FR2862660A1 - Systeme d'expression inductible de proteines recombinantes chez les cyanobacteries. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un système d'expression inductible chez les cyanobactéries, permettant l'expression de protéines recombinantes ainsi que les vecteurs et cyanobactéries contenant ce système d'expression.

Description

se révèle être beaucoup plus difficile chez les cyanobactéries en

utilisant un promoteur constitutif. L'expression de ces protéines est en effet perdue à cause d'un problème de réarrangement plasmidique durant la croissance bactérienne. Le développement d'un système d'expression efficace dans les cyanobactéries est de ce fait un problème

important en ce qui concerne le marquage de protéines recombinantes.

La demanderesse a découvert que l'on pouvait exprimer des protéines potentiellement toxiques sous contrôle d'un promoteur inductible dans les cyanobactéries.

Un objet de l'invention est ainsi un procédé d'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries à partir d'une séquence de promoteur de transcription inductible de cyanobactérie.

Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur contenant une séquence codant une protéine sous contrôle d'une séquence de promoteur de transcription 15 inductible de cyanobactérie.

Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un vecteur de ce type dans les cyanobactéries pour l'expression de protéines recombinantes dans ces bactéries.

Un autre objet de l'invention consiste en une cyanobactérie contenant un 20 vecteur de ce type.

D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lumière de la description, des exemples qui suivent ainsi que des dessins annexés à la présente demande.

La figure lA montre l'accumulation de la protéine MBP en fonction du temps (en jours) dans une bactérie Anabaena sp. PCC 7120 transformée par le plasmide pNirMBP et induite.

La figure 1B montre l'accumulation de la protéine MBP en fonction du temps (en jours) dans une bactérie Anabaena sp. PCC 7120 transformée par le plasmide pTacIndMBP et induite.

La figure 2 montre une comparaison des quantités de protéines synthétisées avant et après induction de la bactérie Anabaena sp. PCC 7120 transformée soit par le plasmide pNirMBP soit par le plasmide pTacIndMBP.

L'invention est ainsi relative à un procédé d'expression de protéines recombinantes caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cyanobactéries une séquence codant une protéine en aval d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie puis à induire l'expression de cette protéine et isoler les protéines recombinantes ainsi synthétisées.

Contrairement à E. coli, il n'existe pas chez les cyanobactéries de système d'expression disponible dans le commerce. Seulement quelques exemples d'expressions hétérologues dans les cyanobactéries ont été rapportés dans la littérature et l'expression de ces protéines est généralement sous le contrôle d'un promoteur de cyanobactérie constitutif. L'expression inductible dans les cyanobactéries pourrait être effectuée grâce à l'utilisation de promoteurs inductibles qui se sont révélés fonctionner dans les cyanobactéries tels que le promoteur PL du bactériophage lambda (XPL), le promoteur trc ou le promoteur tac de E. coli. Ces trois promoteurs nécessitent l'expression de leur propre répresseur chez la cyanobactérie pour permettre la régulation du promoteur. Le promoteur XPL qui est inductible par une augmentation de température à 42 C n'est pas adapté dans notre cas car Anabaena sp. PCC 7120 ne peut pousser à des températures supérieures à 30 C. Les promoteurs tac et trc sont deux promoteurs qui fonctionnent de façon similaire, ils sont tous les deux réprimés par le répresseur LacI de l'opéron lac et induits en présence d'IPTG, un analogue du lactose. Cependant, les essais d'expression avec le promoteur tac se sont révélés décevants. La quantité de protéine recombinante exprimée après induction est très basse (environ 10 fois moindre que celui obtenu avec un promoteur tac constitutif (expression en absence du répresseur LacI dans la cellule) et n'atteint jamais les niveaux de protéine résultant de l'expression constitutive tels que décrits dans les publications. Ainsi, le promoteur tac n'apparaît pas être un promoteur inductible adéquat. De plus, les cyanobactéries ne possédent pas le gène lacY de la lactose perméase qui permet l'entrée efficace de l'inducteur IPTG dans les cellules.

Jusqu'à présent, très peu de promoteurs inductibles ont été caractérisés dans les cyanobactéries. Certains promoteurs de cyanobactéries sont inductibles par des métaux ou des minéraux. Leur utilisation est cependant limitée car ils sont induits à des concentrations très faibles en inducteur de l'ordre du micromolaire et le milieu de culture généralement utilisé pour la croissance des cyanobactéries contient déjà les quantités suffisantes de métaux nécessaires à l'induction de ces promoteurs.

