CN105107026A - 纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法，方法包括：获取聚乳酸微球；对聚乳酸微球进行表面氨解处理；在氨解后的聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原；将接枝有纤维蛋白原的聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。本发明的上述方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝胶支架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球之间的凝胶孔隙、微球表面的相容亲和性也能相应大大提升；能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产物的交换。

Description

纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法

技术领域

本发明属于3D细胞培养技术领域，具体涉及一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法。

背景技术

3D细胞培养技术是在细胞培养过程中，为细胞提供一个更加接近体内生存条件的三维微环境，使细胞能够具有高质量、高密度的细胞繁殖的优势；这些微环境的构建方式，通常有支架、微球载体等等方式实现。

而其中，微球载体其原理是将对细胞无害的颗粒加入到培养容器的培养液中作为载体，使细胞吸附在其表面附着生长，同时通过持续搅动使微球载体始终保持悬浮状态。因为贴壁依赖性细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微球载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。而目前使用较多的微球载体有液体微球载体、大孔明胶微球载体、聚苯乙烯微球载体、PHEMA微球载体、甲壳质微球载体、聚氨酯泡沫微球载体、藻酸盐凝胶微球载体以及磁性微球载体等。这些类型的微球载体在根据细胞培养的需求进行选择时，主要是根据细胞能否在微球载体表面黏附，具体主要是细胞与微球载体的接触概率和相融性；影响这两个因素的是细胞的表面和载体表面的静电引力和范德华力。但是，出于微球之间各自不能稳定的结合，相对之间游离性较大，无法构建比较稳定的细胞生长空间，所以在3D细胞培养的过程中，通常多倾向于用支架进行。

而目前效果较好的支架大多是胶原、蚕丝蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖等原材料制备。但是这些材料在使用中尽管相比具有良好的生物相容性，但是来源非常受限，且受制于材料自身的因素难以控制。而且各种类型的支架都有其有缺陷，比如凝胶类型支架亲和性好一些，但是自身强度低、降解快、机械力学不足、形态变化不稳定；又如聚合物类型的支架形态稳定、密度均一、降解缓慢，却不能提供稳定的细胞贴壁强度。所以采用上述类型的微球载体进行一些培养环境要求较高细胞时，比如DC、CIK等免疫细胞培养时，都无法较好地满足需求。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种机械强度高、孔隙多，且相容亲和性也能相应大大提升的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，包括如下步骤：

获取聚乳酸微球；

对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理，获取氨解聚乳酸微球；

在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原，获取接枝聚乳酸微球；

将所述接枝聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。

本发明的上述方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝胶支架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球之间的凝胶孔隙、微球表面的相容亲和性也能相应大大提升；能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产物的交换。

在上述方法过程的基础上，本发明进一步还提出一种根据上述方法步骤制备得到的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。采用本发明所制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后，微球载体之间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以互相弥补其缺点，具有一定的协同作用，对于一些生长和培养条件和要求严格的细胞生长更为有利。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架的场发射扫描电镜扫描图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，包括如下步骤：

S10，制备聚乳酸微球；

S20，对聚乳酸微球进行表面氨解处理；

S30，在表面氨解后的聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原；

S40，将纤维蛋白原接枝后的聚乳酸微球与纤维蛋白原溶液共同凝结固化。

本发明的上述制备方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝胶支架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球表面的相容亲和性也能相应大大提升；微球之间的凝胶孔隙，能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产物的交换。同时，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后，微球载体之间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以互相弥补其缺点，具有一定的协同作用。对于一些生长和培养条件要求严格的细胞生长更为有利。

