 초음파를 이용하여 가하는 것일 수 있다. 이하에서 초음파 인가에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 전단응력은 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 초음파를 인가시켜 가하는 것일 수 있다.
상기 초음파를 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 가하면, 압력파가 발생하고, 상기 압력파에 의해 상기 약리 활성 물질에 전단응력이 가해질 수 있다.
상기 인가되는 초음파의 세기는 200 J/sec 내지 800 J/sec 또는 400 J/sec 내지 600 J/sec일 수 있다.
상기 인가되는 초음파의 부피당 가해지는 에너지는 초음파의 세기 (J/sec) x 가해진 시간 (sec) / 측정 부피 (ml)로 구해질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 인가되는 초음파의 부피당 가해지는 에너지는 100 J/ml 내지 90 kJ/ml일 수 있다. 상기 초음파의 에너지가 100 J/ml 미만일 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 충분한 전단응력이 가해지지 않아 구조체의 형성이 어려울 수 있다. 또한, 상기 초음파의 에너지가 90 kJ/ml 초과일 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 과도한 열이 가해져서 구조체의 형성이 어려울 수 있다.
상기 초음파는 10 ℃ 내지 80 ℃에서 10 초 내지 60분 간 인가될 수 있다. 상기 초음파가 10 ℃ 미만인 온도에서 인가될 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 변화가 없고, 80 ℃ 초과인 온도에서 인가될 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 상 변화가 일어나서 본 발명에 따른 신규 분자회합체의 형성이 어려울 수 있다. 또한, 상기 초음파가 10 초 미만에서 인가될 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 변화가 없고, 60 분 초과인 시간 동안 인가될 경우, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 구조체가 변형되어, 본 발명에 따른 약리 활성 물질를 형성할 수 없다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 전단응력을 가하는 방법으로 실리카가 충진된 컬럼을 초음파 발생 장치와 결합할 수 있다. 상기 실리카가 충진된 컬럼이 초음파 발생 장치 내부에 배치되거나, 상기 실리카가 충진된 컬럼 및 초음파 발생 장치가 분리되어 연속적으로 배치될 수 있다.
예를 들어, 상기 실리카가 충진된 컬럼에 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액을 부어준 후, 상기 컬럼을 초음파 발생 장치 내에 배치시켜 초음파를 인가시킬 수 있다. 또한, 상기 약리 활성 물질이 포함된 용액에 초음파를 인가시킨 후, 상기 실리카가 충진된 컬럼에 상기 용액을 통과시킬 수 있다.
또한, 필요한 경우, 상기 전단 응력을 가하기에 앞서서, 약리 활성 물질을 유기용매 중에서 반응시키는 단계를 진행할 수 있다. 상기 유기용매로는 극성을 가지는 용매라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로는 OH기를 포함하는 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올과 같은 알코올류를 사용할 수 있다.
또한, 약리 활성 물질이 포함된 용액에 전단응력을 가하여, 본 발명의 신규 분자회합체를 제조한 후, 잔여 용매를 제거하기 위하여 여과하고 건조하는 단계를 추가로 진행할 수 있다. 이 때 여과 및 건조는 상기 분자회합체에 영향을 미치지 않는 방법이라면 특별한 제한 없이 당해 업계에서 사용하는 여과 및 건조 방법을 사용할 수 있다.
전단 응력이 가해지기 전 용액 상은 과포화, 포화 및 불포화 등 어떠한 상태의 용액도 이용 가능하다.
