EP1692291A2 - Systeme d'expression inductible de proteines recombinantes chez les cyanobacteries - Google Patents

Systeme d'expression inductible de proteines recombinantes chez les cyanobacteries

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Publication number
EP1692291A2
EP1692291A2 EP04805507A EP04805507A EP1692291A2 EP 1692291 A2 EP1692291 A2 EP 1692291A2 EP 04805507 A EP04805507 A EP 04805507A EP 04805507 A EP04805507 A EP 04805507A EP 1692291 A2 EP1692291 A2 EP 1692291A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cyanobacteria
expression
vector
protein
nir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04805507A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Etienne Weiss
Dominique Desplancq
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Original Assignee
Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Louis Pasteur Strasbourg I filed Critical Universite Louis Pasteur Strasbourg I
Publication of EP1692291A2 publication Critical patent/EP1692291A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to an inducible expression system for cyanobacteria, allowing the expression of recombinant proteins as well as the vectors and cyanobacteria containing this expression system.
  • Cyanobacteria are photo-autotrophic organisms. These bacteria are capable of growing on a minimum medium containing carbonate as the sole source of carbon, nitrites, nitrates or ammonium as the sole source of nitrogen and mineral salts. Energy is supplied by light through photosynthesis.
  • Patent application FR 2 820 758 describes a system for expression and for constitutive labeling of recombinant proteins in the cyanobacterium Anahaena from the tac promoter of the bacterium E. coli. The system developed in this patent application thus makes it possible to use, for the growth of the cyanobacterium, an inexpensive labeled medium containing Na 15 NO 3 and NaH 13 CO 3 as sources of labeled nitrogen and carbon.
  • An object of the invention is thus a method of expression of recombinant proteins in cyanobacteria from a sequence of promoter of inducible transcription of cyanobacteria.
  • Another object of the invention consists of a vector containing a sequence encoding a protein under the control of an inducible cyanobacterium transcription promoter sequence.
  • Another object of the invention consists in the use of a vector of this type in cyanobacteria for the expression of recombinant proteins in these bacteria.
  • Another object of the invention consists of a cyanobacterium containing a vector of this type.
  • Figure 1A shows the accumulation of the MBP protein as a function of time (in days) in an Anahaena sp. PCC 7120 transformed by the plasmid pNirMBP and induced.
  • Figure 1B shows the accumulation of the MBP protein as a function of time (in days) in an Anahaena sp. PCC 7120 transformed by the plasmid pTacIndMBP and induced.
  • Figure 2 shows a comparison of the quantities of proteins synthesized before and after induction of the bacteria Anahaena sp.
  • PCC 7120 transformed either by the plasmid ipNirMBP or by the plasmid pTacIndMBP.
  • Figure 3 shows Anahaena cells expressing ⁇ -galactosidase respectively (visible microscope photography) and GFP (Green Fluorescent Protein) (fluorescent microscope photography) in an inductive condition (NO 3 " ) or not expressing these proteins in the presence of the NH 4 + repressor.
  • the invention thus relates to a process for the expression of recombinant proteins, characterized in that it consists in introducing into cyanobacteria a sequence encoding a protein downstream of a promoter sequence of inducible transcription of cyanobacteria then in inducing expression of this protein and isolate the recombinant proteins thus synthesized.
  • cyanobacteria Unlike E. coli, there is no commercially available expression system in cyanobacteria. Only a few examples of heterologous expressions in cyanobacteria have been reported in the literature and the expression of these proteins is generally under the control of a constitutive cyanobacterium promoter.
  • Inducible expression in cyanobacteria could be achieved through the use of inducible promoters which have been shown to function in cyanobacteria such as the P L promoter of bacteriophage lambda ( ⁇ P L ), the trc promoter or the tac promoter of E. coli. These three promoters require the expression of their own repressor in cyanobacteria to allow regulation of the promoter.
  • the promoter ⁇ P L which is inducible by an increase in temperature to 42 ° C is not suitable in our case because Anahaena sp. PCC 7120 cannot grow at temperatures above 30 ° C.
  • the tac and trc promoters are two promoters that work in a similar fashion, they are both repressed by the Lad repressor of the lac operon and induced in the presence of IPTG, a lactose analog.
  • the expression tests with the tac promoter have been disappointing.
  • the amount of recombinant protein expressed after induction is very low (about 10 times less than that obtained with a constitutive tac promoter
  • cyanobacteria do not have the lacY gene for lactose permease which allows efficient entry of the LPTG inducer into cells. So far, very few inducible promoters have been characterized in cyanobacteria. Certain promoters of cyanobacteria are inducible by metals or minerals.
  • cyanobacteria a promoter which controls the expression of the nir operon, which is involved in the assimilation of nitrate in cyanobacteria. This operon is induced in the presence of nitrate and also well repressed by ammonium (Frias, JE et al, 1997, J. Bacte ⁇ ol,
  • the process for expressing recombinant proteins according to the invention uses as transcription promoter sequence that of the operon nir of cyanobacteria, a sequence which is induced in the presence of nitrate and / or nitrite in the medium and preferably in the presence of NaNO 3 . It is important to note that the start of the nir promoter in cyanobacteria is extremely rapid and is induced a few hours after incubation of the bacteria in a medium containing nitrate as nitrogen source instead of ammonium.
  • the cyanobacterium used is preferably of the Anahaena species and more particularly Anahaena sp.
  • PCC 7120 strain available at the Collection of Cultures of the Institut Pasteur, Paris
  • a filamentous bacterium which is capable of growing on minimum media containing 13 C and / or 15 N and / or 2 H to produce low cost of the recombinant proteins labeled for NMR analysis.
  • the culture medium of these cyanobacteria used for the labeling of expressed recombinant proteins contains at least Na 15 NO 3 .
  • constitutive expression system expression of proteins takes place throughout the cell cycle
  • the constitutive expression of such proteins in the cell results in a loss of expression due to a rearrangement of the expression vector.
  • the invention thus relates to the expression of recombinant proteins in which the expressed recombinant protein is toxic to cyanobacteria.
  • this nitrate-inducible expression system based on the promoter of the operon nir of cyanobacteria makes it possible to control the expression of the protein of interest. In the absence of an inducer in the culture medium, the protein is not produced because the promoter is repressed. Induction of expression is obtained when the source of nitrogen in the medium is either nitrates or nitrites or both.
  • Another object of the invention is also a vector containing a DNA sequence coding for a recombinant protein under the control of a promoter sequence of transcription inducible of cyanobacteria.
  • the DNA sequence comprising the genetic information necessary for the expression of a recombinant protein under the control of a transcription promoter sequence according to the invention can be included in any vector commonly used by those skilled in the art.
  • the inducible transcription promoter sequence of cyanobacteria is that of the operon nir of cyanobacteria.
  • the present invention also relates to the use of a vector according to the invention for the expression of recombinant proteins in cyanobacteria.
  • the vectors are used in cyanobacteria cultivated in a medium which contains 13 C and / or 15 N and / or 2 H, and more preferably still in a medium which contains at least Na 15 NO 3 .
  • Another object of the invention is also a cyanobacterium transformed by a vector according to the invention.
  • this cyanobacterium is of the species Anahaena and more preferably Anahaena sp. PCC 7120.
  • This expression system makes it possible to solve the problems of loss of expression encountered during the production of toxic proteins in the constitutive system.
  • the expression levels obtained using this system are very high, of the order of 100 mg / L.
  • This system shows an efficiency equivalent to the best expression systems developed in E. coli, in particular the T7 system (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol. 189, 113-130).
  • the recombinant protein can indeed represent more than 30% of the total cellular proteins.
  • This system is therefore particularly suitable for the production of tens of milligrams of proteins labeled 13 C, 15 N, and 2 H for NMR.
