CN116200397A - 密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种密码子优化的牦牛Beta‑乳球蛋白的基因、该基因在制备牦牛Beta‑乳球蛋白中的应用、一种表达载体、一种高效表达牦牛Beta‑乳球蛋白的酵母菌株和一种制备牦牛Beta‑乳球蛋白的方法。通过上述技术方案，本发明能够高效发酵生产牦牛Beta‑乳球蛋白，因此可以用于制备具有更高应用价值的人造乳食品、营养添加剂、生物医药和日用化妆品制品。

Description

密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因、该基因在制备牦牛Beta-乳球蛋白中的应用、一种表达载体、一种高效表达牦牛Beta-乳球蛋白的酵母菌株和一种制备牦牛Beta-乳球蛋白的方法。
背景技术
Beta-乳球蛋白是乳清蛋白中的主要成分，其分子量为18kDa，约占乳清蛋白含量的50-55重量％，占整个鲜奶蛋白质的7-12重量％。Beta-乳球蛋白支链氨基酸含量丰富，能作为能源物质提供能量。Beta-乳球蛋白富含半胱氨酸和甲硫氨酸，能够用于维持体内的谷胱甘肽水平，发挥抗氧化作用。Beta-乳球蛋白还含有大量的赖氨酸和精氨酸，能刺激代谢激素的分泌，促进肌肉生长。Beta-乳球蛋白还可以与矿物质(如锌、钙)、脂溶性维生素(VA、VE)和脂质相结合，具有抗氧化和抗病毒活性。添加Beta-乳球蛋白可以改善酸乳产品的风味、质构，提高酸乳中营养物质的可吸收性。Beta-乳球蛋白具有多个配体结合位点，能有效包埋、传递和保护生物活性成分使其免受氧化和降解，是重要的绿色生物载体，可以用于负载脂溶性功能因子如视黄醇类、叶酸、白藜芦醇、儿茶素、橙皮苷、槲皮素、茶多酚、磷脂、姜黄素、脂肪酸、月桂酸酯和胆固醇等。因此Beta-乳球蛋白在营养添加剂、生物医药与药妆领域具有巨大的应用场景与市场需求。
近些年来，在食品、洗涤剂、造纸、化学、制药和药妆行业中，为了克服天然来源蛋白质提取的困难，并且降低成本，重组蛋白质被广泛使用。但是，仍然需要进一步提高Beta-乳球蛋白的表达量。
发明内容
本发明的目的在于进一步提高Beta-乳球蛋白的表达量。
为了实现上述目的，本发明提供了一种密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了如上所述的基因在制备牦牛Beta-乳球蛋白中的应用。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因并形成表达SEQ ID NO.2所示的Beta-乳球蛋白的表达框。
可选地，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种高效表达牦牛Beta-乳球蛋白的酵母菌株，所述酵母菌株为导入有如上所述的表达载体的毕赤酵母。
本发明还提供了一种制备Beta-乳球蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述Beta-乳球蛋白。
可选地，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
通过上述技术方案，本发明得到了能够使得Beta-乳球蛋白在毕赤酵母中高表达，因此可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是牦牛Beta-乳球蛋白人工高效表达模块的结构示意图。
图2是优化的牦牛Beta-乳球蛋白在酵母菌株中的高效分泌表达结果。M，标准分子量；GS-BgrLG，本发明构建的菌株的发酵液中分泌表达的牦牛Beta-乳球蛋白BgrLG。
图3是对分泌表达蛋白进行质谱检测，得到的短肽在牦牛Beta-乳球蛋白序列中的比对结果。粗体字代表匹配序列。
图4是基因人工优化牦牛Beta-乳球蛋白BgrLG与原始基因牦牛Beta-乳球蛋白WtLG的表达量比较。M，标准分子量；1，表达原始基因的重组菌株GS-WtLG；2，表达优化后基因的重组菌株GS-BgrLG。方框标记了发酵液中分泌表达的牦牛Beta-乳球蛋白。
序列表说明
SEQ ID NO.1是密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2是密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3是构建的牦牛Beta-乳球蛋白的高效表达载体的核苷酸序列；
SEQ ID NO.4是牦牛Beta-乳球蛋白的野生型基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5是Beta-乳球蛋白定量分析上游引物BgrLG-F。
SEQ ID NO.6是Beta-乳球蛋白定量分析下游引物BgrLG-R。
SEQ ID NO.7是看家基因GAP定量分析上游引物GAP-F。
