WO2023093532A1 - 一种复合凝胶、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合凝胶、制备方法及应用，涉及生物医用材料技术领域。所述复合凝胶由聚乳酸和纳米级无机材料组成的双相微球与透明质酸交联制得；所述方法包括将双相微球与透明质酸进行交联形成三相凝胶。本发明制备的复合凝胶集三种材料的优势于一体，可用于生物组织的填充与修复。

Description

一种复合凝胶、制备方法及应用 技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种复合凝胶、制备方法及应用。
背景技术
聚乳酸(PLA)，又称聚丙交酯，是以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，因其良好的生物相容性、生物可降解性以及易加工等特点被用于与羟基磷灰石结合，用来提高羟基磷灰石的机械性能和生物性能。当前，再生型注射产品已经再全球范围内被广泛接受，而聚乳酸则充当了再生注射产品中的主要材料。聚乳酸在进入人体皮肤之后，能够刺激人体自身组织的再生。通过人体自身的组织再生，起到结构重塑和容积填充的作用，达到抗衰老的目的。能够在被刺激之后再生的组织，主要是成纤维细胞和胶原蛋白这两类。聚乳酸就能够激发自身成纤维细胞分泌胶原蛋白，使填充与修复效果更加自然，同时增加皮肤光泽度，实现整体面部年轻化的目的。但聚乳酸的天然缺陷在于，聚乳酸在人体中降解产生乳酸，而人体对于乳酸的代谢过程较为缓慢，大量的乳酸聚集容易造成无菌性炎症，从而引发一系列不良反应。因此，需要在使用聚乳酸时，添加碱性中和剂，降低由于局部酸性过强而导致的无菌性炎症。因此，呈碱性且具有良好生物相容性的羟基磷灰石则成为了聚乳酸碱性中和剂的不二之选。
聚乳酸与无机材料形成的复合材料已经应用于生物材料之中，例如，CN106139256A公开了一种聚乳酸/纳米β-磷酸三钙复合多孔支架， CN111905151A公开了一种介孔生物活性玻璃/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合微球。
特别的，对于羟基磷灰石与聚乳酸的复合材料在骨科等领域已经广泛使用。黄梽焕等(复合材料学学报，2021，38：749-760)在研究了纳米HAP-聚左旋乳酸(PLLA)复合材料中发现，添加了HAP的PLLA压缩屈服强度和拉伸强度对比纯PLLA材料分别提高了9.4％和6.6％，初始分解温度较纯PLLA分别提高了7.4％和5.6％，结晶度提高了6.7％。由此可见，增加了HAP的PLLA材料在材料学性能方面，较纯的PLLA材料优势明显。此外，羟基磷灰石可以减弱炎症：与增加了HAP的PLA材料相比，纯PLA的炎症反应更强烈，而HAP-PLA复合材料在体内仅表现了及轻微的炎性反应。由此可以证明，HAP的添加能够中和由于PLA降解带来的酸性物质，减少由于酸性带来的无菌性炎症。
目前国内外已有相关羟基磷灰石与聚乳酸二元复合材料以及羟基磷灰石与聚乳酸和其他聚合物三元复合材料或者复合微球报道。Dong Yan(Additive Manufacturing,2020；34:101305)等人已经制备得到了聚乳酸与纳米级羟基磷灰石共混微球，微球的最小粒径最约100μm，主要用于微载体等研究。专利如一种纳米羟基磷灰石/聚乳酸复合微球的制备方法(CN101590388A)、一种负载羟基磷灰石的聚乳酸多孔微球及制备方法(CN103868658B)、一种骨组织用聚乳酸/羟基磷灰石晶须复合多孔支架及制备方法(CN105797215A)、聚乳酸-羟基磷灰石微米纳米多级结构复合微球材料及应用(CN 109749119 A)、一种聚乳酸羟基磷灰石复合微球表面多孔结构的可控化制备方法及应用(CN107519536A)、羟基磷灰石/改性聚乳酸复合微球的制备方法(CN109350768A)以及羟基磷灰石/聚乳酸/壳聚糖复合微球的制备方法(CN102489231B)等主要应用于的骨缺陷的修复、填充和载药性能，并未应用于组织填充领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合凝胶、制备方法及其应用，所述复合凝胶集透明质酸、聚乳酸以及无机材料三种材料的优势于一体，可用于生物组织的填充与修复。
本发明提供的技术方案如下：
一种复合凝胶，由聚乳酸和双相微球与透明质酸交联制得，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球。
进一步的，所述的无机材料选自碳酸钙、磷酸钙或酒石酸钙中的一种或多种；进一步的，所述的磷酸钙优选为羟基磷灰石；更进一步的，所述的无机材料为纳米无机材料。
在一个实施方案中，所述的无机材料为纳米羟基磷灰石钙。
