WO2022124840A1 - 해삼 생식선 추출물을 포함하는 조성물, 해삼 난소 추출물로부터 유래된 화합물, 및 이의 용도 - Google Patents

해삼 생식선 추출물을 포함하는 조성물, 해삼 난소 추출물로부터 유래된 화합물, 및 이의 용도 Download PDF

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sea cucumber
extract
formula
ovary
gonad
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노경태
장석규
이지영
장아라
성주경
노진환
이지원
안소희
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사단법인 분자설계연구소
주식회사 벤틱바이오
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Definitions

  • the present invention relates to a novel use of a sea cucumber gonad extract, preferably a use of the sea cucumber gonad extract to improve anti-obesity, anti-diabetes, dyslipidemia, and/or inflammatory diseases, a novel compound isolated from the sea cucumber gonad extract, or the compound It relates to the use of, preferably anti-obesity, anti-diabetes, dyslipidemia improvement, and/or inflammatory disease improvement use.
  • Sea cucumber ( Stichopus japonicus ) is a traditional seafood used as an important ingredient in Asian countries, especially China, Japan and Korea. There are many bioactive substances isolated from sea cucumber. In particular, collagen peptides and polysaccharides are well known to exhibit various biological activities. The ovaries of sea cucumbers are called sea cucumbers and are famous for their delicacies.
  • adipocytes lipid metabolism occurs through lipolysis and adipogenesis, and during fat synthesis, the preadipocytes undergo proliferation and differentiation processes to differentiate into mature adipocytes. This leads to the accumulation of fat in the cells.
  • transcription factors inducing the differentiation process of adipocytes peroxisome proliferator activated receptor ⁇ (PPAR ⁇ ) and CCAAT enhancer binding protein ⁇ (C/EBPa) have been reported. Expression of the transcription factors is induced at different time points in the process of adipocyte differentiation, and through interaction with each other, the expression of adipocyte-specific genes is controlled, and fat metabolism is activated and adipocyte differentiation is gradually induced. They are known to be involved in lipogenesis and adipogenesis leading to obesity.
  • Dyslipidemia is a disease name that includes hyperlipidemia, hypercholesterolemia, and hypertriglyceridemia. This is a state in which total cholesterol, LDL cholesterol, and triglycerides in the blood are increased or HDL cholesterol is decreased. Dyslipidemia is diagnosed if at least one of these is found in the blood test for total cholesterol below 200 mg/dL, LDL cholesterol below 130 mg/dL, HDL cholesterol above 60 mg/dL, and triglyceride below 150 mg/dL. Diagnosis of dyslipidemia is based on the universally accepted American National Cholesterol Education Program (NCEP), total cholesterol, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol, high-density lipoprotein (HDL). ) is diagnosed through lipid indicators such as cholesterol and triglyceride.
  • NCEP National Cholesterol Education Program
  • Type 2 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by insulin resistance, pancreatic beta-cell dysfunction, and consequent rise in blood sugar, and the occurrence of the disease shows a complex genetic tendency.
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
  • PPAR ⁇ is a gene thought to be important in relation to insulin resistance.
  • PPAR ⁇ is specific to adipocytes, is involved in adipocyte differentiation and fatty acid metabolism, and thiazolidinediones, an antidiabetic drug, is known as a ligand.
  • PPAR ⁇ a lipid-activating transcription factor
  • PPAR ⁇ has several functions in the immune system, and it is known that it can regulate inflammation and anti-inflammatory responses through inhibition of this transcription factor, and it is known that it is involved in the treatment of inflammatory bowel disease and rheumatoid arthritis.
  • PPAR ⁇ in immunity and inflammation cell types and diseases, Biochimica et Biophysica Acta 1771 (2007) 1014 - 1030).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a new compound isolated from sea cucumber, in particular, a saponin compound.
  • the problem to be solved by the present invention is a sea cucumber gonad extract, preferably an ovarian extract, anti-obesity, anti-diabetes, dyslipidemia improvement, and/or inflammatory disease improvement of a saponin compound derived from the extract for preventing or treating diseases We want to provide new uses.
  • it is intended to provide a composition for treating or preventing obesity, diabetes, or inflammatory disease comprising a sea cucumber gonad extract, or a saponin compound derived from the extract.
  • the present invention provides a novel compound represented by the following Chemical Formulas S1, S2, S3, S4 and/or S9.
  • the compound may be derived from nature or may be synthesized by a chemical synthesis method, and the process for obtaining the compound is not particularly limited.
  • the compound may be extracted or isolated from the gonads of sea cucumbers, preferably extracted or isolated from the ovaries of sea cucumbers.
  • Another embodiment of the present invention includes a sea cucumber gonad extract, or a saponin compound derived from sea cucumber gonad as an active ingredient, prevention of any one or more diseases selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, and / or inflammation
  • a therapeutic composition is provided.
  • the diabetes may be type 2 diabetes.
  • the sea cucumber ovary extract means that the ovary, which is the reproductive organ of sea cucumber, is extracted with a solvent.
  • a solvent As the gonads of sea cucumbers mature, it is known that the testes turn milky white and the ovaries turn red.
  • the solvent water, C1 to C4 lower alcohol, or a mixed solvent thereof may be used.
  • ethanol or an aqueous ethanol solution is used.
  • the solvent when the solvent is used, the extraction yield of the active ingredient is excellent and may be advantageous in achieving the object of the present invention.
  • the extract of the present invention may be prepared according to a conventional method for producing an extract for an animal, and specifically may be a cold extraction method, a hot extraction method, or a heat extraction method.
  • a fractionator may be used.
  • the sea cucumber gonad extract preferably the ovary extract
  • the sea cucumber ovary extract can be extracted with a 45 to 85% (V/V) aqueous ethanol solution as a solvent, and more preferably, the sea cucumber ovary with a 48 to 55% (V/V) aqueous ethanol solution as a solvent.
  • V/V aqueous ethanol solution
  • 75 to 83% (V/V) aqueous ethanol solution may be extracted as a solvent.
  • the sea cucumber gonad may undergo a process of fractionating the extract, and the sea cucumber ovary fraction obtained therefrom may also be included in the scope of the present invention.
  • the extract obtained by extracting sea cucumber ovaries with an aqueous ethanol solution may be fractionated, and preferably, the aqueous ethanol solution may be 45 to 85% (V/V) aqueous ethanol solution.
  • the fraction may be fractionated from the sea cucumber ovary extract using butanol as a solvent. The fraction can be obtained by suspending the sea cucumber ovary extract in distilled water, etc. and then using a separatory funnel, etc.
  • the sea cucumber ovary extract can be fractionated with butanol.
  • the fractionation may be carried out by a fractionation method commonly used in the art.
  • the prepared extract or the fraction obtained by performing the fractionation process may then be filtered or concentrated or dried to remove the solvent, and both filtration, concentration and drying may be performed.
  • the filtration may use filter paper or a reduced pressure filter, and the concentration may be concentrated under reduced pressure using a reduced pressure concentrator, for example, a rotary evaporator, and the drying may be performed by, for example, a freeze drying method.
  • the extract or fraction may have an excellent body fat reduction effect, an excellent adipocyte differentiation inhibitory activity, an excellent inflammation improvement effect, an excellent cholesterol reduction effect, and an excellent diabetes treatment or improvement effect. .
  • the sea cucumber gonad preferably the ovary extract
  • the following compounds isolated from the dissolved ovarian extract may have therapeutic or preventive effects on any one or more diseases selected from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia.
  • the saponin compound derived from the sea cucumber gonadal, preferably ovarian extract, or sea cucumber ovary is PPAR ⁇ (Peroxisome proliferation activated receptor- ⁇ ), FAS (FS-7-associated surface antigen), aP2 (Adipocyte protein 2), and C/EBPa (CCAAT/Enhancer-binding Protein ⁇ ) expression can be inhibited with any one or more proteins selected from the group consisting of.
  • the saponin compound derived from sea cucumber gonadal, preferably ovarian extract, or sea cucumber ovary can inhibit the differentiation of preadipocytes into adipocytes, or inhibit intracellular fat accumulation. Or it may have a diabetes inhibitory effect.
  • the saponin compound derived from the sea cucumber gonad preferably an ovary extract, or sea cucumber ovary is used for weight loss, blood abnormal lipid reduction, lipid metabolism abnormality alleviation, etc., for inhibiting or improving inflammation, or for treating diabetes Or it can be used for the purpose of improvement.
  • a saponin compound derived from sea cucumber gonad, preferably ovary, or a sea cucumber ovary is treated to an individual in need thereof to suppress, improve or alleviate body fat accumulation, lose weight, or blood abnormalities
  • a method for reducing lipid or inhibiting body fat accumulation in a subject, a method for ameliorating or inhibiting inflammation, or a method for treating or ameliorating diabetes may be provided.
  • One embodiment of the present invention is a composition for inhibiting body fat accumulation in an individual, comprising the following steps: a composition for treating or improving dyslipidemia in an individual, a composition for treating or improving an individual's inflammation-related disease, or diabetes treatment or A method for preparing a composition for improvement can be provided.
  • step S2) treating the gonads of the sea cucumber separated in step S1) with a solvent, preferably with an ethanol solvent, more preferably with a 45 to 85% (V/V) aqueous ethanol solution, and dosing;
  • a solvent preferably with an ethanol solvent, more preferably with a 45 to 85% (V/V) aqueous ethanol solution, and dosing;
  • One embodiment of the present invention is a food or drug for improving or treating obesity comprising the gonad extract of sea cucumber disclosed herein, a food or drug for improving or treating diabetes (especially type 2 diabetes), dyslipidemia (eg, Hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia) improvement or treatment food or medicine, inflammation (eg, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis) improvement or treatment food or medicine can be provided.
