CN113502255A

CN113502255A - 用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物

Info

Publication number: CN113502255A
Application number: CN202111058711.0A
Authority: CN
Inventors: 杜德尧; 王高艳; 张倩; 宗朕; 李明月; 邱悦悦; 尹进; 张浩千
Original assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd; Bluepha Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd; Bluepha Co ltd
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2041-09-10
Also published as: WO2023035527A1; CN113502255B

Abstract

本发明提供了用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物，更具体地是一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶，其特征在于所述工程化大肠杆菌的基因组fabH基因被缺失。所述工程化大肠杆菌实现了改善的橄榄醇和橄榄醇酸收率。

Description

用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及用于生产橄榄醇（olivetol，OL）和橄榄醇酸（olivetolic acid，OA）的工程化微生物。

背景技术

大麻素（cannabinoids）是指来源于植物大麻（Cannabis sativa）的一大类化学分子，种类超过150种。目前国际上使用较多的大麻素包括大麻二酚（cannabidiol，CBD），四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）和大麻萜酚（cannabigerol，CBG）。CBD是植物大麻中的主要化学成分之一，是大麻素中的非成瘾性成分。THC是大麻中的主要精神活性物质，可成瘾，是在世界各国被严格管制的物质。CBG因其在植物大麻中含量较低，通常被归类为微量大麻素或稀有大麻素，因其为其它大麻素的共同前体，被称为是“大麻素之母”。随着植物大麻的生长，大部分CBG转化为CBD和THC，只有微量的CBG残留在植物体内，供应严重受限，使得CBG应用的发展受到了较大的限制。

橄榄醇和橄榄醇酸是来源于大麻属(Cannabis)植物的III型聚酮类化合物，具有抗菌，抗肿瘤和抗紫外线等活性，同时也是大麻素的关键生物合成前体。很少有报道从植物天然提取橄榄醇和橄榄醇酸。而且植物种植受诸多因素限制，例如，相比于生物合成更难获得高纯度产品，种植管制严格，产能有限，需要高昂的植物种植和下游提取的投入，生产稳定性较低。橄榄醇和橄榄醇酸的化学合成成本高昂，并且存在环境污染和条件苛刻等问题。而对于橄榄醇和橄榄醇酸的生物合成，根据发明人所知，以大肠杆菌为底盘菌来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的产量尚不足以达到产业化的要求。Tan Z等（Tan Z, Clomburg J M,Gonzalez R. Synthetic pathway for the production of olivetolic acid inEscherichia coli[J]. ACS synthetic biology, 2018, 7(8): 1886-1896.）报道了在500mL生物反应器中橄榄醇酸的产量仅为80mg/L。2020年，专利号为WO2020176547A1的专利报道了，通过筛选来源于Cymbidium hybrid cultivar的橄榄醇合酶，测试发现橄榄醇的产量为40.7 mg/L。

本领域仍然需要以高收率来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的新型微生物。

发明内容

本发明通过提供以高收率来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的新型工程化微生物而满足了本领域的上述需要。根据本发明的工程化微生物能够在小规模培养下产生高浓度的橄榄醇和橄榄醇酸，而且由于小规模培养时发酵液的细胞浓度（OD600）远低于工业化培养时发酵液的细胞浓度。工业化培养时细胞浓度约为小规模培养时的十倍以上，因此产量也会为十倍以上，可以预期本发明的工程化微生物具有强大的橄榄醇和橄榄醇酸工业化生产潜力，有利于大麻素的工业化生物合成。

因此，在一个方面，本发明提供了一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶（olivetolic acid synthase，OLS），其中所述工程化大肠杆菌的基因组fabH基因被缺失。

在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇酸环化酶（olivetolic acid cyclase，OAC）。

在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的基因组fadE基因被缺失。

在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌被修饰以过表达长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）。

在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌是从BW25113修饰而来。

在所述方面的一些实施方式中，所述修饰是通过引入质粒来进行。

在所述方面的一些实施方式中，所述OLS和OAC通过同一质粒来共表达。

在所述方面的一些实施方式中，所述fadD通过质粒来过表达。

在另一个方面，本方法提供了一种用于制备工程化大肠杆菌的方法，其包括修饰大肠杆菌以表达橄榄醇合成酶（OLS），且使所述大肠杆菌的基因组fabH基因缺失。

在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括修饰所述大肠杆菌以表达橄榄醇酸环化酶（OAC）。

在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括使所述大肠杆菌的基因组fadE基因缺失。

在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括修饰所述大肠杆菌以过表达长链酯酰辅酶A合成酶。

在所述方面的一些实施方式中，所述fadD通过质粒来过表达。

具体实施方式

除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和合成生物学等等的常规技术，其在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的解释：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,”第二版（Sambrook等人，1989）；“Oligonucleotide Synthesis”（M.J. Gait编,1984）；“Animal CellCulture”（R.I. Freshney编,1987）；“Methods in Enzymology”（Academic Press, Inc.）；“Current Protocols in Molecular Biology”（F.M. Ausubel等人编，1987，以及定期更新）；“PCR: The Polymerase Chain Reaction,”（Mullis等人编,1994）；Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第二版，J. Wiley & Sons（NewYork，N.Y.1994）和March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure第四版，John Wiley & Sons（New York，N.Y.1992），为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了下述术语。

冠词"一个/一种（a/an）"和"该/所述（the）"在本文中用于指一个/一种或超过一个/一种（即至少一个/一种）所述冠词的语法对象。例如，"要素"意指一个/一种要素或超过一个/一种要素。

替代（例如"或"）的使用应理解为意指替代方案中任一、两者或其任何组合。

术语"和/或"应理解为意指替代方案中任一或两者。

如本文使用的，术语"约"或"大约”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，改变多达15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"约"或"大约”是指围绕参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。

如本文使用的，术语"基本上（substantially/essentially）”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，是约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"基本上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。

如本文使用的，术语"基本上不含"当用于描述组合物例如细胞群或培养基时，指不含指定物质，例如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含指定物质的组合物，或如通过常规手段测量是无法检测的。类似含义可应用于术语"不存在"，当指不存在组合物的特定物质或组分时。

在本说明书全文，除非上下文另有要求，否则术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”应理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤组或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤组或要素组。在特定实施方式中，术语"术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”同义使用。

"由……组成"意指包括但限于在短语"由……组成"后的任何。因此，短语"由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，并且没有其他要素是可以存在的。

"基本上由……组成"意指包括在短语"基本上由……组成"后列出的任何要素，并且限于不干扰或贡献于所列出的要素的公开内容中指定的活动或动作的其他要素。因此，短语"基本上由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，但没有其他要素是任选的，并且取决于它们是否影响所列出的要素的活动或动作而可以存在或不存在。

在本说明书全文，提到"一个实施方式"、"一些实施方式"、"一个具体的实施方式"等类似表述意指与所述实施方式结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述短语在本说明书全文的各个地方的出现不一定全部指相同实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合。

在公开关于本发明的特定方面（例如本发明的产品）的特征时，这样的公开也被认为适用于本发明的任何其他方面（例如本发明的方法和用途），并作出必要的修正。

本发明至少部分地基于这样的发现：通过使宿主微生物（例如大肠杆菌）中的基因组fabH编码序列缺失，表达橄榄醇合成酶（OLS）和/或橄榄醇酸环化酶（OAC）的宿主微生物可产生高浓度的橄榄醇和/或橄榄醇酸。不希望受到理论的限制，据信通过使fabH基因缺失，促进工程化微生物中的橄榄醇合成酶（OLS）和/或橄榄醇酸环化酶（OAC）利用胞内增加的水平的丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）和己酰辅酶A（Hexanoyl-CoA）为底物来合成橄榄醇和/或橄榄醇酸。这样，可将该工程化微生物用于按需生产橄榄醇或橄榄醇酸，由此超越了仍然依赖于复杂合成化学的繁琐高成本的现有技术。

因此，在一个方面，本发明提供了一种工程化微生物，其中所述工程化微生物被修饰以表达橄榄醇合成酶（OLS），其中所述工程化微生物的基因组fabH基因被缺失。

在一些实施方式中，被工程化来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的微生物是大肠杆菌（E. coli）或其亲缘菌。在一个具体实施方式中，被工程化来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的微生物是大肠杆菌BW25113（ATCC编号；购自美国菌种保藏中心American Type CultureCollection）。BW25113菌株来源于E.coli K-12W1485，是K-12W1485的衍生菌株，与MG1655类似，是一种经过较少改造，比较接近于“野生型”的大肠杆菌工程菌株。与WT相比在丙二酰辅酶A和己酰辅酶A的产量方面有所改善。

在一些实施方式中，本文所用的橄榄醇合成酶可以来源于大麻（Cannabis sativa）。橄榄醇合成酶可以是优化的用于在大肠杆菌中表达的变体。在一些实施方式中，橄榄醇合成酶可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或由与SEQ ID NO: 2具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方式中，橄榄醇合成酶可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 3具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的氨基酸序列。

本文所用的示例性橄榄醇合成酶可以包括全长橄榄醇合成酶、橄榄醇合成酶的片段、橄榄醇合成酶的变体、截短的橄榄醇合成酶或具有橄榄醇合成酶的至少一种活性的融合酶。在一些实施方式中，在本发明中使用的橄榄醇合成酶具有催化从丙二酰辅酶A和己酰辅酶A合成橄榄醇的活性。

在一些实施方式中，本文所用的橄榄醇酸环化酶可以来源于大麻（Cannabis sativa）。橄榄醇酸环化酶可以是优化的用于在大肠杆菌中表达的变体。在一些实施方式中，橄榄醇酸环化酶可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或由与SEQ ID NO: 4具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方式中，橄榄醇酸环化酶可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 5具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的氨基酸序列。

本文所用的示例性橄榄醇酸环化酶可以包括全长橄榄醇酸环化酶、橄榄醇酸环化酶的片段、橄榄醇酸环化酶的变体、截短的橄榄醇酸环化酶或具有橄榄醇酸环化酶的至少一种活性的融合酶。在一些实施方式中，在本发明中使用的橄榄醇酸环化酶具有将橄榄醇羧化成橄榄醇酸的活性。

在本发明的一些实施方式中，长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）、脂酰辅酶A脱氢酶（fadE）和β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶（fabH）是大肠杆菌中的固有组分。

在一些实施方式中，本文所用的fadD可以来源于大肠杆菌。fadD可以是优化的用于在大肠杆菌中表达的变体。在一些实施方式中，fadD可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列或由与SEQ ID NO: 13具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方式中，fadD可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO: 14具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的氨基酸序列。

本文所用的示例性fadD可以包括全长fadD、fadD的片段、fadD的变体、截短的fadD或具有fadD的至少一种活性的融合酶。在一些实施方式中，在本发明中使用的fadD具有催化从己酸通过酰化产生己酰辅酶A的活性。

在一些实施方式中，本发明所用的一种或多种酶可以是本文描述的酶的突变体（mutant）或变体（variant）。如本文所用的，“突变体”和“变体”是指保留与原始序列的生物学活性相同或基本上相同的生物学活性的分子。该突变体或变体可以来自相同或不同的物种，或者可以是基于天然的分子或现有的分子的合成序列。在一些实施方式中，术语“突变体”和“变体”是指多肽具有的氨基酸序列与对应的野生型多肽至少相差一个氨基酸。例如，突变体和变体可以包含保守氨基酸取代：即用具有相似性质的氨基酸取代原有的对应氨基酸。保守取代可以是极性对极性氨基酸（甘氨酸（G，Gly）、丝氨酸（S，Ser）、苏氨酸（T，Thr）、酪氨酸（Y，Tyr）、半胱氨酸（C，Cys）、天冬酰胺（N，Asn）和谷氨酰胺（Q，Gln））；非极性对非极性氨基酸（丙氨酸（A，Ala）、缬氨酸（V，Val）、色氨酸（W，Trp）、亮氨酸（L，Leu）、脯氨酸（P，Pro）、甲硫氨酸（Μ，Met）、苯丙氨酸（F，Phe））；酸性对酸性氨基酸（天冬氨酸（D，Asp）、谷氨酸（E，Glu））；碱性对碱性氨基酸（精氨酸（R，Arg）、组氨酸（H，His）、赖氨酸（K，Lys））；带电荷氨基酸对带电荷氨基酸（天冬氨酸（D，Asp）、谷氨酸（E，Glu）、组氨酸（H，His）、赖氨酸（K，Lys）和精氨酸（R，Arg））；和疏水对疏水性氨基酸（丙氨酸（A，Ala）、亮氨酸（ULeu）、异亮氨酸（I，Ile）、缬氨酸（V，Val）、脯氨酸（P，Pro）、苯丙氨酸（F，Phe）、色氨酸（W，Trp）和甲硫氨酸（M，Met））。在一些其他实施方式中，突变体或变体也可以包含非保守性取代。

