CN116829568A - 包含海参生殖腺提取物、来源于海参卵巢提取物的化合物的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了海参生殖腺提取物，优选从卵巢提取物中分离的新的皂苷化合物，以及海参生殖腺提取物或从海参生殖腺提取物中分离的化合物的新的用途。海参生殖腺(优选卵巢)提取物或从海参生殖腺(优选卵巢)提取物中分离的化合物具有治疗或预防选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的一种或更多种疾病的作用。

Description

包含海参生殖腺提取物、来源于海参卵巢提取物的化合物的 组合物及其用途
技术领域
本申请要求于2020年12月10日提交的韩国专利申请No.10-2020-0172701的优先权，并且相应申请的说明书和附图中公开的全部内容并入到本申请中。本发明涉及海参生殖腺提取物的新的用途，优选地海参生殖腺提取物用于抗肥胖、抗糖尿病、改善血脂异常和/或改善炎性疾病的用途，并且涉及从海参生殖腺提取物中分离的新化合物，或者所述化合物的用途，优选地用于抗肥胖、抗糖尿病、改善血脂异常和/或改善炎性疾病的用途。
背景技术
海参(sea cucumber，学名Stichopus japonicus)是一种传统的海产品，在亚洲国家，特别是中国、日本和韩国用作重要的食品成分。从海参中分离出了许多生物活性物质。特别地，胶原肽、多糖等公知表现出多种生物活性。海参的卵巢称为Haeseoja，并且以佳肴著称。
另一方面，在脂肪细胞中，脂质代谢通过脂解(lipolysis)和脂肪生成(adipogenesis)发生，并且在脂肪合成期间，前脂肪细胞(preadipocyte)通过增殖和分化过程分化为成熟脂肪细胞(adipocyte)，并且最终，脂肪在细胞中积累。已报道了PPARγ(peroxisome proliferator activated receptorγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)和C/EBPα(CCAAT enhancer binding proteinα，CCAAT增强子结合蛋白α)等作为诱导脂肪细胞分化过程的转录因子(transcription factors)。所述转录因子在脂肪细胞分化过程期间的每个不同时间点诱导表达，通过彼此的相互作用调节脂肪细胞特异性基因表达，并逐渐诱导脂肪代谢的激活和脂肪细胞的分化。已知它们参与脂肪形成(lipogenesis)和脂肪生成(adipogenesis)，其引起肥胖。
血脂异常是包括高脂血症、高胆固醇血症和高甘油三酯血症的疾病名称。这是血液中总胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯提高的状态或血液中HDL胆固醇降低的状态。当通过血液测试发现那些异常中的任一种在总胆固醇200mg/dL或更低、LDL胆固醇130mg/dL或更低、HDL胆固醇60mg/dL或更高以及甘油三酯150mg/dL或更低的标准中时，诊断为血脂异常。血脂异常的诊断是根据普遍接受的U.S.NCEP(National Cholesterol EducationProgram，国家胆固醇教育计划)，通过脂质指标例如总胆固醇(total cholesterol)、低密度脂蛋白(LDL，low density lipoprotein)胆固醇、高密度脂蛋白(HDL，high densitylipoprotein)胆固醇、甘油三酯(triglyceride)等进行诊断的。
2型糖尿病是一种代谢性疾病，其特征在于胰岛素抵抗和胰腺β细胞的功能障碍以及由此引起的血糖提高，并且所述疾病的发生显示出复杂的遗传倾向。已有数项研究结果报道，许多基因的多态性涉及2型糖尿病的发生。特别地，PPARγ(peroxisomeproliferator-activated receptor-gamma，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ)基因是认为与胰岛素抵抗有关系的基因。PPARγ对脂肪细胞具有特异性并参与脂肪细胞分化和脂肪酸代谢，并且是针对糖尿病的治疗剂，噻唑烷二酮已知为其配体，因此其已被指出可以是与2型糖尿病和肥胖有关的致病基因。
特别地，脂质活化转录因子PPARγ在免疫系统中具有多种功能，并且已知炎症响应和抗炎响应可通过抑制该转录因子来调节，并且已知其通过该抑制来参与炎性肠病或类风湿性关节炎的治疗(PPARγin immunity and inflammation:cell types anddiseases,Biochimica et Biophysica Acta1771(2007)1014-1030)。
然而，关于对抗肥胖、预防或治疗糖尿病或血脂异常、或改善或治疗炎症具有优异作用并且安全的物质的报道仍然不足。
发明内容
技术问题
因此，本发明要解决的问题之一是提供从海参中分离的新化合物，特别是皂苷化合物。本发明要解决的问题之一是提供海参生殖腺提取物(优选卵巢提取物)和来源于所述提取物的皂苷化合物用于预防或治疗疾病，例如抗肥胖、抗糖尿病、改善血脂异常和/或改善炎性疾病的新的用途。另外，提供了用于治疗或预防肥胖、糖尿病或炎性疾病的组合物，所述组合物包含海参生殖腺提取物或来源于所述提取物的皂苷化合物。
技术解决方案
为了解决上述问题，本发明提供了由以下化学式S1、S2、S3、S4或S9表示的新的化合物：
<化学式S1>
<化学式S2>
<化学式S3>
<化学式S4>
<化学式S9>。
所述化合物可来源于自然，并且也可通过化学合成方法合成，并且获得所述化合物的方法不受特别限制。在本发明的一个实例中，所述化合物可从海参生殖腺中提取或分离，并且优选地，其可从海参卵巢中提取或分离。
本发明的另一个实例提供了用于预防或治疗选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病的组合物，所述组合物包含海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物。优选地，糖尿病可以是2型糖尿病。
海参卵巢提取物意指用溶剂提取的海参生殖器官，即卵巢。已知随着海参生殖腺成熟，睾丸变为乳白色，并且卵巢变为红色。本发明可使用海参生殖腺(优选卵巢)的提取物。作为溶剂，可使用水、C1至C4低级醇、或其混合溶剂，并且优选地，优选使用乙醇或乙醇水溶液。特别地，当使用溶剂时，活性成分提取产率是优异的，并且有利于实现本发明的目的。本发明的提取物可根据使用普通动物作为提取对象的提取物的制备方法来制备，并且具体地，可以是冷吸提取法浸渍提取法或热提取法等，并且可使用普通提取装置、声提取器、或分离器。优选地，海参生殖腺提取物，优选卵巢提取物可用45％至85％(V/V)乙醇水溶液作为溶剂来提取，并且更优选地，海参卵巢可用48％至55％(V/V)乙醇水溶液作为溶剂或者用75％至83％(V/V)乙醇水溶液作为溶剂来提取。当使用所述溶剂时，可有利于实现本发明的目的。
在另一个实例中，海参生殖腺(优选卵巢)可经历对提取物进行分级(fractionize)的过程，并且由此获得的海参卵巢级分可包括在本发明的范围内。优选地，用乙醇水溶液提取的海参卵巢提取物可被分级，并且优选地，乙醇水溶液可以是45％至85％(V/V)乙醇水溶液。所述级分可优选地是用丁醇作为溶剂分级的海参卵巢提取物。在将海参卵巢提取物混悬在蒸馏水等中之后，可使用分液漏斗通过己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇、水或其组合获得所述级分，并且优选地，根据本发明的目的，海参卵巢提取物可用丁醇分级。可通过本领域常用的分级方法进行分级。