약학 조성물
본 발명은 상기 분자회합체를 포함하는 안과학적 장애의 치료 또는 방지용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
상기 분자회합체의 기술적 특징은 앞서 살펴본 분자회합체의 내용과 동일하다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 투여할 수 있으나, 반드시 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 매개체 또는 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 매개체 및 첨가제는 통상적으로 사용되는 매개체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 분자회합체 외에, 완충제, 점도 조절제, 등장화제, 항산화제, 킬레이트화제 및 pH 조절제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 매개체 또는 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물에 사용되기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 매개체는 안과용 제제에 통상적으로 사용되어지는 것들로서, 사이클로덱스트린 (Cyclodextrin), 메틸셀룰로오스(MC), 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스(HPMC) 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(NaCMC)과 같은 셀룰로오스질 폴리머 및 폴리비닐알코올(PVA) 등을 사용할 수 있지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물에 사용되기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 안정화제, 계면활성제, 겔화제와 같은 고분자 기반의 담체, 유기 공-유매, pH 활성 구성 요소, 삼투성 활성 구성 요소 및 방부제에 포함하지만, 이에 제한되지 않는다
본 발명의 일 구현예에 있어서, 약학 조성물은 안과학적 점안제로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 눈에 국소 투여를 위한 수성 안과학적 제제를 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 구성 중 분산매를 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구현예 중 하나인 약학 조성물은 분산매에 안정적으로 잘 분산되는 효과를 가지고 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분산매는 앞서 용어 및 정의에서 설명한 바와 같이 물, 식염수 (saline solution) 혹은 수용액 버퍼 (buffered aqueous solution) 일 수 있지만, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 비와과적 치료방법인 점안제로 사용되어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물의 통상적인 투여 방법은 눈으로 점안하는 전달 방식이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 안과학적 장애를 치료하거나 방지할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 분자회합체를 포함하는 조성물을 안구에 투여하여 안과학적 장애를 치료하거나 방지하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 후안구 질병 및 장애의 치료제로 쓰일 수 있다. 상기 후안구 질병 및 장애는 안구의 후안영역에 염증성 반응, 증식 및 혈관신생과 관련된 질환으로 대표적인 예로는 노화로 인한 황반 변성 (AMD), 맥락막 혈관 신생 (CNV), 융모막 모양의 신생 혈관 멤브레인 (CNVM), 전망막 (ERM)와 망막황반 홀, myopia-associated 맥락막의 신생 혈관 증식, 망막 디태치먼트, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 그물막 색소 상피 (RPE)의 위축성 변화, 그물막 색소 상피 (RPE)의 비대성 변화, 망막 정맥 폐색, 융모막 모양의 망막 정맥 차폐, 색소성 망막염, 스타가트(Stargardt)의 질병, 녹내장, 염증성 질환, 백내장, 내화성 변칙, 원추각막(ceratoconus), 조숙성의 망막증, 다음 각막염 각막 혈관 형성, 각막 이주 또는 각막 성형, 저산소혈 (광역 접촉 렌즈 착용) 때문에 각막 혈관 생성, 익상편 결막, 안저 부종 및 망막내 부종을 포함하는 질환일 수 있으며, 이에 제한하는 것은 아니다.
구체적으로 wet/dry 황반변성 또는 맥락막 혈관 신생과 같은 망막질환의 치료제로 사용되어질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 습성황방변성의 치료 효과 및 효능은 맥락막신생혈관 (CNV)을 특징으로 하는 동물질환모델에서 안구의 CNV 영역, 즉 혈관 누출 (vascular leakage)의 정도를 측정하여 평가할 수 있지만, 이에 제한하지 않는다.
약리 활성 물질 및 약리 활성 물질의 분자회합체의 생체 투과율
본 발명의 약리 활성 물질의 분자회합체는 높은 생체 투과율을 보인다. 본 발명의 안정적인 분자회합체 상태로 인해 본 발명의 분자회합체는 일반 약리 활성 물질보다 높은 생체 또는 세포 투과율을 보인다.
상기 생체/세포 투과율이란 물질의 생체내 조직 또는 세포 막에 대한 흡수 및 투과도를 측정한 것으로 각막 (cornea), 피부 (skin), 뇌혈관장벽 (blood brain barrier), 혈망막장벽 (blood retina barrier) 같은 생체내 생물학적 장벽 (biological barrier)을 통과할 수 있는 약리 활성 물질의 농도를 측정한 것이다.
상기, 생체내 조직 또는 세포 막은 인체 내 세포로 이루어진 어떤 세포든 모두 가능하며, 언급한 생체내 조직 또는 세포막에 한정되지 아니한다.
세포 막은 내피 세포, 심장 세포, 면역 세포, 골격근 세포 및 뇌세포로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상일 수 있으며, 상기 약리 활성 물질의 분자회합체는 경구, 경점막, 국소, 경피, 경피 내 피하, 눈 또는 유리체 내 결막 하, 맥락막 전방 내, 기관지 내 폐, 정맥 또는 동맥 내, 십이지장 내, 방광 내, 비경구, 지주막하강 내, 근육내 및 위장 내로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 경로에 의해 세포 투과가 가능하며, 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 약리 활성물질의 분자회합체가 투과할 수 있는 생체내 조직 및 세포로는 안구의 각막 상피 (corneal epithelium), 망막색소상피 (retinal pigment epithelium), 공막 (sclera), 결막 (conjunctiva), 브룩스 멤브레인 (Bruch's membrane), 맥락막 등 안구 조직 내 또는 주위의 세포 또는 세포 막으로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상일 수 있으며, 이제 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약리 활성 물질의 분자회합체를 포함하는 약학 조성물은 세포 내, 특히 안구 내 망막으로 약리활성물질의 분자회합체를 용이하게 전달할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 약리활성물질의 일례인 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 약학 조성물의 각막 투과율을 측정했다.