Un des promoteurs les mieux caractérisés dans les cyanobactéries est le promoteur qui contrôle l'expression de l'opéron nir, qui est impliqué dans l'assimilation du nitrate dans les cyanobactéries. Cet opéron est induit en présence de nitrate et également bien réprimé par l'ammonium (Frias, J.E. et al., 1997, J.Bacteriol., 179, 477-486).

En effet, chez les cyanobactéries, les gènes impliqués dans l'assimilation du nitrate sont codés dans l'opéron nir, dont la transcription est contrôlée par le promoteur nir. L'activation de ce promoteur 0 demande la fixation sur l'ADN de deux régulateurs de transcription, NtcA et NtcB, nécessaires pour l'expression des gènes codant des protéines spécifiquement impliquées dans l'assimilation du nitrate (Frias, J.E. et al., 1997, J. Bacteriol. , 179, 477-486).

Ainsi, le procédé d'expression de protéines recombinantes selon l'invention utilise comme séquence promoteur de transcription celle de l'opéron nir des cyanobactéries, séquence qui est induite en présence de nitrate et/ou de nitrite dans le milieu et préférentiellement en présence de NaNO3.

Il est important de noter que le démarrage du promoteur nir dans les cyanobactéries est extrêmement rapide et est induit quelques heures après incubation des bactéries dans un milieu contenant du nitrate comme source de d'azote à la place de l'ammonium.

La cyanobactérie utilisée est de préférence de l'espèce Anabaena et plus particulièrement Anabaena sp. PCC 7120 (souche disponible à la Collection de Cultures de l'Institut Pasteur, Paris), une bactérie filamenteuse qui est capable, comme toutes les cyanobactéries, de croître sur des milieux minimum contenant du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H pour produire à bas coût des protéines recombinantes marquées pour l'analyse par RMN. De préférence, le milieu de culture de ces cyanobactéries utilisé pour le marquage de protéines recombinantes exprimées contient au moins du Na15NO3.

Dans le système d'expression constitutif (l'expression des protéines a lieu pendant toute la durée du cycle cellulaire) utilisé, il est impossible de produire des protéines eucaryotes qui étaient toxiques pour la cellule. L'expression constitutive de telles protéines dans la cellule se traduit par une perte de l'expression due à un réarrangement du vecteur d'expression.

L'invention est ainsi relative à l'expression de protéines recombinantes dans laquelle la protéine recombinante exprimée est toxique pour les cyanobactéries.

En effet, ce système d'expression inductible au nitrate basé sur le promoteur de l'opéron nir des cyanobactéries permet de contrôler l'expression de la protéine d'intérêt. En absence d'inducteur dans le milieu de culture, la protéine n'est pas produite car le promoteur est réprimé. L'induction de l'expression est obtenue lorsque la source d'azote dans le milieu est soit des nitrates soit des nitrites soit les deux.

Un autre objet de l'invention est aussi un vecteur contenant une séquence d'ADN codant une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie.

La séquence d'ADN comprenant l'information génétique nécessaire pour l'expression d'une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription selon, l'invention peut être comprise dans tout vecteur couramment utilisé par l'homme du métier.

De préférence, la séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie est celle de l'opéron nir des cyanobactéries.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un vecteur selon l'invention pour l'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries.

Préférentiellement, les vecteurs sont utilisés dans des cyanobactéries cultivées dans un milieu qui contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H, et plus préférentiellement encore dans un milieu qui contient au moins du Na15NO3.

Un autre objet de l'invention est également une cyanobactérie transformée par un vecteur selon l'invention. De préférence, cette cyanobactérie est de l'espèce Anabaena et plus préférentiellement Anabaena sp. PCC 7120.

Ce système d'expression permet de résoudre les problèmes de perte d'expression rencontrés lors de la production de protéines toxiques en système constitutif. Les taux d'expression obtenus en utilisant ce système sont très élevés, de l'ordre de 100 mg/L. Ce système montre une efficacité équivalente aux meilleurs systèmes d'expression développés chez E. coli, notamment le système T7 (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol. 189, 113-130). La protéine recombinante peut en effet représenter plus de 30 % des protéines cellulaires totales.