在所制备的提取物或级分(其通过进行分级过程而获得)中，可通过进行随后的过滤或浓缩或干燥过程去除溶剂，并且过滤、浓缩和干燥可全部进行。具体地，过滤可以使用滤纸，或使用减压过滤器；并且浓缩可使用减压浓缩器，例如旋转蒸发器进行减压浓缩；并且干燥可通过例如冻干法进行。
所述提取物或级分可具有优异的减轻体重的作用，并且可具有脂肪细胞分化的抑制活性，并且可具有改善炎症的优异作用，并且可具有降低胆固醇的优异作用，并且可具有治疗或改善糖尿病的作用。
在本发明的一个实例中，海参生殖腺(优选卵巢)提取物包括选自以下化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9中的任意一种或更多种，优选地，选自S3、S4、S5、S6和S8中的任意一种或更多种皂苷化合物。优选地，从海参卵巢提取物中分离的以下化合物可具有治疗或预防选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任意一种或更多种疾病的作用。
<化学式S1>
<化学式S2>
<化学式S3>
<化学式S4>
<化学式S5>
<化学式S6>
<化学式S8>
<化学式S9>
海参生殖腺(优选卵巢)提取物，或来源于海参卵巢的皂苷化合物，可抑制选自以下中的任意一种或更多种蛋白的表达：PPARγ(Peroxisome proliferation activatedreceptor-γ，过氧化物酶体增殖激活受体-γ)、FAS(FS-7-associated surface antigen，FS-7相关表面抗原)、aP2(Adipocyte protein 2，脂肪细胞蛋白2)和C/ebpα(CCAAT/Enhancer-binding Proteinα，CCAAT/增强子结合蛋白α)。
海参生殖腺(优选卵巢)提取物，或来自海参卵巢的皂苷化合物，可抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，或抑制胞内脂肪积累。另外，其可具有抑制糖尿病的作用。
海参生殖腺(优选卵巢)提取物，或来源于海参卵巢的皂苷化合物，可用作用于体重减轻、降低血液中的异常脂质、缓解对象的脂质代谢异常的用途，用于抑制或改善炎症的用途，或者用于治疗或改善糖尿病的用途。
本发明的一个实例可提供通过海参生殖腺(优选卵巢)的提取物或来源于海参卵巢的皂苷化合物的处理用于抑制、改善或减轻对象的体内脂肪积累、或者降低体重或降低血液中的异常脂质、或者抑制体内脂肪积累的方法，用于改善或抑制炎症的方法，或者用于治疗或改善糖尿病的方法。
本发明的一个实例可提供用于制备以下组合物的方法：用于抑制对象的体内脂肪积累的组合物、用于治疗或改善对象的血脂异常的组合物、用于治疗或改善对象的炎症相关疾病的组合物、或者用于治疗或改善糖尿病的组合物，所述方法包括以下步骤。
S1)从海参中分离出生殖腺，优选卵巢；
S2)用溶剂，优选乙醇溶剂，更优选45％至85％(V/V)乙醇水溶液溶剂处理在步骤S1)中分离的海参生殖腺；
S3)用溶剂处理海参的生殖腺之后，在室温下搅拌24小时；以及
S4)通过减压浓缩过滤之后的经过滤溶液获得海参提取物。
本发明的一个实施方案可提供用于改善或治疗肥胖的食品或药物、用于改善或治疗糖尿病(特别是2型糖尿病)的食品或药物、用于改善或治疗血脂异常(例如高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症)的食品或药物、或者用于改善或治疗炎症(例如，炎性肠病、类风湿性关节炎)的食品或药物，所述食品或药物包含本文中公开的海参生殖腺提取物。
在不限制本发明目的的范围内，所述食品或药物可包含本领域常用的赋形剂、添加剂等而不受限制。
本发明的一个实施方案可提供在有此需要的对象中通过海参卵巢提取物的处理用于抑制选自PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα中的任意一种或更多种蛋白质的表达的方法。
根据本发明的一个实例的组合物可用于本发明的海参生殖腺(优选卵巢)提取物或来源于海参生殖腺(优选卵巢)的皂苷化合物用于治疗、预防和/或改善选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任意一种或更多种疾病的新的用途可应用而不受限制的任何领域，并且优选地，所述组合物可以以药物组合物或食品组合物的形式提供。优选地，所述食品组合物可作为健康功能性食品组合物提供。
当将本发明的组合物制备为药物组合物时，本发明的药物组合物包含可药用载体。包含在本发明的药物组合物中的可药用载体是在配制期间常用的载体，并且包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等但不限于此。除了上述组分之外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。药物载体是一个非限制性实例，并且不限于上述种类。本发明的药物组合物可经口或胃肠外施用，并且优选地，其可通过经口施用方法来施加。本发明药物组合物的合适剂量可由因素例如制备方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、病态食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性来不同地开出。以一个成人为标准，药物组合物的优选剂量可在0.001至100mg/kg的范围内。本发明的药物组合物可通过使用可药用载体和/或赋形剂根据本发明所属领域的技术人员容易实施的方法进行配制，而以单位剂量的形式制备，或者通过插入多剂量容器中来制备。然后，制剂可以以在油或水性介质中的溶液剂、混悬剂、糖浆剂或乳液剂的形式，或者可以以提取物、散剂、干粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式，并且还可包含分散剂或稳定剂。
当将本发明的组合物制备为食品组合物时，其包含在食品制备期间通常添加的组分，并且例如，其包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养物、调味剂和矫味剂。上述碳水化合物的实例是单糖，例如，葡萄糖、果糖等；二糖，例如，麦芽糖、蔗糖、低聚糖等；和多糖，例如，普通糖例如糊精、环糊精等，以及糖醇例如木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等。关于矫味剂，可使用天然矫味剂例如甜叶菊提取物，或合成矫味剂例如糖精等。
本发明的一个实例提供了通过提高选自化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9中的任意一种或更多种皂苷化合物优选地选自S3、S4、S5、S6和S8中的任意一种或更多种皂苷化合物来改善海参生殖腺(优选卵巢)提取物的预防或治疗选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中任意一种或更多种疾病的作用的方法。可使用用于获得本发明中提及的皂苷化合物的所有方法，并且优选地，关于所述方法，可使用用乙醇水溶液提取海参生殖腺(优选卵巢)并从提取物中获得丁醇级分的方法，并且优选地，可使用用45％至85％(V/V)乙醇水溶液提取海参生殖腺(优选卵巢)并从提取物中进行丁醇分级的方法。