  • Substrates labeled are added only at the time of induction of protein expression, which reduces labeling costs compared to the constituent expression system. Indeed, with the constitutive tac system (Desplancq et al., 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217) during labeling with 13 C in a fermenter, 90% of NaH 13 CO 3 is lost in CO 2 form during aeration of the argon fermenter and must be compensated by regular additions of NaH 13 CO 3 throughout the duration of the fermentation (8 to 10 days).
  • the use of NaH 13 CO 3 only during the expression period (5 days) of the recombinant protein thus limits the amounts of substrate labeled NaH 13 CO 3 used and therefore reduces the cost of labeling. at 13 C.
  • these bacteria are capable of overproducing labeled recombinant proteins with an isotopic enrichment rate equivalent to that obtained in E. coli, but at a cost approximately 10 times less.
  • the high levels of expression in the inducible expression system according to the invention make it possible not only to reduce the culture volumes used and consequently the labeling costs but also to more easily produce deuterated proteins because, in E. coli, culture in a deuterated medium generally results in a reduction of the expression rate by a factor 3 to 4 times.
  • cyanobacteria directly use 2 H 2 O as a deuterated substrate. This makes it possible to recycle the deuterated medium and to reuse it for new markings.
  • the 2 H labeling of recombinant proteins in cyanobacteria therefore makes it possible to significantly reduce the cost of 2 H labeling.
  • the following examples illustrate the invention without limiting it in any way.
  • Example No. 1 Construction of the vector p7 ⁇ c and its derivatives pTacMBP. pTacGyrBf 1-219). pTacGST-E6. ptacMBP-E6 ct ptacMBP-YZD2.
  • the vector pRL25Cmcs was obtained by digesting the vector pRL25C (Wolk et al, 1988, J. Bacteriol.
  • the fragment coding for the tac promoter was obtained by digestion of the vector pKK223.3 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) with the restriction enzymes Xmnl and Sspl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). This fragment was then ligated into the vector pRL25Cmcs previously digested with SmaI and dephosphorylated with calf intestine phosphatase (New England Biolabs) to give the vector p7 ⁇ c.
  • the genes coding for the protein GST-E6 (fusion protein comprising glutathione-S-transferase (GST) and the protein E6 of the HPV16 virus), the protein MBP-E6 (fusion protein comprising the maltose-binding protein (MBP) and the E6 protein of the HPV16 virus) and the MBPY-ZD2 protein (fusion protein comprising the maltose binding protein (MBP) and the C-terminal domain of the oncoprotein E6, (YZD2)) were obtained by PCR from plasmids pETGST- E6, pETMBP-E6 and pETMBP-YZD2.
  • the latter vector is identical to the vector MBP-E6-C4C / 4S (Norniné et al, 2003 Biochem. 42, 4909-4917).
  • the vectors pETGST-E6 and pETMBP-E6 were constructed as follows: the gene coding for the protein E6 was obtained by PCR with the following oligonucleotides 5 ′ - ATCCGGGGTCTCCCATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGAC and 5 ′ - ATCCGGGGTCTCGGTACCGCGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
  • This PCR fragment was then digested with the restriction enzymes Ncol and Kpn1 and ligated with the vector pETM-30 previously linearized with the enzymes Ncol and Kpnl to give the vector pETGST-E6.
  • This same PCR fragment coding for the protein E6 and digested with the restriction enzymes Ncol and Kpnl was also ligated with the vector pETM-41 previously linearized with the enzymes Ncol and Kpnl to give the vector pETMBP-E6.
  • the vectors pETM-30 and pETM-41 were obtained from Dr.
  • the fragment coding for the tac promoter and the MBP gene was obtained by digesting the vector pMALc2 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) with the restriction enzymes Sspl and BamHI. This fragment was then ligated into the vector linearized pRL25C as follows to give the vector pTacMBP.
  • pRL25C was linearized with the restriction enzyme Not1 and then treated with the enzyme Klenow, redigested by the restriction enzyme BamHI and finally dephosphorylated with calf intestine phosphatase (New England Biolabs).
  • the vector pTacGyrB (l-219) which contains the N-terminal domain of gyrase B of E. coli under the control of the constitutive tac promoter, corresponds to the vector pRL25C24K (Desplancq et al, 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217).
  • Example No. 2 Construction of the pNir expression vector and its yNirMBP derivatives. yNirGyrB (l-219). pNirMBP-YZD2. pNirMBP-E6. pNirGFP. pNirLacZ and pNirGST-E6.
  • the expression vector pN r was constructed from the vector pRL25Cmcs.
  • the fragment coding for the Nir promoter was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the vector pCSE21 (Frias et al, 1997, J. Bacteriol. 179, 477 -486) as matrix and the 5 'oligonucleotides -
  • the nir promoter can be cloned in both orientations into the vector pRL25Cmcs.
  • the orientation was used which generates downstream of the promoter a multiple cloning site containing EcoRl, BamHI, Stul, Xhol, Smal and Notl. All the coding sequences of the recombinant proteins tested (MBP, GyrB (l-219), GST-E6, MBP-E6, GFPuv (Green Fluorescent Protein,
  • Example No. 4 Transformation of the cyanobacterium and amplification of the transformants. All crops at 'Anahaena sp. PCC 7120 on solid and liquid medium were carried out at a temperature of 28 ° C and with an illumination of 1500 lux.
  • the culture medium used is BG-11 medium (Castenholt, RW 1988, Methods Enzymol. 167, 68-92).
  • the E. coli J53 strain containing the plasmid RP4 and the E. coli HB101 strain containing the plasmid pRL623 (donations from Dr Wolk) are used for the conjugation transfer in Anahaena of the expression plasmid. Anahaena sp.
  • PCC 7120 was transformed by conjugation according to the method described by Elhai and Wolk (1988, Methods Enzymol. 167, 747-754) with the expression vectors derived from pNz ' r.
  • the cells transformed with the expression vector pNl ' r were plated out on a BG-11 agar medium containing 10 mM
  • the conditioned medium is a medium which has been previously used to cultivate the wild strain Anahaena sp. PCC 7120, then sterilized by filtration on a 0.22 ⁇ filter before use.
  • the 100 ⁇ l of transformants preculture were then used to inoculate 1 ml of BG-11 medium containing 10 mM NH 4 C1 and 10 mM TES pH8 and 15 ⁇ g / ml of neomycin. This 1 ml culture was used to inoculate 5 ml of the same BG-11 medium and then 25 ml thereafter.
  • PCC 7120 with the expression vectors derived from the vector pc, the transformation protocol is similar to that used for the expression vectors pNi ' r except that the solid medium contains ⁇ a ⁇ O 3 as nitrogen source at a concentration of 500 mg / L.
  • the nitrogen source is also NaNO 3 in the medium used for the amplification.
  • the liquid BG-11 used contains 500 mg / L of NaNO 3 and 300 ⁇ g / ml of neomycin.
  • the other parameters of the amplification protocol are unchanged.
  • the expression of the protein of interest is under the control of the tac or nir promoters.
  • These expression vectors contain, in addition to their specific promoter, an origin of operational replication ColEl in E. coli, an origin of operational replication in Anahaena sp.
  • PCC 7120 (pDUlj, a transfer origin for conjugation and a neomycin resistance gene.
  • Example No. 5 Comparison of the nir and constituent tac systems.
  • the cultures at Anahaena were carried out at a temperature of 28 ° C, stirring of 150 rpm and an illumination of 1500 lux.
  • Cells Ana 'Anahaena sp. PCC 7120 transformed by the vector pTacMBP or pTacGyrB (1-219) were resuspended in 50 ml of BG-11 medium containing 300 ⁇ g / ml of neomycin and 500 mg / L of NaNO 3 and cultured to an optical density at 700 nm (DO 700 ) of approximately 2.