본 발명의 공정을 수행하여, 상기 약리 활성 물질의 분자회합체는 최종 분산매에 불포화 (혹은 활성 물질 함량이 최종 분산매에서 포화용해도 이하)되도록 (예를 들어, 특정 온도 및 압력 하에서 활성 물질의 함량과 분산매의 조성을 포함하는 조건일 수 있음) 조성물을 제조하면, 생체내 생물학적 장벽 투과도, 생체이용율 혹은 치료 효능이 기존 조성물보다 매우 우수한 조성물을 얻을 수 있다. 일례로, 본 발명의 공정으로 구현되어 약리 활성 물질의 분자회합체가 최종 분산매에 불포화된 상태인 조성물의 생물학적 장벽 투과도 (예를 들어, 각막 투과도, 피부 투과도, GI trac 투과도, BBB 투과도 등)는 기존 약리 활성 물질의 용액 조성물에 비하여 1.1배이상, 1.2배이상, 1.5배이상, 2배이상, 3배이상, 3.5배이상, 5배이상, 10배 이상 높일 수 있다.
In vivo 마우스 효능 (마우스 CNV 모델에서 fluorescein angiography)
습성황반변성의 대표적인 동물질환 모델은 맥락막신생혈관 (Choroidal Neo-vascularization)를 특징으로 하는 질환모델이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 약리 활성 물질의 일례인 수니티닙 말레이트를 포함하는 신규 분자회합체는 후안구 질환 및 장애에서 혈관 생성(neovascularization)을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 약리 활성 물질의 분자회합체 중 상기 약리 활성 물질로 수니티닙 또는 수니티닙 말레이트를 포함하는 신규 분자회합체는 마우스 CNV 모델에서 기존의 수니티닙 말레이트에 비해 현저한 혈관 생성 억제 효과를 보인다.
상기 CNV 모델은 습식황반변성의 질환모델 중 하나이며, Laser를 이용해서 안구의 맥락막에 인위적으로 손상을 주어 신생혈관 형성을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 마우스 안구에서의 혈관 생성 (neovascularization) 억제 효과는 형광안저조영술인 Fundus Fluorescein angiography (FFA) 및 빛간섭단층촬영술 (OCT; optical coherence tomography)를 이용해서 관찰된다. 두 가지 기법을 실시하여 손상된 부위의 신생혈관 면적과 부피를 측정하여 억제 효능을 비교 평가할 수 있다.
상기 형광안저조영술 (FFA)는 안구에 fluorescein 조영제를 주사한 후, 형광색소의 누출 (leakage density) 및 CNV 병변 크기를 촬영 및 관찰하는 방법으로 맥락막신생혈관 진단을 위해 통상적으로 사용되어지는 실험기법이다.
상기 빛간섭단층촬영 기법은 고해상도 및 간섭단층촬영 장비를 이용해 망막과 맥락막에서의 병변 부위의 부피를 측정하는 통상적인 실험 기법이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 마우스 CNV 모델에서 약리 활성 물질의 구조체를 포함하는 안구 점안제형을 용량별로 마우스 안구에 투여해 CNV 병변억제 효능과 용량의존적 유효성을 평가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 마우스 CNV 모델에서 약리 활성 물질의 구조체가 망막 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해 망막전위도 변화를 측정한다. 망막전위도는 빛 자극에 반응하는 망막의 전기적 활동을 측정하는 검사 방법이다.
상기 망막전위도 변화는 CNV 모델 유도 후, scotopic ERG (electro-retinogram)을 이용해 mono-flash 같은 빛 자극에 대한 망막 전위도의 변화를 ER G그래프 wave의 진폭, amplitude로 평가한다. 망막 ERG 그래프를 이용해 망막 기능 장애의 유무를 판단할 수 있는 통상적인 실험기법이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물을 수용하는 용기를 포함하는 약학 키트로서, 상기 용기가 환자의 눈에 약학 조성물을 국소 투여하도록 맞춰진 분배 수단을 가지는 약학 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 조성물을 사용하는 안구 점안제로서, 상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내이고, 상기 조성물은 우싱(Ussing) 챔버를 이용한 돼지 각막 투과도 실험에서 수니티닙 말레이트를 포함하는 조성물보다 3.5배 이상의 투과율을 보여주는 안구 점안제를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 이들 실시예에 국한되는 것이 아님은 당연하다 할 것이다.
[실시예]
실시예 1. 수니티닙 분자회합체 제조 방법
수니티닙 말레이트(Nanjing furuisi Pharma 사, 중국) 0.332 g을 정제수 100 g에 녹여서 약 0.25%의 수니티닙 말레이트 용액을 제조하였다.
SYLOID 244FP(GRACE사, 미국) 20 g을 94.5% 에탄올 200 g으로 적신 후(wetting), 직경이 90mm 뷰흐너 깔때기(Buchner funnel)에 0.45 μm PVDF membrane filter를 올린 뒤 진공여과타입으로 준비하기 위하여, 에탄올로 적신 SYLOID 244FP 용액을 뷰흐너 깔때기에 부어주면서 Packing 하여 약 1cm 높이의 SYLOID 244FP 컬럼(Column)을 제조하였다.