进一步的，所述的透明质酸为交联透明质酸；进一步的，所述的交联透明质酸通过交联剂制备得到，所述的交联剂选自二醛、二硫化物、聚乙二醇(PEG)交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚、双环氧化物、二胺或多胺中的一种或多种。
更进一步的，所述的交联剂选自双碳二亚胺、脂肪二胺、乙二胺、己二胺、内源多胺(精胺或亚精胺)、季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、二乙烯砜(DVS)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1，2-双(2，3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1，2，7，8-二环氧基辛烷(DEO)、(亚苯基双-(乙基)-碳二亚胺和1，6-六亚甲基双(乙基碳二亚胺)、己二酸二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2，3-环氧丙基)-2，3-环氧环己烷、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油醚氧丁烷、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、1，3-丁二烯二环氧化物、1，2，7，8-二环氧辛烷、1，5-己二烯二环氧化物。优选的，所述的交联剂为二胺或多胺，其反应过程可以参考专利CN99813143.1、US9907739、CN202111326226.7等。
进一步的，所述的交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。
进一步的，所述的聚乳酸与透明质酸交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸与透明质酸反应形成酰胺键交联反应。所述物理静电交联包括将双相微球进行表面电荷改性后与透明质酸形成静电交联。更进一步的，所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸进行氨基修饰后与透明质酸反应形成酰胺键交联反应，所述物理静电交联包括将双相微球进行表面电荷改性后与具有正离子的交联透明质酸形成静电交联。
在一个实施方案中，提供了一种复合凝胶，由聚乳酸和纳米级羟基磷灰石组成的双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球与透明质酸交联制得。
一种复合凝胶的制备方法，包括将由双相微球与透明质酸进行交联形成复合凝胶(三相复合凝胶)，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球。
进一步的，所述的双相微球与透明质酸交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。
进一步的，所述透明质酸为非交联的透明质酸或交联的透明质酸。在一个实施方案中，所述的透明质酸为交联透明质酸，优选为二胺或多胺交联的透明质酸，更优选为内源多胺交联的透明质酸。
在一个实施方案中，所述双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球中，羟基磷灰石的质量占微球总质量的0.1-50％，微球除羟基磷灰石外的其余部分均为聚乳酸。
在一个实施方案中，以多胺为交联剂制备交联的透明质酸水凝胶，优选地，多胺交联剂占透明质酸总质量的0.5～20％；所述水凝胶中，透明质酸的质量浓度范围为1～35mg/mL。
在一个实施方案中，所述透明质酸为由微生物发酵法制备的透明质酸； 优选地，所述透明质酸的分子量范围为100KDa～3000KDa，优选500KDa～1500KDa。微生物发酵的透明质酸为非动物源透明质酸，其分子量分布更加均一。
在一个实施方案中，所述交联为固相交联；进一步地，所述固相交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。
在一个实施方案中，所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸进行氨基修饰后，将修饰后的双相微球与透明质酸反应形成酰胺键交联；进一步的，所述的氨基修饰包括将双相微球与胺类化合物反应；更进一步的，酰胺键交联包括将修饰后的双相微球与透明质酸在碳二亚胺活化剂存在下进行偶联反应。
在一个实施方案中，所述胺类化合物包含二胺、多胺或多氨基化合物；优选地，所述二胺包括脂族二胺、芳族二胺和杂原子二胺中的任一种；例如但不限于脂肪二胺、乙二胺、己二胺；所述多胺包括脂族多胺、芳族多胺和杂原子多胺中的任一种；例如但不限于内源性多胺如亚精胺、精胺；所述多氨基化合物包括双端氨基化聚乙二醇和末端氨基化多臂聚乙二醇中的任一种；