本发明的一个实施方案提供了用于治疗或改善选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病的方法，所述方法包括将有效治疗量的海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物施用到有此需要的对象中。应当理解，本文提及的来源于海参生殖腺的皂苷化合物包含选自化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9中的任意一种或更多种。另一些实施方案可提供用于治疗或改善选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病的方法，所述方法在有此需要的对象中提高了海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物。另一些实施方案可提供用于治疗或改善选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病的组合物，所述组合物包含海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物和可药用载体。另一些实施方案可提供海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物用于治疗或改善选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病的用途。另一些实施方案可提供用于抑制选自PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα中的任意一种或更多种蛋白在体内的表达的方法，所述方法包括将有效治疗量的海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物施用到有此需要的对象中。
有利作用
本发明提供了常规上未知的新的皂苷化合物。
本发明提出了海参生殖腺(优选卵巢)提取物或从其中分离的皂苷化合物的新用途。通过本发明，已经确认与海参的其他部分相比，海参生殖腺(优选卵巢)提取物的抗肥胖作用，减轻体重的作用，治疗或改善糖尿病的作用，抗炎作用，预防、改善或治疗血脂异常的作用等是优异的。通过本发明，可获得预防、改善或治疗选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的一种或更多种疾病的作用。
附图说明
在本说明书中所附的以下附图说明了本发明的优选实例，并且通过上述本发明的内容发挥理解本发明的技术精神的作用，因此本发明不应被解释为仅限于这样的附图中所描述的内容。
图1是通过改变针对3T3-L1细胞的乙醇浓度来确认在对从海参卵巢提取物和除卵巢之外的内脏器官获得的提取物进行处理之后细胞的细胞生存力的结果。
图2a是示出海参提取物抑制脂肪细胞分化和脂肪积累的作用的图。图2b示出了样品1至4处理之后确认的O.D.值。
图3示出了通过海参提取物的一部分和浓度，分析脂肪细胞分化相关基因和蛋白的结果。图3a是示出蛋白质表达程度的结果，并且图3b的图是确认海参提取物对mRNA表达的作用的结果。
图4a是示出海参提取物的脂肪细胞分化的照片，图4b是示出抑制脂肪积累(25、50μg/ml)的作用的图。
图5是确认海参提取物对参与脂肪细胞分化过程的蛋白PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα表达的作用的结果。确认了海参卵巢提取物抑制这些蛋白。
图6示出了如图通过对海参卵巢提取物进行提取和分级来分离化合物的过程。
图7示出了从海参卵巢提取物中分离的化合物对3T3-L1细胞生存力的作用。
图8的(a)示出了3T3-L1细胞完成脂肪分化之后，通过油红O染色来分析从海参卵巢提取物中分离的化合物的脂肪积累程度的结果。(b)示出了经分化的3T3-L1细胞；并且(c)示出了在500nm下测得的油红O的光密度(OD)。所述化合物分别以2.5、5μg/ml的浓度处理。
数据以平均值±标准差(SD)表示。与分化的对照组(MDI)相比，*、**和***分别表示p<0.05、0.01和0.001。
图9示出了分别用S1至S6、S8至S9化合物处理时，经分化的3T3-L1细胞的脂肪生成相关蛋白的水平。
图10是确认海参卵巢提取物和海参除卵巢之外的内脏器官提取物的葡萄糖摄取的结果。
图11是确认在海参卵巢提取物的提取条件下葡萄糖摄取的结果。
图12是确认从海参的卵巢提取物中分离的皂苷化合物的葡萄糖摄取的结果。
图13是观察体重变化的结果。
图14示出了在高卡路里饮食摄入的情况下提取物处理之后确认的最终体重。
图15是通过H&E染色确认的白色脂肪细胞尺寸变化的结果。
图16是表示HDL含量相对于总胆固醇的结果。
图17是确认降低总胆固醇的作用的结果。
图18示出确认降低甘油三酯的作用的结果。
图19是确认提取物处理组的降低PPARγ表达的作用的结果。
发明模式
在下文中，为了帮助理解本发明，将通过实施例等详细描述本发明。然而，根据本发明的实施例可被修改为多种其他形式，并且本发明的范围不应被解释为受以下实施例限制。提供本发明的实施例以向本发明所属领域的技术人员更完整地描述本发明。
I.实验例1-海参部分提取物的作用的确认
1.样品提取
(1)提取部分和溶剂浓度
[表1]
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将海参分为卵巢和除卵巢之外的肠器官，并提取它们。将50％乙醇和80％乙醇各自添加至干燥状态的海参卵巢和肠器官20次，并在室温下搅拌24小时以进行提取。在此之后，通过过滤和减压浓缩的过程，获得海参卵巢和肠器官提取物。
2.海参提取物对脂肪细胞分化的抑制能力的评价
(1)实验材料和方法
试剂和材料如下。
3T3-L1细胞(ATCC,CL-173)，DMEM高葡萄糖(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco)，磷酸盐缓冲盐水(Gibco)，放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Thermo scientific)，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo scientific)，PVDF膜(Bio-rad)，一抗(PPARγ(Santa cruz))，C/EBPα(cell signaling)，FAS(cellsignaling)，aP2(cell signaling)，β-肌动蛋白(Santa-cruz)，油红O粉末(sigma)和MTT粉末(sigma)。
(2)细胞生存力的测量
将3T3-L1细胞以1×104个细胞/孔的浓度等分到96孔板中并培养一天，并随后用6种提取物以100至200μg/ml的浓度进行处理。24小时之后，将MTT粉末以5mg/ml的浓度溶解在PBS中，并随后过滤，各等分20μl的细胞，并培养2小时。撇清(skim)培养基之后，等分200μl的DMSO，并随后在570nm下测量吸光度以测量细胞生存力。
(3)3T3-L1前脂肪细胞的培养和脂肪细胞的分化
将3T3-L1细胞在添加了10％小牛血清和青霉素链霉素谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM培养基中培养，并每2至3天传代培养。将3T3-L1细胞以4×105个细胞/孔的浓度等分到96孔板中并随后培养它们，2天之后，更换为MDI培养基，其中地塞米松(dexamethasone)、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)被添加至包含10％ FBS而不是小牛血清的培养基中。2天之后，将其更换为包含胰岛素的培养基，并将该培养基每2天再次更换并诱导分化。更换培养基之后，海参提取物以200μg/ml的浓度处理30分钟。
(4)油红O染色
将完成分化的3T3-L1细胞用4％甲醛固定1小时，并随后使用0.5％油红O染色溶液对脂肪进行染色以确认分化程度。对于脂肪分化的定量分析，用100％异丙醇溶解细胞中染色的染料，并在500nm下测量吸光度。
(5)定量实时PCR
引物序列如表2所示。
[表2]
