CN117136185A

CN117136185A - 5-[（1,1-二氧化-4-硫代吗啉基）甲基]-2-苯基-n-（四氢-2h-吡喃-4-基）-1h-吲哚-7-胺的新晶型

Info

Publication number: CN117136185A
Application number: CN202280028250.9A
Authority: CN
Inventors: 金淳河; 张惠卿; 金亨珍; 李世渊; 全祥权; 刘银京; 徐武永
Original assignee: SpA Immunotherapy Ltd
Current assignee: SpA Immunotherapy Ltd
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2023-11-28
Also published as: JP2024515630A; BR112023021066A2; US20240043409A1; WO2022220519A1; EP4324830A1; KR20220141251A

Abstract

本发明涉及化学式1化合物的晶型A，其与化学式1的化合物的无定型和其它晶型相比具有物理和化学上突出的特性。本发明化学式1化合物的晶型A，与无定型或其他晶型相比，即使在长时间暴露于恶劣条件下也不会变性，且具有低的吸水性，晶型即使在压力下或粉碎时也不会改变，因此有利于制剂化，并且晶型本身具有极好的稳定性，因此可长时间储存。

Description

5-[(1,1-二氧化-4-硫代吗啉基)甲基]-2-苯基-N-(四氢-2H- 吡喃-4-基)-1H-吲哚-7-胺的新晶型

技术领域

本发明涉及以下化学式1的化合物的新晶型，5-[(1,1-二氧化-4-硫代吗啉基)甲基]-2-苯基-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吲哚-7-胺。

[化学式1]

背景技术

各种晶型或无定型可以表现出各种固态物理特性，例如水分吸附、响应压缩的行为、储存期间的稳定性以及研磨固体的流动性。这些特性反过来影响某些固态作为商业生产的活性药物成分的适用性。例如，流动性会影响药物加工过程中物质的处理设施。如果粉末状化合物的颗粒不容易相互流动，那么配方专家在开发片剂或胶囊配方时应考虑到这一事实，并且此类配方可能需要使用润滑剂，如胶体二氧化硅、滑石、淀粉或磷酸三钙。

同一药物的不同晶型或无定型可能在药物重要性质(如溶出速率和生物利用度)方面存在显著差异。溶出速率不仅是糖浆、灵丹妙药和其他液体药物制备过程中的一个考虑因素，还可能导致治疗结果的差异。例如，活性成分在患者胃液中的溶解速率影响口服给药的活性成分到达患者血流的速率，从而导致治疗结果不同。

同时，化学式1的化合物，5-[(1,1-二氧化-4-硫代吗啉基)甲基]-2-苯基-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吲哚-7-胺是通过国际专利公开WO2009-025478公开的化合物，并且是据报道对细胞坏死和相关疾病表现出预防或治疗和改善作用的物质。

本发明人在使用化学式1的化合物开发产品的过程中，对制造方便且具有优异稳定性的化学式1晶型进行了连续研究。结果，本发明人已经证实，在化学式1的化合物的晶型中，晶型A与无定型和其他晶型相比具有最突出的物理和化学特性。

[现有技术文献]

[专利文献]

(专利文献0001)国际专利公开WO2009-025478

发明内容

本发明的目的是提供一种化学式1化合物的晶型A，与化学式1的化合物的无定型和其他晶型相比，其具有优异的物理和化学性质。

本发明的另一个目的是提供一种化学式1化合物的晶型A的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其包含化学式1的化合物的晶型A作为活性成分。

本发明提供了化学式1化合物的晶型A，与化学式1的化合物的无定型和其他晶型相比，其具有优异的物理和化学性质。“晶型A”是在化学式1化合物的晶型筛选过程中被命名为晶型XII的物质，后来被重命名为“模式A”或“晶型A”，在本发明中，“晶型A”、“模式A”或“晶型XII”可相替换使用。在本发明中，“晶型”和“模式”可相替换使用。根据X射线粉末衍射(XRPD)分析，晶型A具有不同于其他晶型的结晶结构。

根据本发明的一个实施例，化学式1的化合物的晶型A的特征在于，其用X射线粉末衍射图确认，所述X射线粉末XRD图具有至少4个以上衍射峰，例如4、5、6、7、8、9或10个衍射峰，所述衍射峰的2[θ]值选自7.64±0.2、12.32±0.2、12.62±0.2、15.26±0.2、17.32±0.2、19.18±0.2、19.61±0.2、19.95±0.2、20.60±0.2、21.12±0.2、22.94±0.2、24.11±0.2和28.15±0.2。

特别地，X射线粉末衍射图的特征在于，衍射峰的2[θ]值选自7.64±0.2、15.26±0.2、17.32±0.2、19.18±0.2、21.12±0.2和22.94±0.2。

更具体地，化学式1的化合物的晶型A的特征在于，该X射线粉末XRD图案的峰位置与下表1中列出的峰位置一致。

[表1]

在另一个实例中，本发明提供的化学式1化合物的晶型A的特征在于，通过差示扫描量热仪测定时，其起始点为272.7℃(±2.5)，峰值最大值为273.4℃(±2.5％)。

本发明提供了一种制备由化学式1的化合物的晶型A的方法，所述方法包括将化学式1的化合物与包含选自DMSO、DMF或NMP的溶剂的溶液在加热下搅拌1-24小时的步骤；和通过在搅拌下将溶液冷却1至72小时至0至25℃来生长晶体的步骤。

这里，用作起始材料的化学式1的化合物可以是无定型或其任意晶型。

同时，可以通过加热将温度提高到50至120℃的范围。

此外，冷却可以在5至20℃/h的速率下进行。

本发明的另一个实施例提供了一种制备由化学式1的化合物的晶型A的方法，该方法包括以下步骤：将化学式1的化合物溶解在溶剂中得到的溶液中添加抗溶剂来结晶的步骤；以及将溶液搅拌6至48小时，并冷却至0至25℃来生长晶体的步骤。

同样，这里，用作起始材料的化学式1的化合物可以是无定型或其任意晶型。

在本发明的一个实施例中，制备化学式1化合物的晶型A的方法，还包括，在添加抗溶剂的步骤中，化学式1的化合物的晶型A作为晶种添加的步骤。

作为溶剂，只要能够溶解化学式1的化合物的溶剂即可，不受其他限制。例如，溶剂可以选自DMSO、DMF和NMP，但不限于这些。

所述抗溶剂是对于目标化合物不溶或表现出低溶解度的溶剂，并且可以通过将抗溶剂添加到溶解有化合物的溶液中沉淀目标化合物。因此，在根据本发明的制备晶型A的方法中，考虑溶解化学式1的化合物的溶剂的类型、溶解度等，可以通过选择并添加合适的抗溶剂来结晶该化合物，并且晶体可以是具有X射线粉末衍射图案和吸热峰的晶体。

在本发明的一个实例中，可以使用乙醇或MTBE作为抗溶剂，但抗溶剂不限于此。

在本发明的一个实例中，溶剂的重量与化学式1的化合物的重量相比，可以是至少2倍。只要溶解化学式1的化合物即可，对于溶剂的最大用量没有限制，但考虑到反应的经济性，溶剂的使用范围优选为化学式1化合物重量的2-10倍。

同时，用于结晶的抗溶剂的量由所使用的溶剂的量来确定。在本发明的一个实例中，抗溶剂的重量与溶剂的重量相比可以是两倍以上。虽然对抗溶剂的用量没有上限，但与溶剂相比，抗溶剂的重量优选为2至15倍。

在制备化学式1化合物的晶型A的方法中，可以进一步包括过滤或干燥步骤，以去除杂质、过量溶剂等，从而获得高纯度的产物。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含化学式1的化合物的晶型A和药学上可接受的载体。

