WO2022180265A2 - Methode de production d'une forme periplasmique de la proteine crm197 - Google Patents

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WO2022180265A2
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Nicolas Havelange
Stéphane HUBERTY
Philippe Ledent
Christian Rodriguez
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a periplasmic form of the CRM197 protein, to the expression vector coding for the CRM197 protein and for the signal sequence, OmpC, allowing targeting of the CRM197 protein to the periplasmic space, as well as to the strain transformed by the expression vector.
  • the recombinant protein CRM197, Cross Reacting Material, or CRM can be used for example as carrier protein in conjugate vaccines.
  • a conjugate vaccine is a type of vaccine combining a weakly immunogenic antigen with a so-called "carrier" protein which has T epitopes recognized by the immune system, in order to obtain a stronger response to the antigen.
  • CRM197 is a non-toxic mutant diphtheria toxin protein.
  • hapten is one of the building blocks of an antigen which, when combined with a protein carrier, gives it sufficient antigenic potency to generate a humoral immune response.
  • the CRM197 protein is a detoxified form of diphtheria toxin where a substitution of glycine at position 52 by a glutamic acid abolishes the ADP-ribosyltransferase activity of the native toxin and renders it non-toxic.
  • the CRM197 protein comprises a single polypeptide chain of 535 amino acids, with a molecular weight of 58.4 kDa.
  • the CRM197 gene was originally cloned in Corynebacterium diphtheriae, the pathogenic bacterium causing diphtheria and containing the native toxin. Like the native toxin, CRM197 is only very weakly secreted. Consequently, considerable efforts have been made to produce the CRM197 protein in other bacteria.
  • the CRM197 protein is used as a carrier protein in several conjugate vaccines. For example, Hibtiter TM , a vaccine to protect against Haemophius influenzae type b, approved by the FDA 'Food and Drug Administration' in 1990 was the first conjugate vaccine to use the CRM197 protein as carrier protein; the hapten is a sugar.
  • the CRM197 protein also has a binding site for HB-EGF 'heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor', a member of the EGF family. As this EGF receptor is overexpressed in many cancer cells, the literature indicates that the CRM197 protein could also be used as a potential agent in targeted anti-cancer therapies. The demand for having an industrial production of the CRM197 protein is therefore growing. Unfortunately, at the production level of CRM197, it is always difficult to achieve high and stable expression levels of the CRM197 protein in the native strain. Wild-type E. coli BL21 bacteria. An insoluble form of the CMR197 protein can be produced at a relatively high level by fermentation in E.
  • the production of the CRM197 protein in an E. coli strain K12 is known from document EP3113800.
  • This document relates to a method for producing a recombinant CRM197 protein in a host cell of E. coli.
  • the method comprises incubating an E. coli strain having a reduced genome comprising an expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding the protein CRM197 operably linked to a sequence of expression control under conditions suitable for the expression of the recombinant CRM197 protein.
  • a significant increase in the yield of CRM197 is obtained in a host cell of E.
  • EP3170837 provides an improved method of producing a bacterial toxin by periplasmic expression comprising the steps of a) growing a culture of the bacterial host cell containing an expression vector in which particular signal peptide sequences are linked to the sequence of a bacterial toxin and b) inducing expression of the polypeptide containing particular signal peptide sequences bound to a bacterial toxin such that a bacterial toxin is expressed and secreted into the periplasm.
  • EP2445930 proposes a process for the production of the CRM197 protein and similar proteins, as an alternative to the use of the microorganism Corynebacterium diphtheriae. According to the procedure described in this document, the protein of interest can be obtained in large quantities both for basic research and for applications in the medical-therapeutic field.
  • EP3444269 describes an expression system for producing a diphtheria toxin polypeptide in a strain of E. coli deficient for rhamnose catabolism. This document describes an expression system comprising a rhamnose-inducible promoter sequence and an expression sequence comprising a first portion with a signal sequence and a second portion comprising the diphtheria toxin sequence.
  • the present invention provides an expression system allowing a high and stable expression yield over time and which has optimized ratios between the rate of synthesis and that of secretion of the CRM197 protein (SEQ ID NO:12) as well as a purification yield allowing commercial exploitation and provision of SEQ ID NO:12 as a protein/peptide for the subsequent development of vaccines or targeted therapies.
  • SEQ ID NO:12 the CRM197 protein
  • the inventors sought to produce SEQ ID NO: 12 in yeast, which is advantageous for the downstream purification steps; unfortunately it didn't work.
  • the inventors used plasmids with a very high copy level or with an optimal promoter, so as to allow massive synthesis of SEQ ID NO: 12 in E. coli or in its periplasmic space.
  • the present invention provides a Gram-negative prokaryotic expression vector having the following characteristics: (i) a low copy number origin of replication, the low copy number being defined by a plasmid copy number of 20 per cell or less, (ii) a promoter sequence inducible to an exogenous inducing agent, (iii) a medium strength ribosome binding site, the medium strength ribosome binding site corresponds to a sequence in mRNA modified to have reduced ribosome binding, (iv) a protein coding sequence having at least 95% identity to complete SEQ ID NO:12.
  • the inducible promoter sequence has an identity of at least 95% with respect to SEQ ID NO: 5 over the entire length and is recognized specifically by an RNA polymerase of phage T7.
  • the medium strength ribosome binding site is defined by a consensus sequence SEQ ID NO:6 or by the consensus sequence SEQ ID NO:6 comprising an addition and/or a deletion and/or a point mutation of 1 or 2 or 3 or 4 or 5 nucleotides, SEQ ID NO: 6 being located upstream of a translation initiation site.
  • the present invention also relates to a transformed strain of E. coli bacteria comprising the expression vector.
  • the E. coli BL21 T7XB strain was deposited in the name of Xpress Biologicals at the BCCM 'Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms' in Ghent on 23/12/2020 under the reference LMBP 12507.
  • a strain of E. coli BL21 bacteria defined by a deletion of the ⁇ DE3 prophage with the exception of the genes necessary for expression of the RNA polymerase of the T7 phage: E. coli BL21( ⁇ DE3) or E.
  • the present invention also relates to a method for producing in the periplasmic space a peptide having an identity of at least 95% with respect to SEQ ID NO: 12 over its entire length comprising: (i) a transformation of a strain of E. coli by a vector allowing the expression of SEQ ID NO: 12 in the periplasmic space of the transformed E. coli strain, the expression being inducible by an exogenous agent, (ii) a culture of the transformed E. coli strain at a substantially constant temperature, for example 37° C.
  • the substantially constant temperature is a temperature compatible with optimal growth metabolism of the transformed E. coli strain.
  • the E. coli strain is the BL21 strain defined by a deletion of the ⁇ DE3 prophage with the exception of the genes necessary for expression of the RNA polymerase of the T7 phage.
  • the production in the periplasmic space of a peptide having an identity of at least 95% with respect to SEQ ID NO: 12 over its entire length is ensured by an addressing signal peptide in the periplasmic space, the signal peptide having a sequence identity to SEQ ID NO:2 of at least 95%.
  • the reduced temperature is 23° C. ⁇ 0.5° C.
  • the predetermined duration of the induction phase is between 15 and 25 h, preferably between 6 and 10 p.m. and more particularly around 8 p.m. and/or the pH of the induction phase is between 6.8 and 7.5, preferably between 7.0 and 7.2.
  • the expression inducible by an exogenous agent is carried out by an on/off induction system and where the exogenous agent is isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside. Isopropyl- ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside is also known as IPTG.
  • the culture and the induction phase are devoid of antibiotics such as, for example, kanamycin, ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, or tetracycline.
  • antibiotics such as, for example, kanamycin, ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, or tetracycline.
  • the expression vector is low copy number defined by a plasmid copy number of 20 per cell or less and/or the ribosome binding sequence is of medium strength.
  • the purification of the protein SEQ ID NO:12 comprises the successive steps of: (i) clarification of the supernatant resulting from the periplasmic extraction containing the components of the periplasmic space and the protein SEQ ID NO:12 by at least a filtration step, preferably two filtration steps with recovery of a filtrate comprising SEQ ID NO: 12, optionally, (ii) a series of chromatographic steps arranged to recover SEQ ID NO:12 in a fraction to be kept and the contaminants in one or more fractions to be eliminated, (iii) optionally, an elimination of residual endotoxins, and (iv) optionally , a sterilization of the fraction comprising SEQ ID NO: 12 to be preserved, devoid of endotoxins.
  • the periplasmic extraction is a periplasmic extraction by osmotic shock.
  • the periplasmic extraction comprises the steps of: (i) suspending the pellet formed by the bacteria collected in a hypertonic solution to form a hypertonic suspension of bacteria, (ii) transferring the hypertonic suspension of bacteria into a second mixing vessel through a diffusion ring and by means of a transfer tubing and a first pump, (iii) feeding said mixing vessel with a hypotonic solution by means of a transfer tubing and a second pump, so as to cause an osmotic shock on the bacteria of the hypertonic suspension in the second mixing container, the osmotic shock allowing the release of the contents of the periplasmic space into the solution of the second mixing container, (iv) drawing off the mixture so that the residence time of the bacteria in the suspension of bacteria in the second container is between 10 seconds and one minute, more preferably around 30 seconds and that the volume of the mixture in the second container is kept constant, the withdrawal being carried out
  • the series of chromatographic steps comprises a first chromatography on anion exchange resin and a second chromatography on a hydrophobic resin.