  • DO 700 optical density at 700 nm
  • PCC 7120 transformed by the vector pNirMBP or pNirGyrB (1-219) were also induced.
  • the cells of Anabaena sp. PCC 7120 transformed and cultivated in a BG-11 medium containing 10 mM NH 4 C1, 10 mM TES pH 8 and 15 ⁇ g / ml of neomycin were washed twice with BG-11 medium containing no source of nitrogen. After washing, the cells were resuspended to an OD 700 of 0.5 in BG11 medium containing 500 mg / L NaNO 3 and 15 ⁇ g / ml of neomycin.
  • the GyrB protein (1,219) is approximately 10 times less expressed in the constitutive tac system compared to the nir system. In the case of the MBP protein, this ratio is 2. All of the tests carried out elsewhere have shown that the constitutive tac system does not make it possible to achieve expression levels as high as those obtained with the nir system.
  • Example n ° 6 Comparison of the induced tac and nir systems.
  • the inducible and nir tac systems were compared using MBP as the test protein.
  • Anahaena sp. PCC 7120 transformed with the vector pTadndMBP were induced in the presence of 1 mM LPTG. Induction was carried out over 7 days and cells were removed daily. In parallel, cells of Anahaena sp. PCC 7120 transformed by the vector pNirMBP were also induced. In this case, the induction was also carried out over 7 days. Anahaena sp.
  • FIGS. 1A and 1B show the SDS-PAGE analysis of cellular extracts from aliquots of induced cells of Anahaena sp. PCC 7120 transformed by the vectors pNirMBP or xpTacIndMBP as a function of time.
  • the nir system makes it possible to obtain an approximately 10 times higher expression level of MBP protein from day 4 (FIG. 1A) compared to the tac system (FIG. 1B).
  • the nir system is therefore a very efficient inducible expression system which allows in a few days the accumulation of the order of 250 mg / L of MBP in cyanobacteria.
  • Example n ° 7 Regulation of the expression of tac systems of E. coli and nir in Anahaena sp. PCC 7120.
  • the basal expression levels of MBP were tested in the non-induced cell extracts.
  • Cell extracts of uninduced cells and cells induced for 5 days from Anahaena sp. PCC 7120 transformed with either the plasmid -pNirMBP or the plasmid ipTacIndMBP were analyzed by SDS-PAGE. The proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane and detected using antibodies. polyclonal rabbit anti-MBP (New England Biolabs) by chemiluminescence.
  • Figure 2 shows that in the absence of an inducer, no protein is detected in the cellular extract of Anahaena transformed with the vector pNirMBP while the protein MBP is demonstrated in the cellular extract of Anahaena transformed with the vector pTadndMBP. The same observations were made with the protein
  • GyrB (l-219).
  • the nir promoter is better repressed in the absence of an inducer than the tac promoter.
  • Example 8 Expression of toxic proteins in Anabaena sp. PCC 7120
  • the nir system has also been tested for the production of the E6 protein and its C-terminal domain (YZD2) expressed in the form of fusions.
  • YZD2 C-terminal domain
  • the three fusion proteins GST-E6, MBP-E6 and MBP-YZD2 were tested in the constitutive tac system in Anabaena sp. PCC 7120. In this case, a loss of expression during cell growth was observed, a loss of expression which is earlier in the case of the proteins GST-E6 and MBP-E6 where it appears from the second stage.
  • Table 2 summarizes the average values of the expression levels obtained with the constitutive and tac systems for the GST-E6, MBP-E6 and MBP- polypeptides.
  • Example No. 9 Expression of GFPuv and E. coli ⁇ -galactosidase with the nir system in Anabaena sp. PCC 7120
  • Cells of Anabaena sp. PCC 7120 transformed with the vector pNzV containing the GFPuv gene were induced for 5 days in a BG-11 medium containing nitrate.
  • Analysis of these induced cells by fluorescence microscopy revealed that all of the cells analyzed were fluorescent indicating that GFP was expressed in all cells homogeneously (see Figure 3). This observation was confirmed with another protein: ⁇ -galactosidase from E. coli. Cells of Anabaena sp.
  • PCC 7120 transformed with the vector pNzr containing the lacZ gene were induced for 3 days in a BG-11 medium containing nitrate. These cells were then fixed with a 4% solution of paraformaldehyde, then incubated for 5 hours in the presence of 5 mM K 3 Fe (C ⁇ ) 6 , 5 mM K 4 Fe (CN) 6 , 1 mg / ml 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside, 2 mM MgCl 2 . Analysis by visible microscopy showed a homogeneous blue coloration in all cells indicating expression of ⁇ -galactosidase in all cells analyzed (see Figure 3). GFP and ⁇ -galactosidase were produced in Anabaena with the nir expression system with a yield of the order of 50 mg / L.
  • Example 10 Production of insoluble protein in E. coli in soluble form with the nir expression system in Anabaena sp. PCC 7120
  • the MBP expressed under the control of the nir promoter can represent up to 30% of cellular proteins. When such amounts of recombinant proteins are obtained from E. coli, they are generally accumulated in the form of inclusion bodies.
  • the gene coding for an insoluble mutant of MBP, malE31 (Betton and Contra, 1996, J. Biol. Chem. 271, 8046-8052) was cloned by PCR into the vector pNzV. The PCR was carried out in two stages. In a first step, the mutations were introduced.
  • PCR were then purified and mixed equimolar and then re-amplified with oligos 1 and 4 to obtain a fragment corresponding to the malE31 gene.
  • This fragment was digested with the restriction enzymes EcoRl and BamHI and inserted into the vector pNir previously digested with the same enzymes and dephosphorylated.
  • Cells of Anabaena sp. PCC 7120 transformed with the vector pNz ' r containing the mutant malE31 were induced for 4 days. The cells were then lysed by sonication. The cell extracts were centrifuged for 10 min at 10,000 rpm and the supernatant corresponding to the soluble fraction was separated from the pellet (insoluble fraction).
  • Example 11 Production of proteins labeled with 14 C.
  • the nir expression system was used to produce the protein GyrB (l-219) labeled with 14 C. Cells of Anabaena sp.
  • PCC 7120 transformed with the vector pNirGyrB (1-219) were induced for 4 days in a BG-11 medium containing 33 mg / L of NaH 14 CO 3 (1 mCi, 52 mCi / mmol, NEN Life Science Products,
  • the counts per minute (cpm) were determined by counting in the presence of 2 ml of scintillation liquid in a radioactivity counter (Packard, Groningen, Netherlands).
  • the specific activity of the purified protein was 4 ⁇ 10 14 cpm / mol.
  • the nir system therefore makes it possible to carry out metabolic labeling with 14 C of recombinant proteins.
  • Example 12 Production of proteins labeled with 15 N. 13 C. 2 H.
  • the protein GyrB (l-219) was used with the nir system for the overproduction of recombinant proteins labeled with 15 N, 13 C, 2 H
  • a cell preculture is first carried out in 600 ml of BG-11 medium containing 10 mM NILC1 and 10 mM TES pH8 and 15 ⁇ g / ml of neomycin.
  • BG-11 containing 0.5 g / L of NaNO 3 , 0.5 g / L of NaHCO 3 and 15 ⁇ g / ml of neomycin in a fermenter.
  • This fermenter is equipped with pH, O 2 and temperature sensors which automatically regulate the pH to a value of 8, the temperature to a value of 28 ° C and monitor the consumption of NaHCO 3 by online analysis of oxygen production cells.
  • the culture is carried out over a period of 5 days with daily addition of Ig / L of NaHCO 3 . Agitation in the fermenter is 100 rpm and the culture is subjected to a constant flow of argon throughout the duration of the experiment.