关于药物组合物，其包含化学式1的化合物的晶型A的，化学式1化合物的用途如下。

根据WO2009-025478，公开了化学式1的化合物示出出对细胞坏死和相关疾病的预防、治疗和改善作用。

根据WO2009-025478，从急性/慢性肝病(如肝炎、肝纤维化、肝硬化)、神经退行性疾病(如痴呆、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症)、缺血性心脏病、缺血性再融合综合征(韩国注册专利10-1325272)组中选择了细胞坏死和相关的疾病、缺血性脑卒中、胰腺炎、细菌/病毒性败血症、糖尿病合并症、糖尿病血管病[特别是，这些糖尿病是由破坏胰腺的物质引起的，并由病毒、高血糖、脂肪酸、饮食、毒素、链脲佐菌素等介导]、坏死性直肠炎、膀胱炎、风湿病、退行性关节炎、肾病、细菌感染，病毒感染(例如HIV)，多发性硬化症、白血病、淋巴瘤、新生儿呼吸困难综合征、窒息、肺结核、子宫内膜异位症、血管衰弱、牛皮癣、冻疮、类固醇治疗并发症、坏疽、压痛、血红蛋白尿、烧伤、高热、克罗恩氏病、独身症、室综合征、脊髓损伤、肾小球肾炎、肌肉萎缩、遗传代谢紊乱、支原体病、炭疽病、安德森氏病、先天性线粒体疾病、苯丙酮尿症、胎盘出血、梅毒、无菌坏死和梅毒。此外，药物和毒性物质使用的坏死和相关疾病是从与酒精中毒、暴露、和/或服用和/或自行服用可卡因、药物(如对乙酰氨基酚)有关的新冠病毒组中选择的，抗生素、抗癌剂、阿霉素、嘌呤霉素、博来霉素、非甾体抗炎药、环孢菌素、化学毒素(如四氯化碳、氰化物、甲醇、乙二醇)、有毒物质、农用化学品、重金属(如铅、汞、镉)、或与暴露有关的放射性/紫外线及其相关的坏死。

根据WO2009-025478，细胞坏死和相关疾病选自急性/慢性肝病(例如肝炎、肝纤维化、肝硬化)、神经退行性疾病(例如痴呆、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症)、缺血性心脏病、缺血性再灌注损伤(韩国注册专利10-1325272)，缺血性中风或缺血性损伤、胰腺炎、细菌/病毒性败血症、糖尿病或糖尿病并发症、糖尿病血管疾病[特别是这些糖尿病是由胰腺细胞破坏物质引起的，并由病毒、高血糖、脂肪酸、饮食、毒素、链脲佐菌素等介导]、坏死性直肠炎、囊性纤维化、类风湿性关节炎，退行性关节炎、肾病、细菌感染、病毒感染(如HIV)、多发性硬化症、白血病、淋巴瘤、新生儿呼吸窘迫综合征、窒息、肺结核、子宫内膜异位症、血管衰弱、银屑病、冻疮、类固醇

此外，化学式1的化合物还预期在细胞坏死及相关疾病中，急性/慢性肾脏疾病、创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病、坏死性结肠炎、病毒感染(例如SARS-CoV)，包括银屑病和过敏性皮炎的皮肤病以及器官保存/器官移植(参见韩国注册专利10-1098583和10-1941004)上具有预防、治疗或改善效果。

此外，包含化学式1的化合物的药物组合物能够调节细胞内钙的功能，并且能够改善由于细胞内钙水平异常引起的ER(Endoplasmic Reticulum：内质网)应激和线粒体功能障碍。因此，包含化学式1的化合物的药物组合物预计对与其相关的疾病表现出预防或治疗和改善效果。相关疾病如下。

炎症性肺病，包括急性肺损伤综合征/急性肺病、肺炎、肺结核、哮喘、肺动脉高血压、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化和囊性纤维化(见Mitochondrial dysfunction infibrotic diseases.CellDeathDiscov.2020Sep5；6:80.Mitochondrial dysfunction inlung aging and diseases.EurRespirRev.2020Oct15；29(157):200165，参见韩国专利10-1636563)。

脱髓鞘疾病，包括脱髓鞘和肌萎缩侧索硬化症，高血压，包括肺动脉高压、中风、朊病毒病(prion disease)、癫痫、共济失调、偏头痛、认知能力下降、癫痫发作、震颤、心理疾病(如抑郁症)(见Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer'sdisease.CellCalcium.Oct-Nov2003；34(4-5):385-97.Mitochondrial disorders:challenges in diagnosis&treatment.IndianJMedRes.2015Jan；141(1):13-26.)。

胰岛素抵抗、高脂血症、动脉粥样硬化、炎症性肠病(IBD)(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、各种癌症和癌症转移(见reticulum stress and oxidative stress in cellfate decision and human disease.Antioxid Redox Signal.2014Jul20；21(3):396-413)。

视觉障碍相关疾病(如视网膜色素变性、视神经病变、白内障、青光眼)、贫血、胆汁淤积、甲状旁腺功能减退、全血细胞减少、胰腺疾病、乳酸酸中毒、乳酸血症、听力损失、身材矮小、肠梗阻、心传导缺陷、心肌病、子宫内膜异位症、不孕，更年期早期(见Mitochondrialdiseases:thecontribution of organelle stress responses topathology.NatRevMolCellBiol.2018Feb；19(2):77-92.Seminars in medicine of the Beth IsraelHospital,Boston.Mitochondrial DNA and disease.N Engl JMed.1995Sep 7；333(10):638-44.Mitochondrial injury and dysfunction in hypertension–induced cardiacdamage.Eur Heart J.2014Dec7；35(46):3258-3266)。

肌萎缩疾病包括肢体格氏/贝克肌营养不良症(LGMD/BMD)和杜氏肌营养不良症(DMD)(Duchenne muscular dystrophy is associated with the inhibition ofcalcium uniport in mitochondria and an increased sensitivity of theorganelles to the calcium-induced permeability transition.见Biochim BiophysActa Mol Basis Dis.2020May1；1866(5):165674.)。

衰老和衰老相关疾病(见Interrelation between ROS and Ca²⁺in aging andage-relateddiseases.RedoxBiology.2020；6:101678.)。

根据WO2009-025478，包含化学式1的化合物的药物组合物不仅表现出肝保护和肝功能改善效果，而且还表现出对急性和慢性肝疾病的预防和治疗效果，例如脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和病毒或药物诱导的肝炎。此外，作为结果，药物组合物可以预防或治疗肝病并发症，例如门脉高压，但不限于此。此外，根据本发明的药物组合物在预防和治疗选自肝移植、酒精性或非酒精性脂肪肝(参见韩国注册专利10-2006247)、肝纤维化、肝硬化和病毒或药物诱导的肝炎中的肝病方面是有效的，并且对急慢性酒精性肝病是有效的。此外，本发明的组合物在治疗或预防由脂肪酸引起的脂肪肝或由脂肪肝引起的急性或慢性肝病方面是有效的。

根据韩国专利第10-1852304号，化学式1的化合物可用于干细胞培养步骤，以提高干细胞衍生的心肌细胞的分化效率和成熟度。

因此，本发明进一步提供一种组合物，其包含化学式1化合物的晶型A，用于诱导干细胞分化为心肌细胞。

此外，根据WO2016-072692，化学式1的化合物可用于预防和治疗粘膜炎。

因此，本发明提供了包含化学式1化合物的晶型A和药学上可接受的载体的药物组合物用于预防或治疗上述疾病的用途，以及预防或治疗以上列出的疾病的方法，包括将该药物组合物给予有需要的受试者。在本发明中，“治疗”是指当应用于表现出疾病症状发作的受试者时中断或延迟疾病的进展，而“预防”是指应用于没有表现出疾病症状，但具有发作风险的受试时中断或推迟疾病发作的迹象。

在本发明中，“药物组合物”可以包括本发明的化合物以及药学上可接受的载体。

根据本发明的化学式1的化合物，可以以各种口服和非口服剂型给药用于临床给药，并且当配制时，使用稀释剂或赋形剂如常用的填料、填充剂、结合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂制备。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、药丸、粉末、颗粒、胶囊和含片，并且这种固体制剂是通过将至少一种本发明的化合物与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶)混合来制备的。

此外，除了简单的赋形剂之外，还使用诸如硬脂酸镁或滑石的润滑剂。口服给药的液体制剂包括悬浮液、溶液、乳液或糖浆，除了常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。

非口服给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干制剂、栓剂。作为非水溶剂和悬浮溶剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯类如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用威特普醇(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂醇脂、甘油、明胶等。

此外，本发明化学式1化合物的人体有效剂量可根据患者的年龄、体重、性别、给药方式、健康状况和疾病严重程度而变化，通常约为0.001-100mg/kg/天，优选0.01-35mg/kg/天。对于体重为70kg的成年患者，通常为0.07-7000mg/天，优选0.7-2500mg/天。根据医生或药剂师的判断，可以每天给药一次，也可以在特定时间间隔内分多次给药。

发明效果

与无定型或其他晶型相比，本发明化学式1的化合物的晶型A即使在长时间暴露于恶劣条件下也不会变性，具有低的吸水性，对于配制是有利的，因为晶型即使在压力下或粉碎时也不会改变，并且晶型本身具有极好的稳定性，可用于长时间储存。