SEQ ID NO.8是看家基因GAP定量分析下游引物GAP-R。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了如上所述的基因在制备牦牛Beta-乳球蛋白中的应用。如上所述的Beta-乳球蛋白的基因能够显著地提高牦牛Beta-乳球蛋白在毕赤酵母中的表达量。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体插入有如上所述的基因并形成表达SEQ ID NO.2所示的牦牛Beta-乳球蛋白的表达框。
其中，SEQ ID NO.2的序列中，1-169位的氨基酸为牦牛Beta-乳球蛋白的主体，末尾的6个氨基酸为纯化标签。
其中，可以根据宿主的适配性，选择合适的表达载体，例如淼灵生物公司的pPIC9K表达载体。
可选地，如图1所示，该表达载体插入有牦牛Beta-乳球蛋白表达模块，所述表达载体为pPIC-LG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种高效表达Beta-乳球蛋白的酵母菌株，所述酵母菌株为导入有如上所述的表达载体的毕赤酵母。
其中，毕赤酵母可以为各种商业使用的毕赤酵母表达菌株，例如淼灵生物公司的酵母表达菌株GS115。
本发明还提供了一种制备Beta-乳球蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中获得所述Beta-乳球蛋白。
可选地，所述培养的条件可以包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体pPIC9K：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株GS115：为淼灵生物公司市售产品。
实施例1
如图1所示，本实施例举例说明牦牛Beta-乳球蛋白表达模块的构建过程。
首先，利用化学合成法合成靶标牦牛Beta-乳球蛋白密码子优化后的编码基因BgrLG。构建靶标Beta-乳球蛋白表达功能模块。
然后，添加限制性内切酶SnaBI与NotI序列连接酵母表达载体pPIC9K多克隆位点中构建载体pPIC-BgrLG。
接着，利用限制性内切酶Sal I切割将验证正确的阳性重组表达载体pPIC-BgrLG，制备线性化质粒DNA，电击转化(1.5kV，25μF，200Ω)毕赤酵母GS115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用菌落PCR进行鉴定并测序验证。
鉴定结果和测序结果表明，成功构建了靶标牦牛Beta-乳球蛋白编码基因BgrLG表达功能模块。将表达模块连接载体pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC-BgrLG(图1)，并转化至毕赤酵母中进行整合。研究结果显示，成果构建了牦牛Beta-乳球蛋白酵母表达酵母菌株GS-BgrLG。
实施例2
本实施例用于举例说明Beta-乳球蛋白在毕赤酵母中的高效表达。
本实施例使用实施例1构建的牦牛Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG和对照酵母表达菌株GS115。
首先，挑取Beta-乳球蛋白菌株至种子液培养基(培养基成分包括20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖)中，在30℃下培养20小时。
接着，以2％浓度转接于100mL发酵培养基(培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇)中，在30℃下转速220rpm下摇瓶发酵72小时，每隔24h补加一次甲醇(甲醇的补加量为5mL/L)。然后，离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的His-Tag标签，Ni-NTA-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况(图2)，通过MS质谱分析鉴定表达产物(图3)。
实验结果显示，构建的带有牦牛Beta-乳球蛋白基因表达功能模块的酵母表达菌株GS-BgrLG能够通过摇瓶发酵诱导Beta-乳球蛋白高效异源表达，质谱鉴定显示表达蛋白为牦牛Beta-乳球蛋白。结果显示，表达菌株GS-BgrLG表达的Beta-乳球蛋白的胞外浓度高达为352mg/L，达到工业生产水平。
实施例3
本实施例用于举例说明优化后的Beta-乳球蛋白编码基因显著提高了毕赤酵母表达量。
首先，利用化学合成法合成靶标牦牛Beta-乳球蛋白的原始编码基因WtLG，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示
然后，应用实施例1相同方法构建了原始牦牛Beta-乳球蛋白基因WtLG的酵母表达菌株GS-WtLG。