进一步地，所述碳二亚胺活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺、1,3-二[二(甲氧甲基)甲基]碳二亚胺中或其盐的一种或多种。
在一个实施方案中，所述制备方法还包含与碳二亚胺活化剂一起联合使用助剂；例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、叔丁醇等。水溶性碳二亚胺活化剂需要与助剂联合使用以提高交联反应效率，助剂的加入量为碳二亚胺质量的10～30％。
在一个实施方案中，所述化学交联中双相微球与所述透明质酸的质量比为1：0.5～20，优选为1：1～10；
反应体系中所述胺类化合物的加入量为所述双相微球质量的30～200％；所述胺类化合物的浓度范围为10～1000mg/mL；
进一步地，所述碳二亚胺活化剂的加入量为所述透明质酸总质量的10～150％；
进一步地，所述透明质酸溶液的浓度为10～100mg/mL；
进一步地，所述氨基修饰反应和所述述酰胺键交联反应的温度为5～60℃，反应时间为6～24h；反应体系的pH值范围为5.0～6.0。
在一个实施方案中，所述的微球为双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球，所述的化学交联包括将双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球在置于水中分散，加入胺类化合物(多胺衍生剂)，调节pH值，使微球表面的羧基与多胺衍生剂发生表面修饰反应，在表面修饰上氨基；将表面氨基修饰的聚乳酸羟基磷灰石分散微球(PLA-HAP双相微球)投入到透明质酸溶液中，调节pH值5.0～6.0，同时加入碳二亚胺活化剂与助剂，完成PLA-HAP双相微球的偶联反应。表面修饰反应温度为5～60℃，反应时间为6～24h；偶联反应的温度为5～60℃，反应时间为6～24h。
所述物理静电交联包括将所述双相微球进行表面电荷改性，得到表面携带负离子的改性双相微球，将改性双相微球与具有正离子的交联透明质酸混合，发生静电交联；进一步的，所述的具有正离子的交联透明质酸为具有采用二胺或多胺交联得到的交联透明质酸；更进一步的，所述的双相微球进行表面电荷改性包括将双相微球浸泡于碱性缓冲液中分离得到。
进一步，所述物理交联中双相微球与所述交联的透明质酸的质量比为1：1～50；优选为1：1～20；
进一步地，所述碱性缓冲液为碱性磷酸盐缓冲液；所述碱性磷酸盐缓冲液的pH范围优选为9.0～11.0。
在一个实施方案中，所述的微球为双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球，所述物理交联包括双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球浸泡于pH9.0～11.0的 PBS溶液中进行表面电荷改性，使得微球表面携带负电荷，分离取出双相微球，与多胺作为交联剂的交联透明质酸凝胶进行物理混合，使得聚乳酸表面的羧酸根负离子与交联透明质酸中的铵正离子发生静电交联。
在一个实施方案中，本发明还包括双相聚乳酸羟基磷灰石分散微球的制备方法，所述方法包括
(a)将聚乳酸(PLA)溶于二氯甲烷中充分搅拌溶解配置成溶液，随后过滤除去不溶物；
(b)加入羟基磷灰石进行超声，搅拌均匀，使羟基磷灰石完全分散在溶液中，形成羟基磷灰石均匀分散的悬浊液；
(c)按照所述二氯甲烷的比例配置聚乙烯醇溶液进行搅拌，在此期间将二氯甲烷悬浊液滴加到该体系中，在搅拌剪切作用以及乳化作用下形成微球；
(d)将乳化后的溶液进行水浴、搅拌，挥发除去二氯甲烷，然后将所得溶液洗涤，过滤。
在一个具体的实施方案中，所述步骤(a)中，优选地，所述PLA的二氯甲烷溶液浓度为10mg/mL～80mg/mL，包括但不限于：15mg/mL，30mg/mL，40mg/mL，60mg/mL和80mg/mL。
优选地，所述PLA包含聚左旋乳酸(PLLA)、聚消旋乳酸(PDLLA)以及聚右旋乳酸(PDLA)中的一种或多种的混合物。
优选地，所述PLA的分子量范围为10KDa～150KDa。
在一个具体的实施方案中，所述步骤(b)中，优选地，所述羟基磷灰石质量分数1％～20％，保证其能够完全结合到聚乳酸微球中。
优选地，所述超声能量为1-300KJ，优选能量为1-20KJ，超声能量计算公式如下：
超声能量(KJ)＝超声功率(W)×超声时间(s)/1000。
在一个具体的实施方案中，所述步骤(c)中，优选地，所述聚乙烯醇溶液浓度为5mg/ml～30mg/ml，在此浓度区间可以保证乳化效果，控制微球尺寸。
优选地，所述二氯甲烷溶液与聚乙烯醇溶液比例为1/2-1/10。
优选地，所述的搅拌设备中搅拌桨的转速为100～600rpm/min，在此转速区间，能够保证持续乳化，形成良好的乳浊液。