  • dyslipidemia eg, Hyperlipidemia, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia
  • inflammation eg, inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis
  • the food or drug may include, without limitation, excipients, additives, and the like generally used in the industry in a range that does not impair the purpose of the present invention.
  • One embodiment of the present invention may provide a method for inhibiting the expression of any one or more proteins selected from the group consisting of PPAR ⁇ , FAS, aP2, and C/EBPa in an individual in need thereof by treating the sea cucumber ovary extract.
  • the composition according to an embodiment of the present invention is selected from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia of the saponin compound derived from the sea cucumber gonad, preferably ovarian extract, or sea cucumber gonad, preferably ovary of the present invention.
  • Any one or more diseases may be used without limitation as long as the field can be applied to a novel use for treatment, prevention, and/or improvement, etc., and may preferably be provided in the form of a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the food composition may be provided as a health functional food composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • the pharmaceutical carrier is a non-limiting example, and is not limited to the above type.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and is preferably applied by oral administration.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity of the patient.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is within the range of 0.001-100 mg/kg for adults.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or it may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in oil or an aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the composition of the present invention when prepared as a food composition, it includes ingredients commonly added during food production, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • the above-mentioned carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; and polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a natural flavoring agent such as stevia extract or a synthetic flavoring agent such as saccharin may be used.
  • any one or more saponin compounds selected from the group consisting of Formula S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and S9, preferably S3, S4, S5, S6 and S8 It provides a method of improving the prevention or treatment effect of any one or more diseases selected from the group consisting of obesity, anti-inflammatory, diabetes, and dyslipidemia of sea cucumber gonadal, preferably ovarian extract, by increasing any one or more saponin compounds selected from .
  • All of the methods for obtaining the saponin compound mentioned in the present invention can be used, and preferably, the method is used as a method of extracting sea cucumber gonads, preferably ovaries with an aqueous ethanol solution, and obtaining a butanol fraction from the extract, Preferably, extraction with 45 to 85% (V/V) aqueous ethanol solution, and a method of fractionating butanol from the extract may be used.
  • One embodiment of the present invention is from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia, comprising administering an effective amount of a saponin compound derived from the gonad extract of sea cucumber or sea cucumber gonad to an individual in need thereof
  • a method for treating or ameliorating any one selected disease is provided.
  • the saponin compound derived from the germline of sea cucumber mentioned herein includes any one or more selected from the group consisting of Formulas S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and S9.
  • Another embodiment treats or improves any one disease selected from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia that increases the saponin compound derived from the gonad extract of sea cucumber or the gonad of sea cucumber in an individual in need thereof can provide a way to Another embodiment is the treatment of any one disease selected from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia, comprising a gonad extract of sea cucumber, or a saponin compound derived from the gonad of sea cucumber and a pharmaceutically acceptable carrier Or it may provide a composition for improvement.
  • Another embodiment may provide a use for treating or ameliorating any one disease selected from the group consisting of obesity, inflammation, diabetes, and dyslipidemia of a gonad extract of sea cucumber, or a saponin compound derived from the gonad of sea cucumber.
  • Another embodiment is any one selected from the group consisting of PPAR ⁇ , FAS, aP2, and C/EBPa in the body, comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a gonad extract of sea cucumber, or a saponin compound derived from the gonad of sea cucumber
  • Methods of inhibiting expression of one or more proteins may be provided.
  • the present invention provides a novel saponin compound not previously known.
  • the present invention proposes a novel use of a sea cucumber gonadal, preferably ovarian extract or a saponin compound isolated therefrom.
  • the sea cucumber gonad preferably the ovary extract
  • 1 is a result of confirming the cell viability after treating 3T3-L1 cells with a sea cucumber ovary extract and an extract obtained by varying the ethanol concentration of intestines except for the ovaries.
  • Figure 2a is a diagram showing the effect of a sea cucumber extract on adipocyte differentiation and fat accumulation inhibition.
  • Figure 2b shows O.D. represents a value.
  • Figure 3 shows the results of analysis of genes and proteins related to adipocyte differentiation by region and concentration of sea cucumber extract.
  • Figure 3a is a result showing the protein expression level
  • the graph of Figure 3b is the result of confirming the effect of the sea cucumber extract on mRNA expression.
  • Figure 4a is a photograph showing the differentiation of adipocytes of the sea cucumber extract
  • Figure 4b is a graph showing the fat accumulation inhibitory effect (25, 50 ⁇ g / ml).
  • FIG. 6 is a diagram showing the process of isolating the compound through the extraction and fractionation of the sea cucumber ovary extract.
  • Figure 8 shows the results of analyzing the degree of fat accumulation through Oil red O staining after the completion of adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells for compounds isolated from sea cucumber ovary extract.
  • (b) shows differentiated 3T3-L1 cells
  • (c) shows the optical density (OD) of Oil Red O measured at 500 nm. 2.5 and 5 ⁇ g/ml concentrations were treated, respectively.
  • Figure 14 shows the final body weight confirmed after the extract treatment of high-calorie diet intake rats.
  • Sea cucumbers were extracted by dividing the ovaries and intestines except for the ovaries, and 50% ethanol and 80% ethanol were added 20 times each to the dried sea cucumber ovaries and intestines, respectively, and extracted by stirring at room temperature for 24 hours. Thereafter, sea cucumber ovary and intestine extracts were obtained through filtration and concentration under reduced pressure.
  • Reagents and materials are as follows.
  • 3T3-L1 cells ATCC, CL-173
  • DMEM high glucose (Gibco) fetal bovine serum
  • Gibco penicillin-streptomycin-glutamin
  • phosphate buffered saline (Gibco) Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Thermo) scientific), protease- and phosphatase-inhibitor cocktails (Thermo scientific), PVDF membrane (Bio-rad), Primary antibody (PPAR ⁇ (Santa cruz), C/EBPa (cell signaling), FAS (cell signaling), aP2 (cell signaling) ), ⁇ -actin (Santa cruz), Oli red O powder (sigma), and MTT powder (sigma) were used.
  • PPAR ⁇ Santa cruz
  • C/EBPa cell signaling
  • FAS cell signaling
  • aP2 cell signaling
  • ⁇ -actin Oli red O powder
  • MTT powder MTT powder
  • 3T3-L1 cells were aliquoted in a 96-well plate at a concentration of 1x10 4 cells/well, cultured for one day, and 6 extracts were treated at a concentration of 100-200 ⁇ g/ml. After 24 hours, MTT powder was dissolved in PBS at a concentration of 5 mg/ml, filtered, and 20 ⁇ l of each cell was dispensed and cultured for 2 hours. After removing the medium, 200 ⁇ l of DMSO was dispensed, and absorbance was measured at 570 nm to measure cell viability.
  • 3T3-L1 cells were cultured in high glucose DMEM medium supplemented with 10% calf serum and penicillin streptomycin glutamin, and subcultured every 2-3 days. 3T3-L1 cells were aliquoted in a 6 well plate at a concentration of 4x10 5 cells/well and cultured for 2 days. Then, dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. ) was replaced with the added MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with insulin, and the medium was replaced every 2 days to induce differentiation. The sea cucumber extract was treated at a concentration of 200 ⁇ g/ml 30 minutes after medium replacement.
  • IBMX 3-isobuty-1-methylxanthine
  • 3T3-L1 cells were fixed with 4% formaldehyde for 1 hour, and then the degree of differentiation was confirmed by staining the fat using a 0.5% Oil red O staining solution.
  • absorbance was measured at 500 nm by dissolving the dye dyed in cells with 100% isopropyl alcohol.
  • RNA expression level of the related genes was confirmed using qRT-PCR.
  • 3T3-L1 cells were harvested using PBS and extracted using Rneasy Mini kit (Qiagen).
  • the extracted RNA was 1 ⁇ g cDNA (ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, FSQ-201, TOYOBO) was synthesized and SYBR RT-PCR was performed in the green method.
  • PCR conditions were 40 cycles of pre-denaturation (95°C, 1 min), 95°C, 15 sec, and 60°C, 15 sec.
  • the primer sequences used are shown in Table 2.
  • FIG. 1 The viability of 3T3-L1 cells after sea cucumber extract treatment is shown in FIG. 1 .
  • the degree of fat accumulation was analyzed through Oil red O staining. It showed the effect of reducing fat accumulation.
  • the absorbance was measured by dissolving Oil red O dyed in the cells with 100% isopropyl alcohol. It was confirmed that the accumulation was reduced.
  • the sea cucumber ovary extract had a significant fat accumulation inhibitory effect compared to other organs of the sea cucumber.
  • treatment groups 3 and 4 ovarian extract
  • O.D O.D.
  • the value was only about half that of treatment groups 1 and 2.
  • sea cucumber extract inhibits fat differentiation by regulating the expression of genes and proteins related to fat differentiation.
  • 3 shows the results of suppressing the expression of fat differentiation-related genes and proteins of the sea cucumber extract.
  • the best extraction conditions are sea cucumber ovary 50% (Sample name: SJ-O-D1-50) or 80% ethanol extract (Sample name: SJ- O-D1-80). That is, treatment groups 3 and 4 were excellent in inhibiting gene expression related to adipogenesis.
  • Sample name extract information One SJ-O-D1-30 Dry ovary 30% EtOH, 20 times, 24h stirring, primary extraction 2 SJ-O-D1-50 Dry ovary 50% EtOH, 20 times, 24h stirring, 1st extraction 3 SJ-O-D1-80 Dry ovary 80% EtOH, 20 times, 24h stirring, 1st extraction 4 SJ-O-D1-H hexane fraction of sample 2 5 SJ-O-D1-B Sample 2 BuOH fraction
  • 3T3-L1 cells were cultured in high glucose DMEM medium supplemented with 10% calf serum and penicillin streptomycin glutamin, and subcultured every 2-3 days. 3T3-L1 cells were aliquoted in a 6 well plate at a concentration of 4x10 5 cells/well and cultured for 2 days. Then, dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. ) was replaced with the added MDI medium, and the sea cucumber extract was treated 30 minutes after the replacement of the MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with an insulin-containing medium, and a new medium was replaced every 2 days to induce differentiation.
  • dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum.
  • IBMX 3-isobuty-1-methylxanthine
  • 3T3-L1 cells were fixed with 4% formaldehyde for 1 hour, and then the degree of differentiation was confirmed by staining the fat using a 0.5% Oil red O staining solution.
  • absorbance was measured at 500 nm by dissolving the dye dyed in cells with 100% isopropyl alcohol.
  • Ethanol extracts were obtained by extracting the intestines and ovaries of sea cucumber except for the ovaries, respectively, as follows. After adding 30% EtOH, 50% EtOH, or 80% EtOH to the dried sea cucumber ovary in 20 folds, the mixture was stirred for 24 hours, filtered in the same way, and then concentrated.
  • the fractions of the sea cucumber ovary extract were obtained in the following way.
  • each sea cucumber extract was treated with a differentiation medium at a concentration of 25 and 50 ⁇ g/ml (Sample 6, 10, 25 ⁇ g/ml) for 48 hours. So the experiment was carried out. As a result of analyzing the degree of fat accumulation through Oil red O staining, all samples except sample 1 showed a significant fat accumulation inhibitory effect. (Fig. 4)
  • the separation/purification method is shown in FIG. 6 .
  • a specific separation/purification method is as follows.
  • each single compound was treated at a concentration of 2.5 - 5 ⁇ g/ml to check cell viability. As a result, the majority of samples showed no significant change. could check Samples of S3, S4, and S5 showed a significant decrease at a concentration of 2.5 ⁇ g/ml, but showed a cell viability of about 80% or more.
  • Samples of S3 suppressed about 16, 40, and 80% fat accumulation from 1 ⁇ g/ml to 5 ⁇ g/ml, and showed a tendency to have a concentration-dependent inhibitory effect on adipogenesis, while samples of S4-S8 showed differentiation at 2.5 ⁇ g/ml. It was confirmed that fat accumulation was suppressed at the level of cells that were not treated.
  • Tables 4 to 9 below show the results of 13 C and 1 H NMR chemical shifts of S1-S4 and S9 of the compounds isolated from the sea cucumber ovary extract. Through this, it was confirmed that S1-S4 and S9 were newly isolated saponin compounds.
  • 3T3-L1 cells ATCC, CL-173
  • DMEM high glucose Welgene
  • Fetal bovine serum MPBio
  • penicillin-streptomycin Welgene
  • Dulbecco's phosphate-buffered saline Welgene
  • Trypsin-EDTA Welgene
  • Bovine calf serum Welgene
  • Glucose Uptake-Glo Assay Kit Promega
  • 3T3-L1 cells were cultured in high glucose DMEM medium supplemented with 10% Calf serum and penicillin-streptomycin, and subcultured every 2-3 days. 3T3-L1 cells were aliquoted in a 96-well plate at a concentration of 2x10 4 cells/well and cultured for 3 days. Then, dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. It was replaced with the added MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with insulin, and the medium was replaced every 2 days to induce differentiation.
  • dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. It was replaced with the added MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with insulin, and the medium was replaced every 2 days to induce differentiation.
  • 3T3-L1 cells were subjected to stavation for 16 hours, and then treated with sea cucumber extract at concentrations of 25 and 50 ug/mL in serum-free medium for 6 hours. The culture supernatant was recovered and the glucose transport activity was measured using a luminometer in 3T3-L1 cells using the Glucose Uptake-Glo Assay Kit.
  • the intracellular glucose uptake rate of the sea cucumber ovary extract is remarkably excellent.
  • 10 is a result of confirming the glucose absorption rate of the sea cucumber ovary extract and the intestine extract excluding the ovary of sea cucumber.
  • 11 is a result of confirming the glucose absorption rate for each extraction condition of the sea cucumber ovary extract.
  • Glucose absorption rate was excellent compared to the control group at all concentrations. In particular, it was confirmed that it has a higher glucose absorption efficiency than Rosiglitazone, which is used as a diabetes treatment, and it was found that the sea cucumber ovary extract has an excellent antidiabetic effect.
  • the sea cucumber ovary extract increased the glucose absorption rate compared to the untreated group, and in particular, compared to the 1.24-fold increase in Rosiglitazone, the sea cucumber ovary extract had a much higher absorption rate (1.29 times, 1.43 times, 1.35 times).
  • 3T3-L1 cells were cultured in high glucose DMEM medium supplemented with 10% Calf serum and penicillin-streptomycin, and subcultured every 2-3 days. 3T3-L1 cells were aliquoted in a 96-well plate at a concentration of 2x10 4 cells/well and cultured for 3 days. Then, dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. It was replaced with the added MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with insulin, and the medium was replaced every 2 days to induce differentiation.
  • dexamethasone, insulin, and 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX) were added to a medium containing 10% FBS instead of calf serum. It was replaced with the added MDI medium. After 2 days, the medium was replaced with insulin, and the medium was replaced every 2 days to induce differentiation.
  • 3T3-L1 cells were treated with a single compound derived from sea cucumber at a concentration of 2.5 ug/mL in a serum-free medium for 6 hours after stavation for 16 hours.
  • the culture supernatant was recovered and the glucose transport activity was measured using a luminometer in 3T3-L1 cells using the Glucose Uptake-Glo Assay Kit.
  • FIG. 12 is a result of confirming the glucose absorption rate of the saponin compounds isolated from the ovarian extract of sea cucumber. As can be seen in FIG. 12 , when the glucose absorption rate of the untreated group was 100%, all compounds showed an absorption rate of 100% or more. Through these results, it was found that the isolated compounds increased the glucose absorption rate compared to the untreated group, and each had an antidiabetic effect.
  • Table 11 is a fold change value showing the degree of glucose uptake compared to the control group. It also showed a similar level of glucose uptake as that of rosiglitazone.
  • mice in each group were tested. Except for the normal diet group, all groups were fed a high-fat diet.
  • the extract was fed through a diet by preparing a feed, and the experiment was conducted for 8 weeks. Body weight was measured once a week, and dietary intake was measured three times a week.
  • 13 and 14 are results of observing the weight change and finally confirmed body weight of rats ingesting a high-calorie diet.
  • the group treated with the sea cucumber ovary extract (50% ethanol) confirmed that up to 8 weeks, the weight gain was significantly reduced compared to the untreated group.
  • the final body weight decreased when compared to the HFD-labeled sea cucumber ovary extract untreated group.
  • Hematoxilin is a basic/cationic substance that stains the nucleus (anion) in dark blue or purple, and eosin is an acidic/anionic substance that stains the cytoplasm (cation) in red or pink.
  • HDL/TC High-density lipoprotein content compared to total cholesterol in blood
  • HDL-C(mg/dl) (absorbance of sample/absorbance of standard) x 100(mg/dl)
  • test tubes for blind/standard/sample respectively.
  • Total cholesterol (mg/dl) (absorbance of sample/absorbance of standard) x concentration of standard solution
  • test tubes for blind/standard/sample respectively.
  • Triglyceride mass (mg/dl) (absorbance of sample / absorbance of standard) x 300 (mg/dl)
  • the present invention may provide a composition for weight loss, an anti-obesity composition, an anti-diabetic composition, an anti-inflammatory composition, and a composition for improving dyslipidemia, which include a sea cucumber ovary extract.
  • the composition of the present invention may provide a method for weight loss, a method for suppressing obesity, a method for treating or improving diabetes, a method for treating or improving inflammation, and a method for treating or improving dyslipidemia.

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Abstract

본 발명은 해삼의 생식선 추출물, 바람직하게 난소 추출물로부터 분리된 신규 사포닌 화합물, 해삼 생식선 추출물 또는 해삼 생식선 추출물로부터 분리된 화합물의 신규 용도를 제공한다. 본 발명은 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물 또는 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물로부터 분리된 화합물을 포함하는, 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환을 치료 또는 예방하는 효과를 가진다.

Description

해삼 생식선 추출물을 포함하는 조성물, 해삼 난소 추출물로부터 유래된 화합물, 및 이의 용도
본 출원은 2020년 12월 10일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0172701호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다. 본 발명은 해삼 생식선 추출물의 신규 용도, 바람직하게 해삼 생식선 추출물의 항비만, 항당뇨, 이상지질혈증 개선, 및/또는 염증성 질환 개선 용도에 관한 것이며, 해삼 생식선 추출물로부터 분리된 새로운 화합물, 또는 상기 화합물의 용도, 바람직하게 항비만, 항당뇨, 이상지질혈증 개선, 및/또는 염증성 질환 개선 용도에 관한 것이다.
해삼(sea cucumber, 학명 Stichopus japonicus)은 아시아 국가, 특히 중국, 일본 및 한국에서 중요한 식재료로 사용되는 전통 해산물이다. 해삼에서 분리된 많은 생리 활성 물질이 있다. 특히 콜라겐 펩타이드, 다당류 등은 다양한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 해삼의 난소는 해서자라고 하여 진미로 유명하다.