진공펌프를 이용해 컬럼 위에 준비한 수니티닙 말레이트 용액을 투입하고 추가로 1M HCl 0.1 mL과 1M NaCl 0.2 mL 넣은 94.5% 에탄올 400g 용액을 컬럼에 통과시켜 SYLOID 244 FP에 남아있는 수니티닙을 회수하였다. 이 때의 유출 유속은 약 2.25 g/min이었고 유출액은 506.83 g이었다.
유출액 내에 존재하는 수니티닙의 농도는 HPLC (Waters, e2695)를 이용하여 분석하였고, 수득된 수니티닙의 양은 0.206 g이었다. 이 때, 회수율은 약 82%이다.
이 유출액의 506.83 g에 동량의 탈이온수를 넣어 회전식 감압건조기를 이용해 에탄올을 제거하였다. 25℃, 20 mbar 압력에서 회전속도를 50rpm 내지 150rpm으로 유지하면서 3시간 동안 운전하였고 농축액의 수니티닙의 농도가 0.3 % 정도가 되었을 때 농축을 중단한 뒤 0.22μm PVDF syringe filter로 여과하였다. 농축하여 수득된 수니티닙 말레이트 분자회합체의 HPLC 분석결과 0.225 g임을 확인하였다.
여과된 수니티닙 말레이트의 분자회합체 45 g을 예비동결기(Ilshin biobase, DF8502S)에서 3시간 예비동결 한 뒤 동결건조기 (Ilshin biobase, FD8508)에서 48시간 건조하였다.
최종적으로, 수니티닙 말레이트 분자회합체를 얻었으며, 건조된 파우더 중량은 0.2324 g 중 35%(813.4 mg)는 부형제[salt]였으며, 65 %(1510 mg)는 수니티닙 말레이트 분자회합체였다. 참고로, 본 발명의 출원인은 제조된 분자 회합체에 대하여 WP라는 표현을 함께 사용하였다.
실시예 2. 수니티닙 말레이트 분자회합체를 포함하는 약학 조성물
실시예 1에서 얻은 수니티닙 말레이트 분자회합체 0.5mg/ml 수용액에 pH 완충제 25mM Sodium Phosphate (pH 6.3)와 등장화제로써 110mM NaCl을 첨가하여 약학조성물을 제조하였다.
비교예 1. 시중에서 구입한 수니티닙 말레이트
시중 제품 중 하나인 Selleckchem사의 수니티닙 말레이트 제품을 사용하였으며, 이것은 상업적 공급원으로부터 쉽게 이용 가능한 제품이다.
비교예 2. 수니티닙 말레이트 자체를 포함하는 약학 조성물
비교예 1의 수니티닙 말레이트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 약학조성물을 제조하였다.
[실험예]
실험예 1. NMR 샘플 제조 및 측정
비교예 1의 수니티닙 말레이트와 이에 대응하는 실시예 1의 수니티닙 말레이트 분자 회합체의 1H NMR 및 NOESY NMR 분석 조건은 다음과 같이 동일하다.
본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 수니티닙 말레이트 분자회합체 20 mg을 D2O(중수) 4 mL에 녹였다. 수니티닙 말레이트 고형분을 D2O(중수) 용매에 약 10 mg/mL 농도로 분산시킨 후 Wilmad(윌마드)사의 직경 5 mm NMR 전용 튜브에 샘플링하여 분석하였다. 사용한 NMR 기기는 Bruker(브루커)사의 400 MHz AVANCE III HD (자기장 약 9.4 테슬라)이며, 사용한 펄스 시퀀스는 각 실험의 순서대로 "zg30"과 "noesygpphpp"이다. 상온에서 분석을 진행하였으며, 중수 피크의 chemical shift(화학적 이동)를 기준으로 하였고, 이의 화학적 이동값을 4.800 ppm 기준으로 맞추었다. 시간영역에서 구해진 fid 데이터의 프로세싱은 Mestrelab사의 MestReNova 프로그램을 사용하여 주기(frequency) 영역으로 전환하는 것을 수행하였다. 위의 실험조건으로 측정한 결과, 본 발명의 비교예 1에 대한 1H-핵자기공명 (NMR) 스펙트럼은 도 1의 상단에 나타냈고, 실시예 1에 따른 수니티닙의 분자회합체의 1H-핵자기공명 (NMR) 분석은 도 1의 하단에 도시하였다. 비교예 1의 시중에서 구입한 수니티닙의 스펙트럼은 도 2에 나타내었고, 본 발명의 실시예 1에 따른 수니티닙의 분자회합체에 대한 2D NMR-NOESY (핵자기공명) 스펙트럼은 도 3에 나타내었고다.