在一个具体的实施方案中，在步骤(d)中，优选地，所述水浴温度为20～37℃，在此温度区间可以控制二氯甲烷挥发速率，从而优化微球的中空效果以及表面微孔构造；在步骤(d)后，将所得滤饼进行干燥即可得到双相聚乳酸羟基磷灰石纳米分散微球；优选地，所述干燥过程包括真空烘干和冷冻干燥两种方式，真空干燥是利用在近似真空条件下，水沸点下降，在较低的温度下将水分挥发出来，冷冻干燥法是利用冰晶升华的原理，避免了固相组分液化过程对微球内部结构的破坏，能够更好地保持制备得到的聚乳酸微球的空间结构。
在一个实施方案中，本发明复合凝胶的平均弹性模量为400至1000Pa。
在一个实施方式中，本发明复合凝胶的灭菌前后弹性模量损失率低于30％，更优选的，低于20％。在另一个方面，本发明保护所述制备方法制得的复合凝胶。
在再一个方面，本发明还保护复合凝胶在制备药物载体、组织填充物或组织修复材料中的应用。
进一步的，所述的药物载体可以为生物药物、化学药物或天然提取药物的药物载体。
有益效果：
(1)本发明通过先制备聚乳酸-无机材料双相微球，再利用固相交联技术将双相微球中聚乳酸末端的羧基基团与透明质酸进行物理静电交联或 化学交联，形成三相复合凝胶稳定性高，生物相容性好，可用于生物组织的填充与修复。
(2)本发明中的双相微球，由于加入了亲水的钙盐无机材料(如羟基磷灰石、磷酸钙、酒石酸钙等)，进一步提高了聚乳酸微球的亲水性。并且双相微球中钙基无机材料可以以微米级的聚乳酸为载体，引入到宏观的交联透明质酸的网络结构中(交联透明质酸的颗粒也是微米级别)，通过钙离子与透明质酸中的羧基和羟基的络合作用，填补了交联透明质酸之间的网络缝隙，使得三相凝胶具有更紧密的网络结构；同时借助钙基无机材料与透明质酸的络合作用，拉近了聚乳酸与透明质酸分子链之间的距离，从而提高两者交联反应效率，提高三相复合凝胶的机械强度与热稳定性。
(3)本发明制备方法工艺简单，操作方便，易于实现产业化。
(4)本发明制得的复合凝胶可发挥透明质酸的即时填充作用、聚乳酸的胶原再生作用以及钙基无机材料如羟基磷灰石骨性填充与中和乳酸的作用，集三种材料的优势于一体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中双相聚乳酸羟基磷灰石纳米分散微球显微镜照片；
图2为本发明实施例1中双相聚乳酸羟基磷灰石纳米分散微球扫描电镜照片；
图3为本发明实施例1中双相聚乳酸羟基磷灰石纳米分散微球扫描电镜局部放大照片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：双相微球制备1
称取1.8g的聚乳酸放置于50mL烧杯中，然后加入50mL的二氯甲烷，用药匙搅拌使其完全溶解，然后用10mm尼龙66材质针头过滤器过滤到超声专用烧杯中，然后称取0.2g的纳米羟基磷灰石加入到该体系中，60％的功率作用10min将纳米材料充分分散在聚乳酸的二氯甲烷溶液中，在此期间将135mL的聚乙烯醇溶液(1.5wt％)加入到300mL三口烧瓶中并放置于30℃水浴中，随后用速率为400rpm/min的机械搅拌。待超声结束随后将二氯甲烷浊液慢慢加入到聚乙醇溶液中，搅拌过夜挥发除去二氯甲烷。
将上一步所得的浊液加入纯化水稀释至500mL，然后静置1h，倒掉上层悬浮液，重复两次，然后复溶沉淀，用0.45μm的水系滤膜过滤，除去液体，然后将所得固体用200mL纯化水分散，再次过滤，重复四次，然后将所得固体用150mL纯化水复溶，加入到肖特瓶中，放入100℃烘箱加热30min取出，待其冷却过滤，纯化水清洗三次，最后一次洗涤得到的固体转移到培养皿中，放入真空干燥箱中40℃过夜烘干得到终产物。产物粒径主要分布在25-86μm之间显微镜照片见图1，扫描电镜照片见图2-3。从图中可以看出，双相微球形貌规整，粒径均匀。
实施例2：双相微球制备2
称取1.6g的聚乳酸放置于50mL烧杯中，然后加入50mL的二氯甲烷， 用药匙搅拌使其完全溶解，然后用10mm尼龙66材质针头过滤器过滤到超声专用烧杯中，然后称取0.2g的纳米羟基磷灰石加入到该体系中，60％的功率作用10min将纳米材料充分分散在聚乳酸的二氯甲烷溶液中，在此期间将90mL的聚乙烯醇溶液(1.5wt％)加入到300mL三口烧瓶中并放置于30℃水浴中，随后用速率为400rpm/min的机械搅拌。待超声结束随后将二氯甲烷浊液慢慢加入到聚乙醇溶液中，搅拌过夜挥发除去二氯甲烷。
将上一步所得的浊液加入纯化水稀释至500mL，然后静置1h，倒掉上层悬浮液，重复两次，然后复溶沉淀，用0.45μm的水系滤膜过滤，除去液体，然后将所得固体用200mL纯化水分散，再次过滤，重复四次，然后将所得固体用150mL纯化水复溶，加入到肖特瓶中，放入100℃烘箱加热30min取出，待其冷却过滤，纯化水清洗三次，最后一次洗涤得到的固体转移到培养皿中，冷冻干燥得到终产物。粒径主要分布在25-72μm之间。