附图说明

图1示出精制前P9的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图2示出精制前P9的差示扫描量热法(DSC)结果。

图3示出精制前P9的热重分析(TGA)结果。

图4示出晶型IV的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图5示出晶型IV的TGA/DSC叠加结果。

图6示出晶型IV的TGA试验之后测量的XRPD结果。

图7示出晶型IV的TGA/DSC叠加结果。

图8示出晶型V的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图9示出晶型V的TGA/DSC叠加结果。

图10示出晶型V的TGA试验之后测量的XRPD结果。

图11示出晶型VIII的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图12示出晶型VIII的TGA/DSC叠加结果。

图13示出在晶型VIII的TGA试验之后测量的XRPD结果。

图14示出晶型XII的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图15示出晶型XII的TGA/DSC叠加结果。

图16示出晶型XI的X射线粉末衍射图案(XRPD)分析结果。

图17示出晶型XI的TGA/DSC叠加结果。

图18示出晶型XI的TGA之后测量的XRPD结果。

图19示出化学式1的化合物的小规模再结晶试验(试验1-3)的模拟图。

图20示出中间晶型I的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果，中间晶型I是从晶型V转化为晶型A的过程的中间体(试验4)。

图21示出中间晶型II的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果，中间晶型II是从晶型V转化为晶型A的过程的中间体(试验5)。

图22示出在不同DMSO/EtOH比率下重结晶的化学式1的化合物的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图23示出化学式1的化合物在50℃下以不同的DMSO/EtOH比率(1:2、1:3、1:4、1:5、1:7)重结晶的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

图24示出在不同温度下在混合DMSO/EtOH溶剂中成浆的化学式1的化合物的XRPD分析结果。

图25示出化学式1的化合物在每个重结晶步骤的XPRD结果，图26示出对化学式1化合物的重结晶产物的HPLC分析结果，并且图27示出在重结晶之前的化学式1混合物及其重结晶产物。

图28示出了不使用晶种的方法制备的晶型A的照片，图29示出了用不使用晶种的方法制备的晶型A的XRPD分析结果，图30示出了用不使用晶种的方法制备的晶型A的HPLC色谱结果，图31示出了用不使用晶种的方法制备的晶型A的偏振显微镜图像，图32示出了用不使用晶种的方法制制备的晶型A的TGA/DSC结果，并且图33示出了用不使用晶种的方法制得的晶型A的粒径分布。

图34示出了使用最终制备方法产生的晶型A的XRPD分析结果，图35示出了使用最后制备方法生成的晶型A的偏振显微镜(PLM)图像，图36示出了使用最初制备方法所生成的晶型A的TSA/DSC结果，图37示出使用最终制备方法产生的晶型A的粒度分布(PSD)。

图38示出晶型A的水分吸附和解吸等温线分析结果。

图39示出化学式1的化合物在tBHP处理条件下的钙浓度调节效果。

图40示出与化学式1的化合物的线粒体钙浓度的调节作用有关的成像结果，该调节作用是在除tBHP之外还用thapsigargin和CaCl₂进行额外处理的条件下进行的。

图41示出化学式1的化合物在tBHP处理条件下的线粒体内活性氧物种去除效果。

图42示出与化学式1的化合物在tBHP处理条件下的线粒体内超氧化物去除效果有关的成像结果。

图43示出化学式1的化合物在SIN-1处理条件下的细胞内过氧化氮去除效果。

图44示出在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用化学式1的化合物治疗后改善总时间的效果。

图45示出在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用化学式1的化合物治疗后的T形转弯改善效果。

图46示出在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用化学式1的化合物治疗时改善握力的效果。

图47示出在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用化学式1的化合物治疗后恢复纹状体中TH水平的效果。

图48示出在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用化学式1的化合物治疗后恢复黑质中TH水平的效果。

具体实施方式

通过参考以下详细描述的实施例，本发明的优点和特征以及实现该优点和特征的方法更加明确。然而，本发明不限于以下公开的实施例，并且可以以各种形式实现。本实施例仅旨在完整公开本发明，并告知本领域普通技术人员本发明的全部范围；本发明仅由所附权利要求限定。

[实施例]

缩写

在本申请中使用了以下缩写。

使用的设备、标准和方法1.X射线粉末衍射(XRPD)

使用Bruker D8 Advance功率衍射仪进行测量。利用Cu k-αx射线(40kV/40mA)将试样旋转3°～40°测量x射线衍射图。

试样旋转速率＝15RPM

扫描速率＝18.5°/min

2.差示扫描量热法(DSC)

使用TADSCQ2000和DiscoveryDSC-2500进行测量，将大约1mg的试样放置在带针孔的密封铝锅中，并以10℃/min的速率从25℃加热到300℃。

3.热重分析(TGA)

使用TGAQ50或TAQ5000，通过将大约4mg的试样放置在打开的铂盘中并以10℃/min的速率从30℃加热到300℃来进行测量。

4.粒度分布分析(PSD)

在0.5大气压下，通过Sympatec HELOS粒度分析仪使用RODOS的分散系统进行测量。

5.偏光显微镜(Polarizedlightmicroscopy，PLM)

使用具有20倍放大率物理透镜的500万像素CCD尼康LV100POL显微镜。

6.等温下水的吸附和解吸研究(Water sorptionanddesorptionstudy,DVScycle)

使用SMSDVSAdvantage1，将10mg试样置于网状不锈钢篮中。整个试验周期包括在恒定温度(25℃)下，在40％至90％的范围内(每个湿度水平为60至360分钟)，以10％的相对湿度间隔扫描两次(吸附和解吸)。

实施例1：5-[(1,1-二氧化-4-硫代吗啉基)甲基]-2-苯基-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吲哚-7-胺的制备

[反应式1]

WO2009-025478中公开的制备化学式1的化合物的制备方法如以上反应方案1所示。

根据反应式1制备的P9包含大量杂质和异物。化学式1的化合物具有非常低的溶解度，因此精制是非常重要的步骤。为了从最初获得用于研究的P9中去除颜色和异物，将其溶解在DMSO中，然后过滤，并加入EtOH作为抗溶剂，得到精制的化合物，命名为化学式1的化合物。

图1和表2示出精制前P9的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。图2示出精制前P9的差示扫描量热法(DSC)结果，图3示出精制前的P9的热重分析(TGA)结果。

经后续的实验结果，P9为晶型V。在高达160℃时，观察到11.4％的质量减少，熔点为271℃。

[表2]

P9(晶型V)的特征XRPD峰列表

为了减少或去除精制物质(P9)中残留的DMSO、颜色和杂质等，进行使用EtOH的加热/成浆的二次精制步骤以获得命名为化学式1的化合物的固体。晶型IV、V、VIII、XI、XII和其他根据工艺的浓度、温度或持续时间被进一步确认。

对于在GMP设施大规模生产高纯度和稳定的临床物质，建立优化和标准化的精制条件和制备最稳定晶型的条件非常重要。因此，为了研究目的制备的化学式1的化合物用于精制研究和多种晶型的研究。

实施例2：用于精制的溶剂的筛选

对化学式1化合物的溶解度进行了筛选，以找到一种合适的溶剂来获得化学式1的化合物，该化合物没有异物或颜色，并且具有最稳定的晶型。具体地，使用上清液在25℃和50℃下分析化学式1合物在各种溶剂下的溶解度和纯度。

[表3]

化学式1的化合物在25℃和50℃下在各种溶剂中的溶解度

TRS(总相关物质)＝100％-纯度％(溶解在有机溶剂中的DS用HPLC分析)

*由于HPLC测定中，相对较低浓度导致的纯度降低

如表3所示，化学式1的化合物在大多数溶剂中的溶解度非常低，并且表现出40mg/mL或更高溶解度的溶剂是DMF、NMP和DMSO。然而，DMF、NMP和DMSO对杂质也具有高溶解度，并且认为使用抗溶剂的重结晶研究适合作为精制研究。作为抗溶剂，优先考虑总相关物质(TRS)含量低的MeOH、EtOH、IPA或EtOAc。

基于上述结果进行精制和多晶型研究，发现化学式1的化合物具有各种晶型，该方法在实施例3中描述。

实施例3：晶型的制备

实施例3-1：晶型IV–浆料法(DMF溶剂化物)

600mg化学式1的化合物置于4mL DMF中，并在25℃下搅拌一天。使用超离心机除去上清液，并真空干燥剩余的固体以获得晶体。这被命名为化学式1的化合物的晶型IV，并测量XRPD、DSC/TGA和¹HNMR。

[表4]

晶型IV的特征XRPD峰列表

图4和表4示出晶型IV的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

晶型IV的形式的特征在于，它使用X射线粉末衍射图进行确认，该衍射图在选自8.52±0.2、17.06±0.2、21.12±0.2，21.76±0.2、24.18±0.2、24.35±0.2和28.27±0.2的2[θ]值处具有至少四个衍射峰。

图5示出晶型IV的TGA/DSC叠加结果。

同时，¹HNMR结果如下。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.41-1.54(m,1H),2.06(brd,J＝11.29Hz,2H),2.74(s,3H,DMF),2.89(s,7H),3.09(brd,J＝4.77Hz,4H),3.46-3.56(m,2H),3.59-3.71(m,3H),3.90-4.00(m,2H),5.35(d,J＝7.78Hz,1H),6.32(s,1H),6.76(s,2H),7.27-7.35(m,1H),7.48(t,J＝7.65Hz,2H),7.80(d,J＝7.28Hz,2H),7.96(s,1H,DMF),10.94(s,1H).