Ce système est donc particulièrement adapté à la production de dizaines de milligrammes de protéines marquées 13C, 15N, et 2H pour la RMN. Les substrats marqués ne sont ajoutés qu'au moment de l'induction de l'expression de la protéine, ce qui permet de diminuer les coûts de marquage par rapport au système d'expression constitutif. En effet, avec le système tac constitutif (Desplancq et al., 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217) lors du marquage au 13C en fermenteur, 90 % du NaH13CO3 est perdu sous faune CO2 lors de l'aération du fermenteur en argon et doit être compensé par des ajouts réguliers de NaH13CO3 pendant toute la durée de la fermentation (8 à 10 jours).

Dans le système selon l'invention, l'utilisation de NaH13CO3 uniquement pendant la période d'expression (5 jours) de la protéine recombinante limite ainsi les 10 quantités en substrat marqué NaH13CO3 utilisé et donc diminue le coût du marquage au 13C.

Ainsi, ces bactéries sont capables de surproduire des protéines recombinantes marquées avec un taux d'enrichissement isotopique équivalent à celui obtenu chez E. coli, mais à un coût environ 10 fois moindre.

Les taux d'expression élevés dans le système d'expression inductible selon l'invention permettent non seulement de diminuer les volumes de culture utilisés et par conséquent les coûts de marquage mais aussi de produire plus facilement des protéines deutérées car, chez E. coli, la culture en milieu deutéré entraîne généralement une diminution du taux d'expression d'un facteur 3 à 4 fois. De plus, les cyanobactéries utilisent directement 2H2O comme substrat deutéré. Ceci permet de recycler le milieu deutéré et de le réutiliser pour de nouveaux marquages. Le marquage au 2H de protéines recombinantes chez les cyanobactéries permet donc de diminuer de façon significative le coût de marquage 2H.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.

Exemple n 1: Construction du vecteur pTac et de ses dérivés pTacMBP, pTacGyrB(I -219), pTacGST-E6, ptacMBP-YZD2.

Le vecteur pRL25Cmcs a été obtenu en digérant le vecteur pRL25C (Wolk et al., 1988, J. Bacteriol. 170, 1239-1244) par les enzymes de restriction Notl et BamHI selon les instructions du fabricant (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) pour y introduire un site de clonage pour les enzymes de restriction Stul, Xhol et Smal en utilisant les amorces oligonucléotidiques suivantes: 5'- GGCCGCAGGCCTCTCGAGCCCGGGG et 5'-GATCCCCCGGGCTCGAGAGGCCTGC. Le fragment codant pour le promoteur tac a été obtenu par digestion du vecteur pKK223. 3 (Amersham Biosciences,Uppsala, Sweden) avec les enzymes de restriction Xmnl et Sspl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Ce fragment a ensuite été ligué dans le vecteur pRL25Cmcs préalablement digéré par Smal et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs) pour donner le vecteur pTac. Les gènes codant pour la protéine GST-E6 (protéine de fusion comprenant la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine E6 du virus HPV16), et la protéine MBPY-ZD2 (protéine de fusion comprenant la protéine liant le maltose (MBP) et le domaine C-terminal de l'oncoprotéine E6, (YZD2)) ont été obtenus par PCR à partir des plasmides pETGST-E6 et pETMBP-YZD2. Ce dernier vecteur est identique au vecteur MBP-E6-C4C/4S (Nominé et al., 2003 Biochem. 42, 4909-4917). Le vecteur pETGST-E6 a été construit comme suit: le gène codant la protéine E6 a été obtenu par PCR avec les oligonucléotides suivants 5'ATCCGGGGTCTCCCATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGAC et 5'ATCCGGGGTCTCGGTACCGCGGCCGCTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTC en utilisant comme matrice le vecteur MBP-E6 6C/6S (Nominé et al., 2001, Protein Eng.14, 297305). Ce fragment de PCR a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Ncol et Kpnl et ligué avec le vecteur pETM-30 préalablement linérarisé avec les enzymes Ncol et Kpnl pour donner le vecteur pETGST-E6. Le vecteur pETM-30 a été obtenu du Dr. Stier et est référencé sur le site www.emblheidelberg.de/Externalinfo/geerlof/draft frame/index.htlm Les fragments de PCR provenant des plasmides pETGST-E6 et pETMBPYGD2 ont ensuite été clonés entre les sites de restriction EcoRI et BamHI situés dans le site de clonage multiple du vecteur pTac pour générer les vecteurs pTacGST-E6 et pTacMBP-YZD2. Le fragment codant pour le promoteur tac et le gène de la MBP a été obtenu en digérant le vecteur pMALc2 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) avec les enzymes de restriction Sspl et BamHI. Ce fragment a ensuite été ligué dans le vecteur pRL25C linéarisé comme suit pour donner le vecteur pTacMBP. pRL25C a été linéarisé avec l'enzyme de restriction Notl puis traité par l'enzyme Klenow, redigéré par l'enzyme de restriction BamHI et finalement déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs) . Le vecteur pTacGyrB(1-219) qui contient le domaine N-terminal de la gyrase B d'E. coli sous contrôle du promoteur tac constitutif, correspond au vecteur pRL25C24K (Desplancq et al., 2001, Protein Express. Purif. 23, 201-217).