한편, 지방세포에서는 지방분해(lipolysis)와 합성(adipogenesis)을 통하여 지질대사가 일어나고, 상기 지방 합성 시 상기 지방전구세포(preadipocyte)가 증식과 분화과정을 거쳐 성숙한 지방세포(adipocyte)로 분화되어 궁극적으로 세포 내에 지방이 축적되게 된다. 상기 지방세포의 분화과정을 유도하는 전사인자(transcription factors)로는 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ) 및 C/EBPα(CCAAT enhancer binding protein α) 등이 보고되어 있다. 상기 전사인자는 지방세포 분화과정 중 각기 다른 시점에서 발현이 유도되며, 서로 상호작용을 통하여 지방세포 특이 유전자들의 발현을 조절하고 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 점진적으로 유도해 나간다. 이들은 비만을 유도하는 지질합성(lipogenesis) 및 지방형성(adipogenesis)에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이상지질혈증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증을 포함하는 질환명이다. 이는 혈중에 총콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중성지방이 증가된 상태거나 HDL콜레스테롤이 감소된 상태이다. 혈액검사를 통해 총콜레스테롤 200mg/dL 이하, LDL콜레스테롤 130mg/dL 이하, HDL콜레스테롤 60mg/dL 이상, 중성지방 150mg/dL 이하 기준에서 이 중 하나라도 이상이 발견되면 이상지질혈증이라 진단한다. 이상지질혈증에 대한 진단은 보편적으로 받아들여지고 있는 미국의 NCEP (National Cholesterol Education Program)에 따라 총콜레스테롤(total cholesterol), 저밀 도지단백(LDL, low density lipoprotein) 콜레스테롤, 고밀도지단백(HDL, high density lipoprotein) 콜레스테롤, 중성지방(triglyceride) 등의 지질 지표를 통해 진단하고 있다.
제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 췌장 베타세포의 기능 이상 및 이로 인한 혈당상승을 특징으로 하는 대사성 질환이며 질환의 발생은 복합적인 유전적 경향을 보인다. 제2형 당뇨병의 발생에는 많은 유전자의 다형성이 관련되어 있다는 여러 연구결과가 보고되었다. 특히, PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma) 유전자는 인슐린저항성과의 관련성이 중요하다고 사료되는 유전자이다. PPARγ는 지방세포에 특이적이고, 지방세포의 분화 및 지방산 대사에 관여하며 당뇨병 치료제인 thiazolidinediones가 리간드로 알려져 있어 제2형 당뇨병 및 비만증과 관련성이 있는 원인 유전자일 가능성이 지적되어 왔다.
특히, 지질 활성화 전사 인자인 PPARγ는 면역계에서 여러 기능을 갖는데, 이 전사 인자의 억제를 통해 염증 및 항염증 반응을 조절할 수 있다는 것이 알려져 있고, 이를 통해 염증성장질환, 류머티스 관절염 치료에 관여한다는 것이 알려져 있다 (PPARγ in immunity and inflammation: cell types and diseases, Biochimica et Biophysica Acta 1771 (2007) 1014 - 1030).
그러나, 아직까지 항비만, 당뇨병 또는 이상지질혈증관련 질환의 예방 또는 치료, 또는 염증 개선 또는 치료 등의 효과가 우수하고, 안전한 물질에 대한 보고가 미흡하다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 해삼으로부터 분리된 새로운 화합물, 특히 사포닌 화합물을 제공하고자 한다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 해삼 생식선 추출물, 바람직하게 난소 추출물, 상기 추출물로부터 유래된 사포닌 화합물의 항비만, 항당뇨, 이상지질혈증 개선, 및/또는 염증성 질환 개선 등의 질환 예방 또는 치료를 위한 신규한 용도를 제공하고자 한다. 또한, 해삼 생식선 추출물, 또는 상기 추출물로부터 유래된 사포닌 화합물을 포함하는 비만, 당뇨병, 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 S1, S2, S3, S4 및/또는 S9로 표시되는 신규 화합물을 제공한다.
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000001
<화학식 S1>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000002
<화학식 S2>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000003
<화학식 S3>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000004
<화학식 S4>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000005
<화학식 S9>
상기 화합물은 자연에서 유래될 수도 있고, 화학적 합성방법으로 합성될 수도 있으며, 상기 화합물은 얻는 과정은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 화합물은 해삼의 생식선으로부터 추출 또는 분리할 수 있으며, 바람직하게 해삼의 난소로부터 추출 또는 분리할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 해삼 생식선 추출물, 또는 해삼 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비만, 당뇨, 이상지질혈증 개선, 및/또는 염증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 바람직하게 상기 당뇨는 제2형 당뇨일 수 있다.
상기 해삼 난소 추출물은 해삼의 생식기인 난소를 용매로 추출한 것을 의미한다. 해삼의 생식선은 성숙함에 따라 정소는 유백색으로 난소는 홍색으로 변하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 해삼의 생식선 중 바람직하게 난소 추출물을 이용할 수 있다. 상기 용매는 물, C1~C4의 저급알코올, 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게, 에탄올 또는 에탄올 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 용매를 사용했을 때 특히 유효성분 추출 수율이 우수하고 본 발명의 목적 달성에 유리할 수 있다. 본 발명의 추출물은 통상의 동물을 추출대상으로 한 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것 일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파 분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 바람직하게 상기 해삼 생식선 추출물, 바람직하게 난소 추출물은 45 내지 85%(V/V) 에탄올 수용액을 용매로 추출할 수 있으며 더 바람직하게 상기 해삼 난소를 48 내지 55%(V/V) 에탄올 수용액을 용매로, 또는 75 내지 83%(V/V) 에탄올 수용액을 용매로 추출할 수 있다. 상기 용매를 사용했을 때 본 발명의 목적 달성에 유리할 수 있다.
또 다른 실시예에서 상기 해삼 생식선, 바람직하게 난소는 추출물을 분획하는 과정을 거칠 수 있으며, 이로부터 수득된 해삼 난소 분획물도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 바람직하게 해삼 난소를 에탄올 수용액으로 추출한 추출물을 분획할 수 있으며, 바람직하게 상기 에탄올 수용액은 45 내지 85%(V/V) 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 분획물은 바람직하게 해삼 난소 추출물을 부탄올을 용매로 하여 분획할 수 있다. 상기 분획물은 해삼 난소 추출물을 증류수 등에 현탁시킨 후 분별 깔때기 등을 사용하여 헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 또는 이들의 조합에 의해 얻을 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 목적상 상기 해삼 난소 추출물은 부탄올로 분획할 수 있다. 상기 분획화는 당업계에서 통상적으로 이용되는 분획화 방법으로 실시할 수 있다.
상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.
상기 추출물 또는 분획물은 체지방 감소 효과가 우수할 수 있고, 지방세포 분화 억제 활성이 뛰어날 수 있고, 염증 개선 효과가 뛰어날 수 있고, 콜레스테롤 감소 효과가 우수할 수 있고, 당뇨병 치료 또는 개선 효과가 뛰어날 수 있다.
본 발명의 일 실시예서, 상기 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물은 하기 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을, 바람직하게 S3, S4, S5, S6 및 S8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사포닌 화합물을 포함한다. 바람직하게 상기 해산 난소 추출물에서 분리된 하기 화합물들은 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방 효과를 가질 수 있다.
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000006
<화학식 S1>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000007
<화학식 S2>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000008
<화학식 S3>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000009
<화학식 S4>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000010
<화학식 S5>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000011
<화학식 S6>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000012
<화학식 S8>
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000013
<화학식 S9>
상기 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물, 또는 해삼 난소로부터 유래된 사포닌 화합물은 PPARγ(Peroxisome proliferation activated receptor-γ), FAS(FS-7-associated surface antigen), aP2(Adipocyte protein 2), 및 C/EBPα(CCAAT/Enhancer-binding Protein α)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질로 발현을 억제할 수 있다.
해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물, 또는 해삼 난소로부터 유래된 사포닌 화합물은 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제하거나, 세포 내 지방축적을 억제할 수 있다. 또는 당뇨 억제 효과를 가질 수 있다.
상기 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물, 또는 해삼 난소로부터 유래된 사포닌 화합물은 개체의 체중감량, 혈중 이상 지질 감량, 지질대사 이상 완화 등을 위한 용도로, 염증 억제 또는 개선을 위한 용도로, 또는 당뇨 치료 또는 개선을 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 해삼 생식선, 바람직하게 난소의 추출물 또는 해삼 난소로부터 유래된 사포닌 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 처리하여 체내 지방 축적을 억제, 개선 또는 완화하거나, 체중을 감량하거나, 혈중 이상 지질을 감소하거나, 개체의 체지방 축적을 억제하는 방법을, 염증의 개선 또는 억제 방법을, 또는 당뇨병 치료 또는 개선 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 다음 단계를 포함하는 개체의 체지방 축적 억제용 조성물을, 개체의 이상 지질 혈증 치료 또는 개선용 조성물을, 개체의 염증 관련 질환의 치료 또는 개선용 조성물을, 또는 당뇨병 치료 또는 개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
S1) 해삼으로부터 생식선, 바람직하게 난소를 분리하는 단계;
S2) S1) 단계에서 분리된 해삼의 생식선을 용매에 처리하는 단계, 바람직하게 에탄올 용매로, 더 바람직하게 45 내지 85%(V/V) 에탄올 수용액 용매로 처리하여 해는 단계;
S3) 해삼의 생식선을 용매에 처리한 후, 상온에서 24시간동안 교반하는 단계; 및
S4) 필터링한 후 여과된 용액을 감압농축하여 해삼 추출물을 얻는 단계.
본 발명의 일 구현예는 본원에 개시된 해삼의 생식선 추출물을 포함하는 비만 개선 또는 치료용 식품 또는 의약품, 당뇨병 (특히, 2형 당뇨병) 개선 또는 치료용 식품 또는 의약품, 이상지질혈증 (예를 들어, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증) 개선 또는 치료용 식품 또는 의약품, 염증 (예를 들어, 염증성장질환, 류머티스 관절염) 개선 또는 치료용 식품 또는 의약품을 제공할 수 있다.
