BE1029145A1

BE1029145A1 - Methode de production d'une forme periplasmique de la proteine crm197

Info

Publication number: BE1029145A1
Application number: BE20215137A
Authority: BE
Inventors: Philippe Ledent; Stéphane Huberty; Nicolas Havelange; Marc Daukandt; Christian Rodriguez
Original assignee: Curavac Europe; Xpress Biologics
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2022-09-19
Also published as: WO2022180265A3; WO2022180265A2; JP2024507994A; EP4298224A2; BE1029145B1; CN116964206A

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de production d’une forme périplasmique de la SEQ ID NO :12, au vecteur d’expression codant pour la SEQ ID NO :12 et pour la séquence signal, SEQ ID NO :2, permettant le ciblage de SEQ ID NO :12 vers l’espace périplasmique, ainsi qu’à la souche transformée par le vecteur d’expression.

Description

(METHODE DE PRODUCTION D'UNE FORME PERIPLASMIQUE DE LA PROTEINE CRM197 » La présente invention se rapporte à une méthode de production d'une forme périplasmique de la protéine CRM197, au vecteur d'expression codant pour la protéine CRM197 et pour la sequence signal, OmpC, permettant le ciblage de la protéine CRM197 vers l'espace périplasmique, ainsi qu'à la souche transformée par le vecteur d'expression.

La protéine recombinante CRM197, Cross Reacting Material, ou CRM, peut être utilisée par exemple comme protéine porteuse dans les vaccins conjugués. Un vaccin conjugué est un type de vaccin combinant un antigène faiblement immunogène avec une protéine dite « porteuse » qui possède des épitopes T reconnus par le système immunitaire, afin d'obtenir Une réponse plus forte à l'antigène.

La CRM197 est une protéine mutante non-toxique de la toxine diphtérique. Elle est utilisée comme protéine porteuse pour des haptènes tels que des polysaccharides de manière à permettre une réponse immunogène. Un haptène est l'un des éléments constitutifs d'un antigène qui, lorsqu'il est combiné avec un porteur protéique, lui confère un pouvoir antigénique suffisant pour générer une réponse immunitaire humorale.

La protéine CRM197 est une forme détoxifiée de la toxine diphtérique où une substitution de la glycine à la position 52 par un acide glutamique abolit l'activité ADP-ribosyltransférase de la toxine native et la rend non toxique. La protéine CRM197 comporte une chaîne polypeptidique simple de 535 acides aminés, d'un poids moléculaire de 58.4 kDa.

Le gène de la CRM197 a été initialement cloné dans Corynebacterium diphtheriae, la bactérie pathogène provoquant la diphtérie et contenant la toxine native. Comme la toxine native, la CRM197 n'est que très faiblement sécrétée. En conséquence, des efforts conséquents ont été consentis pour produire la protéine CRM197 dans d'autres bactéries.

Aujourd'hui, la protéine CRM197 est utilisée comme protéine porteuse dans plusieurs vaccins conjugués. A titre d'exemple, HibtiterTM, un vaccin pour protéger contre Haemophius influenzae type b, approuvé par la FDA ‘Food and Drug Administration’ en 1990 était le premier vaccin conjugué à utiliser Ia protéine CRM197 comme protéine porteuse ; l'haptène est un sucre.

La protéine CRM197 possède également Un site de liaison pour HB-EGF ‘heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor’, un membre de la famille EGF. Comme ce récepteur EGF est surexprimé dans de nombreuses cellules cancéreuses, la littérature indique que la protéine CRM197 pourrait également être utilisée comme agent potentiel dans des thérapies ciblées anti- cancéreuses.

La demande pour disposer d'une production industrielle dela protéine CRM197 est donc de plus en plus grande.

Malheureusement, au niveau de la production de la CRM197, il est toujours difficile d'atteindre des niveaux d'expression élevés et stables de la protéine CRM197 dans la souche native sauvage de la bactérie E. coli BL21. Une forme insoluble de la protéine CMR197 peut être produite à un niveau relativement élevé par fermentation dans E. coli, mais seulement une très faible fraction de cette forme insoluble de la protéine peut être convertie en forme soluble.

La production de la protéine CRM197 dans une souche K12 de E. coli est connue du document EP31 13800. Ce document concerne un procédé de production d'une protéine CRM197 recombinante dans une cellule hôte d'E. coli. Dans plusieurs modes de réalisation, le procédé comprend l'incubation d'une souche de E. coli possédant un génome réduit comprenant un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine CRM197 liée de manière fonctionnelle à une séquence de contrôle d'expression dans des conditions appropriées pour l'expression de la protéine CRM197 recombinante. Une augmentation significative du rendement de CRM197 est obtenue dans une cellule hôte d'E. coli à génome réduit selon ce document EP3113800 par rapport à la production dans des souches d'E. coli de type sauvage telles que BL21.

Le document EP3170837 propose un procédé amélioré de production d'une toxine bactérienne par expression périplasmique comprenant les étapes de a) croissance d'une culture de la cellule hôte bactérienne contenant un vecteur d'expression dans lequel des séquences de peptide signal particulières sont liées A la séquence d'une toxine bactérienne et b) induction de l'expression du polypeptide contenant des séquences de peptide signal particulières liées à une toxine bactérienne de telle sorte qu'une toxine bactérienne est exprimée et sécrétée dans le périplasme.

Le document EP2445930 propose un procédé de production de la protéine CRM197 et de protéines similaires, en alternative à l'utilisation du micro-organisme Corynebacterium diphtheriae. Selon le mode opératoire décrit dans ce document, la protéine d'intérêt peut être obtenue en grandes quantités à la fois pour la recherche fondamentale et pour des applications dans le domaine médico-thérapeutique. Malheureusement, bien que certains documents vantent les mérites de leur technologie, il n'existe actuellement pas sur le marché une méthode pour produire la CRM197 qui soit exploitable aisément et qui soit industriellement rentable, quelle que soit l'échelle de production industrielle.

Il existe donc un besoin de disposer d'un vecteur alternatif et d'une souche alternative transformée par ce vecteur qui permettent Un niveau d'expression élevé et stable de la forme soluble de la protéine CRM197 et une méthode de purification simple de la protéine CRM197 de manière à pouvoir en permettre un Usage industriel accessible à l'ensemble du marché.

En effet, face à la demande globale grandissante de la protéine CRM197, une problématique récurrente avec la production de cette protéine est d'obtenir à la fois UN rendement de production élevé et stable dans le temps qui soit le plus simple possible afin d'atteindre des coûts de production permettant une accessibilité à l'ensemble du marché.

Pour pallier ces inconvénients et difficultés, la présente invention procure un système d'expression permettant un rendement d'expression élevé et stable dans le temps et qui présente des rapports optimisés entre la vitesse de synthèse et celle de sécrétion de la protéine CRM197 (SEQ ID NO :12) ainsi qu'un rendement de purification permettant une exploitation commerciale et une mise à disposition de la SEQ ID NO :12 comme protéine/peptide pour la mise au point ultérieure de vaccins ou thérapie ciblées.