  • the present invention finally relates to a method for selecting a signal peptide so as to optimize production of a protein of interest in the periplasmic space of the bacterium E. coli in which: - a genetic construct is generated comprising a rhamnose-inducible promoter having a sequence identity of at least 95% with respect to SEQ ID NO: 7 controlling the expression of the protein of interest arranged with the signal peptide to be tested, - the bacterium E. coli with the genetic construction, - several parallel cultures of the transformed E.
  • coli bacterium are carried out in a culture medium devoid of rhamnose, - the transformed E. coli bacterium is cultivated in the presence of a determined concentration of rhamnose so as to obtain a weak induction of the expression of the protein of interest and another culture of the bacterium E.
  • the deleterious effects on metabolism are quantified, for example, by establishing a score associated with the signal peptide and protein couple of interest where several deleterious effects are taken into account such as the loss of the plasmid, the reduction in the bacterial biomass, the formation of cytosolic aggregates or degradation products and partial cleavage of the signal peptide.
  • the signal peptide associated with this protein of interest is cleaved during transport to the periplasmic space. A partial cleavage of the signal peptide can therefore generate an undesired modification of the functionality of the protein of interest.
  • FIG. 1 shows the different stages of production by fermentation of the protein SEQ ID NO: 12.
  • FIG. 2 presents the different stages of purification of the protein SEQ ID NO:12.
  • FIG. 3 shows an expression of the protein SEQ ID NO:12 using an optical density measurement at 600 nm of the cultures of E. coli BL21 (DE3) inoculated with different expression vectors.
  • Plasmid pD431 low plasmid copy number
  • plasmid pD451 high plasmid copy number.
  • MR medium ribosome binding strength
  • SR high ribosome binding strength.
  • the strain of E. coli BL21 T7XB transformed with an expression vector pLM7-OC-CRM (step I of figure 1) is cultured at a constant temperature of 37° C. ⁇ 0.5° C. and a constant pH of 7.0 ⁇ 0 ,2. More particularly, the culture (stage II to IV of FIG. 1) of the E. coli strain BL21 T7XB transformed by the expression vector pLM7-OC-CRM at a constant temperature of 37° C.
  • stage V of figure 1 a preculture under agitation in a flask (stage II of figure 1), (ii) a growth in 'batch' mode in a bioreactor (stages III and IV of figure 1), (iii) a growth in 'fed-batch' mode in the bioreactor (stages III and IV in Figure 1).
  • the bioreactor is for example a 50L bioreactor, fed through a 0.2 ⁇ m sterilizing filter with 35L of GYPSCI medium, glycerol and yeast extract.
  • the cell pellet formed from the separated bacteria is then stored at low temperature; ex -20°C or even less (step VII of Figure 2).
  • the bacteria collected are then used as basic material for carrying out a periplasmic extraction (steps VIII and IX of FIG. 2 and see example 4).
  • a purification of the latter is carried out as described above (steps X to XIV of FIG. 2). More particularly, the series of chromatographic steps comprises a first chromatography on anion exchange resin (step XI of FIG. 2) and a second chromatography on a hydrophobic resin (step XII of FIG. 2).
  • the next filtration step is an ultrafiltration step (step XIV of FIG. 2).
  • the first step of the ultrafiltration process consists in concentrating SEQ ID NO: 12 to approximately 4.5 mg/mL and the second step in diafiltering the concentration retentate against a 10 times larger volume of formulation buffer (phosphate buffer 15 mM, 5% sucrose, pH 7.35).
  • formulation buffer phosphate buffer 15 mM, 5% sucrose, pH 7.35.
  • the 30 kDa hollow fiber was selected because it corresponds to that having the highest cut-off threshold capable of retaining SEQ ID NO: 12.
  • an additional step of elimination of residual endotoxins can be carried out (step XIII of FIG. 2), more particularly on a membrane containing in its coating groups of quaternary ammonium.
  • Example 1 Preparation of the expression vector
  • E. coli To select the vector allowing periplasmic expression by E. coli, several signal peptides were fused to the N-terminal part of SEQ ID NO: 12 within an inducible vector to rhamnose. After transformation of E. coli BL21 (DE3) by these different combinations, the expression of SEQ ID NO: 12 in each clone was evaluated by immunoblot analysis for different rhamnose concentrations, and therefore for different levels of induction .
  • a selection matrix was constituted in order to select the signal peptide-SEQ ID NO:12 combinations which will then be tested for their expression after induction with IPTG.
  • Table 1 shows the attribution of the scores as well as the cumulative scores, calculated by multiplying the scores obtained for the three criteria and for the three levels of induction. The highest cumulative score represents the construct expressing the greatest quantity of periplasmic SEQ ID NO:12, in the absence of cytoplasmic SEQ ID NO:12, without degradation or aggregation. If the score of the TorT-SEQ ID NO:12 construct is significantly higher than for the other variants, except at 11 mM, the cleavage of the signal peptide during secretion leaves an additional alanine residue at the beginning of the N- end.
  • SEQ ID NO: 12 The identity of the SEQ ID NO: 12 produced is not 100%, which led the inventors to discard this variant.
  • Two candidates were selected for screening for vectors inducible to IPTG: SEQ ID NO:9 – SEQ ID NO:12 (OmpA-CRM197) and SEQ ID NO:2 – SEQ ID NO:12 (OmpC-CRM197).
  • Table 1 Matrix used to select signal peptide-SEQ ID NO:12 (CRM197) combinations
  • Figure 3 shows, for eight different expression systems in terms of plasmid copy number ( ⁇ 20 and ⁇ 500 copies), ribosome binding strength (average binding following a modification of the mRNA sequence and binding forte) as well as the signal peptide SEQ ID NO: 2 (OmpC) and SEQ ID NO: 9 (OmpA), that the OD600 of the cultures induced for 4 h with IPTG are much lower than those non-induced or auto- lactose-induced.
  • the optical density at 600 nm of the culture medium in the flask, OD600 is measured by spectrophotometry according to a standard protocol well known to those skilled in the art for measuring the optical density and taking into account a blank measurement corresponding to the optical density of culture medium without bacteria.
  • the inventors conclude from this that the SEQ ID NO: 12 produced too quickly and too much is toxic and/or that its synthesis represents a substantial metabolic load for the bacterium, thereby slowing down bacterial growth.
  • This result demonstrates the importance of dissociating the biomass production and expression phases of SEQ ID NO: 12 and of inducing expression in a sufficiently slow and controlled manner, in order to avoid any phenomenon of toxicity, overload metabolic and/or saturation of the secretory pathways.
  • coli BL21(DE3) were selected for the final selection carried out in a 5L bioreactor, a bioreactor representative of the conditions used for production on an industrial scale: BL21(DE3)/pD431-MR-OmpC-CRM197 (also called BL21(DE3) / pLM7-OC-CRM) which has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 10 and BL21(DE3)/pD451-SR-OmpC-CRM197 (also called BL21(DE3)/pHS7-OC-CRM) which has a nucleotide sequence SEQ ID NO: 11.
  • the first system of expression comprises elements ensuring slow expression of SEQ ID NO: 12 (low number of plasmid copies, medium binding to the ribosome) avoiding any phenomenon of toxicity, metabolic overload and/or saturation of the secretory pathways while the second includes elements in favor of a rapid expression of the protein (high number of copies of plasmid, strong binding to the ribosome).
  • the second vector was nevertheless selected in anticipation of low plasmid stability.
  • the expression levels of the two expression systems (BL21(DE3)/pLM7-OC-CRM and BL21(DE3)/pHS7-OC-CRM) were compared under conditions representative of industrial conditions.
  • a condition which combines the expression of the highest SEQ ID NO: 12 and high plasmid stability involves low plasmid copy number, medium ribosome attachment, and temperature upon induction of 23° C., which corresponds to a set of factors allowing slow and controlled expression of SEQ ID NO: 12.
  • condition F03 The conditions leading to the weakest expression (condition F03) or to the weakest plasmid stability (condition F06) involve a high plasmid copy number and strong ribosome binding, a factor leading to rapid expression of SEQ ID NO:12 and responsible for phenomena of toxicity, metabolic overload and/or saturation of the secretory pathways.
  • Table 2 Expression levels and plasmid stabilities in 5L reactor - Strain E. colt BL21 (DE3)
  • Example 2 Preparation of the bacterial strain containing the expression vector
  • Three bacterial strains were transformed with different vectors containing SEQ ID NO:12 fused to the signal peptide SEQ ID NO:2 (OmpC): ⁇ E. coli BL21, a strain characterized by the absence of the ⁇ DE3 prophage and by the use bacterial polymerase T5 whose transcription efficiency does not reach that of prophage T7 polymerase;
  • E. coli BL21 ⁇ DE3 or E. coli BL21 T7XB, a proprietary strain characterized by the deletion of the prophage sequence, with the exception of the genes necessary for the expression of the T7 polymerase.