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为了研究海参提取物对脂肪分化相关基因的表达的作用，使用qRT-PCR确认相关基因的mRNA表达程度。使用PBS撇清分化完成的3T3-L1细胞，并随后使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen)进行提取，并通过SYBR green法通过用1μg所提取的RNA合成cDNA(ReverTraAce qPCR RT Master Mix,FSQ-201,TOYOBO)进行RT-PCR。在预变性(95℃，1分钟)、95℃15秒和60℃15秒的40个循环的PCR条件下进行。所使用的引物序列如表2。
(6)Western印迹
为了研究海参提取物对脂肪细胞分化相关蛋白表达的作用，通过Western印迹确认相关蛋白的表达。将分化完成的3T3-L1细胞用PBS洗涤，并随后将它们用RIPA缓冲液裂解，并随后通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白。在此之后，将它们转移至PVDF膜，并使用5％脱脂乳进行封闭30分钟。然后，在与一抗反应后，附着二抗，并使用ECL溶液确认蛋白质表达。
(7)统计学
使用GraphPad Prism 7软件(San DIego,CA,USA)对结果进行统计分析，并通过单因素ANOVA分析各组之间的显著差异。(p<0.05)
3.实验结果
(1)细胞生存力
作为研究海参提取物对3T3-L1细胞生存力作用的结果，根据每种条件，所有6种提取的海参提取物在最高至200μg/ml时都没有显示出与非处理组的显著差异。
在海参提取物处理之后，3T3-L1细胞的生存力在图1中示出。
(2)油红O染色结果
为了研究海参提取物对3T3-L1细胞脂肪分化的影响，作为通过油红O染色分析脂肪积累程度的结果，在用海参卵巢50％和80％乙醇提取物处理的细胞中，染色程度降低，并且显示出降低脂肪积累的作用。另外，为了定量表示这种作用，作为通过用100％异丙醇溶解细胞中染色的油红O来测量吸光度的结果，在用海参卵巢50％和80％乙醇提取物处理的细胞中，确认了吸光度显著降低并且脂肪积累降低。
换句话说，确认了与海参的其他器官相比，海参卵巢提取物具有抑制脂肪积累的作用。
在图2中，示出了海参提取物抑制脂肪细胞分化和脂肪积累的作用。如在图2中可确认的，在处理组3和4(卵巢提取物)中，与处理组1和2相比，脂肪积累更少，因此O.D.值几乎是处理组1和2的一半。
(3)脂肪细胞分化相关基因和蛋白的分析
作为确认海参提取物影响已知在脂肪细胞分化过程中发挥重要作用的PPARγ、FAS、aP2、C/EBPα的蛋白质和mRNA表达的作用的结果，可确认在用海参卵巢50％和80％乙醇提取物处理的细胞中蛋白质表达降低，与先前的实验类似。另外，可确认，与海参的其他肠器官部分相比，用海参卵巢50％和80％乙醇提取物处理的细胞中的mRNA表达也显著降低。因此，综合这些结果，海参提取物显示出通过调节与脂肪分化相关的基因和蛋白质的表达来抑制脂肪分化。在图3中，示出了海参提取物抑制脂肪分化相关基因和蛋白质表达的作用的结果。
当比较根据每种条件提取的海参提取物抑制脂肪分化的作用时，最有效的提取条件被确认为海参卵巢50％乙醇提取物(样品名称：SJ-O-D1-50)或海参卵巢80％乙醇提取物(样品名称：SJ-O-D1-80)。换句话说，处理组3和4具有抑制脂肪分化相关基因表达的优异作用。
II.实验例2-根据溶剂条件对提取作用和分离作用的验证
1.实验材料和方法
(1)海参样品的制备
[表3]
样品名称 提取信息
1 SJ-O-D1-30 干燥的卵巢30％EtOH，20倍，24小时搅拌，初步提取
2 SJ-O-D1-50 干燥的卵巢50％EtOH，20倍，24小时搅拌，初步提取
3 SJ-O-D1-80 干燥的卵巢80％EtOH，20倍，24小时搅拌，初步提取
4 SJ-O-D1-H 样品2的己烷级分
5 SJ-O-D1-B 样品2的BuOH级分
(2)试剂和材料
如I-2-(1)项进行准备。
(3)3T3-L1前脂肪细胞的培养和脂肪细胞的分化
将3T3-L1细胞在添加了10％小牛血清和青霉素链霉素谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM培养基中培养，并每2至3天传代培养。将3T3-L1细胞以4×105个细胞/孔的浓度等分到96孔板中，并随后用MDI培养基(其中地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)被添加至包含10％ FBS而不是小牛血清的培养基)重新铺平板，并在更换为MDI培养基之后30分钟内，用海参提取物处理。2天之后，将其更换为包含胰岛素的培养基，并且每3天再次更换为新培养基以诱导分化。
(4)油红O染色
将分化完成的3T3-L1细胞用4％甲醛固定1小时，并随后使用0.5％油红O染色溶液对脂肪进行染色以确认分化程度。对于脂肪分化的定量分析，用100％异丙醇溶解细胞中染色的染料，并在500nm下测量吸光度。
(5)Western印迹
为了研究海参提取物对脂肪细胞分化相关蛋白表达的作用，通过western印迹确认相关蛋白的表达。将分化完成的3T3-L1细胞用PBS洗涤，并随后用RIPA缓冲液裂解，并随后通过SDS-PAGE根据分子量分离蛋白。在此之后，将其转移至PVDF膜，并使用5％脱脂乳封闭30分钟。然后，与一抗反应，并随后附着二抗以使用ECL溶液确认蛋白质表达。
(6)统计学
使用GraphPad Prism 7软件(San DIego,CA,USA)对结果进行统计分析，并通过单因素ANOVA分析各组之间的显著差异。(p<0.05)。
2.实验结果
(1)制备提取物和级分的过程
如下通过分别提取海参除卵巢之外的肠器官和卵巢来获得乙醇提取物。在将30％EtOH、50％ EtOH或80％ EtOH添加至干燥的海参卵巢20次之后，将其搅拌24小时，并随后以相同的方式过滤和浓缩。
海参卵巢提取物的级分通过以下方法获得。
在通过添加蒸馏水混悬经浓缩的海参卵巢提取物之后，添加相同量的正己烷并摇动，并随后静置。层分离完成之后，分离并浓缩正己烷层。将水饱和丁醇添加至剩余的混悬液并摇动，并随后充分静置，在层分离完成之后，分离并浓缩水饱和丁醇层。
(2)油红O染色结果
为了研究海参提取物对3T3-L1细胞的脂肪分化的作用，将各海参提取物用分化培养基以25和50μg/ml的浓度(样品No.6，10、25μg/ml)处理48小时以进行实验。作为通过油红O染色分析脂肪积累程度的结果，除了样品No.1之外，所有样品都显示出抑制脂肪积累的显著作用。(图4)
(3)脂肪细胞分化、血液中的脂质和炎症相关蛋白的分析
多种蛋白参与脂肪细胞分化的过程，并且当这些蛋白被抑制时，脂肪分化和积累被抑制。作为确认海参提取物对主要相关蛋白PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα表达的作用的结果，与先前的实验类似，可确认在两个独立的实验中，在五个样品中除了样品No.1之外，脂肪分化相关蛋白的表达降低，并且因此，综合这些结果，可看出海参提取物抑制脂肪分化相关蛋白质的表达，并且这种抑制作用抑制了脂肪分化和积累。
通过上述实验，作为在每种条件下提取的海参提取物抑制脂肪细胞分化和脂肪积累的作用的实验结果，在25和50μg/ml的浓度下确认了抑制脂肪积累的浓度依赖性作用。这种作用显示出抑制脂肪细胞分化和脂肪积累相关蛋白例如PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα的表达，并调节分化为脂肪细胞的过程，并且显示出海参提取物具有抑制脂肪细胞分化的显著作用。在PPARγ的情况下，PPARγ是与炎性疾病相关的因子，在FAS的情况下，FAS是参与脂肪酸生物合成的酶并且已知其是调节SREBP-1(调节脂肪和肝组织中胆固醇和脂肪酸合成的转录因子)和血液中甘油三酯浓度的酶。因此，通过抑制这些蛋白的表达，可获得改善血脂异常和炎症的作用。