비교예 1인 도 2의 2D NMR-NOESY (핵자기공명) 스펙트럼과 달리, 실시예 1의 도 3은 도 2보다 더 넓은 cross peak volume을 나타내고 있다. 이는, 분자간에 거리가 더 가깝게 위치해 있음을 알 수 있는 데이터이며, 구조적으로 새로운 chemical entity를 갖고 있다고 예측된다. 또한, 비교예 1은 용액 상에서 분자간의 거리가 10Å을 초과한 구조를 갖고 있을 것이라 예상된다. 반면, 실시예 1은 용액상에서 분자간 양성자의 근접 거리가 10Å 이내인 어느 정도 단단한 구조의 형태를 띄는 신규한 구조의 형태를 갖고 있을 것으로 예측된다.
실험예 2. 비교예 1 및 실시예 1을 포함하는 약학적 안구 조성물(실시예2)의 돼지 각막 투과 실험
실시예 1에서 제조한 파우더 형태의 수니티닙 말레이트 분자회합체를 포함하는 약학 조성물인 실시예 2와 비교예 1의 수니티닙 말레이트 자체에 대한 각막 투과 실험을 수행하였다.
상기 각막 투과 실험은 이미 공개되어 있는 논문인 "Lee　et. al, "Modulating the Transport Characteristics of Bruch's Membrane With Steroidal Glycosides and its Relevance to Age-Related Macular Degeneration (AMD) .　Invest.　Ophthalmol. Vis. Sci.　 2015,　56, 8403., 2015"의 내용을 참조하여 진행하였다.
투과실험을 위한 셀은 도 5에 나타난 바와 같이 우싱 챔버(ussing chamber)를 자체 제작하였다. 우싱 챔버는 크게 세부분으로 구성되는데, 약물을 투여하는 공급 챔버(donor chamber), 수용 챔버(receiver chamber) 그리고 약물이 투과할 멤브레인 막으로 구성된다. 기본적으로 약물을 우싱 챔버의 공급 챔버에 약물을 투입하고, 돼지 눈의 각막 부위를 8mm 크기의 원형으로 체취하고, 각막에 붙어있는 다른 조직들을 제거한 후, 멤브레인 위치에 고정하고, 막을 투과한 용액을 수용 챔버에서 받게 되며, 이때 확산이 일어나는 온도를 사람의 체온에 가까운 37℃에 맞춘 항온 챔버에 넣어서 보관하였다. 일정한 시간이 흐르면, 각 공급 챔버와 수용 챔버 내에서의 용액 농도를 측정하여, 각 시료의 diffusion에 대한 물성을 파악할 수 있었다. 각각의 시료에 대한 18시간 후에 농도를 하기 표 1에 표시하였다. 농도는 UV/VIS spectrum(Thermo사, Evolution201 UV/Vis)을 활용하였고, 420nm의 peak높이를 이용하여 농도를 측정하였다.
Initial drug load (μg) Drug in corneal tissue
(μg, Mean±SD)		 Drug in receiver
(μg, Mean±SD)		 Transport percentage*
(%, Mean±SD)
수니티닙 말레이트 540 65.7 ± 7.5 8.8 ± 5.8 1.6 ± 1.1
수니티닙말레이트 분자회합체 490 70.2 ± 10.7 27.8 ± 2.9 5.7 ± 0.6***
*투과율 = (각막에서의 약물양)/(초기 약물양)x100, ***p<0.001
상기 표 1과 같이, 투과된 양을 백분율로 표시하면 수니티닙 말레이트 분자회합체의 투과도가 수니티닙 말레이트의 투과도와 비교할 때 대략 4배 정도의 우수한 투과도를 보임을 알 수 있다. 본 발명에 따른 분자회합체의 세포에 대한 투과도가 약리 활성 물질 자체보다 현저하게 우수하다는 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 비교예 2 및 실시예 2의 약학 조성물의 습성황반변성 동물 질환 모델 효능 비교 평가
본 실험예에서는 수니티닙 말레이트 분자회합체를 포함하는 실시예 2의 약 학조성물과 수니티닙 말레이트를 포함하는 약학조성물의 마우스 CNV 병변 억제 효과를 비교 평가하여 도 6에 도시하였다. CNV는 습식황반변성의 질환모델 중 하나이며 일반적으로 사용되고 있는 Mouse CNV (choroidal neovascularization) 모델을 이용하여 비교예 2 및 실시예 2의 약학 조성물을 안구점안제로 사용한 경우의 습식황반변성 치료 효과를 평가하였다. 보다 정확한 평가를 위하여, 약리 활성 물질로 수니티닙 외에도, 기존의 황반변성 치료제인 aflibercept (EyleaTM) 를 함께 비교 평가하였다. 각 실험군은 아래의 표 2와 같다.