其中在上述步骤S10中制备聚乳酸微球，或者可以直接购买；聚乳酸微球是使用比较多的聚合物微球载体，是比较成熟的商品，可以直接购买得到。进一步，在本发明的上述实施过程中，聚乳酸微球主要的目的是为了在纤维蛋白凝胶内形成填充，而且最好填充之后能在微球之间能利于形成凝胶内部孔隙，提升细胞的附着和生长空间。而经过试验之后，采用粒径和尺寸比较均一的微球填充之后，比较难产生内部应力和孔隙差，相对比较均一；所以本发明中采用粒径尺寸不相同的聚乳酸微球进行混合，以增加填充之后凝胶内部的孔隙差。而具体实施中，根据所购买的聚乳酸凝胶产品的规格(市售的聚乳酸微球一般都是在60～250μm之间)，本发明中优选采用三种粒径不同的聚乳酸微球进行配合，三种粒径不同的聚乳酸微球的添加比例按照小粒径微球：中粒径微球：大粒径微球为4～6：2～3：1的比例进行。其中，这三种粒径不同的微球尺寸和大小均是相对的，实施中一般可以分别选择250μm左右、180μm左右、120μm左右稍微比较有差别的进行。

进一步在步骤S10选料完成之后，步骤S20进一步对微球的表面进行处理，处理的方式为氨解处理，聚乳酸微球的聚酯类聚合物链中的酯键可以在氨基存在下发生断裂，一端与氨基形成酰胺键，另一端形成羟基。氨解反应之后增加微球表面的活性基团数量，这些活性的基团一方面可以便于后续与纤维蛋白的连接；第二方面可以改变微球表面的亲水性，便于细胞的细胞粘附、增殖。其中，在该步骤中氨解反应的过程采用己二胺对聚乳酸微球表面进行氨解，己二胺中的一个氨基与断开的聚乳酸的酯键形成酰胺键，而另一端保存形成为自由氨基，从而将自由氨基引到聚乳酸微球的表面。

并且，在该步骤中氨解发生的过程只需微球表面产生这些暴露的基团即可，而尽量避免聚乳酸微球自身的大量损失；而且氨解的处理中，在保证氨基引入量和基体机械强度的前提下，本发明相比其他的氨解的过程，采用尽量加强引入氨解的反应物的浓度，增加局部反应的程度和效率，且尽量降低反应时间；其目的在于反应的初始阶段尽量增加局部的剧烈性，局部剧烈之后能够在很短的时间内将微球表面产生凹陷或者孔洞形态，增加孔隙率；有利于在后续填充之后提升支架的细胞吸附空间。所以，本发明该步骤相比正常其他的表面处理的方式中，用于改性的己二胺的浓度控制在12～15％mg/mL的质量体积浓度，同时将氨解的过程控制10～15min；并且更加优选地为了加快初始反应的速率，可以将反应温度提升至50～60℃的温度。

在上述步骤S20之后，步骤S30进一步将表面氨解之后的聚乳酸微球进行表面接枝；而采用该手段进行的处理中，接枝采用的接枝物为纤维蛋白原；接枝上纤维蛋白原的目的，一方面是接枝上的纤维蛋白原可以在后续的过程中，自身形成纤维蛋白凝胶的成分，可以提升微球与凝胶的结合力；而另一方面，接枝上的纤维蛋白原固化之后会形成微球之间连接的丝网或者骨架，通过该丝网或者骨架，后续组织工程培养中当整体的纤维蛋白凝胶发生降解之后，这些微球所接枝并固化的纤维蛋白形成微载体之间保持相互连接堆砌的桥梁，仍然可以维持细胞生长的空间，大大延缓并提升了复合支架的使用的效率。

其中在本发明的步骤S30中进行接枝处理的方式可以采用“schiff碱反应”进行，具体实施的方式可以采用将步骤S20氨解之后的聚乳酸微球戊二醛溶液中，使微球表面的氨基转换成醛基-CHO，而后表面富含醛基的聚乳酸微球浸泡于纤维蛋白原溶液中，由于Schiff碱反应，醛基与纤维蛋白胶原分子链中的氨基反应形成-C＝N-基团，从而实现将纤维蛋白原共价接枝固定在微球表面。

同时，在接枝反应的过程中，本身表面氨解处理之后能接枝上纤维蛋白的量已经确定(即为氨解过程中聚乳酸表面上所生成的活性集团的数量)，所以接枝的过程中，直接可以稍微过量添加纤维蛋白原，以保证基本上都能接枝上即可。