在一些实施方式中，突变体或变体多肽可以具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个或前述数值中的任意两者构成的范围的氨基酸的置换、添加、插入或缺失。与未改变的酶相比，突变体或变体可以具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的活性。酶活性可以通过本领域已知的常规技术，例如比色酶学测定来测定。

如本领域技术人员众所周知的，可以通过使编码多肽如酶的核苷酸序列中的一个或多个编码核苷酸（即密码子）被在宿主中更好表达的另一种密码子替代来改善在宿主中异源核酸的表达（即密码子优化）。产生这种效应的一种原因是由于不同的生物体显示出对不同密码子的偏好。在一些实施方式中，本文公开的编码多肽如酶的核苷酸序列被修饰或优化，使得所得核苷酸序列反映针对特定宿主的密码子偏好。例如，在一些实施方式中，编码多肽如酶的核苷酸序列被针对大肠杆菌密码子偏好进行修饰或优化。参见例如Gouy M,Gautier C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity[J].Nucleic acids research, 1982, 10(22): 7055-7074.；Eyre-Walker A. Synonymouscodon bias is related to gene length in Escherichia coli: selection fortranslational accuracy[J]. Molecular biology and evolution, 1996, 13(6): 864-872.；Nakamura Y, Gojobori T, Ikemura T. Codon usage tabulated frominternational DNA sequence databases: status for the year 2000[J]. Nucleicacids research, 2000, 28(1): 292-292.。

多核苷酸或多肽与另一个多核苷酸或多肽具有一定的“序列同一性”或“同一性”百分比，意味着当比对两条序列时，该百分比的碱基或氨基酸相同并且在相同的相对位置。确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比同一性可以包括比对和比较两个序列中相应位置处的氨基酸残基或核苷酸。如果两个序列中的所有位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，那么所述序列被认为是100%相同的。序列同一性可以以多种不同方式确定，例如，可以使用各种方法和计算机程序（例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等）对序列进行比对。

本发明的一些实施方式涉及包含一个或多个编码OLS和/或OAC的核苷酸序列的表达构建体，例如载体，如质粒，优选地是包含一个或多个编码OLS和OAC的核苷酸序列的表达构建体。所述编码OLS或OAC的核苷酸序列如上所述。优选地，所述表达构建体是质粒。优选地，所述表达构建体可以用于在大肠杆菌，优选地在大肠杆菌BW25113中表达OLS和/或OAC，更优选共表达OLS和OAC两者。

本发明的一些实施方式涉及包含编码fadD的核苷酸序列的表达构建体，例如载体，如质粒。所述编码fadD的核苷酸序列如上所述。优选地，所述表达构建体是质粒。优选地，所述表达构建体可以用于在大肠杆菌，优选地在大肠杆菌BW25113中表达fadD。在一些实施方式中，宿主微生物本身表达fadD，因此在所述宿主微生物中引入编码fadD的表达构建体以过表达fadD。

对微生物进行工程化可以包括在所述微生物中表达感兴趣的酶。在一些实施方式中，本文所述的表达构建体通过转化（transformation）而引入到宿主微生物中以表达感兴趣的酶。所述转化可以通过本领域公知的方法进行。例如，本文所述的包含编码fadD的核苷酸序列的质粒可以通过转化而引入到大肠杆菌中以过表达fadD。转化可以是，但不限于，农杆菌介导的转化、用质粒DNA的电穿孔、DNA摄取、基因枪转化、病毒介导的转化或原生质体转化。转化可以是适用于特定宿主的任意其他转化方法。

在宿主微生物中表达感兴趣的酶以实现预期目的可以如上所述通过向所述宿主微生物中转化编码所述酶的表达构建体来实现，也可以通过采用各种各样的方式将编码所述酶的表达构建体整合到所述宿主微生物的基因组序列中来实现，也可以通过采用各种各样的方式增强所述宿主微生物中原有的酶编码基因如fadD编码基因的转录和/或表达来实现，例如通过使用更强的调节元件如启动子。这样的方式大体上都是本领域技术人员熟知的。在一些实施方式中，本文所用的质粒如SEQ ID NO: 1所示。在一些实施方式中，本文所用的质粒如SEQ ID NO: 12所示。在一些实施方式中，本文所用的质粒如SEQ ID NO: 15所示。

对微生物进行工程化可以包括干预所述微生物中的感兴趣的蛋白的功能，例如，减少或消除所述蛋白的表达，这可以例如通过在所述微生物中使感兴趣的基因组序列缺失来实现。在一些实施方式中，本文所述的微生物中的基因组fabH基因被缺失，使得3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶3（3-oxoacyl-[acyl carrier protein] synthase 3）不在所述微生物中被表达。在一些实施方式中，3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶3的氨基酸序列以NCBI ACCESSION NO: NP_415609（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/16129054）示出。在一些实施方式中，本文所述的微生物中的基因组fadE基因被缺失，使得酰基-CoA脱氢酶（acyl-CoA dehydrogenase）不在所述微生物中被表达。在一些实施方式中，酰基-CoA脱氢酶的氨基酸序列以NCBI ACCESSION NO: NP_414756（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/90111100）示出。在一些实施方式中，本文所述的微生物中的基因组fabH和fadE基因两者被缺失，使得3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶3和酰基-CoA脱氢酶两者不在所述微生物中被表达。在一些实施方式中，被缺失的fabH基因序列如SEQ ID NO: 8所示，或者是SEQ ID NO: 8的被缺失可以使得与3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]合成酶3具有相同或相似功能的蛋白不被表达的变体序列。在一些实施方式中，被缺失的fadE基因序列如SEQ ID NO: 11所示，或者是SEQ ID NO: 11的被缺失可以使得与酰基-CoA脱氢酶具有相同或相似功能的蛋白不被表达的变体序列。

微生物中的感兴趣的基因组序列的缺失可以通过本领域已知的方法进行。例如可以通过针对所述基因组序列设计用于λ-Red同源重组的人工序列，利用λ-Red同源重组将所述人工序列整合到基因组中的目标位置来使所述基因组序列缺失。具体实验方案可以参见本文描述的实施例。在一些实施方式中，用于缺失fabH基因的人工序列如SEQ ID NO: 6所示。在一些实施方式中，其中缺失fabH基因的大肠杆菌如BW25113基因组序列中在原fabH基因位点处上下游的部分序列为SEQ ID NO: 7。在一些实施方式中，用于缺失fadE基因的人工序列如SEQ ID NO: 9所示。在一些实施方式中，其中缺失fadE基因的大肠杆菌如BW25113基因组序列中在原fadE基因位点处上下游的部分序列为SEQ ID NO: 10。

除了使微生物中的感兴趣的基因组序列缺失以外，还可以通过本领域已知的其他方法来干预感兴趣的蛋白的功能，包括，但不限于，干预编码感兴趣的蛋白的基因组序列的转录、干预编码感兴趣的蛋白的mRNA的表达、干预感兴趣的蛋白的递送，例如向细胞外递送；更具体地，包括，但不限于，使编码感兴趣的蛋白的基因组序列或其调控元件如启动子的全部或部分缺失、在编码感兴趣的蛋白的基因组序列或其调控元件如启动子的中间插入影响其转录的一个或多个核苷酸例如终止密码子或使其一个或多个核苷酸突变至所述基因组序列无法正常转录的程度的方法、引入干预或沉默编码感兴趣的蛋白的mRNA的试剂如siRNA或dsRNAi试剂、或者抑制或停止递送感兴趣的蛋白例如至细胞外的系统（例如伴侣蛋白、信号序列、转运蛋白）的功能的方法。

用于宿主培养的合适的培养基可以包括标准培养基（例如Luria-Bertani肉汤，任选地补充一种或多种其他试剂，例如诱导剂；标准酵母培养基；等等）。在一些实施方式中，培养基可以补充有可发酵糖（例如己糖，例如葡萄糖、木糖等）。在一些实施方式中，合适的培养基包含诱导剂。在某些这样的实施方式中，诱导剂包括鼠李糖。

用于宿主培养的合适的培养基中的碳源可以不同，从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的更复杂的水解产物，如酵母提取物。盐的添加通常提供必需的元素，例如镁、氮、磷和硫，以允许细胞合成多肽和核酸。合适的培养基还可以补充有选择性试剂，例如抗生素，以选择维持某些质粒等。例如，如果微生物对某种抗生素具有抗性，如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素，则可以将该抗生素添加到培养基中，以阻止缺乏抗性的细胞生长。合适的培养基可以根据需要补充其他化合物以选择期望的生理或生化特性，如特定的氨基酸等。

本文例如在实施例部分中描述了适用于本发明的微生物的维持和生长的材料和方法。适用于微生物（例如大肠杆菌）的维持和生长的其他材料和方法在本领域中是众所周知的。示例性技术可以见于WO2009/076676；US12/335,071（US2009/0203102）；WO2010/003007；US2010/0048964；WO2009/132220；US2010/0003716；Gerhardt P, Murray R G E,Costilow R N, et al. Manual of methods for general bacteriology[J]. 1981.；Crueger W, Crueger A, Brock T D, et al. Biotechnology: a textbook ofindustrial microbiology[J]. 1990.，其中描述了可以使用的标准培养条件和发酵模式，例如分批、补料分批或连续发酵，其全部内容通过引用全文并入本文。

对于小规模生产，可以使工程化微生物以例如约100mL、500mL、1L、5L或10L的规模进行批量生长，发酵，并诱导其表达期望的核苷酸序列，如编码OLS、OAC和/或fadD的核苷酸序列，和/或合成期望的发酵产物，如橄榄醇和/或橄榄醇酸。对于大规模生产，可以使工程化微生物以约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L或更大的规模进行批量生长，发酵，并诱导其表达期望的核苷酸序列，如编码OLS、OAC和/或fadD的核苷酸序列，和/或合成期望的发酵产物，如橄榄醇和/或橄榄醇酸。

可以通过色谱法优选HPLC分离感兴趣的发酵产物来进行发酵产物的分析，以确定培养过程中的一个或多个时间处的浓度。也可以通过光度测定方式（吸收、荧光）检测微生物培养物和发酵产物。

本文所述的工程化微生物实现了改善的橄榄醇和/或橄榄醇酸的产量。在一些实施方式中，本文所述的工程化微生物与适当的未工程化或部分工程化的微生物对照相比，在橄榄醇和/或橄榄醇酸生产方面实现了至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000倍或更高或前述数值中的任意两者构成的范围的更高产量。在一些实施方式中，本文所述的工程化微生物在橄榄醇和/或橄榄醇酸生产方面实现了至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 mg/L或更高或前述数值中的任意两者构成的范围的产量。

本发明还提供了以下一些优选实施方式：

项目1.一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶（OLS），其中所述工程化大肠杆菌的基因组fabH基因被缺失。

项目2.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇酸环化酶（OAC）。

项目3.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌的基因组fadE基因被缺失。

项目4.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以过表达长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）。

项目5.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌是从BW25113修饰而来。

项目6.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述修饰是通过引入质粒来进行。

项目7.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述OLS和OAC通过同一质粒来共表达。

项目8.根据前述项目中任一项所述的工程化大肠杆菌，其中所述fadD通过质粒来过表达。

项目9.一种用于制备工程化大肠杆菌的方法，其包括修饰大肠杆菌以表达橄榄醇合成酶（OLS），且使所述大肠杆菌的基因组fabH基因缺失。

项目10.根据前述项目中任一项所述的方法，其包括修饰所述大肠杆菌以表达橄榄醇酸环化酶（OAC）。

项目11.根据前述项目中任一项所述的方法，其包括使所述大肠杆菌的基因组fadE基因缺失。

项目12.根据前述项目中任一项所述的方法，其包括修饰所述大肠杆菌以过表达长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）。