투여 약물, 용량 투여 방식 투여군
Vehicle 안구 점안/BID G1
Aflibercept 유리체내 주사/ 20 μg/㎕ G2
비교예 2 (Sunitinib, 0.05%) 안구 점안/ 5 ㎕ BID G3
실시예 2 (Sunitinib 분자회합체 인 SCAI-003, 0.05%) 안구 점안/ 5 ㎕ BID G4
마우스 (8주령, C57BL/6 Male 마우스, n=30)의 CNV 모델에서 각각의 안구점안제 실험군을 10일동안 매일 2회 반복 투여하였다. CNV 유도 후 10일째에 FFA (fundus fluorescein angiography)를 실시하여, CNV 병변의 크기 및 부피를 각각 측정하였다.마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취시키고, 산동제를 점안하여 산동 유도한다. 마우스를 제물대 위에 올려놓고 Micron-IV의 imaging camera로 안저 (fundus)에 영상을 맞춘 후, 해당 안구에 윤활젤을 점안한 뒤 Micron-IV의 렌즈를 마우스의 각막과 접촉시킨다. CNV 유도조건(wavelength 532 nm, diameter 50 uM, duration 80 mS, power level 200 mW)에 따라 레이저 화상을 유도하여 브루크 막 (Bruch membrane)을 파괴시킨다. CNV 유도가 완료된 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안한다. 총 30 마리의 마우스를 그룹 1 (대조군, PBS), 그룹 2 (Aflibercept, 20μg /μL), 그룹 3 (Sunitinib, 0.05 %), 그룹 4 (SCAI-003, Sunitinib WP 0.05 %)인 4개 그룹으로 분류했다. 시험물질 및 PBS는 CNV 유도 당일 (0일차)부터 망막영상평가 (11일차) 당일 오전까지 5 uL/eye의 부피로 하루에 2회 점안한다 (8시간 간격). 한편, 대조물질인 aflibercept은 CNV 유도 직후에 IO 키트에 연결된 36G 주사바늘을 공막천자 (scleral puncture)로 자입시킨 후 1uL/eye의 부피로 양안에 투여한다. IVT 투여가 완료되면 마우스의 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하여 감염을 막는다
CNV 유도 후 10일에 마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 형광 조영제를 복강 주사한다. 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취를 시킨 후, 산동제를 점안하여 산동 유도한다. 마우스를 제물대 위에 올려놓고 Micron-IV의 imaging camera로 안저에 영상을 맞춘 후, 해당 안구에 윤활젤을 점안한 뒤 OCT의 렌즈를 마우스의 각막과 접촉시킨다. FFA/OCT 촬영을 실시한 후 마우스 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안한다. FFA에 대한 이미지 분석은 ‘Image-J’ 프로그램을 이용하여, OCT 이미지에 대한 분석은 ‘InSight’ 프로그램을 이용하여 실시한다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이 본 발명의 실시예 1의 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 실시예 2의 약학조성물인 G4군의 scai-003의 평균 CTF의 망막병변 값이 수니티닙 말레이트를 포함하는 비교예 2의 약학조성물인 G3의 평균값에 비해 통계적으로 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (p<0.05). 또한, G2 와 G4 모두 부형제 대조군의 1022678 ± 524841 (n=40)보다 통계적으로 유의성 있게 감소되었다. 단, 본 발명의 분자회합체 기술을 적용하지 않았던 비교예 2의 약학조성물인 G3군의 Sunitinib-API 점안군만이 통계적으로 유의성이 관찰되지 않았다.
또한, 도 6을 통하여, 본 발명의 실시예 2의 약학조성물인 G4군이 CTF 망막병변값을 기존 치료제인 aflibercept 주사제(G2)보다 우수하게 또는 유사하게 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 2의 약학조성물인 SCAI-003 점안액을 비침습적인 점안식 치료방법으로 사용하더라도 기존 외과적 치료방식인 aflibercept 주사 치료제와 비교할 때, 최소 비슷하거나 더 나은 치료효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
종래의 Aflibercept 같은 주사 치료제는 안구 조직 내로 빈번한 주입 (injection) 이 요구됨으로, 이로 인한 망막박리 (Retinal detachment), 망막 출혈 (Retinal haemorrhage), 내안구염 (Endophtlamitis)등과 같은 부작용을 수반할 뿐 아니라, 유리체 주사에 대한 환자들의 순응도 문제도 가지고 있다. 하지만, 본 발명에 따른 수니티닙 말레이트 분자회합체를 포함하는 약학적 안구 조성물인 SCAI-003 점안액의 경우, 이러한 단점을 극복할 수 있으며, 편리하고 효과적으로 약물을 안구 내부로 전달할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 4. 황반변성 질환 동물모델 및 용량별 생체 효능 시험
마우스 맥락맥신생혈관생성 모델 (Chorodial Neovascularization CNV)
본 실험예에서는 습식황반변성의 질환모델 중 하나이며 일반적으로 사용되고 있는 Mouse CNV (choroidal neovascularization) 모델을 이용하여 본 발명의 치료 효과를 평가하고자 하였다. Mouse CNV 모델에서는 일반 Mouse (8주령의 C57BL/6 Male 마우스)에 Laser를 이용해서 양쪽 안구의 맥락막에 손상을 주어 신생혈관 형성을 유도한 후, 약물을 처치하고 형광안저조영술 (FFA; fundus fluorescein angiography) 및 빛간섭단층촬영술 (OCT; optical coherence tomography)를 실시하여 손상된 부위의 신생혈관 면적과 부피를 측정함으로써 효능을 비교 평가하였다.