III.实验例3-从海参卵巢提取物中分离的化合物的作用
1.5种新的皂苷和3种常规报道的皂苷化合物的分离、结构鉴定
通过以下方法从海参卵巢提取物的丁醇级分中分离对应于化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9的化合物。为了从提取物中分离活性组分，根据活性追踪分级(activityguided fractionation)进行分离和纯化。为了从海参卵巢的水饱和丁醇级分中分离活性组分，通过进行多种类型的柱色谱分离/纯化了8种皂苷组分。
分离/纯化方法在图6中示出。
具体的分离/纯化方法如下。
1)通过反相柱色谱将从以上获得的海参卵巢丁醇级分分为小的级分。
2)通过用100％蒸馏水中的50％甲醇洗脱来除去多糖，并在此之后，分别获得60％甲醇和70％甲醇级分1和2。
3)通过制备型LC将60％甲醇级分用30％ ACN洗脱以获得皂苷1。
4)通过制备型LC将60％甲醇级分用30％ ACN洗脱以获得皂苷1。
5)再次通过反相柱色谱将70％甲醇级分1分为4个小级分，并且其中No.1小级分通过制备型LC用30％ ACN洗脱以获得皂苷2。
6)通过制备型LC将以上No.2小级分用32％ ACN洗脱以分别获得皂苷3和9。
7)再次通过正相柱色谱将上述No.3小级分分为MC:MeOH＝3:1、2:1、1:1级分，并且其中通过制备型LC用35％ ACN将MC:MeOH＝2:1级分洗脱，以获得皂苷4和5。
8)再次通过正相柱色谱将70％甲醇级分2分为MC:MeOH＝7:1、5:1、3:1级分，并且其中通过制备型LC将MC:MeOH＝3:1级分用35％至40％ACN洗脱以分别获得皂苷6和皂苷8。
其中，分别对应于皂苷-1、2、3、4和9的对应于化学式S1、S2、S3、S4和S9的化合物被确认为新的化合物，并且皂苷5、6和8被分别确认为海参毒素D1、海参毒素B和海参毒素A的化学结构。
2.实验结果
(1)细胞生存力
为了研究总共8种单一化合物对3T3-L1细胞生存力的作用，作为通过以2.5至5μg/ml的浓度的每种单一化合物处理确认细胞生存力的结果，可确认在大多数样品中没有显示出显著的变化。在S3、S4和S5的样品中，在2.5μg/ml的浓度下显示出显著降低，并且显示出约80％或更高的细胞生存力。
(2)油红O染色结果
为了研究海参卵巢提取物中的单一化合物对3T3-L1细胞的脂肪分化的作用，将总共8种化合物在分化培养基的情况下以2.5和5μg/ml的浓度处理48小时。在完成分化之后，可确认在所有浓度下均没有显示出显著差异，但是在S3至S9处理的情况下，在2.5、5μg/ml的浓度下脂肪积累显著降低。可确认1μg/ml至5μg/ml的S3的样品抑制的脂肪积累为约16％、40％、80％，并且显示出具有以浓度依赖性方式的脂肪分化抑制效力的趋势，并且S4至S8的样品在2.5μg/ml下抑制了在未分化细胞水平下的脂肪积累。
(3)脂肪细胞分化相关蛋白的分析
为了弄清楚以上检测的单一化合物的脂肪积累抑制效力的机制，确认了脂肪生成相关蛋白FAS、PPARγ、C/EBPα和FABP4的蛋白质表达程度。作为结果，可确认用S1、S2处理的3T3-L1细胞与未进行任何处理的对照相比没有显示出蛋白质表达的显著差异，但在用S3、S4、S5处理的细胞中，与对照组相比，来自用2.5μg/ml处理的细胞的相关蛋白质的表达明显降低，并且可确认，用1μg/ml处理的细胞中相关蛋白质的表达明显降低。接下来，作为确认用S6、S8、S9处理的细胞中的蛋白质表达的结果，与对照组相比，在S6和S8中可确认明确降低的蛋白质表达。因此，综合这些结果，显示出单一化合物S3至6、S8通过抑制脂肪生成相关蛋白的表达来抑制脂肪细胞分化和脂肪积累。
通过本次实验，确认了海参卵巢提取物中的单一化合物抑制脂肪细胞分化和脂肪积累的作用。作为先前提取物的实验结果，显示出脂肪生成相关蛋白FAS、PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达显著降低，并且通过这样的蛋白质抑制来抑制脂肪细胞分化。
<NMR数据>
下表4至9示出了从海参卵巢提取物中分离的化合物中S1至S4和S9的13C和1H NMR化学位移的结果。由此确认了S1至S4和S9是新的分离出的皂苷化合物。
[表4]
化合物1至3、9的糖苷配基在C5D5N/D2O中的13C NMR(200MHz)数据(δ以ppm为单位)
位置 1 2 3 9
1 36.0 36.0 36.0 36.0
2 27.1 27.2 27.2 27.2
3 89.0 89.1 89.1 89.1
4 39.5 39.6 39.6 39.6
5 47.7 47.8 47.8 47.8
6 23.4 23.5 23.5 23.4
7 122.6 122.6 122.6 122.6
8 147.9 148.0 148.0 148.0
9 46.2 46.2 46.2 46.2
10 35.7 35.7 35.7 35.7
11 22.1 22.1 22.1 22.0
12 20.6 20.6 20.6 20.6
13 54.8 54.9 54.9 54.9
14 46.0 46.0 46.1 46.1
15 44.7 44.7 44.7 44.7
16 79.8 79.9 79.9 79.9
17 62.5 62.5 62.5 62.5
18 182.1 182.2 182.2 182.3
19 24.1 24.1 24.2 24.1
20 71.3 71.3 71.3 71.3
21 26.7 26.7 26.7 26.6
22 42.6 42.5 42.5 42.5
23 22.1 22.1 22.1 22.1
24 38.5 38.5 38.5 38.5
25 146.0 146.0 146.1 146.0
26 110.5 110.5 110.5 110.6
27 22.4 22.4 22.4 22.5
30 17.4 17.3 17.3 17.3
31 28.8 28.7 28.7 28.7
32 34.6 34.6 34.6 34.6
[表5]
C5D5N/D2O中的化合物1至3、9的糖苷配基的1H NMR(800MHz)数据(δ以ppm为单位)
位置 1 2 3 9
1 1.47(2H) 1.47(2H) 1.47(2H) 1.47(2H)
2 2.09，1.88 2.09，1.88 2.10，1.87 2.10，1.87
3 3.25 3.26 3.25 3.25
4 - - - -
5 0.98 0.97 0.99 0.98
6 2.05，1.97 2.04，1.96 2.05，1.97 2.04，1.96
7 5.67 5.66 5.67 5.67
8 - - - -
9 3.25 3.25 3.23 3.24
10 - - - -
11 2.05，1.84 2.05，1.83 2.05，1.84 2.05，1.87
12 2.67，2.18 2.66，2.17 2.66，2.18 2.66，2.19
13 - - - -
14 - - - -
15 2.17，2.03 2.18，2.01 2.19，2.03 2.19，2.02
16 5.11 5.10 5.11 5.12
17 2.69 2.67 2.69 2.70
18 - - - -
19 1.06(3H) 1.05(3H) 1.06(3H) 1.05(3H)
20 - - - -
21 1.52(3H) 1.51(3H) 1.52(3H) 1.52(3H)
22 1.82，1.78 1.82，1.77 1.82，1.78 1.82，1.78
23 1.72，1.53 1.72，1.53 1.71，1.53 1.72，1.53