  • Table 3 compares the different expression systems involving the three strains tested (E. coli BL21, E. coli BL21 (DE3) and E. coli BL21 T7XB) in terms of plasmid copy number, type of promoter (T5 or T7) and ribosome binding strength (medium and strong) as well as the results obtained during the microplate cultures (OD 600 and cytoplasmic expression level of SEQ ID NO: 12).
  • E. coli BL21 ⁇ DE3
  • E. coli BL21 T7XB a proprietary strain characterized by the deletion of the prophage sequence, with the exception of the genes necessary for the expression of the T7 polymerase.
  • Table 3 compares the different expression systems involving the three strains tested (E. coli BL21
  • coli BL21 bacteria characterized by a lower efficiency of bacterial polymerase T5, bacterial growths (OD 600 ) are not significantly (or little) impacted during induction with IPTG whereas that the expression levels evaluated by immunoblot analysis are low with the exception of that obtained for the strain transformed by a vector involving a high copy number and a strong binding to the ribosome.
  • An absence of toxicity on bacterial growth and a significant expression are observed during induction with IPTG for the E coli BL21 (DE3) strain transformed by a plasmid involving a low number of copies and an average binding to the ribosome; all other constructs being subject to toxicity and/or low expression.
  • the results obtained for the E. coli BL21 T7XB strain are similar to those obtained for the E. coli BL21 (DE3) strain.
  • the expression levels as well as the plasmid stabilities were determined for the three bacterial strains (E. coli BL21, E. coli BL21 (DE3) and E. coli BL21 T7XB transformed with different vectors containing SEQ ID NO: 12 fused to the signal peptide SEQ ID NO: 2 under conditions representative of industrial conditions
  • the cultures were carried out in 5 L fermenters which are designed, used and controlled in an identical manner to industrial production fermenters, in particular in terms of the agitation and aeration cascade.
  • the cultures reach high cell densities through the adoption of “fed-batch” type feeding strategies.
  • Expression levels, plasmid stabilities recorded for the different constructs and the conditions tested are summarized in Table 4.
  • the four constructions involving the strain E coli BL21 characterized by the lower efficiency of the bacterial polymerase T5 presents levels of express high ions between 1.02 and 2.46 g/L and high plasmid stability (between 97 and 100%), whatever the number of plasmid copies and the ribosome binding strength.
  • E coli BL21 (DE3) strain only constructs involving a low plasmid copy number and medium ribosome binding exhibit high expression levels between 1.00 and 3.10 g/L and plasmid stability. high (between 94 and 100%).
  • coli BL21 (T7XB) strain characterized by the deletion of the prophage sequence, with the exception of the genes necessary for the expression of polymerase 17, a high level of expression (1.62 g/L) and high plasmid stability (97%) are recorded for the construction involving low plasmid copy number and medium ribosome binding while low expression level (0.62 g/L) and low plasmid stability ( 23%) are observed with the strain transformed by a vector implying a low plasmid copy number and a strong binding to the ribosome.
  • Table 4 Expression levels and plasmid stabilities in a 5L reactor: E. coli BL21, E. coli BL21 (DE3) and E. coli BL21 T7XB strains
  • E. coli BL21 T7XB strain characterized by the deletion of the prophage sequence, with the exception of the genes necessary for the expression of the T7 polymerase, was retained for the production of SEQ ID NO: 12.
  • the inventors have determined that controlling expression in the presence of an expression system based on bacterial T5 RNA polymerase (E coli BL21), sometimes leads to leakage phenomena and less robustness. and, on the other hand, that the presence of the ⁇ DE3 prophage in the E. coli BL21 (DE3) strain presents a potential reactivation of the lytic cycle and therefore a non-negligible industrial risk.
  • telomere length is a parameter that influences the expression of the CRM197 protein.
  • telomere length is a parameter that influences the expression of the CRM197 protein.
  • Too high an expression level can generate strong cytoplasmic production of the CRM1 97 protein, in insoluble form, reduce cell viability, without generating significant periplasmic production.
  • Step 1 Preculture in flask Flask volume: 500 ml to 2 L, inoculation OD 600 : 0.005, culture medium: YGP, kanamycin: 25 mg/L, temperature: 37°C, agitation: 270 rpm, culture duration: 7h +/- 1 h.
  • step 4 induction phase
  • step 4 induction phase
  • the temperature applied during the induction is a parameter that has a weak impact on the level of expression but not on the plasmid stability (comparison of the conditions FO1 and F02).
  • the pH is a parameter that significantly impacts the level of expression and, to a lesser extent, the plasmid stability; a pH of 6.5 being less favorable while a pH of 7.0 is optimal for these two criteria.
  • the absence of kanamycin, a decrease in temperature from 28 to 23°C during induction and a pH of 7.0 kept constant throughout the culture stages allow a good production yield of SEQ ID NO: 12.
  • Table 5 Expression levels and plasmid stabilities in a 51 reactor: impact of kanamycin, temperature and pH
  • the E. coli BL21 T7XB bacteria transformed with the vector pLM7-OC-CRM (SEQ ID NO: 10) are centrifuged and the cell pastes are frozen at -20°C.
  • the periplasmic extraction starts by thawing the 1350 g cell pastes for 15h +/- 5h at 6°C +/- 2°C.
  • Cell pastes are diluted 2:1 (v/w) in a hypertonic solution (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0), mixed for 15 min and pumped with 'a first pump in a mixer through a diffusion ring whose flow is 121 ml/min.
  • An osmotic shock of the cell suspension is then carried out thanks to a dilution of the cell suspension contained in the mixer using a hypotonic solution (MgCl 2 5 mM) which is pumped with a second pump in the mixer containing the suspension cell with a flow of 279 ml/min and a dilution ratio of 2.3:1 (v/v) of hypotonic solution.
  • the temperature of the hypotonic solution is between 4 and 8°C.
  • the volume of the cell suspension in the mixer is 200 ml and the residence time of the cell suspension in the mixer is 30 sec.
  • a third pump ensures the extraction of the cell suspension from the mixer, which is collected in centrifuge pots, at a flow rate of 400 ml/min so as to maintain a constant cell suspension volume of 200 ml in the mixer.
  • a 1350g weight of cell paste yields approximately 13.4 liters of osmotic shocked cell suspension.
  • Example 5 Clarification of the supernatant containing the components of the periplasmic space and SEQ ID NO: 12
  • the clarification of the supernatant resulting from the centrifugation of the cell suspension after osmotic shock (see example 4) consists of two serial filtration steps .
  • the supernatant is pumped with a flow rate of 400 ml/min through a filter whose mesh size is 0.8-0.45 ⁇ m and whose area is 0.2 m 2 .
  • the solution filtered for the first time is then pumped with a flow rate of 400 ml/min through a second filter whose mesh size is 0.45 - 0.22 ⁇ m and whose area is 0.1 m 2 , which makes it possible to obtain a solution containing a clarified periplasmic extract.

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de production d'une forme périplasmique de la SEQ ID NO :12, au vecteur d'expression codant pour la SEQ ID NO :12 et pour la séquence signal, SEQ ID NO :2, permettant le ciblage de SEQ ID NO :12 vers l'espace périplasmique, ainsi qu'à la souche transformée par le vecteur d'expression.

