WO2022220519A1 - 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-n-(테트라하이드로-2h-피란-4-일)-1h-인돌-7-아민의 신규 결정형 - Google Patents

5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-n-(테트라하이드로-2h-피란-4-일)-1h-인돌-7-아민의 신규 결정형 Download PDF

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crystalline form
disease
solvent
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김순하
장혜경
김형진
이세연
전상권
유은경
서무영
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주식회사 미토이뮨테라퓨틱스
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells

Definitions

  • the present invention relates to a compound of formula 1, 5-[(1,1-dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]-2-phenyl- N- (tetrahydro- 2H -pyran-4-yl) It relates to a novel crystalline form of -1H -indole-7-amine.
  • the various crystalline or amorphous forms can exhibit various solid state physical properties, such as hygroscopicity, behavior to compression, stability during storage, and flowability of milled solids. These properties in turn influence their suitability as active pharmaceutical substances for the commercial production of certain solid states. For example, flowability affects the ease of handling a substance during processing into a pharmaceutical product. If the particles of the powdered compound do not flow easily, formulation specialists will have to take that fact into account when developing formulations for tablets or capsules, which may contain lubricating agents such as colloidal silicon dioxide, talc, starch or tribasic calcium phosphate. may require use.
  • lubricating agents such as colloidal silicon dioxide, talc, starch or tribasic calcium phosphate. may require use.
  • dissolution rate is not only taken into account in formulating syrups, elixirs and other liquid medicaments, but may also vary the outcome of treatment.
  • a difference in the dissolution rate of an active ingredient from a patient's gastric juice may affect the time it takes for an orally administered active ingredient to reach the patient's bloodstream, resulting in different treatment outcomes.
  • the compound of Formula 1 5-[(1,1-dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]-2-phenyl- N- (tetrahydro- 2H -pyran-4-yl)-1 H -indole-7-amine is a compound disclosed through International Patent Application Publication No. WO2009-025478, and is a substance known to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on cell necrosis and related diseases.
  • the present inventors have continuously conducted research on the crystalline form of the compound of Formula 1, which is convenient to prepare and has excellent stability in the product development process of the compound of Formula 1. As a result, the present inventors confirmed that among the crystalline forms of the compound of Formula 1, crystalline Form A has the most excellent physicochemical properties when compared to amorphous and other crystalline forms.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing crystalline Form A of the compound of Formula 1 above.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the crystalline form A of the compound of Formula 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides crystalline Form A of the compound of Formula 1, which has excellent physicochemical properties compared to the amorphous form of the compound of Formula 1 and other crystalline forms.
  • 'Crystalline Form A' is a substance named crystalline Form XII in the crystalline form screening process of the compound of Formula 1, and was later renamed as 'Pattern A' or 'Crystalline Form A'.
  • 'Form A', 'pattern A' or 'form XII' are used interchangeably herein.
  • 'Crystalline' and 'pattern' are also used interchangeably. According to powder X-ray diffraction (XRPD) analysis, Form A has a different crystal structure from other crystal forms.
  • the crystalline form A of the compound of Formula 1 is 7.64 ⁇ 0.2, 12.32 ⁇ 0.2, 12.62 ⁇ 0.2, 15.26 ⁇ 0.2, 17.32 ⁇ 0.2, 19.18 ⁇ 0.2, 19.61 ⁇ 0.2, 19.95 ⁇ 0.2, 20.60 4 or more, for example, 4, 5, 6, 7, 8, 9 at 2 [ ⁇ ] values selected from ⁇ 0.2, 21.12 ⁇ 0.2, 22.94 ⁇ 0.2, 24.11 ⁇ 0.2 and 28.15 ⁇ 0.2 , characterized in that it is characterized by an X-ray powder diffraction pattern having 10 or more diffraction peaks.
  • the X-ray powder diffraction pattern has a diffraction peak at a value of 2 [ ⁇ ] selected from 7.64 ⁇ 0.2, 15.26 ⁇ 0.2, 17.32 ⁇ 0.2, 19.18 ⁇ 0.2, 21.12 ⁇ 0.2, and 22.94 ⁇ 0.2 .
  • Form A of the compound of Formula 1 is characterized by being characterized by an X-ray powder diffraction pattern matching the peak positions listed in Table 1 below.
  • Form A of the compound of Formula 1 provided by the present invention is characterized by starting at 272.7°C ( ⁇ 2.5) and having a maximum melting point at 273.4°C ( ⁇ 2.5) as measured by differential scanning calorimetry.
  • the present invention provides a method comprising: stirring a solution containing a compound of Formula 1 and a solvent selected from DMSO, DMF or NMP for 1 to 24 hours under heating; and cooling the solution to 0 to 25° C. over 1 to 72 hours while stirring the solution to grow crystals.
  • the compound of Formula 1 used as a starting material may be in an amorphous form or in an arbitrary crystalline form.
  • the heating may be performed by increasing the temperature to a range of 50 to 120 °C.
  • the cooling may be performed at a rate of 5 to 20 °C / h.
  • Another embodiment of the present invention comprises the steps of: crystallizing by adding an anti-solvent to a solution obtained by dissolving the compound of Formula 1 in a solvent; and cooling the solution to 0 to 25° C. over 6 to 48 hours while stirring the solution to grow crystals.
  • the compound of Formula 1 used as a starting material may be in an amorphous form or in an arbitrary crystalline form.
  • the method for preparing crystalline Form A of the compound of Formula 1 may further include adding crystalline Form A of the compound of Formula 1 as a seed during the addition of the anti-solvent.
  • the solvent may be used without limitation as long as it is a solvent capable of dissolving the compound of Formula 1.
  • the solvent may be, for example, selected from DMSO, DMF, or NMP.
  • the "antisolvent” is a solvent that exhibits low solubility or insoluble in the target compound, and may be used to precipitate the target compound by adding an antisolvent to a solution in which the compound is dissolved. Therefore, in the method for preparing crystalline Form A according to the present invention, the compound can be crystallized by selecting an appropriate anti-solvent and adding it in consideration of the type of solvent in which the compound of Formula 1 is dissolved, the solubility of the compound, etc. The resulting crystal may have an X-ray powder diffraction pattern and an endothermic peak.
  • the anti-solvent may be ethanol or MTBE, but is not limited thereto.
  • the weight of the solvent relative to the weight of the compound of Formula 1 may be twice or more.
  • the maximum amount of the solvent is not limited, but in consideration of the economics of the reaction, the weight ratio of the solvent to the compound of Formula 1 is preferably used in a range of 2 to 10 times.
  • the amount of the anti-solvent used for crystallization is determined according to the amount of the solvent used.
  • the weight of the anti-solvent relative to the weight of the solvent may be 2 times or more.
  • the amount of the anti-solvent used is also not limited in its upper limit, but the weight ratio of the anti-solvent to the solvent is preferably used in a range of 2 to 15 times.
  • a step of filtration or drying thereafter may be additionally performed in order to obtain a product with high purity by removing foreign substances, excess solvent, and the like.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising Form A of the compound of Formula 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the compound of Formula 1 is known to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on cell necrosis and related diseases.
  • the cell necrosis and related diseases are acute/chronic liver diseases (eg hepatitis, liver fibrosis, cirrhosis), neurodegenerative diseases (eg dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease), ischemic heart disease, Reperfusion injury (Korean Patent No.
  • ischemic stroke or ischemic injury pancreatitis, bacterial/viral sepsis, diabetes or diabetic complications, diabetic vascular disease
  • diabetes in particular, are caused by substances that destroy pancreatic cells and , virus, hyperglycemia, fatty acids, diet, toxins, streptozotocin, etc.] necrotizing procolitis, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, degenerative arthritis, nephropathy, bacterial infection, virus Infection (eg HIV), multiple sclerosis, leukemia, lymphoma, neonatal respiratory distress syndrome, asphyxiation, tuberculosis, endometriosis, angioplasty, psoriasis, frostbite, steroid treatment complications, necrosis, tenderness, hemoglobinuria, burns, hyperthermia, Crohn's disease, celiac disease, compartment syndrome, leprosy injury, glomerulonephritis, muscular dystrophy
  • cell necrosis caused by drugs and toxic substances and related diseases include alcoholism, cocaine, drugs (eg paracetamol, antibiotics, anticancer drugs, adriamycin, puromycin, bleomycin) , NSAIDs, cyclosporine, chemical toxins (e.g. carbon tetrachloride, cyanide, methanol, ethylene glycol), toxic gases, pesticides, heavy metals (e.g. lead, mercury, cadmium) exposure and/or administration and/or or necrosis associated with self-administration, damage caused by radiation/UV exposure, and cell necrosis associated therewith.
  • drugs eg paracetamol, antibiotics, anticancer drugs, adriamycin, puromycin, bleomycin
  • NSAIDs e.g. cyclosporine
  • chemical toxins e.g. carbon tetrachloride, cyanide, methanol, ethylene glycol
  • toxic gases e.g. lead, mercury, cadmi
  • the compound of Formula 1 is a cell necrosis and related diseases, additionally acute / chronic kidney disease, traumatic brain injury, neurodegenerative diseases such as Lou Gehrig's disease, necrotizing colitis, viral infection (eg SARS-CoV) , psoriasis and skin diseases including allergic dermatitis, organ preservation/organ transplantation (refer to Korean Patent Nos. 10-1098583, 10-1941004), etc., are expected to exhibit preventive or therapeutic and improvement effects.
  • neurodegenerative diseases such as Lou Gehrig's disease, necrotizing colitis, viral infection (eg SARS-CoV) , psoriasis and skin diseases including allergic dermatitis, organ preservation/organ transplantation (refer to Korean Patent Nos. 10-1098583, 10-1941004), etc.
  • the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 has a function of regulating intracellular calcium, and can improve endoplasmic reticulum (ER) stress and mitochondrial dysfunction caused by abnormal intracellular calcium levels. Accordingly, the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 is expected to exhibit preventive or therapeutic and ameliorating effects on related diseases.
  • Related diseases include:
  • Demyelination diseases including demyelination and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), hypertension including pulmonary arterial hypertension, stroke, prion disease, epilepsy, ataxia, Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium. Oct-Nov 2003;34(4-5):385-97. Mitochondrial disorders: challenges in diagnosis & treatment. See Indian J Med Res. 2015 Jan;141(1):13-26. )
  • IBD inflammatory bowel disease
  • metastasis reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease
  • retinitis pigmentosa retinitis pigmentosa, optic neuropathy, cataracts, glaucoma
  • anemia cholestasis, hypoparathyroidism, pancytopenia, pancreatic disorders, lactic acidosis, lactacidaemia , Hearing loss, short stature, ileus, cardiac conduction defect, cardiomyopathy, endometriosis, infertility
  • Mitochondrial diseases the contribution of organelle stress responses to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol.
  • Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition of calcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of the organelles to the calcium-induced permeability transition. See Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020 May 1;1866(5):165674. )
  • the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 exhibits liver protection and liver function improvement effects, as well as chronic liver diseases such as fatty liver, liver fibrosis and cirrhosis, hepatitis caused by viruses or drugs, etc. It shows the effect of preventing or treating chronic liver disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can also be used for the treatment of liver diseases selected from liver transplantation, alcoholic or non-alcoholic fatty liver (refer to Korean Patent No.
  • composition according to the present invention is effective for treating or preventing fatty liver-derived fatty liver or acute or chronic liver disease derived from fatty liver.
  • the compound of Formula 1 can enhance the differentiation efficiency and maturity of stem cell-derived cardiomyocytes, including the step of culturing the stem cells.
  • the present invention also provides a composition for inducing differentiation from stem cells into cardiomyocytes, comprising the crystalline form A of the compound of formula (1).
  • the compound of Formula 1 can be used for preventing and treating mucositis.
  • the present invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising crystalline Form A of a compound of Formula 1 and a pharmaceutically acceptable carrier for the treatment of the diseases listed above, and comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof. It provides a method for preventing or treating the diseases listed above.
  • treatment means stopping or delaying the progression of a disease when used in an object showing symptoms of onset
  • prevention means stopping the symptom of an onset when used in a subject that does not show symptoms of onset but is at high risk. or delay.
  • the "pharmaceutical composition” may include a pharmaceutically acceptable carrier along with the compound of the present invention, if necessary.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention may be administered in various oral and parenteral formulations during clinical administration, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, diluents such as surfactants, or It is prepared using excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, and these solid preparations include one or more compounds of the present invention with at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, water It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, or syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. can
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerol, gelatin, etc. may be used.
  • the effective dose of the compound of Formula 1 to the human body of the present invention may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status and disease level, and is generally about 0.001-100 mg/kg/day and preferably 0.01-35 mg/kg/day. Based on an adult patient weighing 70 kg, it is generally 0.07-7000 mg/day, preferably 0.7-2500 mg/day, and once a day at regular intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist It may be administered in several divided doses.
  • the crystalline form A of the compound of Formula 1 according to the present invention is not denatured even under harsh conditions for a long period of time compared to an amorphous or other crystalline form, has low hygroscopicity, and is advantageous for formulation because the crystalline form does not change even under pressure or grinding, and the stability of the crystalline form itself is very Excellent for long-term storage.
  • TGA thermogravimetric analysis
  • XRPD X-ray powder diffraction pattern
  • FIG. 25 shows the XRPD results of each recrystallization step of the compound of Formula 1
  • FIG. 26 shows the HPLC analysis results of the recrystallization product of the compound of Formula 1
  • FIG. 27 shows photos of the recrystallization product and before recrystallization of the compound of Formula 1.
  • FIG. 28 is a photograph of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 29 is an XRPD analysis result of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 30 is a method without using a seed crystal
  • the HPLC chromatogram results of Form A produced by FIG. 31 are polarized microscopic images of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 32 is a TGA of Form A produced by a method not using a seed crystal.
  • FIG. 33 shows a particle size distribution diagram of Form A produced by a method not using a seed crystal.
  • FIG. 34 is an XRPD analysis result of Form A produced by the final manufacturing method
  • FIG. 35 is a polarization microscopy (PLM) image of Form A produced by the final manufacturing method
  • FIG. 36 is TGA of Form A produced by the final manufacturing method.
  • Figure 37 shows the particle size distribution diagram (PSD) of the crystalline form A produced by the final manufacturing method.
  • FIG. 40 shows imaging results related to the mitochondrial calcium concentration control effect of the compound of Formula 1 in the condition of additional treatment with tBHP and thapsigargin and CaCl 2 .
  • Figure 41 shows the mitochondrial active oxygen removal effect of the compound of Formula 1 under tBHP treatment conditions.
  • Figure 44 shows the effect of improving the total time when treating the compound of Formula 1 in the MPTP-induced Parkinson's disease mouse model.
  • TA DSC Q2000 and Discovery DSC-2500 approximately 1 mg of sample was placed in a hermetic aluminum pan with pinhole and heated from 25°C to 300°C at a rate of 10°C/min.
  • TGA Q50 or TA Q5000 was used, and approximately 4 mg of sample was placed in an open platinum pan and heated from 30°C to 300°C at a rate of 10°C/min.
  • PSD Particle size Distribution Analyzer
  • Dispersing system using RODOS under a pressure of 0.5 bar was measured with Sympatec HELOS particles size analyzer.
  • a 5 megapixel CCD Nikon LV100POL microscope equipped with a 20x physical lens was used.
  • An SMS DVS Advantage 1 was used to place 10 mg of sample into a mesh stainless steel basket.
  • the entire experimental cycle consisted of two scans (moisture absorption and dehumidification) at constant temperature (25° C. and 10% RH in the range of 40 - 90% (60 - 360 minutes for each humidity level).
  • P9 prepared according to Scheme 1 contains a large amount of impurities and foreign substances. Since the compound of Formula 1 has very low solubility, purification has become a very important process.
  • the purified compound obtained by dissolving in DMSO, filtering, and adding EtOH as an anti-solvent was called the compound of Formula 1 in order to remove foreign substances and color of P9 obtained for research at the beginning.
  • FIG. 1 and Table 2 show the results of X-ray powder rotation pattern (XRPD) analysis of P9 before purification.