fragment a ensuite été digéré par les enzymes de restriction BglII et BamHI, puis ligué dans le vecteur pRL25Cmcs préalablement digéré par BamHI et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs) pour donner le vecteur pNir.

Le promoteur nir peut être cloné dans les deux orientations dans le vecteur pRL25Cmcs. Pour toutes les expériences d'expression a été utilisée l'orientation qui génère en aval du promoteur un site de clonage multiple contenant EcoRI, BamHI, StuI, Xhol, Smal et Notl. Toutes les séquences codantes des protéines recombinantes testées (MBP, GyrB(1-219), GST-E6, MBP-YZD2) dans ce vecteur ont été clonées en utilisant les sites de restriction EcoRI et BamHI spécialement introduits à cet effet en aval du promoteur nir.

Exemple n 3: Construction du vecteur pTacIndMBP.

Le vecteur pRL25C a été linéarisé avec l'enzyme de restriction Notl, puis traité par l'enzyme Klenow. Le vecteur a ensuite été redigéré par l'enzyme de restriction BamHI et déphosphorylé avec la phosphatase d'intestin de veau (New England Biolabs). Le fragment MscI/BamHl du vecteur pMALc2 a été ligué dans le vecteur pRL25C linéarisé pour donner le vecteur pTacIndMBP.

Exemple n 4: Transformation de la cyanobactérie et amplification des transformants.

Toutes les cultures d'Anabaena sp. PCC 7120 sur milieu solide et liquide ont été réalisées à une température de 28 C et avec une illumination de 1500 lux. Le milieu culture utilisé est le milieu BG-11 (Castenholt, R.W. 1988, Methods Enzymol.

Exemple n 2: Construction du vecteur d'expression pNir et de ses dérivés 5 pNirMBP, pNirGyrB(1-219), pNirMBP-YZD2 et pNirGST-E6.

Le vecteur d'expression pNir a été construit à partir du vecteur pRL25Cmcs. Le fragment codant pour le promoteur Nir a été obtenu par amplification en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le vecteur pCSE21 (Frias et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 477-486) comme matrice et les oligonucléotides 5'- GCGCGCAGATCTAGCTACTCATTAGTTAAGTGTAATG et 5'GGCCGGGGATCCGAATTCGTTCTCATAAAGTTTTTTTGCTCAAG. Ce 167, 68-92). La souche E. coli J53 contenant le plasmide RP4 et la souche E. coli HB 101 contenant le plasmide pRL623 (dons du Dr Wolk) sont utilisées pour le transfert par conjugaison chez Anabaena du plasmide d'expression.

La souche Anabaena sp. PCC 7120 a été transformée par conjugaison suivant la méthode décrite par Elhai et Wolk (1988, Methods Enzymol.167, 747-754) avec les vecteurs d'expression dérivés du pNir. Les cellules transformées par le vecteur d'expression pNir ont été étalées sur un milieu de BG-11 agar contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM N-tris(hydroxymethyl)methyl2aminoethanesulfonic acid (TES) pH 8. Après 24 heures, la néomycine a été ajoutée sous l'agar à raison de 100 g/ml.