基于XRPD、DSC/TGA和¹HNMR结果，晶型IV是DMF溶剂化物(化学式1的化合物：DMSO＝1∶1)。

同时，图6示出晶型IV的TGA试验(加热至200℃，然后冷却)后测得的XRPD结果。在图6的XRPD结果中，当晶型IV加热到200℃然后冷却时，除去DMF，并观察到另一种晶型，被命名为晶型XII(后来，更名为“模式A”或“晶型A”)。

实施例3-2：晶型IV(DMF溶剂化物)-重结晶

200mg化学式1的化合物置于0.4mLDMF中并加热至50℃。将获得的悬浮液在50℃下过滤，并将获得的溶液以0.5℃/min的速率冷却至0℃以获得固体，该固体被真空干燥以获得晶型。在对获得的晶型实施TGA和DSC分析，如图7所示，观察到晶型IV的TGA/DSC叠加结果与图5相同，确认为晶型IV(化学式1的化合物：DMSO＝1∶1)。

实施例3-3：晶型V(亚稳态)-溶剂/抗溶剂

600mg化学式1的化合物置于2mL DMSO中获得悬浮液，再使用离心机得到上清液(1.5mL)，向上清液中加入DMSO量的7倍量的EtOH(以700RPM搅拌)。真空干燥使用离心机获得的固体得到晶体。被命名为化学式1的化合物的晶型V，并测量XRPD、DSC/TGA和¹HNMR。

[表5]

晶型V的特征XRPD峰列表

图8和表5示出了晶型V的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

晶型V的形式的特征在于，它使用X射线粉末衍射图进行确认，该衍射图在选自6.82±0.2、13.84±0.2、19.08±0.2、19.66±0.2、20.51±0.2、22.84±0.2、23.78±0.2和38.69±0.2的2[θ]值处具有至少四个衍射峰。

图9示出晶型V的TGA/DSC叠加结果。

同时，¹HNMR结果如下。

¹HNMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm1.22-1.34(m,1H),1.56-1.72(m,4H),2.16(brd,J＝12.88Hz,2H),2.64(s,3H),3.05(brd,J＝9.26Hz,8H),3.55-3.81(m,6H),4.10(brd,J＝11.63Hz,2H),6.49(s,1H),6.77(d,J＝1.50Hz,1H),7.02(s,1H),7.28(s,1H),7.32-7.39(m,1H),7.47(t,J＝7.63Hz,2H),7.73(brd,J＝7.38Hz,2H),8.68(brs,1H)

尽管根据¹H-NMR和TGA/DSC数据，DMSO似乎以晶型V形式存在，但即使在加热至200℃以DMSO除去后，即使冷却后仍继续保持晶型V，因此看似并非为DMSO溶剂化物的晶型(图10)。图10示出晶型V的TGA试验(加热至200℃，然后冷却)后测得的XRPD结果。

实施例3-4：晶型VIII(DMSO溶剂化物)-浆料法

50mg化学式1的化合物在1mL DMSO中，在室温下以浆料状态搅拌4周。使用离心机获得的固体后，再经真空干燥获得晶体。被命名为化学式1的化合物的晶型VIII，并测量XRPD、DSC/TGA和¹H NMR。

[表6]

晶型VIII的特征XRPD峰列表

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图11和表6示出了晶型VIII的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

晶型VIII的形式的特征在于，其使用X射线粉末衍射图进行确认，该衍射图在选自6.88±0.2、13.75±0.2、16.17±0.2、17.93±0.2、20.18±0.2、22.82±0.2、25.84±0.2、26.41±0.2和29.68±0.2的2[θ]值处具有至少四个衍射峰。

图12示出了晶型VIII的TGA/DSC叠加结果。

同时，¹H NMR结果如下。

¹HNMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δppm1.58-1.77(m,4H),2.16(brd,J＝11.54Hz,2H),2.58-2.70(m,7H,DMSOpeak),2.93-3.14(m,8H),3.55-3.78(m,5H),4.10(dt,J＝11.80,3.26Hz,2H),6.47(s,1H),6.76(d,J＝2.01Hz,1H),7.00(s,1H),7.28(s,1H),7.31-7.38(m,1H),7.46(t,J＝7.65Hz,2H),7.70-7.82(m,2H),8.99(brs,1H).

基于¹H NMR和TGA/DSC数据，晶型VIII应为DMSO溶剂化物(化学式1的化合物：DMSO＝1∶1)。TGA/XRPD中，加热至200℃后冷却时，从DMSO溶剂合物中去除DMSO后，观察到不同的晶型，确定为晶型XII(图13)。图13示出晶型VIII的TGA试验(加热至200℃，然后冷却)后测得的XRPD结果。

实施例3-5：晶型XII-浆料法

100mg实施例3-3中获得的化学式1化合物的晶型V置于1mL EtOH中，并在室温下搅拌3天。使用0.45μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤器过滤得到固体，在50℃下干燥生成晶体。被命名为化学式1的化合物的晶型XII(后来被重命名为“模式A”或“晶型A”)，并测量XRPD和DSC。

[表7]

晶型XII的特征XRPD峰列表

图14和表7示出了晶型XII的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

晶型XII的形式的特征在于，使用X射线粉末衍射图对其进行确认，该衍射图在选自7.64±0.2、12.32±0.2、12.62±0.2、15.26±0.2、17.32±0.2、19.18±0.2、19.61±0.2、19.95±0.2、20.60±0.2、21.12±0.2、22.94±0.2、24.11±0.2和28.15±0.2的2[θ]值处具有至少四个衍射峰。

图15示出晶型XII的TGA/DSC叠加结果。

从上述结果可知，亚稳态晶型V通过浆化转化为更稳定的晶型XII。

实施例3-6：晶型XI(NMP溶剂化物)-浆料法

500mg化学式1的化合物置于1mL NMP中，然后在25℃下搅拌3小时。使用超离心机除去上清液，并真空干燥剩余的固体以获得晶体。将其命名为化学式1的化合物的晶型XI，并测量XRPD、DSC/TGA和¹H NMR。

[表8]

晶型XI的特征XRPD峰列表

/>

图16和表8示出了晶型XI的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。

晶型XI的形式的特征在于，其使用X射线粉末衍射图进行确认，所述X射线粉末的衍射图在选自16.89±0.2、17.30±0.2、20.37±0.2、20.95±0.2、21.18±0.2、21.34±0.2、23.16±0.2、24.04±0.2和27.85±0.2的2[θ]值处具有至少四个衍射峰。

图17示出了晶型XI的TGA/DSC叠加结果。

同时，¹H NMR结果如下。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.40-1.54(m,2H),1.84-1.96(m,2H),2.06(brd,J＝11.54Hz,2H),2.13-2.23(m,2H),2.70(s,3H,NMP-Me),2.89(brs,4H),3.08(brd,J＝4.52Hz,4H),3.46-3.56(m,2H),3.59-3.72(m,3H),3.89-3.99(m,2H),5.35(d,J＝7.53Hz,1H),6.32(s,1H),6.76(s,2H),7.28-7.35(m,1H),7.48(t,J＝7.78Hz,2H),7.80(d,J＝7.53Hz,2H),10.94(s,1H).