  • FIG. 2 shows the results of differential scanning calorimetry (DSC) of P9 before purification, and
  • FIG. 3 shows the results of thermogravimetric analysis (TGA) of P9 before purification.
  • the solid obtained by the secondary purification of the heating/slurrying process with EtOH is named as the compound of Formula 1, and the temperature or concentration during this process, With time, IV, V, VIII, XI, XII or other crystalline forms were additionally identified.
  • the solubility of the compound of Formula 1 was screened to find a suitable solvent for removing foreign substances, decolorizing, and obtaining the compound of Formula 1 with high purity having the most stable crystalline form. Specifically, the solubility and purity of the compound of Formula 1 in various solvents were analyzed using the supernatant at 25°C and 50°C.
  • TRS (total related substance) 100% - purity% (DS dissolved in organic solvent is analyzed by HPLC)
  • the solubility of the compound of Formula 1 was very low in most solvents, and the solvents showing solubility of 40 mg/mL or more were about DMF, NMP and DMSO.
  • DMF, NMP and DMSO have high solubility in impurities, so recrystallization studies using antisolvents were considered suitable for purification studies.
  • an anti-solvent MeOH, EtOH, IPA or EtOAc with a small amount of total related substance (TRS) were preferentially considered.
  • Form IV is powder X having 4 or more diffraction peaks at a value of 2[ ⁇ ] selected from 8.52 ⁇ 0.2, 17.06 ⁇ 0.2, 21.12 ⁇ 0.2, 21.76 ⁇ 0.2, 24.18 ⁇ 0.2, 24.35 ⁇ 0.2 and 28.27 ⁇ 0.2 - Characterized by being characterized by a line diffraction pattern.
  • FIG. 6 shows the XRPD results measured after TGA test (heating to 200° C. and cooling) of Form IV. Looking at the XRPD result of FIG. 6 , another crystalline form was observed while DMF was removed when crystalline Form IV was heated to 200° C. and cooled, and this was named crystalline Form XII (hereinafter, “pattern A” or “crystal form A”).
  • Form V has 4 or more diffraction peaks at 2[ ⁇ ] values selected from 6.82 ⁇ 0.2, 13.84 ⁇ 0.2, 19.08 ⁇ 0.2, 19.66 ⁇ 0.2, 20.51 ⁇ 0.2, 22.84 ⁇ 0.2, 23.78 ⁇ 0.2, 38.69 ⁇ 0.2 It is characterized in that it is characterized by a powder X-ray diffraction pattern having
  • Form V appeared to contain DMSO from 1 H NMR and TGA/DSC data, but it was seen that DMSO was removed by heating to 200 ° C. ). 10 shows XRPD results measured after TGA testing (heating to 200° C. and cooling) of Form V.
  • FIG. 10 shows XRPD results measured after TGA testing (heating to 200° C. and cooling) of Form V.
  • Form VIII is 4 at a value of 2 [ ⁇ ] selected from 6.88 ⁇ 0.2, 13.75 ⁇ 0.2, 16.17 ⁇ 0.2, 17.93 ⁇ 0.2, 20.18 ⁇ 0.2, 22.82 ⁇ 0.2, 25.84 ⁇ 0.2, 26.41 ⁇ 0.2 and 29.68 ⁇ 0.2 It is characterized by being characterized by a powder X-ray diffraction pattern having more than two diffraction peaks.
  • Forms of Form XII are 7.64 ⁇ 0.2, 12.32 ⁇ 0.2, 12.62 ⁇ 0.2, 15.26 ⁇ 0.2, 17.32 ⁇ 0.2, 19.18 ⁇ 0.2, 19.61 ⁇ 0.2, 19.95 ⁇ 0.2, 20.60 ⁇ 0.2, 21.12 ⁇ 0.2, 22.94 ⁇ 0.2, 24.11 It is characterized in that it is specified as an X-ray powder diffraction pattern having four or more diffraction peaks at a value of 2[ ⁇ ] selected from ⁇ 0.2 and 28.15 ⁇ 0.2.
  • Form XI is 4 at a value of 2 [ ⁇ ] selected from 16.89 ⁇ 0.2, 17.30 ⁇ 0.2, 20.37 ⁇ 0.2, 20.95 ⁇ 0.2, 21.18 ⁇ 0.2, 21.34 ⁇ 0.2, 23.16 ⁇ 0.2, 24.04 ⁇ 0.2 and 27.85 ⁇ 0.2 Characterized by a powder X-ray diffraction pattern having more than two diffraction peaks.
  • FIG. 18 shows XRPD results measured after TGA testing of Form XI (heating to 200° C. and cooling).
  • Example 4 Stability test of five crystalline forms
  • Table 10 below shows the stability test results of five crystalline forms.
  • FIG. 19 shows a schematic diagram of a small-scale recrystallization test of the compound of Formula 1 (Test 1 to 3).
  • the compound of Formula 1 in order to determine the initial concentration of the compound of Formula 1 with respect to the DMSO solvent, it was dissolved at a concentration of 100, 150, and 200 mg/mL, and then 7 times EtOH was added at 50° C. over two hours and then at room temperature for 19 hours. stirred.
  • Step-by-step XRPD measurements of the solid generated immediately after EtOH administration (XRPD-1), the solid generated after stirring at room temperature for one day (XRPD-2), and the solid (XRPD-3) dried in vacuum at 50° C. were measured and the yield was obtained.
  • XRPD-1, XRPD-2, and XRPD-3 show step-by-step crystalline forms immediately after addition of anti-solvent, stirring for one day, and drying, respectively.
  • V ⁇ A* an intermediate process from crystalline form V to crystalline form A
  • Example 5-1 the dropwise addition time of 7 times the amount of EtOH compared to DMSO was 24 hours and 35 hours (in test 7, after adding 6.7% EtOH dropwise, 20% crystalline Form A was added as a seed crystal)
  • the XRPD of the crystalline form obtained in each step was analyzed.
  • Antisolvents 5 times and 7 times MTBE were added to 150 mg/mL DMSO solution of the compound of Formula 1 at 50° C. over 3 hours, followed by stirring at room temperature for 18 hours.
  • the solid obtained by filtration was vacuum dried at 50° C. for 18 hours.
  • each XRPD was measured before and after vacuum drying to confirm the change in the drying process. With a yield of 64.73% of the solid obtained from 7-fold MTBE, it showed crystalline V XRPD both before and after drying, and showed the same crystalline V XRPD both before and after drying with a yield of 59.27% even at 5-fold.
  • EtOH which is an anti-solvent for 150 mg/mL NMP solution of the compound of Formula 1
  • EtOH an anti-solvent for 150 mg/mL NMP solution of the compound of Formula 1
  • the solid obtained by filtration was vacuum-dried at 50°C for 2 hours.
  • each XRPD was measured before and after vacuum drying, and changes during the drying process were also confirmed. It was obtained in a yield of 65 - 74%, and the formation of crystalline Form XI was initially observed even in the NMP/EtOH combination.
  • a DMSO/EtOH mixed solvent (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7) were respectively added to the compound of Formula 1, and the mixture was stirred at 50° C. for one day.
  • the crystalline form of the solid obtained using a centrifuge was measured and analyzed by XRPD.
  • Solubility of compound of formula 1 in mixed solvent of DMSO/EtOH at various temperatures DMSO/EtOH temperature Solubility (mg/mL) XRPD 1:4 75°C 31 Pattern A 60°C 19 Pattern A 50°C 15 Pattern A 1:5 75°C 19 Pattern A 60°C 14 Pattern A 50°C 12 Pattern A
  • Example 10 Method for producing crystalline Form A by supersaturation/recrystallization using seed crystals
  • FIG. 25 shows the XRPD results of each recrystallization step of the compound of Formula 1
  • FIG. 26 shows the HPLC analysis results of the recrystallization product of the compound of Formula 1
  • FIG. 27 shows photos of the recrystallization product and before recrystallization of the compound of Formula 1. Referring to FIG. 27 , it can be seen that the impurities colored from off-white to white are removed from the compound of Formula 1 after recrystallization.
  • Example 11 Preparation of crystalline Form A by supersaturation/recrystallization method without seed crystal
  • Table 22 shows a summary of the recrystallization results of the compound (2g) of Formula 1.
  • Table 22 shows a summary of the recrystallization results of the compound (2g) of Formula 1.
  • Table 22 shows a summary of the recrystallization results of the compound (2g) of Formula 1.
  • Table 22 shows a summary of the recrystallization results of the compound (2g) of Formula 1.
  • the yield was about 5% lower than in Example 10, and a laminated type crystalline Form A having a slightly greenish color was obtained.
  • 28 is a photograph of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 29 is an XRPD analysis result of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 30 is a method without using a seed crystal
  • the HPLC chromatogram results of Form A produced by FIG. 31 are polarized microscopic images of Form A produced by a method not using a seed crystal
  • FIG. 32 is a TGA of Form A produced by a method not using a seed crystal.
  • monitoring of temperature control is also very important because, when the temperature is rapidly lowered during the recrystallization process, the formed crystalline form V acts as a nucleus in the crystallization process and an unwanted crystalline form may be formed (FIG. 29-quick cooling).
  • Example 14 Final preparation method of Form A (30 g scale)
  • FIG. 34 is an XRPD analysis result of Form A produced by the final manufacturing method
  • FIG. 35 is a polarization microscopy (PLM) image of Form A produced by the final manufacturing method
  • FIG. 36 is TGA of Form A produced by the final manufacturing method.
  • Figure 37 shows the particle size distribution diagram (PSD) of the crystalline form A produced by the final manufacturing method.
  • the form of Form A contains at least four 2 ⁇ values ( ⁇ 0.2) selected from 7.64, 12.32, 12.62, 15.26, 17.32, 19.18, 19.61, 19.95, 20.60, 21.12, 22.94, 24.11, 28.15 at a temperature of 25 ⁇ 5° C. It is characterized by a powder X-ray diffraction pattern.
  • Example 15 Formulation suitability evaluation of crystalline Form A
  • Example 16 Effect of maintaining homeostasis of cytoplasmic and mitochondrial calcium concentration in cardiomyocytes
  • H9C2 cells were seeded in a 96-hole plate at 1.5 X 10 4 cells/well and cultured for 24 hours.
  • the cytoplasmic calcium concentration was measured using the FLIPR Calcium 6 assay kit (Molecular devices; #R8190). Cells were treated with probenecid and calcium-specific dye according to the manufacturer's test method, and after 1.75 hours, the cells were treated for 0.25 hours so that the final concentration of the compound of Formula 1 was 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001 ⁇ M.
  • the cytoplasmic calcium concentration was measured in real time every 30 seconds after the cells were treated with tBHP so that the final concentration was 150 ⁇ M.
  • the ⁇ F/F (Max-Min) value of the vertical axis is a value obtained by subtracting the minimum value from the maximum value of the fluorescence value of the calcium-specific dye generated after tBHP treatment, and has a larger value as the cytoplasmic calcium concentration increases.
  • the horizontal axis represents the concentration of the compound of Formula 1, and VC is a control treated with only the vehicle, and the calcium concentration of the cells increases the most during tBHP treatment.
  • H9C2 cells were seeded in a 35 mm culture dish at 1.5 X 10 4 cells and cultured for 24 hours. Imaging of calcium concentration in mitochondria was performed using Rhod-2. Rhod-2, MitoTracker Green (200 nM), and Hoechst33342 (2 drops/ml) were treated for 50 minutes, washed twice with KRB buffer, and incubated for another 30 minutes with buffer solution.
  • the final concentration of the compound of Formula 1 was 10 After treating the cells for 0.25 hours so as to become ⁇ M, the cells are treated for 30 minutes so that the final concentration of tBHP is 150 ⁇ M, thapsigargin 1.2 ⁇ M for 10 minutes, and CaCl 2 After treatment with 2 mM, the Fluorescence from calcium was observed through imaging.
  • FIG. 40 shows imaging results related to the effect of inhibiting the increase in mitochondrial calcium of the compound of Formula 1 under the conditions of additional treatment with tBHP and thapsigargin and CaCl 2 .
  • the results of this experiment are expected to show prevention or treatment and improvement effects on related diseases related to the mechanism of improving ER stress and mitochondrial dysfunction through the function of intracellular calcium regulation.
  • Example 17 Effect of removing reactive oxygen species in mitochondria of cardiomyocytes
  • H9C2 cells were aliquoted in a 96-hole plate at 1.5 X 10 4 cells/well and cultured for 24 hours.
  • a fluorescence measurement method using dihydrorhodamine-123 (DHR-123) was used. After the cells were treated with DHR-123 for 0.5 hours, the cells were then treated for 0.25 hours so that the final concentration of the compound of Formula 1 was 0.0001, 0.001, 0.003, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 10, 30 ⁇ M. After tBHP was added to the cells to a final concentration of 400 ⁇ M, intracellular reactive oxygen species were measured through fluorescence intensity every 3 minutes in real time.
  • the horizontal axis represents the concentration of the compound of Formula 1 on a log scale, and the vertical axis represents the total amount of active oxygen in mitochondria generated for 2 hours after tBHP treatment. Although active oxygen in mitochondria was rapidly increased by tBHP, treatment with the compound of Formula 1 showed an effect of inhibiting the generation of active oxygen in a concentration-dependent manner.
  • H9C2 cells were aliquoted at 1.5 X 10 4 cells in a 35 mm confocal microscope-only culture dish and cultured for 24 hours.
  • Intracellular fluorescence imaging using MitoSOX TM Red Mitochondrial Superoxide Indicator was performed to measure superoxide generated in mitochondria among reactive oxygen species.
  • Cells were pretreated for 0.25 hours so that the concentration of the compound of Formula 1 was 1 ⁇ M, and tBHP was added to the cells so that the final concentration was 50 ⁇ M, and the cells were treated for 1 hour.
  • Example 18 Effect of removing nitric oxide produced in macrophages and astrocytes
  • RAW264.7 cells were seeded in a 96-hole plate at 1 X 10 5 cells/well and cultured for 24 hours. Nitrogen peroxide was measured by fluorescence measurement using DAX-J2TM PON Green dye. Cells were treated with DAX-J2TMPON Green dye for 1 hour before treatment, and then cells were treated with the compound of Formula 1 and ascorbic acid, a positive control, to a final concentration of 10 and 30 ⁇ M, respectively, for 5 minutes. Thereafter, SIN-1 was treated to a final concentration of 200 ⁇ M, and the amount of nitric peroxide generated in the cell every 2 minutes in real time was measured through fluorescence intensity.
  • the results of this experiment were confirmed by confirming the nitric oxide removal effect of macrophages and astrocytes involved in inflammation. It is expected to show prevention, treatment and improvement effects on various inflammatory-based diseases such as pneumonia, hepatitis, and mucositis, and aging and aging-related brain diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Limbagrid/Becker muscular dystrophy, and Duchenne muscular atrophy. do.
  • various inflammatory-based diseases such as pneumonia, hepatitis, and mucositis
  • aging and aging-related brain diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Limbagrid/Becker muscular dystrophy, and Duchenne muscular atrophy. do.
  • Example 19 Behavioral ability improvement effect in MPTP-induced Parkinson's disease mouse model
  • MPTP (1-Methy-4-pheny-1,2,3,6-tetrahydropyridine) is a pro-drug of the neurotoxin MPP + (1-methy-4-phenylpyridium).
  • the compound of Formula 1 was administered intraperitoneally once a day at low, medium and high doses for 6 days from 2 days after MPTP administration. A pole test was performed to confirm the effect of improving the behavioral ability of the compound of Formula 1.
  • Figure 44 shows the effect of improving the Total time when treating the compound of Formula 1 in the MPTP-induced Parkinson's disease mouse model
  • Figure 45 shows the T-turn improvement effect when the compound of Formula 1 is treated in the MPTP-induced Parkinson's disease mouse model.
  • Total time and T-turn values of the MPTP administration group were significantly increased compared to the control group. At this time, it was confirmed that the total time and T-turn values were recovered in a concentration-dependent manner in the group to which the compound of Formula 1 was administered.