项目13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述工程化大肠杆菌是从BW25113修饰而来。

项目14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述修饰是通过引入质粒来进行。

项目15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述OLS和OAC通过同一质粒来共表达。

项目16.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述fadD通过质粒来过表达。

实施例

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs（NEB）公司，所用的小分子标准品采购自Sigma公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国Omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行。所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制，培养基中酵母提取物和蛋白胨购自英国OXID公司，其它试剂购自国药集团化学试剂公司。基因合成服务由华大基因研究院提供。

本文中可使用的大肠杆菌培养基：

•LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌30分钟。

•SOB培养基：5g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，0.5g/L NaCl，浓度为1M的KCl2.5mL。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

•ZY培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，蒸馏水溶解后，调pH至7.0。高压蒸汽灭菌30分钟。

•50×M：1.25mol/L Na₂HPO₄，1.25mol/L KH₂PO₄，2.5mol/L NH₄Cl，0.25mol/LNa₂SO₄，高压蒸汽灭菌30分钟。

•50×5052：25%甘油，2.5%葡萄糖，高压蒸汽灭菌30分钟。

•1M MgSO₄：称取24.6g MgSO₄·7H₂O加H₂O溶解，定容至100mL，然后高压蒸汽灭菌30分钟。

•1000×微量元素：50mmol/L FeCl₃，20mmol/L CaCl₂，10mmol/L MnCl₂，10mmol/LZnSO₄，CoCl₂，NiCl₂，Na₂MO₄，Na₂SeO₃，H₃BO₃各2mmol/L。

•ZYM培养基：在ZY培养基中加入2mL 50×5052，2mL 50×M，200μL 1M的MgSO₄，100μL 1000×微量元素。

实施例1：导入OLS&OAC表达质粒以获得CZ-1

设计合成SEQ ID NO: 1所示的OLS&OAC表达质粒p15A-Prha-OLS-OAC，将其通过大肠杆菌化学转化的方式转到作为底盘菌的大肠杆菌BW25113中以获得在其中表达OLS和OAC两者的工程化大肠杆菌菌株CZ-1，从而利用胞内本底水平的丙二酰辅酶A和己酰辅酶A为底物来合成OA。

实施例2：缺失fabH基因以获得CZ-2

在大肠杆菌BW25113中使其基因组中的fabH基因缺失，以减少胞内丙二酰辅酶A流向支路代谢，从而提高胞内丙二酰辅酶A的积累以进一步增加目标产物OA的合成。

设计合成SEQ ID NO: 6所示的H1-kana-H2，根据文献（Datsenko K A, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 usingPCR products[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97(12): 6640-6645.）提供的方法通过λ-Red同源重组将SEQ ID NO: 6整合至BW25113的基因组的fabH基因位置处以使fabH基因缺失，步骤如下：

1. 制备BW25113的感受态；

2. 导入质粒pKD46；

3. 将BW25113（pKD46）接种到3mL含有氨苄青霉素的LB，氨苄青霉素的浓度为100μg/L，30°C摇床过夜培养；

4. 取过夜培养的BW25113（pKD46）细胞悬液100μL，加入到10mL SOB培养基中，再加入浓度为1M的阿拉伯糖100μL和10μL浓度为100mg/L的氨苄青霉素。30°C摇床培养至OD600=0.4-0.6；

5. 4°C条件下，离心收集菌体，并用10mL预冷的超纯水重悬菌体，同样的方法再洗两次菌体，最后用50μL浓度为10%的甘油溶液重悬菌体；

6. 加入50ng的SEQ ID NO: 6核苷酸序列片段，混匀后将混合液加入电击杯；

7. 将电击杯放进电击仪，进行一次电击，电击条件为200Ω、25μF、2.5KV；

8. 加入1mL预冷的SOB培养基，混合液转入无菌的EP管中，30°C摇床培养1小时；

9. 将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板培养基上，30°C静置培养16-20小时；

10. 验证平板上长出的转化子。

在整合SEQ ID NO: 6后，根据文献（Datsenko K A, Wanner B L.，同上）提供的方法使KanR抗性基因缺失，步骤如下：

1. 制备整合有SEQ ID NO: 6的菌株的感受态；

2. 转化pCP20进入感受态，培养温度为30度；

3. 挑取单克隆至3mL SOB培养基，30度过夜培养；

4. 取100μL转接至10mL SOB，30度摇床培养3-4小时，OD600=0.4；

5. 4度条件下离心收集菌体，用冰浴的无菌水洗菌体两次；

6. 重悬于50μL-100μL无菌水中，用于电击转化；

7. 加入100ng的pCP20，电击转化（电击仪设置：1.8KV，5.5ms），30度复苏1小时；

8. 均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，30度培养2-3天；

9. 挑取单克隆在没有抗生素的LB平板上划线，42度培养过夜；

10. 挑20-30个克隆分别至卡那霉素抗性平板和无抗平板，在卡那霉素平板上不能生长而同时在无抗平板上生长的克隆为目标克隆，进行PCR验证。

在所得到的缺失fabH基因的BW25113中如实施例1所述导入OLS&OAC表达质粒P15A-Prha-OLS-OAC以获得在其中表达OLS和OAC两者、且缺失fabH的工程化大肠杆菌菌株CZ-2。其中缺失fabH基因的BW25113基因组序列中在原fabH基因位点处上下游的部分序列为SEQ ID NO: 7。

实施例3：缺失fadE基因以获得CZ-3

在大肠杆菌BW25113中使其基因组中的fadE基因缺失，以减少胞内己酰辅酶A流向支路代谢，从而提高胞内己酰辅酶A的积累以进一步增加目标产物OA的合成。

设计合成SEQ ID NO: 9所述的H3-kana-H4，如实施例2所述将SEQ ID NO: 9整合至BW25113的基因组的fadE基因位置处以使fadE基因缺失和在整合SEQ ID NO: 4后使KanR抗性基因缺失。

在所得到的缺失fadE基因的BW25113中如实施例1所述导入OLS&OAC表达质粒P15A-Prha-OLS-OAC以获得在其中表达OLS和OAC两者、且缺失fadE的工程化大肠杆菌菌株CZ-3。其中缺失fadE基因的BW25113基因组序列中在原fadE基因位点处上下游的部分序列为SEQ ID NO: 10。

实施例4：缺失fabH基因和fadE基因两者以获得CZ-4

在大肠杆菌BW25113中使其基因组中的fabH和fadE基因两者缺失，以减少胞内丙二酰辅酶A和己酰辅酶A两者流向支路代谢，从而提高胞内丙二酰辅酶A和己酰辅酶A两者的积累以进一步增加目标产物OA的合成。

如实施例2和3所述使BW25113的基因组中的fabH和fadE基因两者缺失。

在所得到的缺失fabH和fadE基因两者的BW25113中如实施例1所述导入OLS&OAC表达质粒P15A-Prha-OLS-OAC以获得在其中表达OLS和OAC两者、且缺失fabH和fadE基因两者的工程化大肠杆菌菌株CZ-4。

实施例5：导入fadD表达质粒以获得CZ-5

在工程化BW25113中过表达长链酯酰辅酶A合成酶（fadD）以将己酸转化为己酰辅酶A，从而增加胞内己酰辅酶A积累，以进一步增加目标产物OA的合成。

设计合成SEQ ID NO: 12所示的fadD（长链酯酰辅酶A合成酶）表达质粒pL-Prha-fadD，将其转化到CZ-4中以获得在其中表达OLS和OAC两者、且过表达fadD、且缺失fabH和fadE基因两者的工程化大肠杆菌菌株CZ-5，从而利用胞内本底水平的丙二酰辅酶A和进一步增加的己酰辅酶A为底物来合成OA。

实施例6：取消OAC以获得CZ-6

为了制造OL而非OA，以与实施例5相同的方式制造工程化菌株，除了其中OLS&OAC表达质粒p15A-Prha-OLS-OAC替换为SEQ ID NO: 15所示的OLS表达质粒p15A-Prha-OLS，以获得在其中表达OLS、且过表达fadD、且缺失fabH和fadE基因两者的工程化大肠杆菌菌株CZ-6来合成OL。

实施例7：工程化菌株CZ1-6的性能测试

实施例1-6中获得的工程化菌株CZ-1、CZ-2、CZ-3、CA-4、CZ-5和CZ-6按照下文所示程序一式三份进行测试。

发酵和样品制备：

1. 重组菌接种至3mL LB液体培养基中，37度，220转/分钟，过夜培养，约14小时，终OD600值达到2-3；

2. 在24深孔板中加入ZYM培养基，每个孔加入2mL；

3. 将步骤1中菌液转接至步骤2中的ZYM培养基，转接后OD600为0.01；

4. 待菌液OD600生长至0.2，加入诱导剂（添加量:鼠李糖0.2%）和前体己酸（1mM），从接种至发酵结束总共24小时；

5. 取1mL发酵液，加入3mL乙酸乙酯，震荡混匀10min，后离心收集上层有机相；

6. 重复操作5，两次离心获得有机相合并在一起约6mL转移至10mL试管中。

7. 利用真空浓缩仪将试管中的有机相全部蒸干，加入1mL甲醇重悬试管中所有样品。

8. 用0.22μM滤器过滤第7步的样品，然后转移至HPLC样品瓶中。

停止发酵时发酵液中的细胞浓度：

用上述HPLC检测方法分析发酵液萃取物中的OL产量。

用上述HPLC检测方法分析发酵液萃取物中的OA产量。

根据峰面积计算发酵液萃取物中的OA产量。结果显示，OA最高产量为224.64mg/L，远高于现有技术（参考文献：Tan Z, Clomburg J M, Gonzalez R. Synthetic pathwayfor the production of olivetolic acid in Escherichia coli[J]. ACS syntheticbiology, 2018, 7(8): 1886-1896.）实现的产量（仅为80mg/L）。

CZ-1、CZ-2、CZ-3、CZ-4和CZ-5发酵液样品中OA产量

另外，CZ-6的平均OL产量为116.02mg/L。CZ-6即为没有OAC表达的CZ-5。本文中用于产生OA的菌株的没有OAC表达的对应版本（即，产生OL而非OA）也获得相对于本文的OA生产对照菌株的没有OAC表达的对应版本（即，产生OL而非OA）的有益OL产量。

虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施方式，但是对本领域技术人员而言应该显而易见是这样的实施方式仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施方式的不同替代方案。