基于XRPD、DSC/TGA和¹H NMR结果，晶型XI是NMP溶剂化物(化学式1的化合物：NMP＝1∶1)。

同时，在TGA/XRPD结果中，当加热至200℃并冷却时，NMP被去除，转化为晶型XII(图18)。图18示出了在晶型XI的TGA试验(加热至200℃，然后冷却)之后测量的XRPD结果。

实施例3概述

[表9]

实施例3中5种晶型的比较

实施例4：5种晶型的稳定性试验

在苛刻条件(40℃，75％相对湿度)下对实施例3中获得的5种晶型进行了8周的稳定性试验。

下面的表10示出了5种晶型的稳定性试验的结果。

[表10]

5种晶型的稳定性试验结果

从表10中可以看出，在苛刻的条件下，所有5种晶型的纯度几乎没有变化。根据1HNMR光谱和DSC/TGA结果，晶型IV、VIII和XI分别确认为DMF、DMSO和NMP溶剂化物，并发现在苛刻条件(40℃，75％相对湿度)下观察8周后转化为晶型XII。晶型V不是溶剂化物，而是亚稳态，发现其也转化为晶型XII。因此，判断晶型XII是最稳定的晶型，并且晶型XII被重命名为晶型A或模式A(晶型XII＝晶型A或者模式A)。

实施例5：优化步骤I

实施例5-1确定化学式1化合物的初始浓度

图19示出化学式1的化合物的小规模重结晶试验(试验1-3)的模拟图。如图19所示，为了确定化学式1化合物在DMSO溶剂中的初始浓度，将化学式1的化合物溶解至浓度为100、150和200mg/mL，在50℃下经2小时加入化学式1混合物的7倍量的EtOH，然后在室温下搅拌19小时。测量每个步骤的XRPD并计算产率，分别为加入EtOH后立即产生的固体(XRPD-1)，在室温下搅拌1天后产生的固体(XRPD-2)，并且在50℃下真空干燥得到的固体(XRPD-3)。

[表11]

化学式1化合物的小规模重结晶试验(试验1～3)的结果

如表11中所示，初始晶型V在150和200mg/mL浓度下产生，并观察到随着时间的推移转化为晶型A。基于这些试验的结果，结晶的初始浓度选择为200mg/mL，其中产率最高。

实施例5-2决定二甲基亚砜/乙醇的比例

为了确定抗溶剂EtOH与化学式1化合物200mg/mLDMSO溶液的比例，在50℃下分别在2小时内加入5倍和7倍EtOH，然后在室温下搅拌16小时。经过滤得到的固体在50℃下真空干燥。在干燥前测量每个试样的XRPD，并观察干燥过程中的变化，获得产率(表12)。从7倍EtOH获得的固体具有84.15％的产率，并且表现出XRPD光谱，其在干燥前表现出晶型V的特征峰，并且那些特征峰对应于干燥后从晶型V转化为晶型A的中间峰(试验4，中间体-I)(图20)。相反，从5倍EtOH获得的固体具有76.55％的产率，并且在干燥之前表现出晶型V的特征峰，以及与干燥之后从晶型V转化为晶型A的晶型不同的新的特征中间晶型的特征峰(试验5，中间体II)(图21)。基于这些结果，决定DMSO:EtOH＝1:7是比1:5更好的晶型A的产率和重结晶条件。

[表12]

化学式1化合物的小规模重结晶试验结果(试验4～5)

注：XRPD-1、XRPD-2和XRPD-3分别表示添加抗溶剂后立即形成的晶型、搅拌一天后形成的晶型和干燥后形成的晶型

V→A*：从晶型V转化为晶型A的中间步骤

图20和表13示出了中间体I的XRPD分析结果。

[表13]

中间体-I(中间体-I)的特征XRPD峰列表

图21和表14示出中间晶型II的XRPD分析结果。

[表14]

中间体II的特征XRPD峰列表(试验5，中间体II)

100mg以上获得的中间体-I置于1mLEtOH中，然后在室温下搅拌3天。对于使用0.45μmPTFE过滤器生成的固体在50℃下真空干燥。对干燥完成的试样进行XRPD分析确定该固体为晶型A(表15)。根据这些结果，可以知道晶型V是亚稳态晶型，并且在足够的时间和条件下转化为更稳定的晶型A。

[表15]

中间体I的浆料化结果

此外，在使用DMSO/EtOH混合溶剂的情况下，结晶过程中的条件可能在中途导致不同转化模式的晶型。因此，有必要建立一种制备方法，其中从重结晶最初开始的时间点产生最稳定的晶型。

实施例5-3向DMSO溶液中滴加抗溶剂(EtOH)的最佳时间

使用实施例5-2中使用的结晶方法，但在24小时和35小时内以DMSO的7倍量更缓慢地添加EtOH(在试验7中，在滴加6.7％EtOH后，添加20％的晶型A作为晶种)，分析XRPD中从每个步骤获得的晶型。与实施例5-1的结果(滴加19小时)一同综合考虑，改变滴加EtOH的时间和使用晶种不可避免地产生初始晶型V，但发现在干燥完成后，可以获得纯晶型A，不含其他晶型。

[表16]

根据抗溶剂的不同添加时间得到的化学式1化合物重结晶的结果(试验6～7)

*添加晶种

实施例6：化学式1的化合物在DMSO/MMTBE溶剂中的重结晶

在50℃下，经3小时将5倍和7倍MTBE抗溶剂加入化学式1化合物150mg/mLDMSO溶液中，然后在室温下搅拌18小时。过滤得到的固体在50℃下真空干燥18小时。这里，通过在真空干燥之前和之后测量各自的XRPD来检查干燥过程中的变化。从7倍的MTBE获得的固体具有64.73％的产率，在干燥之前和之后都表现出晶型V的XRPD。以59.27％的产率从5倍MTBE获得的固体在干燥之前和之后也表现出晶型V。

[表17]

在DMSO/MMTBE溶剂中的化学式1的化合物重结晶结果(试验8～9)

No.

Conc.(mg/mL)

方法

DMSO/MTBE

XRPD-3

产率(％)

纯度(％)

Test8

150

Anti-溶剂

1V:7V

V

64.73

100.00

Test9

150

Anti-溶剂

1V:7V

V

59.27

100.00

实施例7：化学式1的化合物在NMP/EtOH溶剂中的重结晶

在25℃下，经24至35小时将7倍的抗溶剂EtOH加入化学式1的化合物150mg/mLNMP溶液中，然后在室温下搅拌22至33小时。将过滤得到的固体在50℃下真空干燥2小时。这里，通过在真空干燥之前和之后测量各自的XRPD来检查干燥过程中的变化。以65-74％的产率获得固体，并且在NMP/EtOH组合中也观察到晶型XI的初始形成。

[表18]

在NMP/EtOH溶剂中化学式1的化合物重结晶的结果(试验10～11)

实施例5至7的结果分析

观察实施例5、6和7的结果，发现在各种可能的混合溶剂条件下，产生有色晶型以及不稳定的单个中间晶型。考虑到形态、产率和残留溶剂毒性，DMSO/EtOH组合似乎是最佳的优选方案，并进行了以下优化。

[表19]

化学式1的化合物重结晶使用的混合溶剂的结果总结

实施例8：DMSO/EtOH溶剂比例最优化

实施例8-1：DMSO/EtOH抗溶剂比例最优化实验

200mg化学式1的化合物置于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，加热至60℃后，用0.45μmPTFE薄膜过滤，在50℃下，经35小时向获得的溶液中缓慢加入10倍量的EtOH(10mL)。测量并分析在加入EtOH量为DMSO量的1.5倍、2倍、3倍、5倍、7倍和10倍的时间点获得的初始固体的晶型。图22示出在不同DMSO/EtOH比例下重结晶的化学式1的化合物的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。如图22所示，以1:3或更低的比例下形成溶剂化物晶型VIII，并且发现在DMSO/EtOH＝1:5或更高的情况下形成晶型A。为了确定更准确的比率，在下一步中对浆化条件进行了优化。

实施例8-2：在50℃下优化DMSO/EtOH混合溶剂比例的实验

在5个容器中分别加入1mLDMSO/EtOH混合溶剂(1:2，1:3，1:4，1:5，1:7)和200mg化学式1的化合物，并在50℃下搅拌一天。

通过XRPD测量并分析使用离心机获得的固体的晶型。图23示出在50℃下以不同DMSO/EtOH比率(1:2、1:3、1:4、1:5、1:7)成浆的化学式1化合物的X射线粉末衍射图(XRPD)分析结果。如图23所示，在DMSO/EtOH比率为1:4、1:5和1:7的情况下，晶型A在50℃下稳定形成，并且确定最佳比率为DMSO:EtOH＝1:4。