상기 식품 또는 의약품은 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서, 업계에서 일반적으로 사용되는 부형제, 첨가제 등을 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 해삼 난소 추출물을 처리하여 이를 필요로 하는 개체의 PPARγ, FAS, aP2, 및 C/EBPα로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 발현을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 본 발명의 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물, 또는 해삼 생식선, 바람직하게 난소로부터 유래된 사포닌 화합물의 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 치료, 예방, 및/또는 개선 등을 위한 신규 용도가 적용될 수 있는 분야이면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게 약제학적 조성물, 또는 식품 조성물 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게 상기 식품 조성물은 건강 기능 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 담체는 비제한적인 예시이며, 상기 종류로 한정되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제, 또는 사카린 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 상기 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사포닌 화합물을, 바람직하게 S3, S4, S5, S6 및 S8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사포닌 화합물을 증가시켜 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물의 비만, 항염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 효과를 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명에 언급된 상기 사포닌 화합물을 수득하는 방법이 모두 이용될 수 있으며, 바람직하게 상기 방법은 해삼 생식선, 바람직하게 난소를 에탄올 수용액으로 추출하고, 추출물로부터 부탄올 분획을 획득하는 방법으로 이용할 수 있으며, 바람직하게 45 내지 85%(V/V) 에탄올 수용액으로 추출하고, 추출물로부터 부탄올 분획하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본원에서 언급된 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물은 상기 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 다른 구현예는 이를 필요로 하는 개체에 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물을 증가시키는 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료 또는 개선하는 방법을 제공할 수 있다. 다른 구현예는 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환의 치료 또는 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 다른 구현예는 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물의 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료 또는 개선하기 위한 용도를 제공할 수 있다. 다른 구현예는 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 체내 PPARγ, FAS, aP2, 및 C/EBPα로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 발현을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 종래 알려지지 않은 신규한 사포닌 화합물을 제공한다.
본 발명은 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물 또는 이로부터 분리된 사포닌 화합물의 새로운 용도를 제안한다. 본 발명을 통해 해삼 생식선, 바람직하게 난소 추출물이 해삼의 다른 부위에 비해 우수한 항비만 효과, 체중 감량 효과, 당뇨병 치료 또는 개선 효과, 항염증 효과, 이상지질혈증 예방, 개선, 또는 치료효과 등을 확인하였다. 본 발명을 통해 비만, 항염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 해삼 난소 추출물과 난소를 제외한 내장을 에탄올 농도를 달리하여 얻은 추출물을 3T3-L1 세포에 처리한 후 세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 2a는 해삼 추출물의 지방세포 분화 및 지방 축적 억제 효과를 보여주는 그림이다. 도2b는 시료 1-4를 처리한 후 확인한 O.D. 값을 나타낸다.
도 3은 해삼 추출물의 부위 및 농도별 지방세포 분화 관련 유전자 및 단백질 분석 결과를 보여준다. 도 3a는 단백질 발현 정도를 보여준 결과이고, 도 3b의 그래프는 mRNA 발현에 미치는 해삼 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
도 4a는 해삼 추출물의 지방세포 분화를 보여주는 사진이고, 도 4b는 지방 축적 억제 효과 (25, 50 μg/ml)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 해삼 추출물이 지방 세포 분화과정에 관여하는 단백질 PPARγ, FAS, aP2, C/EBPα의 발현에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 해삼 난소 추출물이 단백질을 억제하는 것을 확인하였다.
도 6은 해삼 난소 추출물의 추출 및 분획을 통해 화합물을 분리해낸 과정을 그림으로 보여준다.
도 7은 해삼 난소 추출물에서 분리한 화합물들이 3T3-L1 세포 생존률에 미치는 영향을 보여준다.
도 8의 (a)는 해삼 난소 추출물에서 분리한 화합물들이 3T3-L1 세포의 지방 분화 종료 후 Oil red O 염색을 통하여 지방 축적 정도를 분석한 결과를 보여준다. (b)는 분화된 3T3-L1 세포를 보여주며, (c)는 500 nm에서 측정한 Oil Red O의 Optical density (OD)를 보여준다. 2.5, 5 μg/ml 농도로 각각 처리했다.
Data are presented mean ± standard deviation (SD). *, **, and *** indicate p < 0.05, 0.01, and 0.001, respectively, when compared to the differentiated control group (MDI).
도 9는 S1-S6, S8-S9 화합물을 각각 처리했을 때 분화된 3T3-L1 세포의 Adipogenesis-related protein level을 보여준다.
도 10은 해삼 난소 추출물과 해삼의 난소를 제외한 내장 추출물의 포도당 흡수율을 확인한 결과이다.
도 11은 해삼 난소 추출물의 추출 조건별 포도당 흡수율을 확인한 결과이다.
도 12는 해삼의 난소 추출물에서 분리된 사포닌 화합물들의 포도당 흡수율을 확인한 결과이다.
도 13은 체중변화를 관찰한 결과이다.
도 14는 고열량 식이 섭취 쥐의 추출물 처리 후 확인된 최종 체중을 보여준다.
도 15는 H&E stain을 통해 확인된 백색지방세포 크기 변화 결과이다.
도 16은 총 콜레스테롤 대비 HDL 함량을 표시한 결과이다.
도 17은 총 콜레스테롤의 감소효과를 확인한 결과이다.
도 18은 중성지방의 감소효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 19는 추출물 처리군의 PPARγ 발현 감소 효과를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
Ⅰ. 실험예 1- 해삼 부위별 추출물의 효과 확인
1. 시료추출
(1) 추출 부위 및 용매 농도
부위 용매
해삼 (Stichopus japonicus) 내장 1 50% EtOH
2 80% EtOH
난소 3 50% EtOH
4 80% EtOH
해삼은 난소와 난소를 제외한 내장으로 나누어 추출하였으며, 건조된 상태의 해삼 난소와 내장에 50% 에탄올과 80% 에탄올을 각각 20배수 가하여 상온에서 24시간동안 교반하여 추출하였다. 이후, 여과 및 감압 농축 과정을 통하여 해삼 난소 및 내장 추출물을 얻었다.
2. 해삼 추출물의 지방세포 분화 억제능 평가
(1) 실험 재료 및 방법
시약 및 재료는 다음과 같다.
3T3-L1 cells (ATCC, CL-173), DMEM high glucose (Gibco), fetal bovine serum (Gibco), penicillin-streptomycin-glutamin (Gibco), phosphate buffered saline (Gibco), Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Thermo scientific), protease- and phosphatase-inhibitor cocktails (Thermo scientific), PVDF membrane (Bio-rad), Primary antibody (PPARγ (Santa cruz), C/EBPα (cell signaling), FAS (cell signaling), aP2 (cell signaling), β-actin (Santa cruz), Oli red O powder (sigma), MTT powder (sigma)을 사용하였다.
(2) 세포 생존률 측정
3T3-L1 세포를 1x104 cells/well의 농도로 96well plate에 분주하고 하루 배양한 뒤 6가지의 추출물을 100-200μg/ml의 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, MTT powder을 5mg/ml의 농도로 PBS에 녹인 후 필터링하여 세포의 20μl씩 분주하여 2시간동안 배양하였다. 배지를 걷어낸 뒤 200μl의 DMSO를 분주한 뒤 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 측정하였다.
(3) 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 지방세포 분화
3T3-L1 세포는 10% calf serum과 penicillin streptomycin glutamin이 첨가된 high glucose DMEM 배지에서 배양하였으며 2-3일 마다 계대배양하였다. 3T3-L1 세포를 6 well plate에 4x105 cells/well의 농도로 분주 한 뒤 2일간 배양한 뒤 calf serum 대신 10% FBS가 포함된 배지에 dexamethasone, insulin, 및 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX)가 첨가된 MDI 배지로 교체하였다. 2일 후 insulin이 포함된 배지로 교체하였으며, 다시 2일마다 배지를 교체하며 분화를 유도하였다. 해삼 추출물은 배지 교체 후 30분 뒤에 200μg/ml의 농도로 처리하였다.
(4) Oil Red O 염색
분화가 완료된 3T3-L1 세포를 4% formaldehyde로 1시간 고정시킨 뒤, 0.5% Oil red O 염색 용액을 이용하여 지방을 염색하여 분화 정도를 확인하였다. 지방분화의 정량적인 분석을 위하여 세포에 염색된 염색약을 100% isopropyl alcohol로 녹여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) Quantitative real-time PCR
Primer sequences를 표 2에 나타냈다.
Gene Forward primer (5'→3') Reverse primer (5'→3')
C/EBPα 서열번호 1 서열번호 2
PPARγ 서열번호 3 서열번호 4
FAS 서열번호 5 서열번호 6
aP2 서열번호 7 서열번호 8
β-Actin 서열번호 9 서열번호 10
단해삼 추출물이 지방 분화 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 관련 유전자의 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포를 PBS를 이용하여 걷은 다음 Rneasy Mini kit (Qiagen)을 이용하여 추출하였으며 추출된 RNA는 1μg으로 cDNA (ReverTra Ace qPCR RT Master Mix, FSQ-201, TOYOBO)를 합성하여 SYBR green 방식으로 RT-PCR을 실시하였다. PCR 조건은 pre-denaturation (95℃, 1분), 95℃, 15초, 그리고 60℃, 15초로 40 cycle을 진행하였다. 사용된 primer sequence는 표2와 같다.
(6) Western blotting
해삼 추출물이 지방세포분화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western bolt을 통하여 관련 단백질의 발현을 확인하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포를 PBS로 세척한 다음 RIPA buffer로 lysis한 뒤, SDS-PAGE를 통하여 분자량별로 단백질을 분리하였다. 그 뒤, PVDF membrane에 transfer 하였으며 5% skim milk를 이용하여 30분간 blocking 하였다. 그 후 1차 항체와 반응시킨 뒤, 2차 항체를 붙여 ECL 용액을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.