序列表

<110> 北京蓝晶微生物科技有限公司

深圳蓝晶生物科技有限公司

<120> 用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物

<130> CID210053

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6381

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agcggataac aatttcacac aggagagctc aaagagtgga acaatgcagg acgccgtccg 60

gtaacggtgt tgagcctcgg ttgtgtggtg attattgtcg ccgctaacat cgtcggcatc 120

ggcatggcga attaatcttt ctgcgaattg agatgacgcc actggctggg cgtcatcccg 180

gtttcccggg taaacaccac cgaaaaatag ttactatctt caaagccaca ttcggtcgaa 240

atatcactga ttaacaggcg gctatgctgg agaagatatt gcgcatgaca cactctgacc 300

tgtcgcagat attgattgat ggtcattcca gtctgctggc gaaattgctg acgcaaaacg 360

cgctcactgc acgatgcctc atcacaaaat ttatccagcg caaagggact tttcaggcta 420

gccgccagcc gggtaatcag cttatccagc aacgtttcgc tggatgttgg cggcaacgaa 480

tcactggtgt aacgatggcg attcagcaac atcaccaact gcccgaacag caactcagcc 540

atttcgttag caaacggcac atgctgacta ctttcatgct caagctgacc gataacctgc 600

cgcgcctgcg ccatccccat gctacctaag cgccagtgtg gttgccctgc gctggcgtta 660

aatcccggaa tcgccccctg ccagtcaaga ttcagcttca gacgctccgg gcaataaata 720

atattctgca aaaccagatc gttaacggaa gcgtaggagt gtttatcgtc agcatgaatg 780

taaaagagat cgccacgggt aatgcgataa gggcgatcgt tgagtacatg caggccatta 840

ccgcgccaga caatcaccag ctcacaaaaa tcatgtgtat gttcagcaaa gacatcttgc 900

ggataacggt cagccacagc gactgcctgc tggtcgctgg caaaaaaatc atctttgaga 960

agttttaact gatgcgccac cgtggctacc tcggccagag aacgaagttg attattcgca 1020

atatggcgta caaatacgtt gagaagattc gcgttattgc agaaagccat cccgtccctg 1080

gcgaatatca cgcggtgacc agttaaactc tcggcgaaaa agcgtcgaaa agtggttact 1140

gtcgctgaat ccacagcgat aggcgatgtc agtaacgctg gcctcgctgt ggcgtagcag 1200

atgtcgggct ttcatcagtc gcaggcggtt caggtatcgc tgaggcgtca gtcccgtttg 1260

ctgcttaagc tgccgatgta gcgtacgcag tgaaagagaa aattgatccg ccacggcatc 1320

ccaattcacc tcatcggcaa aatggtcctc cagccaggcc agaagcaagt tgagacgtga 1380

tgcgctgttt tccaggttct cctgcaaact gcttttacgc agcaagagca gtaattgcat 1440

aaacaagatc tcgcgactgg cggtcgaggg taaatcattt tccccttcct gctgttccat 1500

ctgtgcaacc agctgtcgca cctgctgcaa tacgctgtgg ttaacgcgcc agtgagacgg 1560

atactgccca tccagctctt gtggcagcaa ctgattcagc ccggcgagaa actgaaatcg 1620

atccggcgag cgatacagca cattggtcag acacagatta tcggtatgtt catacagatg 1680

ccgatcatga tcgcgtacga aacagaccgt gccaccggtg atggtatagg gctgcccatt 1740

aaacacatga atacccgtgc catgttcgac aatcacaatt tcatgaaaat catgatgatg 1800

ttcaggaaaa tccgcctgcg ggagccgggg ttctatcgcc acggacgcgt taccagacgg 1860

aaaaaaatcc acactatgta atacggtcat actggcctcc tgatgtcgtc aacacggcga 1920

aatagtaatc acgaggtcag gttcttacct taaattttcg acggaaaacc acgtaaaaaa 1980

cgtcgatttt tcaagataca gcgtgaattt tcaggaaatg cggtgagcat cacatcacca 2040

caattcagca aattgtgaac atcatcacgt tcatctttcc ctggttgcca atggcccatt 2100

ttcctgtcag taacgagaag gtcgcgaatt caggcgcttt ttagactggt cgtaatgaaa 2160

ttcaactagt gctctgcagg agctgtcacc ggatgtgctt tccggtctga tgagtccgtg 2220

aggacgaaac agcctctaca aataattttg tttaagagtt actagagagg aggaattaac 2280

catgaaccat ctgcgtgcgg aaggccctgc gagcgtttta gcgattggca ccgcgaatcc 2340

ggaaaacatt ctgctgcagg atgaatttcc ggattattat tttcgcgtga ccaaaagcga 2400

acatatgacc cagctgaaag aaaaatttcg caaaatttgc gacaagagca tgattcgcaa 2460

acgcaactgc tttctgaacg aagaacatct gaaacagaac ccgcgcctgg tggaacatga 2520

aatgcagacc ctggatgcgc gccaggatat gctggtggtg gaagtgccga aactgggcaa 2580

agatgcgtgc gcgaaagcga ttaaagaatg gggccagccg aaaagcaaaa ttacccatct 2640

gatttttacc agcgcgagca ccaccgatat gccgggcgca gattatcatt gcgcgaaact 2700

gctgggcctg agcccgagcg ttaaacgcgt gatgatgtat cagctgggct gctatggcgg 2760

cggcaccgtt ttacgtattg cgaaagatat tgcggaaaac aacaaaggcg cgcgcgtgct 2820

ggcggtgtgt tgtgatatta tggcgtgcct gtttcgcggc ccgagcgaaa gcgatctgga 2880

actgttagtg ggccaggcga tttttggcga tggcgcggcg gcggtgattg tgggtgcaga 2940

acctgatgaa agcgtgggcg aacgccctat ttttgaactg gtgagcaccg gccagaccat 3000

tctgccgaat agcgaaggca ccattggcgg ccatattcgc gaagcgggcc tgatttttga 3060

tctgcataaa gatgtgccga tgctgattag caacaacatt gaaaaatgcc tgattgaggc 3120

gtttaccccg attggcatta gcgattggaa cagcatcttt tggattaccc atccgggcgg 3180

caaagcgatt ctggataaag tggaagaaaa actgcatctg aaaagcgata aattcgtgga 3240

tagccgccat gtgctgagcg aacatggcaa catgagcagc agcaccgtgc tgtttgtgat 3300

ggatgaactg cgcaaacgca gcctggaaga aggcaaaagc accaccggcg atggctttga 3360

atggggcgtg ctgtttggct ttggcccggg cttaaccgtg gaacgcgttg tggttcgtag 3420

cgtgcctatt aaatattaat actagagaaa gaggagaaat actagatggc ggtgaaacat 3480

ctgattgtgc tgaaatttaa agacgagatc accgaggcgc agaaagagga atttttcaaa 3540

acctatgtga acctggtgaa catcatcccg gcgatgaaag atgtgtattg gggcaaagat 3600

gtgacccaga aaaacaaaga agaaggctat acccatattg tggaagtgac ctttgaaagc 3660

gtggaaacca ttcaggatta tattattcac ccggcgcatg tgggctttgg cgatgtgtat 3720

cgcagctttt gggaaaaact gctgattttt gattacaccc cgcgcaaata actcgtcgtg 3780

actgggaaaa ccctggcgac tagtcttgga ctcctgttga tagatccagt aatgacctca 3840

gaactccatc tggatttgtt cagaacgctc ggttgccgcc gggcgttttt tattggtgag 3900

aatccagggg tccccaataa ttacgattta aattggcgaa aatgagacgt gggtctgacg 3960

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 4020

tcacctagat ccttttggtt catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg ataagtttat 4080

caccaccgac tatttgcaac agcgccggtg atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc 4140

ggtggagtgc aatgtcgtgc aatacgaatg gcgaaaagcc gagctcatcg gtcagcttct 4200

caaccttggg gttacccccg gcggtgtgct gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg 4260

gcccctcgaa gatgggccac ttggactgat cgaggccctg cgtgctgcgc tgggtccggg 4320

agggacgctc gtcatgccct cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg atcctgccac 4380

gtcgcccgtt acaccggacc ttggagttgt ctctgacaca ttctggcgcc tgccaaatgt 4440

aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat 4500

ctctgatcca ttgcccctgc cacctcactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga 4560

actcgatggg caggtacttc tcctcggcgt gggacacgat gccaacacga cgctgcatct 4620

tgccgagttg atggcaaagg ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca ttcttcagga 4680

tggcaagttg gtacgcgtcg attatctcga gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt 4740

ggcggacagg tggctcaagg agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt 4800

tgctcggttg atccgctccc gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga 4860

tccgttgatc ttcctgcatc cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca 4920

gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac gagatgacgt tggaggggca aggtcgcgct 4980

gattgctggg gcaacacgtg gagcggatcg gtttgacttt tgtccttttc cgctgcataa 5040

ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt tcggtatatc catccttttt cgcacgatat 5100

acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg 5160

ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg agcgggtgtt ccttcttcac tgtcccttat 5220

tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag gctggccgta ggccggccgc 5280

gatgcaggtg gctgctgaac ccccagccgg aactgacccc acaaggccct agcggagtgt 5340

atactggctt actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg aagtgcttca tgtggcagga 5400

gaaaaaaggc tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat tccgcttcct 5460

cgctcactga ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg gcttacgaac 5520

ggggcggaga tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg agagggccgc 5580

ggcaaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc 5640

aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc ccctggcggc 5700

tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg 5760

ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct 5820

ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 5880

tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg 5940

atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt 6000

ttggtgactg cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa 6060

ccttcgaaaa accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag attacgcgca 6120

gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta ttaactacat ggctctgctg tagtgagtgg 6180

gttgcgctcc ggcagcggtc ctgatccccc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 6240

tgatcttttc tacggcgcgc ccagctgtct agggcggcgg atttgtccta ctcaggagag 6300

cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt 6360

ttatttgatg cctttaatta a 6381

<210> 2

<211> 1158

<212> DNA

<213> Cannabis sativa

<400> 2

atgaaccatc tgcgtgcgga aggccctgcg agcgttttag cgattggcac cgcgaatccg 60

gaaaacattc tgctgcagga tgaatttccg gattattatt ttcgcgtgac caaaagcgaa 120

catatgaccc agctgaaaga aaaatttcgc aaaatttgcg acaagagcat gattcgcaaa 180

cgcaactgct ttctgaacga agaacatctg aaacagaacc cgcgcctggt ggaacatgaa 240

atgcagaccc tggatgcgcg ccaggatatg ctggtggtgg aagtgccgaa actgggcaaa 300

gatgcgtgcg cgaaagcgat taaagaatgg ggccagccga aaagcaaaat tacccatctg 360

atttttacca gcgcgagcac caccgatatg ccgggcgcag attatcattg cgcgaaactg 420

ctgggcctga gcccgagcgt taaacgcgtg atgatgtatc agctgggctg ctatggcggc 480

ggcaccgttt tacgtattgc gaaagatatt gcggaaaaca acaaaggcgc gcgcgtgctg 540

gcggtgtgtt gtgatattat ggcgtgcctg tttcgcggcc cgagcgaaag cgatctggaa 600

ctgttagtgg gccaggcgat ttttggcgat ggcgcggcgg cggtgattgt gggtgcagaa 660

cctgatgaaa gcgtgggcga acgccctatt tttgaactgg tgagcaccgg ccagaccatt 720

ctgccgaata gcgaaggcac cattggcggc catattcgcg aagcgggcct gatttttgat 780

ctgcataaag atgtgccgat gctgattagc aacaacattg aaaaatgcct gattgaggcg 840

tttaccccga ttggcattag cgattggaac agcatctttt ggattaccca tccgggcggc 900

aaagcgattc tggataaagt ggaagaaaaa ctgcatctga aaagcgataa attcgtggat 960

agccgccatg tgctgagcga acatggcaac atgagcagca gcaccgtgct gtttgtgatg 1020

gatgaactgc gcaaacgcag cctggaagaa ggcaaaagca ccaccggcga tggctttgaa 1080

tggggcgtgc tgtttggctt tggcccgggc ttaaccgtgg aacgcgttgt ggttcgtagc 1140

gtgcctatta aatattaa 1158

<210> 3

<211> 385

<212> PRT

<213> Cannabis sativa

<400> 3

Met Asn His Leu Arg Ala Glu Gly Pro Ala Ser Val Leu Ala Ile Gly

1 5 10 15

Thr Ala Asn Pro Glu Asn Ile Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Asp Tyr

20 25 30

Tyr Phe Arg Val Thr Lys Ser Glu His Met Thr Gln Leu Lys Glu Lys

35 40 45

Phe Arg Lys Ile Cys Asp Lys Ser Met Ile Arg Lys Arg Asn Cys Phe

50 55 60

Leu Asn Glu Glu His Leu Lys Gln Asn Pro Arg Leu Val Glu His Glu

65 70 75 80

Met Gln Thr Leu Asp Ala Arg Gln Asp Met Leu Val Val Glu Val Pro

85 90 95

Lys Leu Gly Lys Asp Ala Cys Ala Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile Phe Thr Ser Ala Ser Thr Thr

115 120 125

Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr His Cys Ala Lys Leu Leu Gly Leu Ser

130 135 140

Pro Ser Val Lys Arg Val Met Met Tyr Gln Leu Gly Cys Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Gly Thr Val Leu Arg Ile Ala Lys Asp Ile Ala Glu Asn Asn Lys Gly