实施例3：三相凝胶的物理交联
称取1.5g透明质酸钠(分子量900KDa)，然后加入37.5mL的纯化水，完全溶解后，此时透明质酸的浓度为40mg/mL，向透明质酸溶液中加入亚精胺45mg。在亚精胺三位点交联的前提下，用6mol/L的盐酸溶液将透明质酸溶液的pH值调节至6.2左右，随后加入搅匀，加入0.214g EDC，同时加入NHS 0.04g继续搅拌均匀，密封放入40℃鼓风干燥箱反应14h。反应结束后加入40mL无水乙醇，采用IKA T25高剪切分散机对凝胶颗粒进行粉碎，粉碎转速为10000转/分钟，持续5min。粉碎完成后继续加入无水乙醇200mL使凝胶完全脱水。分离沉淀，将沉淀用200mL无水乙醇连续清洗5次，再将沉淀放入真空烘箱后，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干凝胶1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH6.0PBS共50mL，待凝胶完全溶胀后备用。
取实施例1中获得的双相微球3.0g，浸泡于pH9.0的PBS溶液50mL中进行表面电荷改性，使得微球表面携带负电荷，浸泡30分钟后，分离取 出双相微球，沥干后与50mL交联透明质酸凝胶进行物理混合，使得聚乳酸表面的羧酸根负离子与交联透明质酸中的铵正离子发生静电交联。混合均匀后，将三相凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品凝胶。
实施例4：三相凝胶的化学交联
取实施例1中获得的双相微球1.5g，加入纯化水100mL，加入乙二胺2.0g，使用1mol/L的盐酸溶液将溶液pH调节至5.5，加入2.0g的EDC，0.4g的NHS进行表面氨基修饰反应，40℃条件反应16h。过滤分离微球，将微球用纯化水清洗至pH7.0-7.1范围内，于真空干燥箱中40℃过夜烘干得到表面氨基修饰的双相微球。
称取1.5g透明质酸钠，然后加入37.5mL的纯化水，完全溶解后，此时透明质酸的浓度为40mg/mL，向透明质酸溶液中加入实施例2获得双相微球1.0g。用0.1mol/L的盐酸溶液将透明质酸溶液的pH值调节至5.5左右，随后加入搅匀，加入0.3g EDC同时加入NHS 0.06g(EDC质量的20％)继续搅拌均匀，密封放入40℃鼓风干燥箱反应14h。反应结束后加入无水乙醇200mL使凝胶完全脱水。分离沉淀，将沉淀用200mL无水乙醇连续清洗5次，再将沉淀放入真空烘箱后，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干凝胶1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液共50mL，待凝胶完全溶胀后，将凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品三相凝胶。
实施例5：碳酸钙双相微球的制备
称取1.6g的聚乳酸放置于50mL烧杯中，然后加入50mL的二氯甲烷，用药匙搅拌使其完全溶解，然后用10mm尼龙66材质针头过滤器过滤到超声专用烧杯中，然后称取0.2g的纳米碳酸钙加入到该体系中，60％的功率作用10min将纳米材料充分分散在聚乳酸的二氯甲烷溶液中，在此期间将90mL的聚乙烯醇溶液(1.5wt％)加入到300mL三口烧瓶中并放置于30℃ 水浴中，随后用速率为400rpm/min的机械搅拌。待超声结束随后将二氯甲烷浊液慢慢加入到聚乙醇溶液中，搅拌过夜挥发除去二氯甲烷。
将上一步所得的浊液加入纯化水稀释至500mL，然后静置1h，倒掉上层悬浮液，重复两次，然后复溶沉淀，用0.45μm的水系滤膜过滤，除去液体，然后将所得固体用200mL纯化水分散，再次过滤，重复四次，然后将所得固体用150mL纯化水复溶，加入到肖特瓶中，放入100℃烘箱加热30min取出，待其冷却过滤，纯化水清洗三次，最后一次洗涤得到的固体转移到培养皿中，冷冻干燥得到终产物。
实施例6：酒石酸钙双相微球的制备
称取1.6g的聚乳酸放置于50mL烧杯中，然后加入50mL的二氯甲烷，用药匙搅拌使其完全溶解，然后用10mm尼龙66材质针头过滤器过滤到超声专用烧杯中，然后称取0.2g的纳米酒石酸钙加入到该体系中，60％的功率作用10min将纳米材料充分分散在聚乳酸的二氯甲烷溶液中，在此期间将90mL的聚乙烯醇溶液(1.5wt％)加入到300mL三口烧瓶中并放置于30℃水浴中，随后用速率为400rpm/min的机械搅拌。待超声结束随后将二氯甲烷浊液慢慢加入到聚乙醇溶液中，搅拌过夜挥发除去二氯甲烷。