(7) 통계
결과의 통계 분석은 GraphPad Prism 7 software (San DIego, CA, USA)를 이용하여 실시하였으며 각 그룹간의 유의적인 차이는 One-way ANOVA을 통하여 분석하였다. (p <0.05)
3. 실험 결과
(1) 세포 생존률
3T3-L1 세포의 생존률에 미치는 해삼 추출물의 영향을 알아본 결과 각각의 조건에 따라 추출된 6개의 해삼 추출물 모두 200μg/ml까지 비 처리군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
해삼 추출물 처리 후 3T3-L1 세포의 생존률은 도 1에 나타냈다.
(2) Oil red O 염색 결과
해삼 추출물이 3T3-L1 세포의 지방 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil red O 염색을 통하여 지방 축적 정도를 분석한 결과 해삼 난소 50% 및 80% 에탄올 추출물을 처리한 세포에서 염색된 정도가 감소하여 지방 축적 감소 효과를 나타내었다. 또한 이러한 효과를 정량적으로 나타내기 위하여 세포에 염색된 Oil red O를 100% isopropyl alcohol로 녹여 흡광도를 측정한 결과 해삼 난소 50% 및 80% 에탄올 추출물을 처리한 세포에서 유의적으로 흡광도가 감소하여 지방축적이 감소한 것을 확인 하였다.
즉, 해삼의 다른 장기에 비해 해삼 난소 추출물이 유의한 지방 축적 억제 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
도 2에 해삼 추출물의 지방세포 분화 및 지방 축적 억제 효과를 나타냈다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, 처리군 3 및 4 (난소 추출물)은 처리군 1 및 2에 비해 지방이 덜 축적되어 O.D. 값이 처리군 1 및 2의 거의 절반 수준에 불과하였다.
(3) 지방세포 분화 관련 유전자 및 단백질 분석
지방세포 분화과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 PPARγ, FAS, aP2, C/EBPα의 단백질 및 mRNA 발현에 미치는 해삼 추출물의 효과를 확인해본 결과 이전 실험과 비슷하게 해삼 난소 50% 및 80% 에탄올 추출물을 처리한 세포에서 단백질 발현이 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 또한 mRNA 발현 역시 유의적으로 해삼의 다른 내장 부위에 비해 해삼 난소 50% 및 80% 에탄올 추출물을 처리한 세포에서 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 결과들을 종합해보았을 때, 해삼 추출물은 지방 분화와 관련된 유전자와 단백질의 발현을 조절함으로써 지방분화를 억제하는 것으로 보여진다. 도 3에 해삼 추출물의 지방 분화 관련 유전자 및 단백질 발현 억제 효과 결과를 나타냈다.
각각의 조건에 따라 추출된 해삼 추출물의 지방 분화 억제 효과를 비교해 보았을 때 가장 효과가 좋은 추출조건은 해삼 난소 50% (시료명: SJ-O-D1-50) 또는 80% 에탄올 추출물 (시료명: SJ-O-D1-80)로 확인되었다. 즉, 처리군 3 및 4는 지방분화와 관련된 유전자 발현 억제 효과가 탁월하였다.
Ⅱ. 실험예 2-용매 조건에 따른 추출물의 효과, 분획물의 효과 검증
1. 실험 재료 및 방법
(1) 해삼 시료 준비
　 시료명 추출물 정보
1 SJ-O-D1-30 건조된 난소 30% EtOH, 20배수, 24h 교반, 1차 추출
2 SJ-O-D1-50 건조된 난소 50% EtOH, 20배수, 24h 교반, 1차 추출
3 SJ-O-D1-80 건조된 난소 80% EtOH, 20배수, 24h 교반, 1차 추출
4 SJ-O-D1-H 시료 2의 hexane 분획
5 SJ-O-D1-B 시료 2 BuOH 분획
(2) 시약 및 재료
Ⅰ-2-(1)의 항목과 같이 준비하였다.
(3) 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 지방세포 분화
3T3-L1 세포는 10% calf serum과 penicillin streptomycin glutamin이 첨가된 high glucose DMEM 배지에서 배양하였으며 2-3일 마다 계대배양하였다. 3T3-L1 세포를 6 well plate에 4x105 cells/well의 농도로 분주 한 뒤 2일간 배양한 뒤 calf serum 대신 10% FBS가 포함된 배지에 dexamethasone, insulin, 및 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX)가 첨가된 MDI 배지로 교체하였고 해삼 추출물은 MDI 배지 교체 후 30분 뒤에 처리하였다. 2일 후 insulin이 포함된 배지로 교체하였으며, 다시 2일마다 새로운 배지로 교체하며 분화를 유도하였다.
(4) Oil Red O 염색
분화가 완료된 3T3-L1 세포를 4% formaldehyde로 1시간 고정시킨 뒤, 0.5% Oil red O 염색 용액을 이용하여 지방을 염색하여 분화 정도를 확인하였다. 지방분화의 정량적인 분석을 위하여 세포에 염색된 염색약을 100% isopropyl alcohol로 녹여 500nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) Western blotting
해삼 추출물이 지방세포분화 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western bolt을 통하여 관련 단백질의 발현을 확인하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포를 PBS로 세척한 다음 RIPA buffer로 lysis한 뒤, SDS-PAGE를 통하여 분자량별로 단백질을 분리하였다. 그 뒤, PVDF membrane에 transfer 하였으며 5% skim milk를 이용하여 30분간 blocking 하였다. 그 후 1차 항체와 반응시킨 뒤, 2차 항체를 붙여 ECL 용액을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.
(6) 통계
결과의 통계 분석은 GraphPad Prism 7 software (San DIego, CA, USA)를 이용하여 실시하였으며 각 그룹간의 유의적인 차이는 One-way ANOVA을 통하여 분석하였다. (p <0.05)
2. 실험 결과
(1) 추출물 및 분획물 제조 과정
해삼의 난소를 제외한 내장, 난소를 각각 다음과 같이 추출하여 에탄올 추출물을 얻었다. 건조된 해삼 난소에 30% EtOH, 50% EtOH 또는 80% EtOH을 20배수로 가한 후 24 시간 동안 교반한 후, 동일하게 여과 후 농축하였다.
해삼 난소 추출물의 분획물은 다음과 같은 방법으로 얻었다.
농축된 해삼 난소 추출물에 증류수를 가하여 현탁 시킨 후, 동량의 n-hexane을 가하여 흔든 후 정치 시켰다. 층 분리가 완료된 후, n-hexane 층을 분리하여 농축하였다. 남은 현탁액에 수포화 부탄올을 가하여 흔든 후 충분히 정치 시키고, 층 분리가 완료된 후, 수포화 부탄올 층을 분리하여 농축하였다.
(2) Oil red O 염색 결과
해삼 추출물이 3T3-L1 세포의 지방 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 해삼 추출물을 25와 50 μg/ml (6번 시료 10, 25 μg/ml)의 농도로 분화배지와 함께 48 시간동안 처리하여 실험을 진행하였다. Oil red O 염색을 통하여 지방 축적 정도를 분석한 결과 1번 시료를 제외한 모든 시료에서 유의적인 지방 축적 억제 효과를 나타냈다. (도 4)
(3) 지방세포 분화, 혈중지질, 및 염증 관련 단백질 분석
지방 세포 분화과정에서는 다양한 단백질이 관여하며 이러한 단백질들을 억제하였을 때 지방 분화 및 축적이 억제 된다. 주요한 관련 단백질인 PPARγ, FAS, aP2, C/EBPα의 발현에 미치는 해삼 추출물의 효과를 확인해본 결과 이전 실험과 비슷하게 1번 시료를 제외한 다섯 개의 시료에서 지방 분화 관련 단백질의 발현이 감소된 것을 두 번의 독립적인 실험에서 확인 할 수 있었으며 따라서 이러한 결과들을 종합해보았을 때, 해삼 추출물은 지방 분화와 관련된 단백질의 발현을 억제하며 이러한 억제 효과가 지방 분화 및 축적을 억제하는 것으로 볼 수 있다.
상기 실험을 통해 각각의 조건에서 추출한 해삼추출물의 지방 세포 분화 및 지방 축적을 억제하는 효과를 실험한 결과, 25와 50 μg/ml 농도에서 농도 의존적인 지방 축적 억제 효과를 확인하였다. 이러한 효과는 PPARγ, FAS, aP2, C/EBPα와 같은 지방세포 분화 및 지방축적 관련 단백질의 발현을 억제하여 지방 세포로의 분화 과정을 조절 한 것으로 보이며, 해삼 에탄올 추출물이 유의적인 지방세포 분화 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보여진다. PPARγ 의 경우, 염증성 질환과의 상관관계가 있는 factor이며, FAS의 경우 fatty acid 생합성에 관여하는 효소로 혈중 중성지방의 농도와 SREBP-1(지방과 간조직의 콜레스테롤과 fatty acid 합성 조절 전사인자)를 조절하는 효소로 알려져 있다. 따라서 이들 단백질 발현 억제를 통해 이상지질혈증 및 염증개선 효과를 얻을 수 있다.
Ⅲ. 실험예 3- 해삼 난소 추출물에서 분리된 화합물의 효과
1. 신규 사포닌 5 종 및 기존에 보고되어 있는 사포닌 화합물 3 종의 분리, 구조 동정
하기 방법으로 해삼 난소 추출물의 부탄올 분획물로부터 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9에 해당하는 화합물을 분리하였다. 추출물로부터 활성 성분을 단리하고자 활성유도분획법 (activity guided fractionation)에 따라 분리, 정제를 수행하였다. 해삼 난소의 수포화 부탄올 분획으로부터 활성성분을 분리하고자 각종 column chromatography를 실시하여 8 종의 사포닌 성분을 분리/정제하였다.
분리/정제 방법은 도 6에 나타냈다.
구체적인 분리/정제 방법은 다음과 같다.