165 170 175

Ala Arg Val Leu Ala Val Cys Cys Asp Ile Met Ala Cys Leu Phe Arg

180 185 190

Gly Pro Ser Glu Ser Asp Leu Glu Leu Leu Val Gly Gln Ala Ile Phe

195 200 205

Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Ala Glu Pro Asp Glu Ser

210 215 220

Val Gly Glu Arg Pro Ile Phe Glu Leu Val Ser Thr Gly Gln Thr Ile

225 230 235 240

Leu Pro Asn Ser Glu Gly Thr Ile Gly Gly His Ile Arg Glu Ala Gly

245 250 255

Leu Ile Phe Asp Leu His Lys Asp Val Pro Met Leu Ile Ser Asn Asn

260 265 270

Ile Glu Lys Cys Leu Ile Glu Ala Phe Thr Pro Ile Gly Ile Ser Asp

275 280 285

Trp Asn Ser Ile Phe Trp Ile Thr His Pro Gly Gly Lys Ala Ile Leu

290 295 300

Asp Lys Val Glu Glu Lys Leu His Leu Lys Ser Asp Lys Phe Val Asp

305 310 315 320

Ser Arg His Val Leu Ser Glu His Gly Asn Met Ser Ser Ser Thr Val

325 330 335

Leu Phe Val Met Asp Glu Leu Arg Lys Arg Ser Leu Glu Glu Gly Lys

340 345 350

Ser Thr Thr Gly Asp Gly Phe Glu Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly

355 360 365

Pro Gly Leu Thr Val Glu Arg Val Val Val Arg Ser Val Pro Ile Lys

370 375 380

Tyr

385

<210> 4

<211> 306

<212> DNA

<213> Cannabis sativa

<400> 4

atggcggtga aacatctgat tgtgctgaaa tttaaagacg agatcaccga ggcgcagaaa 60

gaggaatttt tcaaaaccta tgtgaacctg gtgaacatca tcccggcgat gaaagatgtg 120

tattggggca aagatgtgac ccagaaaaac aaagaagaag gctataccca tattgtggaa 180

gtgacctttg aaagcgtgga aaccattcag gattatatta ttcacccggc gcatgtgggc 240

tttggcgatg tgtatcgcag cttttgggaa aaactgctga tttttgatta caccccgcgc 300

aaataa 306

<210> 5

<211> 101

<212> PRT

<213> Cannabis sativa

<400> 5

Met Ala Val Lys His Leu Ile Val Leu Lys Phe Lys Asp Glu Ile Thr

1 5 10 15

Glu Ala Gln Lys Glu Glu Phe Phe Lys Thr Tyr Val Asn Leu Val Asn

20 25 30

Ile Ile Pro Ala Met Lys Asp Val Tyr Trp Gly Lys Asp Val Thr Gln

35 40 45

Lys Asn Lys Glu Glu Gly Tyr Thr His Ile Val Glu Val Thr Phe Glu

50 55 60

Ser Val Glu Thr Ile Gln Asp Tyr Ile Ile His Pro Ala His Val Gly

65 70 75 80

Phe Gly Asp Val Tyr Arg Ser Phe Trp Glu Lys Leu Leu Ile Phe Asp

85 90 95

Tyr Thr Pro Arg Lys

100

<210> 6

<211> 2353

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccttctatca attatatcgg ctatcttgaa gccaatgagt tgttaactgg caagacagat 60

gtgctggttt gtgacggctt tacaggaaat gtcacattaa agacgatgga aggtgttgtc 120

aggatgttcc tttctctgct gaaatctcag ggtgaaggga aaaaacggtc gtggtggcta 180

ctgttattaa agcgttggct acaaaagagc ctgacgaggc gattcagtca cctcaacccc 240

gaccagtata acggcgcctg tctgttagga ttgcgcggca cggtgataaa aagtcatggt 300

gcagccaatc agcgagcttt tgcggtcgcg attgaacagg cagtgcaggc ggtgcagcga 360

caagttcctc agcgaattgc cgctcgcctg gaatctgtat acccagctgg ttttgagctg 420

ctggacggtg gcaaaagcgg aactctgcgg tagcaggacg ctgccagcga actcgcagtt 480

tgcaagtgac ggtatataac cgaaaagtga ctgagcgtca tgattccggg gatccgtcga 540

cctgcagttc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcggatga atgtcagcta 600

ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg 660

gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc 720

agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt 780

gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc 840

gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 900

gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 960

gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 1020

tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 1080

agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 1140

ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 1200

tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 1260

acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 1320

ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat 1380

gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 1440

ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 1500

tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 1560

ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 1620

ccttcttgac gagttcttct gagaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcgaag 1680

cagctccagc ctacatccgc gctggttcgt ttctaggata aggattaaaa catgacgcaa 1740

tttgcatttg tgttccctgg acagggttct caaaccgttg gaatgctggc tgatatggcg 1800

gcgagctatc caattgtcga agaaacgttt gctgaagctt ctgcggcgct gggctacgac 1860

ctgtgggcgc tgacccagca ggggccagct gaagaactga ataaaacctg gcaaactcag 1920

cctgcgctgt tgactgcatc tgttgcgctg tatcgcgtat ggcagcagca gggcggtaaa 1980

gcaccggcaa tgatggccgg tcacagcctg ggggaatact ccgcgctggt ttgcgctggt 2040

gtgattgatt tcgctgatgc ggtgcgtctg gttgagatgc gcggcaagtt catgcaagaa 2100

gccgtaccgg aaggcacggg cgctatggcg gcaatcatcg gtctggatga tgcgtctatt 2160

gcgaaagcgt gtgaagaagc tgcagaaggt caggtcgttt ctccggtaaa ctttaactct 2220

ccgggacagg tggttattgc cggtcataaa gaagcggttg agcgtgctgg cgctgcctgt 2280

aaagcggcgg gcgcaaaacg cgcgctgccg ttaccagtga gcgtaccgtc tcactgtgcg 2340

ctgatgaaac cag 2353

<210> 7

<211> 1261

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccttctatca attatatcgg ctatcttgaa gccaatgagt tgttaactgg caagacagat 60

gtgctggttt gtgacggctt tacaggaaat gtcacattaa agacgatgga aggtgttgtc 120

aggatgttcc tttctctgct gaaatctcag ggtgaaggga aaaaacggtc gtggtggcta 180

ctgttattaa agcgttggct acaaaagagc ctgacgaggc gattcagtca cctcaacccc 240

gaccagtata acggcgcctg tctgttagga ttgcgcggca cggtgataaa aagtcatggt 300

gcagccaatc agcgagcttt tgcggtcgcg attgaacagg cagtgcaggc ggtgcagcga 360

caagttcctc agcgaattgc cgctcgcctg gaatctgtat acccagctgg ttttgagctg 420

ctggacggtg gcaaaagcgg aactctgcgg tagcaggacg ctgccagcga actcgcagtt 480

tgcaagtgac ggtatataac cgaaaagtga ctgagcgtca tgattccggg gatccgtcga 540

cctgcagttc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcgaagca gctccagcct 600

acatccgcgc tggttcgttt ctaggataag gattaaaaca tgacgcaatt tgcatttgtg 660

ttccctggac agggttctca aaccgttgga atgctggctg atatggcggc gagctatcca 720

attgtcgaag aaacgtttgc tgaagcttct gcggcgctgg gctacgacct gtgggcgctg 780

acccagcagg ggccagctga agaactgaat aaaacctggc aaactcagcc tgcgctgttg 840

actgcatctg ttgcgctgta tcgcgtatgg cagcagcagg gcggtaaagc accggcaatg 900

atggccggtc acagcctggg ggaatactcc gcgctggttt gcgctggtgt gattgatttc 960

gctgatgcgg tgcgtctggt tgagatgcgc ggcaagttca tgcaagaagc cgtaccggaa 1020

ggcacgggcg ctatggcggc aatcatcggt ctggatgatg cgtctattgc gaaagcgtgt 1080

gaagaagctg cagaaggtca ggtcgtttct ccggtaaact ttaactctcc gggacaggtg 1140

gttattgccg gtcataaaga agcggttgag cgtgctggcg ctgcctgtaa agcggcgggc 1200

gcaaaacgcg cgctgccgtt accagtgagc gtaccgtctc actgtgcgct gatgaaacca 1260

g 1261

<210> 8

<211> 954

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 8

atgtatacga agattattgg tactggcagc tatctgcccg aacaagtgcg gacaaacgcc 60

gatttggaaa aaatggtgga cacctctgac gagtggattg tcactcgtac cggtatccgc 120

gaacgccaca ttgccgcgcc aaacgaaacc gtttcaacca tgggctttga agcggcgaca 180

cgcgcaattg agatggcggg cattgagaaa gaccagattg gcctgatcgt tgtggcaacg 240

acttctgcta cgcacgcttt cccgagcgca gcttgtcaga ttcaaagcat gttgggcatt 300

aaaggttgcc cggcatttga cgttgcagca gcctgcgcag gtttcaccta tgcattaagc 360

gtagccgatc aatacgtgaa atctggggcg gtgaagtatg ctctggtcgt cggttccgat 420

gtactggcgc gcacctgcga tccaaccgat cgtgggacta ttattatttt tggcgatggc 480

gcgggcgctg cggtgctggc tgcctctgaa gagccgggaa tcatttccac ccatctgcat 540

gccgacggta gttatggtga attgctgacg ctgccaaacg ccgaccgcgt gaatccagag 600

aattcaattc atctgacgat ggcgggcaac gaagtcttca aggttgcggt aacggaactg 660

gcgcacatcg ttgatgagac gctggcggcg aataatcttg accgttctca actggactgg 720

ctggttccgc atcaggctaa cctgcgtatt atcagtgcaa cggcgaaaaa actcggtatg 780

tctatggata atgtcgtggt gacgctggat cgccacggta atacctctgc ggcctctgtc 840

ccgtgcgcgc tggatgaagc tgtacgcgac gggcgcatta agccggggca gttggttctg 900

cttgaagcct ttggcggtgg attcacctgg ggctccgcgc tggttcgttt ctag 954

<210> 9

<211> 2161

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tcattaccga cgcaggaaat atgactaacg tcagaaatag caatcgccgg gtagcccgga 60

cggttttcac ggtagcgacc ggtcaactct tcggcaaagt gcatagcgtc gcaatgggaa 120

ccgccgttgc cgcaggaaag cactttgcca ccggctttaa agctgtctgc taacaggacc 180

gccgcgcgct gaatggcgtg aatattggcg tcatctttta aaaagttagc cagcgtttcc 240

gccgcttcgt tcagttcgtt acgaataaga tcctggtaca tgaggatatc cttcagcata 300

aatgtaatag acaaaatgca gtgtaccgga taccgccaaa agcgagaagt acgggcaggt 360

gctatgacca ggactttttg acctgaagtg cggataaaaa cagcaacaat gtgagctttg 420

ttgtaattat attgtaaaca tattgctaaa tgtttttaca tccactacaa ccatatcatc 480

acaagtggtc agacctccta caagtaaggg gcttttcgtt gaagttccta ttctctagaa 540

agtataggaa cttcggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag 600

cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 660

tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 720

gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 780

aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 840

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 900

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 960

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 1020

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 1080

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 1140

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 1200

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 1260

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 1320

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 1380

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 1440

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 1500

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 1560

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagaagttcc 1620

tattctctag aaagtatagg aacttcatga ataacggagc cgaaaggctc cgtttcttta 1680

tccgctaatt atttaaaatt aaagccatcc ggatggtttt ccaggctgcc ggtcaacgcc 1740

gcgaacaaca ccgttttacc atcaatcgaa agcgcatcgt tcacattcag ccaggtgagt 1800

ttctcttgcg acgttttctc atcaatagtc gagaacagcc ccgtcatctg attagatttc 1860

tcggaccaca tcacagcgat acgttgcgag ccacagtcat gcggtttgca cgcgctcatc 1920

acctgatacg tctcatctcc caacgttacg gtttgtgcgg gagtataagt accgcctttc 1980

atcacccagg caggcagctt atgcccttgt accatctgat taaatgcagc tttggtggtt 2040

tcgccctttg caaggctgct aatggttaaa tcatcctgcg ccattgcact ggtggcgatg 2100

accagagcgg cgactgtcgt tattgcctta aacatcattc ctcccgagct tatcctgccc 2160

a 2161

<210> 10

<211> 1015

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caaagtgcat agcgtcgcaa tgggaaccgc cgttgccgca ggaaagcact ttgccaccgg 60