  • the fermenter is illuminated with two light sources each having an intensity of 4000 lux. Under these conditions, using as substrate marked only Na 15 NO 3 , GyrB (l-219) was produced with a uniform enrichment of 90% in
  • the GyrB protein (l-219) was uniformly enriched in 15 N and 13 C with a enrichment greater than 90% for each of the isotopes. This enrichment is equivalent to that obtained previously with Anabaena sp. PCC 7120 and the expression vector p7 ⁇ c (Desplancq et al, 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217).
  • the GyrB protein (l-219) was produced highly enriched in 2 H. For this type of labeling, it is necessary beforehand to adapt the cells of Anabaena sp.
  • PCC 7120 transformed to growth in a BG-11 medium containing 50% of 2 H 2 O then 70% and finally 90%.
  • the preculture is carried out in deuterated medium at the desired concentration for the final enrichment.
  • a progressive enrichment in 2 H (from 41% to 90%) of the protein GyrB (l-219) was observed for concentrations of 60 to 99.8% in 2 H 2 O in the culture medium. All the observed enrichments were measured using a mass spectrometer.

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Abstract

La présente invention concerne un système d'expression inductible chez les cyanobactéries, permettant l'expression de protéines recombinantes ainsi que les vecteurs et cyanobactéries contenant ce système d'expression.

Description

Système d'expression inductible de protéines recombinantes chez les cyanobactéries La présente invention concerne un système d'expression inductible chez les cyanobactéries, permettant l'expression de protéines recombinantes ainsi que les vecteurs et cyanobactéries contenant ce système d'expression.
Les récents développements de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) permettent maintenant l'étude de biomolécules de taille importante comme les protéines. Cependant, un enrichissement minimum uniforme en 13C et 15N de 90 % est requis pour permettre une analyse RMN. Un enrichissement complémentaire en 2H peut aussi s'avérer nécessaire pour les protéines de poids moléculaire supérieur à 20 kDa. Jusqu'à présent, le procédé de marquage consistait à produire la protéine d'intérêt principalement dans E. coli et à cultiver ce microorganisme sur des milieux marqués, c'est-à-dire enrichis en isotope stable. Cependant, même si ces milieux sont disponibles sur le marché, ils sont extrêmement chers, particulièrement en ce qui concerne des marquages en 13C et H. La production de protéines marquées pour la RMN se révèle donc un procédé difficile et coûteux.
Les cyanobactéries sont des organismes photo-autotrophes. Ces bactéries sont capables de croître sur un milieu minimum contenant du carbonate comme seule source de carbone, des nitrites, des nitrates ou de l'ammonium comme seule source d'azote et des sels minéraux. L'énergie est fournie par la lumière via la photosynthèse. La demande de brevet FR 2 820 758 décrit un système d'expression et de marquage constitutif de protéines recombinantes dans la cyanobactérie Anahaena à partir du promoteur tac de la bactérie E. coli. Le système développé dans cette demande de brevet permet ainsi d'utiliser pour la croissance de la cyanobactérie un milieu marqué peu cher contenant du Na15NO3 et du NaH13CO3 en tant que sources d'azote et de carbone marqués. Cependant, bien qu'il soit facile de produire des protéines non-toxiques telles que les 24 derniers kDa N-terminaux du domaine de la Gyrase B d'E. coli ou la protéine de fixation au maltose (MBP), l'expression de certaines protéines eucaryotes se révèle être beaucoup plus difficile chez les cyanobactéries en utilisant un promoteur constitutif. L'expression de ces protéines est en effet perdue à cause d'un problème de réarrangement plasmidique durant la croissance bactérienne. Le développement d'un système d'expression efficace dans les cyanobactéries est de ce fait un problème important en ce qui concerne le marquage de protéines recombinantes.
La demanderesse a découvert que l'on pouvait exprimer des protéines potentiellement toxiques sous contrôle d'un promoteur inductible dans les cyanobactéries. Un objet de l'invention est ainsi un procédé d'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries à partir d'une séquence de promoteur de transcription inductible de cyanobactérie. Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur contenant une séquence codant une protéine sous contrôle d'une séquence de promoteur de transcription inductible de cyanobactérie. Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un vecteur de ce type dans les cyanobactéries pour l'expression de protéines recombinantes dans ces bactéries. Un autre objet de l'invention consiste en une cyanobactérie contenant un vecteur de ce type.
D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lumière de la description, des exemples qui suivent ainsi que des dessins annexés à la présente demande. La figure 1A montre l'accumulation de la protéine MBP en fonction du temps (en jours) dans une bactérie Anahaena sp. PCC 7120 transformée par le plasmide pNirMBP et induite. La figure 1B montre l'accumulation de la protéine MBP en fonction du temps (en jours) dans une bactérie Anahaena sp. PCC 7120 transformée par le plasmide pTacIndMBP et induite. La figure 2 montre une comparaison des quantités de protéines synthétisées avant et après induction de la bactérie Anahaena sp. PCC 7120 transformée soit par le plasmide ipNirMBP soit par le plasmide pTacIndMBP. La figure 3 montre des cellules d 'Anahaena exprimant respectivement la β- galactosidase (photographie au microscope visible) et la GFP (Green Fluorescent Protein) (photographie au microscope à fluorescence) en condition inductrice (NO3 ") ou n'exprimant pas ces protéines en présence du répresseur NH4 +.
L'invention est ainsi relative à un procédé d'expression de protéines recombinantes caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cyanobactéries une séquence codant une protéine en aval d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie puis à induire l'expression de cette protéine et isoler les protéines recombinantes ainsi synthétisées. Contrairement à E. coli, il n'existe pas chez les cyanobactéries de système d'expression disponible dans le commerce. Seulement quelques exemples d'expressions hétérologues dans les cyanobactéries ont été rapportés dans la littérature et l'expression de ces protéines est généralement sous le contrôle d'un promoteur de cyanobactérie constitutif. L'expression inductible dans les cyanobactéries pourrait être effectuée grâce à l'utilisation de promoteurs inductibles qui se sont révélés fonctionner dans les cyanobactéries tels que le promoteur PL du bactériophage lambda (λPL), le promoteur trc ou le promoteur tac de E. coli. Ces trois promoteurs nécessitent l'expression de leur propre répresseur chez la cyanobactérie pour permettre la régulation du promoteur. Le promoteur λPLqui est inductible par une augmentation de température à 42 °C n'est pas adapté dans notre cas car Anahaena sp. PCC 7120 ne peut pousser à des températures supérieures à 30 °C. Les promoteurs tac et trc sont deux promoteurs qui fonctionnent de façon similaire, ils sont tous les deux réprimés par le répresseur Lad de l'opéron lac et induits en présence d'IPTG, un analogue du lactose. Cependant, les essais d'expression avec le promoteur tac se sont révélés décevants. La quantité de protéine recombinante exprimée après induction est très basse (environ 10 fois moindre que celle obtenue avec un promoteur tac constitutif