L'incubation a été poursuivie jusqu'à ce que les colonies apparaissent (environ 8 jours). Les transformants ont ensuite été cultivés dans 100 de milieu BG-11 contenant 15 g/ml de néomycine et 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8 dilué au demi dans un milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8 conditionné. Le milieu conditionné est un milieu ayant été préalablement utilisé pour cultiver la souche sauvage Anabaena sp. PCC 7120, puis stérilisé par filtration sur filtre 0,22 avant utilisation. Les 100 l de préculture de transformants ont été ensuite utilisés pour inoculer 1 ml de milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH8 et 15 g/ml de néomycine. Cette culture de 1 ml a été utilisée pour inoculer 5 ml du même milieu BG-11 puis par la suite 25 ml.

Pour les transformations de la souche Anabaena sp. PCC 7120 avec les vecteurs d'expression dérivés du vecteur pTac, le protocole de transformation est similaire à celui utilisé pour les vecteurs d'expression pNir excepté que le milieu solide contient NaNO3 comme source d'azote à une concentration de 500 mg/L. La source d'azote est également NaNO3 dans le milieu utilisé pour l'amplification. Le BG-11 liquide utilisé contient 500 mg/L de NaNO3 et 300 g/ml de néomycine. Les autres paramètres du protocole d'amplification sont inchangés.

Dans chaque cas, l'expression de la protéine d'intérêt est sous le contrôle des promoteurs tac ou nir. Ces vecteurs d'expression contiennent en plus de leur promoteur spécifique, une origine de réplication ColEl opérationnelle chez E. coli, une origine de réplication opérationnelle chez Anabaena sp. PCC 7120 (pDU1), une origine de transfert pour la conjugaison et un gène de résistance à la néomycine.

Exemple N 5: Comparaison des systèmes nir et tac constitutif.

Les cultures d'Anabaena ont été réalisées à une température de 28 C, une agitation de 150 rpm et une illumination de 1500 lux. Des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pTacMBP ou pTacGyrB(1219) ont été resuspendues dans 50 ml de milieu BG-11 contenant 300 gg/ml de néomycine et 500 mg/L de NaNO3 et cultivées jusqu'à une densité optique à 700 nm (DO,00) d'environ 2. En parallèle, des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pNirMBP ou pNirGyrB(1- 219) ont également été induites. Pour ce faire, les cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées et cultivées dans un milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1, 10 mM '1ES pH 8 et 15 p,g/ml de néomycine ont été lavées deux fois avec du milieu BG-11 ne contenant aucune source d'azote. Après lavage, les cellules ont été resuspendues à une DO,00 de 0,5 dans du milieu BG11 contenant 500 mg/L NaNO3 et 15 pg/ml de néomycine.

Les extraits cellulaires de ces cultures ont été analysés par gel d'électrophorèse de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate (SDSPAGE) et une évaluation de ces différents taux d'expression a été réalisée en comigrant sur un tel gel une gamme de quantité connue de protéine. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 suivant: Vecteurs pNirMBP pTacMBP pNirGyrB(1-219) pTacGyrB(1-219) Protéines MBP GyrB(1-219) Taux 250 10 125 10 100 3 15 0,5 d'expression en mg/L La protéine GyrB(1-219) est environ 10 fois moins exprimée dans le système tac constitutif par rapport au système nir. Dans le cas de la protéine MBP, ce rapport est de 2. L' ensemble des essais effectués par ailleurs a montré que le système tac constitutif ne permet pas d'atteindre des taux d'expression aussi élevés que ceux obtenus avec le système nir.

Exemple n 6: Comparaison des systèmes tac et nir induits.

Les systèmes tac inductible et nir ont été comparés en utilisant la MBP comme protéine-test. Des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pTaclndMBP ont été induites en présence de 1 mM IPTG. L'induction a été réalisée sur 7 jours et chaque jour des cellules ont été prélevées. En parallèle, des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées par le vecteur pNirMBP ont également été induites. Dans ce cas, l'induction a aussi été réalisée sur 7 jours. Des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 non transformées ont été cultivées comme contrôle négatif d'expression dans du milieu BG-11 contenant soit 500 mg/L de NaNO3, soit 10 mM NH4C1 et 10 mM TES pH 8. Les figures lA et 1B montrent l'analyse par SDSPAGE des extraits cellulaires d'aliquotes des cellules induites d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées par les vecteurs pNirMBP ou pTaclndMBP en fonction du temps. Le système nir permet d'obtenir un taux d'expression environ 10 fois plus élevé de protéine MBP à partir du jour 4 (Figure 1A) par rapport au système tac (Figure 1B).