Description

METHODE DE PRODUCTION D’UNE FORME PERIPLASMIQUE DE LA PROTEINE CRM197 La présente invention se rapporte à une méthode de production d’une forme périplasmique de la protéine CRM197, au vecteur d’expression codant pour la protéine CRM197 et pour la séquence signal, OmpC, permettant le ciblage de la protéine CRM197 vers l’espace périplasmique, ainsi qu’à la souche transformée par le vecteur d’expression. La protéine recombinante CRM197, Cross Reacting Material, ou CRM, peut être utilisée par exemple comme protéine porteuse dans les vaccins conjugués. Un vaccin conjugué est un type de vaccin combinant un antigène faiblement immunogène avec une protéine dite « porteuse » qui possède des épitopes T reconnus par le système immunitaire, afin d’obtenir une réponse plus forte à l’antigène. La CRM197 est une protéine mutante non-toxique de la toxine diphtérique. Elle est utilisée comme protéine porteuse pour des haptènes tels que des polysaccharides de manière à permettre une réponse immunogène. Un haptène est l’un des éléments constitutifs d’un antigène qui, lorsqu’il est combiné avec un porteur protéique, lui confère un pouvoir antigénique suffisant pour générer une réponse immunitaire humorale. La protéine CRM197 est une forme détoxifiée de la toxine diphtérique où une substitution de la glycine à la position 52 par un acide glutamique abolit l’activité ADP-ribosyltransférase de la toxine native et la rend non toxique. La protéine CRM197 comporte une chaîne polypeptidique simple de 535 acides aminés, d’un poids moléculaire de 58.4 kDa. Le gène de la CRM197 a été initialement cloné dans Corynebacterium diphtheriae, la bactérie pathogène provoquant la diphtérie et contenant la toxine native. Comme la toxine native, la CRM197 n’est que très faiblement sécrétée. En conséquence, des efforts conséquents ont été consentis pour produire la protéine CRM197 dans d’autres bactéries. Aujourd’hui, la protéine CRM197 est utilisée comme protéine porteuse dans plusieurs vaccins conjugués. A titre d’exemple, HibtiterTM, un vaccin pour protéger contre Haemophius influenzae type b, approuvé par la FDA ‘Food and Drug Administration’ en 1990 était le premier vaccin conjugué à utiliser la protéine CRM197 comme protéine porteuse ; l’haptène est un sucre. La protéine CRM197 possède également un site de liaison pour HB-EGF ‘heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor’, un membre de la famille EGF. Comme ce récepteur EGF est surexprimé dans de nombreuses cellules cancéreuses, la littérature indique que la protéine CRM197 pourrait également être utilisée comme agent potentiel dans des thérapies ciblées anti- cancéreuses. La demande pour disposer d’une production industrielle de la protéine CRM197 est donc de plus en plus grande. Malheureusement, au niveau de la production de la CRM197, il est toujours difficile d’atteindre des niveaux d’expression élevés et stables de la protéine CRM197 dans la souche native sauvage de la bactérie E. coli BL21. Une forme insoluble de la protéine CMR197 peut être produite à un niveau relativement élevé par fermentation dans E. coli, mais seulement une très faible fraction de cette forme insoluble de la protéine peut être convertie en forme soluble. La production de la protéine CRM197 dans une souche K12 de E. coli est connue du document EP3113800. Ce document concerne un procédé de production d'une protéine CRM197 recombinante dans une cellule hôte d'E. coli. Dans plusieurs modes de réalisation, le procédé comprend l'incubation d’une souche de E. coli possédant un génome réduit comprenant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine CRM197 liée de manière fonctionnelle à une séquence de contrôle d'expression dans des conditions appropriées pour l'expression de la protéine CRM197 recombinante. Une augmentation significative du rendement de CRM197 est obtenue dans une cellule hôte d'E. coli à génome réduit selon ce document EP3113800 par rapport à la production dans des souches d'E. coli de type sauvage telles que BL21. Le document EP3170837 propose un procédé amélioré de production d'une toxine bactérienne par expression périplasmique comprenant les étapes de a) croissance d'une culture de la cellule hôte bactérienne contenant un vecteur d'expression dans lequel des séquences de peptide signal particulières sont liées à la séquence d'une toxine bactérienne et b) induction de l'expression du polypeptide contenant des séquences de peptide signal particulières liées à une toxine bactérienne de telle sorte qu'une toxine bactérienne est exprimée et sécrétée dans le périplasme. Le document EP2445930 propose un procédé de production de la protéine CRM197 et de protéines similaires, en alternative à l'utilisation du micro-organisme Corynebacterium diphtheriae. Selon le mode opératoire décrit dans ce document, la protéine d'intérêt peut être obtenue en grandes quantités à la fois pour la recherche fondamentale et pour des applications dans le domaine médico-thérapeutique. Le document EP3444269 décrit un système d’expression pour produire un polypeptide de la toxine diphtérique dans une souche de E. coli déficiente pour le catabolisme du rhamnose. Ce document décrit un système d’expression comprenant une séquence promotrice inductible au rhamnose et une séquence d’expression comprenant une première portion avec une séquence signal et une deuxième portion comprenant la séquence de la toxine diphtérique. Le document WO2011/126811A2, quant à lui, décrit une méthode de production d’une protéine recombinante chez Pseudomonas. Philippe Goffin et col., Biotechnol. J. 2017, 12, 1700168, DOI 10.1002/biot.201700168, ont également montré qu’un découplage entre la croissance du microorganisme et la production de la protéine CRM197 peut favoriser la production périplasmique de la protéine CRM197. Malheureusement, bien que certains documents vantent les mérites de leur technologie, il n’existe actuellement pas sur le marché une méthode pour produire la CRM197 qui soit exploitable aisément et qui soit industriellement rentable, quelle que soit l’échelle de production industrielle. Il existe donc un besoin de disposer d’un vecteur alternatif et d’une souche alternative transformée par ce vecteur qui permettent un niveau d’expression élevé et stable de la forme soluble de la protéine CRM197 et une méthode de purification simple de la protéine CRM197 de manière à pouvoir en permettre un usage industriel accessible à l’ensemble du marché. En effet, face à la demande globale grandissante de la protéine CRM197, une problématique récurrente avec la production de cette protéine est d’obtenir à la fois un rendement de production élevé et stable dans le temps qui soit le plus simple possible afin d’atteindre des coûts de production permettant une accessibilité à l’ensemble du marché. Pour pallier ces inconvénients et difficultés, la présente invention procure un système d’expression permettant un rendement d’expression élevé et stable dans le temps et qui présente des rapports optimisés entre la vitesse de synthèse et celle de sécrétion de la protéine CRM197 (SEQ ID NO :12) ainsi qu’un rendement de purification permettant une exploitation commerciale et une mise à disposition de la SEQ ID NO :12 comme protéine/peptide pour la mise au point ultérieure de vaccins ou thérapie ciblées. Tout d’abord, les inventeurs ont cherché à produire la SEQ ID NO :12 chez la levure, ce qui est avantageux pour les étapes de purifications en aval ; malheureusement, cela n’a pas fonctionné. De même, les inventeurs ont utilisé des plasmides avec un très haut niveau de copie ou avec un promoteur optimal, de manière à permettre une synthèse massive de SEQ ID NO :12 dans E. coli ou dans son espace périplasmique. Ceci n’a pas fonctionné. Après les différentes étapes préliminaires, les inventeurs ont conclu qu’il fallait un système d’expression dans l’espace périplasmique d’E. coli, mais avec un niveau bien calibré, suffisamment élevé pour qu’il soit utilisable à large échelle, mais pas trop élevé pour éviter les agrégations dans E. coli. A cette fin, en ayant identifié les nombreux problèmes ci-dessus, les inventeurs ont activement recherché les meilleures conditions de culture et de production, y compris les meilleures constructions génétiques (contrôle de la transcription, contrôle de la traduction, séquence d’adressage périplasmique). Plus particulièrement, la présente invention procure un vecteur d’expression chez un procaryote Gram négatif possédant les caractéristiques suivantes : (i) une origine de réplication à faible nombre de copies, le faible nombre de copies étant défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins, (ii) une séquence promotrice inductible à un agent inducteur exogène, (iii) un site de liaison au ribosome d’une force moyenne, le site de liaison au ribosome d’une force moyenne correspond à une séquence en ARNm modifiée pour avoir une fixation au ribosome réduite, (iv) une séquence codant pour une protéine ayant une identité d’au moins 95% par rapport à SEQ ID NO :12 complète. (v) une séquence codant pour un peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d’au moins 95%, le peptide signal étant agencé pour permettre un adressage de la SEQ ID NO :12 vers un espace périplasmique. De manière avantageuse, le résidu acide glutamique à la position 52 de SEQ ID NO :12 est maintenu. En effet, une mutation remplaçant la glycine native de SEQ ID NO :12 à la position 52 par un acide glutamique assure un peptide SEQ ID NO :12 détoxifié. De manière particulièrement avantageuse, la séquence promotrice inductible présente une identité d’au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :5 sur toute la longueur et est reconnue spécifiquement par une ARN polymérase du phage T7. De manière favorable, le site de liaison au ribosome d’une force moyenne est défini par une séquence consensus SEQ ID NO :6 ou par la séquence consensus SEQ ID NO :6 comprenant un ajout et/ou une délétion et/ou une mutation ponctuelle de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 nucléotides, la SEQ ID NO :6 étant localisée en amont d’un site d’initiation de la traduction. La présente invention se rapporte aussi à une souche transformée de bactéries E. coli comprenant le vecteur d’expression. La souche E. coli BL21 T7XB a été déposée au nom de Xpress Biologicals au BCCM ‘Belgian Co-ordinated Collections of Micro- organisms’ de Gand le 23/12/2020 sous la référence