实施例9：在DMSO/EtOH混合溶剂中，不同温度下的平衡溶解度和过饱和

200mg化学式1的化合物分别置于1mL两种DMSO/EtOH(1:4，1:5)混合溶剂中，制备200mg/mL悬浮液后加热，并以50℃、60℃和75℃的恒温搅拌6小时。经6小时后，使用HPLC分析悬浮液的上清液以找到溶解度平衡，固体的XRPD分析结果示出在表20和图24中。图24示出在不同温度下在混合DMSO/EtOH溶剂中成浆的化学式1的化合物的XRPD分析结果。研究发现，在所有温度(50℃，60℃，75℃)和混合溶剂(1:4，1:5)条件下存在的固体都具有晶型A。75℃时，在DMSO/EtOH1:4混合溶剂中的溶解度为31mg/mL，这意味着使用DMSO/EtOH1:4混合溶剂的重结晶方法从一开始就不合适。因此，决定考虑采用过饱和法。

[表20]

化学式1的化合物在不同温度下在DMSO/EtOH混合溶剂中的溶解度

注：过饱和＝(40mg/mL)/(31mg/mL)＝1.3

200mg化学式1化合物溶于1mLDMSO中，加热至75℃，然后加入4倍EtOH，形成浓度为40mg/mL、过饱和度为混合溶剂1.3倍(40/31)的透明过饱和溶液。基于实施例5-1的结果，以200mg化学式1/1mL DMSO的化合物为目标化合物，只有当溶解度至少为40mg/mL时才能保持高产率。因此，决定采用过饱和法。

实施例10：通过使用晶种的过饱和/重结晶方法制备晶型A的方法

3g化学式1的化合物加入15mL DMSO中并在75℃下溶解，然后使用0.45μm聚四氟乙烯膜过滤器去除异物。在75℃的恒温下，加入60mLEtOH(在这种状态确认到澄清液得以保持)，当加入2％的晶种(晶型A)时，开始观察到悬浮液。在75℃下，在15小时内缓慢添加45mLEtOH。所有结晶都是在250RPM搅拌同时进行。加入所有EtOH后，以10℃/h的速度将混合物冷却至5℃。使用0.45μmPTFE膜过滤器，然后在50℃下真空干燥21小时。如表21所示，使用晶种对化学式1的化合物进行重结晶示出出74.58％的产率和99.95％的纯度。

[表21]

化学式1的化合物重结晶的结果(3g)(实施例10，使用晶种)

注：当加入EtOH时，会出现大量沉淀。

图25示出了化学式1的化合物在每个重结晶步骤的XPRD结果，图26示出了对化学式1化合物的重结晶产物的HPLC分析结果，并且图27示出在重结晶之前的化学式1混合物及其重结晶产物。观察图27，化学式1的化合物在重结晶后从灰白色变为白色，有色杂质被去除。

实施例11：通过不使用晶种的过饱和/重结晶方法制备晶型A的方法

2g化学式1的化合物在60℃下溶解在10mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后使用0.45μm聚四氟乙烯膜过滤器去除异物。保持60℃的恒温，加入40mLEtOH，然后再搅拌30分钟(混合物变成悬浮液)。[这里，将一部分悬浮液在室温下冷却以获得固体，其XRPD测量确认到其为晶型V–图29(快速冷却)固体在室温下分离出来]在12分钟内将温度再次升高至75℃并保持恒温10分钟(仍然是悬浮液)。在1.5小时内将温度缓慢降低到50℃，测量了在60℃下形成的固体的XRPD-1。保持恒温50℃下，经15小时缓慢加入30mLEtOH。所有结晶过程都是在250RPM搅拌下进行。将混合物以10℃/h的速度冷却至5℃，并用0.45μmPTFE膜过滤器分离后测定XRPD-2，在50℃真空干燥17小时后测定XRPD-3(产率70.35％，纯度99.95％)。根据图29中的结果，每个步骤的XRPD都是晶型A。

[表22]

化学式1化合物(2g)的重结晶结果总结(实施例11，无晶种)

表22示出化学式1的化合物(2g)的重结晶结果的汇总。分析每个步骤的晶型的XRPD示出，当不使用晶种时，产率比实施例10的产率低约5％。获得具有轻微绿色的层压晶型A(aslightly green color wasobtained)。图28示出了使用不使用晶种的方法制备的晶型A的照片，图29示出了用不使用晶种的方法制备的晶型A的XRPD分析结果，图31示出使用不使用晶种的方法制备的晶型A的偏振显微镜图像，图32示出用不使用晶种的方法制备的晶型A的TGA/DSC结果，并且图33示出通过使用不使用晶种的方法制得的晶型A的粒径分布。

此外，当重结晶过程中温度突然降低，晶型V可能在重结晶工艺中充当核，导致形成无需的晶型，由此确认到监测温度控制非常重要(图29-快速冷却)。

比较实施例10和11，发现使用晶种的情况下，在产率方面更优，需要调整用作抗溶剂的EtOH的总量。

实施例12：调整实施例10中使用的抗溶剂的量(总DMSO:EtOH＝1:5)

将1g化学式1的化合物在60℃下溶解在5mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后使用0.45μm聚四氟乙烯膜过滤器去除异物。将温度升至75℃并保持30分钟，然后加入20mLEtOH，并加入2％晶种(晶型A)，此时开始观察到悬浮液。经1.5小时将温度缓慢降低至50℃并保持恒温，再经5小时缓慢添加5mLEtOH，然后在相同温度下继续搅拌5小时。所有结晶都是在300RPM搅拌下进行。以10℃/小时的速度冷却至5℃后，在相同温度下再搅拌混合物5小时。使用0.45μmPTFE膜过滤器，然后在50℃下真空干燥20小时，得到晶型A，产率为72.12％。

实施例13：调整实施例10中使用的抗溶剂的量(总DMSO:EtOH＝1:6)

将1g化学式1的化合物在60℃下溶解在5mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后使用0.45μm薄膜过滤器去除异物。将温度升至75℃并保持恒温30分钟，然后加入20mLEtOH并加入2％晶种(晶型A)，此时开始观察到悬浮液。经1.5小时将温度缓慢降低至50℃并保持恒温，再经5小时缓慢添加10mLEtOH，然后在相同温度下继续搅拌5小时。所有结晶都是在300RPM搅拌下进行。以10℃/小时的速度冷却至5℃后，在相同温度下再搅拌混合物5小时。使用0.45μmPTFE膜过滤器，然后在50℃下真空干燥20小时，得到晶型A，产率为73.28％。

总结实施例10、12和13的结果，其中，使用DMSO:EtOH＝1:7的实施例10最优。为了确认再现性，最终工艺采用30g化学式1的化合物和使用实施例10的晶种的方法。

实施例14：晶型A的最终制备方法(30g规模)

30g化学式1的化合物加入150mL二甲基亚砜(DMSO)中，并在75℃下溶解，然后使用0.45μm薄膜过滤器去除异物。在保持75℃恒温下，加入600mLEtOH(确认在这种状态下仍保持澄清溶液)，当加入2％晶种(晶型A)时，开始观察到悬浮液。在保持75℃恒温下，经15小时缓慢追加450mLEtOH。所有结晶过程是在250RPM搅拌同时进行。加入所有EtOH后，以10℃/h的速度将混合物冷却至5℃。使用0.45μm聚四氟乙烯膜过滤器获得固体，然后在50℃下真空干燥15小时。如表23(韩文为表22)所示，使用晶种对化学式1的化合物进行重结晶示出出70.35％的产率和99.96％的纯度。

对制备的晶型A进行各种分析，如XRPD、TSA/DSC、PLM、HPLC、PSM和残余溶剂的分析，结果示出在表23至24和图34至38中。图34示出使用最终制备方法产生的晶型A的XRPD分析结果，图35示出使用最后制备方法生成的晶型A的偏振光显微镜(PLM)图像，图36示出使用最初制备方法所生成的晶型A的TSA/DSC结果，图37示出使用最终制备方法产生的晶型A的粒度分布(PSD)。

[表23]

通过最终制备方法生成的晶型A的表征

注：添加EtOH时产生大量固体

晶型A的形式的特征在于X射线粉末衍射图，其包括在25±5℃的温度下在选自7.64、12.32、12.62、15.26、17.32、19.18、19.61、19.95、20.60、21.12、22.94、24.11和28.15的2[θ]值(±0.2)处的至少四个衍射峰。

[表24]

通过最终制备方法生成的晶型A(模式A)的特征XRPD峰列表

晶型A的NMR数据

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.40-1.54(m,2H),2.06(brd,J＝11.04Hz,2H),2.88(brs,4H),3.09(brd,J＝4.52Hz,4H),3.44-3.55(m,2H),3.60-3.70(m,3H),3.95(brd,J＝11.29Hz,2H),5.35(d,J＝7.78Hz,1H),6.32(s,1H)6.76(s,2H),7.24-7.36(m,1H),7.48(t,J＝7.78Hz,2H),7.80(d,J＝7.28Hz,2H),10.93(s,1H).