最后，最终步骤S40在步骤S30接枝完成之后，将接枝后的微球浸到纤维蛋白原溶液中整体进行固化凝结，形成聚乳酸填充的纤维蛋白凝胶支架。

在上述方法过程的基础上，本发明进一步还提出一种根据上述方法步骤制备得到的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架。采用本发明所制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架，得到具有微球载体内填充的纤维蛋白凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球表面的相容亲和性也能相应大大提升；微球之间的凝胶孔隙，能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产物的交换。同时，在组织工程进行细胞培养的后期，纤维蛋白凝胶发生大部分降解后，微球载体之间依然能保持相互连接堆砌，仍然可以维持细胞生长的空间，二者的复合可以互相弥补其缺点，具有一定的协同作用，对于一些生长和培养条件和要求严格的细胞生长更为有利。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明所制备得到的多孔复合支架的品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S10，分别称取S10中所购买的A型聚乳酸微球10g、B型聚乳酸微球20g、C型聚乳酸微球40g；

此实施例中采用的聚乳酸微球购买自西安瑞捷生物科技有限公司，分别包括三种：孔径为200μm、孔隙率为93％的A型聚乳酸微球；孔径为160μm、孔隙率为81％的B型聚乳酸微球；孔径为100μm、孔隙率为68％的C型聚乳酸微球；

S21，将步骤S10中所称取的聚乳酸微球全部置于大烧杯中，并向大烧杯中加入质量体积分数为12％的己二胺/正丙醇溶液中；

S22，然后将步骤S21的烧杯置于在55℃水浴中反应15min后，去除反应残夜并用去离子水充分洗涤聚乳酸微球以除去未反应的己二胺残留，之后再于-20℃下冻干备用；

S31，将步骤S22氨解完成之后的聚乳酸微球浸入1％戊二醛水溶液中，常温中孵育或者保持4h，然后用去离子水冲洗3～5次后，备用；

S32，制备纤维蛋白原(纤维蛋白原凝结固化之后即形成纤维蛋白凝胶)溶液：

将新鲜的冰冻人血浆30h放置于-20℃的冰箱中冻存48小时，取出后放置于4℃冰箱中18～24h；当血浆中出现较多冰渣时，将此化冻的血浆转移至入50ml离心管中，4℃、8000g的条件下离心30分钟；

离心后，弃去上清液，用生理盐水溶解离心管底部的白色沉淀物，得到胶原蛋白原溶液；其中，生理盐水的量添加按照沉淀物估算质量配制成10～40mg/ml浓度的纤维蛋白原溶液；

S33，将步骤S31处理后表面醛基化的聚乳酸微球浸入步骤S32制备的纤维蛋白原溶液中，然后4℃下放置24h，隔2h振荡一次。

完成后，用超纯水对聚乳酸微球进行反复冲洗，洗涤干净后冻干备用；

S40，将步骤S33制备的接枝完成后的聚乳酸微球称重，大概按照聚乳酸微球：纤维蛋白原质量比为1：2的比例，用上述制备的纤维蛋白原在振荡器上震荡使聚乳酸微球均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后加入适量的凝血酶并分散均匀后，放入37℃恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋白原交联，形成凝胶后即获得微载体与纤维蛋白凝胶的复合支架。

为了查看并验证本发明方法制备得到的复合支架的品质，采用冷冻-冻干的方法处理复合支架，然后采用场发射扫描电镜进行观测；观测到的图像如图1所示，从图1中可以看出，不同尺寸的微球随机地联系或者分布在凝胶内，相互之间有较大的孔隙。

并且进一步为了与普通支架对比本发明的上述复合支架是否在一些要求高的细胞3D培养中的效果，以下进行CIK的对比培养验证。

S50，制备通常的纤维蛋白凝胶支架：

配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶1mL溶解冻干纤维蛋白原，即得溶液A；

将凝血酶加入40mmol/LCaCl2溶液中，配制出凝血酶浓度为250～400u/mL的溶液B；

将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm²模具中制作成为圆柱形的复合物，置37℃保温1h，即得到通常的圆柱形的纤维蛋白凝胶支架(规格根据磨具的形状为10*10*10mm³)，4℃冰箱保存备用。