  • a grip strength test was performed to confirm the action ability improvement effect of the compound of Formula 1 .
  • 46 shows the effect of improving grip strength when treated with the compound of Formula 1 in an MPTP-induced Parkinson's disease mouse model.
  • the grip force value of the MPTP-administered group was significantly reduced compared to the control group. At this time, it was confirmed that the grip force value in the group administered with the compound of Formula 1 was restored in a concentration-dependent manner.
  • Example 20 Dopaminergic neuron protective effect in MPTP-induced Parkinson's disease mouse model
  • Behavioral disorders were induced by administering 20 mg/kg MPTP to C57BL/6 mice a total of 4 times at 2 hour intervals.
  • the compound of Formula 1 was administered intraperitoneally once a day at low, medium and high doses for 6 days from 2 days after MPTP administration.
  • mice were sacrificed, frozen sections of brain tissue were prepared, and TH (Tyrosine hydroxylase) staining was performed.
  • 47 shows the effect of restoring TH levels in the striatum when the compound of Formula 1 is treated in a mouse model of MPTP-induced Parkinson's disease. In the striatum, the TH level of the MPTP-administered group was significantly reduced compared to the control group.
  • the TH level was recovered in a concentration-dependent manner in the group administered with the compound of Formula 1, and significantly increased at the medium and high doses.
  • 48 shows the effect of restoring TH levels in the substantia nigra when the compound of Formula 1 is treated in an MPTP-induced Parkinson's disease mouse model.
  • the TH level of the MPTP-administered group was significantly reduced compared to the control group.
  • the TH level was recovered in a concentration-dependent manner, and there was a significant difference at the high dose.

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Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물의 무정형 및 다른 결정형에 비해 물리화학적으로 우수한 특성을 갖는 화학식 1의 화합물의 결정형 A에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A는 무정형 또는 다른 결정형에 비해 장기간의 가혹 조건에서도 변성되지 않고, 흡습성이 낮으며, 압력이나 분쇄에도 결정형이 변하지 않아 제제화에 유리하고 결정형 자체의 안정성도 매우 우수하여 장기간 보관에 유용하다.

Description

5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민의 신규 결정형
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민의 신규 결정형에 관한 것이다.
[화학식 1의 화합물]
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다양한 결정형 또는 무정형은 흡습성, 압착에 대한 거동, 보관 도중 안정성 및 밀링 된 고체의 유동성과 같은 다양한 고체 상태의 물리적 특성을 나타낼 수 있다. 이러한 성질들은 다시 특정 고체 상태의 상업적 생산을 위한 활성 제약 물질로서의 적합성에 영향을 준다. 예를 들어, 유동성은 물질이 제약 제품으로 가공되는 도중 취급의 용이성에 영향을 준다. 분말화 된 화합물의 입자가 쉽게 유동하지 않을 경우, 제제 전문가는 그 사실을 정제 또는 캡슐의 제제를 개발하는 데 고려해야 할 것이며, 이는 콜로이드성 이산화규소, 탈크, 전분 또는 삼염기성 인산 칼슘과 같은 활제의 사용을 필요로 할 수 있다.
또한 같은 약물의 상이한 결정 형태 또는 무정형은 용해 속도 및 생체 이용률과 같은 제약상 중요한 성질에 있어서 실질적인 차이를 가질 수 있다. 용해 속도는 시럽, 엘릭시르 및 기타 액체 의약을 조제하는 데 고려될 뿐만 아니라, 치료의 결과를 달라지게 할 수도 있다. 예를 들어, 환자의 위액에서 활성 성분의 용출 속도의 차이로 경구 투여된 활성 성분이 환자의 혈류에 도달하는 시간에 영향을 주어 치료의 결과가 달라질 수 있다.
한편, 화학식 1의 화합물, 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-1H-인돌-7-아민은 국제특허공개공보 WO2009-025478를 통해 개시된 화합물로, 세포괴사 및 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타내는 것으로 알려진 물질이다.
본 발명자들은 화학식 1의 화합물의 제품 개발 과정에서, 제조하기 편리하고 우수한 안정성을 갖는 화학식 1의 화합물의 결정형에 대한 연구를 지속적으로 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 화학식 1의 화합물의 결정형 중 결정형 A가 무정형 및 다른 결정형과 대비할 때 물리화학적으로 가장 우수한 특성을 갖는다는 점을 확인하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
국제특허공개공보 WO2009-025478
본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물의 무정형 및 다른 결정형에 비해 물리화학적으로 우수한 특성을 갖는 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 화학식 1의 화합물의 무정형 및 다른 결정형에 비해 물리화학적으로 우수한 특성을 갖는 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 제공한다. '결정형 A'는 화학식 1의 화합물의 결정형 스크리닝 과정에서 결정형 XII으로 명명된 물질이며, 이후 '패턴 A' 또는 '결정형 A'로 재명명되었다. 본 명세서에서 '결정형 A', '패턴 A' 또는 '결정형 XII'는 상호교환적으로 사용된다. '결정형'과 '패턴' 또한 상호교환적으로 사용된다. 분말 X-선 회절(XRPD) 분석에 따르면, 결정형 A는 다른 결정형들과는 상이한 결정 구조를 갖는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 화학식 1의 화합물의 결정형 A는 7.64±0.2, 12.32±0.2, 12.62±0.2, 15.26±0.2, 17.32±0.2, 19.18±0.2, 19.61±0.2, 19.95±0.2, 20.60±0.2, 21.12±0.2, 22.94±0.2, 24.11±0.2 및 28.15±0.2 로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상, 예컨대, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 회절 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
특히, 상기 X선 분말 회절 패턴은 7.64±0.2, 15.26±0.2, 17.32±0.2, 19.18±0.2, 21.12±0.2, 및 22.94±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 회절 피크를 가지는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 화학식 1의 화합물의 결정형 A는 하기 표 1에 열거된 피크 위치들과 피크 위치가 일치되는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
2-Theta(o) Distance(Å) Counts Intensity%
7.635 11.5699 1107 53.0
9.436 9.3652 101 4.8
11.653 7.5877 160 7.7
12.32 7.1787 518 24.8
12.62 7.0083 230 11.0
15.259 5.8018 1395 66.8
16.662 5.3164 79 3.8
17.316 5.1169 2089 100.0
17.631 5.0263 74 3.5
17.889 4.9542 68 3.3
18.816 4.7123 99 4.7
19.182 4.6231 672 32.2
19.613 4.5225 432 20.7
19.953 4.4461 532 25.5
20.596 4.3088 434 20.8
20.856 4.2556 182 8.7
21.121 4.2028 667 31.9
21.675 4.0967 129 6.2
22.753 3.9050 420 20.1
22.943 3.8731 1004 48.1
23.547 3.7751 159 7.6
24.108 3.6884 352 16.9
24.718 3.5988 141 6.7
25.342 3.5116 163 7.8
27.068 3.2915 59 2.8
28.146 3.1678 228 10.9
28.453 3.1344 81 3.9
28.992 3.0773 135 6.5
29.395 3.036 81 3.9
30.11 2.9655 64 3.1
30.721 2.9080 104 5.0
다른 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 화학식 1의 화합물의 결정형 A는 시차주사열량계로 측정 시 272.7℃(±2.5)에서 시작하고 273.4℃(±2.5)에서 최대융점을 갖는 것이 특징이다.
본 발명은 화학식 1의 화합물 및 DMSO, DMF 또는 NMP로부터 선택되는 용매를 포함하는 용액을 가온 하 1 내지 24시간 동안 교반하는 단계; 및 상기 용액을 교반하면서 1 내지 72시간에 걸쳐 0 내지 25℃로 냉각시켜 결정을 성장시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법을 제공한다.
여기에서, 시작물질로 사용되는 화학식 1의 화합물은 무정형 또는 임의의 형태의 결정형이어도 무방하다.
한편, 상기 가온은 50 내지 120℃의 범위까지 온도를 높여 수행할 수 있다.
또한, 상기 냉각은 5 내지 20℃/h의 속도로 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는, 화학식 1의 화합물을 용매 중에 용해시켜 얻은 용액에 반용매를 첨가하여 결정화하는 단계; 및 상기 용액을 교반하면서 6 내지 48시간에 걸쳐 0 내지 25℃까지 냉각시켜 결정을 성장시키는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법을 제공한다.
마찬가지로, 여기서, 시작물질로 사용되는 화학식 1의 화합물은 무정형 또는 임의의 형태의 결정형이어도 무방하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법은 상기 반용매의 첨가 과정에서 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 씨결정(seed)으로서 첨가하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 용매는 화학식 1의 화합물을 용해시킬 수 있는 용매이면 제한없이 사용 가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 용매는 예를 들어, DMSO, DMF 또는 NMP로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 "반용매(antisolvent)"는 표적 화합물에 대해 낮은 용해도를 나타내는 또는 불용성인 용매로서 해당 화합물이 용해된 용액에 반용매를 첨가함으로써 표적 화합물을 석출시키기 위하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 결정형 A의 제조방법에서는 화학식 1의 화합물이 용해되어 있는 용매의 종류, 이에 대한 화합물의 용해도 등을 고려하여 적절한 반용매를 선택하여 첨가함으로써 화합물을 결정화 할 수 있으며, 이때 생성되는 결정은 X-선 분말 회절 패턴 및 흡열 피크를 갖을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 반용매는 에탄올 또는 MTBE을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물의 중량 대비 용매의 중량은 2배 이상일 수 있다. 화학식 1의 화합물을 용해시킬 수 있으면 되므로 용매의 최대 사용량은 제한적이지 않으나, 반응 경제성을 고려할 때 화학식 1의 화합물 대비 용매의 중량비는 2 내지 10 배의 범위로 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 결정화를 위해 사용되는 반용매는 용매의 사용량에 따라 그 사용량이 결정된다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 용매의 중량 대비 반용매의 중량은 2 배 이상일 수 있다. 반용매의 사용량 또한 그 상한은 제한이 없으나, 용매 대비 반용매의 중량비는 2배 내지 15배의 범위로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 화학식 1의 화합물의 결정형 A 제조방법에서, 이물질, 여분의 용매 등을 제거함으로써 고순도로 생성물을 수득하기 위하여 이후 여과 또는 건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물의 결정형 A 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 포함하는 약제학적 조성물과 관련하여, 화학식 1의 화합물의 용도로 밝혀진 사항은 다음과 같다.
WO2009-025478에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 세포괴사 및 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. WO2009-025478에 따르면, 상기 세포괴사 및 관련 질환은 급성/만성 간 질환 (예를 들어 간염, 간섬유화, 간경변), 신경퇴행성 질환 (예를 들어 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병), 허혈성 심장질환, 재관류 손상 (한국 등록특허 10-1325272), 허혈성 뇌졸중 또는 허혈성 손상, 췌장염, 박테리아성/바이러스성 패혈증, 당뇨병 또는 당뇨병성 합병증, 당뇨병성 혈관 질환 [이들 당뇨병은 특히, 췌장세포 파괴 물질들에 기인하며, 바이러스, 고혈당, 지방산, 다이어트, 독소, 스트렙토조토신 (streptozotocin) 등에 의해 매개된다], 괴사성 프로콜리티스 (necrotizing procolitis), 낭포성 섬유증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 신증, 박테리아 감염, 바이러스 감염 (예를 들어 HIV), 다발성 경화증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란증후군, 질식, 결핵, 자궁내막증, 혈관무력증, 건선, 동상, 스테로이드처리 합병증, 회저병, 압통, 혈색소뇨증, 화상, 고열증, 크론씨병, 셀리악병, 구획증후군, 나상맥 손상, 사구체신염, 근이양증, 대사성 유전질환, 마이코플라즈마 질환, 탄저병, 앤더슨병, 선천성 마이토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반경색, 매독, 무균성 괴사 등을 포함한다. 또한 약물 및 독성 물질에 의한 세포괴사 및 관련 질환으로는 알코올 중독 및 코카인, 약물 (예를 들어 파라세타몰 (paracetamol), 항생제, 항암제, 아드리아마이신 (adriamycin), 퓨로마이신 (puromycin), 블레오마이신 (bleomycin), NSAID, 사이클로스포린 (cyclosporine), 화학독소 (예를 들어 사염화탄소, 시아니드, 메탄올, 에틸렌 글리콜), 독가스, 농약, 중금속 (예를 들어 납, 수은, 카드뮴)에의 노출 및/또는 이들의 투여 및/또는 자가투여와 관련된 괴사, 방사능/UV에의 노출에 의한 손상 및 이와 관련된 세포괴사로 구성된 그룹에서 선택된다.
또한 상기 화학식 1의 화합물은 세포괴사 및 관련 질환 중, 추가적으로 급성/만성 신장질환, 외상성뇌손상, 신경퇴행성 질환인 루게릭병, 괴사성 대장염 (necrotizing colitis), 바이러스 감염 (예를 들어 SARS-CoV), 건선 및 알러지성 피부염을 포함하는 피부질환, 장기보존/장기이식(한국 등록특허10-1098583, 10-1941004 참조) 등에서도 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
또한 화학식 1의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 세포 내 칼슘 조절의 기능을 가지고, 비정상적 세포내 칼슘 레벨에 의한 소포체 (Endoplasmic Reticulum, ER) 스트레스 및 미토콘드리아 기능 이상을 개선할 수 있다. 따라서 화학식 1의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 이와 연관된 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 관련 질환은 다음과 같다.
급성폐장애신드롬/급성 폐질환, 폐렴, 결핵, 천식, 폐동맥 고혈압, 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstruction pulmonary disease), 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis) 및 낭포성 폐섬유화증 (cystic fibrosis)을 포함하는 염증성 폐질환 (chronic Inflammatory pulmonary disease)(Mitochondrial dysfunction in fibrotic diseases. Cell Death Discov. 2020 Sep 5;6:80. Mitochondrial dysfunction in lung aging and diseases. Eur Respir Rev. 2020 Oct 15;29(157):200165. 참조, 한국 등록 특허 10-1636563 참조)
탈수초화 (demyelination)와 근위축측삭경화증 (ALS; amyotrophic lateral sclerosis)를 포함하는 탈수초질환, 폐동맥고혈압을 포함하는 고혈압, 뇌졸중, 프라이온 질병 (prion disease), 뇌전증, 운동실조 (ataxia), 편두통, 인지력 감퇴, 발작, 떨림, 정신질환 (예를 들어 우울증) (Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium. Oct-Nov 2003;34(4-5):385-97. Mitochondrial disorders: challenges in diagnosis & treatment. Indian J Med Res. 2015 Jan;141(1):13-26. 참조)
인슐린저항성, 고지혈증, 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 크론병과 궤양성결장염을 포함하는 염증성 장질환 (IBD; inflammatory bowel disease), 각종 암 및 암의 전이 (reticulum stress and oxidative stress in cell fate decision and human disease. Antioxid Redox Signal. 2014 Jul 20;21(3):396-413. 참조)
시각장애 관련 질병 (예를 들어 색소 망막염, 시신경병, 백내장, 녹내장), 빈혈, 담즙울혈 (cholestasis), 부갑상선 기능저하증, 범혈구 감소증, 췌장 장애, 젖산 산증 (lactic acidosis), 젖산혈증 (lactacidaemia), 청력손실, 저신장, 장폐색증, 심장 전도 결함 (cardiac conduction defect), 심장근육병증 (cardiomyopathy), 자궁내막증, 불임, 조기 갱년기(Mitochondrial diseases: the contribution of organelle stress responses to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018 Feb;19(2):77-92. Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Mitochondrial DNA and disease. N Engl J Med. 1995 Sep 7;333(10):638-44. Mitochondrial injury and dysfunction in hypertension-induced cardiac damage. Eur Heart J. 2014 Dec 7; 35(46): 3258-3266. 참조)
림바그리드/베커 근위측증 (GGMD/BMD; limbar gride/Becker muscular dystrophy)와 뒤센 근위축증 (DMD; Duchenne muscular dystrophy)을 포함하는 근위측증 질환(Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition of calcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of the organelles to the calcium-induced permeability transition. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020 May 1;1866(5):165674. 참조)
노화 및 노화관련 질환(Interrelation between ROS and Ca2+ in aging and age-related diseases. Redox Biology. 2020 ; 6:101678. 참조)
WO2009-025478에 따르면, 화학식 1의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 간 보호 및 간 기능 개선 효과를 나타낼 뿐아니라 지방간, 간섬유화 및 간경변 등의 만성 간 질환, 바이러스 또는 약물로 인한 간염 등과 같은 급, 만성 간 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낸다. 또한, 그 결과로서 문맥 고혈압 (portal hypertension) 등의 간 질환 합병증을 예방 또는 치료할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 더욱 특히, 본 발명에 따른 의약 조성물은 또한, 간이식, 알콜성 또는 비알콜성 지방간 (한국 등록특허10-2006247 참조), 간섬유증, 간경변, 바이러스 또는 약물로 인한 간염 중에서 선택된 간 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, 알콜성 급, 만성 간 질환에 효과적이다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 지방산으로부터 유래된 지방간 또는 지방간으로부터 유래된 급, 만성 간질환의 치료 또는 예방에 효과적이다.