(expression en absence du répresseur Lad dans la cellule) et n'atteint jamais les niveaux de protéine résultant de l'expression constitutive tels que décrits dans les publications. Ainsi, le promoteur tac n'apparaît pas être un promoteur inductible adéquat. De plus, les cyanobactéries ne possèdent pas le gène lacY de la lactose perméase qui permet l'entrée efficace de l'inducteur LPTG dans les cellules. Jusqu'à présent, très peu de promoteurs inductibles ont été caractérisés dans les cyanobactéries. Certains promoteurs de cyanobactéries sont inductibles par des métaux ou des minéraux. Leur utilisation est cependant limitée car ils sont induits à des concentrations très faibles en inducteur de l'ordre du micromolaire et le milieu de culture généralement utilisé pour la croissance des cyanobactéries contient déjà les quantités suffisantes de métaux nécessaires à l'induction de ces promoteurs. Un des promoteurs les mieux caractérisés dans les cyanobactéries est le promoteur qui contrôle l'expression de l'opéron nir, qui est impliqué dans l'assimilation du nitrate dans les cyanobactéries. Cet opéron est induit en présence de nitrate et également bien réprimé par l'ammonium (Frias, J.E. et al, 1997, J.Bacteήol,
179, 477-486). En effet, chez les cyanobactéries, les gènes impliqués dans l'assimilation du nitrate sont codés dans l'opéron nir, dont la transcription est contrôlée par le promoteur nir. L'activation de ce promoteur demande la fixation sur l'ADN de deux régulateurs de transcription, NtcA et NtcB, nécessaires pour l'expression des gènes codant des protéines spécifiquement impliquées dans l'assimilation du nitrate (Frias, J.E. et al., 1997, J. Bacteriol. , 179, 477-486). Ainsi, le procédé d'expression de protéines recombinantes selon l'invention utilise comme séquence promoteur de transcription celle de l'opéron nir des cyanobactéries, séquence qui est induite en présence de nitrate et/ou de nitrite dans le milieu et préférentiellement en présence de NaNO3. Il est important de noter que le démarrage du promoteur nir dans les cyanobactéries est extrêmement rapide et est induit quelques heures après incubation des bactéries dans un milieu contenant du nitrate comme source de d'azote à la place de l'ammonium. La cyanobactérie utilisée est de préférence de l'espèce Anahaena et plus particulièrement Anahaena sp. PCC 7120 (souche disponible à la Collection de Cultures de l'Institut Pasteur, Paris), une bactérie filamenteuse qui est capable de croître sur des milieux minimum contenant du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H pour produire à bas coût des protéines recombinantes marquées pour l'analyse par RMN. De préférence, le milieu de culture de ces cyanobactéries utilisé pour le marquage de protéines recombinantes exprimées contient au moins du Na15NO3. Dans le système d'expression constitutif (l'expression des protéines a lieu pendant toute la durée du cycle cellulaire) utilisé, il est impossible de produire des protéines eucaryotes qui étaient toxiques pour la cellule. L'expression constitutive de telles protéines dans la cellule se traduit par une perte de l'expression due à un réarrangement du vecteur d'expression. L'invention est ainsi relative à l'expression de protéines recombinantes dans laquelle la protéine recombinante exprimée est toxique pour les cyanobactéries. En effet, ce système d'expression inductible au nitrate basé sur le promoteur de l'opéron nir des cyanobactéries permet de contrôler l'expression de la protéine d'intérêt. En absence d'inducteur dans le milieu de culture, la protéine n'est pas produite car le promoteur est réprimé. L'induction de l'expression est obtenue lorsque la source d'azote dans le milieu est soit des nitrates soit des nitrites soit les deux. Un autre objet de l'invention est aussi un vecteur contenant une séquence d'ADN codant une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie. La séquence d'ADN comprenant l'information génétique nécessaire pour l'expression d'une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription selon, l'invention peut être comprise dans tout vecteur couramment utilisé par l'homme du métier. De préférence, la séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie est celle de l'opéron nir des cyanobactéries. La présente invention concerne également l'utilisation d'un vecteur selon l'invention pour l'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries. Préférentiellement, les vecteurs sont utilisés dans des cyanobactéries cultivées dans un milieu qui contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H, et plus préférentiellement encore dans un milieu qui contient au moins du Na15NO3. Un autre objet de l'invention est également une cyanobactérie transformée par un vecteur selon l'invention. De préférence, cette cyanobactérie est de l'espèce Anahaena et plus préférentiellement Anahaena sp. PCC 7120. Ce système d'expression permet de résoudre les problèmes de perte d'expression rencontrés lors de la production de protéines toxiques en système constitutif. Les taux d'expression obtenus en utilisant ce système sont très élevés, de l'ordre de 100 mg/L. Ce système montre une efficacité équivalente aux meilleurs systèmes d'expression développés chez E. coli, notamment le système T7 (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol. 189, 113-130). La protéine recombinante peut en effet représenter plus de 30 % des protéines cellulaires totales. Ce système est donc particulièrement adapté à la production de dizaines de milligrammes de protéines marquées 13C, 15N, et 2H pour la RMN. Les substrats marqués ne sont ajoutés qu'au moment de l'induction de l'expression de la protéine, ce qui permet de diminuer les coûts de marquage par rapport au système d'expression constitutif. En effet, avec le système tac constitutif (Desplancq et al., 2001 , Protein Express. Purif. 23, 201-217) lors du marquage au 13C en fermenteur, 90 % du NaH13CO3 est perdu sous forme CO2 lors de l'aération du fermenteur en argon et doit être compensé par des ajouts réguliers de NaH13CO3 pendant toute la durée de la fermentation (8 à 10 jours). Dans le système selon l'invention, l'utilisation de NaH13CO3 uniquement pendant la période d'expression (5 jours) de la protéine recombinante limite ainsi les quantités en substrat marqué NaH13CO3 utilisé et donc diminue le coût du marquage au 13C. Ainsi, ces bactéries sont capables de surproduire des protéines recombinantes marquées avec un taux d'enrichissement isotopique équivalent à celui obtenu chez E. coli, mais à un coût environ 10 fois moindre. Les taux d'expression élevés dans le système d'expression inductible selon l'invention permettent non seulement de diminuer les volumes de culture utilisés et par conséquent les coûts de marquage mais aussi de produire plus facilement des protéines deutérées car, chez E. coli, la culture en milieu deutéré entraîne généralement une diminution du taux d'expression d'un facteur 3 à 4 fois. De plus, les cyanobactéries utilisent directement 2H2O comme substrat deutéré. Ceci permet de recycler le milieu deutéré et de le réutiliser pour de nouveaux marquages. Le marquage au 2H de protéines recombinantes chez les cyanobactéries permet donc de diminuer de façon significative le coût de marquage 2H. Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.