Tout d'abord, les inventeurs ont cherché à produire la 5 SEQID NO :12 chez la levure, ce qui est avantageux pour les étapes de purifications en aval ; malheureusement, cela n'a pas fonctionné.

De même, les inventeurs ont utilisé des plasmides avec un très haut niveau de copie ou avec un promoteur optimal, de manière à permettre une synthèse massive de SEQ ID NO :12 dans E.

coliou dans son espace périplasmique. Ceci n'a pas fonctionné.

Après les différentes étapes préliminaires, les inventeurs ont conclu qu’il fallait un système d'expression dans l'espace périplasmique d'E. coli, mais avec un niveau bien calibré, suffisamment élevé pour qu'il soit utilisable à large échelle, mais pas trop élevé pour éviter les agrégations dans E. coli.

A cette fin, en ayant identifié les nombreux problèmes ci-dessus, les inventeurs ont activement recherché les meilleures conditions de culture et de production, y compris les meilleures constructions génétiques (contrôle de la transcription, contrôle de la traduction, séquence d'adressage périplasmique).

Plus particulièrement, la présente invention procure un vecteur d'expression chez un procaryote Gram négatif possédant les caractéristiques suivantes : (i) Une origine de réplication à faible nombre de copies, le faible nombre de copies étant défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins, (1) une séquence promotrice inductibie à un agent inducteur exogène,

(iii) Un site de liaison au ribosome d’une force moyenne, le site de liaison au riposome d'une force moyenne correspond à une séquence en ARNm modifiée pour avoir une fixation au ribosome réduite, (iv) une séquence codant pour une protéine ayant une identité d'au moins 95% par rapport à SEQ ID NO :12 complète.

(v) une séquence codant pour un peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d'au moins 95%, le peptide signal étant agencé pour permettre un adressage de la SEQ ID NO :12 vers un espace périplasmique.

De manière avantageuse, le résidu acide glutamique à la position 52 de SEQ ID NO :12 est maintenu. En effet, une mutation remplaçant la glycine native de SEQ ID NO :12 à la position 52 par un acide glutamique assure un peptide SEQ ID NO :12 détoxifié.

De manière particulièrement avantageuse, la séquence promotrice inductible présente une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :5 sur toute la longueur et est reconnue spécifiquement par une ARN polymérase du phage T7.

De manière favorable, le site de liaison au ribosome d'une force moyenne est défini par une séquence consensus SEQ ID NO :6 ou par la séquence consensus SEQ ID NO :6 comprenant un ajout et/ou une délétion et/ou une mutation ponctuelle de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 nucléotides, Ia SEQ ID NO :6 étant localisée en amont d'un site d'initiation de la traduction.

La présente invention se rapporte aussi à une souche transformée de bactéries E. coli comprenant le vecteur d'expression. La souche E. coli BL21 17XB a été déposée au nom de Xpress Biologicals au BCCM ‘Belgian Co-ordinated Collections of Micro- organisms’ de Gand le 23/12/2020 sous la référence LMBP 12507.

La souche transformée de bactéries E. coli BL21 T7XB avec le vecteur d'expression qui comporte une origine de réplication à faible nombre de copies, défini par un nombre de copies du plasmide compris entre 1 et 20 par cellule, et un site de liaison au ribosome d'une force moyenne, c'est-à-dire ayant une séquence en ARNm modifiée de façon à ce que la fixation au riposome soit réduite, permet d'obtenir un très bon rapport entre le niveau d'expression et de sécrétion de la SEQ ID NO :12 et assure un rendement de production élevé tout en étant stable dans le temps. De préférence, une souche de bactéries E. coli BL21 définie par une délétion du prophage ADE3 à l'exception des gènes nécessaires à Une expression de l'ARN polymérase du phage T7 : E. coli BL21(ADE3) ou E. coli BL21 T7XB. En effet, cette délétion présente les avantages de ne pas présenter de risque de réactivation du prophage, d'offrir une grande flexibilité pour la production sans risque de contamination croisée et d'apporter une grande stabilité plasmidique.

La présente invention se rapporte également à un procédé de production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur comprenant : (i) une transformation d'une souche de E. coli par un vecteur permettant l'expression de la SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique de la souche E. coli transformée, l'expression étant inductible par un agent exogène, (i) une culture de la souche E. coli transformée à une température substantiellement constante, par exemple de 37°C + 1°C, et un pH constant dans des conditions où la SEQ

ID NO :12 n'est pas synthétisée par la souche E. coli transformée, (iii) Une phase d'induction pendant une durée prédéterminée en présence de l'agent exogène et à une température réduite pour synthétiser et sécréter SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique de manière lente et contrôlée, avantageusement afin de réduire des phénomènes de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion, (iv) optionnellement une récolte de la culture après la phase d'induction et après refroidissement, par exemple à 15°C + 0,5°C, (v) optionnellement une collecte des bactéries cultivées contenant SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique, (vi) optionnellement une extraction périplasmique de la SEQ ID NO :12 avec une séparation d’un culot solide contenant les bactéries et un sumageant contenant les éléments de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO :12, et (vii optionnellement une purification de la protéine SEQ ID NO :12.

La présente invention procure donc un procédé de production de SEQ ID NO :12 optimisée pour une expression stable et suffisante où la température et le pH restent substantiellement constants durant toute la phase d'induction, ce qui simplifie la méthode de production, minimise les risques d'erreurs et assure également un rendement optimal au niveau des coûts de production. La température substantiellement constante est une température compatible avec un métabolisme de croissance optimale de la souche E. coli transformée.

De manière préférée, la souche E. coli est la souche BL21 définie par une délétion du prophage ADE3 à l'exception des gènes nécessaires à Une expression de l'ARN polymérase du phage T7.

Avantageusement, la production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur est assurée par un peptide signal d'adressage dans l'espace périplasmique, le peptide signal présentant une identité de séquence à la SEQ ID NO :2 d'au moins 95%.

Préférentiellement, la température réduite est de 23°C + 0,5°C et/ou la durée prédéterminée de la phase d'induction est comprise entre 15 et 25 h, de préférence comprise entre 18 et 22 heures et plus particulièrement autour de 20h et/ou le pH de la phase d'induction est compris entre 6,8 et 7,5, de préférence entre 7,0 et 7,2.

De manière préférée, l'expression inductible par un agent exogène est réalisée par un système d'induction marche/arrêt et où l'agent exogène est l'isopropyl-B-D-1-thiogalactopyranoside. L'isopropyl-B-D-1-thiogalactopyranoside est également connu sous lenom d'IPTG.