습식황반변성의 질환모델인 마우스 CNV 모델을 이용하여 본 발명의 실시예 2의 제형인 SCAI-003 점안제의 용량별 점안에 의한 CNV 병변억제 및 망막기능 회복 효능을 확인하고, 용량의존적 유효성을 비교 평가하기 위하고자 실시하였다. 각 실험군은 다음과 같다.
투여 약물, 용량 투여 방식 투여군
Vehicle 안구 점안 G1
SCAI-003, 0.025% 안구 점안 G2
SCAI-003, 0.05% 안구 점안 G3
SCAI-003, 0.1% 안구 점안 G4
CNV 병변억제 효능 평가
CNV 유도 직후부터 망막 영상 평가 전까지 매일 2회 반복 점안 투여하였다. 망막영상평가는 CNV 유도 후 10일째에 Fluorescein를 마우스 안구에 주사한 후, FFA (fundus fluorescein angiography) 및 OCT (optical coherence tomography)를 실시하여, CNV 병변의 크기 및 부피를 각각 측정하였다.
마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취시키고, 산동제를 점안하여 산동 유도하였다. 마우스를 제물대 위에 올려놓고 Micron-IV의 imaging camera로 안저 (fundus)에 영상을 맞춘 후, 해당 안구에 윤활젤을 점안한 뒤 Micron-IV의 렌즈를 마우스의 각막과 접촉시켰다. CNV 유도조건(wavelength 532 nm, diameter 50 uM, duration 80 mS, power level 200 mW)에 따라 레이저 화상을 유도하여 브루크 막 (Bruch membrane)을 파괴시킨다. CNV 유도가 완료된 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하였다. 마우스를 그룹 1 (대조군, Vehicle), 그룹 2 (SCAI-003, 수니티닙 말레이트 분자회합체 0.025%), 그룹 3 (SCAI-003, 수니티닙 말레이트 분자회합체 0.05%), 그룹 4 (SCAI-003, 수니티닙 말레이트 분자회합체 0.1%) 그룹으로 분류했다. 시험물질 및 PBS는 CNV 유도 당일 (0일차)부터 망막영상평가 (11일차) 당일 오전까지 5 uL/eye의 부피로 하루에 2회 점안하였다 (8시간 간격).
CNV 유도 후 10일에 마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 형광 조영제를 복강 주사하였다. 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취를 시킨 후, 산동제를 점안하여 산동 유도하였다. 마우스를 제물대 위에 올려놓고 Micron-IV의 imaging camera로 안저에 영상을 맞춘 후, 해당 안구에 윤활젤을 점안한 뒤 OCT의 렌즈를 마우스의 각막과 접촉시켰다. FFA/OCT 촬영을 실시한 후 마우스 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하였다. FFA에 대한 이미지 분석은 ‘Image-J’ 프로그램을 이용하여, OCT 이미지에 대한 분석은 ‘InSight’ 프로그램을 이용하여 실시하였다.
그 결과, 도 7에 도시한 바와 같이, CNV 유도된 병변 혈관에서의 fluorescein leakage된 CTF (corrected total fluorescence)의 망막병변 값은 SCAI-003 (수니티닙 말레이트 분자회합체)의 0.05%와 0.1%에서 각각 354490±229492와 308729±186424 pixels로서 부형제 대조군의 564998±367102 pixels과 비교 시 통계적으로 유의하게 감소하였고 (각각 p<0.05 및 p<0.001), 시험물질 점안 후 CTF값은 용량의존적으로 감소하였다. 고용량인 SCAI-001, 0.1%의 CTF값은 저용량인 0.025%의 421126±169499 pixels과 비교시 통계적으로 유의하게 감소하였다 (p<0.05). 이와 일치하게 OCT 촬영하여 산출한 병변 부피결과에서도 도 8에 도시한 바와 같이, SCAI-003의 0.025%, 0.5%와 0.1%의 모든 시험군은 vehicle 대조군 대비 통계적으로 유의하게 감소하였다. (각각 p<0.001, p<0.0001 및 p<0.001).