한국 등록 특허 10-1852304에 따라 화학식 1의 화합물은 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하여 줄기세포 유래 심근세포의 분화 효율 및 성숙도를 증진시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물을 또한 제공한다.
또한, WO2016-072692에 따르면, 화학식 1의 화합물은 점막염 예방 및 치료 용도로도 사용 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 나열된 질환의 치료를 위한 화학식 1의 화합물의 결정형 A 및 약제학적으로 허용가능한 담체을 포함하는 약제학적 조성물의 용도, 및 상기 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 상기 나열된 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에서, “치료”란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, “예방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “약제학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의 화합물과 함께 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/day이며, 바람직하게는 0.7-2500 mg/day이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A는 무정형이나 다른 결정형에 비해 장기간의 가혹 조건에서도 변성되지 않고, 흡습성이 낮으며, 압력이나 분쇄에도 결정형이 변하지 않아 제제화에 유리하고 결정형 자체의 안정성도 매우 우수하여 장기간 보관에 유용하다.
도 1은 정제 전 P9의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 2는 정제 전 P9의 시차 열분석 (Differential scanning calorimetry, DSC) 결과를 보여준다.
도 3은 정제 전 P9의 열중량 측정(Thermal gravimetric analysis, TGA) 결과를 보여준다.
도 4는 결정형 IV의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 5는 결정형 IV의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 6은 결정형 IV의 TGA 테스트 후 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
도 7은 결정형 IV의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 8은 결정형 V의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 9는 결정형 V의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 10은 결정형 V의 TGA 테스트 후 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
도 11은 결정형 VIII의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 12는 결정형 VIII의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 13은 결정형 VIII의 TGA 테스트 후 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
도 14는 결정형 XII의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 15는 결정형 XII의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 16은 결정형 XI의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 17은 결정형 XI의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
도 18은 결정형 XI의 TGA 테스트 후 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
도 19는 화학식 1의 화합물의 소규모 재결정 테스트 모식도 (Test 1 ~ 3)를 보여준다.
도 20은 결정형 V에서 결정형 A로의 변환 과정 중간에 해당하는 중간형-I의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다(test 4).
도 21은 결정형 V에서 결정형 A로의 변환 과정 중간에 해당하는 중간형-II의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다(test 5).
도 22는 상이한 DMSO/EtOH 비율에서 재결정한 화학식 1의 화합물의 X선 분말 회절 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 23은 50℃의 상이한 DMSO/EtOH 비율(1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7)에서 재결정한 화학식 1의 화합물의 X선 분말 회절 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
도 24는 다양한 온도의 DMSO/EtOH 혼합용매에서 슬러리화한 화학식 1의 화합물의 XRPD 분석 결과를 보여준다.
도 25는 화학식 1의 화합물의 재결정 단계별 XRPD 결과를, 도 26은 화학식 1의 화합물의 재결정 산물의 HPLC 분석결과를, 도 27은 화학식 1의 화합물의 재결정 전 및 재결정 산물의 사진을 나타낸다.
도 28은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 사진을, 도 29는 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 XRPD 분석 결과를, 도 30은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 HPLC 크로마토그램 결과를, 도 31은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 편광 검경 이미지를, 도 32는 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 TGA/DSC 결과를, 도 33은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 입자 크기 분포도를 보여준다.
도 34는 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 XRPD 분석 결과를, 도 35는 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 편광 검경(PLM) 이미지를, 도 36은 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 TGA/DSC 결과를, 도 37은 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 입자 크기 분포도(PSD)를 보여준다.
도 38은 결정형 A에 대한 등온수분 흡습/탈습 분석의 결과를 보여준다.
도 39는 tBHP 처리 조건에서의 화학식 1의 화합물의 칼슘 농도 조절 효과를 보여준다.
도 40은 tBHP 및 thapsigargin 과 CaCl2를 추가로 처리한 조건에서의 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 칼슘 농도 조절 효과와 관련한 이미징 결과를 보여준다.
도 41은tBHP 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 활성산소 제거 효과를 보여준다.
도 42는 tBHP 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 초과산화물 제거 효과와 관련한 이미징 결과를 보여준다.
도 43은 SIN-1 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 세포 내 과산화질소 제거 효과를 보여준다.
도 44는 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 Total time 향상 효과를 보여준다.
도 45는 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 T-turn 향상 효과를 보여준다.
도 46은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 악력 향상 효과를 보여준다.
도 47은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 선조체에서의 TH 수준 회복 효과를 보여준다.
도 48은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 흑색질에서의 TH 수준 회복 효과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
약어
하기의 약어가 본 출원에 사용된다.
Figure PCTKR2022005212-appb-img-000002
사용된 기기, 표준, 방법론
1. 분말 X선 회절 (X-ray Powder diffraction, XRPD)
Bruker D8 Advance powder diffractometer를 사용하여 측정하였다. X선 회절 패턴은 Cu K-alpha X선 (l = 1.54179Å) 방사선(40kV/40mA)을 이용하여 시료를 3o ~ 40o에서 회전하면서 기록하였다.
시료의 회전속도 = 15 RPM
scanning rate = 18.5o/min
2. 시차 열분석 (Differential scanning calorimetry, DSC)
TA DSC Q2000과 Discovery DSC-2500을 사용하여 대략 1mg의 시료를 pinhole이 있는 hermetic aluminum pan에 넣고 25℃에서 300℃까지 10℃/min의 속도로 가열하여 측정하였다.
3. 열중량 측정 (Thermal gravimetric analysis, TGA)
TGA Q50이나 TA Q5000를 사용하였으며 대략 4mg의 시료를 open platinum pan에 넣고 30℃에서 300℃까지 10℃/min의 속도로 가열하여 측정하였다.
4. 입자 크기 분석 (Particle size Distribution Analyzer, PSD)
0.5 bar의 압력 하에서 RODOS를 이용한 dispersing system으로 Sympatec HELOS particles size analyzer로 측정하였다.
5. 편광 검경 (Polarized Light Microscopy, PLM)
20배율 physical lens를 갖춘 5 megapixel CCD Nikon LV100POL microscope를 사용하였다.
6. 등온수분 흡습/탈습 분석 (Water sorption and desorption study, DVS cycle)
SMS DVS Advantage 1 을 사용하여 샘플 10mg을 메쉬 스테인레스 스틸 바스켓 안에 넣었다. 전체 실험 사이클은 일정한 온도(25℃ 및 40 - 90% 범위에서 10% RH 간격으로(각 습도 수준에 대해 60 - 360분) 2회 스캔(흡습 및 탈습)으로 구성된다.
실시예 1: 5-[(1,1-디옥시도-4-티오몰포리닐)메틸]-2-페닐- N -(테트라하이드로-2 H -피란-4-일)-1 H -인돌-7-아민의 제조
[반응식 1]
Figure PCTKR2022005212-appb-img-000003
WO2009-025478에 공지된 화학식 1의 화합물의 제조방법은 상기 반응식 1과 같다.
반응식 1에 따라 제조된 P9은 불순물과 이물질이 다량 포함된 상태이다. 화학식 1의 화합물은 용해도가 매우 낮아 정제가 매우 중요한 과정이 되었다. 초기에 연구용으로 얻은 P9의 이물질과 색을 제거하기 위해 DMSO에 녹여 여과, 반용매로 EtOH을 가하여 얻은 정제된 화합물을 화학식 1의 화합물 이라고 칭하였다.
도 1 및 표 2는 정제 전 P9의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다. 도 2는 정제 전 P9의 시차 열분석 (Differential scanning calorimetry, DSC) 결과를, 도 3은 정제 전 P9의 열중량 측정 (Thermal gravimetric analysis, TGA) 결과를 나타낸 것이다.
P9는 추후 연구결과로 보면 결정형 V인 것으로 확인되었다. 160℃ 이하에서 11.4%의 질량 감소, 271℃의 융점을 보였다.
P9의 특징적인 XRPD 피크의 목록 (결정형 V)
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
6.931 12.74359 22.4 4.7
7.358 12.00503 30.2 6.3
9.203 9.60138 112 23.3
9.630 9.17694 49.5 10.3
11.219 7.88062 134 27.8
12.727 6.94995 29.7 6.2
13.008 6.80032 23.6 4.9
13.927 6.35345 245 51.0
15.776 5.61291 78.2 16.2
16.342 5.41964 67.7 14.1
17.256 5.13477 52.9 11.0
17.587 5.03886 333 69.3
18.319 4.83894 329 68.4
18.893 4.69343 126 26.1
19.334 4.58729 162 33.6
19.797 4.48093 481 100.00
20.624 4.30307 162 33.6
21.956 4.04498 125 25.9
22.388 3.96797 271 56.3
22.955 3.87117 73.2 15.2
23.642 3.76027 61.3 12.7
24.049 3.69749 102 21.1
27.545 3.23567 40.1 8.3
28.046 3.17899 86.8 18.0
29.891 2.98685 75.3 15.6
31.789 2.81269 32.4 6.7
32.209 2.77699 19.6 4.1
33.682 2.65879 17.7 3.7
일차 정제한 물질(P9)의 DMSO 잔존함량과 색, 불순물 등을 낮추거나 제거하기 위해 EtOH로 가온/슬러리화과정의 이차 정제로 얻은 고체를 화학식 1의 화합물로 명명하고 이 과정 중의 온도나 농도, 시간에 따라 IV, V, VIII, XI, XII 혹은 다른 결정형도 추가로 확인되었다.
고순도의 안정한 임상 물질을 GMP 시설에서 대량생산을 하려면 표준화된 최적의 정제와 가장 안정한 결정형 생산조건을 확립하는 것이 매우 중요하다. 이에 연구용으로 제조한 화학식 1의 화합물을 이용하여 정제 연구와 다결정형 연구를 시작하게 되었다.
실시예 2: 정제를 위한 용매 스크리닝
이물질 제거, 탈색과 가장 안정한 결정형을 갖는 고순도의 화학식 1의 화합물을 얻기 위한 적합한 용매를 찾기 위해 화학식 1의 화합물의 용해도를 스크리닝하였다. 구체적으로, 25℃와 50℃에서 상등액을 이용하여 다양한 용매에 대한 화학식 1의 화합물의 용해도 및 순도를 분석하였다.
25℃와 50℃에서 다양한 용매에 대한 화학식 1의 화합물의 용해도
Solvents Solubility (mg/mL) Purity (TRS, %)
25℃ 50℃ 25℃ 50℃
MeOH 0.59 1.15 2.33 3.64
EtOH 1.41 1.08 2.06 2.42
IPA 0.32 0.54 2.21 3.65
1-Butanol 0.65 1.00 5.52 4.89
ACN 3.09 4.04 3.26 4.86
Acetone 5.29 17.50 9.83 2.82
MEK 6.08 8.12 11.78 9.24
MIBK 2.10 2.82 65.92 58.06
EtOAc 1.36 1.86 3.74 2.98
iPrOAc 0.71 0.91 4.49 3.36
MTBE 0.06 0.07 19.33* 11.87*
DMF 206.03 332.99 4.05 1.85
THF 17.40 16.26 4.81 4.62
2-MeTHF 2.78 3.41 8.16 9.74
NMP 160.03 192.42 4.92 4.84
DMSO 43.35 238.15 9.49 6.92
CHCl3 4.70 4.62 3.34 5.14
Toluene 0.02 0.02 41.21* 46.12*
Heptane <LOQ <LOQ <LOQ <LOQ
Water 0.001 0.046 59.06* 0.83
MeOH/H2O=1:1(v/v) 0.03 0.08 23.04* 20.52*
Acetone-H2O (1:2) 0.08 0.16 23.27* 21.68*
Acetic acid-H2O (1:1) 52.77 75.61 10.83 28.75
TRS (total related substance) = 100% - purity% (유기용매에 용해된 DS를 HPLC로 분석)
*HPLC 어세이에서 상대적으로 낮은 농도로 인한 순도 저하
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 화학식 1의 화합물의 용해도는 대부분의 용매에서 매우 낮으며 40mg/mL 이상의 용해도를 보여주는 용매는 DMF, NMP와 DMSO 정도였다. 그러나 DMF, NMP 와 DMSO는 불순물에 대한 용해도도 높아 반용매를 이용한 재결정 연구가 정제 연구로 적합하다고 생각하였다. 반용매로는 총 유연물질(Total related substance, TRS) 양이 적은 MeOH, EtOH, IPA나 EtOAc를 우선적으로 고려하였다.
상기 결과를 기초로 정제와 다결정형 연구를 진행하면서 화학식 1의 화합물이 여러 결정 구조를 갖는다는 것을 알게 되었고 이 과정을 실시예 3에 기술하였다.
실시예 3: 결정형 제조
3-1: 결정형 IV - 슬러리 방법 (DMF 용매화물)
DMF 4mL에 600mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 25℃에서 하루동안 교반하였다. Ultracentrifuge 로 상등액을 제거하고 남은 고체를 진공 건조하여 결정을 수득하였다. 이를 화학식 1의 화합물의 결정형 IV라고 명명하고, XRPD, DSC/TGA 및 1H NMR를 측정하였다.
결정형 IV의 특징적인 XRPD 피크의 목록
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
8.519 10.3703 1173 11.6
9.495 9.3070 111 1.1
10.499 8.4189 307 3.0
13.581 6.5146 177 1.8
15.438 5.7349 295 2.9
16.484 5.3732 265 2.6
17.060 5.1930 10069 100.0
18.013 4.9204 267 2.7
19.016 4.6630 103 1.0
21.118 4.2034 1389 13.8
21.757 4.0814 668 6.6
22.245 3.9929 400 4.0
22.565 3.9370 67 0.7
23.189 3.8325 94 0.9
23.367 3.8038 64 0.6
23.915 3.7178 55 0.5
24.184 3.6771 832 8.3
24.345 3.6530 400 4.0
25.104 3.5444 150 1.5
27.331 3.2605 150 1.5
28.274 3.1538 418 4.2
28.966 3.0800 53 0.5
29.207 3.0551 163 1.6
29.581 3.0173 130 1.3
30.008 2.9754 314 3.1
31.785 2.8130 74 0.7
33.991 2.6353 80 0.8
34.466 2.6000 271 2.7
36.039 2.4901 110 1.1
38.076 2.3614 57 0.6
도 4 및 표 4은 결정형 IV의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
결정형 IV의 형태는 8.52±0.2, 17.06±0.2, 21.12±0.2, 21.76±0.2, 24.18±0.2, 24.35±0.2 및 28.27±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 분말 X-선 회절패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
도 5는 결정형 IV의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
한편, 1H NMR 결과는 다음과 같았다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δppm 1.41 - 1.54 (m, 1 H), 2.06 (br d, J = 11.29 Hz, 2 H), 2.74 (s, 3 H, DMF), 2.89 (s, 7 H), 3.09 (br d, J = 4.77 Hz, 4 H), 3.46 - 3.56 (m, 2 H), 3.59 - 3.71 (m, 3 H), 3.90 - 4.00 (m, 2 H), 5.35 (d, J = 7.78 Hz, 1 H), 6.32 (s, 1 H), 6.76 (s, 2 H), 7.27 - 7.35 (m, 1 H), 7.48 (t, J = 7.65 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 7.28 Hz, 2 H), 7.96 (s, 1 H, DMF), 10.94 (s, 1 H).