Le système nir est donc un système d'expression inductible très performant qui permet en quelques jours l'accumulation de l'ordre de 250 mg/L de MBP dans des cyanobactéries.

Exemple n 7: Régulation de l'expression des systèmes tac d'E. coli et nir 20 chez Anabaena sp. PCC 7120.

Pour étudier la régulation des promoteurs nir et tac, les taux d'expression basale de la MBP ont été testés dans les extraits cellulaires non induits. Des extraits cellulaires de cellules non induites et de cellules induites pendant 5 jours d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées soit par le plasmide pNirMBP ou le plasmide pTaclndMBP ont été analysés par SDS-PAGE. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de nitrocellulose et détectées à l'aide d'anticorps polyclonal de lapin anti-MBP (New England Biolabs) par chimioluminescence. La Figure 2 montre qu'en absence d'inducteur aucune protéine n'est détectée dans l'extrait cellulaire d'Anabaena transformées avec le vecteur pNirMBP alors que la protéine MBP est mise en évidence dans l'extrait cellulaire d'Anabaena transformées avec le vecteur pTaclndMBP. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine GyrB(1-219). Ainsi, le promoteur nir est mieux réprimé en absence d'inducteur que le promoteur tac.

Exemple n 8: Expression de protéines toxiques chez Anabaena sp. PCC 7120 Le système nir a également été testé pour la production de la protéine E6 et de son domaine C-terminal (YZD2) exprimés sous la forme de fusions. Lorsque ces polypeptides sont exprimés chez E. coli, ils s'avèrent toxiques et nécessitent l'utilisation d'un système d'expression hautement régulée (G. Travé, communication personnelle). Les deux protéines de fusion GST-E6 et MBP-YZD2 ont été testées dans le système tac constitutif chez Anabaena sp. PCC 7120. Dans ce cas, une perte d'expression au cours de la croissance des cellules a été observée, perte d'expression qui est plus précoce dans le cas de la protéine GST-E6 où elle apparaît dès la deuxième étape d'amplification. Pour la protéine MBP-YZD2, la perte d'expression a été mise en évidence lorsque la culture a atteint un volume de 200 ml. Dans les deux cas, cette perte d'expression est liée à un remaniement du plasmide contenu dans les cellules transformées. Ceci a été mis en évidence en comparant le profil de restriction après digestion par les enzymes de restriction Ndel, SpeI, Xhol du vecteur d'expression d'origine avant transformation et celui du vecteur réextrait des cellules d'Anabaena transformées n'exprimant plus la protéine. Lorsque ces protéines ont été testées dans le système nir aucune perte d'expression n'a été observée.

Le tableau 2 résume les valeurs moyennes des taux d'expression obtenus avec les 20 systèmes tac constitutif et nir pour les polypeptides GST-E6 et MBP-YZD2.

Vecteurs pNirMBP-YZD2 pTacMBP-YZD2 pNirGST-E6 pTacGST-E6 Protéines MBPYZD2 GST-E6 Taux 10 1 0 10 1 0 d'expression en mg/L Des taux d'expression de l'ordre de 10 mg/L ont ainsi été obtenus après induction. Le système nir est donc suffisamment régulé pour permettre la production de protéines toxiques chez Anabaena sp. PCC 7120.

Exemple n 9: Production de protéine insoluble chez E. coli sous forme soluble avec le système d'expression nir chez Anabaena sp. PCC 7120 La MBP exprimée sous le contrôle du promoteur nir peut représenter jusqu'à 30% des protéines cellulaires. Lorsque de telles quantités de protéines recombinantes sont obtenues chez E. coli, elles sont généralement accumulées sous la forme de corps d'inclusion.