将上一步所得的浊液加入纯化水稀释至500mL，然后静置1h，倒掉上层悬浮液，重复两次，然后复溶沉淀，用0.45μm的水系滤膜过滤，除去液体，然后将所得固体用200mL纯化水分散，再次过滤，重复四次，然后将所得固体用150mL纯化水复溶，加入到肖特瓶中，放入100℃烘箱加热30min取出，待其冷却过滤，纯化水清洗三次，最后一次洗涤得到的固体转移到培养皿中，冷冻干燥得到终产物。
实施例7：碳酸钙三相凝胶的化学交联
取实施例5中获得的双相微球1.5g，加入纯化水100mL，加入乙二胺2.0g，使用1mol/L的盐酸溶液将溶液pH调节至5.5，加入2.0g的EDC，0.4g的NHS进行表面氨基修饰反应，40℃条件反应16h。过滤分离微球， 将微球用纯化水清洗至pH7.0-7.1范围内，于真空干燥箱中40℃过夜烘干得到表面氨基修饰的双相微球。
称取1.5g透明质酸钠，然后加入37.5mL的纯化水，完全溶解后，此时透明质酸的浓度为40mg/mL，向透明质酸溶液中加入双相微球1.0g。用0.1mol/L的盐酸溶液将透明质酸溶液的pH值调节至5.5左右，随后加入搅匀，加入0.3g EDC同时加入NHS 0.06g(EDC质量的20％)继续搅拌均匀，密封放入40℃鼓风干燥箱反应14h。反应结束后加入无水乙醇200mL使凝胶完全脱水。分离沉淀，将沉淀用200mL无水乙醇连续清洗5次，再将沉淀放入真空烘箱后，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干凝胶1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液共50mL，待凝胶完全溶胀后，将凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品三相凝胶。
实施例8：酒石酸钙三相凝胶的化学交联
取实施例6中获得的双相微球1.5g，加入纯化水100mL，加入乙二胺2.0g，使用1mol/L的盐酸溶液将溶液pH调节至5.5，加入2.0g的EDC，0.4g的NHS进行表面氨基修饰反应，40℃条件反应16h。过滤分离微球，将微球用纯化水清洗至pH7.0-7.1范围内，于真空干燥箱中40℃过夜烘干得到表面氨基修饰的双相微球。
称取1.5g透明质酸钠，然后加入37.5mL的纯化水，完全溶解后，此时透明质酸的浓度为40mg/mL，向透明质酸溶液中加入双相微球1.0g。用0.1mol/L的盐酸溶液将透明质酸溶液的pH值调节至5.5左右，随后加入搅匀，加入0.3g EDC同时加入NHS 0.06g(EDC质量的20％)继续搅拌均匀，密封放入40℃鼓风干燥箱反应14h。反应结束后加入无水乙醇200mL使凝胶完全脱水。分离沉淀，将沉淀用200mL无水乙醇连续清洗5次，再将沉淀放入真空烘箱后，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干凝胶1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液共50mL，待 凝胶完全溶胀后，将凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品三相凝胶。
对比例1.非交联三相凝胶的制备
称取1.5g透明质酸钠，然后加入37.5mL的纯化水，完全溶解后，此时透明质酸的浓度为40mg/mL，向透明质酸溶液中加入实施例2获得的双相微球1.0g，搅拌均匀。搅拌结束后加入无水乙醇200mL使凝胶完全脱水。分离沉淀，将沉淀用200mL无水乙醇连续清洗5次，再将沉淀放入真空烘箱后，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干凝胶1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH7.0磷酸盐缓冲液共50mL，待凝胶完全溶胀后，将凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得非交联三相凝胶。
对比例2.三相非物理交联共混凝胶的制备
亚精胺交联的透明质酸凝胶制备方法同实施例3，整体制作方法完全一致。
取实施例1中获得的双相微球3.0g，直接与50mL交联透明质酸凝胶进行物理混合。混合均匀后，将三相凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品凝胶。
对比例3.单相PLA微球与交联透明质酸物理共混凝胶的制备
称取1.6g的聚乳酸放置于50mL烧杯中，然后加入50mL的二氯甲烷，用药匙搅拌使其完全溶解，然后用10mm尼龙66材质针头过滤器过滤到超声专用烧杯中，在此期间将90mL的聚乙烯醇溶液(1.5wt)加入到300mL三口烧瓶中并放置于30℃水浴中，随后用速率为400rpm/min的机械搅拌。随后将二氯甲烷溶液慢慢加入到聚乙醇溶液中，搅拌过夜挥发除去二氯甲烷。将上一步所得的浊液加入纯化水稀释至500mL，然后静置1h，倒掉上层悬浮液，重复两次，然后复溶沉淀，用0.45μm的水系滤膜过滤，除去液体，然后将所得固体用200mL纯化水分散，再次过滤，重复四次，然后将 所得固体用150mL纯化水复溶，加入到肖特瓶中，放入100℃烘箱加热30min取出，待其冷却过滤，纯化水清洗三次，最后一次洗涤得到的固体转移到培养皿中，冷冻干燥得到终产物PLA微球。