XRPD와 DSC/TGA, 1H NMR 측정결과를 종합해 볼 때, 결정형 IV 은 DMF 용매화물(화학식 1의 화합물: DMSO = 1:1) 이다.
한편, 도 6은 결정형 IV의 TGA 테스트 후(200℃까지 가열 후 냉각) 측정한 XRPD 결과를 보여준다. 도 6의 XRPD 결과를 보면 결정형 IV를 200℃까지 가열 후 냉각 시 DMF가 제거되면서 다른 결정형이 관찰되었고 이를 결정형 XII (이후, "패턴 A" 또는 "결정형 A"로 재명명함)로 명명하였다.
3-2: 결정형 IV (DMF 용매화물) - 재결정
DMF 0.4mL에 200mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 50℃로 가열하여 얻어진 현탁액을 50℃에서 필터한 후 얻은 용액을 0.5℃/min의 속도로 0℃까지 냉각한 후 얻은 고체를 진공 건조하여 결정형을 수득하였다. 얻어진 결정형에 대해 TGA 및 DSC 분석을 수행한 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 도 5와 동일한 결정형 IV의 TGA/DSC 오버레이 결과가 관찰되어, 상기 결정형은 결정형 IV(화학식 1의 화합물: DMSO = 1:1)임을 확인하였다.
3-3: 결정형 V (준안정) - 용매/반용매
DMSO 2mL에 600mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 얻은 현탁액을 원심분리기를 이용하여 얻은 상등액(1.5mL)에 DMSO 대비 7배의 EtOH(10.5mL)를 1시간 동안 상온에서 천천히 가하였다(700 RPM으로 교반). 원심분리기를 사용하여 얻은 고체를 진공 건조하여 결정을 수득하였다. 이를 화학식 1의 화합물의 결정형 V라고 명명하고, XRPD, DSC/TGA 및 1H NMR를 측정하였다.
결정형 V의 특징적인 XRPD 피크의 목록
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
2.247 39.28 121 1.3
6.817 12.9562 2284 24.8
9.116 9.6929 478 5.2
9.517 9.2851 278 3.0
11.135 7.9392 109 1.2
12.989 6.81 82 0.9
13.837 6.3944 2089 22.7
16.246 5.4513 128 1.4
17.372 5.1005 899 9.8
18.058 4.9084 154 1.7
18.268 4.8524 902 9.8
18.669 4.749 201 2.2
19.084 4.6468 5081 55.2
19.661 4.5115 5264 57.2
19.953 4.4461 161 1.7
20.512 4.3264 9207 100.0
22.262 3.99 279 3.0
22.84 3.8903 945 10.3
23.903 3.7197 156 1.7
26.112 3.4098 120 1.3
27.452 3.2464 569 6.2
27.849 3.2009 400 4.3
28.778 3.0997 1268 13.8
33.582 2.6665 74 0.8
34.497 2.5977 556 6.0
38.689 2.3254 1161 12.6
도 8 및 표 5는 결정형 V의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
결정형 V의 형태는 6.82±0.2, 13.84±0.2, 19.08±0.2, 19.66±0.2, 20.51±0.2, 22.84±0.2, 23.78±0.2, 38.69±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 분말 X-선 회절패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
도 9는 결정형 V의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
한편, 1H NMR 결과는 다음과 같았다.
1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δppm 1.22 - 1.34 (m, 1 H), 1.56 - 1.72 (m, 4 H), 2.16 (br d, J = 12.88 Hz, 2 H), 2.64 (s, 3 H), 3.05 (br d, J = 9.26 Hz, 8 H), 3.55 - 3.81 (m, 6 H), 4.10 (br d, J = 11.63 Hz, 2 H), 6.49 (s, 1 H), 6.77 (d, J = 1.50 Hz, 1 H), 7.02 (s, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 7.32 - 7.39 (m, 1 H), 7.47 (t, J = 7.63 Hz, 2 H), 7.73 (br d, J = 7.38 Hz, 2 H), 8.68 (br s, 1 H)
결정형 V는 1H NMR과 TGA/DSC 자료를 보아 DMSO가 존재하는 것으로 보였으나 200℃까지 가열하여 DMSO를 제거, 냉각 후에도 결정형 V를 계속 유지하는 것으로 보아 DMSO 용매화물은 아닌 결정형으로 보인다(도 10). 도 10은 결정형 V의 TGA 테스트 후(200℃까지 가열 후 냉각) 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
3-4: 결정형 VIII (DMSO 용매화물) - 슬러리 방법
화학식 1의 화합물 50mg을 1mL의 DMSO에서 상온에서 슬러리 상태로 4주 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 얻은 고체를 진공 건조하여 결정을 수득하였다. 이를 화학식 1의 화합물의 결정형 VIII라고 명명하고, XRPD, DSC/TGA 및 1H NMR를 측정하였다.
결정형 VIII의 특징적인 XRPD 피크의 목록
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
6.879 12.8395 230 11.0
9.106 9.7034 135 6.5
10.153 8.7053 159 7.6
11.064 7.9906 109 5.2
11.769 7.5135 67 3.2
13.752 6.4339 559 26.8
14.056 6.2956 63 3.0
14.730 6.0088 158 7.6
16.171 5.4765 210 10.1
16.871 5.2509 61 2.9
17.321 5.1154 133 6.4
17.930 4.9431 456 21.8
19.180 4.6236 77 3.7
19.470 4.5554 114 5.5
19.814 4.4772 101 4.8
20.181 4.3964 2089 100.0
20.675 4.2925 154 7.4
21.081 4.2109 161 7.7
21.369 4.1547 96 4.6
22.819 3.8939 191 9.1
23.247 3.8232 91 4.4
23.923 3.7166 64 3.1
24.201 3.6745 80 3.8
25.188 3.5327 94 4.5
25.842 3.4448 406 19.4
26.412 3.3717 271 13.0
27.698 3.2180 125 6.0
28.374 3.1429 53 2.5
29.050 3.0712 29 1.4
29.679 3.0075 201 9.6
30.443 2.9338 65 3.1
31.388 2.8476 27 1.3
33.015 2.7109 111 5.3
33.355 2.6841 76 3.6
33.830 2.6475 78 3.7
34.588 2.5911 35 1.7
34.811 2.5750 38 1.8
35.347 2.5372 38 1.8
35.687 2.5138 34 1.6
36.400 2.4662 40 1.9
36.874 2.4356 34 1.6
38.733 2.3228 35 1.7
39.649 2.2713 51 2.4
도 11 및 표 6은 결정형 VIII의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
결정형 VIII의 형태는 6.88±0.2, 13.75±0.2, 16.17±0.2, 17.93±0.2, 20.18±0.2, 22.82±0.2, 25.84±0.2, 26.41±0.2 및 29.68±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 분말 X선 회절패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
도 12는 결정형 VIII의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
한편, 1H NMR 결과는 다음과 같았다.
1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) δppm 1.58 - 1.77 (m, 4 H), 2.16 (br d, J = 11.54 Hz, 2 H), 2.58 - 2.70 (m, 7 H, DMSO peak), 2.93 - 3.14 (m, 8 H), 3.55 - 3.78 (m, 5 H), 4.10 (dt, J=11.80, 3.26 Hz, 2 H), 6.47 (s, 1 H), 6.76 (d, J=2.01 Hz, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 7.31 - 7.38 (m, 1 H), 7.46 (t, J=7.65 Hz, 2 H), 7.70 - 7.82 (m, 2 H), 8.99 (br s, 1 H).
결정형 VIII는 1H NMR과 TGA/DSC 자료를 보아 DMSO 용매화물(화학식 1의 화합물: DMSO = 1:1)로 보이며, TGA/XRPD에서 200℃까지 가열 후 냉각 시 DMSO 용매화물에서 DMSO 제거가 되고 다른 결정형이 관찰되었고, 이는 결정형 XII로 확인되었다 (도 13). 도 13은 결정형 VIII의 TGA 테스트 후(200℃까지 가열 후 냉각) 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
3-5: 결정형 XII - 슬러리 방법
실시예 3-3에서 얻은 결정형 V의 화학식 1의 화합물 100mg에 1mL의 EtOH을 넣고 상온에서 3일 동안 교반하였다. 0.45μm PTFE(Polytetrafluoroethylene) filter를 사용하여 여과한 고체를 50℃에서 건조하여 결정을 수득하였다. 이를 화학식 1의 화합물의 결정형 XII라고 명명하고(이후, "패턴 A" 또는 "결정형 A"로 재명명함), XRPD와 DSC를 측정하였다.
결정형 XII의 특징적인 XRPD 피크의 목록
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
7.633 11.5720 1194 18.7
11.623 7.6072 316 5.0
12.314 7.1820 850 13.3
12.586 7.0274 342 5.4
12.786 6.918 92 1.4
15.242 5.8081 1576 24.7
16.647 5.3209 86 1.3
17.282 5.1268 6381 100
17.608 5.0326 242 3.8
17.89 4.9539 128 2.0
18.794 4.7176 141 2.2
19.162 4.6279 946 14.8
19.59 4.5277 599 9.4
19.933 4.4507 910 14.3
20.586 4.3109 1093 17.1
20.819 4.2633 183 2.9
21.103 4.2065 1001 15.7
21.669 4.0978 222 3.5
21.852 4.064 101 1.6
22.734 3.9082 677 10.6
22.939 3.8737 1001 15.7
23.546 3.7752 308 4.8
24.109 3.6884 794 12.4
24.698 3.6017 535 8.4
25.29 3.5187 246 3.9
25.536 3.4853 121 1.9
26.819 3.3214 109 1.7
27.047 3.294 206 3.2
28.127 3.1699 343 5.4
28.971 3.0794 177 2.8
29.411 3.0343 113 1.8
30.663 2.9133 241 3.8
32.726 2.7342 103 1.6
35.661 2.5156 130 2.0
36.057 2.4888 82 1.3
38.365 2.3443 79 1.2
39.407 2.2847 81 1.3
도 14 및 표 7은 결정형 XII의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
결정형 XII의 형태는 7.64±0.2, 12.32±0.2, 12.62±0.2, 15.26±0.2, 17.32±0.2, 19.18±0.2, 19.61±0.2, 19.95±0.2, 20.60±0.2, 21.12±0.2, 22.94±0.2, 24.11±0.2 및 28.15±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
도 15는 결정형 XII의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
상기 결과로 볼 때 준결정형 V는 슬러리화로 더 안정한 결정형 XII로 변환되는 것을 알 수 있었다.
3-6: 결정형 XI (NMP 용매화물) - 슬러리 방법
NMP 1mL에 500mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 25℃에서 3시간 교반하였다. Ultracentrifuge 로 상등액은 제거하고 남은 고체를 진공 건조하여 결정을 수득하였다. 이를 화학식 1의 화합물의 결정형 XI 로 명명하고, XRPD, DSC/TGA 및 1H NMR을 측정하였다.
결정형 XI의 특징적인 XRPD 피크의 목록
2-Theta(°) Distance(Å) Counts Intensity%
8.419 10.4941 157 7.8
9.617 9.1887 84 4.2
10.071 8.7762 96 4.7
10.482 8.4330 75 3.7
13.216 6.6935 66 3.3
13.701 6.4578 94 4.6
15.417 5.7426 149 7.4
15.620 5.6686 107 5.3
16.605 5.3344 170 8.4
16.889 5.2453 2024 100.0
17.297 5.1225 860 42.5
17.869 4.9598 115 5.7
19.240 4.6093 51 2.5
19.445 4.5611 34 1.7
20.369 4.3564 164 8.1
20.954 4.2359 810 40.0
21.178 4.1918 335 16.6
21.338 4.1606 225 11.1
22.100 4.0189 45 2.2
23.163 3.8368 669 33.1
24.040 3.6988 165 8.2
24.655 3.6080 61 3.0
25.209 3.5298 50 2.5
26.556 3.3537 143 7.1
27.428 3.2491 73 3.6
27.845 3.2014 254 12.5
28.275 3.1537 140 6.9
28.966 3.0799 108 5.3
29.311 3.0445 47 2.3
29.983 2.9778 142 7.0
30.366 2.9411 25 1.2
31.065 2.8765 45 2.2
31.437 2.8433 53 2.6
32.573 2.7467 37 1.8
34.053 2.6306 82 4.1
34.871 2.5707 34 1.7
36.130 2.4840 27 1.3
36.988 2.4283 27 1.3
38.121 2.3587 37 1.8
38.710 2.3242 67 3.3
도 16 및 표 8은 결정형 XI의 X선 분말 회전 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다.
결정형 XI의 형태는 16.89±0.2, 17.30±0.2, 20.37±0.2, 20.95±0.2, 21.18±0.2, 21.34±0.2, 23.16±0.2, 24.04±0.2 및 27.85±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 분말 X-선 회절패턴으로 특정되는 것을 특징으로 한다.
도 17은 결정형 XI의 TGA/DSC 오버레이 결과를 보여준다.
한편, 1H NMR 결과는 다음과 같았다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δppm 1.40 - 1.54 (m, 2 H), 1.84 - 1.96 (m, 2 H), 2.06 (br d, J = 11.54 Hz, 2 H), 2.13 - 2.23 (m, 2 H), 2.70 (s, 3 H, NMP-Me), 2.89 (br s, 4 H), 3.08 (br d, J = 4 .52 Hz, 4 H), 3.46 - 3.56 (m, 2 H), 3.59 - 3.72 (m, 3 H), 3.89 - 3.99 (m, 2 H), 5.35 (d, J = 7.53 Hz, 1 H), 6.32 (s, 1 H), 6.76 (s, 2 H), 7.28 - 7.35 (m, 1 H), 7.48 (t, J = 7.78 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 7.53 Hz, 2 H), 10.94 (s, 1 H).
XRPD, DSC/TGA 및 1H NMR 측정결과를 종합하면, 결정형 XI 은 NMP 용매화물(화학식 1의 화합물: NMP = 1:1) 이였다.
한편, TGA/XRPD 결과 200℃까지 가열 후 재냉각 시 NMP가 제거되면서 역시 결정형 XII로 변환된 것을 확인하였다 (도 18). 도 18은 결정형 XI의 TGA 테스트 후(200℃까지 가열 후 냉각) 측정한 XRPD 결과를 보여준다.
실시예 3의 요약
실시예 3의 5가지 결정형의 비교
결정형 IV 결정형 V 결정형 VIII 결정형 XI 결정형 XII
(결정형 A)
융점 & 엔탈피
(℃/J/g)		 96/270 141/272 144/272 129/266 274
39.11/73.08 46.21/93.32 64.97/88.61 67.05/74.60 120.73
중량 감소율 (TGA, %) 12.95%
(< 120 ℃)		 15.37%
(< 150 ℃)		 15.06%
(< 160 ℃)		 18.34%
(< 150 ℃)		 0.04%
(< 160 ℃)
Summary DMF 용매화물
(1:1) 		무수물, 준안정 DMSO 용매화물
(1:1)		 NMP 용매화물
(1:1)		 무수물,
가장 안정
실시예 4: 5가지 결정형의 안정성 시험
실시예 3에서 얻은 5가지 결정형에 대해 가혹조건(40℃, 상대습도 75%)하에서 8주 동안 안정성 시험을 수행하였다.
하기 표 10은 5가지 결정형의 안정성 시험 결과를 나타낸 것이다.