Avantageusement, la culture et la phase d'induction sont dépourvues d'antibiotiques telles que par exemple la kanamycine, l'ampicilline, la streptomycine, le chloramphénicol, ou la tétracycline.

Préférentiellement, le vecteur d'expression est à faible nombre de copie défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins et/ou la séquence de liaison au ribosome est de force moyenne.

Avantageusement, la purification de la protéine SEQ ID NO :12 comprend les étapes successives de :

() une clarification du sumageant issu de l'extraction périplasmique contenant les composants de l'espace périplasmique et la protéine SEQ ID NO :12 par au moins une étape de filtration, de préférence deux étapes de filtration avec une récupération d'un filtrat comprenant SEQ ID

NO :12, optionnellement, (i) une série d'étapes chromatographiques agencées pour récupérer SEQ ID NO :12 dans une fraction à conserver et les contaminants dans une ou plusieurs fractions à éliminer,

(ii) optionnellement, une élimination d'endotoxines résiduelles, et (iv) optionnellement, une stérilisation de la fraction comprenant SEQ ID NO :12 à conserver, dépourvue d'endotoxines.

Avantageusement, l'extraction périplasmique est une extraction périplasmique par choc osmotique.

De préférence, l'extraction périplasmique comprend les étapes de :

(1) une mise en suspension du culot formé par les bactéries collectées dans une solution hypertonique pour former une suspension hypertonique de bactéries,

(ii) un transfert de la suspension hypertonique de bactéries dans un deuxième récipient de mélange au travers d'un anneau de diffusion et au moyen d'une tubulure de transfert et d'une première pompe,

(ii) Une alimentation dudit récipient de mélange par une solution hypotonigue au moyen d'une tubulure de transfert et d'une deuxième pompe, de manière à provoquer un choc osmotique sur les bactéries de la suspension hypertonique dans le deuxième récipient de mélange, le choc osmotique permettant la libération du contenu de l'espace périplasmique dans la solution du deuxième récipient de mélange, (iv) un soutirage du mélange de manière à ce que le temps de séjour des bactéries de la suspension de bactéries dans le deuxième récipient soit compris entre 10 secondes et une minute, plus préférentiellement autour de 30 secondes et que le volume du mélange dans le deuxième récipient soit maintenu constant, le soutirage étant réalisé par une tubulure et une troisième pompe péristaltique.

Préférentiellement, la série d'étapes chromatographiques comprend une première chromatographie sur résine échangeuse d'anions et une deuxième chromatographie sur une résine hydrophobe.

La présente invention se rapporte enfin à une méthode de sélection d'un peptide signal de manière à optimiser une production d'une protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique de la bactérie E. coli dans lequel: - on génère une construction génétique comprenant Un promoteur inductible au rnamnose ayant une identité de séquence d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :7 contrôlant l'expression de la protéine d'intérêt agencée avec le peptide signal à tester, - on transforme la bactérie E. coli avec la construction génétique,

- on réalise plusieurs cultures parallèles de la bactérie E. coli transformée dans un milieu de culture dépourvu de rnamnose, - on cultive la bactérie E. coli transformée en présence d'une concentration déterminée de ramnose de manière à obtenir une induction faible de l'expression de la protéine d'intérêt et une autre culture de la bactérie E. coli transformée en présence d'une autre concentration déterminée de rnamnose de manière à obtenir une induction forte de expression de la protéine d'intérêt et, - on compare l'abondance de la protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique et, optionnellement, on quantifie les effets délétères au métabolisme sélectionnés parmi le groupe constitué de la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d'agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation, un clivage partiel du peptide signal et, - on sélectionne le peptide signal en fonction de l'abondance de la protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique et, optionnellement, en rejetant les peptides signaux associés aux effets délétères trop importants.

Les effets délétères au métabolisme sont quantifiés par exemple par un établissement d'un score associé au couple peptide signal et protéine d'intérêt où plusieurs effets délétères sont pris en compte comme la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d'agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation et un clivage partiel du peptide signal. Dans un processus normal d'expression périplasmique d'une protéine d'intérêt, le peptide signal associé à cette protéine d'intérêt est clivé lors du transport vers l'espace périplasmique. Un clivage partiel du peptide signal peut donc engendrer une modification, non désirée, de la fonctionnalité de la protéine d'intérêt.

D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention ressortiront de la description donnée ci-après, à titre non limitatif et en faisant référence aux dessins annexés.

La figure 1 présente les différentes étapes de production par fermentation de la protéine SEQ ID NO :12.

La figure 2 présente les différentes étapes de purification de la protéine SEQ ID NO :12.

La figure 3 montre une expression de la protéine SEQ ID NO :12 à l'aide d'une mesure de densité optique à 600 nm des cultures de E. coli BL21 (DE3) inoculées par différents vecteurs d'expression. Plasmide pD431: faible nombre de copies de plasmides, plasmide pD451: nombre élevé de copies de plasmides. MR: force de fixation moyenne au ribosome, SR: force de fixation élevée au ibosome. Type d'induction: cultures non-induites (colonnes avec points noirs), induites à l'IPTG (colonnes avec lignes verticales) ou auto-induites au lactose (colonnes avec lignes horizontales). Les 3 dernières colonnes sur la droite: contrôles positifs dans les mêmes conditions d'induction.

La souche d'E. coli BL21 T7XB transformée par un vecteur d'expression pLM7-OC-CRM (étape | de la figure 1) est mise en culture à température constante de 37°C + 0,5°C et un pH constant de 7,0 + 0,2.

Plus particulièrement, la culture (étape Il à IV de la figure 1) de la souche E. coli BL21 17XB transformée par le vecteur d'expression pLM7-OC-CRM à une température constante de 37°C + 0,5°C puis, lors de l'induction (étape V de la figure 1), à une température constante de 23 + 0,5°C et un pH constant de 7,0 + 0,2 comporte 3 étapes successives : () une préculture sous agitation en flacon (étape II de la figure 1), (i) une croissance en mode ‘batch’ dans un bioréacteur (étapes Ill et IV de la figure 1), (ii) Une croissance en mode ‘fed-batch' dans le bioréacteur (étapes Ill et IV de la figure 1).

Le bioréacteur est par exemple un bioréacteur de 50L, alimenté à travers un filtre steérilisant de 0,2 um avec 35L de milieu GYPSCI, du glycérol et de l'extrait de levure (yeast extract).

La croissance en mode «fed-bacth» dans le bioréacteur se déroule avec un apport d'oxygène de telle manière qu'un taux d'oxygène dissous soit supérieur ou égal à 30% de saturation, et sous agitation constante.

Tant la culture en mode « batch » que « fed-batch » est réalisée de préférence en présence d'un agent anti-moussant.