S60，从血液中分离单个核细胞：

a.取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中，300g离心10min，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中，56℃水浴灭活30min，再于400g离心10min后，收集上层黄色液体即低血小板血浆(PoorPlateletPlasma，PPP)，4℃储存备用；

b.向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合液，用移液器混匀，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层，400g离心20min；吸取中间白膜层(即单个核细胞)至新的50ml离心管中，用生理盐水补液到45ml后，离心洗涤单个核细胞2次。

S70，采用步骤S50制备的普通纤维蛋白凝胶支架和本发明步骤S40制备的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架用步骤S60获得的单个核细胞进行CIK培养，具体按照如下步骤进行：

S71，将步骤S60中的细胞悬液进行离心，收集单个核细胞；然后将单个核细胞与支架以1x10⁴：1的比例混合置于抗CD3单克隆抗体(50ng/ml)和RetroNectin(10-50μg/ml)预包被的培养瓶中，加入含1％PPP和50μl1000IU/mlIFN-γ的GTT551培养基；

S72，第2天，添加IL-1α、IL-2，以上生长因子在培养基中的终浓度分别为100IU/ml、300IU/ml；

S73，第3天，补充培养基至总体积为100mL，同时添加IL-2，使其在培养基中的终浓度维持在300IU/ml。以后每隔2-3天根据细胞生长情况进行扩增；

S74，第21天收获细胞。

在该步骤S70中，分步骤S71中采用的支架分别用步骤S50制备的通常纤维蛋白凝胶支架(命名为对照组)和本发明步骤S40制备的复合支架(命名为实验组)相互作为对照，同时进行；然后分别在S74的培养结束之后，收获细胞，并进行如下测试：

1、用ELISA试剂盒分析CIK细胞的细胞因子(TNF-α细胞因子和IFN-γ细胞因子)，结果如下：

2、MTT(噻唑蓝，活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为不溶于水，却溶于DMSO的甲簪，死细胞则不能)检测活细胞数量：

分别取21天的全部培养细胞(本发明中支架中填充有微球，需要将微球砸碎分离细胞)，分别分装在EP管中，加入40μL5mg/mLMTT和200μL新鲜的培养基，并轻轻吹打，使微球悬浮于染液中。避光于37℃、5％CO²动物细胞培养箱中孵育4h反应结束后去上清，加入300μLDMSO振荡，10000rpm高速离心5min。吸取200μL上清，转移至96孔板，使用酶标仪在490nm处测吸光值(OD值)。

	OD值
		实验组	0.61±0.13
对照组	0.42±0.22

从上述两项测试的结果中，在本发明实施例的培养要求或者生长条件要求非常苛刻的免疫细胞CIK进行3D环境培养中，最终培养得到的细胞的数量和代谢量都远远要好于常规的支架，本发明的支架具有显著的进步性，当然，本发明还可应用于干细胞的3D环境中培养。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取聚乳酸微球；

对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理，获取氨解聚乳酸微球；

在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原，获取接枝聚乳酸微球；

将所述接枝聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。

2.如权利要求1所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，获取所述聚乳酸微球的步骤中，所述聚乳酸微球的粒径为60～250μm。

3.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，获取所述聚乳酸微球的步骤中，所述聚乳酸微球包括三种粒径依次递增的第一粒径微球、第二粒径微球和第三粒径微球。

4.如权利要求3所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，所述聚乳酸微球中第一粒径微球：第二粒径微球：第三粒径微球为4～6：2～3：1。

5.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理的步骤为，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理。

6.如权利要求5所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，所述己二胺的浓度为12～15％mg/mL；

和/或，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，反应温度为50～60℃；

和/或，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，反应时间为10～15min。

7.如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原的步骤包括：

将所述氨解聚乳酸微球用戊二醛溶液进行醛基化处理；

将醛基化后的所述氨解聚乳酸微球与纤维蛋白原反应。

8.一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架，其特征在于，所述纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架根据权利要求1至7任一项所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法制备。