等温水的吸附和解吸研究(Water sorption and desorption study,DVS cycle)

使用SMSDVSAdvantage1，将10mg晶型A置于网状不锈钢篮中。整个试验周期包括在恒定温度(25℃)下，在40％至90％的范围内(每个湿度水平为60至360分钟)，以10％的相对湿度间隔扫描两次(吸附和解吸)。相对于吸附水平，大约0.7％的重量增加和吸收和损失表明试样不吸湿。图38是晶型A的等温线(重量变化％v.RH％)，以及重量变化％vs.时间和相对湿度％的动力学曲线。DVS后的XRPD分析示出晶型没有变化，这似乎是最稳定的晶型。

实施例15：评估晶型A用于制剂的适用性

实施例15-1晶型A的加压试验

将100mg晶型A置于模腔中，然后通过使用上冲头在2、3和4MPa的压力下分别压制3分钟制成片剂。研磨各片剂后的XRPD分析示出没有变化，被认为是最稳定的晶型。

实施例15-2晶型A的研磨试验

1)干磨

将30mg晶型A在研磨碗中手动研磨5分钟。XRPD分析结果示出没有变化。

2)在EtOH中湿法研磨

将30mg晶型A和40mLEtOH置于研磨碗中，并手动研磨5分钟。XRPD分析结果示出没有变化。

3)在H₂O中湿法研磨

将30mg晶型A和40mLH₂O置于研磨碗中，并手动研磨5分钟。XRPD分析结果示出没有变化。

实施例16：提高心肌细胞中细胞质和线粒体钙浓度的维持作用

为了检测心肌细胞中钙浓度的维持作用，将H9C2细胞以1.5×10⁴个细胞/孔的速度放置在96孔板中并培养24小时。为了测量细胞质钙浓度，使用FLIPR钙6测定试剂盒(Moleculardevices；#R8190)。按照制造商的实验方法，用丙磺舒(Probenecid)和钙特异性染料处理细胞，1.75小时后，将细胞处理0.25小时，使得化学式1的化合物的最终浓度为0.1、0.03、0.01、0.03和0.001μM。为了刺激细胞，用tBHP处理细胞至最终浓度为150μM，然后每30秒实时测量细胞质钙浓度。图39示出化学式1的化合物在tBHP处理条件下的钙浓度调节效果。纵轴的ΔF/F(MaxMin)值是tBHP处理后钙特异性染料荧光值的最大值和最小值之间的差值。ΔF/F值随细胞质钙浓度的增加而增加。横轴表示化学式1的浓度，并且V.C.是仅用载体处理的对照，其中当用tBHP处理时细胞质钙浓度增加最多。在用0.01μM化学式1的化合物处理细胞的情况下，由tBHP处理引起的异常增加的细胞质钙浓度降低，并且在0.1μM处理下，表现出正常水平的细胞质钙含量。

此外，为了通过细胞成像确认抑制心肌细胞中线粒体钙浓度增加的效果，将H9C2细胞以1.5×10⁴个细胞接种在35mm培养皿中并培养24小时。使用Rhod-2对线粒体中的钙浓度进行成像。用Rhod-2、MitoTrackerGreen(200nM)和Hoechst3342(2滴/ml)处理细胞50分钟，用KRB缓冲液洗涤两次，并用缓冲溶液再培养30分钟。用化学式1化合物处理细胞0.25小时至最终浓度为10μM，并用tBHP处理30分钟至最终浓度150μM。然后，用1.2μMthapsigargin处理10分钟，再用2mMCaCl2处理细胞1后，观察活细胞的线粒体中钙而产生的荧光。图40示出了与在除了tBHP之外还用thapsigargin和CaCl₂进行额外处理的条件下化学式1化合物的线粒体钙增加的效果有关的成像结果。作为实验的结果，通过Rhod-2荧光的降低观察到，化学式1的化合物有效地抑制了在用tBHP、thapsigargin和CaCl₂额外处理的条件下发生的线粒体中钙浓度的增加。通过该结果，证实了化学式1的化合物强烈抑制线粒体中钙的增加。

该实验的结果有望对与通过细胞内钙调整功能改善内质网应激和线粒体功能障碍的机制有关的疾病的预防、治疗和改善效果。

实施例17：心肌细胞中线粒体内活性氧的去除作用

为了检测心肌细胞中线粒体内活性氧的去除效果，将H9C2细胞以1.5×10⁴个细胞/孔放置在96孔板中，并培养24小时。为了测量线粒体特异性活性氧，使用二氢罗丹明-123(DHR-123)的荧光测定法。在用DHR-123提前0.5小时处理细胞后，用化学式1的化合物处理细胞0.25小时直至化学式1的化合物的最终浓度为0.0001、0.001、0.003、0.03、0.1、0.3、1、10和30μM。将tBHP添加到细胞中，最终浓度为400μM，每3分钟通过荧光强度实时测量细胞内活性氧。图41示出化学式1的化合物在tBHP处理条件下的线粒体内活性氧物种去除效果。横轴表示对数刻度上化学式1的浓度，纵轴表示tBHP处理后2小时内发生的线粒体内活性氧的总量。尽管线粒体内活性氧由于tBHP处理而急剧增加，但观察到用化学式1的化合物处理以浓度依赖的方式抑制活性氧的出现。为了通过细胞成像确认化学式1的化合物的活性氧去除效果，将H9C2细胞放置在1.5×10⁴细胞的35mm共聚焦显微镜培养板中并培养24小时。为了测量线粒体中存在的活性氧中的超氧化物，通过使用线粒体超氧化物指示剂(MitoSOXTM)使用细胞内荧光成像。

用化学式1的化合物将细胞预处理0.25小时至1μM的浓度，然后将tBHP添加到细胞中至50μM的最终浓度，然后处理1小时。用不含酚红的培养基代替细胞培养基，然后用HOECHST(0.5滴/ml)、MitoTrackerGreen(150nM)和MitoSOX(2μM)处理细胞30分钟，然后通过成像观察细胞内荧光。

图42示出了与化学式1的化合物在tBHP处理条件下的线粒体内超氧化物去除效果有关的成像结果。实验结果通过用MitoSOX处理化学式1的化合物时荧光的减少观察到化学式1化合物有效地去除线粒体内活性氧，从而确认了化学式1作为有效去除线粒体中存在的活性氧的强大抗氧化剂。

上述实验中示出的去除线粒体中活性氧的效果与细胞坏死有关，因此有望对细胞损伤和与坏死有关的疾病示出出预防、治疗和改善效果。

实施例18：去除巨噬细胞和星形胶质细胞中产生的过氧化氮的效果

为了确认巨噬细胞去除过氧化氮的效果，将RAW264.7细胞以1×105个细胞/孔接种在96孔板中并培养24小时。通过使用DAX-J2^TMPON绿色染料的荧光测量法测量过氧化氮。用DAX-J2^TMPON绿色染料预处理细胞1小时后，用化学式1的化合物和抗坏血酸作为阳性对照将细胞处理至最终浓度分别为10μM和30μM，持续5分钟。此后，使用SIN-1处理至最终浓度为200μM，并通过荧光强度实时测量每2分钟在细胞中产生的过氧化氮的量。为了确认星形胶质细胞去除过氧化氮的效果，将C8-D1A细胞以6×104个细胞/孔接种在96孔板中并培养24小时，并且在相同条件下进行实验。图43示出了在SIN-1处理条件下化学式1的化合物的细胞内过氧化氮去除效果。在图中，结果示出巨噬细胞在左边，星形胶质细胞在右边。横轴表示式1化合物和抗坏血酸的浓度，V.C是仅用载体处理的对照组，并且细胞内过氧化氮的浓度在SIN-1处理期间增加最多。纵轴表示SIN-1处理后1小时产生的过氧化氮的总量。尽管SIN-1使细胞内过氧化氮迅速增加，但通过用化学式1的化合物处理，过氧化氮的产生受到抑制，且依赖于浓度，同时表现出比阳性对照抗坏血酸更好的抑制作用。

