CN116496341A - 一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，通过对氨酰tRNA合成酶变体库的筛选获得能够识别酯化天冬氨酸的氨酰tRNA合成酶变体，基于遗传密码子扩展技术，将酯化天冬氨酸编码至目的蛋白，在中性或弱碱性条件下孵育，酯化天冬氨酸位点首先转化为琥珀酰亚胺中间体，然后在碱性条件下相对快速地水解获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。本发明成功地在蛋白质特定位点快速构建异天冬氨酸修饰，极大地缩短制备异天冬氨酸修饰蛋白的时间，不受蛋白氨基酸序列的限制，并可与噬菌体展示方法相结合，用于含有异天冬氨酸多肽药物的研发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法。
背景技术
一般来说，蛋白质由20种L型α氨基酸按照特定的序列通过肽键连接而成。蛋白质在核糖体完成生物合成后，其蛋白质侧链经常会发生各种蛋白质翻译后修饰(PTM)，极大地增加了细胞内蛋白质组的结构和功能多样性，影响蛋白质的稳定性、生物活性、蛋白质间相互作用以及细胞定位等。其中，异天冬氨酸(isoD)的形成是一种普遍存在的翻译后修饰，由自发的Asn脱酰胺或Asp异构化经琥珀酰亚胺中间体(Suc)而形成。isoD的形成将亚甲基插入蛋白质骨架，产生“扭结”，并可能极大地改变蛋白质的结构和功能，从而在无数生物学过程发挥关键作用。在大多数情况下，isoD的形成被认为是蛋白质损伤；另一方面，它也可能在信号传递和调节中发挥作用。但由于其形成速率较慢，获得isoD特异性位点修饰的蛋白困难，这一领域的研究受到严重阻碍。
目前构建isoD蛋白的主要方法是通过Asn或Asp自发的脱酰胺或脱水，但该反应速率很大程度取决于Asn/Asp的C侧相邻氨基酸残基以及Asn/Asp所处位点的蛋白柔顺性，通常在生理条件下其半衰期在1到1000天之间，甚至更长。另外，科学家还通过全合成、表达蛋白连接及羧酸活化等方法获得含有isoD修饰的蛋白，但都存在明显的局限性。
遗传密码子扩展技术(GCE)可以将带有不同结构和功能的非天然氨基酸(ncAA)引入目标蛋白，作为生物物理探针、光交联剂、PTM和药物偶联物对蛋白质进行修饰，在生物学研究和医学应用方面发挥重要作用。蛋白质L-异天冬氨酸甲基转移酶(PIMT)能够通过甲基化isoD侧链促使Suc中间体重新形成，进而部分水解转化为Asp。
目前，尚未有基于GCE获得含有isoD修饰蛋白的构建方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法。
本发明的技术方案概述如下：
含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，包括如下步骤：
(1)将含有氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5和pRep-PylT(GFPuv)质粒的感受态细胞置于液体培养基中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养；收取生长的细胞，提取DNA；
所述氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述pRep-PylT(GFPuv)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)获得的DNA电转至含有pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的感受态细胞中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和阿拉伯糖的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养，收取板上生长的细胞，提取DNA；
所述pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)将步骤(2)获得的DNA电转至含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的感受态细胞，复苏后涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基；待所述培养基晾干后倒置培养；
(4)挑取步骤(3)倒置培养得到的单克隆至含有卡那霉素和四环素的液体培养基中孵育至饱和；对饱和菌液稀释后，分别涂于两种固体培养基上；其一种是含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基，为实验组；另一种是含有卡那霉素、四环素和氯霉素的固体培养基为对照组；待各自的培养基晾干后倒置培养；通过对照实验，将实验组的固体培养基上有明显生长优势而对照组对应位置未长菌的实验组的单克隆挑至含有卡那霉素的液体培养基中，孵育至饱和后提取质粒；
(5)对步骤(4)获得的质粒测序，获得能够识别酯化天冬氨酸的氨酰tRNA合成酶变体，基于遗传密码子扩展技术，得到含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白；
(6)将步骤(5)获得的含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白在缓冲液1中孵育，获得含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白；
(7)将步骤(6)获得的含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白在缓冲液2中孵育，获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。
所述蛋白为泛素、绿色荧光蛋白或SUMO-sfGFP融合蛋白，还可以是其它蛋白。
缓冲液1优选pH＝5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
缓冲液2优选pH＝7.4-11.0的磷酸盐缓冲液。
本发明具有以下优点：
(1)本发明成功在蛋白质特定位点快速构建isoD。
(2)本发明可极大地缩短制备isoD修饰蛋白的时间，不受蛋白氨基酸序列的限制。
(3)本发明可与噬菌体展示方法相结合，用于isoD多肽药物的研发。
附图说明
图1为利用遗传密码子扩展技术构建含有异天冬氨酸修饰蛋白的反应示意图。
图2为isoD的形成及通过hPIMT修复验证。
图3：Ub-62BnD-63G纯化蛋白质谱
图4：Ub-62Suc-63G形成质谱
图5：Ub-62isoD-63G形成质谱
图6：hPIMT修复验证Ub-62isoD-63G形成质谱
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
大肠杆菌感受态细胞E.coil DH10B为市售。
含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞的制备，包括如下步骤：