ctttaaagct gtctgctaac aggaccgccg cgcgctgaat ggcgtgaata ttggcgtcat 120

cttttaaaaa gttagccagc gtttccgccg cttcgttcag ttcgttacga ataagatcct 180

ggtacatgag gatatccttc agcataaatg taatagacaa aatgcagtgt accggatacc 240

gccaaaagcg agaagtacgg gcaggtgcta tgaccaggac tttttgacct gaagtgcgga 300

taaaaacagc aacaatgtga gctttgttgt aattatattg taaacatatt gctaaatgtt 360

tttacatcca ctacaaccat atcatcacaa gtggtcagac ctcctacaag taaggggctt 420

ttcgttaccg tttaaataat gccaattatt taaagttagc ggccgcgaag ttcctattct 480

ctagaaagta taggaacttc atgaataacg gagccgaaag gctccgtttc tttatccgct 540

aattatttaa aattaaagcc atccggatgg ttttccaggc tgccggtcaa cgccgcgaac 600

aacaccgttt taccatcaat cgaaagcgca tcgttcacat tcagccaggt gagtttctct 660

tgcgacgttt tctcatcaat agtcgagaac agccccgtca tctgattaga tttctcggac 720

cacatcacag cgatacgttg cgagccacag tcatgcggtt tgcacgcgct catcacctga 780

tacgtctcat ctcccaacgt tacggtttgt gcgggagtat aagtaccgcc tttcatcacc 840

caggcaggca gcttatgccc ttgtaccatc tgattaaatg cagctttggt ggtttcgccc 900

tttgcaaggc tgctaatggt taaatcatcc tgcgccattg cactggtggc gatgaccaga 960

gcggcgactg tcgttattgc cttaaacatc attcctcccg agcttatcct gccca 1015

<210> 11

<211> 2445

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 11

atgatgattt tgagtattct cgctacggtt gtcctgctcg gcgcgttgtt ctatcaccgc 60

gtgagcttat ttatcagcag tctgattttg ctcgcctgga cagccgccct cggcgttgct 120

ggtctgtggt cggcgtgggt actggtgcct ctggccatta tcctcgtgcc atttaacttt 180

gcgcctatgc gtaagtcgat gatttccgcg ccggtatttc gcggtttccg taaggtgatg 240

ccgccgatgt cgcgcactga gaaagaagcg attgatgcgg gcaccacctg gtgggagggc 300

gacttgttcc agggcaagcc ggactggaaa aagctgcata actatccgca gccgcgcctg 360

accgccgaag agcaagcgtt tctcgacggc ccggtagaag aagcctgccg gatggcgaat 420

gatttccaga tcacccatga gctggcggat ctgccgccgg agttgtgggc gtaccttaaa 480

gagcatcgtt tcttcgcgat gatcatcaaa aaagagtacg gcgggctgga gttctcggct 540

tatgcccagt ctcgcgtgct gcaaaaactc tccggcgtga gcgggatcct ggcgattacc 600

gtcggcgtgc caaactcatt aggcccgggc gaactgttgc aacattacgg cactgacgag 660

cagaaagatc actatctgcc gcgtctggcg cgtggtcagg agatcccctg ctttgcactg 720

accagcccgg aagcgggttc cgatgcgggc gcgattccgg acaccgggat tgtctgcatg 780

ggcgaatggc agggccagca ggtgctgggg atgcgtctga cctggaacaa acgctacatt 840

acgctggcac cgattgcgac cgtgcttggg ctggcgttta aactctccga cccggaaaaa 900

ttactcggcg gtgcagaaga tttaggcatt acctgtgcgc tgatcccaac caccacgccg 960

ggcgtggaaa ttggtcgtcg ccacttcccg ctgaacgtac cgttccagaa cggaccgacg 1020

cgcggtaaag atgtcttcgt gccgatcgat tacatcatcg gcgggccgaa aatggccggg 1080

caaggctggc ggatgctggt ggagtgcctc tcggtaggcc gcggcatcac cctgccttcc 1140

aactcaaccg gcggcgtgaa atcggtagcg ctggcaaccg gcgcgtatgc tcacattcgc 1200

cgtcagttca aaatctctat tggtaagatg gaagggattg aagagccgct ggcgcgtatt 1260

gccggtaatg cctacgtgat ggatgctgcg gcatcgctga ttacctacgg cattatgctc 1320

ggcgaaaaac ctgccgtgct gtcggctatc gttaagtatc actgtaccca ccgcgggcag 1380

cagtcgatta ttgatgcgat ggatattacc ggcggtaaag gcattatgct cgggcaaagc 1440

aacttcctgg cgcgtgctta ccagggcgca ccgattgcca tcaccgttga aggggctaac 1500

attctgaccc gcagcatgat gatcttcgga caaggagcga ttcgttgcca tccgtacgtg 1560

ctggaagaga tggaagcggc gaagaacaat gacgtcaacg cgttcgataa actgttgttc 1620

aaacatatcg gtcacgtcgg tagcaacaaa gttcgcagct tctggctggg cctgacgcgc 1680

ggtttaacca gcagcacgcc aaccggcgat gccactaaac gctactatca gcacctgaac 1740

cgcctgagcg ccaacctcgc cctgctttct gatgtctcga tggcagtgct gggcggcagc 1800

ctgaaacgtc gcgagcgcat ctcggcccgt ctgggggata ttttaagcca gctctacctc 1860

gcctctgccg tgctgaagcg ttatgacgac gaaggccgta atgaagccga cctgccgctg 1920

gtgcactggg gcgtacaaga tgcgctgtat caggctgaac aggcgatgga tgatttactg 1980

caaaacttcc cgaaccgcgt ggttgccggg ctgctgaatg tggtgatctt cccgaccgga 2040

cgtcattatc tggcaccttc tgacaagctg gatcataaag tggcgaagat tttacaagtg 2100

ccgaacgcca cccgttcccg cattggtcgc ggtcagtacc tgacgccgag cgagcataat 2160

ccggttggct tgctggaaga ggcgctggtg gatgtgattg ccgccgaccc aattcatcag 2220

cggatctgta aagagctggg taaaaacctg ccgtttaccc gtctggatga actggcgcac 2280

aacgcgctgg tgaaggggct gattgataaa gatgaagccg ctattctggt gaaagctgaa 2340

gaaagccgtc tgcgcagtat taacgttgat gactttgatc cggaagagct ggcgacgaag 2400

ccggtaaagt tgccggagaa agtgcggaaa gttgaagccg cgtaa 2445

<210> 12

<211> 6563

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcgtcgacct aattcccatg tcagccgtta agtgttcctg tgtcactcaa aattgctttg 60

agaggctcta agggcttctc agtgcgttac atccctggct tgttgtccac aaccgttaaa 120

ccttaaaagc tttaaaagcc ttatatattc ttttttttct tataaaactt aaaaccttag 180

aggctattta agttgctgat ttatattaat tttattgttc aaacatgaga gcttagtacg 240

tgaaacatga gagcttagta cgttagccat gagagcttag tacgttagcc atgagggttt 300

agttcgttaa acatgagagc ttagtacgtt aaacatgaga gcttagtacg tgaaacatga 360

gagcttagta cgtactatca acaggttgaa ctgcggatct tgatgagtgg atagtacgtt 420

gctaaaacat gagataaaaa ttgactctca tgttattggc gttaagatat acagaatgat 480

gaggtttttt tatgagactc aaggtcatga tggacgtgaa caaaaaaacg aaaattcgcc 540

accgaaacga gctaaatcac accctggctc aacttccttt gcccgcaaag cgagtgatgt 600

atatggcgct tgctcccatt gatagcaagg aacctcttga acgagggcga gttttcaaaa 660

ttagggctga agaccttgca gcgctcgcca aaatcacccc atcgcttgct tatcgacaat 720

taaaagaggg tggtaagtta cttggtgcca gcaaaatttc gctaagaggg gatgatatca 780

ttgcttcagc taaagagctt aacctgctct ttactgctaa agactcccct gaagagttag 840

atcttaacat tattgagtgg atagcttatt caaatgatga aggatacttg tctttaaaat 900

tcaccagaac catagaacca tatatctcta gccttattgg gaaaaaaaat aaattcacaa 960

cgcaattgtt aacggcaagc ttacgcttaa gtagccagta ttcatcttct ctttatcaac 1020

ttatcaggaa gcattactct aattttaaga agaaaaatta ttttattatt tccgttgatg 1080

agttaaagga agagttaata gcttatactt ttgataaaga tggaagtatt gagtacaaat 1140

accctgactt tcctattttt aaaagggatg tattaaataa agccattgct gaaattaaaa 1200

agaaaacaga aatatcgttt gttggcttta ctgttcatga aaaagaagga agaaaaatta 1260

gtaagctgaa gttcgaattt gtcgttgatg aagatgaatt ttctggcgat aaagatgatg 1320

aagctttttt tatgaattta tctgaagcta atgcagcttt tctcaaggta tttgatgaaa 1380

ccgtacctcc caaaaaagct aaggggtgat atatggctaa aatttacgat ttccctcaag 1440

gagccgaacg ccgcaggatg caccgcaaaa tccagtggaa caacgctgta aaattatcta 1500

aaaatggctg gagtaagcca gaggttaaac gctggtcttt tttagcattc atctcaactg 1560

gctgcggccg cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 1620

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gggaagcggt 1680

gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga ggtagttggc gtcatcgagc gccatctcga 1740

accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca 1800

cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc 1860

tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc 1920

tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg tggcgttatc cagctaagcg 1980

cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc 2040

cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt 2100

ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc 2160

gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa 2220

tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa 2280

ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact 2340

tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca 2400

gttggaagaa tttgtccact acgtgaaagg cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg 2460