接着，以实施例1构建的牦牛Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG和对照表达原始基因WtLG的酵母表达菌株GS-WtLG为出发菌株。以2％浓度转接与发酵培养基(培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇)中，在30℃下转速220rpm下摇瓶发酵72小时，隔天补加一次甲醇(甲醇的补加量为5mL/L)。离心收集发酵上清液，并通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况(图4)。
实验结果显示，构建菌株GS-BgrLG能够明显检测到诱导表达的Beta-乳球蛋白BgrLG，而表达原始基因序列的菌株GS-WtLG只能看到微弱条带。经过Ni-NTA-resin纯化柱纯化靶标乳蛋白并蛋白表达量比较，结果显示，牦牛Beta-乳球蛋白原始基因的表达菌株GS-WtLG的表达量为1.34mg/L，而优化基因序列的表达菌株GS-BgrLG表达量是GS-WtLG菌株的262倍。
实施例4
本实施例用于举例说明牦牛Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG中BgrLG基因插入拷贝数量。
本实施例使用实施例1构建的牦牛Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG。利用实时荧光定量PCR方法进行了检测。
首先，选取毕赤酵母看家基因GAP为内参基因，并以BgrLG和GAP基因为模板设计实时定量引物。
引物 序列
BgrLG-F TGTTCAAGATAGACGCGCTGA(SEQ ID NO.5)
BgrLG-R TTGGGTTGAAGCTGAGACGG(SEQ ID NO.6)
GAP-F GGTATTAACGGTTTCGGACGTATTG(SEQ ID NO.7)
GAP-R GATGTTGACAGGGTCTCTCTCTTGG(SEQ ID NO.8)
接着，接种Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG于液体培养基中，在30℃下培养20小时，提取基因组测定基因组浓度与纯度。
然后，取抽提的GS-BgrLG基因组样品，将进行10倍稀释，得到原液、10-1、10-2、10-3四个梯度。同样分别以BgrLG-F和BgrLG-R、GAP-F和GAP-R为引物进行荧光定量PCR。每个梯度重复测定3次。随后，根据标准曲线，以单拷贝GAP基因为基准，用GS-BgrLG基因的拷贝数与GAP基因的拷贝数的比值即为GS-BgrLG基因在毕赤酵母基因组中的起始拷贝数。
实验结果显示，牦牛Beta-乳球蛋白表达模块菌株GS-BgrLG中BgrLG的基因拷贝数数值在4.46～6.28之间，考虑系统误差选取平均值。工程酵母菌株GS-BgrLG中BgrLG的基因拷贝数为5。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.密码子优化的牦牛Beta-乳球蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的基因在制备牦牛Beta-乳球蛋白中的应用。
3.一种表达载体，其特征在于，该表达载体插入有权利要求1所述的基因并形成表达SEQ ID NO.2所示的牦牛Beta-乳球蛋白的表达框。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种高效表达牦牛Beta-乳球蛋白的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为导入有权利要求3-4中任意一项所述的表达载体的毕赤酵母。
6.一种制备牦牛Beta-乳球蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求5所述的酵母菌株进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述Beta-乳球蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨和5-20g/L的酵母提取物。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基的成分还包括1-2g/L的无氨基酵母氮源。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养基的成分还包括0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述培养的条件还包括：培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
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