Le gène codant pour un mutant insoluble de la MBP, malE31 (Betton and Hoffnung, 1996, J. Biol. Chem. 271, 8046-8052) a été cloné par PCR dans le vecteur pNir. La PCR a été réalisée en deux étapes. Dans une première étape les mutations ont été introduites. Deux fragments chevauchants de PCR ont été obtenus en utilisant comme matrice le vecteur pNirMBP et les deux paires d'oligonucléotides suivants: oligol, 5'-CGCGCGAATTCATGAAAATCGAAGAAGGTA et oligo 2, 5'GACTTTAGGATCGGTATCTTTCTCGAATTTCTTA, oligo 3, 5'GATACCGATCCTAAAGTCACCGTTGAGCATCC et oligo 4, 5'CGCGCGGGATCCCTATGAAATCCTTCCCTCGATCCC. Les deux fragments de PCR ont ensuite été purifiés et mélangés de façon équimolaire puis réamplifiés avec les oligos 1 et 4 pour obtenir un fragment correspondant au gène malE31. Ce fragment a été digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et BamHI et inséré dans le vecteur pNir préalablement digéré avec les mêmes enzymes et déphosphorylé. Des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNir contenant le mutant malE31 ont été induites pendant 4 jours. Les cellules ont ensuite été lysées par sonication. Les extraits cellulaires ont été centrifugés 10 min à 10000 rpm et le surnageant correspondant à la fraction soluble a été séparé du culot (fraction insoluble). L'analyse par SDS-PAGE d'une aliquote des fractions soluble et insoluble a montré que le polypeptide malE31 produit était présent essentiellement dans la fraction soluble. Cette protéine insoluble chez E. coli et produite sous forme de corps d'inclusion peut donc être accumulée sous forme soluble chez Anabaena à un taux d'expression équivalent à celui de la protéine sauvage.

Exemple n 10: Production de protéines marquées au 14C.

Le système d'expression nir a été utilisé pour produire la protéine GyrB(1-219) marquée au 14C. Des cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées avec le vecteur pNirGyrB(1-219) ont été induites pendant 4 jours dans un milieu BG-11 contenant 33 mg/L de NaH14CO3 (1 mCi, 52 mCilmmol, NEN Life Science Products, Zaventem, Belgium), 500 mg/L de NaNO3 et 15 g/ml de néomycine. Les cellules ont été incubées à une température de 28 C sous une illumination de 1500 lux dans un système de culturehermétiquement clos. L'analyse par SDS-PAGE et autoradiographie d'extraits de cellules d'Anabaena cultivées en présence de NaH14CO3 a montré que toutes les protéines cellulaires étaient marquées uniformément au 14C. La protéine GyrB(1-219) ainsi marquée a été purifiée selon la méthode décrite par (Desplancq et al., 2001, Protein Express. Purif 23, 201-217). Son taux d'incorporation de 14C a été déterminé à partir de 20 l d'une solution de protéine purifiée à partir des extraits cellulaires induits. Les coups par minute (cpm) ont été déterminés par comptage en présence de 2 ml de liquide de scintillation dans un compteur de radioactivité (Packard, Groningen, Netherlands).

L'activité spécifique de la protéine purifiée a été de 4x1014 cpm/mol. Le système nir permet donc de réaliser un marquage métabolique au 14C de protéines recombinantes.

Exemple n 11: Production de protéines marquées au 15N, 13C,2H.

La protéine GyrB(1-219) a été utilisée avec le système nir pour la surproduction de protéines recombinantes marquées au 15N, 13C, 2H. Une préculture de cellules est d'abord réalisée dans 600 ml de milieu BG-11 contenant 10 mM NH4C1 et 10 mM 'l'ES pH8 et 15 g/ml de néomycine. Les cellules sont incubées pendant 5 jours jusqu'à D0700=1,5-2 à une température de 28 C, une agitation de 150 rpm et une illumination de 1500 lux, puis centrifugées pour éliminer le milieu contenant le NH4C1. Elles sont ensuite utilisées pour inoculer deux litres de BG-11 contenant 0,5 g/L de NaNO3, 0,5 g/L de NaHCO3 et 15 g/ml de néomycine dans un fermenteur. Ce fermenteur est équipé de capteurs pH, 02 et température qui permettent de réguler automatiquement le pH à une valeur 8, la température à une valeur de 28 C et de suivre la consommation de NaHCO3 par analyse en ligne de la production en oxygène des cellules. La culture est réalisée sur une période de 5 jours avec addition quotidienne d' lg/L de NaHCO3. L'agitation dans le fermenteur est de 100 rpm et la culture est soumise à un flux constant d'argon pendant toute la durée de l'expérience. Le fermenteur est illuminé avec deux sources de lumière ayant chacune une intensité de 4000 lux.