LMBP 12507. La souche transformée de bactéries E. coli BL21 T7XB avec le vecteur d’expression qui comporte une origine de réplication à faible nombre de copies, défini par un nombre de copies du plasmide compris entre 1 et 20 par cellule, et un site de liaison au ribosome d’une force moyenne, c’est-à-dire ayant une séquence en ARNm modifiée de façon à ce que la fixation au ribosome soit réduite, permet d’obtenir un très bon rapport entre le niveau d’expression et de sécrétion de la SEQ ID NO :12 et assure un rendement de production élevé tout en étant stable dans le temps. De préférence, une souche de bactéries E. coli BL21 définie par une délétion du prophage ^DE3 à l’exception des gènes nécessaires à une expression de l’ARN polymérase du phage T7 : E. coli BL21(ΔDE3) ou E. coli BL21 T7XB. En effet, cette délétion présente les avantages de ne pas présenter de risque de réactivation du prophage, d’offrir une grande flexibilité pour la production sans risque de contamination croisée et d’apporter une grande stabilité plasmidique. La présente invention se rapporte également à un procédé de production dans l’espace périplasmique d’un peptide ayant une identité d’au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur comprenant : (i) une transformation d’une souche de E. coli par un vecteur permettant l’expression de la SEQ ID NO :12 dans l’espace périplasmique de la souche E. coli transformée, l’expression étant inductible par un agent exogène, (ii) une culture de la souche E. coli transformée à une température substantiellement constante, par exemple de 37°C ± 1°C, et un pH constant dans des conditions où la SEQ ID NO :12 n’est pas synthétisée par la souche E. coli transformée, (iii) une phase d’induction pendant une durée prédéterminée en présence de l’agent exogène et à une température réduite pour synthétiser et sécréter SEQ ID NO :12 dans l’espace périplasmique de manière lente et contrôlée, avantageusement afin de réduire des phénomènes de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion, (iv) optionnellement une récolte de la culture après la phase d’induction et après refroidissement, par exemple à 15°C ± 0,5°C, (v) optionnellement une collecte des bactéries cultivées contenant SEQ ID NO :12 dans l’espace périplasmique, (vi) optionnellement une extraction périplasmique de la SEQ ID NO :12 avec une séparation d’un culot solide contenant les bactéries et un surnageant contenant les éléments de l’espace périplasmique et la SEQ ID NO :12, et (vii) optionnellement une purification de la protéine SEQ ID NO :12. La présente invention procure donc un procédé de production de SEQ ID NO :12 optimisée pour une expression stable et suffisante où la température et le pH restent substantiellement constants durant toute la phase d’induction, ce qui simplifie la méthode de production, minimise les risques d’erreurs et assure également un rendement optimal au niveau des coûts de production. La température substantiellement constante est une température compatible avec un métabolisme de croissance optimale de la souche E. coli transformée. De manière préférée, la souche E. coli est la souche BL21 définie par une délétion du prophage λDE3 à l’exception des gènes nécessaires à une expression de l’ARN polymérase du phage T7. Avantageusement, la production dans l’espace périplasmique d’un peptide ayant une identité d’au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur est assurée par un peptide signal d’adressage dans l’espace périplasmique, le peptide signal présentant une identité de séquence à la SEQ ID NO :2 d’au moins 95%. Préférentiellement, la température réduite est de 23°C ± 0,5°C et/ou la durée prédéterminée de la phase d’induction est comprise entre 15 et 25 h, de préférence comprise entre 18 et 22 heures et plus particulièrement autour de 20h et/ou le pH de la phase d’induction est compris entre 6,8 et 7,5, de préférence entre 7,0 et 7,2. De manière préférée, l’expression inductible par un agent exogène est réalisée par un système d’induction marche/arrêt et où l’agent exogène est l’isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside. L’isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside est également connu sous le nom d’IPTG. Avantageusement, la culture et la phase d’induction sont dépourvues d’antibiotiques telles que par exemple la kanamycine, l’ampicilline, la streptomycine, le chloramphénicol, ou la tétracycline. Préférentiellement, le vecteur d’expression est à faible nombre de copie défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins et/ou la séquence de liaison au ribosome est de force moyenne. Avantageusement, la purification de la protéine SEQ ID NO :12 comprend les étapes successives de : (i) une clarification du surnageant issu de l’extraction périplasmique contenant les composants de l’espace périplasmique et la protéine SEQ ID NO :12 par au moins une étape de filtration, de préférence deux étapes de filtration avec une récupération d’un filtrat comprenant SEQ ID NO :12, optionnellement, (ii) une série d’étapes chromatographiques agencées pour récupérer SEQ ID NO :12 dans une fraction à conserver et les contaminants dans une ou plusieurs fractions à éliminer, (iii) optionnellement, une élimination d’endotoxines résiduelles, et (iv) optionnellement, une stérilisation de la fraction comprenant SEQ ID NO :12 à conserver, dépourvue d’endotoxines. Avantageusement, l’extraction périplasmique est une extraction périplasmique par choc osmotique. De préférence, l’extraction périplasmique comprend les étapes de : (i) une mise en suspension du culot formé par les bactéries collectées dans une solution hypertonique pour former une suspension hypertonique de bactéries, (ii) un transfert de la suspension hypertonique de bactéries dans un deuxième récipient de mélange au travers d’un anneau de diffusion et au moyen d’une tubulure de transfert et d’une première pompe, (iii) une alimentation dudit récipient de mélange par une solution hypotonique au moyen d’une tubulure de transfert et d’une deuxième pompe, de manière à provoquer un choc osmotique sur les bactéries de la suspension hypertonique dans le deuxième récipient de mélange, le choc osmotique permettant la libération du contenu de l’espace périplasmique dans la solution du deuxième récipient de mélange, (iv) un soutirage du mélange de manière à ce que le temps de séjour des bactéries de la suspension de bactéries dans le deuxième récipient soit compris entre 10 secondes et une minute, plus préférentiellement autour de 30 secondes et que le volume du mélange dans le deuxième récipient soit maintenu constant, le soutirage étant réalisé par une tubulure et une troisième pompe péristaltique. Préférentiellement, la série d’étapes chromatographiques comprend une première chromatographie sur résine échangeuse d’anions et une deuxième chromatographie sur une résine hydrophobe. La présente invention se rapporte enfin à une méthode de sélection d’un peptide signal de manière à optimiser une production d’une protéine d’intérêt dans l’espace périplasmique de la bactérie E. coli dans lequel : - on génère une construction génétique comprenant un promoteur inductible au rhamnose ayant une identité de séquence d’au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :7 contrôlant l’expression de la protéine d’intérêt agencée avec le peptide signal à tester, - on transforme la bactérie E. coli avec la construction génétique, - on réalise plusieurs cultures parallèles de la bactérie E. coli transformée dans un milieu de culture dépourvu de rhamnose, - on cultive la bactérie E. coli transformée en présence d’une concentration déterminée de rhamnose de manière à obtenir une induction faible de l’expression de la protéine d’intérêt et une autre culture de la bactérie E. coli transformée en présence d’une autre concentration déterminée de rhamnose de manière à obtenir une induction forte de l’expression de la protéine d’intérêt et, - on compare l’abondance de la protéine d’intérêt dans l’espace périplasmique et, optionnellement, on quantifie les effets délétères au métabolisme sélectionnés parmi le groupe constitué de la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d’agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation, un clivage partiel du peptide signal et, - on sélectionne le peptide signal en fonction de l’abondance de la protéine d’intérêt dans l’espace périplasmique et, optionnellement, en rejetant les peptides signaux associés aux effets délétères trop importants. Les effets délétères au métabolisme sont quantifiés par exemple par un établissement d’un score associé au couple peptide signal et protéine d’intérêt où plusieurs effets délétères sont pris en compte comme la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d’agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation et un clivage partiel du peptide signal. Dans un processus normal d’expression périplasmique d’une protéine d’intérêt, le peptide signal associé à cette protéine d’intérêt est clivé lors du transport vers l’espace périplasmique. Un clivage partiel du peptide signal peut donc engendrer une modification, non désirée, de la fonctionnalité de la protéine d’intérêt. D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins annexés. La figure 1 présente les différentes étapes de production par fermentation de la protéine SEQ ID NO :12. La figure 2 présente les différentes étapes de purification de la protéine SEQ ID NO :12. La figure 3 montre une expression de la protéine SEQ ID NO :12 à l’aide d’une mesure de densité optique à 600 nm des cultures de E. coli BL21 (DE3) inoculées par différents vecteurs d’expression. Plasmide pD431: faible nombre de copies de plasmides, plasmide pD451: nombre élevé de copies de plasmides. MR: force de fixation moyenne au ribosome, SR: force de fixation élevée au ribosome. Type d’induction: cultures non-induites (colonnes avec points noirs), induites à l’IPTG (colonnes avec lignes verticales) ou auto-induites au lactose (colonnes avec lignes horizontales). Les 3 dernières colonnes sur la droite: contrôles positifs dans les mêmes conditions d’induction. La souche d’E. coli BL21 T7XB transformée par un vecteur d’expression pLM7-OC-CRM (étape I de la figure 1) est mise en culture à température constante de 37°C ± 0,5°C et un pH constant de 7,0 ± 0,2. Plus particulièrement, la culture (étape II à IV de la figure 1) de la souche E. coli BL21 T7XB transformée par le