망막 기능 및 망막 전위도 평가
망막의 기능을 평가하기 위하여 망막전위도 변화를 측정하였다. 망막-전위도평가는 CNV 유도 후 11일째에 scotopic ERG (electro-retinogram)에서 mono-flash (0.9 log cds/m2) 자극에 대한 망막 전위도의 변화를 A-wave에서부터 B-wave까지의 amplitude를 평가하였으며, 그 결과를 도 9에 도시하였다.
먼저, 마우스는 망막전위도 (ERG) 평가 12시간 전부터 암실에서 암순응을 유도하였다. 평가 당일(CNV 유도 후 11일)에 마우스를 케타민으로 전신 마취시킨 후, 마취 점안제를 안구에 점안하여 추가 국소 마취시키고, 산동제를 점안하여 산동 유도하였다. 마우스를 ERG 제물대 위에 올려놓고 ERG의 probe를 각각 꼬리, 머리 및 각막에 접촉시켰다. ERG의 flash 자극을 단계별로 높여가며 망막 전위도의 변화를 측정하였다. ERG 평가가 종료되면 마우스 안구에 항생제 점안액을 한 방울 점안하였다. ERG에 대한 분석은 ‘LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)’ 프로그램을 이용하여 실시하였다.
그 결과, 도 9에 도시한 바와 같이, 망막 전위도(ERG) 평가결과에서도 SCAI-003의 0.025% (486.2±74.91μV), 0.5% (510.0±67.80μV)와 0.1% (606.6±119.84μV)까지 모든 시험군은 부형제 대조군 (290.9±68.15μV) 대비 통계학적으로 유의하게 증가되었으며, 망막 기능을 회복하거나 기능 저하를 억제하는 효과를 보였다 (각각 p<0.0001). SCAI-003 0.1%의 B-wave amplitude는 대조군과 비교 시 2배 이상 유지되었고, 저용량군인 0.025% 점안군과 비교에서도 통계적으로 유의하게 증가되었다 (p<0.05).
이상의 결과로부터, 본 발명의 수니티닙 말레이트 분자회합체를 사용하는 조성물인 SCAI-003은 마우스 CNV 모델에서 SCAI-003의 0.025%부터 0.1%까지 2회/일 점안 투여 결과, 용량 의존적으로 CNV 병변 크기 및 leakage density와 병변 부피 감소 결과와 함께 scotopic-ERG에서 B-wave amplitude를 증가시킴으로써 망막기능의 기능개선 효과 또한 인정할 수 있다.

Claims (15)

  1. 약리 활성 물질의 분자회합체로서,
    상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내인, 분자회합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약리 활성 물질은 수니티닙, 액시티닙, 파조파닙, 사이클로스포린, 니클로사마이드, 아데노신, 디옥시콜릭 산, 파클리탁셀 및 이들의 약학적으로 허용되는 염(salt)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 이의 유도체 (derivatives)인 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염이며,
    상기 분자회합체는 수니티닙 화학적 구조의 alkyl기와, alkyl기를 제외한 이중결합 또는 aromatic ring이 서로 강한 intensity를 형성하는 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염이며,
    상기 분자회합체는 2D NMR-NOESY 스펙트럼의 off-diagonal peak position에서 chemical shift 값(δ) 1.5 내지 2.0와 6 내지 6.5에서의 peak 세기가 강하게 관찰되는 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약리 활성 물질은 수니티닙 또는 수니티닙 염이며,
    상기 분자회합체는 도 3의 표시된 2D NMR-NOESY 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수니티닙 염은 수니티닙 말레이트인 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 분자회합체는 수평균 직경이 1 nm 내지 100 nm 인 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 용액은 물 또는 중수소(D2O)인 것을 특징으로 하는, 분자회합체.
  9. 제1항의 분자회합체를 포함하는 안과학적 장애의 치료 또는 방지용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제 및 액체 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 투여가능한 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 매개체 또는 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 안구에 사용하는 안과학적 점안제로 사용되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 노화로 인한 황반 변성 (AMD), 맥락막 혈관 신생 (CNV), 융모막 모양의 신생 혈관 멤브레인 (CNVM), 전망막 (ERM)와 망막황반 홀 및 myopia-associated 맥락막의 신생 혈관 증식으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 안과학적 장애를 치료하거나 방지하기 위한 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  14. 제9항의 조성물을 수용하는 용기를 포함하는 약학 키트로서,
    상기 용기가 환자의 눈에 약학 조성물을 국소 투여하도록 맞춰진 분배 수단을 가지는 약학 키트.
  15. 수니티닙 말레이트의 분자회합체를 포함하는 조성물을 사용하는 안구 점안제로서,
    상기 분자회합체는 용액상에서 분자간 양성자의 공간적 근접 거리가 10Å 이내이고,
    상기 조성물은 우싱(Ussing) 챔버를 이용한 돼지 각막 투과도 실험에서 수니티닙 말레이트를 포함하는 조성물보다 3.5배 이상의 투과율을 보여주는 것을 특징으로 하는, 안구 점안제.
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