Une fois que l'expression induite de la SEQ ID NO :12, codée par le vecteur pLM7-OC-CRM, et la sécrétion de la SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique sont terminées, la culture est alors récoltée après refroidissement à 15°C + 0,5°C (étapes VI et VII de la figure 1). La culture est suivie d'une collecte des bactéries contenant SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique par centrifugation (étape VII de la figure 1).

Concernant la purification de la SEQ ID NO :12, le culoi cellulaire formé des bactéries séparées est ensuite stocké à basse température ; ex -20°C ou encore moins (étape VII de la figure 2). Les bactéries collectées sont ensuite utilisées comme matériel de base pour la réalisation d'une extraction périplasmique (étapes VIII et IX de la figure 2 et voir exemple 4). A partir du surnageant clarifié contenant les éléments de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO :12, Une purification de celle-ci est effectuée comme décrite ci- avant (étapes X à XIV de la figure 2). Plus particulièrement, la série d'étapes chromatographique comprend une première chromatographie sur résine échangeuse d'anions (étape XI de la figure 2) et une deuxième chromatographie sur une résine hydrophobe (étape XII de la figure 2). Avantageusement, l'étape suivante de filtration est une étape d'ultrafiltration (étape XIV de la figure 2). La première étape du procédé d'ultrafiltration consiste à concentrer Ia SEQ ID NO :12 à environ 4,5 mg/mL et la seconde étape à diafiltrer le rétentat de concentration contre Un volume 10 fois plus important de tampon de formulation (tampon phosphate 15 MM, sucrose 5%, pH 7,35). La fibre creuse de 30 kDa a été retenue car elle correspond à celle présentant le seuil de passage ‘cut-off’ le plus élevé pouvant retenir la SEQ ID NO :12. Si l’on veut améliorer la pureté de la SEQ ID NO :12, une étape additionnelle d'élimination d'endotoxines résiduelles peut être effectuée (étape XIII de la figure 2), plus particulièrement sur une membrane contenant dans son enrobage des groupements d'ammonium quaternaire.

Exemples illustratifs.

Exemple 1.- Préparation du vecteur d’expression Pour sélectionner le vecteur permettant l'expression périplasmique par E. coli, plusieurs peptides signaux ont été fusionnés à la partie N-terminale de la SEQ ID NO :12 au sein d'un vecteur inductiple au rnamnose. Après transformation de E. coli BL21(DE3) par ces différentes combinaisons, l'expression de la SEQ ID NO :12 dans chaque clone a été évaluée par une analyse immunoblot pour différentes concentrations en rnamnose, et par conséquent pour différents niveaux d'induction.

Trois critères ont été pris en compte pour sélectionner des combinaisons SEQ ID NO :12 - peptide signal (CRM197-peptide signal) qui seront ensuite testées pour leur expression après induction à l'IPTG : (1) intensité de la bande correspondant à la SEG ID NO :12 et présentant un poids moléculaire apparent de -58 kDa, (2) absence ou faible proportion de la SEG ID NO :12 possédant toujours le peptide signal {poids moléculaire apparent de -60 kDa) traduisant une saturation de la voie de sécrétion, (3) absence ou faible présence de produits issus d'agrégation ou de dégradation (bandes présentant des poids moléculaires apparents supérieurs à 97 kDa ou compris entre 14 et 58 kDa).

Une matrice de sélection a été constituée afin de sélectionner les combinaisons peptide signal-SEQ ID NO :12 qui seront ensuite testées pour leur expression après induction à l'IPTG. Le tableau 1 reprend l'atiribution des scores ainsi que des scores cumulés, calculés en multipliant les scores obtenus pour les trois critères et pour les trois niveaux d'induction. Le score cumulé le plus élevé représente la construction exprimant la plus grande quantité de SEQ ID NO :12 périplasmique, en l'absence de SEQ ID NO :12 cytoplasmigve, sans dégradation ni agrégation.

Si le score de la construction TorT-SEQ ID NO :12 est largement plus élevé que pour les autres variants, sauf à 11 mM, le clivage du peptide signal lors de la sécrétion laisse un résidu alanine additionnel au début de l'extrémité N-terminale de la protéine SEG

ID NO: 12. L'identité de la SEQ ID NO :12 produite n'est pas de 100%, ce qui a conduit les inventeurs à écarter ce variant.

Deux candidats ont été sélectionnés pour le criblage en vecteurs Iinductibles à PIPTG : SEQ ID NO :9 — SEQ ID NO :12 (OMpA-CRM197) et SEG ID NO :2 - SEQ ID NO :12 (OmpC-CRM197}. Tableau 1 : Matrice utilisée de sélectionner les combinaisons peptide signal-SEQ ID NO :12 (CRM197) een enen em Ex |1(21812|2111112121 ®% | [MmAe 12 (1 |213|111(21212| ®% | Scores attribués (1-2-3) sur base du résultat des immunoblots (Western Blots): e S1 : score pour critère 1 : intensité de la bande correspondant à la SEQ ID N :12.

e S2: score pour critère 2: absence / faible proportion de protéine possédant toujours le peptide signal. e S3: score pour critère 3 : absence / faible présence de produits issus d'agrégation ou de dégradation ies deux combinaisons peptide-SEQ ID NO:12 sélectionnées ont été sous-clonées dans une série de vecteurs inductibles à l'IPTG où 1) l'origine de réplication (nombre de copies}, 1} la force du site de liaison au ribosome, ij} le type d'ARN polymérase, T5 pour l'hôte E. coli BL21 ou T7 phagique pour la souche BL21{DE3) et iv} la concentration de l'inducteur IPTG ont été évalués.

La figure 3 montre, pour huit systèmes d'expression différent au niveau du nombre de copies de plasmides [<20 et -500 copies), de la force de liaison au ribosome (fixation moyenne suite à une modification de la séquence en ARNm et fixation forte} ainsi que du peptide signal SEG ID NO :2 (OmpC} et SEG ID NO :9 (OmpA)}, que les DO des cultures induites pendant 4 h à l'IPTG sont bien plus faibles que celles non-induites ou auto-indultes au lactose.

La densité optique à 600 nm du milieu de culture dans le flacon, DO, est mesurée par spectrophotométrie selon un protocole standard bien connu de l'homme de métier pour mesurer la densité optique et en tenant compte d'une mesure de blanc correspondant à la densité optique du mileu de culture sans bactérie.

Les inventeurs en concluent que la SEQ ID NO :12 produite de façon trop rapide et trop importante est toxique et/ou que sa synthèse représente une charge métabolique conséquente pour la bactérie, ralentissant de ia sorte ia croissance bactérienne.

Ce résultat démontre l'importance de dissocier les phases de production de biomasse et d'expression de la SEQ ID NO :12 ei d'induire l'expression de façon suffisamment lente et contrôlée, afin d'éviter tout phénomène de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion.