取获得的PLA微球3.0g，浸泡于pH9.0的PBS溶液50mL中进行表面电荷改性，使得微球表面携带负电荷，浸泡30分钟后，分离取出微球，沥干后与实施例3中获得的50mL交联透明质酸凝胶进行物理混合，使得聚乳酸表面的羧酸根负离子与交联透明质酸中的铵正离子发生静电交联。混合均匀后，将共混凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品凝胶。
对比例4.纳米级HAP与交联透明质酸物理共混凝胶的制备
亚精胺交联的透明质酸凝胶制备方法同实施例3，整体制作方法完全一致。
取纳米级HAP 3.0g，直接与50mL交联透明质酸凝胶进行物理混合。混合均匀后，将共混凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃，15min的条件进行湿热灭菌，获得终产品凝胶。
效果例：
三相凝胶的流变学性能检测
将实施例以及对比例获得的三相凝胶中，分为灭菌前与灭菌后两个类型各取出2.0mL，采用TA DHR-2型平板流变仪检测凝胶的弹性模量(G’)，并计算弹性模量损失率。其中，G’损失率由下式进行计算：
G’损失率＝(灭菌前G’-灭菌后G’)/灭菌前G’
流变仪参数为，操作间隙：1000mm，装载间隙：45000m，运行温度：37℃，形变量：1％，频率：0.9Hz，运行时间：60s。各凝胶流变学数据如表1所示：
表1.三相凝胶的流变学数据
实施例 灭菌前G’(Pa) 灭菌后G’(Pa) G’损失率
实施例3 473 344 27.3％
实施例4 867 698 19.5％
实施例7 813 615 24.4％
实施例8 837 618 26.2％
对比例1 372 10 97.3％
对比例2 403 256 36.5％
对比例3 275 166 39.6％
对比例4 266 153 42.5％
表1数据可以看出，实施例3的物理交联得到的三相凝胶，相较于对比例2的三相非物理交联共混凝胶，弹性模量有所提高，并且热稳定性也有一定提高，说明经物理交联对复合凝胶弹性模量的提高具有一定的贡献，也在一定程度上提升了三相凝胶的热稳定性。而对比例1由于只是将非交联HA、PLA、HAP三种物质进行物理混合，三种物质中并未存在化学键的作用，无法抵抗湿热灭菌时的剧烈水解作用，导致了灭菌后对比例1的弹性模量下降值超过了97％。
对比例3中虽然将PLA与HA物理交联，但是未加入HAP，其复合凝胶的弹性模量较实施例3低，热损失率高。说明HAP在与PLA形成复合微球后，纳米HAP以微米级别的PLA为载体，引入到宏观的交联透明质酸的网络结构中(交联透明质酸的颗粒也是微米级别)，通过钙离子与透明质酸中的羧基和羟基的络合作用，填补了交联透明质酸之间的网络缝隙，使得三相凝胶具有更紧密的网络结构；同时借助HAP与HA的络合作用，拉近了PLA与HA分子链之间的距离，从而提高两者交联反应效率，因此具有更高的弹性模量与更强的热稳定性。
对比例4公开纳米级HAP与交联透明质酸物理共混，但是没有展现较高的弹性模量与较强的热稳定性，这是由于对比例4是直接加入了纳米级 的HAP，相比微米级的交联透明质酸凝胶，两者之间的物理尺寸相差较大，从而导致二者空间差异较大，HAP难以填补交联透明质酸凝胶的缝隙，从而不能形成更紧密的网络结构。这也进一步说明了通过将HAP与PLA形成双相微球，使HAP负载在PLA的微米级载体上，可以进一步与交联透明质酸凝胶形成更加紧密的网络结构，从而具备更高的弹性模量和更强的热稳定性。因此，该复合凝胶是在交联透明质酸、PLA-HAP双相微球三者之间的相互协同作用，可以提高三相凝胶中的弹性模量和热稳定性，三相凝胶中的三个组分缺一不可。
实施例4、7、8化学交联得到的三相复合凝胶弹性模量明显提高，说明将物理交联替换为化学交联时，由于化学交联形成的键合作用强度远高于物理交联的相互作用强度，因此交联透明质酸、HAP(或其他纳米级钙盐)与PLA三者之间的相互作用得到了进一步的增强，相比于物理交联的三相凝胶，化学交联三相凝胶的弹性模量和热稳定性得到了进一步提高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

  1. 一种复合凝胶，其特征在于，由双相微球与透明质酸交联制得，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球。