vecteur d’expression pLM7-OC-CRM à une température constante de 37°C ± 0,5°C puis, lors de l’induction (étape V de la figure 1), à une température constante de 23 ± 0,5°C et un pH constant de 7,0 ± 0,2 comporte 3 étapes successives : (i) une préculture sous agitation en flacon (étape II de la figure 1), (ii) une croissance en mode ‘batch’ dans un bioréacteur (étapes III et IV de la figure 1), (iii) une croissance en mode ‘fed-batch’ dans le bioréacteur (étapes III et IV de la figure 1). Le bioréacteur est par exemple un bioréacteur de 50L, alimenté à travers un filtre stérilisant de 0,2 µm avec 35L de milieu GYPSCI, du glycérol et de l’extrait de levure (yeast extract). La croissance en mode « fed-bacth » dans le bioréacteur se déroule avec un apport d’oxygène de telle manière qu’un taux d’oxygène dissous soit supérieur ou égal à 30% de saturation, et sous agitation constante. Tant la culture en mode « batch » que « fed-batch » est réalisée de préférence en présence d’un agent anti-moussant. Une fois que l’expression induite de la SEQ ID NO :12, codée par le vecteur pLM7-OC-CRM, et la sécrétion de la SEQ ID NO :12 dans l’espace périplasmique sont terminées, la culture est alors récoltée après refroidissement à 15°C ± 0,5°C (étapes VI et VII de la figure 1). La culture est suivie d’une collecte des bactéries contenant SEQ ID NO :12 dans l’espace périplasmique par centrifugation (étape VII de la figure 1). Concernant la purification de la SEQ ID NO :12, le culot cellulaire formé des bactéries séparées est ensuite stocké à basse température ; ex -20°C ou encore moins (étape VII de la figure 2). Les bactéries collectées sont ensuite utilisées comme matériel de base pour la réalisation d’une extraction périplasmique (étapes VIII et IX de la figure 2 et voir exemple 4). A partir du surnageant clarifié contenant les éléments de l’espace périplasmique et la SEQ ID NO :12, une purification de celle-ci est effectuée comme décrite ci- avant (étapes X à XIV de la figure 2). Plus particulièrement, la série d’étapes chromatographique comprend une première chromatographie sur résine échangeuse d’anions (étape XI de la figure 2) et une deuxième chromatographie sur une résine hydrophobe (étape XII de la figure 2). Avantageusement, l’étape suivante de filtration est une étape d’ultrafiltration (étape XIV de la figure 2). La première étape du procédé d’ultrafiltration consiste à concentrer la SEQ ID NO :12 à environ 4,5 mg/mL et la seconde étape à diafiltrer le rétentat de concentration contre un volume 10 fois plus important de tampon de formulation (tampon phosphate 15 mM, sucrose 5%, pH 7,35). La fibre creuse de 30 kDa a été retenue car elle correspond à celle présentant le seuil de passage ‘cut-off’ le plus élevé pouvant retenir la SEQ ID NO :12. Si l’on veut améliorer la pureté de la SEQ ID NO :12, une étape additionnelle d’élimination d’endotoxines résiduelles peut être effectuée (étape XIII de la figure 2), plus particulièrement sur une membrane contenant dans son enrobage des groupements d’ammonium quaternaire. Exemples illustratifs. Exemple 1.- Préparation du vecteur d’expression Pour sélectionner le vecteur permettant l’expression périplasmique par E. coli, plusieurs peptides signaux ont été fusionnés à la partie N-terminale de la SEQ ID NO :12 au sein d’un vecteur inductible au rhamnose. Après transformation de E. coli BL21(DE3) par ces différentes combinaisons, l’expression de la SEQ ID NO :12 dans chaque clone a été évaluée par une analyse immunoblot pour différentes concentrations en rhamnose, et par conséquent pour différents niveaux d’induction. Trois critères ont été pris en compte pour sélectionner des combinaisons SEQ ID NO :12 - peptide signal (CRM197-peptide signal) qui seront ensuite testées pour leur expression après induction à l’IPTG : (1) intensité de la bande correspondant à la SEQ ID NO :12 et présentant un poids moléculaire apparent de ~58 kDa, (2) absence ou faible proportion de la SEQ ID NO :12 possédant toujours le peptide signal (poids moléculaire apparent de ~60 kDa) traduisant une saturation de la voie de sécrétion, (3) absence ou faible présence de produits issus d’agrégation ou de dégradation (bandes présentant des poids moléculaires apparents supérieurs à 97 kDa ou compris entre 14 et 58 kDa). Une matrice de sélection a été constituée afin de sélectionner les combinaisons peptide signal-SEQ ID NO :12 qui seront ensuite testées pour leur expression après induction à l’IPTG. Le tableau 1 reprend l’attribution des scores ainsi que des scores cumulés, calculés en multipliant les scores obtenus pour les trois critères et pour les trois niveaux d’induction. Le score cumulé le plus élevé représente la construction exprimant la plus grande quantité de SEQ ID NO :12 périplasmique, en l’absence de SEQ ID NO :12 cytoplasmique, sans dégradation ni agrégation. Si le score de la construction TorT-SEQ ID NO :12 est largement plus élevé que pour les autres variants, sauf à 11 mM, le clivage du peptide signal lors de la sécrétion laisse un résidu alanine additionnel au début de l’extrémité N-terminale de la protéine SEQ ID NO : 12. L’identité de la SEQ ID NO :12 produite n’est pas de 100%, ce qui a conduit les inventeurs à écarter ce variant. Deux candidats ont été sélectionnés pour le criblage en vecteurs inductibles à l’IPTG : SEQ ID NO :9 – SEQ ID NO :12 (OmpA-CRM197) et SEQ ID NO :2 – SEQ ID NO :12 (OmpC-CRM197). Tableau 1 : Matrice utilisée de sélectionner les combinaisons peptide signal-SEQ ID NO :12 (CRM197)
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Scores attribués (1-2-3) sur base du résultat des immunoblots (Western Blots) : • S1 : score pour critère 1 : intensité de la bande correspondant à la SEQ ID N :12. • S2 : score pour critère 2 : absence / faible proportion de protéine possédant toujours le peptide signal. • S3 : score pour critère 3 : absence / faible présence de produits issus d’agrégation ou de dégradation Les deux combinaisons peptide-SEQ ID NO :12 sélectionnées ont été sous-clonées dans une série de vecteurs inductibles à l’IPTG où i) l’origine de réplication (nombre de copies), ii) la force du site de liaison au ribosome, iii) le type d’ARN polymérase, T5 pour l’hôte E. coli BL21 ou T7 phagique pour la souche BL21(DE3) et iv) la concentration de l’inducteur IPTG ont été évalués. La figure 3 montre, pour huit systèmes d’expression différent au niveau du nombre de copies de plasmides (<20 et ~500 copies), de la force de liaison au ribosome (fixation moyenne suite à une modification de la séquence en ARNm et fixation forte) ainsi que du peptide signal SEQ ID NO :2 (OmpC) et SEQ ID NO :9 (OmpA), que les DO600 des cultures induites pendant 4 h à l’IPTG sont bien plus faibles que celles non-induites ou auto-induites au lactose. La densité optique à 600 nm du milieu de culture dans le flacon, DO600, est mesurée par spectrophotométrie selon un protocole standard bien connu de l’homme de métier pour mesurer la densité optique et en tenant compte d’une mesure de blanc correspondant à la densité optique du milieu de culture sans bactérie. Les inventeurs en concluent que la SEQ ID NO :12 produite de façon trop rapide et trop importante est toxique et/ou que sa synthèse représente une charge métabolique conséquente pour la bactérie, ralentissant de la sorte la croissance bactérienne. Ce résultat démontre l’importance de dissocier les phases de production de biomasse et d’expression de la SEQ ID NO :12 et d’induire l’expression de façon suffisamment lente et contrôlée, afin d’éviter tout phénomène de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion. En outre, dans ces conditions, en particulier l’induction forte à l’IPTG de l’expression de SEQ ID NO :12, la toxicité cellulaire est beaucoup plus faible lorsque le peptide signal OmpC est utilisé, par rapport au peptide signal OmpA. Sur base des résultats comparatifs exemplifiés ci-dessus et obtenus dans des cultures effectuées en microplaques, deux vecteurs associés à la souche E. coli BL21(DE3) ont été retenus pour la sélection finale effectuée en bioréacteur de 5L, bioréacteur représentatif des conditions utilisées pour des productions à l’échelle industrielle : BL21(DE3)/pD431-MR-OmpC-CRM197 (aussi appelé BL21(DE3) / pLM7-OC-CRM) qui possède une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 10 et BL21(DE3)/pD451-SR-OmpC-CRM197 (aussi appelé BL21(DE3)/pHS7-OC-CRM) qui possède une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 11. Le premier système d’expression comprend des éléments assurant une expression lente de la SEQ ID NO :12 (faible nombre de copies de plasmide, fixation moyenne au ribosome) évitant tout phénomène de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion tandis que le second comprend des éléments en faveur d’une expression rapide de la protéine (nombre élevé de copies de plasmide, fixation forte au ribosome). Le second vecteur a néanmoins été sélectionné dans l’anticipation d’une faible stabilité plasmidique. Les niveaux d’expression des deux systèmes d’expression (BL21(DE3)/pLM7-OC-CRM et BL21(DE3)/pHS7-OC-CRM) ont été comparés dans des conditions représentatives des conditions industrielles. Les cultures ont été réalisées dans des fermenteurs de 5L qui sont conçus, utilisés et contrôlés de façon identique aux fermenteurs de production industrielle notamment en termes de cascade d’agitation et d’aération. Les cultures ont été réalisées de manière à atteindre de hautes densités cellulaires via l’adoption de stratégies d’alimentation de type «fed-batch». Les niveaux d’expression ainsi que les stabilités plasmidiques enregistrés pour les différentes constructions et conditions testées sont résumés dans le tableau 2. Une condition qui combine l’expression de la SEQ ID NO :12 la plus élevée et une stabilité plasmidique élevée (condition F05) implique un faible nombre de copies de plasmide, une fixation moyenne au ribosome et une température lors de l’induction de 23°C, ce qui correspond à un ensemble de facteurs permettant une expression lente et contrôlée de la SEQ ID NO :12. Les conditions conduisant à une expression la plus faible (condition F03) ou à une stabilité plasmidique la plus faible (condition F06) impliquent un nombre de copies de plasmide élevé et une fixation forte au ribosome, facteur conduisant à une expression rapide de la SEQ ID NO :12 et responsable de phénomènes de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion.