Dans ces conditions, en utilisant comme substrat marqué uniquement Na15NO3, la GyrB(1-219) a été produite avec un enrichissement uniforme de 90% en 15N. Lors d'un marquage double 15N et 13C réalisé avec les substrats marqués Na'5NO3etNaH13CO3, la protéine GyrB(1-219) a été enrichie de façon uniforme en 15N et 13C avec un enrichissement supérieur à 90% pour chacun de isotopes. Cet enrichissement est équivalent à celui obtenu précédemment avec Anabaena sp. PCC 7120 et le vecteur d'expression pTac (Desplancq et al., 2001; Protein Express. Purif. 23, 201-217).

En utilisant 2H2O à la place de H2O dans le milieu de culture, la protéine GyrB(1-219) a été produite fortement enrichie en 2H. Pour ce type de marquage, il est nécessaire au préalable d'adapter les cellules d'Anabaena sp. PCC 7120 transformées à la croissance dans un milieu BG-11 contenant 50 % d'2H2O puis 70 % et enfin 90 %. Ainsi, avant transfert dans le fermenteur, la préculture est réalisée dans du milieu deutéré à la concentration souhaitée pour l'enrichissement final. Une culture effectuée dans un milieu contenant 65 % d'2H2O a permis d'obtenir la protéine GyrB(1-219) enrichie à 41% en 2H et une culture effectuée dans un milieu contenant 92,5% d'2H2O a permis un enrichissement de 84% en 2H. Tous les enrichissements constatés ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre de masse.

Lors d'expériences de triple marquage réalisées avec les substrats marqués Na15NO3 et NaH13CO3 dans un milieu contenant 92,5% 2H2O, l'analyse RMN de la protéine GyrB(1-219) purifiée a montré qu'il est en outre possible d'enrichir en 2H les groupements méthyles de certains acides aminés. Dans le cas de E. coli ceci nécessite l'utilisation de glucose deutéré (Bruno Kieffer, communication personnelle). La méthode de marquage mis au point chez Anabaena sp. PCC 7120 permet ainsi de marquer de façon simple avec 2H2O des groupements methyls dont le marquage chez E. coli nécessiterait l'utilisation de substrats complexes. Enfin, avec Anabaena sp. PCC 7120 et le système d'expression nir, il semblerait que l'expression de protéines recombinantes ne soit pas affectée de façon significative lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux fortement deutérés (>90% 2H2O). Par contre chez E. coli, il est couramment observé une diminution du taux d'expression lors de culture en présence de taux élevé d' 2H2O (>90%) dans le milieu de culture.

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'expression de protéines recombinantes caractérisé en ce qu'il consiste à introduire dans des cyanobactéries une séquence codant une protéine en aval d'une séquence promoteur de transcription de cyanobactérie inductible puis à induire l'expression de cette protéine et isoler les protéines recombinantes ainsi synthétisées.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la séquence promoteur de transcription est celle de l'opéron nir des cyanobactéries.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel la séquence promoteur de transcription est induite par les nitrates et/ou les nitrites.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la séquence promoteur de transcription est induite par le NaNO3.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la cyanobactérie est de l'espèce Anabaena.

6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la cyanobactérie est Anabaena sp. PCC 7120.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le milieu de culture des cyanobactéries contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu de culture des cyanobactéries contient au moins du Na15NO3.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la protéine recombinante exprimée est toxique pour les cyanobactéries.

10. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN codant une protéine recombinante sous contrôle d'une séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie.

11. Vecteur selon la revendication 10, dans lequel la séquence promoteur de transcription inductible de cyanobactérie est celle de l'opéron nir des cyanobactéries.

12. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 10 ou 11 pour l'expression de protéines recombinantes dans les cyanobactéries.

13. Utilisation selon la revendication 12, lesdites cyanobactéries étant cultivées dans un milieu qui contient du 13C et/ou du 15N et/ou du 2H.

14. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13, lesdites cyanobactéries étant cultivées dans un milieu qui contient au moins du Na15NO3.

15. Cyanobactérie caractérisée par le fait qu'elle a été transformée par un vecteur selon l'une des revendications 10 ou 11.

16. Cyanobactérie selon la revendication 15, qui est de l'espèce Anabaena

17. Cyanobactérie selon la revendication 16, qui est Anabaena sp. PCC 7120.