En outre,

dans ces conditions, en particulier l'induction forte à l'IPTG de l'expression de SEQ ID NO :12, la toxicité cellulaire est beaucoup plus faible lorsque le peptide signal OmpC est utilisé, par rapport au peptide signal OMpA.

Sur base des résultats comparatifs exemplifiés ci-dessus et obtenus dans des cultures effectuées en microplaques, deux vecteurs associés à la souche E. coli BL21{DE3} ont été retenus pour ia sélection finale effectuée en bioréacieur de SL, bioréacteur représentatif des conditions utilisées pour des productions à l'échelle industrielle: BL21(DE3)/pD431-MR-OmpC-CRM197 {aussi appelé BL21{DE3} / DpLM7-OC-CRM] qui possède une séquence nucléotidique SEQ ID NO : 10 et BL21(DE3}/pD451-SR-OmpC-CRM197 (aussi appelé BL21(DE3)/pHS7-OC-CRM) qui possède une séquence nucléotidique SEQ ID NO: 11. Le premier système d'expression comprend des éléments assurant une expression lente de la SEQ ID NO :12 (faible nombre de copies de plasmide, fixation moyenne au ribosome) évitant tout phénomène de toxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion tandis que le second comprend des éléments en faveur d'une expression rapide de ia protéine (nombre élevé de copies de plasmide, fixation forte au rbosome). Le second vecteur a néanmoins été sélectionné dans l'anticipation d'une faible stabilité plasmidique.

Les niveaux d'expression des deux systèmes d'expression (BL21{DE3}/pLM7-CC-CRM et BL21(DE3}/pHS7-OC-CRM} ont été comparés dans des conditions représentatives des conditions industrielles. Les cuitures ont été réalisées dans des fermenteurs de 5L qui sont conçus, utilsés et contrôlés de façon identique aux fermenteurs de production industrielle nolomment en fermes de cascade d'agitation et d'aération. Les cultures ont été réalisées de manière à atteindre de hautes densités cellulaires via l'adoption de stratégies d'alimentation de type «fed-batch». Les niveaux d'expression ainsi que les stabilités plasmidiques enregistrés pour les différentes constructions et conditions testées sont résumés dans le tableau 2. Une condition qui combine l'expression de la SEG ID NO :12 la plus élevée et une stabilité plasmidique élevée (condition FOS} implique un faible nombre de copies de piasmide, une fixation moyenne au ribosome et une température lors de l'induction de 23°C, ce qui correspond à un ensemble de facteurs permettant une expression lente et contrôlée de ia SEQ ID NO :12, Les conditions conduisant à une expression la plus faible (condition FO3} ou à une stabilité plasmidique la plus faible (condition F06) impliquent un nombre de copies de plasmide élevé et une fixation forte au rbosome, facteur conduisant à une expression rapide de la SEQ ID NO :12 et responsable de phénomènes de foxicité, de surcharge métabolique et/ou de saturation des voies de sécrétion.

ee 2 ĳ ; D pa D ni ES RS RK 5 & IE © 15 TEE EE ai E x 8 [5 [5 15 |F IS JE „LSB en EEE A |: 2 | — : 88 ;: | — : 7 = La + [0 [= |A Im | NE ŸÉ à ee DO ler Jee | | =d zn art É ee Ce. u w È | es 0| 28% —|-|- |=- |=- IR [PR = SE É8 So |0 |6 |0 es © IS = ie? = 8 DE sis eel le le Je 6 sis «28 SS A 9 18 18 18 18 [IN IN die Baj

SIE EE 5 GL. E S 15 |G (9 |z 18 |z 16 Pt D du Si 9 # * 5 U A 51 | 28 Da Cle. 85 GO À Es ts di 3 Ch 88 A Li. Oo 1e © 9 ZE ont 818 5 3 862 TOE 5810 lo |S |@ ls | OÖ ie = 0 + dee | |©& | Fos sac u O im © dl © Ä > Ä D “IN 8a SIE IE IE |E 2 WR JE © 8 282 Dd © $ © SE 5 € 3 2 12 jo gg vre C8 verg Ds 88/2 12218 Die 7 5 >. = a il a. gs = DE Oui = st |} © ä ee = à cs a a ;| | Is Im | Im m je M = m = ET ZEE EF |R FE = jp IE

Sur base des résultats comparatifs exemplifiés ci-dessus, le vecteur pLM7-OC-CRM a été retenu pour la production de la SEG ID NO :12 de par son niveau d'expression suffisamment élevé et sa haute stabilité plasmidique.

Exemple 2.- Préparation de ic souche bactérienne contenant le vecteur d'expression Trois souches bactériennes ont été transformées avec différents vecteurs contenant la SEQ ID NO :12 fusionnées au peptide signal SEG ID NO :2 (OmpC) : e E coli BL21, une souche caractérisée par l'absence du prophage ADE3 et par l'utilisation de la polymérase bactérienne T5 dont l'efficacité de transcription n'atteint pas celle de la polymérase T7 du prophace ; e E. coli BL21(DE3) impliquant l'induction à IPTG sur base de la RNA polymérase T7 du prophage ADE3; e EE. coli BL21(ADE3) ou E. coli BL21 T7XB, une souche propriétaire coractérisée par ia délétion de la séquence du prophage, à l'exception des gènes nécessaires à l'expression de la polymérase T7.

Le tableau 3 compare les différents systèmes d'expression impliquant les trois souches testées (E. coli BL21, E. coli BL21{DE3;} et E coli BL21 T7XB) en termes de nombre de copies de plasmide, du type de promoteur (T5 ou 17) et de force de liaison au ibosome (Moyenne et forte] ainsi que les résultats obtenus lors des cultures en micropiaques (ODeoo et niveau d'expression cytoplasmique de la SEG ID NO :12). Pour les oactéries E. coli BL21 caractérisées par une moindre efficacité de la polymérase bactérienne T5, les croissances bactériennes (ODso} ne sont pas significativement (ou peu) impactées lors de l'induction à l'IPTG alors que les niveaux d'expression évalués par analyse immunoblot sont faibles à l'exception de celui obtenu pour Ia souche transformée par un vecteur impliquant un nombre de copies élevé et une liaison forte au ribosome.

Une absence de toxicité sur ia croissance bactérienne et une expression significative sont observées lors de l'induction 9 l'IPTG pour la souche E. coli BL21(DE3) transformée par un plasmide impliquant un nombre de copies faibie et une liaison moyenne au ioosome; toutes les autres constructions étant sujettes à un phénomène de toxicité et/ou à une expression faibie.