24 2.08(2H) 2.07(2H) 2.08(2H) 2.08(2H)
25 - - - -
26 4.83(2H) 4.83(2H) 4.83(2H) 4.83(2H)
27 1.73(3H) 1.73(3H) 1.73(3H) 1.73(3H)
30 1.11(3H) 1.11(3H) 1.11(3H) 1.10(3H)
31 1.28(3H) 1.28(3H) 1.28(3H) 1.27(3H)
32 1.44(3H) 1.43(3H) 1.45(3H) 1.45(3H)
[表6]
C5D5N/D2O中的化合物1至3、9的糖苷部分的13C NMR(200MHz)数据(δ以ppm为单位)
位置 1 2 3 9
Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3)
1 105.3 105.2 105.2 105.2
2 82.6 83.4 83.3 83.3
3 75.7 75.8 75.7 75.8
4 77.6 77.4 77.4 77.4
5 64.1 64.1 64.1 64.1
Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1)
1 103.4 103.3 103.3 103.3
2 74.4 74.3 74.4 74.4
3 78.0 78.0 78.0 77.9
4 71.5 71.5 71.5 71.4
5 78.7 78.6 78.3 78.6
6 62.4 62.4 62.4 62.3
Glc2(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1)
1 105.4 105.4 105.4 105.4
2 76.2 76.2 76.2 76.2
3 75.9 75.7 75.8 75.8
4 81.5 87.3 87.2 87.1
5 76.6 71.7 71.7 71.7
6(或Me) 61.5 18.2 18.2 18.3
Glc3(1→4Glc2) Glc2(1→4Quin1) Glc2(1→4Quin1) Glc2(1→4Quin1)
1 104.4 104.8 104.8 105.3
2 73.7 73.8 73.8 74.8
3 88.0 88.0 87.7 78.0
4 69.7 69.8 69.8 71.5
5 77.9 77.9 77.9 78.4
6 62.1 62.2 62.1 62.4
Glc4(1→3Glc2) Glc3(1→3Glc2) MeGlc1(1→3Glc2) -
1 105.6 105.6 105.3 -
2 75.4 75.4 75.0 -
3 78.0 78.0 87.8 -
4 71.5 71.5 70.6 -
5 78.6 78.5 78.6 -
6 62.4 62.4 62.1 -
Me - - 60.8 -
[表7]
C5D5N/D2O中的化合物1至3、9的糖苷部分的1H NMR(800MHz)数据(δ以ppm为单位)
位置 1 2 3 9
Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3)
1 4.73 4.72 4.73 4.73
2 4.14 4.04 4.04 4.04
3 4.26 4.24 4.25 4.25
4 4.29 4.33 4.33 4.33
5 4.43，3.66 4.43，3.66 4.44，3.67 4.44，3.67
Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1) Glc1(1→4Xyl1)
1 5.02 5.02 5.02 5.02
2 4.03 4.03 4.02 4.03
3 4.25 4.25 4.24 4.26
4 4.18 4.16 4.15 4.15
5 4.01 4.00 4.00 4.01
6 4.55，4.31 4.55，4.29 4.54，4.27 4.55，4.28
Glc2(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1) Quin1(1→2Xyl1)
1 5.26 5.13 5.13 5.13
2 4.05 4.03 4.03 4.04
3 4.22 4.10 4.10 4.12
4 4.33 3.66 3.66 3.67
5 3.86 3.77 3.76 3.77
6(或Me) 4.55，4.43 1.74 1.74 1.74
Glc3(1→4Glc2) Glc2(1→4Quin1) Glc2(1→4Quin1) Glc2(1→4Quin1)
1 5.16 4.97 4.97 4.98
2 4.09 4.07 4.05 4.04
3 4.21 4.27 4.29 4.27
4 4.05 4.02 4.03 4.13
5 3.96 4.02 4.03 4.09
6 4.45，4.17 4.50，4.17 4.50，4.17 4.61，4.25
Glc4(1→3Glc2) Glc3(1→3Glc2) MeGlc1(1→3Glc2) -
1 5.28 5.33 5.33 -
2 4.07 4.08 4.00 -
3 4.25 4.25 3.75 -
4 4.15 4.14 4.08 -
5 4.03 4.04 4.01 -
6 4.55，4.27 4.55，4.26 4.51，4.23 -
Me - - 3.89 -
[表8]
C5D5N/D2O中的化合物4的糖苷配基部分的13C和1H NMR数据(δ以ppm为单位)
δCa) δHb)
1 36.3 1.84，1.42
2 27.0 2.20，2.01
3 88.9 3.24
4 39.9 -
5 52.8 0.87
6 21.1 1.62，1.46
7 28.5 1.62，1.21
8 38.8 3.24
9 151.2 -
10 39.7 -
11 111.2 -
12 32.1 2.65，2.55
13 55.9 -
14 42.1 -
15 52.1 2.45，2.22
16 214.0 -
17 61.3 2.94
18 176.5 -
19 22.1 1.37(3H)
20 83.5 -
21 26.9 1.49(3H)
22 38.4 1.82，1.66
23 22.3 1.81，1.54
24 38.0 2.00，1.97
25 145.6 -
26 110.6 4.79(2H)
27 22.3 1.71(3H)
30 16.7 1.11(3H)
31 28.1 1.23(3H)
32 20.7 0.95(3H)
[表9]
C5D5N/D2O中的化合物4的糖苷部分的13C和1H NMR数据(δ以ppm为单位)
δCa) δHb)
Xyl1(1→C3) Xyl1(1→C3)
1 105.2 4.78
2 81.9 4.20
3 75.5 4.29
4 77.7 4.29
5 63.9 63.9
Glc1(1→2Xyl1) Glc1(1→2Xyl1)
1 104.9 5.30
2 75.9 4.05
3 75.8 4.20
4 81.4 81.4
5 76.5 76.5
6(或Me) 61.5 61.5
Glc2(1→4Glc1) Glc2(1→4Glc1)
1 104.1 5.14
2 73.8 4.08
3 87.6 4.25
4 69.5 3.99
5 77.6 3.98
6 61.9 4.44，4.15
Glc3(1→3Glc2) Glc3(1→3Glc2)
1 105.2 5.28
2 75.3 4.07
3 77.7 4.25
4 71.4 4.09
5 78.3 4.04
6 62.3 4.55，4.22
Me - -
Glc4(1→4Xyl1) Glc4(1→4Xyl1)
1 102.6 5.01
2 73.5 4.03
3 87.4 4.31
4 69.6 69.6