Tableau 2 : Niveaux d’expression et stabilités plasmidiques en réacteur de 5L - Souche E. colt BL21 (DE3)
Figure imgf000024_0001
Sur base des résultats comparatifs exemplifiés ci-dessus, le vecteur pLM7-OC-CRM a été retenu pour la production de la SEQ ID NO : 12 de par son niveau d’expression suffisamment élevé et sa haute stabilité plasmidique. Exemple 2.- Préparation de la souche bactérienne contenant le vecteur d’expression
Trois souches bactériennes ont été transformées avec différents vecteurs contenant la SEQ ID NO :12 fusionnées au peptide signal SEQ ID NO :2 (OmpC) : · E. coli BL21, une souche caractérisée par l’absence du prophage λDE3 et par l’utilisation de la polymérase bactérienne T5 dont l’efficacité de transcription n'atteint pas celle de la polymérase T7 du prophage ;
• E. coli BL21 (DE3) impliquant l’induction à IRTG sur base de la RNA polymérase T7 du prophage λDE3 ;
• E. coli BL21 (ΔDE3) ou E. coli BL21 T7XB, une souche propriétaire caractérisée par la délétion de la séquence du prophage, à l’exception des gènes nécessaires à l’expression de la polymérase T7. Le tableau 3 compare les différents systèmes d’expression impliquant les trois souches testées (E. coli BL21 , E. coli BL21 (DE3) et E. coli BL21 T7XB) en termes de nombre de copies de plasmide, du type de promoteur (T5 ou T7) et de force de liaison au ribosome (moyenne et forte) ainsi que les résultats obtenus lors des cultures en microplaques (OD600 et niveau d'expression cytoplasmique de la SEQ ID NO : 12) . Pour les bactéries E. coli BL21 caractérisées par une moindre efficacité de la polymérase bactérienne T5, les croissances bactériennes (OD600) ne sont pas significativement (ou peu) impactées lors de l'induction à l’IPTG alors que les niveaux d'expression évalués par analyse immunoblot sont faibles à l’exception de celui obtenu pour la souche transformée par un vecteur impliquant un nombre de copies élevé et une liaison forte au ribosome. Une absence de toxicité sur la croissance bactérienne et une expression significative sont observées lors de l’induction à i’IPTG pour la souche E coli BL21 (DE3) transformée par un plasmide impliquant un nombre de copies faible et une liaison moyenne au ribosome ; toutes les autres constructions étant sujettes à un phénomène de toxicité et/ou à une expression faible. Les résultats obtenus pour la souche E. coli BL21 T7XB sont similaires à ceux obtenus pour la souche E. coli BL21 (DE3).
Tableau 3 : OD600 et niveaux d’expression périplasmique des cultures inoculées par les différents systèmes d’expression après induction à l’IPTG
Figure imgf000027_0001
Les niveaux d'expression ainsi que les stabilités plasmidiques ont été déterminées pour les trois souches bactériennes (E coli BL21, E. coli BL21 (DE3) et E coli BL21 T7XB transformées avec différents vecteurs contenant la SEQ ID NO :12 fusionnées au peptide signal SEQ ID NO :2 dans des conditions représentatives des conditions industrielles. Les cultures ont été réalisées dans des fermenteurs de 5L qui sont conçus, utilisés et contrôlés de façon identique aux fermenteurs de productionndustrielle notamment en termes de cascade d’agitation et d’aération. Les cultures atteignent de hautes densités cellulaires via une adoption de stratégies d'alimentation de type «fed-batch». Les niveaux d’expression, les stabilités plasmidiques enregistrés pour les différentes constructions et les conditions testées sont résumés dans le tableau 4. Les quatre constructions impliquant la souche E coli BL21 caractérisée par la moindre efficacité de la polymérase bactérienne T5 présente des niveaux d’expression élevés compris entre 1 ,02 et 2,46 g/L et une stabilité plasmidique élevée (entre 97 et 100%) , quel que soit le nombre de copies de plasmide et la force de liaison au ribosome. Pour la souche E coli BL21 (DE3), seules les constructions impliquant un nombre de copies de plasmide faible et une liaison moyenne au ribosome présentent des niveaux d’expression élevés compris entre 1 ,00 et 3,10 g/L et une stabilité plasmidique élevée (entre 94 et 100%). Pour la souche E. coli BL21 (T7XB) caractérisée par la délétion de la séquence du prophage, à l’exception des gènes nécessaires à l’expression de la polymérase 17, un niveau d'expression élevé (1,62 g/L) et une stabilité plasmidique élevée (97%) sont enregistrés pour la constructionmpliquant un nombre de copies de plasmide faible et une liaison moyenne au ribosome tandis qu'un niveau d’expression faible (0,62 g/L) et une stabilité plasmidique faible (23%) sont observés avec la souche transformée par un vecteur impliquant un nombre de copies de plasmide faible et une liaison forte au ribosome. Tableau 4 : Niveaux d’expression et stabilités plasmidiques en réacteur de 5L : souches E. coli BL21 , E. coli BL21 (DE3) et E. coli BL21 T7XB
Figure imgf000029_0001
Cependant, la troisième souche E. coli BL21 T7XB caractérisée par la délétion de la séquence du prophage, à l’exception des gènes nécessaires à l’expression de la polymérase T7 a été retenue pour la production de la SEQ ID NO :12. En effet, les inventeurs ont déterminé qu’un contrôle de l’expression en présence d’un système d'expression basé sur l’ARN polymérase bactérienne T5 (E coli BL21 ), conduit parfois à des phénomène de fuite et à une moindre robustesse et, d’autre part, que la présence du prophage ÀDE3 dans la souche E. coli BL21 (DE3) présente une potentielle réactivation du cycle lytique et donc un risque industriel non-négligeable.
Exemple 3.- Expression périplasmique de la CRM] 97 dans E coli.
Le vecteur pLM7-OC-CRM combiné à la souche E coli BL21 T7XB permet d’avoir un rendement optimal de production périplasmique de la SEQ ID NO :12. Une production périplasmique optimale de la CRM197 dépend d’une balance adéquate entre le taux d’expression de la protéine CRM 197, la nature du peptide signal et la stabilité plasmidique du vecteur. Un taux d'expression trop élevé peut générer une forte production cytoplasmique de la protéine CRM1 97, sous forme insoluble, diminuer la viabilité cellulaire, sans générer une production périplasmique importante.
Les étapes ci-dessous décrivent, dans un exemple de réalisation de la présente invention, les différentes conditions utilisées afin de produire la SEQ ID NO : 12 au cours de la culture réalisée en fermenteur inoculé par la souche E coli BL21 T7XB transformée par le plasmide pLM7-OC-CRM :
• Souche utilisée : E coli BL21 T7XB/pLM7-OC-CRM (SEQ ID NO :
10) .
• Etape 1 : Préculture en flacon Volume du flacon : 500 ml à 2L, OD600 d'inoculation : 0,005, milieu de culture : YGP, kanamycine : 25 mg/L, température : 37°C, agitation : 270 rpm, durée de culture : 7h +/- 1 h.
• Etape 2 : Culture en mode « batch »
Volume du bioréacteur : 50 L, milieu de culture : GYPSCI contenant 10 g/L de glycérol et 5 g/L d'extrait de levure, température : 37°C, pH : 7,0, démarrage au temps t = Oh de l'alimentation en milieu GYPSCI contenant 400 g/L de glycérol et 217,5 g/L d'extrait de levure en suivant une augmentation linéaire du taux d'alimentation de 0 à 127 g/h entre le temps t = 0 et t = 9h30.
• Etape 3 : culture en mode « fed-batch »
Démarrage au temps t = 9h30 de l'alimentation en milieu GYPSCI selon un taux de croissance exponentiel de 0,15 h-1, température : 37°C, pH : 7,0, arrêt de l'alimentation exponentiel après +/- 10h lorsque la DO600 = 60 +/- 2.
• Etape 4 : Phase d'induction en mode « fed-batch »
Adoption d'un taux de croissance exponentiel de 0,1 h-1 pendant 6h puis d'un taux d'alimentation constant durant 14h, démarrage de l'induction par addition d'IPTG de façon à obtenir une concentration dans le réacteur de 2mM, température : 23°C, pH : 7,0, temps total de la phase d'induction : 20h.
• Etape 5 : Etape de collecte et de centrifugation
Arrêt de l'étape 4 (phase d'induction) après 20h, température diminuée à 15°C, transfert du contenu du bioréacteur dans des pots de centrifugation, centrifugation à 7000 rpm (9000-9500 g), collecte des culots cellulaires, transfert dans des sacs en plastique et stockage desdits sacs en plastique à -20°C. L'impact du changement de différents paramètres de culture (présence de kanamycine dans le milieu de culture, température et pH lors de l'induction) a été étudié et les résultats présentés dans le tableau 5. Dans les conditions optimisées par les inventeurs, l'absence de kanamycine n'affecfe pas de façon significative le niveau d'expression de la SEQ ID NO :12, ni la stabilité plasmidique (comparaison des conditions FOI, F05 et Fl 3). La température appliquée lors de l’induction est un paramètre impactant faiblement le niveau d'expression mais pas la stabilité plasmidique (comparaison des conditions FO1 et F02). Le pH est un paramètre impactant significativement le niveau d'expression et, dans une moindre mesure, la stabilité plasmidique ; un pH de 6,5 étant moins favorable tandis qu'un pH de 7,0 est optimal pour ces deux critères. L'absence de kanamycine, une diminution de la température de 28 à 23°C lors de l'induction et un pH de 7,0 maintenu constant tout au long des étapes de culture permettent un bon rendement de production de la SEQ ID NO :12.