Les résultats obtenus pour la souche E coli BL21 T7XB sont similaires à ceux obtenus pour ia souche E. coli BL21{DE3).

et Oo PSS A |; =

LEA PSS SEEN © Ce © $ © = EES] © CE ON & & | © |] = = | à 812/215/512|12|121512 psc] 7 tb ts {D © qd A D 12e à 015 815 518 É|É (5/8 0 |£ # 8/9 295% 8% /85 5/28/7518 vi ha àa13515/16/1€/€0/151/5S151E1S U 8 En ee 1.2 = |# HE AD | 5 3 8 OD | # S S @ d 8 peen RE we en | #4 || | 2/1 BJ ||| | 8 à | 8 ü 2 | #8 = en S _ | 2 1 ale [552 2252 = [es 2 | | 1 GG | 13 9 DATA ISIS RR % haa oo IR 2/12/0182 X 2 a SI8|2|E|E VOELEN 5 IS HH © 2 9 0/09 A | 5/15/1515] A 10 9. 15 51616018 R1815/R “ |# |2els|s|E1E/2121P16E1P D | 151515151512 2/2 È(£ 2 IE AK EE 212 2/21/2512 2 LL. |JO|J0/10|/0/ 0/15 51 E | /O1IF Si . OO ERIK JO | G ee _ ESE 5 | 2 | [el |z| jol |g 3 | 8 1€ 25|2|52 S|2|E 2 SSSR SE SESEES be tee Ü le 1515 É15/ 5156) 5151 518 ta Le JOE Ig] B] |M] | D | 5 |= = = 2 = D 2 dy .. = IE = |L TD T T TD 5 PS ES Dj 5 Ke UN = Cd an > #5 23/83/23 | 83/23 2 45 cou > © © D © © SE Ee A 0 — © A 0 ma = 2 | 55/05 / 5 5 22 3892 85 | 52132 sou = à gs = El A 2 == = |17* "561 56/86 |/ 76/56 5 LL LG © 2 Q = LD aas! ze] U | É Is ISlslslslsislsSlgslis z | 8 ISIN Ill ZIG] S | 2 à/8/5/A18/68 1818/15/18 X | DH oO a. q Le z01| à. SE - zZ | 82 na le Jon 15 Inl SS q = 5. IEEE lll]

SUE * eo jp ai CO 5 LL. Le =*|=|=|x|2|2 m) an C1 UD || 2 SSR allen Ss EE eg la" al IS 58 2 5 LL. © © | 8/5 | |

BSL pu OÖ

Les niveaux d'expression ainsi que les stabilités plasmidiques ont été déterminées pour les trois souches bactériennes (E. coli BL21, E. col BL21{DE3} et E. coli BL21 T7XB transformées avec différents vecteurs contenant la SEG ID NO :12 fusionnées au peptide signal SEQ ID NO :2 dans des conditions représentatives des conditions industrielles.

Les cultures ont été réalisées dans des fermenteurs de 5L qui sont CONÇUS, utilisés et contrôlés de façon identique aux fermenteurs de production industriele notamment en fermes de cascade d'agiiation el d'aération.

Les cultures atteignent de hautes densités cellulaires via une adoption de stratégies d'alimentation de type «fed-batch.

Les niveaux d'expression, les stabilités plasmidiques enregistrés pour les différentes constructions et les conditions testées sont résumés dans le tableau 4. Les quatre constructions impliquant la souche E. coli BL21 caractérisée par la moindre efficacité de ia polymérase bactérienne T5 présente des niveaux d'expression élevés compris entre 1,02 et 2,46 g/L et une stabilité plasmidique élevée (entre 97 et 1007}, quel que soit le nombre de copies de piasmide et la force de liaison au rbosome.

Pour la souche E. coli BL21{DE3), seules les constructions impliquant un nombre de copies de plasmide faibie et une liaison moyenne au ribosome présentent des niveaux d'expression élevés compris entre 1,00 et 3,10 g/L et une stabilité plasmidique élevée (entre 94 et 100%). Pour la souche E. coli BL21{T7XB) caractérisée par la délétion de la séquence du prophage, à l'exception des gènes nécessaires à l'expression de la polymérase T7, un niveau d'expression élevé {1,62 g/L] et une stabilité plasmidique élevée (97%) sont enregistrés pour la construction impliquant un nombre de copies de plasmide faible et une liaison moyenne au ribosome tandis qu'un niveau d'expression faible (0,62 g/L] et une stabilité plasmidique faible (23%) sont observés avec la souche transformée par un vecteur impliquant un nombre de copies de plasmide faibie et une liaison forte au ribosome.

D Da JLD LL = 22 LI 0 || pp | pe | pp | be 2 o | 62 | 68 | ge]

BE =S SJS EE ES RER RS ES ETS el 89 - ES 55 SES ER || | Me! ee ce RR N OD S/A | À | 6 a ST RAT ST tiel mid NN zn =| ||| [OS] SN LJ eu nd Le © es u u u OÖ vo a es . Se BEE WI | D | u | #3 1 a Ll se B HSE TS RS = LA | 3% 5 = = = = ale else = ol SS da se) LE ee | A] A — vn £ ©. ö De) 5 A |D LE 9 “3 SI 5D D Al =: 2355 allen ale le ala le am ala IM x 2 Sa, NTFS TN SN SN EN SN [dj NA [A |A] mes RE TV 8 lé SS 18 = e Le © = ee Û ee lee seele ee S SE Ë G1S|185/15/1252 12 RR 85/27 217 2151/82/58 D :. 5 212221019919 [ZOLL RIO ZZ ZE HR SE © VU 8. a = S ; © © Ed 64 La En > LI © ee 8 + … © © v|2 © a | © D dd LE) 48e D KE 512 8 SS S = [Sl DSE 5/09 50/55 0/10 É|0/v|8 É|0| Ê| » = Ee 58 DIE dl El dla ll ol EI ÉE| 0 | %|C || E Le U. 9 > à Stal Els JE JE JL IS Elin SE ES EE CO & 5 7 A = | 4+ m | bb = 7 te | Aal 5 bh | Lb = = | 4 = | 4 doo Ee = Ta y y y 4 DA se US CE © U u © © ee £ £ S/& = S/E £ q SE = a di & 1818 „8,3 2/0 0lw 2 2 ww 20 02 22 ale SS ui © 2 { Q = | |J ; | =|, “| 71 |] 818125 a NIET 235 8 SLE 8 8 [58 © 58|8|88 D ES 3 ù Bu USE SU CIS SE JE || |} BE 9 A $ sn = Lis Be © ee 58 = Si SS

;. ö 4 => A Se 3 x Ca N Ds = Ge du ° N a © So mmm ee Es hs 2 …u = | allle la mla a en lg alom] «ul PE: BIS ZI SIE BE / 8/8 5/85) 2/12/2128 be 26e SLEE [| DL Lille 2 VEL. 2 :;:O —_— > TE H- Lu

Cependant, la troisième souche E. coli BL21 T7XB caractérisée par la délétion de la séquence du prophage, à l'exception des gènes nécessaires à l'expression de la polymerase T7 a été retenue pour la production de la SEG ID NO :12. En effet, les inventeurs ont déterminé qu'un contrôle de l'expression en présence d'un système d'expression basé sur l'ARN polymérase bactérienne TS (E. coli BL21}, conduit parfois à des phénomène de fuite et à une moindre robustesse et, d'autre part, que la présence du prophage ADES dans ia souche E. coli BL21(DE3) présente une potentielle réactivation du cycle vtique et donc un risque industriel non-négligeable.