将质粒pRep-PylT(GFPuv)(SEQ ID NO.2)电转至大肠杆菌感受态细胞E.coilDH10B中，加入1mL2-YT培养基，37℃，220rpm复苏1h后，取10μL涂布于含有25μg/mL四环素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养约10h；之后，从板上挑取一个单克隆菌落，接种于10mL含有25μg/mL四环素的2-YT培养基中，37℃，220rpm过夜培养；将饱和菌液稀释100倍接种于1L含有25μg/mL四环素的2-YT培养基中，37℃，220rpm孵育，待菌液OD600为0.6时，将锥形瓶放置在冰上晃动，使菌液迅速降温；接着转移菌液到500mL离心筒中，4℃，6000rpm离心7min，弃上清；用1L体积浓度10％甘油水溶液，重悬细胞后，4℃，6000rpm离心7min，弃上清；然后使用10％甘油重复洗涤两次；最后，在冰上用离心筒中残留的10％甘油将菌体重悬，每管50μL分装并使用液氮速冻，获得含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coilDH10B感受态细胞。
含有氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5和pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞的制备，包括如下步骤：
将氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5(SEQ ID NO.1)电转至含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞中，37℃，220rpm复苏1h后，全部涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL四环素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养10h；加入2-YT培养基，使用细胞推刮器将细胞刮下后加入终浓度10％的甘油，每管109个细胞分装并保存于-80℃，获得含有氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5和pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞。
含有pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞的制备，包括如下步骤：
将质粒pNeg-PylT-barnase(2TAG)(SEQ ID NO.3)电转至大肠杆菌感受态细胞E.coil DH10B中，加入1mL 2-YT液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，取10μL涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱倒置培养10h；之后，从板上挑取一个单克隆菌落，接种于10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的2-YT液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养；将饱和菌液稀释100倍接种于1L含有100μg/mL氨苄青霉素的2-YT液体培养基中，37℃，220rpm孵育，待菌液OD600为0.6时，将锥形瓶放置在冰上晃动，使菌液迅速降温；接着转移菌液到500mL离心筒中，4℃，6000rpm离心7min，弃上清；用1L 10％甘油重悬细胞后，4℃，6000rpm离心7min，弃上清；然后使用10％甘油重复洗涤两次；最后，在冰上用离心筒中残留的10％甘油将菌体重悬，每管50μL分装并液氮速冻，获得含有pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞。
实施例1
1.特异性氨酰tRNA合成酶的筛选步骤：
(1)将含有氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)和pRep-PylT(GFPuv)质粒(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2)的大肠杆菌E.coilDH10B感受态细胞置于1mL 2-YT液体培养基中，37℃，220rpm复苏1h后，将其全部涂布于含有50μg/mL卡那霉素、25μg/mL四环素、40μg/mL氯霉素和2mM L-天冬氨酸-4-苄酯(BnD)的LB固体培养基上；待所述培养基晾干后，于37℃恒温培养箱倒置培养48h；收取生长的细胞，提取DNA；
(2)将步骤(1)获得的DNA电转至含有pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3)的大肠杆菌E.coil DH10B感受态细胞中，于1mL 2-YT液体培养基中，37℃，220rpm复苏1h后，将其全部涂布于含有50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄青霉素、2mg/mL阿拉伯糖的LB固体培养基上；待培养基晾干后，于37℃恒温培养箱倒置培养12h；之后，收取生长的细胞，提取DNA。
(3)将步骤(2)获得的DNA电转至含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的大肠杆菌E.coilDH10B感受态细胞，于1mL 2-YT液体培养基中，37℃，220rpm复苏1h后，取50μl涂布于含有50μg/mL卡那霉素、25μg/mL四环素、50μg/mL氯霉素和2mM BnD的LB固体培养基；待LB固体培养基晾干后，于37℃恒温培养箱倒置培养48h。
(4)挑取96个步骤(3)倒置培养得到的单克隆至400μL含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL四环素的2-YT液体培养基中，37℃，220rpm过夜孵育至饱和；使用2-YT液体培养基对饱和菌液进行100倍稀释后，用排枪分别点涂3μL于两种LB固体培养基上；
其一种是含有50μg/mL卡那霉素、25μg/m四环素、50μg/mL氯霉素和2mM BnD的LB固体培养基，为实验组；另一种是含有50μg/mL卡那霉素、25μg/m四环素和50μg/mL氯霉素的LB固体培养基为对照组；(对照组不加入BnD)；
待各自的培养基晾干后，于37℃恒温培养箱倒置培养10h，通过对照实验，将实验组的固体培养基上有明显生长优势而对照组对应位置未长菌的实验组的单克隆挑至含有50μg/mL卡那霉素的4mL 2-YT液体培养基中，37℃，220rpm孵育至饱和后提取质粒；
(5)对步骤(4)获得的质粒进行测序，获得能够识别BnD的氨酰tRNA合成酶变体，即BnDRS；
表1：BnDRS测序结果