Exemple n°l : Construction du vecteur p7αc et de ses dérivés pTacMBP. pTacGyrBf 1-219). pTacGST-E6. ptacMBP-E6 ct ptacMBP-YZD2. Le vecteur pRL25Cmcs a été obtenu en digérant le vecteur pRL25C (Wolk et al, 1988, J. Bacteriol. 170, 1239-1244) par les enzymes de restriction Nσtl et BamHl selon les instructions du fabricant (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) pour y introduire un site de clonage pour les enzymes de restriction Stwl, Xhol et Smal en utilisant les amorces oligonucléotidiques suivantes : 5 ' - G G C C G C A G G C C T C T C G A G C C C G G G G e t 5 ' -
GATCCCCCGGGCTCGAGAGGCCTGC. Le fragment codant pour le promoteur tac a été obtenu par digestion du vecteur pKK223.3 (Amersham Biosciences,Uppsala, Sweden) avec les enzymes de restriction Xmnl et Sspl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Ce fragment a ensuite été ligué dans le vecteur pRL25Cmcs préalablement digéré par Smal et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs) pour donner le vecteur p7αc. Les gènes codant pour la protéine GST-E6 (protéine de fusion comprenant la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine E6 du virus HPV16), la protéine MBP-E6 (protéine de fusion comprenant la protéine liant le maltose (MBP) et la protéine E6 du virus HPV16) et la protéine MBPY-ZD2 (protéine de fusion comprenant la protéine liant le maltose (MBP) et le domaine C-terminal de l'oncoprotéine E6, (YZD2)) ont été obtenus par PCR à partir des plasmides pETGST- E6, pETMBP-E6 et pETMBP-YZD2. Ce dernier vecteur est identique au vecteur MBP- E6-C4C/4S (Norniné ét al, 2003 Biochem. 42, 4909-4917). Les vecteurs pETGST-E6 et pETMBP-E6 ont été construit comme suit : le gène codant la protéine E6 a été obtenu par PCR avec les oligonucléotides suivants 5 ' - ATCCGGGGTCTCCCATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGAC et 5 ' - ATCCGGGGTCTCGGTACCGCGGCCGCT ACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTC en utilisant comme matrice le vecteur MBP-E6 6C/6S (Norniné et al, 2001, Protein Eng.14, 297-305). Ce fragment de PCR a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Ncol et Kpnl et ligué avec le vecteur pETM-30 préalablement linérarisé avec les enzymes Ncol et Kpnl pour donner le vecteur pETGST-E6. Ce même fragment de PCR codant pour la protéine E6 et digéré par les enzymes de restriction Ncol et Kpnl a également été ligué avec le vecteur pETM-41 préalablement linérarisé avec les enzymes Ncol et Kpnl pour donner le vecteur pETMBP-E6. Les vecteurs pETM-30 et pETM-41 ont été obtenus du Dr. Stier et sont référencés sur le site www.embl- heidelberg.de Externalinfo/geerlof/draft frame/index.htlm. Les fragments de PCR codant pour les protéines GST-E6, MBP-E6 et MBP- YZD2 provenant respectivement des plasmides pETGST-E6, pETMBP-E6 et pETMBP-YZD2 ont ensuite été clones entre les sites de restriction EcoRl et BamHl situés dans le site de clonage multiple du vecteur p7αc pour générer les vecteurs τpTacGST-E6, τptacMBP-E6 et TacMBP-YZD2. Le fragment codant pour le promoteur tac et le gène de la MBP a été obtenu en digérant le vecteur pMALc2 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) avec les enzymes de restriction Sspl et BamHl. Ce fragment a ensuite été ligué dans le vecteur pRL25C linéarisé comme suit pour donner le vecteur pTacMBP. pRL25C a été linéarisé avec l'enzyme de restriction Notl puis traité par l'enzyme Klenow, redigéré par l'enzyme de restriction BamHl et finalement déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs). Le vecteur pTacGyrB(l-219) qui contient le domaine N-terminal de la gyrase B d'E. coli sous contrôle du promoteur tac constitutif , correspond au vecteur pRL25C24K (Desplancq et al, 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217).
Exemple n°2 : Construction du vecteur d'expression pNir et de ses dérivés yNirMBP. yNirGyrB(l-219). pNirMBP-YZD2. pNirMBP-E6. pNirGFP. pNirLacZ et pNirGST-E6. Le vecteur d'expression pN r a été construit à partir du vecteur pRL25Cmcs. Le fragment codant pour le promoteur Nir a été obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le vecteur pCSE21 (Frias et al, 1997, J. Bacteriol. 179, 477 -486 ) c omme matric e et les oligonucléotides 5 ' -
GCGCGCAGATCTAGCTACTCATTAGTTAAGTGTAATG et 5 ' - GGCCGGGGATCCGAATTCGTTCTCATAAAGTTTTTTTGCTCAAG. Ce fragment a ensuite été digéré par les enzymes de restriction BgUI et BamHl, puis ligué dans le vecteur pRL25Cmcs préalablement digéré par BamHl et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs) pour donner le vecteur pNir.
Le promoteur nir peut être clone dans les deux orientations dans le vecteur pRL25Cmcs. Pour toutes les expériences d'expression a été utilisée l'orientation qui génère en aval du promoteur un site de clonage multiple contenant EcoRl, BamHl, Stul, Xhol, Smal et Notl. Toutes les séquences codantes des protéines recombinantes testées (MBP, GyrB(l-219), GST-E6, MBP-E6, GFPuv (Green Fluorescent Protein,
Crameri et al, (1996) Nature BiotechnoL, 14 : pp 315-19, β-galactosidase de E. coli), MBP-YZD2) dans ce vecteur ont été clonées en utilisant les sites de restriction EcoRl et BamHl spécialement introduits à cet effet en aval du promoteur nir. Exemple n°3 : Construction du vecteur pTacIndMBP. Le vecteur pRL25C a été linéarisé avec l'enzyme de restriction Notl, puis traité par l'enzyme Klenow. Le vecteur a ensuite été redigéré par l'enzyme de restriction BamHl et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs). Le fragment MscllBamHl du vecteur pMALc2 a été ligué dans le vecteur pRL25C linéarisé pour donner le vecteur pTadndMBP.
Exemple n°4 : Transformation de la cyanobactérie et amplification des transformants. Toutes les cultures à' Anahaena sp. PCC 7120 sur milieu solide et liquide ont été réalisées à une température de 28 °C et avec une illumination de 1500 lux. Le milieu culture utilisé est le milieu BG-11 (Castenholt, R.W. 1988, Methods Enzymol. 167, 68-92). La souche E. coli J53 contenant le plasmide RP4 et la souche E. coli HB101 contenant le plasmide pRL623 (dons du Dr Wolk) sont utilisées pour le transfert par conjugaison chez Anahaena du plasmide d'expression. La souche Anahaena sp. PCC 7120 a été transformée par conjugaison suivant la méthode décrite par Elhai et Wolk (1988, Methods Enzymol.167, 747-754) avec les vecteurs d'expression dérivés du pNz'r. Les cellules transformées par le vecteur d'expression pNî'r ont été étalées sur un milieu de BG-11 agar contenant 10 mM
ΝH4C1 et 10 mM N-tris(hydroxymethyl)methyl2-aminoethanesulfonic acid (TES) pH 8. Après 24 heures, la néomycine a été ajoutée sous l'agar à raison de 100 μg/ml. L'incubation a été poursuivie jusqu'à ce que les colonies apparaissent (environ 8 jours). Les transformants ont ensuite été cultivés dans 100 μl de milieu BG-11 contenant 15 μg/ml de néomycine et 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8 dilué au demi dans un milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8 conditionné. Le milieu conditionné est un milieu ayant été préalablement utilisé pour cultiver la souche sauvage Anahaena sp. PCC 7120, puis stérilisé par filtration sur filtre 0,22μ avant utilisation. Les 100 μl de préculture de transformants ont été ensuite utilisés pour inoculer 1 ml de milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH8 et 15 μg/ml de néomycine. Cette culture de 1 ml a été utilisée pour inoculer 5 ml du même milieu BG-11 puis par la suite 25 ml. Pour les transformations de la souche Anahaena sp. PCC 7120 avec les vecteurs d'expression dérivés du vecteur p c, le protocole de transformation est similaire à celui utilisé pour les vecteurs d'expression pNï'r excepté que le milieu solide contient ΝaΝO3 comme source d'azote à une concentration de 500 mg/L. La source d'azote est également NaNO3 dans le milieu utilisé pour l'amplification. Le BG-11 liquide utilisé contient 500 mg/L de NaNO3 et 300 μg/ml de néomycine. Les autres paramètres du protocole d'amplification sont inchangés. Dans chaque cas, l'expression de la protéine d'intérêt est sous le contrôle des promoteurs tac ou nir. Ces vecteurs d'expression contiennent en plus de leur promoteur spécifique, une origine de réplication ColEl opérationnelle chez E. coli, une origine de réplication opérationnelle chez Anahaena sp. PCC 7120 (pDUlj, une origine de transfert pour la conjugaison et un gène de résistance à la néomycine.