tctaacaatt cgttcaagcc gaggggccgc aagatccggc cacgatgacc cggtcgtcgg 2520

ttcagggcag ggtcgttaaa tagccgctta tgtctattgc tggtttaccg gtttattgac 2580

taccggaagc agagcggata acaatttcac acaggagagc tcaaagagtg gaacaatgca 2640

ggacgccgtc cggtaacggt gttgagcctc ggttgtgtgg tgattattgt cgccgctaac 2700

atcgtcggca tcggcatggc gaattaatct ttctgcgaat tgagatgacg ccactggctg 2760

ggcgtcatcc cggtttcccg ggtaaacacc accgaaaaat agttactatc ttcaaagcca 2820

cattcggtcg aaatatcact gattaacagg cggctatgct ggagaagata ttgcgcatga 2880

cacactctga cctgtcgcag atattgattg atggtcattc cagtctgctg gcgaaattgc 2940

tgacgcaaaa cgcgctcact gcacgatgcc tcatcacaaa atttatccag cgcaaaggga 3000

cttttcaggc tagccgccag ccgggtaatc agcttatcca gcaacgtttc gctggatgtt 3060

ggcggcaacg aatcactggt gtaacgatgg cgattcagca acatcaccaa ctgcccgaac 3120

agcaactcag ccatttcgtt agcaaacggc acatgctgac tactttcatg ctcaagctga 3180

ccgataacct gccgcgcctg cgccatcccc atgctaccta agcgccagtg tggttgccct 3240

gcgctggcgt taaatcccgg aatcgccccc tgccagtcaa gattcagctt cagacgctcc 3300

gggcaataaa taatattctg caaaaccaga tcgttaacgg aagcgtagga gtgtttatcg 3360

tcagcatgaa tgtaaaagag atcgccacgg gtaatgcgat aagggcgatc gttgagtaca 3420

tgcaggccat taccgcgcca gacaatcacc agctcacaaa aatcatgtgt atgttcagca 3480

aagacatctt gcggataacg gtcagccaca gcgactgcct gctggtcgct ggcaaaaaaa 3540

tcatctttga gaagttttaa ctgatgcgcc accgtggcta cctcggccag agaacgaagt 3600

tgattattcg caatatggcg tacaaatacg ttgagaagat tcgcgttatt gcagaaagcc 3660

atcccgtccc tggcgaatat cacgcggtga ccagttaaac tctcggcgaa aaagcgtcga 3720

aaagtggtta ctgtcgctga atccacagcg ataggcgatg tcagtaacgc tggcctcgct 3780

gtggcgtagc agatgtcggg ctttcatcag tcgcaggcgg ttcaggtatc gctgaggcgt 3840

cagtcccgtt tgctgcttaa gctgccgatg tagcgtacgc agtgaaagag aaaattgatc 3900

cgccacggca tcccaattca cctcatcggc aaaatggtcc tccagccagg ccagaagcaa 3960

gttgagacgt gatgcgctgt tttccaggtt ctcctgcaaa ctgcttttac gcagcaagag 4020

cagtaattgc ataaacaaga tctcgcgact ggcggtcgag ggtaaatcat tttccccttc 4080

ctgctgttcc atctgtgcaa ccagctgtcg cacctgctgc aatacgctgt ggttaacgcg 4140

ccagtgagac ggatactgcc catccagctc ttgtggcagc aactgattca gcccggcgag 4200

aaactgaaat cgatccggcg agcgatacag cacattggtc agacacagat tatcggtatg 4260

ttcatacaga tgccgatcat gatcgcgtac gaaacagacc gtgccaccgg tgatggtata 4320

gggctgccca ttaaacacat gaatacccgt gccatgttcg acaatcacaa tttcatgaaa 4380

atcatgatga tgttcaggaa aatccgcctg cgggagccgg ggttctatcg ccacggacgc 4440

gttaccagac ggaaaaaaat ccacactatg taatacggtc atactggcct cctgatgtcg 4500

tcaacacggc gaaatagtaa tcacgaggtc aggttcttac cttaaatttt cgacggaaaa 4560

ccacgtaaaa aacgtcgatt tttcaagata cagcgtgaat tttcaggaaa tgcggtgagc 4620

atcacatcac cacaattcag caaattgtga acatcatcac gttcatcttt ccctggttgc 4680

caatggccca ttttcctgtc agtaacgaga aggtcgcgaa ttcaggcgct ttttagactg 4740

gtcgtaatga aattcaacta gtgctctgca ggagctgtca ccggatgtgc tttccggtct 4800

gatgagtccg tgaggacgaa acagcctcta caaataattt tgtttaagag ttactagaga 4860

aagaggagaa atactagttg aagaaggttt ggcttaaccg ttatcccgcg gacgttccga 4920

cggagatcaa ccctgaccgt tatcaatctc tggtagatat gtttgagcag tcggtcgcgc 4980

gctacgccga tcaacctgcg tttgtgaata tgggggaggt aatgaccttc cgcaagctgg 5040

aagaacgcag tcgcgcgttt gccgcttatt tgcaacaagg gttggggctg aagaaaggcg 5100

atcgcgttgc gttgatgatg cctaatttat tgcaatatcc ggtggcgctg tttggcattt 5160

tgcgtgccgg gatgatcgtc gtaaacgtta acccgttgta taccccgcgt gagcttgagc 5220

atcagcttaa cgatagcggc gcatcggcga ttgttatcgt gtctaacttt gctcacacac 5280

tggaaaaagt ggttgataaa accgccgttc agcacgtaat tctgacccgt atgggcgatc 5340

agctatctac ggcaaaaggc acggtagtca atttcgttgt taaatacatc aagcgtttgg 5400

tgccgaaata ccatctgcca gatgccattt catttcgtag cgcactgcat aacggctacc 5460

ggatgcagta cgtcaaaccc gaactggtgc cggaagattt agcttttctg caatacaccg 5520

gcggcaccac tggtgtggcg aaaggcgcga tgctgactca ccgcaatatg ctggcgaacc 5580

tggaacaggt taacgcgacc tatggtccgc tgttgcatcc gggcaaagag ctggtggtga 5640

cggcgctgcc gctgtatcac atttttgccc tgaccattaa ctgcctgctg tttatcgaac 5700

tgggtgggca gaacctgctt atcactaacc cgcgcgatat tccagggttg gtaaaagagt 5760

tagcgaaata tccgtttacc gctatcacgg gcgttaacac cttgttcaat gcgttgctga 5820

acaataaaga gttccagcag ctggatttct ccagtctgca tctttccgca ggcggtggga 5880

tgccagtgca gcaagtggtg gcagagcgtt gggtgaaact gaccggacag tatctgctgg 5940

aaggctatgg ccttaccgag tgtgcgccgc tggtcagcgt taacccatat gatattgatt 6000

atcatagtgg tagcatcggt ttgccggtgc cgtcgacgga agccaaactg gtggatgatg 6060

atgataatga agtaccacca ggtcaaccgg gtgagctttg tgtcaaagga ccgcaggtga 6120

tgctgggtta ctggcagcgt cccgatgcta ccgatgaaat catcaaaaat ggctggttac 6180

acaccggcga catcgcggta atggatgaag aaggattcct gcgcattgtc gatcgtaaaa 6240

aagacatgat tctggtttcc ggttttaacg tctatcccaa cgagattgaa gatgtcgtca 6300

tgcagcatcc tggcgtacag gaagtcgcgg ctgttggcgt accttccggc tccagtggtg 6360

aagcggtgaa aatcttcgta gtgaaaaaag atccatcgct taccgaagag tcactggtga 6420

ctttttgccg ccgtcagctc acgggataca aagtaccgaa gctggtggag tttcgtgatg 6480

agttaccgaa atctaacgtc ggaaaaattt tgcgacgaga attacgtgac gaagcgcgcg 6540

gcaaagtgga caataaagcc tga 6563

<210> 13

<211> 1686

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 13

ttgaagaagg tttggcttaa ccgttatccc gcggacgttc cgacggagat caaccctgac 60

cgttatcaat ctctggtaga tatgtttgag cagtcggtcg cgcgctacgc cgatcaacct 120

gcgtttgtga atatggggga ggtaatgacc ttccgcaagc tggaagaacg cagtcgcgcg 180

tttgccgctt atttgcaaca agggttgggg ctgaagaaag gcgatcgcgt tgcgttgatg 240

atgcctaatt tattgcaata tccggtggcg ctgtttggca ttttgcgtgc cgggatgatc 300

gtcgtaaacg ttaacccgtt gtataccccg cgtgagcttg agcatcagct taacgatagc 360

ggcgcatcgg cgattgttat cgtgtctaac tttgctcaca cactggaaaa agtggttgat 420

aaaaccgccg ttcagcacgt aattctgacc cgtatgggcg atcagctatc tacggcaaaa 480

ggcacggtag tcaatttcgt tgttaaatac atcaagcgtt tggtgccgaa ataccatctg 540

ccagatgcca tttcatttcg tagcgcactg cataacggct accggatgca gtacgtcaaa 600

cccgaactgg tgccggaaga tttagctttt ctgcaataca ccggcggcac cactggtgtg 660

gcgaaaggcg cgatgctgac tcaccgcaat atgctggcga acctggaaca ggttaacgcg 720

acctatggtc cgctgttgca tccgggcaaa gagctggtgg tgacggcgct gccgctgtat 780

cacatttttg ccctgaccat taactgcctg ctgtttatcg aactgggtgg gcagaacctg 840

cttatcacta acccgcgcga tattccaggg ttggtaaaag agttagcgaa atatccgttt 900

accgctatca cgggcgttaa caccttgttc aatgcgttgc tgaacaataa agagttccag 960

cagctggatt tctccagtct gcatctttcc gcaggcggtg ggatgccagt gcagcaagtg 1020

gtggcagagc gttgggtgaa actgaccgga cagtatctgc tggaaggcta tggccttacc 1080

gagtgtgcgc cgctggtcag cgttaaccca tatgatattg attatcatag tggtagcatc 1140

ggtttgccgg tgccgtcgac ggaagccaaa ctggtggatg atgatgataa tgaagtacca 1200

ccaggtcaac cgggtgagct ttgtgtcaaa ggaccgcagg tgatgctggg ttactggcag 1260

cgtcccgatg ctaccgatga aatcatcaaa aatggctggt tacacaccgg cgacatcgcg 1320

gtaatggatg aagaaggatt cctgcgcatt gtcgatcgta aaaaagacat gattctggtt 1380

tccggtttta acgtctatcc caacgagatt gaagatgtcg tcatgcagca tcctggcgta 1440

caggaagtcg cggctgttgg cgtaccttcc ggctccagtg gtgaagcggt gaaaatcttc 1500

gtagtgaaaa aagatccatc gcttaccgaa gagtcactgg tgactttttg ccgccgtcag 1560

ctcacgggat acaaagtacc gaagctggtg gagtttcgtg atgagttacc gaaatctaac 1620

gtcggaaaaa ttttgcgacg agaattacgt gacgaagcgc gcggcaaagt ggacaataaa 1680

gcctga 1686

<210> 14

<211> 561

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 14

Leu Lys Lys Val Trp Leu Asn Arg Tyr Pro Ala Asp Val Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Gln Ser Leu Val Asp Met Phe Glu Gln Ser

20 25 30

Val Ala Arg Tyr Ala Asp Gln Pro Ala Phe Val Asn Met Gly Glu Val

35 40 45

Met Thr Phe Arg Lys Leu Glu Glu Arg Ser Arg Ala Phe Ala Ala Tyr

50 55 60

Leu Gln Gln Gly Leu Gly Leu Lys Lys Gly Asp Arg Val Ala Leu Met

65 70 75 80

Met Pro Asn Leu Leu Gln Tyr Pro Val Ala Leu Phe Gly Ile Leu Arg

85 90 95

Ala Gly Met Ile Val Val Asn Val Asn Pro Leu Tyr Thr Pro Arg Glu

100 105 110

Leu Glu His Gln Leu Asn Asp Ser Gly Ala Ser Ala Ile Val Ile Val

115 120 125

Ser Asn Phe Ala His Thr Leu Glu Lys Val Val Asp Lys Thr Ala Val

130 135 140

Gln His Val Ile Leu Thr Arg Met Gly Asp Gln Leu Ser Thr Ala Lys

145 150 155 160

Gly Thr Val Val Asn Phe Val Val Lys Tyr Ile Lys Arg Leu Val Pro

165 170 175

Lys Tyr His Leu Pro Asp Ala Ile Ser Phe Arg Ser Ala Leu His Asn

180 185 190

Gly Tyr Arg Met Gln Tyr Val Lys Pro Glu Leu Val Pro Glu Asp Leu

195 200 205

Ala Phe Leu Gln Tyr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Val Ala Lys Gly Ala

210 215 220

Met Leu Thr His Arg Asn Met Leu Ala Asn Leu Glu Gln Val Asn Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Gly Pro Leu Leu His Pro Gly Lys Glu Leu Val Val Thr Ala

245 250 255

Leu Pro Leu Tyr His Ile Phe Ala Leu Thr Ile Asn Cys Leu Leu Phe

260 265 270

Ile Glu Leu Gly Gly Gln Asn Leu Leu Ile Thr Asn Pro Arg Asp Ile

275 280 285

Pro Gly Leu Val Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Pro Phe Thr Ala Ile Thr

290 295 300

Gly Val Asn Thr Leu Phe Asn Ala Leu Leu Asn Asn Lys Glu Phe Gln

305 310 315 320

Gln Leu Asp Phe Ser Ser Leu His Leu Ser Ala Gly Gly Gly Met Pro

325 330 335

Val Gln Gln Val Val Ala Glu Arg Trp Val Lys Leu Thr Gly Gln Tyr

340 345 350

Leu Leu Glu Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Cys Ala Pro Leu Val Ser Val

355 360 365

Asn Pro Tyr Asp Ile Asp Tyr His Ser Gly Ser Ile Gly Leu Pro Val

370 375 380

Pro Ser Thr Glu Ala Lys Leu Val Asp Asp Asp Asp Asn Glu Val Pro

385 390 395 400

Pro Gly Gln Pro Gly Glu Leu Cys Val Lys Gly Pro Gln Val Met Leu

405 410 415

Gly Tyr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Thr Asp Glu Ile Ile Lys Asn Gly

420 425 430

Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Ala Val Met Asp Glu Glu Gly Phe Leu

435 440 445

Arg Ile Val Asp Arg Lys Lys Asp Met Ile Leu Val Ser Gly Phe Asn

450 455 460

Val Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Asp Val Val Met Gln His Pro Gly Val

465 470 475 480

Gln Glu Val Ala Ala Val Gly Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Glu Ala