| 267 | 271 | 311 | 313 | 349 | |
| BnDRS1 | GCC | TAC | TGT | TCG | TTT |
| BnDRS2 | GCG | TAT | TCT | GCG | CTG |
| BnDRS3 | GCT | TAT | TGT | GCG | TTT |
| BnDRS4 | GCG | ATG | TGT | TCT | TTT |
| BnDRS5 | GCG | TTT | TGT | GCT | CTT |
| BnDRS6 | GCT | ATG | TCG | GCT | TTT |
包括BnDRS1：N311C、C313S和Y349F；
BnDRS2：N311S、C313A和Y349L；
BnDRS3：N311C、C313A和Y349F；
BnDRS4：Y271M、N311C、C313S和Y349F；
BnDRS5：Y271F、N311C、C313A和Y349L；
BnDRS6：Y271M、N311S、C313A和Y349F。
BnDRS能够识别吡咯赖氨酰-tRNA(tRNAPyl)，在大肠杆菌E.coil DH10B中通过(遗传密码子扩展技术GCE，见图1)将BnD编码至目的蛋白泛素Ub(也可以选用绿色荧光蛋白或SUMO-sfGFP融合蛋白)的特定位点62位并将63位的K突变为G，这里涉及的特定位点由编码目的蛋白基因中人为引入的终止密码子(如TAG)定义。将蛋白纯化后使用截留分子量3KD的超滤管将溶液置换为pH 7.4的磷酸盐缓冲液获得的含有BnD位点修饰的蛋白Ub-62BnD-63G(见图3)；
(6)将步骤(5)获得的含有BnD位点修饰的蛋白Ub-62BnD-63G在20mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液(缓冲液1)中37℃孵育3h便能将Ub-62BnD-63G完全转化(见图4)，其中90％为Ub-62Suc-63G，10％为Ub-62D/isoD-63G的混合物，获得含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白；
缓冲液1也可以选用pH＝5.0或pH＝8.0的磷酸盐缓冲液或pH＝5.0、pH 7.4或pH＝8.0的醋酸盐缓冲液)
(7)将步骤(6)获得的含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白Ub-62Suc-63G在100mM pH 11.0的磷酸盐缓冲液(缓冲液2)中，37℃孵育30min便完全水解为Ub-62D/isoD-63G(见图5)，其中Ub-62isoD-63G约占76％，获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。
缓冲液2也可以选用pH＝7.4或pH＝11.0的磷酸盐缓冲液。
(8)将步骤(7)获得的含有异天冬氨酸修饰的蛋白Ub-62D/isoD-63G与1当量的hPIMT、1mM S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)和1mM DTT再100mM pH 8.0的HEPES缓冲液中孵育6h，产生异天冬氨酸甲基化产物(见图6)，验证步骤(7)获得了含有异天冬氨酸修饰的蛋白。
操作步骤(6)(7)(8)的反应示意图见图2。
尽管上面对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明的宗旨的情况下，还可以作出更多变形，这些均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.含有异天冬氨酸修饰蛋白的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将含有氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5和pRep-PylT(GFPuv)质粒的感受态细胞置于液体培养基中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养；收取生长的细胞，提取DNA；
所述氨酰tRNA合成酶变体库pBK-MbPylRS-NNK5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述pRep-PylT(GFPuv)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)将步骤(1)获得的DNA电转至含有pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的感受态细胞中，复苏后将其涂布于含有卡那霉素、氨苄青霉素和阿拉伯糖的固体培养基上；待所述培养基晾干后倒置培养，收取板上生长的细胞，提取DNA；
所述pNeg-PylT-barnase(2TAG)质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)将步骤(2)获得的DNA电转至含有pRep-PylT(GFPuv)质粒的感受态细胞，复苏后涂布于含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基；待所述培养基晾干后倒置培养；
(4)挑取步骤(3)倒置培养得到的单克隆至含有卡那霉素和四环素的液体培养基中孵育至饱和；对饱和菌液稀释后，分别涂于两种固体培养基上；其一种是含有卡那霉素、四环素、氯霉素和酯化天冬氨酸的固体培养基，为实验组；另一种是含有卡那霉素、四环素和氯霉素的固体培养基为对照组；待各自的培养基晾干后倒置培养；通过对照实验，将实验组的固体培养基上有明显生长优势而对照组对应位置未长菌的实验组的单克隆挑至含有卡那霉素的液体培养基中，孵育至饱和后提取质粒；
(5)对步骤(4)获得的质粒测序，获得能够识别酯化天冬氨酸的氨酰tRNA合成酶变体，基于遗传密码子扩展技术，得到含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白；
(6)将步骤(5)获得的含有酯化天冬氨酸位点修饰的蛋白在缓冲液1中孵育，获得含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白；
(7)将步骤(6)获得的含有琥珀酰亚胺位点特异性修饰的蛋白在缓冲液2中孵育，获得含有异天冬氨酸修饰的蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述蛋白为泛素、绿色荧光蛋白或SUMO-sfGFP融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述缓冲液1为pH＝5.0-8.0的磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1或所述的方法，其特征是所述缓冲液2为pH＝7.4-11.0的磷酸盐缓冲液。
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