Exemple N°5 : Comparaison des systèmes nir et tac constitutif. Les cultures à' Anahaena ont été réalisées à une température de 28°C, une agitation de 150 rpm et une illumination de 1500 lux. Des cellules ά' Anahaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pTacMBP ou pTacGyrB( 1-219) ont été resuspendues dans 50 ml de milieu BG-11 contenant 300 μg/ml de néomycine et 500 mg/L de NaNO3 et cultivées jusqu'à une densité optique à 700 nm (DO700) d'environ 2. En parallèle, des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pNirMBP ou pNirGyrB( 1-219) ont également été induites. Pour ce faire, les cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées et cultivées dans un milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1, 10 mM TES pH 8 et 15 μg/ml de néomycine ont été lavées deux fois avec du milieu BG-11 ne contenant aucune source d'azote. Après lavage, les cellules ont été resuspendues à une DO700 de 0,5 dans du milieu BG11 contenant 500 mg/L NaNO3 et 15 μg/ml de néomycine. Les extraits cellulaires de ces cultures ont été analysés par gel d'électrophorèse de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS- PAGE) et une évaluation de ces différents taux d'expression a été réalisée en co- migrant sur un tel gel une gamme de quantité connue de protéine. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 suivant :
La protéine GyrB(l-219) est environ 10 fois moins exprimée dans le système tac constitutif par rapport au système nir. Dans le cas de la protéine MBP, ce rapport est de 2. L'ensemble des essais effectués par ailleurs a montré que le système tac constitutif ne permet pas d'atteindre des taux d'expression aussi élevés que ceux obtenus avec le système nir.
Exemple n°6 : Comparaison des systèmes tac et nir induits. Les systèmes tac inductible et nir ont été comparés en utilisant la MBP comme protéine-test. Des cellules d' Anahaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pTadndMBP ont été induites en présence de 1 mM LPTG. L'induction a été réalisée sur 7 jours et chaque jour des cellules ont été prélevées. En parallèle, des cellules d' Anahaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pNirMBP ont également été induites. Dans ce cas, l'induction a aussi été réalisée sur 7 jours. Des cellules d' Anahaena sp. PCC 7120 non transformées ont été cultivées comme contrôle négatif d'expression dans du milieu BG-11 contenant soit 500 mg/L de NaNO3, soit 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8. Les figures 1A et 1B montrent l'analyse par SDS-PAGE des extraits cellulaires d'aliquotes des cellules induites d' Anahaena sp. PCC 7120 transformées par les vecteurs pNirMBP ou xpTacIndMBP en fonction du temps. Le système nir permet d'obtenir un taux d'expression environ 10 fois plus élevé de protéine MBP à partir du jour 4 (Figure 1A) par rapport au système tac (Figure 1B). Le système nir est donc un système d'expression inductible très performant qui permet en quelques jours l'accumulation de l'ordre de 250 mg/L de MBP dans des cyanobactéries.
Exemple n°7 : Régulation de l'expression des systèmes tac d'E. coli et nir chez Anahaena sp. PCC 7120. Pour étudier la régulation des promoteurs nir et tac, les taux d'expression basale de la MBP ont été testés dans les extraits cellulaires non induits. Des extraits cellulaires de cellules non induites et de cellules induites pendant 5 jours d' Anahaena sp. PCC 7120 transformées soit par le plasmide -pNirMBP ou le plasmide ipTacIndMBP ont été analysés par SDS-PAGE. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de nitrocellulose et détectées à l'aide d'anticorps polyclonal de lapin anti-MBP (New England Biolabs) par chimioluminescence. La Figure 2 montre qu'en absence d'inducteur, aucune protéine n'est détectée dans l'extrait cellulaire d' Anahaena transformées avec le vecteur pNirMBP alors que la protéine MBP est mise en évidence dans l'extrait cellulaire d'Anahaena transformées avec le vecteur pTadndMBP. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine
GyrB(l-219). Ainsi, le promoteur nir est mieux réprimé en absence d'inducteur que le promoteur tac.
Exemple n°8 : Expression de protéines toxiques chez Anabaena sp. PCC 7120 Le système nir a également été testé pour la production de la protéine E6 et de son domaine C-terminal (YZD2) exprimés sous la forme de fusions. Lorsque ces polypeptides sont exprimés chez E. coli, ils s'avèrent toxiques et nécessitent l'utilisation d'un système d'expression hautement régulée (G. Travé, communication personnelle). Les trois protéines de fusion GST-E6, MBP-E6 et MBP-YZD2 ont été testées dans le système tac constitutif chez Anabaena sp. PCC 7120. Dans ce cas, une perte d'expression au cours de la croissance des cellules a été observée, perte d'expression qui est plus précoce dans le cas des protéines GST-E6 et MBP-E6 où elle apparaît dès la deuxième étape d'amplification. Pour la protéine MBP-YZD2, la perte d'expression a été mise en évidence lorsque la culture a atteint un volume de 200 ml. Dans les deux cas, cette perte d'expression est liée à un remaniement du plasmide contenu dans les cellules transformées. Ceci a été mis en évidence en comparant le profil de restriction après digestion par les enzymes de restriction Ndél, Spel, Xhol du vecteur d'expression d'origine avant transformation et celui du vecteur réextrait des cellules d' Anabaena transformées n'exprimant plus la protéine. Lorsque ces protéines ont été testées dans le système nir, aucune perte d'expression n'a été observée.
Le tableau 2 résume les valeurs moyennes des taux d'expression obtenus avec les systèmes tac constitutif et nir pour les polypeptides GST-E6, MBP-E6 et MBP-
YZD2.
Des taux d'expression de l'ordre de 10 mg/L ont ainsi été obtenus après induction. Le système nir est donc suffisamment régulé pour permettre la production de protéines toxiques chez Anahaena sp. PCC 7120.
Exemple n°9 : Expression de la GFPuv et de la β-galactosidase de E. coli avec le système nir chez Anabaena sp. PCC 7120 Des cellules d' Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNzV contenant le gène de la GFPuv ont été induites pendant 5 jours dans un milieu BG-11 contenant du nitrate. L'analyse de ces cellules induites, par microscopie à fluorescence a révélé que toutes les cellules analysées étaient fluorescentes indiquant que la GFP était exprimée dans toutes les cellules de façon homogène (voir figure 3). Cette observation a été confirmée avec une autre protéine : la β-galactosidase de E. coli. Des cellules d' Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNzr contenant le gène lacZ ont été induites pendant 3 jours dans un milieu BG-11 contenant du nitrate. Ces cellules ont ensuite été fixées avec une solution à 4 % de paraformaldéhyde, puis incubées pendant 5 heures en présence de 5 mM K3Fe(CΝ)6, 5 mM K4Fe(CN)6, lmg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, 2 mM MgCl2. L'analyse en microscopie visible a montré une coloration bleue homogène dans toutes les cellules indiquant une expression de la β-galactosidase dans toutes les cellules analysées (voir figure 3). La GFP et la β-galactosidase ont été produites chez Anabaena avec le système d'expression nir avec un rendement de l'ordre de 50 mg/L.