5 77.8 77.8
6 61.9 61.9
MeGlc1(1→3Glc4) MeGlc1(1→3Glc4)
1 105.1 5.33
2 74.9 3.99
3 87.5 3.77
4 70.6 4.04
5 78.1 4.04
6 62.1 4.52，4.20
Me 60.9 3.90
a)在C5D5N/D2O中在200MHz下测量，b)在C5D5N/D2O中在800MHz下测量。
通过NMR数据，确认了S1至S4和S9是新的皂苷化合物。
IV.实验例4-海参卵巢提取物的抗糖尿病作用的确认
1.实验材料和方法
(1)试剂和材料
3T3-L1细胞(ATCC,CL-173)，DMEM高葡萄糖(Welgene)，胎牛血清(MPBio)，青霉素-链霉素(Welgene)，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(Welgene)，胰蛋白酶-EDTA(Welgene)，小牛血清(Welgene)，葡萄糖摄取-Glo测定试剂盒(Promega)。
(2)3T3-L1前脂肪细胞的培养和脂肪细胞的分化
将3T3-L1细胞在添加了10％小牛血清和青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM培养基中培养，并每2至3天传代培养。将3T3-L1细胞以2×104个细胞/孔的浓度等分到96孔板中并随后培养3天，并随后更换为MDI培养基(其中地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)被添加至包含10％ FBS而不是小牛血清的培养基)，2天之后，将其更换为包含胰岛素的培养基，并每2天再次更换培养基并诱导分化。
(3)葡萄糖摄取-Glo测定
使分化完成的3T3-L1细胞饥饿16小时，并随后将海参提取物以25、50μg/mL的浓度在无血清培养基中处理6小时。回收培养的上清液，并在3T3-L1细胞中使用葡萄糖摄取-Glo测定试剂盒，使用光度计测量葡萄糖转运活性程度。
2.实验结果
(1)确认海参卵巢提取物的葡萄糖摄取到细胞中(肌肉葡萄糖摄取)的程度的结果
如可在图10中确认的，海参卵巢提取物的胞内葡萄糖摄取是显著优异的。图10是确认海参卵巢提取物和海参除卵巢之外的肠器官提取物的葡萄糖摄取的结果。图11是通过海参卵巢提取物的提取条件确认葡萄糖摄取的结果。与对照组相比，在所有浓度下，葡萄糖摄取都是优异的。特别地，可看出海参卵巢提取物具有优异的抗糖尿病作用，因为与常规用作用于糖尿病的治疗剂的罗格列酮(Rosiglitazone)相比，海参卵巢提取物的葡萄糖摄取效率提高得更多。
可在下表10中确认，与未经处理组相比，海参卵巢提取物的葡萄糖摄取提高，并且特别是，与罗格列酮的提高1.24倍相比，海参卵巢提取物在全部浓度下显示出高得多的摄取水平(1.29倍、1.43倍、1.35倍)。
[表10]
样品 倍数变化
罗格列酮(参考) 1.24
30％EtOH 约1.29
50％EtOH 约1.43
80％EtOH 约1.35
通过该结果，确认了通过海参卵巢提取物的处理提高了葡萄糖摄取。
V.实验例5-从海参卵巢提取物中分离的皂苷化合物的抗糖尿病作用的确认
1.实验方法
(1)试剂和材料
如IV-1-(1)项那样进行准备。
3T3-L1前脂肪细胞的培养和脂肪细胞的分化
将3T3-L1细胞在添加了10％小牛血清和青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM培养基中培养，并每2至3天传代培养。将3T3-L1细胞以2×104个细胞/孔的浓度等分到96孔板中并培养3天，并随后更换为MDI培养基(其中地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)被添加至包含10％ FBS而不是小牛血清的培养基)。2天之后，将其更换为包含胰岛素的培养基，并每2天再次更换该培养基以诱导分化。
葡萄糖摄取-Glo测定
对于分化完成的3T3-L1细胞，进行饥饿16小时，并随后用海参来源的单一化合物以2.5μg/mL的浓度在无血清培养基中处理6小时。回收培养的上清液，并且对于3T3-L1细胞使用葡萄糖摄取-Glo测定试剂盒，使用光度计测量葡萄糖转运活性程度。
对于先前获得的皂苷化合物，确认了抗糖尿病作用。
2.实验结果
图12是确认从海参卵巢提取物中分离的皂苷化合物的葡萄糖摄取的结果。如可在图12中确认的，当将未经处理组的葡萄糖摄取认为是100％时，所有化合物显示出100％或更高的摄取。通过该结果，可看出，与未经处理组相比，所分离的化合物均提高了葡萄糖摄取，并且可看出，每种化合物都具有抗糖尿病作用。
下表11是倍数变化值，显示出与对照组相比的葡萄糖摄取程度。还显示出与罗格列酮类似水平的葡萄糖摄取。
[表11]
样品 相对于对照的倍数
罗格列酮(参考) 1.49
S1 1.25
S2 1.43
S3 1.1
S4 1.6
S5 1.38
S6 1.24
S8 1.43
S9 1.03
VI.实验实例6-海参卵巢提取物的体内实验
[降低体重的作用(抗肥胖用途)]
1.实验方法
(1)实验动物组信息
对C57BL/6雄性小鼠(5周龄)进行实验，总共50只动物，每组10只。所有组除正常饮食组之外，均饲喂高脂饮食。
1)正常(Normal diet group，正常饮食组)
2)HFD((High fat diet group，高脂饮食组)
3)HFD+0.05％海参卵巢提取物(SCOE)
4)HFD+0.1％海参卵巢提取物(SCOE)
5)HFD+0.2％海参卵巢提取物(SCOE)
(2)繁殖条件
通过制备饲料将提取物通过饮食饲喂，并且实验进行8周。每周测量一次体重，并且每周测量3次饮食摄入。
实验结果
图13和14是观察高卡路里饮食摄入小鼠的体重变化和最终确认的体重的结果。通过图13，可看出，作为最长至8周的确认的结果，在用海参卵巢提取物(50％乙醇)处理的组中，体重提高速率显著降低。如通过图14确认的，可看出，当与用通过HFD表示的海参卵巢提取物的未经处理组相比时，最终体重降低。
[白色脂肪组织减小作用(抗肥胖用途)]
1.实验方法
(1)脂肪组织的H&E染色
苏木精是碱性/阳离子物质，其将细胞核(阴离子)染为深蓝色或紫色，并且伊红是酸性/阴离子物质，其将胞质(阳离子)染为红色或粉红色。
H&E染色的过程如下。
脱蜡→脱水→苏木精→差异化→变蓝→伊红→脱水→纯化(clearing)→盖上玻片
(2)脂肪组织中的白色脂肪与肥胖和超重相关，并且在本实验中，通过H&E染色对附睾白色脂肪的脂质积累进行组织学分析以确认白色脂肪组织的组织尺寸。
2.结果
图15是通过H&E染色确认的白色脂肪细胞变化的结果。
确认了当施用高卡路里饮食(HFD)时，与肥胖相关的白色脂肪细胞的尺寸变得显著更大，并且当施用本文的海参卵巢提取物(HFD+SOCE 0.05％，HFD+SOCE 0.1％，HFD+SOCE0.2％)时，脂肪细胞尺寸显著降低。由此，确认了通过海参卵巢提取物的处理可获得脂肪细胞尺寸降低、抗肥胖作用等。
[血液中总胆固醇和甘油三酯的降低的确认(高脂血症、代谢综合征的改善)]
1.实验方法
(1)血液中高密度脂蛋白含量比总胆固醇(HDL/TC)
将200μl的沉降剂添加至200μl的血液样品，然后将它们混合并在室温下放置5分钟。5分钟之后，以3000rpm进行离心10分钟，并将3ml的酶溶液添加至各100μl的离心上清液，并混合。将它们在37℃恒温水浴中反应5分钟。使用盲测作为对照，在500nm波长下测量吸光度。
HDL-C(mg/dl)＝(试样的吸光度/标准品的吸光度)×100(mg/dl)
(2)血液中的TC(Total cholesterol，总胆固醇)
分别准备用于盲测/标准品/试样的试管。将3ml的酶溶液添加至20μl的血液试样，并将它们充分混合。将它们在37℃水浴中反应5分钟。使用盲测作为对照，在505nm波长下测量标准品和试样的吸光度。