1) 위에서 수득한 해삼 난소 부탄올 분획물을 역상컬럼크로마토그래피를 통하여 소분획으로 나누었다.
2) 100% 증류수에서 50% 메탄올로 용출시켜 다당류를 제거하였고, 이후, 60% 메탄올과 70% 메탄올 분획 1과 2를 각각 얻었다.
3) 60% 메탄올 분획은 preparative LC를 통하여 30% ACN으로 용출하여 사포닌 1을 얻었다.
4) 60% 메탄올 분획은 preparative LC를 통하여 30% ACN으로 용출하여 사포닌 1을 얻었다.
5) 70% 메탄올 분획 1은 다시 역상 컬럼크로마토그래피를 통하여 4개의 소분획으로 나누었고, 이 중 1번 소분획을 preparative LC를 통하여 30% ACN으로 용출하여 사포닌 2를 얻었다.
6) 위의 2번 소분획을 preparative LC를 통하여 32% ACN으로 용출하여 사포닌 3과 9를 각각 얻었다.
7) 위의 3번 소분획은 다시 순상 컬럼크로마토그래피를 통하여 MC:MeOH=3:1, 2:1, 1:1 분획으로 나누었고, 이 중 MC:MeOH=2:1 분획은 다시 preparative LC를 통하여 35% ACN으로 용출하여 사포닌 4와 5를 각각 얻었다.
8) 70% 메탄올 분획 2는 다시 순상 컬럼크로마토그래피를 통하여 MC:MeOH=7:1, 5:1. 3:1분획으로 나누었고, 이 중 MC:MeOH=3:1 분획은 다시 preparative LC를 통하여 35%~40% ACN으로 용출하여 사포닌 6와 8을 각각 얻었다.
이 중 각각 saponin-1, 2, 3, 4, 및 9에 해당하는 화학식 S1, S2, S3, S4 및 S9에 해당하는 화합물이 신규 화합물로 확인되었고, Saponin-5, 6, 및 8번은 각각 holotoxin D1, holotoxin B, holotoxin A의 화학구조로 확인되었다.
2. 실험 결과
(1) 세포 생존률
총 8가지의 단일 화합물이 3T3-L1 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 단일 화합물을 2.5 - 5 μg/ml 농도로 처리하여 세포 생존률을 확인한 결과 대다수의 시료에서 유의적인 변화를 나타내지 않은 것을 확인 할 수 있었다. S3, S4, S5의 시료에서 2.5 μg/ml의 농도에서 유의적인 감소를 나타냈으나 약 80% 이상의 세포 생존률을 보였다.
(2) Oil red O 염색 결과
해삼 난소 추출물 내 단일 화합물이 3T3-L1 세포의 지방 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 총 8개의 화합물을 2.5 및 5 μg/ml의 농도로 분화배지와 함께 48 시간동안 처리하였다. 분화 종료 후 Oil red O 염색을 통하여 지방 축적 정도를 분석한 결과 S1, S2의 시료에서는 모든 농도에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나 S3 - S9을 처리하였을 때 2.5, 5 μg/ml의 농도에서 유의적으로 지방 축적이 감소된 것을 확인 할 수 있었다. S3의 시료는 1 μg/ml부터 5μg/ml 까지 약 16, 40, 80% 지방 축적을 억제시켜 농도 의존적으로 지방 분화 억제 효능을 가지는 경향을 보였으며 S4-S8의 시료는 2.5μg/ml에서 분화시키지 않은 세포 수준으로 지방 축적이 억제된 것을 확인 할 수 있었다.
(3) 지방세포 분화 관련 단백질 분석
앞서 살펴본 단일화합물의 지방 축적 억제 효능의 기전을 파악하기 위하여 adipogenesis 관련 단백질인 FAS, PPARγ, C/EBPα, FABP4의 단백질 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 S1, S2 처리 3T3-L1 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 control에 비해 유의적인 단백질 발현 차이가 보여지지 않았으나 S3, S4, S5를 처리한 세포에서는 2,5 μg/ml 처리 세포에서부터 관련 단백질의 발현이 확연히 감소한 것을 확인 할 수 있었으며 1 μg/ml 처리 세포 에서도 control 군에 비하여 확연히 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 다음으로 S6, S8, S9를 처리한 세포에서의 단백질 발현을 확인해본 결과 control군에 비해 S6과 S8에서 확연한 단백질 발현의 감소를 확인 할 수 있었다. 따라서 이러한 결과들을 종합해보았을 때 단일 화합물 S3-6, S8가 adipogenesis 관련 단백질의 발현의 억제를 통하여 지방세포 분화 및 지방 축적을 억제하는 것으로 보여진다.
이번 실험을 통하여 해삼 난소 추출물 내 단일화합물의 지방 세포 분화 및 지방 축적 억제 효과를 확인하였다. 이전 추출물의 실험 결과와 같이 adipogenesis 관련 단백질인 FAS, PPARγ, C/EBPα, FABP4의 발현을 유의적으로 감소시켰으며 이러한 단백질 억제를 통하여 지방세포 분화를 억제하는 것으로 보여진다.
<NMR data>
하기 표 4 내지 9는 해삼 난소 추출물에서 분리한 화합물 중 S1-S4 및 S9들의 13C and 1H NMR chemical shifts 결과를 보여준다. 이를 통해 S1-S4 및 S9는 새롭게 분리한 사포닌 화합물임을 확인하였다.
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Figure PCTKR2021018696-appb-img-000015
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000016
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000017
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000018
Figure PCTKR2021018696-appb-img-000019
a) Measured at 200 MHz in C5D5N/D2O, b) Measured at 800 MHz in C5D5N/D2O.
상기 NMR 데이터를 통해, S1-S4 및 S9는 신규 사포닌 화합물임을 확인하였다.
Ⅳ. 실험예 4- 해삼 난소 추출물의 항당뇨 효과 확인
1. 실험 재료 및 방법
(1) 시약 및 재료
3T3-L1 cells (ATCC, CL-173), DMEM high glucose (Welgene), Fetal bovine serum (MPBio), penicillin-streptomycin (Welgene), Dulbecco’s phosphate-buffered saline (Welgene), Trypsin-EDTA (Welgene), Bovine calf serum (Welgene), Glucose Uptake-Glo Assay Kit (Promega)
(2) 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 지방세포 분화
3T3-L1 세포는 10% Calf serum과 penicillin-streptomycin이 첨가된 high glucose DMEM 배지에서 배양하였으며 2-3일 마다 계대배양하였다. 3T3-L1 세포를 96well plate에 2x104 cells/well의 농도로 분주 한 뒤 3일간 배양한 뒤 calf serum 대신 10% FBS가 포함된 배지에 dexamethasone, insulin 및 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX)가 첨가된 MDI배지로 교체하였다. 2일 후 insulin이포함된 배지로 교체하였으며, 다시 2일마다 배지를 교체하며 분화를 유도하였다.
(3) Glucose Uptake-Glo Assay
분화가 완료된 3T3-L1 세포는 16시간 stavation 진행한 뒤 serum이 없는 배지에 해삼 추출물을 25, 50ug/mL의 농도로 6시간 처리하였다. 배양 상등액을 회수하고 3T3-L1 세포에 Glucose Uptake-Glo Assay Kit를 이용하여 포도당 수송 활성 정도를 Luminometer를 사용하여 측정하였다.
2. 실험결과
(1) 해삼 난소 추출물의 세포로 포도당의 흡수(muscle glucose uptake) 정도 확인 결과
도 10에서 확인할 수 있듯이, 해삼 난소 추출물의 세포 내 포도당 흡수율이 현저히 우수하다. 도 10은 해삼 난소 추출물과 해삼의 난소를 제외한 내장 추출물의 포도당 흡수율을 확인한 결과이다. 도 11은 해삼 난소 추출물의 추출 조건별 포도당 흡수율을 확인한 결과이다. 모든 농도에서 대조군 대비 포도당 흡수율이 우수하였다. 특히, 기존에 당뇨치료제로 이용되는 Rosiglitazone 보다 더 증가된 포도당 흡수 효율을 가지는 것으로 확인되어, 해삼 난소 추출물이 뛰어난 항당뇨 효과가 있음을 알 수 있었다.
아래 표 10에서 확인할 수 있듯이, 해삼 난소 추출물은 미처리 군 대비 포도당 흡수율이 증가되었고, 특히 Rosiglitazone이 1.24배 증가하는 것에 비해 해삼 난소 추출물은 전 농도에서 훨씬 더 높은 수준의 흡수율 (1.29배, 1.43배, 1.35배)을 보였다.
Sample Fold change
Rosiglitazone (Ref.) 1.24
30% EtOH ~1.29
50% EtOH ~1.43
80% EtOH ~1.35
상기 결과를 통해 해삼 난소의 추출물 처리로 인해 증가된 포도당 흡수 효율을 갖는다는 점을 확인하였다.
Ⅴ. 실험예 5-해삼 난소 추출물에서 분리된 사포닌 화합물들의 항당뇨 효과 확인
1. 실험방법
(1) 시약 및 재료
Ⅳ-1-(1)의 항목과 같이 준비하였다.
(2) 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 지방세포 분화
3T3-L1 세포는 10% Calf serum과 penicillin-streptomycin이 첨가된 high glucose DMEM 배지에서 배양하였으며 2-3일 마다 계대배양하였다. 3T3-L1 세포를 96well plate에 2x104 cells/well의 농도로 분주 한 뒤 3일간 배양한 뒤 calf serum 대신 10% FBS가 포함된 배지에 dexamethasone, insulin 및 3-isobuty-1-methylxanthine (IBMX)가 첨가된 MDI배지로 교체하였다. 2일 후 insulin이포함된 배지로 교체하였으며, 다시 2일마다 배지를 교체하며 분화를 유도하였다.