Exemple n°10 : Production de protéine insoluble chez E. coli sous forme soluble avec le système d'expression nir chez Anabaena sp. PCC 7120 La MBP exprimée sous le contrôle du promoteur nir peut représenter jusqu'à 30% des protéines cellulaires. Lorsque de telles quantités de protéines recombinantes sont obtenues chez E. coli, elles sont généralement accumulées sous la forme de corps d'inclusion. Le gène codant pour un mutant insoluble de la MBP, malE31 (Betton and Hoffnung, 1996, J. Biol. Chem. 271, 8046-8052) a été clone par PCR dans le vecteur pNzV. La PCR a été réalisée en deux étapes. Dans une première étape, les mutations ont été introduites. Deux fragments chevauchants de PCR ont été obtenus en utilisant comme matrice le vecteur pNirMBP et les deux paires d'oligonucléotides suivants : oligol, 5'-CGCGCGAATTCATGAAAATCGAAGAAGGTA et oligo 2, 5'- GACTTTAGGATCGGTATCTTTCTCGAATTTCTTA, oli go 3 , 5 ' - GATACCGATCCTAAAGTCACCGTTGAGCATCC et oligo 4, 5 ' - CGCGCGGGATCCCTATGAAATCCTTCCCTCGATCCC. Les deux fragments de
PCR ont ensuite été purifiés et mélangés de façon équimolaire puis réamplifiés avec les oligos 1 et 4 pour obtenir un fragment correspondant au gène malE31. Ce fragment a été digéré avec les enzymes de restriction EcoRl et BamHl et inséré dans le vecteur pNir préalablement digéré avec les mêmes enzymes et déphosphorylé. Des cellules d' Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNz'r contenant le mutant malE31 ont été induites pendant 4 jours. Les cellules ont ensuite été lysées par sonication. Les extraits cellulaires ont été centrifugés 10 min à 10000 rpm et le surnageant correspondant à la fraction soluble a été séparé du culot (fraction insoluble). L'analyse par SDS-PAGE d'une aliquote des fractions soluble et insoluble a montré que le polypeptide malE31 produit était présent essentiellement dans la fraction soluble. Cette protéine insoluble chez E . coli et produite sous forme de corps d'inclusion peut donc être accumulée sous forme soluble chez Anabaena à un taux d'expression équivalent à celui de la protéine sauvage. Exemple n°ll : Production de protéines marquées au 14C. Le système d'expression nir a été utilisé pour produire la protéine GyrB(l- 219) marquée au 14C. Des cellules d' Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNirGyrB( 1-219) ont été induites pendant 4 jours dans un milieu BG-11 contenant 33 mg/L de NaH14CO3 (1 mCi, 52 mCi/mmol, NEN Life Science Products,
Zaventem, Belgium), 500 mg/L de NaNO3et 15 μg/ml de néomycine. Les cellules ont été incubées à une température de 28°C sous une illumination de 1500 lux dans un système de culture hermétiquement clos. L'analyse par SDS-PAGE et autoradiographie d'extraits de cellules d' Anabaena cultivées en présence de NaH14CO3 a montré que toutes les protéines cellulaires étaient marquées uniformément au 14C. La protéine GyrB(l-219) ainsi marquée a été purifiée selon la méthode décrite par (Desplancq et al, 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217). Son taux d'incorporation de 14C a été déterminé à partir de 20 μl d'une solution de protéine purifiée à partir des extraits cellulaires induits. Les coups par minute (cpm) ont été déterminés par comptage en présence de 2 ml de liquide de scintillation dans un compteur de radioactivité (Packard, Groningen, Netherlands). L'activité spécifique de la protéine purifiée a été de 4xl014 cpm/mol. Le système nir permet donc de réaliser un marquage métabolique au 14C de protéines recombinantes.
Exemple n°12 : Production de protéines marquées au 15N. 13C. 2H. La protéine GyrB(l-219) a été utilisée avec le système nir pour la surproduction de protéines recombinantes marquées au 15N, 13C, 2H. Une préculture de cellules est d'abord réalisée dans 600 ml de milieu BG-11 contenant 10 mM NILC1 et 10 mM TES pH8 et 15 μg/ml de néomycine. Les cellules sont incubées pendant 5 jours jusqu'à DO700= 1,5-2 à une température de 28°C, une agitation de 150 rpm et une illumination de 1500 lux, puis centrifugées pour éliminer le milieu contenant le NH4C1. Elles sont ensuite utilisées pour inoculer deux litres de BG-11 contenant 0,5 g/L de NaNO3 , 0,5 g/L de NaHCO3 et 15 μg/ml de néomycine dans unfermenteur. Ce fermenteur est équipé de capteurs pH, O2 et température qui permettent de réguler automatiquement le pH à une valeur 8, la température à une valeur de 28 °C et de suivre la consommation de NaHCO3 par analyse en ligne de la production en oxygène des cellules. La culture est réalisée sur une période de 5 jours avec addition quotidienne d' Ig/L de NaHCO3. L'agitation dans le fermenteur est de 100 rpm et la culture est soumise à un flux constant d'argon pendant toute la durée de l'expérience. Le fermenteur est illuminé avec deux sources de lumière ayant chacune une intensité de 4000 lux. Dans ces conditions, en utilisant comme substrat marqué uniquement Na15NO3, la GyrB(l-219) a été produite avec un enrichissement uniforme de 90% en
15N. Lors d'un marquage double 15N et 13C réalisé avec les substrats marqués Na15NO3 etNaH13CO3, la protéine GyrB(l-219) a été enrichie de façon uniforme en 15N et 13C avec un enrichissement supérieur à 90% pour chacun des isotopes. Cet enrichissement est équivalent à celui obtenu précédemment avec Anabaena sp. PCC 7120 et le vecteur d'expression p7αc (Desplancq et al, 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217). En utilisant 2H2O à la place de H2O dans le milieu de culture, la protéine GyrB(l-219) a été produite fortement enrichie en 2H. Pour ce type de marquage, il est nécessaire au préalable d'adapter les cellules d' Anabaena sp. PCC 7120 transformées à la croissance dans un milieu BG-11 contenant 50 % d'2H2O puis 70 % et enfin 90 %. Ainsi, avant transfert dans le fermenteur, la préculture est réalisée dans du milieu deutéré à la concentration souhaitée pour l'enrichissement final. Un enrichissement progressif en 2H (de 41 % à 90 %) de la protéine GyrB(l-219) a été observé pour des concentrations de 60 à 99,8 % en 2H2O dans le milieu de culture. Tous les enrichissements constatés ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre de masse. Lors d'expériences de triple marquage réalisées avec les substrats marqués
Na15NO3et NaH13CO3 dans un milieu contenant 92,5 % 2H2O, l'analyse RMN de la protéine GyrB(l-219) purifiée a montré qu'il est en outre possible d'enrichir en 2H les groupements méthyles de certains acides aminés. Dans le cas de E. coli ceci nécessite l'utilisation de glucose deutéré (Bruno Kieffer, communication personnelle). La méthode de marquage mis au point chez Anabaena sp. PCC 7120 permet ainsi de marquer de façon simple avec 2H2O des groupements methyls dont le marquage chez E. coli nécessiterait l'utilisation de substrats complexes. Enfin, avec Anabaena sp. PCC 7120 et le système d'expression nir, il semblerait que l'expression de protéines recombinantes ne soit pas affectée de façon significative lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux fortement deutérés (>90% H2O). Par contre chez E. coli, il est couramment observé une diminution du taux d'expression lors de culture en présence de taux élevé d' 2H2O (>90%) dans le milieu de culture.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'expression de protéines recombinantes caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cyanobactéries une séquence codant une protéine en aval d'une séquence promoteur de transcription de cyanobactérie inductible puis à induire l'expression de cette protéine et isoler les protéines recombinantes ainsi synthétisées.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séquence promoteur de transcription est celle de l'opéron nir des cyanobactéries.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la séquence promoteur de transcription est induite par les nitrates et/ou les nitrites.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la séquence promoteur de transcription est induite par le NaNO3.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la cyanobactérie est de l'espèce Anabaena.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la cyanobactérie est
Anabaena sp. PCC 7120.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le milieu de culture des cyanobactéries contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu de culture des cyanobactéries contient au moins du Na15NO3.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine recombinante exprimée est toxique pour les cyanobactéries.
10. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN codant une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie.
11. Vecteur selon la revendication 10, dans lequel la séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie est celle de l'opéron nir des cyanobactéries.
12. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 10 ou 11 pour l'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries.
13. Utilisation selon la revendication 12, lesdites cyanobactéries étant cultivées dans un milieu qui contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H.
14. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13, lesdites cyanobactéries étant cultivées dans un milieu qui contient au moins du Na15NO3.
15. Cyanobactérie caractérisée par le fait qu'elle a été transformée par un vecteur selon l'une des revendications 10 ou 11.
16. Cyanobactérie selon la revendication 15, qui est de l'espèce Anabaena 17. Cyanobactérie selon la revendication 16, qui est Anabaena sp. PCC 7120.
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