Exemple 3.- Expression périplasmique de la CRM197 dans E. coli.

Le vecteur pLM7-OC-CRM combiné à la souche E. coli BL21 T7XB permet d'avoir un rendement optimal de production périplasmique de la SEG ID NO :12. Une production périplasmique optimale de la CRM197 dépend d'une balance adéquate entre le taux d'expression de la protéine CRM197, la nature du peptide signal et ia stabilité plasmidique du vecteur. Un taux d'’ expression trop élevé peut générer une forte production cytoplasmique de la protéine CRM197, sous forme insolubie, diminuer la viabilité cellulaire, sans générer une production périplasmique importante.

Les étapes ci-dessous décrivent, dans un exemple de réalisation de la présente invention, les différentes conditions utilisées afin de produire la SEQ ID NO :12 au cours de la culture réalisée en fermenteur inoculé par la souche E. coli BL21 T7XB transformée par le plasmide pLM7-OC-CRM : e Souche utilisée : E. coli BL21 T7XB/pLM7-OC-CRM (SEG ID NO: 10}. e Etape | : Préculture en flacon

Volume du flacon : 500 ml à 2L, ODsoo d’inoculation : 0,005, milieu de culture : YGP, kanamycine : 25 mg/L, température : 37°C, agitation : 270 rpm, durée de culture : 7h +/- 1h. e Etape 2: Culture en mode « batch »

Volume du bioréacteur : 50 L, milieu de culture : GYPSCI contenant g/L de glycerol et 5 g/L d'extrait de levure, température : 37°C, pH: 7,0, démarage au temps t = Oh de l'alimentation en milieu GYPSCI contenant 400 g/L de glycérol et 217,5 g/L d'extrait de levure en suivant une augmentation linéaire du taux d'alimentation de 0 à

10 127 g/h entre le temps t = 0 et à = 9h30. e Etape 3 : culture en mode « fed-batch » Démarrage au temps t = 9h30 de l'alimentation en milieu GYPSCI selon un taux de croissance exponentiel de 0,15 hl, température : 37°C, pH: 7,0, arrêt de l'alimentation exponentiel après +/- 10h lorsque la DO = 60 +/- 2. e Etape 4: Phase d'induction en mode « fed-batch » Adoption d'un taux de croissance exponentiel de 0,1 h7 pendant 6h puis d'un taux d'alimentation constant durant 14h, démarrage de l'induction par addition d'IPTG de façon à obtenir une concentration dans le réacteur de 2MM, température : 23°C, pH : 7,0, temps total de la phase d'induction : 20h. e Etape 5: Etape de collecte et de centrifugation Arrêt de l'étape 4 (phase d'induction) après 20h, température diminuée à 15°C, transfert du contenu du bioréacteur dans des pots de centrifugation, centrifugation à 7000 rpm (9000-9500 g), collecte des culots cellulaires, transfert dans des sacs en plastique et stockage desdits sacs en plastique à -20°C.

L'impact du changement de différents paramètres de culture (présence de kanamycine dans le milieu de culture, température et pH lors de l'induction) a été étudié et les résultats présentés dans le tableau 5. Dans les conditions optimisées par les inventeurs, l'absence de kanamycine n'affecie pas de façon significative le niveau d'expression de la SEG ID NO :12, ni la stabilité plasmidique (comparaison des conditions FOI, FO5 et F13). La température appliquée lors de l'induction est un paramètre impactant faiblement le niveau d'expression mais pas la stabilité plasmidique (comparaison des conditions FOI et FO2). Le pH est un paramètre impactant significativement le niveau d'expression et, dans une moindre mesure, la stabilité plasmidique ; un pH de 6,5 étant moins favorable tandis qu'un pH de 7,0 est optimal pour ces deux critères.

L'absence de kanamycine, une diminution de la température de 28 à 23°C lors de l'induction et un pH de 7,0 maintenu constant tout au long des étapes de culture permettent un bon rendement de production de la SEG ID NO :12.

a 5 Pro sc wu= — |. z æ : = - | 2 B S 3 5 & 5/5 D Et 88 KR da EE

Exemple 4.- Extraction périplasmique de la SEQ ID NO : 12

Après les différentes étapes de culture et d'induction, les bactéries E.coli BL21 T7XB transformées par le vecteur pLM7-OC-CRM (SEQ ID NO: 10} sont centrifugées et les pâtes cellulaires sont congelées à -20°C.

L'extraction périplasmique démarre par une décongélation des pâtes cellulaires de 1350 g pendant 15h +/- 5h à 6°C +/- 2°C.

Les pâtes cellulaires sont diluées dans un rapport 2 :1 (v/w) dans une solution hypertonique (Tris 50 MM, EDTA 5 MM, Sucrose 20%, pH 8,0), mélangées pendant 15 min et pompées à l'aide d'une première pompe dans un mélangeur à travers un anneau de diffusion dont le flux est de 121 ml/min.

Un choc osmotique de la suspension cellulaire est ensuite réalisé grâce à une dilution de la suspension cellulaire contenue dans le mélangeur à l'aide d'une solution hypotonique (MgCl2 5 MM) qui est pompée avec une deuxième pompe dans le mélangeur contenant la suspension cellulaire avec un flux de 279 ml/min et un rapport de dilution de 2,3:1 (v/v) de solution hypotonique.

La température de la solution hypotonique est comprise entre 4 et 8°C.

Le volume de la suspension cellulaire dans le mélangeur est de 200 ml et le temps de résidence de la suspension cellulaire dans le mélangeur est de 30 sec.

Une troisième pompe assure l'extraction de la suspension cellulaire du mélangeur, qui est collectée dans des pots de centrifugation, à un débit de 400 ml/min de manière à maintenir un volume de suspension cellulaire constant de 200 ml dans le mélangeur.

Un poids de 13509 de pâtes cellulaires donne approximativement 13,4 litres de suspension cellulaire ayant subi un choc osmotique.

La suspension cellulaire ayant subi un choc osmotique est centrifugée à 8000 rpm pendant 20 min (g = 9379 et facteur K = 3242). Les culots sont éliminés et le surnageant est clarifié par filtration. Exemple 5.- Clarification du surnageant contenant les composants de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO :12 La clarification du surnageant résultant de la centrifugation de la suspension cellulaire après choc osmotique (voir exemple 4) consiste en deux étapes de filtration en série. Pour la première filtration, le surnageant est pompé avec un débit de 400 ml/min au travers d'un filtre dont le maillage est de 0,8 — 0,45 um et dont l'aire est de 0,2 m2. La solution filtrée une première fois est ensuite pompé avec un débit de 400 ml/min au travers d’un deuxième filtre dont le maillage est de 0,45 - 0,22 um et dont l'aire est de 0,1 m2, ce qui permet d'obtenir une solution contenant un extrait périplasmique clarifié.

Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.

Claims

REVENDICATIONS

1. Vecteur d'expression chez un procaryote Gram négatif possédant les caractéristiques suivantes : (1) une origine de réplication à faible nombre de copies, ledit faible nombre de copies étant défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins, (ii) une séquence promotrice inductible à un agent inducteur exogène, (ii) Un site de liaison au riposome d'une force moyenne, ledit sie de liaison au ribosome d'une force moyenne correspond à une séquence en ARNm modifiée pour avoir une fixation au ribosome réduite, (iv) une séquence codant pour une protéine ayant une identité d'au moins 95% par rapport à SEQ ID NO :12 complète.

(v) Une séquence codant pour un peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d'au moins 95%, ledit peptide signal étant agencé pour permettre un adressage de ladite SEQ ID NO:12 vers un espace périplasmique.

2. Vecteur d'expression selon la revendication 1, dans lequel le résidu acide glutamique à la position 52 de SEQ ID NO :12 est maintenu.

3. Vecteur d'expression selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel la séquence promoitrice inductible présente une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :5 sur toute la longueur et est reconnue spécifiquement par une ARN polymérase du phage T7.

4. Vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le site de liaison au ribosome d'une force moyenne est défini par une séquence consensus SEQ ID NO :6 ou par la séquence consensus SEQ ID NO :6 comprenant un ajout et/ou une délétion et/ou une mutation ponctuelle de 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 nucléotides, ladite SEQ ID NO :6 étant localisée en amont d'un site d'initiation de la traduction.

5. Souche transformée de bactéries E. coli comprenant le vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications précédentes.

6. Souche transformée de bactéries selon la revendication 5, étant la souche E. coli BL21 définie par une délétion du prophage ADE3 à l'exception des gènes nécessaires à une expression de l'ARN polymérase du phage T7.

7. Procédé de production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur comprenant : (1) Une transformation d'une souche de E. coli par un vecteur permettant l'expression de ladite SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique de ladite E. coli, ladite expression étant inductible par un agent exogène, (i) Une culture de la souche E. coli transformée à une température substantiellement constante, par exemple de 37°C + 1°C , et un pH constant dans des conditions où la SEQ ID NO :12 n'est pas synthétisée par ladite souche E. coli transformée, (ii) une phase d'induction pendant une durée prédéterminée en présence dudit agent exogène et à une température réduite pour synthétiser et sécréter SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique de manière lente et contrôlée, (iv) optionnellement une récolte de la culture après ladite phase d'induction et après refroidissement, (v) optionnellement une collecte des bactéries cultivées contenant SEQ ID NO :12 dans l'espace périplasmique, (vi) optionnellement une extraction périplasmique de ladite SEQ ID NO :12 avec une séparation d'un culot solide contenant les bactéries et un surnageant contenant les éléments de l'espace périplasmique et la SEQ ID NO :12, et (vii optionnellement une purification de ladite protéine SEQ ID NO :12.

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la souche E. coli est la souche BL21 définie par une délétion du prophage \DE3 à l'exception des gènes nécessaires à une expression de l'ARN polymérase du phage T7.

9. Procédé selon la revendication 7 ou la revendication 8 dans lequel la production dans l'espace périplasmique d'un peptide ayant une identité d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :12 sur toute sa longueur est assurée par un peptide signal d'adressage dans l'espace périplasmique, ledit peptide signal présentant une identité de séquence à SEQ ID NO :2 d'au moins 95%.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel la température réduite est de 23°C + 0,5°C et/ou la durée prédéterminée de la phase d'induction est comprise entre 15 et 25 h, de préférence comprise entre 18 et 22 heures et plus particulièrement autour de 20h et/ou le pH de la phase d'induction est compris entre 6,8 et 7,5, de préférence entre 7,0 et 7,2.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel l'expression inductible par un agent exogène est réalisée par un système d'induction marche/arrêt et où ledit agent exogène est l'isopropyl-B-D-1- thiogalactopyranoside.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel la culture et la phase d'induction sont dépourvues d'antibiotiques.

13. Procédé selon une quelconque des revendications 7 à 12 dans lequel le vecteur d'expression est à faible nombre de copie défini par un nombre de copies du plasmide de 20 par cellule ou moins et/ou la séquence de liaison auribosome est de force moyenne.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, dans lequel la purification de la protéine SEQ ID NO :12 comprend les étapes successives de : () une clarification du surnageant issu de l'extraction périplasmique contenant les composants de l'espace périplasmique et la protéine par au moins une étape de filtration, de préférence deux étapes de filtration avec une récupération d'un filtrat comprenant SEQ ID NO :12, optionnellement, (ii) Une série d'étapes chromatographiques agencées pour récupérer SEQ ID NO :12 dans une fraction à conserver et les contaminants dans Une ou plusieurs fractions à éliminer, (ii) optionnellement, une élimination d'endotoxines résiduelles, et

(iv) optionnellement, une stérilisation de la fraction comprenant SEQ ID NO:12 à conserver, dépourvue d'endotoxines.

15. Methode de sélection d'un peptide signal de manière à optimiser une production d'une protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique de la bactérie E. coli dans lequel : - on génère une construction génétique comprenant un promoteur inductible au rnamnose ayant une identité de séquence d'au moins 95% par rapport à la SEQ ID NO :7 contrôlant l'expression de ladite protéine d'intérêt agencée avec ledit peptide signal à tester, - on transforme ladite E coli avec ladite construction génétique, - on réalise plusieurs cultures parallèles de ladite E. coli transformée dans un milieu de culture dépourvu de rnamnose, - on cultive ladite E. coli transformée en présence d'une concentration déterminée de rnamnose de manière à obtenir une induction faible de l'expression de ladite protéine d'intérêt et une autre culture de ladite E. coli transformée en présence d'une autre concentration déterminée de rnamnose de manière à obtenir une induction forte de l'expression de ladite protéine d'intérêt et, - on compare l'abondance de la protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique et, optionnellement, on quantifie les effets délétères au métabolisme sélectionnés parmi le groupe constitué de la perte du plasmide, la réduction de la biomasse bactérienne, la formation d'agrégats cytosoliques ou de produits de dégradation, un clivage partiel du peptide signal et,

- on sélectionne le peptide signal en fonction de l'abondance de la protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique et, optionnellement, en rejetant les peptides signaux associés aux effets délétères trop importants.