Tableau 5 : Niveaux d’expression et stabilités plasmîdîques en réacteur de 51 : impact de la kanamycine, de la température et du pH
Figure imgf000033_0001
Exemple 4.- Extraction périplasmique de la SEQ ID
NO : 12
Après les différentes étapes de culture et d'induction, les bactéries E.coli BL21 T7XB transformées par le vecteur pLM7-OC-CRM (SEQ ID NO : 10) sont centrifugées et les pâtes cellulaires sont congelées à -20°C. L'extraction périplasmique démarre par une décongélation des pâtes cellulaires de 1350 g pendant 15h +/- 5h à 6°C +/- 2°C. Les pâtes cellulaires sont diluées dans un rapport 2 :1 (v/w) dans une solution hypertonique (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Sucrose 20%, pH 8,0), mélangées pendant 15 min et pompées à l'aide d'une première pompe dans un mélangeur à travers un anneau de diffusion dont le flux est de 121 ml/min.
Un choc osmotique de la suspension cellulaire est ensuite réalisé grâce à une dilution de la suspension cellulaire contenue dans le mélangeur à l'aide d'une solution hypotonique (MgCl25 mM) qui est pompée avec une deuxième pompe dans le mélangeur contenant la suspension cellulaire avec un flux de 279 ml/min et un rapport de dilution de 2,3 :1 (v/v) de solution hypotonique. La température de la solution hypotonique est comprise entre 4 et 8°C. Le volume de la suspension cellulaire dans le mélangeur est de 200 ml et le temps de résidence de la suspension cellulaire dans le mélangeur est de 30 sec. Une troisième pompe assure l'extraction de la suspension cellulaire du mélangeur, qui est collectée dans des pots de centrifugation, à un débit de 400 ml/min de manière à maintenir un volume de suspension cellulaire constant de 200 ml dans le mélangeur. Un poids de 1350g de pâtes cellulaires donne approximativement 13,4 litres de suspension cellulaire ayant subi un choc osmotique. La suspension cellulaire ayant subi un choc osmotique est centrifugée à 8000 rpm pendant 20 min (g = 9379 et facteur K = 3242). Les culots sont éliminés et le surnageant est clarifié par filtration.
Exemple 5.- Clarification du surnageant contenant les composants de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO : 12 La clarification du surnageant résultant de la centrifugation de la suspension cellulaire après choc osmotique (voir exemple 4) consiste en deux étapes de filtration en série. Pour la première filtration, le surnageant est pompé avec un débit de 400 ml/min au travers d'un filtre dont le maillage est de 0,8 - 0,45 μm et dont l'aire est de 0,2 m2. La solution filtrée une première fois est ensuite pompé avec un débit de 400 ml/min au travers d'un deuxième filtre dont le maillage est de 0,45 - 0,22 μm et dont l'aire est de 0,1 m2, ce qui permet d'obtenir une solution contenant un extrait périplasmique clarifié. II est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Vecteur d'expression chez un procaryote Gram négatif possédant les caractéristiques suivantes :
(i) une origine de réplication à faible nombre de copies, ledit faible nombre de copies étant défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins,
(ii) une séquence promotrice inductible à un agent inducteur exogène,
(iii) un site de liaison au ribosome d'une force moyenne, ledit site de liaison au ribosome d'une force moyenne correspond à une séquence en ARNm modifiée pour avoir une fixation au ribosome réduite,
(iv) une séquence codant pour une protéine ayant une identité d'au moins 95% par rapport à SEQ ID NO : 12 complète.
(v) une séquence codant pour un peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d'au moins 95%, ledit peptide signal étant agencé pour permettre un adressage de ladite SEQ ID NO : 12 vers un espace périplasmique.
2. Vecteur d'expression selon la revendication 1 , dans lequel le résidu acide glutamique à la position 52 de SEQ ID NO : 12 est maintenu.
3. Vecteur d'expression selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel la séquence promotrice inductible présente une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :5 sur toute la longueur et est reconnue spécifiquement par une ARN polymérase du phage T7.
4. Vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le site de liaison au ribosome d'une force moyenne est défini par une séquence consensus SEQ ID NO :6 ou par la séquence consensus SEQ ID NO :6 comprenant un ajout et/ou une délétion et/ou une mutation ponctuelle de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 nucléotides, ladite SEQ ID NO :6 étant localisée en amont d'un site d'initiation de la traduction.
5. Souche transformée de bactéries £ coli comprenant le vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes.
6. Souche transformée de bactéries selon la revendication 5, étant la souche E. coli BL21 définie par une délétion du prophage λDE3 à l'exception des gènes nécessaires à une expression de l'ARN polymérase du phage T7.
7. Procédé de production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO : 12 sur toute sa longueur comprenant :
(i) une transformation d'une souche de £ coli par un vecteur permettant l'expression de ladite SEQ ID NO : 12 dans l'espace périplasmique de ladite E. coli, ladite expression étant inductible par un agent exogène,
(ii) une culture de la souche £ coli transformée à une température substantiellement constante, par exemple de 37°C + 1°C , et un pH constant dans des conditions où la SEQ ID NO : 12 n'est pas synthétisée par ladite souche £ coli transformée,
(iii) une phase d'induction pendant une durée prédéterminée en présence dudit agent exogène et à une température réduite pour synthétiser et sécréter SEQ ID NO : 12 dans l'espace périplasmique de manière lente et contrôlée,
(iv) optionnellement une récolte de la culture après ladite phase d'induction et après refroidissement, (v) optionnellement une collecte des bactéries cultivées contenant SEQ ID NO : 12 dans l'espace périplasmique,
(vi) optionnellement une extraction périplasmique de ladite SEQ ID NO :12 avec une séparation d'un culot solide contenant les bactéries et un surnageant contenant les éléments de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO : 12, et
(vii) optionnellement une purification de ladite protéine SEQ ID NO : 12.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la souche E. coli est la souche BL21 définie par une délétion du prophage λDE3 à l'exception des gènes nécessaires à une expression de l'ARN polymérase du phage T7.
9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8, dans lequel la production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO : 12 sur toute sa longueur est assurée par un peptide signal d'adressage dans l'espace périplasmique, ledit peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d'au moins 95%.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel la température réduite est de
23°C + 0,5°C et/ou la durée prédéterminée de la phase d'induction est comprise entre 15 et 25 h, de préférence comprise entre 18 et 22 heures et plus particulièrement autour de 20h ef/ou le pH de la phase d'induction est compris entre 6,8 et 7,5, de préférence entre 7,0 et 7,2.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel l'expression inductible par un agent exogène est réalisée par un système d'induction marche/arrêt et où ledit agent exogène est l’isopropyl-β-D-l- thiogalactopyranoside.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel la culture et la phase d'induction sont dépourvues d'antibiotiques.
13. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 12 dans lequel le vecteur d'expression est à faible nombre de copie défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins ef/ou la séquence de liaison au ribosome est de force moyenne.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, dans lequel la purification de la protéine SEQ ID NO : 12 comprend les étapes successives de :
(i) une clarification du surnageant issu de l'extraction périplasmique contenant les composants de l'espace périplasmique et la protéine par au moins une étape de filtration, de préférence deux étapes de filtration avec une récupération d'un filtrat comprenant SEQ ID NO : 12, optionnellement, (ii) une série d'étapes chromatographiques agencées pour récupérer SEQ ID NO : 12 dans une fraction à conserver et les contaminants dans une ou plusieurs fractions à éliminer, (iii) optionnellement, une élimination d'endotoxines résiduelles, et (iv) optionnellement, une stérilisation de la fraction comprenant SEQ ID NO : 12 à conserver, dépourvue d'endotoxines.
15. Méthode de sélection d'un peptide signal de manière à optimiser une production d'une protéine d 'inférét dans l'espace périplasmique de la bactérie E. coli dans lequel :
- on génère une construction génétique comprenant un promoteur inductible au rhamnose ayant une identité de séquence d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :7 contrôlant l'expression de ladite protéine d'intérêt agencée avec ledit peptide signal à tester,
- on transforme ladite E. coli avec ladite construction génétique,
- on réalise plusieurs cultures parallèles de ladite E. coli transformée dans un milieu de culture dépourvu de rhamnose,
- on cultive ladite E. coli transformée en présence d'une concentration déterminée de rhamnose de manière à obtenir une induction faible de l'expression de ladite protéine d'intérêt et une autre culture de ladite E. coli transformée en présence d'une autre concentration déterminée de rhamnose de manière à obtenir une induction forte de l'expression de ladite protéine d'intérêt et,
- on compare l'abondance de la protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique et, optionnellement, on quantifie les effets délétères au métabolisme sélectionnés parmi le groupe constitué de la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d'agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation, un clivage partiel du peptide signal et, - on sélectionne le peptide signal en fonction de l'abondance de la protéine d 'inférét dans l'espace périplasmique et, optionnellement, en rejetant les peptides signaux associés aux effets délétères trop importants.
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