该实验的结果，确认了化学式1的化合物对参与炎症的巨噬细胞和星形胶质细胞的过氧化氮去除作用。它有望对各种炎症性疾病(如胰腺炎、类风湿性关节炎、退变性关节炎、细菌和病毒感染、肾小球肾炎、急慢性肾病、坏死性结肠炎、肺炎、肝炎、粘膜炎等)以及老年和神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)示出出预防、治疗和改善效果，帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化症、四肢网格肌营养不良、杜兴肌萎缩等。

实施例19：MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的运动性能改善效果

MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶；1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine))是神经毒素MPP⁺(1-甲基4-苯基吡啶鎓；1-methyl-4-phenylpyridinium)的前药。当服用时，它会破坏多巴胺能神经元，并导致帕金森病症状。通过以2小时间隔向C57BL/6小鼠施用20mg/kgMPTP总共4次来诱导行为障碍。化学式1的化合物从MPTP给药后2天开始以低、中和高剂量每天腹膜内给药一次，持续6天。进行大小鼠爬杆实验(PoleTest)以确认改进化学式1化合物的行动能力的效果。图44示出了当在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中处理式1化合物时改善总时间的效果，并且图45示出了当化学式1化合物在MPTP诱发的帕金森病鼠模型中处理时T转弯改善效果。MPTP给药组的总时间和T转数值与对照组相比显著增加。此时，证实在施用式1化合物的组中，总时间和T转变时间以浓度依赖性方式恢复。

此外，进行抓握强度试验以确认化学式1化合物的行动能力改善效果。图46示出了在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中用式1的化合物处理时改善握力的效果。MPTP给药组的握力值与对照组相比显著降低。此时，证实了给予式1化合物的组中的握力值以浓度依赖性方式恢复。

实施例20：MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的多巴胺能神经元保护作用

通过以2小时间隔向C57BL/6小鼠施用20mg/kgMPTP总共4次来诱导行为障碍。化学式1的化合物从MPTP给药后2天开始以低、中和高剂量每天腹膜内给药一次，持续6天。在施用化学式1化合物后的第6天，处死小鼠，制备脑组织的冷冻切片，并进行TH(酪氨酸羟化酶；Tyrosinehydroxylase)染色。图47示出当在MPTP诱导的帕金森病的小鼠模型中处理化学式1的化合物时恢复纹状体中TH水平的效果。在纹状体中，与对照组相比，MPTP给药组的TH水平显著降低。此时，在施用化学式1化合物的组中，TH水平以浓度依赖性方式恢复，并且在中剂量和高剂量时显著增加。图48示出当在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中处理化学式1的化合物时恢复黑质中TH水平的效果。在黑质中，MPTP给药组的TH水平与对照组相比显著降低。此时，在用化学式1的化合物给药的组中，TH水平以浓度依赖性方式恢复，并且在高剂量时存在显著差异。

Claims

1.化学式1的化合物的晶型A，

[化学式1]

其中，所述晶型用X射线粉末衍射图确认，所述X射线粉末XRD图具有至少4个衍射峰，所述衍射峰的2[θ]值选自7.64±0.2、12.32±0.2、12.62±0.2、15.26±0.2、17.32±0.2、19.18±0.2、19.61±0.2、19.95±0.2、20.60±0.2、21.12±0.2、22.94±0.2、24.11±0.2和28.15±0.2。

2.根据权利要求1所述的晶型，其中，所述X射线粉末XRD图具有至少4个衍射峰，所述衍射峰的2[θ]值选自7.64±0.2、15.26±0.2、17.32±0.2、19.18±0.2、21.12±0.2和22.94±0.2。

3.根据权利要求1所述的晶型，通过X射线粉末衍射图确认，其峰位置与下表中列出的峰位置一致：

4.制备由根据权利要求1所述的化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，所述方法包括：

将化学式1的化合物与包含选自DMSO、DMF或NMP的溶剂的溶液在加热下搅拌1-24小时的步骤；和

通过在搅拌下将溶液冷却1至72小时至0至25℃来生长晶体的步骤，

[化学式1]

5.根据权利要求4所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中，通过将温度升高到50至120℃的范围来进行加热。

6.根据权利要求4所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中所述冷却以5-20℃/h的速率进行。

7.制备由根据权利要求1所述的化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，所述方法包括：

将抗溶剂添加在通过将化学式1的化合物溶解在溶剂中得到的溶液中来结晶的步骤；和

在搅拌下将溶液冷却6至48小时至0至25℃来生长晶体的步骤，

[化学式1]

8.根据权利要求7所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，所述方法还包括在添加所述抗溶剂的步骤中，添加化学式1的化合物的晶型A作为晶种。

9.根据权利要求7所述的用于制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中，所述溶剂选自DMSO、DMF或NMP。

10.根据权利要求7所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中，所述抗溶剂为乙醇或MTBE。

11.根据权利要求7所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中，溶剂的重量是化学式1化合物重量的至少2倍。

12.根据权利要求7所述的制备由化学式1所表示的化合物的晶型A的方法，其中，抗溶剂的重量是溶剂重量的至少2倍。

13.一种药物组合物，包含根据权利要求1-3中任一项所述的化学式1的化合物的晶型A和药学上可接受的载体。

14.一种药物组合物，包含根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的化学式1的化合物的晶型A和药学上可接受的载体，其用于预防或治疗细胞坏死和相关疾病，例如：急性/慢性肝病、痴呆症、帕金森氏症、亨廷顿舞蹈症、缺血性疾病、糖尿病、胰腺炎、细菌/病毒性败血症、坏死性直肠炎、囊性纤维化、类风湿性关节炎、退行性关节炎，肾病、细菌感染、病毒感染、多发性硬化症、白血病、淋巴瘤、新生儿呼吸窘迫综合征、窒息、肺结核、子宫内膜异位症、血管衰弱、银屑病、冻疮、类固醇治疗并发症、坏疽、压疮、血红蛋白尿、烧伤、高热、克罗恩病、乳糜泻、隔室综合征、脊髓损伤、肾小球肾炎、肌营养不良、支原体病、炭疽病、Andersen病、先天性线粒体病、苯丙酮尿症、胎盘梗死、梅毒、无菌性坏死；此外，由药物和有毒物质引起的坏死和相关疾病选自由以下组成的组：与酗酒、暴露于可卡因、抗生素、抗癌药物、非甾体抗炎药(NSAIDSs)；环孢菌素、化学毒素、有毒气体、农用化学品、重金属或因暴露于辐射/UV而引起的损伤及其相关坏死、急性/慢性肾脏疾病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化症、坏死性结肠炎、病毒感染、皮肤病(包括银屑病和过敏性皮炎)、器官保存/器官移植、急性肺损伤综合征/急性肺病、肺炎、肺结核、哮喘、肺动脉高压、炎症性肺病(包括慢性阻塞性肺病)、特发性肺纤维化和囊性纤维化、脱髓鞘疾病(包括脱髓鞘和肌萎缩侧索硬化症(ALS))；高血压、包括肺动脉高压、中风、朊病毒病、癫痫、共济失调、偏头痛、认知能力下降、癫痫发作、震颤、心理疾病、胰岛素抵抗、高脂血症、动脉粥样硬化、炎症性肠病(IBD)、包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、各种癌症和癌症转移、视觉障碍相关疾病、如视网膜色素变性、视神经病变、白内障、青光眼、贫血、胆汁淤积、甲状旁腺功能减退、全血细胞减少症、胰腺疾病、乳酸酸中毒、乳酸血症、听力损失、身材矮小、肠梗阻、心脏传导缺陷、心肌病、子宫内膜异位症、不孕、更年期早期、肌肉萎缩疾病、包括肢体网格肌营养不良/贝克尔肌营养不良(LGMD/BMD)和杜兴肌营养不良症(DMD)、衰老和衰老相关疾病以及粘膜炎。

15.一种组合物，包含根据权利要求1-3中任一项所述的化学式1的化合物的晶型A，所述组合物用于诱导干细胞分化为肌细胞。