5가지 결정형의 안정성 시험 결과
초기 결정형 조건 형상 XRPD patterns 순도 어세이
결정형 IV
(DMF solvate)		 Initial Yellow powder Pattern IV 99.87% 100.00%
40℃/75%RH, 1주 Yellow powder Pattern A 99.73% 101.81%
40°C/75%RH, 2주 Yellow powder Pattern A 99.88% 105.36%
40℃/75%RH, 4주 Yellow powder Pattern A 99.87% 99.58%
40℃/75%RH, 8주 Yellow powder Pattern A 99.86% 104.25%
결정형 V
(DMSO metastable)		 Initial Light yellow powder Pattern V 99.37% 100.00%
40℃/75%RH, 1주 Light yellow powder Pattern A 99.60% 103.86%
40℃/75%RH, 2주 Light yellow powder Pattern A 99.21% 103.99%
40℃/75%RH, 4주 Light yellow powder Pattern A 99.16% 98.50%
40℃/75%RH, 8주 Yellow powder Pattern A 99.36% 104.75%
결정형 VIII
(DMSO solvate)		 Initial White powder Pattern VIII 99.94% 100.00%
40℃/75%RH, 1주 White powder Pattern A 99.95% 106.67%
40℃/75%RH, 2주 White powder Pattern A 99.91% 102.74%
40℃/75%RH, 4주 White powder Pattern A 99.83% 105.56%
40℃/75%RH, 8주 White powder Pattern A 100.00% 107.08%
결정형 XI
(NMP solvate)
 Initial Off white powder Pattern XI 99.55% 100.00%
40℃/75%RH, 1주 Off white powder Pattern A+XI 99.70% 95.79%
40℃/75%RH, 2주 Off white powder Pattern A+XI 99.36% 105.59%
40℃/75%RH, 4주 Off white powder Pattern A 99.56% 103.58%
40℃/75%RH, 8주 Off white powder Pattern A 99.58% 104.04%
결정형 XII
(결정형 A)
 Initial Off white powder Pattern A 98.85% 100.00%
40℃/75%RH, 1주 Off white powder Pattern A 99.19% 100.17%
40℃/75%RH, 2주 Off white powder Pattern A 98.69% 102.12%
40℃/75%RH, 8주 Off white powder Pattern A 99.88% 102.17%
표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 5가지 결정형 모두 가혹조건에서 순도 변화는 거의 없었다. 결정형 IV와 VIII, XI은 1H NMR spectroscopy와 DSC/TGA 측정결과로 각각 DMF, DMSO와 NMP용매화물로 확인이 되었고, 가혹조건(40℃, 상대습도 75%) 하에서 8주 동안 추적 관찰한 결과 결정형 XII로 변환되며, 결정형 V는 용매화물은 아니지만 준안정한 형태로 역시 결정형 XII로 변환되는 것을 알게 되었다. 이에 결정형 XII이 가장 안정한 결정형 구조라고 판단되어 결정형 XII을 결정형 A 또는 패턴 A라고 명명하였다(결정형 XII = 결정형 A 또는 패턴 A).
실시예 5: 최적화 과정 Ⅰ
5-1. 화학식 1의 화합물의 초기농도 결정
도 19는 화학식 1의 화합물의 소규모 재결정 테스트 모식도(Test 1 ~ 3)를 보여준다. 도 19에 따라, DMSO용매에 대한 화학식 1의 화합물의 초기 농도를 결정하기 위해 100, 150, 200mg/mL의 농도로 녹인 후 50℃에서 7배의 EtOH를 두 시간에 걸쳐 가한 후 상온에서 19시간 교반하였다. EtOH 투여 직후 생성된 고체 (XRPD-1), 상온에서 하루 교반 후 생성된 고체 (XRPD-2), 그리고 50℃에서 진공건조한 고체 (XRPD-3)의 단계별 XRPD를 측정하고 수율을 구하였다.
화학식 1의 화합물의 소규모 재결정 테스트 (Test 1~3) 결과
Test No. Conc.(mg/mL) Method DMSO/EtOH XRPD-1-wet XRPD-2-wet XRPD-3-dry Yield (%) Purity (%)
1 200 Anti-solvent 1V:7V V A A 87.53 100.00
2 150 1V:7V V A A 83.39 100.00
3 100 1V:7V A A A 76.55 100.00
표 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 150과 200 mg/mL 농도에서 초기 결정형 V가 생성되는 것을 알 수 있었으며 시간이 경과됨에 따라 결정형 A 로 변환되는 것도 관찰되었다. 해당 시험 결과를 바탕으로 수율이 가장 높은 200mg/mL으로 결정화 초기 농도로 선정하였다.
5-2. DMSO/EtOH 반용매 비율 결정
화학식 1의 화합물 200mg/mL DMSO 용액에 대한 반용매인 EtOH의 비율을 결정하기 위해 50℃에서 각각의 5배와 7배의 EtOH를 두 시간에 걸쳐 가한 후 상온에서 16시간 교반하였다. 여과하여 얻어진 고체를 50℃에서 진공상태로 건조하였다. 건조 전 후 각각의 시료에 대하여 XRPD를 측정하여 건조과정 중 변화도 같이 확인하고 수율을 구하였다(표 12). 7배수의 EtOH에서 얻은 고체는 84.15%의 수율로 건조 전에는 결정형 V, 건조 후에는 결정형 V에서 결정형 A로의 변환 과정 중간에 해당하는 특징적인 피크가 나타나는 XRPD spectrum (test 4, 중간형-I)을 보여주었다 (도 20). 이와는 달리 5배수에서 얻은 고체는 76.55%의 수율로 건조 전에는 결정형 V, 건조 후에는 결정형 V에서 결정형 A로의 변환 과정 패턴과는 다른 새로운 특징적인 중간 결정형 (test 5, 중간형-II)을 보여주었다 (도 21). 이러한 결과를 바탕으로 DMSO:EtOH = 1:7이 1:5 보다는 결정형 A에 더 좋은 수율과 재결정 조건인 것으로 고려되었다.
화학식 1의 화합물의 소규모 재결정 테스트 결과 (Test 4 ~ 5)
Test No. Conc.
(mg/mL)		 Method DMSO/EtOH XRPD-1-wet XRPD-2-wet XRPD-3-dry Yield (%) Purity (%)
4 200 반용매 1V:7V V V V→A*
(중간형 I)		 84.15 100.00
5 200 반용매 1V:5V V V not A,
not V
(중간형 II)		 76.55 100.00
노트: XRPD-1, XRPD-2 과 XRPD-3 는 각각 반용매를 가한 직후, 하루 교반한 후, 건조 후의 단계별 결정형을 나타냄
V→A*: 결정형 V 에서 결정형 A로 변환하는 중간 과정
도 20 및 표 13은 중간형-I의 XRPD 분석결과를 나타낸다.
중간형-I의 특징적인 XRPD 피크의 목록 (중간형-I)
2-Theta(o) Distance(Å) Counts Intensity%
7.611 11.6057 1072 100
15.223 5.8152 1005 93.8
17.246 5.1375 302 28.2
22.919 3.8771 497 46.4
24.084 3.6921 105 9.8
24.656 3.6078 58 5.4
도 21 및 표 14는 중간형-II의 XRPD 분석결과를 나타낸다.
중간형-II의 특징적인 XRPD 피크의 목록 (중간형-II)
2-Theta(o) Distance(Å) Counts Intensity%
6.489 13.6102 1137 100
16.219 5.4604 66 5.8
18.605 4.7652 559 49.2
19.465 4.5566 405 35.6
21.509 4.1279 132 11.6
24.781 3.5898 101 8.9
26.045 3.4184 186 16.4
30.78 2.9024 61 5.4
위에서 얻은 중간형-I 100mg에 1mL의 EtOH에 넣고 상온에서 3일 동안 교반하였다. 0.45μm PTFE 필터를 사용하여 생성된 고체를 50℃, 진공에서 건조하였다. 건조 완료된 시료의 XRPD 분석 결과 결정형 A로 확인하였다(표 15). 이 결과로 볼 때 결정형 V는 준안정 결정형이며 충분한 시간과 조건이 되면 더 안정한 결정형 A로 변환되는 것을 알 수 있었다.
중간형-I 의 추가 슬러리화 결과
No. Conc.(mg/mL) Method Solvent Initial XRPD Final XRPD Yield (%) Purity (%)
Test 4 100 Slurry EtOH V → A
(중간형-I)		 A 80.00 100.00
또한 DMSO/EtOH 혼합용매를 사용한 경우 결정화과정에서 조건에 따라 중간에 변환중인 다른 패턴의 결정형도 나올 수 있어서 처음 재결정이 시작되는 시점부터 가장 안정한 결정형이 생성되는 생산공정의 확립이 필요해졌다.
5-3. DMSO 용액에 반용매(EtOH) 적가시간 최적화
실시예 5-2에서 사용한 결정화 방법을 이용하여 DMSO 대비 7배의 EtOH의 적가시간을 24시간과 35시간 (test 7에서 6.7% EtOH을 적가한 후 20%의 결정형 A를 씨결정으로 추가)으로 더 천천히 가하였을 때 각각 단계에서 얻어진 결정형의 XRPD를 분석하였다. 실시예 5-1 (적가시간 19시간)의 결과를 포함하여 종합적으로 보면 적가시간 변화와 씨결정 사용으로는 초기 결정형 V의 생성을 회피하기 어려웠지만 건조 완료 후에는 다른 결정형이 없는 순수한 결정형 A를 얻을 수 있다는 사실을 밝혀냈다.
반용매 적가시간 변화에 따른 화학식 1의 화합물재결정 결과 (Test 6 ~ 7)
No. Solvent Anti-solvent Conc. (mg/mL) Ratio Adding time Slurry time XRPD-1-wet XRPD-2-wet XRPD-3-dry Purity (%) Yield (%)
Test 6 DMSO EtOH 200 1:7 24h 13h V A A 100.00 72.28
Test 7 200 1:7 35h 21h V* A A 99.97 86.36
*씨결정 추가
실시예 6: DMSO/MTBE 용매에서 화학식 1의 화합물의 재결정
50℃의 화학식 1의 화합물 150mg/mL DMSO 용액에 반용매인 5배와 7배의 MTBE를 3시간에 걸쳐 가한 후 상온에서 18 시간 교반하였다. 여과하여 얻어진 고체를 50℃에서 18시간 진공건조하였다. 여기서 각각의 XRPD를 진공건조 전과 건조 후 측정하여 건조과정의 변화도 같이 확인하였다. 7배수의 MTBE에서 얻은 고체 64.73%의 수율로 건조 전후 모두 결정형 V XRPD를 보여주었고 5배수에서도 59.27%의 수율로 건조 전후 모두 같은 결정형 V를 보여주었다.
DMSO/MTBE 용매에서 화학식 1의 화합물의 재결정 결과 (Test 8 ~ 9)
No. Conc.(mg/mL) Method DMSO/MTBE XRPD-3 Yield (%) Purity (%)
Test 8 150 반용매 1V:7V V 64.73 100.00
Test 9 150 반용매 1V:5V V 59.27 100.00
실시예 7: NMP/EtOH 용매에서 화학식 1의 화합물의 재결정
25℃에서 화학식 1의 화합물 150mg/mL NMP 용액에 대한 반용매인 7배의 EtOH를 24-35 시간에 걸쳐 가한 후 상온에서 22-33시간 교반하였다. 여과하여 얻어진 고체를 50℃에서 2시간 진공건조하였다. 여기서 각각의 XRPD를 진공건조 전과 후 측정하여 건조과정 중의 변화도 같이 확인하였다. 65 - 74%의 수율로 얻어졌으며 NMP/EtOH 조합에서도 초기에 결정형 XI의 생성이 관찰되었다.
NMP/EtOH 용매에서 화학식 1의 화합물 재결정결과 (Test 10 ~ 11)
No. Solvent Anti-solvent Conc. (mg/mL) Ratio Adding time Slurry time XRPD-1-wet XRPD-2-wet XRPD-3-dry Purity (%) Yield (%)
Test 10 NMP EtOH 150 1:7 24h 22h XI(NMP solvate) A A 100.00 74.37
Test 11 150 1:7 35h 33h N/A XI (NMP solvate) A 100.00 65.33
실시예 5 내지 7의 결과 분석
실시예 5, 6, 7의 결과를 볼 때 가능한 여러가지 혼합용매조건에서 색이 있는 결정형이 나오거나 안정성이 확보되지 않는 각각의 중간형 결정형도 있다는 것을 확인하였다. 형상, 수율과 잔존용매 독성 등을 고려해 볼 때 DMSO/EtOH의 조합이 가장 좋은 후보로 보여 다음 최적화를 진행하였다.
화학식 1의 화합물 재결정에 사용한 혼합용매 결과 요약
용매 조건 DMSO/EtOH NMP/EtOH DMSO/MTBE
발생 가능
결정형*		 V 또는 VIII
(DMSO 준결정 또는 용매화물)		 XI
(NMP 용매화물)		 V
(DMSO 준결정)
형상 흰색 분말 파란색 분말 흰색 분말
수율 % 72~85% 65~74% 59~65%
잔류용매 ICH class Class III (저독성) Class II Class III (저독성)
실시예 8: DMSO/EtOH 용매 비율 최적화
8-1: DMSO/EtOH 반용매 비율 최적화 실험
DMSO 1mL에 200mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 60℃로 열을 가한 후 0.45μm PTFE membrane을 사용하여 여과한 후 얻은 용액을 50℃에서 35시간 동안 DMSO 대비 10배수의 EtOH(10mL)을 천천히 가하였다. EtOH이 DMSO 대비 1.5배, 2배, 3배, 5배, 7배, 10배 들어간 시점에서 얻은 초기 고체의 결정형을 측정, 분석하였다. 도 22는 상이한 DMSO/EtOH 비율에서 재결정한 화학식 1의 화합물의 X선 분말 회절 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다. 도 22에서 볼 수 있는 바와 같이, 1:3 이하인 경우에는 용매화물인 결정형 VIII이 생성되며, DMSO/EtOH = 1:5 이상인 경우에 결정형 A가 생성되는 것을 확인하였다. 더 정확한 비율을 찾기 위해 다음 단계에서 슬러리화 최적조건을 진행하였다.
8-2: 50℃ DMSO/EtOH 혼합용매 비율 최적화 실험
다섯 개의 용기에 DMSO/EtOH 혼합용매 (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7)를 각각 1mL와 200mg의 화학식 1의 화합물을 넣고 50℃에서 하루동안 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 얻은 고체의 결정형을 XRPD로 측정하여 분석하였다. 도 23은 50℃의 상이한 DMSO/EtOH 비율(1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:7)에서 슬러리화한 화학식 1의 화합물의 X선 분말 회절 패턴(XRPD) 분석 결과를 보여준다. 도 23에 볼 수 있는 바와 같이, 결정형 A가 50℃에서 DMSO/EtOH 의 비율이 1:4, 1:5 와 1:7 인 경우에 안정하게 생성되어 최적비율을 DMSO:EtOH = 1:4 로 결정하였다.
실시예 9: DMSO/EtOH 혼합용매에서의 온도 별 평형용해도와 과포화
200mg의 화학식 1의 화합물을 두 가지 DMSO/EtOH (1:4, 1:5) 혼합 용액 1mL에 각각 넣고 200mg/mL의 혼탁액을 만든 후 50℃, 60℃, 75℃ 로 각각 가온, 유지하면서 6시간 교반하였다. 6시간 후의 혼탁액에서 상등액은 HPLC로 분석하여 평형용해도를 구하고 동시에 고체들의 XRPD 분석 결과를 표 20 및 도 24에 나타내었다. 도 24는 다양한 온도의 DMSO/EtOH 혼합용매에서 슬러리화한 화학식 1의 화합물의 XRPD 분석 결과를 보여준다. 여러 온도(50℃, 60℃, 75℃)와 혼합용매(1:4, 1:5) 모든 조건에서 존재하는 고체는 결정형 A를 갖는 것을 확인하였다. DMSO/EtOH 1:4 혼합 용액에서의 용해도는 75℃에서 31mg/mL로 처음부터 DMSO/EtOH 1:4 혼합 용매를 이용한 재결정방법은 적당하지 않아 과포화방법을 고려해 보기로 하였다.