总胆固醇(mg/dl)＝(试样的吸光度/标准品的吸光度)×标准品溶液浓度
血液中的TG(Total glyceride，总甘油酯)
分别准备用于盲测/标准品/试样的试管。将3ml的酶溶液添加至20μl的血液试样，并将它们充分混合。将它们在37℃水浴中反应5分钟。使用盲测作为对照，在505nm波长下测量标准品和试样的吸光度。
甘油三酯的量(mg/dl)＝(试样的吸光度/标准品的吸光度)×300(mg/dl)
(标准溶液的甘油三酯的量：300mg/dl)
2.结果
图16至18示出了表示HDL含量比总胆固醇的结果、确认降低总胆固醇的作用的结果、和确认降低甘油三酯的作用的结果。通过这些结果，确认了海参卵巢提取物处理组显示出降低血液中胆固醇和甘油三酯的水平的作用。特别地，这里应该注意的是，尽管总胆固醇数值降低，但HDL数值提高。通过该结果，可看出其显示出用于治疗血脂异常的作用。
另外，作为使用所述提取物确认PPARγ(已知其参与炎症调节特别是炎性肠病和/或类风湿性关节炎)的表达的结果，可确认与高卡路里饮食相比的降低PPARγ的作用。该结果可在图19中确认。由此，确认了海参卵巢提取物可获得抑制炎症的作用。
工业适用性
本发明可提供包含海参卵巢提取物的用于降低体重的组合物、用于抑制肥胖的组合物、用于抗糖尿病的组合物、用于抗炎的组合物和用于改善血脂异常的组合物。本发明的组合物可提供用于降低体重的方法、用于抑制肥胖的方法、用于治疗或改善糖尿病的方法、用于治疗或改善炎症的方法以及用于治疗或改善血脂异常的方法。
<110> Bioinformatics & Molecular Design Research Center
Benthic Bio Inc.
<120> 海参卵巢提取物的用途、来源于海参性腺提取物的化合物及其用途
<130> P21-213
<150> KR 10-2020-0172701
<151> 2020-12-10
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C/EBPα的正向引物
<400> 1
caagaacagc aacgagtacc g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C/EBPα的反向引物
<400> 2
gtcactggtc aactccagca c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPARγ的正向引物
<400> 3
tcgctgatgc actgcctatg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PPARγ的反向引物
<400> 4
gagaggtcca cagagctgat t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS的正向引物
<400> 5
ggaggtggtg atagccggta t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS的反向引物
<400> 6
tgggtaatcc atagagccca g 21
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aP2的正向引物
<400> 7
ccgcagacga cagga 15
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aP2的反向引物
<400> 8
ctcatgccct ttcataaact 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白的正向引物
<400> 9
gcaggagtac gatgagtccg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白的反向引物
<400> 10
acgcagctca gtaacagtcc 20

Claims (13)

1.化合物，其由以下化学式S1、S2、S3、S4或S9表示：
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是从海参的卵巢提取或分离的。
3.组合物，其用于预防或治疗选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的任一种疾病，所述组合物包含海参生殖腺提取物或来源于海参生殖腺的皂苷化合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述海参生殖腺是海参的卵巢。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述海参生殖腺提取物通过用45％至85％(V/V)乙醇水溶液作为溶剂提取海参生殖腺来获得。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述海参生殖腺提取物通过用48％至55％(V/V)乙醇溶剂提取海参生殖腺来获得。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述海参生殖腺提取物是丁醇级分，所述丁醇级分是通过用丁醇作为溶剂对通过用48％至55％(V/V)乙醇水溶液提取海参生殖腺获得的提取物进行分级而获得的。
8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述皂苷化合物包含选自以下化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9中的任意一种或更多种：
9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述海参生殖腺提取物或来源于所述海参生殖腺的皂苷化合物抑制选自PPARγ、FAS、aP2和C/EBPα中的任意一种或更多种蛋白的表达。
10.根据权利要求3所述的组合物，其中所述海参生殖腺提取物或来源于所述海参生殖腺的皂苷化合物抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的分化或抑制胞内脂肪积累。
11.用于改善海参生殖腺提取物对选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的一种或更多种疾病的预防或治疗作用的方法，所述方法是提高选自以下化学式S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8和S9中的一种或更多种皂苷化合物：
12.根据权利要求11所述的用于提高海参生殖腺提取物对选自肥胖、炎症、糖尿病和血脂异常中的一种或更多种疾病的预防或治疗作用的方法，其中所述海参生殖腺提取物是海参卵巢提取物。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法是用48％至55％(V/V)乙醇水溶液来提取海参卵巢，并从所述提取物中获得丁醇级分。
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CN102224924B (zh) * 2011-04-27 2013-04-10 中国海洋大学 含有海参皂苷的组合物及其在食品药品中的应用
CN110338367A (zh) * 2018-04-08 2019-10-18 于明志 一种人工方式将海参性腺注入海参体内的海参产品加工方法

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