(3) Glucose Uptake-Glo Assay
분화가 완료된 3T3-L1 세포는 16시간 stavation 진행한 뒤 serum이 없는 배지에 해삼 유래 단일화합물을 2.5ug/mL의 농도로 6시간 처리하였다. 배양 상등액을 회수하고 3T3-L1 세포에 Glucose Uptake-Glo Assay Kit를 이용하여 포도당 수송 활성 정도를 Luminometer를 사용하여 측정하였다.
앞서 얻어진 사포닌 화합물들을 대상으로 항당뇨 효과를 확인하였다.
2. 실험 결과
도 12는 해삼의 난소 추출물에서 분리된 사포닌 화합물들의 포도당 흡수율을 확인한 결과이다. 도 12에서 확인할 수 있듯이, 미처리군의 포도당 흡수율을 100%로 봤을 때, 모든 화합물들이 100% 이상의 흡수율을 보였다. 이러한 결과를 통해 분리된 화합물들은 미처리군에 비해 포도당 흡수율을 증가시킨다는 것을 알 수 있었고, 각각 항당뇨 효과가 있음을 알 수 있었다.
아래 표 11은 대조군 대비 포도당 흡수율 정도를 나타낸, fold change 값이다. Rosiglitazone과 유사한 수준의 포도당 흡수율을 보이기도 하였다.
Sample Fold Relative to Control
Rosiglitazone (Ref.) 1.49
S1 1.25
S2 1.43
S3 1.1
S4 1.6
S5 1.38
S6 1.24
S8 1.43
S9 1.03
Ⅵ. 실험예 6-해삼 난소 추출물의 in vivo 실험
[체중 감소 효과 (항비만 용도)]
1. 실험방법
(1) 실험 동물군 정보
C57BL/6 male mouse (5주령), 군당 각 10마리씩 총 50마리를 대상으로 실험을 수행하였다. Normal diet 군을 제외한 나머지 군들은 모두 고지방식이를 급여하였다.
1) Normal (Normal diet group)
2) HFD (High fat diet group)
3) HFD + 0.05% 해삼난소추출물(SCOE)
4) HFD + 0.1% 해삼난소추출물(SCOE)
5) HFD + 0.2% 해삼난소추출물(SCOE)
(2) 사육조건
추출물은 사료를 조제하여 식이를 통해 급여하였으며, 8주 동안 실험을 진행하였다. 체중은 주 1회 측정하였고, 주 3회 식이섭취량을 측정하였다.
2. 실험결과
도 13 및 14는 고열량 식이 섭취 쥐의 체중변화 및 최종 확인된 체중을 관찰한 결과이다. 도 13을 통해 해삼 난소 추출물 (50% 에탄올)을 처리한 군은 8주까지 확인한 결과 체중증가율이 미처리군에 비해 훨씬 감소한 것을 알 수 있었다. 도 14를 통해 확인된 바와 같이, HFD로 표시된 해삼난소 추출물 미처리군과 비교했을 때, 최종 체중이 감소한 것을 알 수 있었다.
[white adipose tissue 감소 효과 (항비만 용도)]
1. 실험방법
(1) 지방조직의 H&E stain
Hematoxilin은 염기성/양이온성 물질로 핵(음이온)을 어두운 파랑이나 보라색으로 염색시키고, eosin은 산성/음이온성 물질로 세포질(양이온)을 빨간색이나 분홍색으로 염색시키는 물질이다.
H&E staining의 과정은 다음과 같다.
Dewaxing → dehydration → hematoxylin → differentiation → blueing → eosin → dehydration → clearing → cover-slipping
(2) 지방조직 중에서 백색지방은 비만 및 과체중과 관련되어있으며, 본 실험에서는 H&E 염색으로 부고환백색지방의 lipid accumulation을 조직학적으로 분석하여 white adipose tissue의 조직 크기를 확인하였다.
2. 결과
도 15는 H&E stain을 통해 확인된 백색지방세포 크기 변화 결과이다.
고열량식이가 투여되는 경우 (HFD), 비만과 연관된 백색지방세포 크기가 현저히 커졌고, 여기에 해삼 난소 추출물이 투여되는 경우(HFD+SOCE 0.05%, HFD+SOCE 0.1%, HFD+SOCE 0.2%), 지방세포 크기가 현저히 감소된 것으로 확인되었다. 이를 통해 해삼 난소 추출물 처리에 의해 지방세포 크기 감소, 항비만효과 등을 얻을 수 있음을 확인하였다.
[혈중 총 콜레스테롤 및 중성지방 감소 확인 (고지혈증, 대사증후군 개선)]
1. 실험방법
(1) 혈중 총 콜레스테롤 대비 High-density lipoprotein 함량(HDL/TC)
혈액 검체 200μl에 침강시약 200μl 넣은 후, 잘 혼합하여 실온에서 5분 방치한다. 5분 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하고, 원심분리한 상청액 100μl에 효소용액 3ml씩 넣고 혼합한다. 37℃ 항온수조에서 5분간 반응시킨다. 맹검을 대조로 500nm 파장에서 흡광도를 측정한다.
HDL-C(mg/dl) = (검체의 흡광도/표준의 흡광도) x 100(mg/dl)
(2) 혈중 TC (Total cholesterol)
맹검용/표준용/검체용 시험관을 각각 준비한다. 혈액 검체 20μl에 효소용액 3ml씩 넣고 잘 혼합한다. 37℃ water bath 에서 5분간 반응시킨다. 맹검을 대조로 505nm 파장에서 표준 및 검체의 흡광도를 측정한다.
총 콜레스테롤(mg/dl) = (검체의 흡광도/표준의 흡광도) x 표준액의 농도
(3) 혈중 TG (Total glyceride)
맹검용/표준용/검체용 시험관을 각각 준비한다. 혈액 검체 20μl에 효소용액 3ml씩 넣고 잘 혼합한다. 37℃ water bath 에서 5분간 반응한다. 맹검을 대조로 550nm 파장에서 표준 및 검체의 흡광도를 측정한다.
중성지방량(mg/dl) = (검체의 흡광도/표준의 흡광도) x 300(mg/dl)
(표준액의 중성지방량: 300mg/dl)
2. 결과
도 16 내지 18은 각각 총 콜레스테롤 대비 HDL 함량을 표시한 결과, 총 콜레스테롤의 감소효과 확인 결과, 중성지방의 감소효과 확인 결과를 보여준다. 이들 결과를 통해 해삼난소 추출물 처리군은 혈중 콜레스테롤 및 중성지방의 레벨이 감소 효과를 보인다는 것을 확인했다. 특히, 여기서 주목할 점은 총 콜레스테롤 수치가 감소하였음에도 불구하고 HDL 수치는 증가하였다는 점에 있다. 이러한 결과를 통해 이상지질혈증 치료에 효과를 보인다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 추출물을 이용하여 염증 조절, 특히 염증성장질환 및/또는 류머티스 관절염에 관여하는 것으로 알려진 PPARγ 발현을 확인한 결과, 고열량 식이 대비 PPARγ 감소 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 도 19에서 확인할 수 있다. 이를 통해 해삼 난소 추출물은 염증 억제 효과도 얻을 수 있음을 확인했다.
본 발명은 해삼 난소 추출물을 포함하는 체중 감소용 조성물, 비만 억제용 조성물, 항당뇨 조성물, 항염증용 조성물, 이상지질혈증 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 체중 감소 방법, 비만 억제 방법, 당뇨 치료 또는 개선 방법, 염증 치료 또는 개선 방법, 이상지질혈증 치료 또는 개선 방법을 제공할 수 있다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 S1, S2, S3, S4 또는 S9로 표시되는 화합물.
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000020
    <화학식 S1>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000021
    <화학식 S2>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000022
    <화학식 S3>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000023
    <화학식 S4>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000024
    <화학식 S9>
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 해삼의 난소로부터 추출 또는 분리된 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 해삼의 생식선 추출물, 또는 해삼의 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물을 유효성분으로 포함하는, 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 해삼의 생식선은 해삼의 난소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물은 해삼 생식선을 45 내지 85%(V/V) 에탄올 수용액을 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물은 해삼 생식선을 48 내지 55%(V/V) 에탄올 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물은 해삼 생식선을 48 내지 55%(V/V) 에탄올 수용액으로 추출한 추출물을 부탄올을 용매로 하여 분획한 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 사포닌 화합물은 하기 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는, 조성물.
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000025
    <화학식 S1>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000026
    <화학식 S2>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000027
    <화학식 S3>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000028
    <화학식 S4>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000029
    <화학식 S5>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000030
    <화학식 S6>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000031
    <화학식 S8>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000032
    <화학식 S9>
  9. 제3항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물, 또는 해삼 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물은 PPARγ, FAS, aP2, 및 C/EBPα로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제3항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물, 또는 해삼 생식선으로부터 유래된 사포닌 화합물은 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제하거나, 세포 내 지방축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 하기 화학식 S1, S2, S3, S4, S5, S6, S8 및 S9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 사포닌 화합물을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 해삼 생식선 추출물의 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 효과를 개선하는 방법.
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000033
    <화학식 S1>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000034
    <화학식 S2>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000035
    <화학식 S3>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000036
    <화학식 S4>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000037
    <화학식 S5>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000038
    <화학식 S6>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000039
    <화학식 S8>
    Figure PCTKR2021018696-appb-img-000040
    <화학식 S9>
  12. 제11항에 있어서, 상기 해삼 생식선 추출물은 해삼 난소 추출물인 것을 특징으로 하는 해삼 생식선 추출물의 비만, 염증, 당뇨병, 및 이상지질혈증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 효과를 개선하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방법은 해삼 난소를 48 내지 55%(V/V) 에탄올 수용액으로 추출하고, 추출물로부터 부탄올 분획을 획득하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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