다양한 온도의 DMSO/EtOH 혼합용매에 대한 화학식 1의 화합물의 용해도
DMSO/EtOH 온도 용해도 (mg/mL) XRPD
1:4 75℃ 31 Pattern A
60℃ 19 Pattern A
50℃ 15 Pattern A
1:5 75℃ 19 Pattern A
60℃ 14 Pattern A
50℃ 12 Pattern A
노트: 과포화도= (40mg/mL)/(31mg/mL) = 1.3
200mg의 화학식 1의 화합물을 DMSO 1mL에 녹인 후 75℃로 가열한 후 4배의 EtOH을 가해서 투명한 과포화 용액상태로 존재하였으며 이때 농도는 40mg/mL이며 과포화도는 혼합용매 대비 1.3배(40/31)이다. 실시예 5-1 결과에 기반하여 200mg 화학식 1의 화합물/1mL DMSO를 목표로 하면 적어도 40mg/mL의 용해도가 되어야 높은 수율을 유지할 수 있을 것으로 보여 과포화방법으로 진행하기로 하였다.
실시예 10: 씨결정을 사용하는 과포화/재결정 방법에 의한 결정형 A의 제조방법
15mL의 DMSO에 3g의 화학식 1의 화합물을 75℃에서 녹인 후 0.45μm PTFE membrane filter로 이물을 제거했다. 75℃로 유지하면서 60mL의 EtOH을 가하고(이 상태에서 clear solution 유지가 되는 것이 확인됨), 2%의 씨결정 (결정형 A)을 넣고 suspension 이 관찰되기 시작하였다. 75℃를 계속 유지하면서 추가로 45mL의 EtOH을 15시간 동안 천천히 가하였다. 모든 결정화 과정은 250 RPM 교반 하에 진행하였다. EtOH를 모두 가한 후 10℃/h의 속도로 5℃까지 냉각하여 생성된 고체를 0.45μm PTFE membrane filter를 사용하여 얻은 후 50℃에서 21시간 진공 건조하였다. 표 21에 나타낸 바와 같이, 씨결정을 사용한 화학식 1의 화합물의 재결정화 결과 수율 74.58%, 순도 99.95%로 나타났다.
화학식 1의 화합물(3g) 재결정 결과 (실시예 10, Seed 사용)
Method 형상 Initial XRPD Intermediate products* Final XRPD Yield (%) Purity (%)
실시예 10 흰색 분말 결정형 A 결정형 A 결정형 A 74.58 99.95
노트: EtOH를 가할 때 다량의 침전 발생
도 25는 화학식 1의 화합물의 재결정 단계별 XRPD 결과를, 도 26은 화학식 1의 화합물의 재결정 산물의 HPLC 분석결과를, 도 27은 화학식 1의 화합물의 재결정 전 및 재결정 산물의 사진을 나타낸다. 도 27을 보면 재결정 후 화학식 1의 화합물은 off-white에서 white 로 색을 띤 불순물이 제거되었음을 알 수 있었다.
실시예 11: 씨결정을 사용하지 않는 과포화/재결정 방법에 의한 결정형 A의 제조방법
10mL의 DMSO에 2g의 화학식 1의 화합물을 60℃에서 녹인 후 0.45μm PTFE membrane filter로 이물을 제거했다. 60℃로 유지하면서 40mL의 EtOH을 가하고 30분 더 교반하였다(현탁액으로 변함). [여기서 일부분의 현탁액을 바로 상온에서 냉각시켜 얻은 고체의 XRPD를 측정하여 본 결과 결정형 V인 것을 확인하였다 - 도 29 (급냉각) solid separated out at room temperature] 다시 온도를 75℃로 12분 동안 천천히 올려서 10분 동안 유지하였다(계속 현탁액). 50℃까지 1.5시간 동안 천천히 온도를 내리면서 중간에 60℃에서 생성된 고체의 XRPD-1를 측정하였다. 50℃의 온도를 유지하면서 30mL의 EtOH을 15시간동안 천천히 가하였다. 모든 결정화 과정은 250 RPM으로 교반 하에 진행하였다. 10℃/hr의 속도로 5℃까지 냉각하여 생성된 고체를 0.45μm PTFE membrane filter로 분리하여 XRPD-2를 측정하였고 50℃에서 진공 하에서 17시간 건조한 후 XRPD-3를 측정하였다(수율 70.35%, 순도 99.95%). 도 29에 나타난 결과로 보면 각 단계별 XRPD는 모두 결정형 A이다.
화학식 1의 화합물(2g) 재결정 결과 요약(실시예 11, No Seed)
Method Appearance Initial XRPD Intermediate products* Final XRPD Particle size Yield (%) Purity (%) DSC TGA PLM
실시예 11 Slightly green powder Pattern A Pattern A Pattern A D10: 9.99m
D50: 55.38m D90: 158.06m		 69.84 99.96 272℃;
107 J/g		 0.33%
<105℃		 laminated structure
표 22는 화학식 1의 화합물(2g) 재결정 결과를 요약하여 나타낸 것이다. 각각의 단계에서 결정형의 XRPD를 분석한 결과 씨결정을 사용하지 않은 경우 실시예 10 대비 5% 정도 낮은 수율을 나타내었고, 약간 녹색빛을 띠는 laminated type의 결정형 A를 얻었다. 도 28은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 사진을, 도 29는 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 XRPD 분석 결과를, 도 30은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 HPLC 크로마토그램 결과를, 도 31은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 편광 검경 이미지를, 도 32는 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 TGA/DSC 결과를, 도 33은 씨결정을 사용하지 않은 방법으로 생성된 결정형 A의 입자 크기 분포도를 보여준다.
또한 재결정 과정 중에 온도가 급격하게 하강하는 경우 형성된 결정형 V 이 결정화 과정에서 핵으로 작용하여 원하지 않는 결정형이 형성될 수 있으므로 온도 조절에 대한 모니터링도 매우 중요하다는 것을 확인하였다 (도 29-급냉각).
실시예 10과 11을 비교해 본 결과 seed 를 사용할 경우 더 높은 수율을 나타내어 반용매로 사용되는 EtOH 의 총 용매량을 조절해 보기로 하였다.
실시예 12: 실시예 10의 반용매 사용량 조절 (총 DMSO: EtOH = 1:5)
5mL의 DMSO에 1g의 화학식 1의 화합물을 60℃에서 녹인 후 0.45μm PTFE membrane filter로 이물을 제거했다. 75℃로 온도를 올리고 30분간 유지한 후 20mL의 EtOH을 가하고, 2%의 씨결정 (결정형 A)을 넣고 suspension 이 관찰되기 시작하였다. 1.5 시간 동안 50℃로 온도를 천천히 내리고 계속 유지하면서 추가로 5mL의 EtOH을 5시간 동안 천천히 가하고 같은 온도에서 5시간 더 교반하였다. 모든 결정화 과정은 300 RPM 교반 하에 진행하였다. 10℃/hr의 속도로 5℃까지 냉각하고 추가로 같은 온도에서 5시간 더 교반하였다. 생성된 고체를 0.45μm PTFE membrane filter를 사용하여 얻은 후 50℃에서 20시간 진공 건조하여 결정형 A를 수율 72.12% 로 얻었다.
실시예 13: 실시예 10의 반용매 사용량 조절 (총 DMSO: EtOH = 1:6)
5mL의 DMSO에 1g의 화학식 1의 화합물을 60℃에서 녹인 후 0.45μm PTFE membrane filter로 이물을 제거했다. 75℃로 온도를 올리고 30분간 유지한 후 20mL의 EtOH을 가하고, 2%의 씨결정 (결정형 A)을 넣고 suspension 이 관찰되기 시작하였다. 1.5 시간 동안 50℃로 온도를 천천히 내리고 계속 유지하면서 추가로 10mL의 EtOH을 5시간 동안 천천히 가하고 같은 온도에서 5시간 더 교반하였다. 모든 결정화 과정은 300 RPM 교반 하에 진행하였다. 10℃/hr의 속도로 5℃까지 냉각하고 추가로 같은 온도에서 5시간 더 교반하였다. 생성된 고체를 0.45μm PTFE membrane filter를 사용하여 얻은 후 50℃에서 20시간 진공 건조하여 결정형 A를 수율 73.28% 로 얻었다.
실시예 10과 12, 13의 결과를 종합해보면 총 DMSO:EtOH = 1:7 을 사용한 실시예 10이 가장 좋은 것으로 보이며 재현성을 확인하고자 최종 공정은 씨결정을 사용하는 실시예 10의 방법으로 30g의 화학식 1의 화합물을 사용하여 진행하였다.
실시예 14: 결정형 A의 최종 제조방법 (30g scale)
150mL의 DMSO에 30g의 화학식 1의 화합물을 75℃에서 녹인 후 0.45μm PTFE membrane filter로 이물을 제거했다. 75℃로 유지하면서 600mL의 EtOH을 가하고 (이 상태에서 용액 유지가 되는 것이 확인됨), 2%의 씨결정(결정형 A)을 넣고 suspension이 관찰되기 시작하였다. 75℃로 계속 유지하면서 추가로 450mL의 EtOH을 15시간 천천히 가하였다. 모든 결정화 과정은 250 RPM 교반 하에 진행하였다. EtOH를 모두 가한 후 10℃/h의 속도로 5℃까지 냉각하여 생성된 고체를 0.45μm PTFE membrane filter를 사용하여 얻은 후 50℃에서 15시간 진공 건조하였다. 표 22에 나타낸 바와 같이, 씨결정을 사용한 화학식 1의 화합물의 재결정화 결과 수율 70.35%, 순도 99.96%로 얻었다.
여기서 얻은 결정형 A로 XRPD, TSA/DSC, PLM, HPLC, PSM와 잔류용매 등 여러가지 분석을 하여 그 결과를 표 23 내지 표 24 및 도 34 내지 38에 나타내었다. 도 34는 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 XRPD 분석 결과를, 도 35는 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 편광 검경(PLM) 이미지를, 도 36는 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 TGA/DSC 결과를, 도 37은 최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 입자 크기 분포도(PSD)를 보여준다.
최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 characterization
Method 실시예 14: 최종 제조방법 (30g scale)
Appearance White powder with slightly green
Initial XRPD Pattern A
Intermediate products* Pattern A
Final XRPD Pattern A
Particle size D10: 11.99μm
D50: 92.34μm
D90: 171.38μm
Yield (%) 70.35
Residual solvent content 0.07%(EtOH), 0.36%(DMSO)
Purity (%) 99.96
DSC 273℃; 114 J/g
TGA 0.15%, <105℃
PLM Tabular-shape
노트: EtOH 첨가 시 대량의 고체 발생
결정형 A의 형태는 25±5℃의 온도에서 7.64, 12.32, 12.62, 15.26, 17.32, 19.18, 19.61, 19.95, 20.60, 21.12, 22.94, 24.11, 28.15에서 선택된 4개 이상의 2θ 값 (±0.2)을 포함하는 분말 X-선 회절패턴을 특징으로 한다.
최종 제조방법으로 생성된 결정형 A의 특징적인 XPRD 피크의 목록 (Pattern A)
2-Theta(o) Distance(Å) Counts Intensity%
7.635 11.5699 1107 53.0
9.436 9.3652 101 4.8
11.653 7.5877 160 7.7
12.32 7.1787 518 24.8
12.62 7.0083 230 11.0
15.259 5.8018 1395 66.8
16.662 5.3164 79 3.8
17.316 5.1169 2089 100.0
17.631 5.0263 74 3.5
17.889 4.9542 68 3.3
18.816 4.7123 99 4.7
19.182 4.6231 672 32.2
19.613 4.5225 432 20.7
19.953 4.4461 532 25.5
20.596 4.3088 434 20.8
20.856 4.2556 182 8.7
21.121 4.2028 667 31.9
21.675 4.0967 129 6.2
22.753 3.9050 420 20.1
22.943 3.8731 1004 48.1
23.547 3.7751 159 7.6
24.108 3.6884 352 16.9
24.718 3.5988 141 6.7
25.342 3.5116 163 7.8
27.068 3.2915 59 2.8
28.146 3.1678 228 10.9
28.453 3.1344 81 3.9
28.992 3.0773 135 6.5
29.395 3.036 81 3.9
30.11 2.9655 64 3.1
30.721 2.9080 104 5.0
NMR data of pattern A
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δppm 1.40 - 1.54 (m, 2 H), 2.06 (br d, J = 11.04 Hz, 2 H), 2.88 (br s, 4 H), 3.09 (br d, J = 4.52 Hz, 4 H), 3.44 - 3.55 (m, 2 H), 3.60 - 3.70 (m, 3 H), 3.95 (br d, J = 11.29 Hz, 2 H), 5.35 (d, J = 7.78 Hz, 1 H), 6.32 (s, 1 H) 6.76 (s, 2 H), 7.24 - 7.36 (m, 1 H), 7.48 (t, J = 7.78 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 7.28 Hz, 2 H), 10.93 (s, 1 H).
등온수분 흡습/탈습 분석 (Water sorption and desorption study, DVS cycle)
SMS DVS Advantage 1 을 사용하여 결정형 A 10mg을 메쉬 스테인레스 스틸 바스켓 안에 넣었다. 전체 실험 사이클은 일정한 온도(25℃ 및 40 - 90% 범위에서 10% RH 간격으로(각 습도 수준에 대해 60-360분) 2회 스캔(흡습 및 탈습)으로 구성된다. 약 0.7%의 중량 증가와 습도 수준 대비 흡수 및 소실은 비흡습성 샘플임을 의미한다. 도 38는 결정형 A에 대한 등온 곡선이며(중량 변화% 대 RH%)과 중량 변화% 대 시간 및 상대 습도%의 키네틱 곡선이다. DVS 진행 이후 XRPD 분석결과, 결정형의 변화는 없어 가장 안정한 결정형으로 보인다.
실시예 15: 결정형 A의 제제화 적합성 평가
15-1. 결정형A의 가압 테스트
100mg의 결정형 A 분말을 다이 캐비티(die cavity)에 충진하고 상부펀치로 2, 3 과 4 MPa의 압력으로 각각 3분간 가압하여 타정하였다. 각각의 타블렛을 분쇄한 후 XRPD 분석결과 변화가 없어 가장 안정한 결정형으로 보인다.
15-2. 결정형 A의 그라인딩 테스트
1) 건식 분쇄
30mg의 결정형 A를 막자사발에서 5분동안 수동으로 갈았다. XRPD 분석결과 변화가 없었다.
2) EtOH에서 습식 분쇄
30mg의 결정형 A와 40mL의 EtOH을 막자사발에 넣고 5분동안 수동으로 갈았다. XRPD 분석결과 변화가 없었다.
3) H2O에서 습식 분쇄
30mg의 결정형 A와 40mL의 H2O을 막자사발에 넣고 5분동안 수동으로 갈았다. XRPD 분석결과 변화가 없었다.
실시예 16: 심근세포에서 세포질 및 미토콘드리아의 칼슘 농도의 항상성 유지 효과
심근세포에서 칼슘 농도 유지 효과를 확인하고자 H9C2 세포를 96공 플레이트에 1.5 X 104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 세포질의 칼슘 농도 측정은 FLIPR Calcium 6 assay kit (Molecular devices; #R8190)을 이용하였다. 제조사 실험방법에 따라 세포에 probenecid와 칼슘 특이적 염색제를 처리하고, 1.75 시간 경과 후 화학식 1의 화합물의 최종 농도가 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001 μM이 되도록 세포에 0.25 시간 동안 처리하였다. 세포의 자극을 위해 tBHP를 최종 농도가 150 μM이 되도록 세포에 처리 후 실시간으로 30초마다 세포질의 칼슘 농도를 측정하였다. 도 39는 tBHP 처리 조건에서의 화학식 1의 화합물의 칼슘 농도 조절 효과를 보여준다. 세로 축의 ΔF/F(Max-Min) 값은 tBHP 처리 후 발생한 칼슘 특이적 염색제의 형광 값의 최대치에서 최소치를 뺀 값으로, 세포질의 칼슘 농도가 많이 증가할수록 큰 값을 가진다. 가로 축은 화학식1의 화합물의 농도를 나타내고, V.C은 운반체만 처리한 대조군으로 tBHP 처리 시 세포의 칼슘 농도가 가장 많이 증가한다. 화학식 1의 화합물이 0.01 μM 처리된 경우 tBHP 처리에 의한 비정상적으로 증가된 세포질의 칼슘 농도가 감소되었고, 0.1 μM 처리 조건에서는 정상 수준의 세포질 칼슘 농도를 나타내었다.