485 490 495

Val Lys Ile Phe Val Val Lys Lys Asp Pro Ser Leu Thr Glu Glu Ser

500 505 510

Leu Val Thr Phe Cys Arg Arg Gln Leu Thr Gly Tyr Lys Val Pro Lys

515 520 525

Leu Val Glu Phe Arg Asp Glu Leu Pro Lys Ser Asn Val Gly Lys Ile

530 535 540

Leu Arg Arg Glu Leu Arg Asp Glu Ala Arg Gly Lys Val Asp Asn Lys

545 550 555 560

Ala

<210> 15

<211> 6049

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agcggataac aatttcacac aggagagctc aaagagtgga acaatgcagg acgccgtccg 60

gtaacggtgt tgagcctcgg ttgtgtggtg attattgtcg ccgctaacat cgtcggcatc 120

ggcatggcga attaatcttt ctgcgaattg agatgacgcc actggctggg cgtcatcccg 180

gtttcccggg taaacaccac cgaaaaatag ttactatctt caaagccaca ttcggtcgaa 240

atatcactga ttaacaggcg gctatgctgg agaagatatt gcgcatgaca cactctgacc 300

tgtcgcagat attgattgat ggtcattcca gtctgctggc gaaattgctg acgcaaaacg 360

cgctcactgc acgatgcctc atcacaaaat ttatccagcg caaagggact tttcaggcta 420

gccgccagcc gggtaatcag cttatccagc aacgtttcgc tggatgttgg cggcaacgaa 480

tcactggtgt aacgatggcg attcagcaac atcaccaact gcccgaacag caactcagcc 540

atttcgttag caaacggcac atgctgacta ctttcatgct caagctgacc gataacctgc 600

cgcgcctgcg ccatccccat gctacctaag cgccagtgtg gttgccctgc gctggcgtta 660

aatcccggaa tcgccccctg ccagtcaaga ttcagcttca gacgctccgg gcaataaata 720

atattctgca aaaccagatc gttaacggaa gcgtaggagt gtttatcgtc agcatgaatg 780

taaaagagat cgccacgggt aatgcgataa gggcgatcgt tgagtacatg caggccatta 840

ccgcgccaga caatcaccag ctcacaaaaa tcatgtgtat gttcagcaaa gacatcttgc 900

ggataacggt cagccacagc gactgcctgc tggtcgctgg caaaaaaatc atctttgaga 960

agttttaact gatgcgccac cgtggctacc tcggccagag aacgaagttg attattcgca 1020

atatggcgta caaatacgtt gagaagattc gcgttattgc agaaagccat cccgtccctg 1080

gcgaatatca cgcggtgacc agttaaactc tcggcgaaaa agcgtcgaaa agtggttact 1140

gtcgctgaat ccacagcgat aggcgatgtc agtaacgctg gcctcgctgt ggcgtagcag 1200

atgtcgggct ttcatcagtc gcaggcggtt caggtatcgc tgaggcgtca gtcccgtttg 1260

ctgcttaagc tgccgatgta gcgtacgcag tgaaagagaa aattgatccg ccacggcatc 1320

ccaattcacc tcatcggcaa aatggtcctc cagccaggcc agaagcaagt tgagacgtga 1380

tgcgctgttt tccaggttct cctgcaaact gcttttacgc agcaagagca gtaattgcat 1440

aaacaagatc tcgcgactgg cggtcgaggg taaatcattt tccccttcct gctgttccat 1500

ctgtgcaacc agctgtcgca cctgctgcaa tacgctgtgg ttaacgcgcc agtgagacgg 1560

atactgccca tccagctctt gtggcagcaa ctgattcagc ccggcgagaa actgaaatcg 1620

atccggcgag cgatacagca cattggtcag acacagatta tcggtatgtt catacagatg 1680

ccgatcatga tcgcgtacga aacagaccgt gccaccggtg atggtatagg gctgcccatt 1740

aaacacatga atacccgtgc catgttcgac aatcacaatt tcatgaaaat catgatgatg 1800

ttcaggaaaa tccgcctgcg ggagccgggg ttctatcgcc acggacgcgt taccagacgg 1860

aaaaaaatcc acactatgta atacggtcat actggcctcc tgatgtcgtc aacacggcga 1920

aatagtaatc acgaggtcag gttcttacct taaattttcg acggaaaacc acgtaaaaaa 1980

cgtcgatttt tcaagataca gcgtgaattt tcaggaaatg cggtgagcat cacatcacca 2040

caattcagca aattgtgaac atcatcacgt tcatctttcc ctggttgcca atggcccatt 2100

ttcctgtcag taacgagaag gtcgcgaatt caggcgcttt ttagactggt cgtaatgaaa 2160

ttcaactagt gctctgcagg agctgtcacc ggatgtgctt tccggtctga tgagtccgtg 2220

aggacgaaac agcctctaca aataattttg tttaagagtt actagagagg aggaattaac 2280

catgaaccat ctgcgtgcgg aaggccctgc gagcgtttta gcgattggca ccgcgaatcc 2340

ggaaaacatt ctgctgcagg atgaatttcc ggattattat tttcgcgtga ccaaaagcga 2400

acatatgacc cagctgaaag aaaaatttcg caaaatttgc gacaagagca tgattcgcaa 2460

acgcaactgc tttctgaacg aagaacatct gaaacagaac ccgcgcctgg tggaacatga 2520

aatgcagacc ctggatgcgc gccaggatat gctggtggtg gaagtgccga aactgggcaa 2580

agatgcgtgc gcgaaagcga ttaaagaatg gggccagccg aaaagcaaaa ttacccatct 2640

gatttttacc agcgcgagca ccaccgatat gccgggcgca gattatcatt gcgcgaaact 2700

gctgggcctg agcccgagcg ttaaacgcgt gatgatgtat cagctgggct gctatggcgg 2760

cggcaccgtt ttacgtattg cgaaagatat tgcggaaaac aacaaaggcg cgcgcgtgct 2820

ggcggtgtgt tgtgatatta tggcgtgcct gtttcgcggc ccgagcgaaa gcgatctgga 2880

actgttagtg ggccaggcga tttttggcga tggcgcggcg gcggtgattg tgggtgcaga 2940

acctgatgaa agcgtgggcg aacgccctat ttttgaactg gtgagcaccg gccagaccat 3000

tctgccgaat agcgaaggca ccattggcgg ccatattcgc gaagcgggcc tgatttttga 3060

tctgcataaa gatgtgccga tgctgattag caacaacatt gaaaaatgcc tgattgaggc 3120

gtttaccccg attggcatta gcgattggaa cagcatcttt tggattaccc atccgggcgg 3180

caaagcgatt ctggataaag tggaagaaaa actgcatctg aaaagcgata aattcgtgga 3240

tagccgccat gtgctgagcg aacatggcaa catgagcagc agcaccgtgc tgtttgtgat 3300

ggatgaactg cgcaaacgca gcctggaaga aggcaaaagc accaccggcg atggctttga 3360

atggggcgtg ctgtttggct ttggcccggg cttaaccgtg gaacgcgttg tggttcgtag 3420

cgtgcctatt aaatattaac tcgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgacta gtcttggact 3480

cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg gatttgttca gaacgctcgg 3540

ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccaggggtc cccaataatt acgatttaaa 3600

ttggcgaaaa tgagacgtgg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 3660

ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttggttca tgtgcagctc 3720

catcagcaaa aggggatgat aagtttatca ccaccgacta tttgcaacag cgccggtgat 3780

cgtgctatga tcgactgatg tcatcagcgg tggagtgcaa tgtcgtgcaa tacgaatggc 3840

gaaaagccga gctcatcggt cagcttctca accttggggt tacccccggc ggtgtgctgc 3900

tggtccacag ctccttccgt agcgtccggc ccctcgaaga tgggccactt ggactgatcg 3960

aggccctgcg tgctgcgctg ggtccgggag ggacgctcgt catgccctcg tggtcaggtc 4020

tggacgacga gccgttcgat cctgccacgt cgcccgttac accggacctt ggagttgtct 4080

ctgacacatt ctggcgcctg ccaaatgtaa agcgcagcgc ccatccattt gcctttgcgg 4140

cagcggggcc acaggcagag cagatcatct ctgatccatt gcccctgcca cctcactcgc 4200

ctgcaagccc ggtcgcccgt gtccatgaac tcgatgggca ggtacttctc ctcggcgtgg 4260

gacacgatgc caacacgacg ctgcatcttg ccgagttgat ggcaaaggtt ccctatgggg 4320

tgccgagaca ctgcaccatt cttcaggatg gcaagttggt acgcgtcgat tatctcgaga 4380

atgaccactg ctgtgagcgc tttgccttgg cggacaggtg gctcaaggag aagagccttc 4440

agaaggaagg tccagtcggt catgcctttg ctcggttgat ccgctcccgc gacattgtgg 4500

cgacagccct gggtcaactg ggccgagatc cgttgatctt cctgcatccg ccagaggcgg 4560

gatgcgaaga atgcgatgcc gctcgccagt cgattggctg agctcatgag cggagaacga 4620

gatgacgttg gaggggcaag gtcgcgctga ttgctggggc aacacgtgga gcggatcggt 4680

ttgacttttg tccttttccg ctgcataacc ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc 4740

ggtatatcca tcctttttcg cacgatatac aggattttgc caaagggttc gtgtagactt 4800

tccttggtgt atccaacggc gtcagccggg caggataggt gaagtaggcc cacccgcgag 4860

cgggtgttcc ttcttcactg tcccttattc gcacctggcg gtgctcaacg ggaatcctgc 4920

tctgcgaggc tggccgtagg ccggccgcga tgcaggtggc tgctgaaccc ccagccggaa 4980

ctgaccccac aaggccctag cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg 5040

tgtcagtgaa gtgcttcatg tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat 5100

atgtgataca ggatatattc cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga 5160

ctgcggcgag cggaaatggc ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag 5220

atacttaaca gggaagtgag agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc 5280

ctgacaagca tcacgaaatc tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat 5340

aaagatacca ggcgtttccc ctggcggctc cctcgtgcgc tctcctgttc ctgcctttcg 5400

gtttaccggt gtcattccgc tgttatggcc gcgtttgtct cattccacgc ctgacactca 5460

gttccgggta ggcagttcgc tccaagctgg actgtatgca cgaacccccc gttcagtccg 5520

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggaaaga catgcaaaag 5580

caccactggc agcagccact ggtaattgat ttagaggagt tagtcttgaa gtcatgcgcc 5640

ggttaaggct aaactgaaag gacaagtttt ggtgactgcg ctcctccaag ccagttacct 5700

cggttcaaag agttggtagc tcagagaacc ttcgaaaaac cgccctgcaa ggcggttttt 5760

tcgttttcag agcaagagat tacgcgcaga ccaaaacgat ctcaagaaga tcatcttatt 5820

aactacatgg ctctgctgta gtgagtgggt tgcgctccgg cagcggtcct gatcccccgc 5880

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggcgcgccc agctgtctag 5940

ggcggcggat ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag 6000

gcccagtctt tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc tttaattaa 6049

Claims

1.一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶，其特征在于所述工程化大肠杆菌的SEQ ID NO: 8所示的基因组fabH基因被缺失。

2.根据权利要求1所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇酸环化酶。

3.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述工程化大肠杆菌的SEQID NO: 11所示的基因组fadE基因被缺失。

4.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述工程化大肠杆菌被修饰以过表达长链酯酰辅酶A合成酶。

5.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述工程化大肠杆菌是从BW25113修饰而来。

6.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述修饰是通过引入质粒来进行。

7.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶通过同一质粒来共表达。

8.根据权利要求1或2所述的工程化大肠杆菌，其特征在于所述长链酯酰辅酶A合成酶通过质粒来过表达。

9.一种用于制备工程化大肠杆菌的方法，其包括修饰大肠杆菌以表达橄榄醇合成酶，其特征在于所述方法包括使所述大肠杆菌的SEQ ID NO: 8所示的基因组fabH基因缺失。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括修饰所述大肠杆菌以表达橄榄醇酸环化酶。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述方法包括使所述大肠杆菌的SEQID NO: 11所示的基因组fadE基因缺失。

12.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述方法包括修饰所述大肠杆菌以过表达长链酯酰辅酶A合成酶。

13.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述工程化大肠杆菌是从BW25113修饰而来。

14.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述修饰是通过引入质粒来进行。

15.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述橄榄醇合成酶和橄榄醇酸环化酶通过同一质粒来共表达。

16.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于所述长链酯酰辅酶A合成酶通过质粒来过表达。