  2. 权利要求1所述的复合凝胶，其特征在于，所述的交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。
  3. 权利要求2所述的复合凝胶，其特征在于，所述的聚乳酸与透明质酸交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。
  4. 权利要求1所述的复合凝胶，其特征在于，所述的无机材料选自碳酸钙、磷酸钙或酒石酸钙中的一种或多种；进一步的，所述的磷酸钙优选为羟基磷灰石；更进一步的，所述的无机材料为纳米无机材料。
  5. 权利要求3所述的复合凝胶，其特征在于，所述的透明质酸为交联透明质酸；进一步的，所述的交联透明质酸通过交联剂制备得到，所述的交联剂选自二醛、二硫化物、聚乙二醇(PEG)交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚、双环氧化物、多胺中的一种或多种；更进一步的，所述的交联剂为内源多胺。
  6. 一种复合凝胶的制备方法，其特征在于，包括将双相微球与透明质酸进行交联形成复合凝胶，所述的双相微球为聚乳酸/无机材料双相微球，所述的交联包括双相微球中聚乳酸与透明质酸交联。
  7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述交联为固相交联；进一步地，所述固相交联包括物理静电交联和化学交联中的任一种。
  8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸为交联的透明质酸，所述的交联透明质酸通过交联剂制备得到，所述的交联剂选自二醛、二硫化物、聚乙二醇(PEG)交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚、双环氧化物、多胺中的一种或多种。
  9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化学交联包括将双相微球中的聚乳酸进行氨基修饰后，将修饰后的双相微球与透明质酸反应形成酰胺键交联；进一步的，所述的氨基修饰包括将双相微球与胺类化合物反应；更进一步的，酰胺键交联包括将修饰后的双相微球与透明质酸在碳二亚胺活化剂存在下进行偶联反应。
  10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述胺类化合物包含多胺或多氨基化合物；
    优选地，所述多胺包括脂族多胺、芳族多胺和杂原子多胺中的任一种；所述多氨基化合物包括双端氨基化聚乙二醇和末端氨基化多臂聚乙二醇中的任一种；
    进一步地，所述碳二亚胺活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺、1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺、1,3-二[二(甲氧甲基)甲基]碳二亚胺或其盐中的一种或多种。
  11. 根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述化学交联中双相微球与所述透明质酸的质量比为1：0.5～20，优选为1：1～10；
    进一步地，所述胺类化合物的加入量为所述双相微球质量的30～200％；所述胺类化合物的浓度范围为10～1000mg/mL；
    进一步地，所述碳二亚胺活化剂的加入量为所述透明质酸的总质量的10～150％；
    进一步地，所述透明质酸溶液的浓度为10～100mg/mL；
    进一步地，所述氨基修饰反应和所述酰胺键交联反应的温度为5～60℃，反应时间为6～24h。
  12. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述物理静电交联包括将所述双相微球进行表面电荷改性，得到表面携带负离子的改性双相微球，将改性双相微球与具有正离子的交联透明质酸混合，发生静电交联；进一步的，所述的具有正离子的交联透明质酸为具有采用多胺交联得到的 交联透明质酸；更进一步的，所述的双相微球进行表面电荷改性包括将双相微球浸泡于碱性缓冲液中，分离得到。
  13. 根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述物理静电交联中双相微球与所述交联的透明质酸的质量比为1：1～50；优选为1：1～20；
    进一步地，所述碱性缓冲液为碱性磷酸盐缓冲液；所述碱性磷酸盐缓冲液的pH范围优选为9.0～11.0。
  14. 权利要求1-5所述的复合凝胶或权利要求6～13任一项所述制备方法制得的复合凝胶在制备药物载体、填充物或组织修复材料中的应用。
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