또한 심근세포에서 미토콘드리아의 칼슘 농도 증가를 억제하는 효과를 세포 이미징으로 확인하고자 H9C2 세포를 35 mm 배양접시에 1.5 X 104 cells 로 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 미토콘드리아 내 칼슘 농도 이미징은 Rhod-2를 이용하였다. Rhod-2와 MitoTracker Green (200nM), Hoechst33342 (2 drops/ml)를 50 분 처리하고, KRB 완충용액으로 2회 세척한 후 완충용액을 넣어 30 분 더 배양하였다 화학식 1의 화합물의 최종 농도가 10 μM이 되도록 세포에 0.25 시간 동안 처리 후 tBHP의 최종 농도가 150 μM이 되도록 세포에 30 분 동안 처리하고 thapsigargin 1.2 μM을 10 분, 이어 CaCl2를 2 mM 처리 후 살아있는 세포의 미코콘드리아에 존재하는 칼슘에서 발색하는 형광을 이미징을 통해 관찰하였다. 도 40 은 tBHP 및 thapsigargin 과 CaCl2를 추가로 처리한 조건에서 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 칼슘 증가를 억제하는 효과와 관련한 이미징 결과를 보여준다. 실험 결과, 화학식 1의 화합물이 tBHP 및 thapsigargin 과 CaCl2를 추가로 처리한 조건에서 발생한 미토콘드리아 내 칼슘 농도 증가를 효과적으로 억제하는 것을 Rhod-2 형광의 감소를 통해 관찰하였고, 이를 통해 화학식 1의 화합물이 미토콘드리아 내 증가하는 칼슘을 강력하게 억제하는 것을 확인하였다.
이 실험 결과는 세포 내 칼슘 조절의 기능을 통한 ER 스트레스 및 미토콘드리아 기능 이상을 개선하는 기전과 연관된 관련질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 17: 심근세포의 미토콘드리아 내 활성산소 제거 효과
심근세포에서 미토콘드리아 내 발생하는 활성산소의 제거 효과를 확인하고자 H9C2 세포를 96 공 플레이트에 1.5 X 104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 미토콘드리아 특이 활성산소 측정은 dihydrorhodamine-123 (DHR-123)을 통한 형광 측정법을 이용하였다. 세포에 DHR-123을 0.5 시간 처리한 후, 이어 화학식 1의 화합물의 최종 농도가 0.0001, 0.001, 0.003, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 10, 30 μM이 되도록 세포에 0.25 시간 동안 처리하였다. tBHP를 최종 농도가 400 μM 이 되도록 세포에 첨가한 후 실시간으로 3분마다 세포 내 활성산소를 형광 세기를 통해 측정하였다. 도 41은 tBHP 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 활성산소 제거 효과를 보여준다. 가로 축은 화학식 1의 화합물의 농도를 로그 스케일로 나타내고, 세로 축은 tBHP 처리 후 2시간 동안 발생한 미토콘드리아 내 활성산소의 총량을 나타낸 것이다. tBHP에 의해 미토콘드리아 내 활성산소가 급격히 증가하였으나, 화학식 1의 화합물을 처리함으로써 농도 의존적으로 활성산소 발생이 억제되는 효과를 나타내었다.
화학식 1의 화합물의 활성산소 제거 효과를 세포 이미징으로 확인하고자 H9C2 세포를 35 mm 공초점 현미경 전용 배양접시에 1.5 X 104 cells 로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 활성산소 중 미토콘드리아에서 발생하는 초과산화물 측정을 위해 MitoSOXTM(Red Mitochondrial Superoxide Indicator)를 이용한 세포 내 형광 이미징을 수행하였다. 화학식 1의 화합물의 농도가 1 μM이 되도록 세포에 0.25 시간 동안 전처리하고 tBHP를 최종 농도가 50 μM이 되도록 세포에 첨가하고 1시간 동안 처리하였다. 세포를 페놀레드가 없는 배지로 교환해주고 HOECHST (0.5 drop/ml), MitoTracker Green (150 nM), MitoSOX(2 μM)를 30분 동안 처리한 후 세포 내 형광을 이미징을 통해 관찰하였다. 도 42은 tBHP 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 미토콘드리아 내 초과산화물 제거 효과와 관련한 이미징 결과를 보여준다. 실험 결과, 화학식 1의 화합물이 미토콘드리아 내 초과산화물을 포함한 활성산소를 효과적으로 제거하는 것을 MitoSOX 형광의 감소를 통해 관찰하였고, 이를 통해 화학식 1의 화합물이 미토콘드리아 내 발생한 활성산소를 강력하게 제거하는 항산화제로 작용한다는 것을 확인하였다.
이 실험 결과에서 보인 미토콘드리아 내 활성산소를 제거하는 효과는 세포괴사와 연관되어 있으므로, 세포손상 및 괴사와 관련한 질환에 대하여 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 18: 대식세포와 별 아교 세포에서 생성되는 과산화질소 제거 효과
대식세포에서 발생되는 과산화질소의 제거 효과를 확인하고자 RAW264.7 세포를 96 공 플레이트에 1 X 105 cells/well 로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 과산화질소 측정은 DAX-J2™PON Green dye 를 통한 형광 측정법을 이용하였다. 세포에 DAX-J2™PON Green dye를 1 시간 전 처리한 후 화학식 1의 화합물과 양성대조군인 ascorbic acid를 각각 최종 농도가 10, 30 μM 이 되도록 세포에 5 분 동안 처리하였다. 이 후 SIN-1을 최종 농도가 200 μM 이 되도록 처리하고 실시간으로 2 분마다 세포 내 생성되는 과산화질소의 양을 형광 세기를 통해 측정하였다. 별 아교 세포에서의 과산화질소 제거 효과를 확인하고자 C8-D1A 세포를 96 공 플레이트에 6 X 104 cells/well 로 분주하여 24시간 동안 배양하였고, 같은 조건으로 실험을 진행하였다. 도 43는 SIN-1 처리 조건에서 화학식 1의 화합물의 세포 내 과산화질소 제거 효과를 보여준다. 왼쪽은 대식세포, 오른쪽은 별 아교 세포에서의 결과를 나타내었다. 가로 축은 화학식 1의 화합물과 ascorbic acid의 농도를 나타내고, V.C은 운반체만 처리한 대조군으로 SIN-1 처리 시 세포 내 과산화질소 농도가 가장 많이 증가한다. 세로 축은 SIN-1 처리 후 1 시간이 지나 발생한 과산화질소의 총량을 나타낸 것이다. SIN-1에 의해 세포 내 과산화질소가 급격하게 증가하였으나, 화학식 1의 화합물을 처리함으로써 농도 의존적으로 과산화질소 발생이 억제되었고, 양성대조군인 ascorbic acid 보다도 더 우수한 억제 효과를 나타내었다.
이 실험 결과는 염증에 관여하는 대식세포와 별 아교 세포의 과산화질소 제거 효과를 확인함으로써, 췌장염, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 박테리아 및 바이러스 감염, 사구체신염, 급성/만성 신장질환, 괴사성 대장염, 폐렴, 간염, 점막염 등의 각종 염증 기반 질환과, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 림바그리드/베커 근위측증, 뒤센 근위축증 등 노화 및 노화 관련 뇌질환에 대한 예방 또는 치료 및 개선 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
실시예 19: MPTP-유도 파킨슨병 마우스 모델에서 행동 능력 향상 효과
MPTP(1-Methy-4-pheny-1,2,3,6-tetrahydropyridine)는 신경 독소인 MPP+(1-methy-4-phenylpyridium)의 pro-drug으로, 투여 시 도파민성 뉴런을 파괴하여 파킨슨병의 증상을 유발하는 물질이다. C57BL/6 마우스에 2시간 간격으로 20 mg/kg MPTP를 총 4 회 투여하여 행동 장애를 유도하였다. MPTP 투여 2일 후부터 6일간 화학식 1의 화합물을 저, 중 및 고 용량으로 하루 한번 복강 투여하였다. 화학식 1의 화합물의 행동 능력 향상 효과를 확인하기 위해 장대 시험 (pole test)를 수행하였다. 도 44는 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물을 처리 시 Total time 향상 효과를, 도 45는 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물을 처리 시 T-turn 향상 효과를 보여준다. MPTP 투여 군의 Total time과 T-turn 값은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. 이때, 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서 Total time과 T-turn 값이 농도 의존적으로 회복되는 것을 확인하였다.
또한, 화학식 1의 화합물의 행동 능력 향상 효과를 확인하기 위해 악력 시험 (Grip strength test)를 수행하였다. 도 46은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물 처리 시 악력 향상 효과를 보여준다. MPTP 투여 군의 악력 값은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이때, 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서 악력 값이 농도의존적으로 회복되는 것을 확인하였다.
실시예 20: MPTP-유도 파킨슨병 마우스 모델에서 도파민성 뉴런 보호 효과
C57BL/6 마우스에 2시간 간격으로 20 mg/kg MPTP를 총 4 회 투여하여 행동 장애를 유도하였다. MPTP 투여 2일 후부터 6일간 화학식 1의 화합물을 저, 중 및 고 용량으로 하루 한번 복강 투여하였다. 화학식 1의 화합물의 투여 6일째 날에 마우스를 희생하여, 뇌조직의 동결 절편을 제조하고, TH (Tyrosine hydroxylase) 염색을 수행하였다. 도 47은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물을 처리 시 선조체에서의 TH 수준 회복 효과를 보여준다. 선조체에서 MPTP 투여 군의 TH 수준은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이 때, 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서 TH 수준이 농도 의존적으로 회복되었으며, 중 및 고 용량에서 유의하게 증가하였다. 도 48은 MPTP-유도 파킨슨병 마우스모델에서 화학식 1의 화합물을 처리 시 흑색질에서의 TH 수준 회복 효과를 보여준다. 흑색질에서 MPTP 투여 군의 TH 수준은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이때, 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서 TH 수준이 농도 의존적으로 회복되었으며, 고용량에서 유의한 차이를 보였다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1의 화합물의 결정형 A로서,
    [화학식 1의 화합물]
    Figure PCTKR2022005212-appb-img-000004
    상기 결정형이 7.64±0.2, 12.32±0.2, 12.62±0.2, 15.26±0.2, 17.32±0.2, 19.18±0.2, 19.61±0.2, 19.95±0.2, 20.60±0.2, 21.12±0.2, 22.94±0.2, 24.11±0.2 및 28.15±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 하는 결정형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 X선 분말 회절 패턴은 7.64±0.2, 15.26±0.2, 17.32±0.2, 19.18±0.2, 21.12±0.2 및 22.94±0.2로부터 선택되는 2[θ]값에서 4개 이상의 회절 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 하는 결정형.
  3. 제1항에 있어서, 하기 표에 열거된 피크 위치들과 피크 위치가 일치되는 X선 분말 회절 패턴으로 특정되는 것을 특징으로 하는 결정형:
    Figure PCTKR2022005212-appb-img-000005
  4. 하기 화학식 1의 화합물 및 DMSO, DMF 또는 NMP로부터 선택되는 용매를 포함하는 용액을 가온 하 1 내지 24시간 동안 교반하는 단계; 및
    상기 용액을 교반하면서 1 내지 72시간에 걸쳐 0 내지 25℃로 냉각시켜 결정을 성장시키는 단계를 포함하는
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
    [화학식 1의 화합물]
    Figure PCTKR2022005212-appb-img-000006
  5. 제4항에 있어서, 상기 가온은 50 내지 120℃의 범위까지 온도를 높여 수행되는 것인 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 냉각은 5 내지 20℃/h의 속도로 수행되는 것인 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  7. 하기 화학식 1의 화합물을 용매 중에 용해시켜 얻은 용액에 반용매를 첨가하여 결정화하는 단계; 및
    상기 용액을 교반하면서 6 내지 48시간에 걸쳐 0 내지 25℃까지 냉각시켜 결정을 성장시키는 단계를 포함하는
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
    [화학식 1의 화합물]
    Figure PCTKR2022005212-appb-img-000007
  8. 제7항에 있어서, 상기 반용매의 첨가 과정에서 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 씨결정으로서 첨가하는 것을 포함하는,
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 용매는 DMSO, DMF 또는 NMP로부터 선택되는 것인
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 반용매는 에탄올 또는 MTBE인
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물의 중량 대비 용매의 중량은 2배 이상인
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 용매의 중량 대비 반용매의 중량은 2 배 이상인
    제1항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A와, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A와, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 하기 그룹에서 선택되는 세포 괴사 및 관련 질환에 대한 예방 또는 치료용 약제학적 조성물: 급성 또는 만성 간 질환, 치매, 파킨슨병, 헌팅톤병, 허혈성 질환, 당뇨병, 췌장염, 박테리아성 또는 바이러스성 패혈증, 괴사성 프로콜리티스(necrotizing procolitis), 낭포성 섬유증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 신증, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 다발성 경화증, 백혈병, 림프종, 신생아 호흡곤란증후군, 질식, 결핵, 자궁내막증, 혈관무력증, 건선, 동상, 스테로이드처리 합병증, 회저병, 압통, 혈색소뇨증, 화상, 고열증, 크론씨병, 셀리악병, 구획증후군, 나상맥 손상, 사구체신염, 근이양증, 마이코플라즈마 질환, 탄저병, 앤더슨병, 선천성 마이토콘드리아병, 페닐케톤뇨증, 태반경색, 매독 및 무균성 괴사; 및 알코올 중독 및 코카인, 항생제, 항암제, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 사이클로스포린 (cyclosporine), 화학독소, 독가스, 농약, 중금속에의 노출 또는 이들의 투여 또는 자가투여와 관련된 괴사, 방사능 또는 UV에의 노출에 의한 손상 및 이와 관련된 세포괴사, 급성/만성 신장질환, 외상성뇌손상, 루게릭병, 괴사성 대장염 (necrotizing colitis), 바이러스 감염, 건선 및 알러지성 피부염을 포함하는 피부질환, 장기보존/장기이식, 급성폐장애신드롬/급성 폐질환, 폐렴, 결핵, 천식, 폐동맥 고혈압, 만성폐쇄성 폐질환 (chronic obstruction pulmonary disease), 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis) 및 낭포성 폐섬유화증 (cystic fibrosis)을 포함하는 염증성 폐질환 (chronic Inflammatory pulmonary disease), 탈수초화 (demyelination)와 근위축측삭경화증 (ALS; amyotrophic lateral sclerosis)를 포함하는 탈수초질환, 폐동맥고혈압을 포함하는 고혈압, 뇌졸중, 프라이온 질병 (prion disease), 뇌전증, 운동실조 (ataxia), 편두통, 인지력 감퇴, 발작, 떨림, 정신질환, 인슐린저항성, 고지혈증, 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 크론병과 궤양성결장염을 포함하는 염증성 장질환 (IBD; inflammatory bowel disease), 암 및 암의 전이, 색소 망막염, 시신경병, 백내장 및 녹내장을 포함하는 시각장애 관련 질병, 빈혈, 담즙울혈 (cholestasis), 부갑상선 기능저하증, 범혈구 감소증, 췌장 장애, 젖산 산증 (lactic acidosis), 젖산혈증 (lactacidaemia), 청력손실, 저신장, 장폐색증, 심장 전도 결함 (cardiac conduction defect), 심장근육병증 (cardiomyopathy), 자궁내막증, 불임, 조기 갱년기, 림바그리드/베커 근위측증 (GGMD/BMD; limbar gride/Becker muscular dystrophy)와 뒤센 근위축증 (DMD; Duchenne muscular dystrophy)을 포함하는 근위측증 질환, 노화 및 노화관련 질환, 및 점막염.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화학식 1의 화합물의 결정형 A를 포함하는 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도용 조성물.
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